KR20210089886A

KR20210089886A - 일산화질소 전달용 융합 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210089886A
Application number: KR1020200002997A
Authority: KR
Inventors: 조인호; 박정현
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-07-19
Also published as: KR102398339B1

Abstract

본 발명은 본 발명은 일산화질소의 세포 내 및/또는 세포 내 소기관 전달능을 가진 신규 융합펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 융합 펩타이드는 세포 내 및/또는 세포 내 소기관으로 일산화질소를 특이적 및 효율적으로 전달할 수 있다. 이에 따라, 암세포 증식 억제, 줄기세포 성장 촉진 및 조골세포로의 분화유도 등 일산화질소가 관여할 수 있는 생체 내 다양한 생리현상을 조절하고 개선할 수 있다.

Description

일산화질소 전달용 융합 펩타이드 및 이의 용도 {Fusion peptide for nitric oxide delivery and use thereof}

본 발명은 일산화질소를 세포 내 및/또는 세포 내 소기관으로 전달할 수 있는 신규 융합 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 생화학 및 생리학 부문에서 일산화질소 (Nitric Oxide, NO)의 심혈관계, 호흡계, 소화계, 비뇨기계 및 신경계에서의 기능들이 속속 밝혀지면서 일산화질소에 대한 연구는 더욱 확대되고 있는 추세이다. 최근 연구에 의하면 체내에서 생성되는 일산화질소는 혈관확장, 신경전달, 혈관형성, 식균작용, 상처치료, 혈전생성방지, 심근손상방지, 면역반응 등의 다양한 생리학적 반응에서 매우 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있다. 일산화질소의 생리학적 역할의 중요성에 대한 발견으로 인하여 일산화질소를 물질 내에 안정적으로 저장하는 것뿐만 아니라 전달하고자 하는 부위에 정확하게 전달할 수 있는 방법에 대한 연구 또한 활발하게 진행되고 있다.

일산화질소를 저장 또는 전달할 수 있는 물질은 여러 가지가 보고되어 있다. 작은 단분자부터 덴드리머, 리포좀, 나노파티클, 탄소나노튜브, 다공성 입자, 마이셀에 이르기까지 일산화질소는 용도에 따라 다양한 물질에 저장될 수 있다.

세포 내 약물을 전달하기 위한 전달체로서 최근 세포 투과 펩타이드 (Cell Penetrating Peptides: CPP)가 주목받고 있다. 세포 투과 펩타이드는 약 10 ~ 30개 정도의 짧은 펩타이드로 이루어진 세포막 투과성 펩타이드로 대부분 단백질-투과 도메인 (protein-transduction domain)이나 막-이동 시퀀스 (membranetranslocating sequence)로부터 유도되었다. 또한 CPP는 세포막에 반응하여 엔도사이토시스(endocytosis)나 또는 직접 세포막을 투과할 수 있는 성질을 갖고 있는 올리고펩타이드로 세포막을 투과할 수 있는 전기화학 및 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 CPP는 약물 전달 시스템으로의 응용방법과 연관되어 연구가 되어 약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 특이적인 생물학적 시스템에서 응용되어 유전자 발현을 조절하는 하나의 도구로서 연구가 많이 진행되어 사용되고 있다.

일산화질소는 고농도에서 독성을 갖고, 다수의 세포 내 표적으로 인해 신체 내 순환 시스템의 완벽한 붕괴를 일으키는 등 문제점이 지적되어 왔으며, 이에 따라 다양한 부작용을 유발하여 일산화질소 전달체를 치료 용도로 적용하는데 한계가 있었다. 따라서 상기와 같은 부작용을 방지하면서도 원하는 표적에 특이적으로 일산화질소를 전달할 수 있는 물질의 개발이 필요하다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 세포 내 및/또는 세포 내 소기관으로 일산화질소를 특이적으로 전달하는 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규 융합 펩타이드를 개발하고, 이러한 융합 펩타이드를 이용하여 일산화질소를 세포 내, 세포 내 소기관, 특히 핵으로 표적하여 효율적으로 전달할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 일산화질소 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 소기관 표적 일산화질소 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 핵 표적 일산화질소 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암세포의 증식 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 줄기세포의 분화 조절용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, “펩타이드”란 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드는 이의 유도체를 포함하는 의미로 상기 펩타이드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L-또는 D-아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다.

상기 융합 폴리펩타이드 또는 이의 유도체는 세포투과성을 가지면서 세포 내로 일산화질소 전달 기능을 보유하도록 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드에서 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인이란 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드의 N-말단 서열이 변형된 시스테인을 가지는 것을 의미한다. 이러한 변이 시스테인은 서열번호 34에 나타내었다. 구체적으로 시스테인의 SH기를 S-NO기로 치환한 것이다. 이러한, N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인을 포함하는 융합 폴리펩티드는 세포 내로 융합 폴리펩티드가 도달한 후에 해당 세포에서 일산화질소를 방출할 수 있도록 한다.

이러한 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인의 제조는 NaNO₂를 사용하거나 과량의 산화 질소 가스를 투여하거나 S-글루타치온을 사용하는 등의 알려진 S-니트로실화(S-nitrosylation) 방법을 사용할 수 있다. 또한, N-말단에 시스테인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용매에 녹여 0 내지 10 ℃로 냉각한 후 t-BuNO₂를 적가하여 교반하여 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 펩타이드를 수득하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인에 연결된 세포 투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CLS) 서열을 포함한다. 여기서 연결은 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 링커는 펩타이드 링커로써 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 또한, 필요에 따라 전달된 위치에서 신호 서열과 시스테인 서열 등을 분리하기 위해 링커 서열을 포함할 수도 있다.

세포 투과성 펩타이드란 일종의 신호 펩타이드로써 세포 내로 물질 전달을 목적하는 펩타이드 서열이다. 주로 7-30 개 정도의 아미노산 펩타이드 서열로 이루어지며, 세포 내로 전달될 수 있는 신호 펩타이드를 가지는 서열이라면 어떠한 서열이라도 본 발명에서 포함될 수 있다.

예컨대, 세포 투과성 펩타이드는 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, PTD-5, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 CPPs(예를 들어, TAT48-60, 페네트라틴(pAntp)43-58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포탄, 등)은 생물학적 활성 물질은 약물운반체들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화 (internalization)가 가능한 활성을 가진다.

이들의 서열 정보의 예시는 아래 표 1에 나타내었다.

HIV-1 Tat (서열번호 1)	GRKKRRQRRR
Penetratin (서열번호 2)	RQIKIWFQNRRMKWKK
HSV VP22 (서열번호 3)	DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS (서열번호 4)	AAVALLPAVLLAAP
Transportan (서열번호 5)	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
PEP-1 (서열번호 6)	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Poly arginine (서열번호 7)	RRRRRRR
PTD-5 (서열번호 8)	RRQRRTSKLMKR

본 발명은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열인 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직하게 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 서열번호 1인 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 구체적으로, N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 이러한 서열은 서열번호 33에 나타내었다.

본 발명에 따른 상기 융합 폴리펩타이드는 세포 내로 NO를 전달함으로써, 다양한 응용이 가능하다.

이에 따라 본 발명은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 일산화질소 전달용 조성물을 제공하는 것이다. 본원 발명의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 일산화질소를 세포 내로 특이적 및 효율적으로 전달함으로써, 암세포 성장 억제, 세포주기 조절, 줄기세포 성장 촉진, 혈관 확장 또는 분화 조절 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 아래 살필 질환 등의 예방 및/또는 치료에 다양하게 이용될 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

상기 융합 폴리펩타이드 또는 이의 유도체는 세포투과성을 가지면서 세포 내 소기관으로 일산화질소 전달 기능을 보유하도록 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드에서 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인이란 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드의 N-말단 서열이 변형된 시스테인을 가지는 것을 의미한다. 구체적으로 시스테인의 SH기를 S-NO기로 치환한 것이다. 이러한, N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인을 포함하는 융합 폴리펩티드는 세포 내 소기관으로 융합 폴리펩티드가 도달한 후에 해당 세포 내 소기관에서 일산화질소를 방출할 수 있도록 한다.

즉, 본 발명에 따른 융합 펩타이드는 N-말단의 시스테인에 일산화질소 공여체가 연결되어 세포 내 소기관으로 일산화질소를 전달할 수 있다. 이는 세포 내로 이동 후 세포 내 소기관에서 일산화질소를 방출할 수 있는 변형된 서열이다. 세포 내에서 일산화질소를 발현할 수 있는 물질은 시스테인의 SH기(티올기)의 수소기를 대신하여 일산화질소를 결합시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인에 연결된 세포 투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CLS) 서열을 포함한다. 세포 투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CLS) 서열은 위에서 살핀 바와 같다.

본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 세포 투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CLS) 서열에 연결된 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열을 포함한다. 여기서 연결은 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 링커는 펩타이드 링커로써 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열이란 세포 내 존재하는 핵, 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 리소좀, 퍼옥시좀 등과 같이 세포를 구성하는 구체적 소기관들을 표적하여 물질을 전달할 수 있는 서열을 의미한다.

즉, 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 세포 투과성 펩타이드 서열을 통해 세포 내로 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인을 포함하는 서열을 도입한 후에 이어지는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열을 통해 세포 내 개별 소기관으로 융합 폴리펩타이드를 전달한다. 이러한 전달을 통해 각 소기관에 융합 폴리펩타이드가 전달된 후 각 세포 내 소기관에서 일산화질소를 방출한다.

예컨대, 핵을 표적하는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열(Nuclear Localization Sequence, NLS)의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 NLS 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV (서열번호 9)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호 10)를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD (서열번호 11) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 12)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열번호 13)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (서열번호 14); 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP (서열번호 15) 및 PPKKARED (서열번호 16); 인간 p53의 서열 PPKKKPL (서열번호 17); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP (서열번호 18); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR (서열번호 19) 및 PKQKKRK (서열번호 20); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL (서열번호 21); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR (서열번호 22); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (서열번호 23); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK (서열번호 24).

예컨대, 미토콘드리아를 표적하는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 서열을 포함한다: mitochondrial 3-oxoacyl-coenzyme-A에서 유래된 MALLRGVFIVAAKRTPFGAYGC (서열번호 25)

예컨대, 소포체를 표적하는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 서열을 포함한다: 소포체 내로 통과하는 대표적인 타킷 서열은 KDEL (서열번호 26)이다.

예컨대, 퍼옥시좀을 표적하는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 서열을 포함한다: 대표적인 퍼옥시좀 타깃 서열은 C C’terminal SKL (서열번호 27)이고 peroxisomal 2,4-dienoyl-CoA reductase에서 유래한 PEALIKSMTSKL (서열번호 28)이 있다.

예컨대, 리소좀을 표적하는 세포 내 소기관 표적 펩타이드 서열의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 서열을 포함한다: 대표적인 리소좀 타깃 서열은 KFERQ (서열번호 29)이다.

본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드 서열은 위와 같이 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함함으로써, 세포 내 소기관에 특이적으로 융합펩타이드를 전달하고, 여기에 일산화질소를 방출하도록 한다.

본 발명에서 상기 세포 투과성 펩타이드 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드는 상기 언급된 임의 서열들의 조합일 수 있다. 세포 투과성 펩타이드 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드는 세포내 투과성 증진, 세포 내 소기관 표적을 증진시키기 위해 세포 투과성 펩타이드에 적어도 한 개, 두 개, 세 개 또는 그 이상의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 조합하는 것이 바람직하다.

바람직하게 본 발명에 따른 융합 펩타이드 서열은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 핵 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

이에 따라, 본 발명은 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 소기관 표적 일산화질소 전달용 조성물이다.

본원 발명의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 일산화질소를 세포 내 소기관 내로 특이적 및 효율적으로 전달함으로써, 암세포 성장 억제, 세포주기 조절, 줄기세포 성장 촉진, 혈관 확장 또는 분화 조절 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 일산화질소의 세포내 소기관 내 전달을 통해 질환 치료에 이용될 수 있다. 이러한 본 발명에 따른 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간에게 사용될 수 있으며 예컨대 정맥내 (intravein), 복막내 (intraperitoneal), 근육내 (intramuscular), 피하내 (subcutaneous), 피내 (intradermal), 비내 (nasal), 점막내 (mucosal), 흡입 (inhalation) 및 경구 (oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 세포에서 세포내 소기관으로 일산화질소를 전달할 수 있다.

이러한 세포내 소기관으로 일산화질소를 전달하여 치료될 수 있는 질환의 비제한적 예시로는 위염, 위궤양, 기관지염, 천식, 부종, 간염, 신장염, 동맥경화, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 대장염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 관절염증관련 질환, 퇴행성 질환 등의 염증성 질환; 전립선암, 백혈병, 골수증식 장애, 골수이형성 증후군, 림프종, 고환암, 두경부암, 식도암, 위암, 간암, 소장암, 담낭암, 직장암, 항문암, 육종, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 골암, 신장암, 흑색종, 결장암, 난소암, 폐암, 중추 신경계암, 다발성 골수종, 피부암, 유방암 등의 암; 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 뇌졸중, 암, 노화, 발기부전, 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell disease), 당뇨병, 협심증, 심근경색, 관절염, 당뇨병성 망막증, 건선, 신생혈관 녹내장, 혈관종, 허혈성 질환 등이 혈관 질환; 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고지혈증, 통풍, 뇌졸증, 동맥경화 등의 대사성 질환이 있을 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 치료 가능한 질환은 암일 수 있다. 즉, 암세포 증식을 현저히 억제하여 그 자체로 우수한 암세포 증식 억제효과가 있으며, 이에 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있다.

우수한 암 세포 증식 억제효능을 나타내는 본 발명의 융합 펩타이드에 추가로 항암 활성을 나타나는 공지된 물질을 더하여 이들의 병용 및 다양한 메커니즘에 대한 고려를 통해 암 등 질환을 유용하게 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, “항암제”는 암세포를 죽이거나 증식을 저해하는 물질로서, 예컨대 백금 화합물, 알킬화제, 항종양 항생제, 항대사산물, 뉴클레오시드 유사체, 토포이소머라아제 저해제, 하이포메틸화제, 프로테오솜 저해제, 에피포도필로톡신, 빈카 알칼로이드, 티로신 키나아제 저해제, 모노클로날 항체, 니트로소우레아, 효소, 생물학적 제제, 헥사메틸멜라민, 미토탄, 혈관신생 저해제, 스테로이드, 호르몬제, 아로마타아제 저해제, 삼산화비소, 트레티노인, 하이드록시우레아, DNA 합성 저해제, 비선택적 사이클로옥시게나아제 저해제 또는 선택적 사이클로옥시게나아제-2(COX-2) 저해제일 수 있으며, 이로 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 융합 펩타이드를 다양한 농도로 암 세포주에 처리한 결과, 암세포 증식 억제 효능이 우수함을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "치료"는 질병 또는 질환의 억제, 경감을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 약제학적 조성물은 적절한 형태로 제제화되어 제공될 수 있다. 상기 제제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 상기 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약제학적적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 제제는 상기 약제학적 조성물 (유효성분)에 추가하여 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 구체예에 있어서, 상기 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.

예를 들면, 상기 제제를 비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔 (gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 제제를 경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.

상기 제제의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 10000 ㎎/kg, 0.01 내지 10000 ㎎/kg, 0.1 내지 10000 ㎎/kg, 0.5 내지 10000 ㎎/kg, 0.001 내지 1000 ㎎/kg, 0.01 내지 1000 ㎎/kg, 0.1 내지 1000 ㎎/kg, 0.5 내지 1000 ㎎/kg, 0.001 내지 500 ㎎/kg, 0.01 내지 500 ㎎/kg, 0.1 내지 500 ㎎/kg, 0.5 내지 500 ㎎/kg, 0.001 내지 300 ㎎/kg, 0.01 내지 300 ㎎/kg, 0.1 내지 300 ㎎/kg, 또는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.

상기 제제의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 제제의 투여 대상은 인간 등의 포유류, 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열은 세포 투과성 펩타이드 서열로 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인을 세포 내로 위치시킬 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열은 핵 국재화 서열로써 세포 내로 이동된 융합 폴리펩타이드를 핵 내로 전달한다. 핵 내로 전달된 융합 폴리펩타이드에서 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인으로부터 일산화질소가 방출될 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열의 경우 1 내지 3개가 연속적으로 결합하는 것이 필요하나, 바람직하게 서열번호 9의 아미노산 서열을 2개 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 서열 사이는 직접 연결되거나, 링커를 통해 연결되고 차후 필요에 따라 프로테아제 등으로 분리될 수도 있다.

바람직하게 상기 서열은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 시스테인의 C-말단에 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 서열번호 1의 아미노산 서열의 C-말단에 연결된 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 가지는 융합 폴리펩티드일 수 있다.

구체적으로, N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 이러한 서열은 서열번호 30에 나타내었다.

구체적으로, N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 2개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 이러한 서열은 서열번호 31에 나타내었다.

구체적으로, N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 이러한 서열은 서열번호 32에 나타내었다.

본 발명은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 핵 표적 일산화질소 전달용 조성물을 제공하는 것이다. 일산화질소 전달 용도에 대해서는 앞서 살핀 바와 같다.

상기 서열들은 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 이러한 서열 사이에는 링커 서열 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 SH group이 S-NO로 치환된 S-니트로소-시스테인 (S-nitroso-cysteine, Cys-NO)을 연결하여 일산화질소 전달용 융합 펩타이드를 제작하였으며, 상기 융합 펩타이드가 정상 세포에 대한 세포 독성 없이 세포 내 핵에서 특이적으로 일산화질소를 높은 효율로 발현하는 것을 확인하였다 (도 5 내지 11). 이에 따라 본 발명에 따른 조성물은 핵 내 일산화질소 전달용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 약제학적 조성물의 치료 용도는 앞서 언급한 질환들에 대한 치료 용도를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 융합 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

암의 치료 용도에서는 앞서 살핀 바와 같다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 조성물의 처리에 따라 암세포 사멸 효과가 증진되었으며, YAP 단백질의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. (도 17 및 도 18)

이에 따라 본 발명에 따른 조성물은 암의 예방 또는 치료 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, “줄기세포 (stem cell)”는 인간의 몸을 구성하는 여러 종류의 세포나 장기로 성장할 수 있는 일종의 모세포로, 간세포 (幹細胞)라 불리기도 하며 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖고 있다. 줄기세포는 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell)로 구별될 수 있다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 및 표피줄기세포의 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 다분화성의 성질을 갖는 한 제한되지 않으며, 인간을 포함한 포유동물, 구체적으로 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어 편도, 골수, 지방, 태반, 배아 및 제대혈로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래할 수 있고, 보다 구체적으로는 편도유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 골세포로의 분화에 통상 사용되는 뼈 분화 배양액 (osteogenic differentiation medium)의 처리 전/후 또는 동시에 처리됨으로써 골세포로의 분화를 빠르게 촉진시킨다.

본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 조성물의 전처리는 편도, 지방 및 골수 유래 세포의 골세포로의 분화를 빠르게 촉진시켰다.

"분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어지는 현상을 들 수 있다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.

"골세포"란, 발육중인 뼈에 있어서 골아세포로부터 분화되는 세포를 의미하는데, 골조직속에 포함된 골소강의 내부에 존재하고, 골소강과 같은 형의 편평한 타원체 형태를 가지며, 극히 많은 돌기를 지니고, 주위골조직의 무기질대사에 관여한다.

이러한 분화 중 골세포로의 분화에 있어서는 아스코빅산 2-포스페이트, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유한 배양배지에 배양하여 골세포로 분화시키는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 (a) N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계; 및

(b) 아스코빅산 2-포스페이트, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유한 배양 배지에 상기 (a) 단계의 중간엽 줄기세포를 배양하여 골세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 골세포로의 분화 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예들에 따르면, 본 발명의 조성물의 처리는 뼈 분화 측면에서 빠르게 분화를 촉진시켰고, osteocalcin 및 osteopontin의 발현을 증진시켰으며 YAP의 발현을 억제하고 Runx2의 발현을 증진시켰다는 점에서 우수한 효과를 가진다.

또한, 본 발명은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분화 조절용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 처리는 중간엽 줄기세포의 증식 속도를 조절함으로써 계대 배양의 시기 등을 조절할 수 있고, 분화가 필요한 적절한 시기에 세포를 이용하도록 하게 한다.

또한, 본 발명은 N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 암세포의 증식 억제용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 처리는 암세포의 증식 속도를 억제할 수 있다. 특히, in vitro 또는 in vivo 실험 (인간을 제외할 수 있음) 등에서 핵을 표적으로 NO를 전달함으로써, NO의 핵 표적 전달을 통한 암세포 증식 억제 작용을 수행할 수 있다. 또한, 이를 통해 다양한 세포 실험 용도로써 이용가능하다.

본 발명의 융합 펩타이드는 세포 내 및/또는 세포 내 소기관으로 일산화질소를 특이적 및 효율적으로 전달할 수 있다. 이에 따라 줄기세포가 다양한 세포로 분화하는 것을 조절할 수 있고, 암줄기세포의 분화에 적용된다면 향후 암 치료제 등의 개발에도 이용될 수 있다. 더욱이, 줄기세포 분화 촉진, 특히 조골세포로의 분화능이 우수하며, 그 자체로써 항암제로 이용도 가능하다. 즉, 세포 내 및/또는 세포 내 소기관 내 일산화질소 전달을 통해 일산화질소가 관여할 수 있는 생체 내 다양한 생리현상을 조절하여 다양한 응용이 가능하다는 장점을 가진다.

도 1은 본 발명에 따른 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 수행한 결과를 나타내는 LC/MS 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 수행한 결과를 나타내는 LC/MS 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 수행한 결과를 나타내는 LC/MS 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 각각의 Rhodamine-CPP 펩타이드들의 세포 내 투과력을 확인한 결과로, Rhodamine-CPP 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSCs)에 3시간 처리하고 난 후에 세포 내 rhodamine의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 Rhodamine-CPP 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 2시간 처리한 후 confocal microscopy를 이용하여 세포 내 위치를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Rhodamine-CPP 펩타이드의 서열 차이에 따른 핵 내 펩타이드 분포 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 Rhodamine-CPP-2xNLS 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 시간별로 처리 한 후 세포 내 위치를 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 Rhodamine-CPP 펩타이드의 처리 시간 차이에 따른 핵 내 펩타이드 분포 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 펩타이드들의 일산화질소 방출을 NO sensor를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 NO-CPP-NLS 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 처리하고 4-Amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM diacetate)를 이용하여 세포 내의 NO의 위치를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 NO-CPP-2xNLS와 CPP-2xNLS 각 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 농도 별로 처리한 후 live & dead 염색하여 살아있는 (live)와 죽은 (dead) 세포를 분석한 결과로써, 세포 사멸이 거의 일어나지 않음을 확인한 결과이다.
도 12는 NO-CPP-NLS 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 여러 농도 (1, 10, 100 μM)로 처리하고 세포 배양하여 BrdU assay를 수행한 결과를 나타낸다.
도 13은 NO-CPP-NLS 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에에 처리하고 씻어낸 후, 4일, 7일, 14일 동안 뼈 분화 배양액 (osteogenic differentiation medium)으로 배양시키고 Alizarin red S로 염색하여 뼈 분화 정도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 14는 지방유래 중간엽 줄기세포 (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, AMSCs)와 골수유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)에 NO-CPP-2xNLS 펩타이드를 처리하고 씻어 낸 후, 7일 동안 뼈 분화를 시키고 Alizarin red S 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 15는 NO-CPP-2xNLS 혹은 CPP-2xNLS 펩타이드를 100 μM의 농도로 TMSCs에 4시간 동안 처리하고 씻어 낸 후, 7일 동안 뼈 분화 배양액으로 배양시키고 뼈 세포의 표지 유전자인 osteocalcin과 osteopontin mRNA의 발현양을 quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)로 분석한 결과를 나타낸다.
도 16은 NO-CPP-2xNLS를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 처리한 후 YAP과 Runx2의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 17은 유방암세포주 MDA-MB-231 세포에 여러 농도 (0, 10, 20, 혹은 40 μM)로 NO-CPP-2xNLS 펩타이드를 처리하고 이의 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 MDA-MB-231 세포에 NO-CPP-2xNLS를 40 μM 처리하여 YAP 단백질의 발현이 세포질과 핵에서 현저히 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 펩타이드 합성 및 분리

펩타이드를 합성하기 위하여, 일반적인 펩타이드 고상 합성법 (Wang C. Chan, Perter D. White, “Fmoc Solid phase peptide synthesis”, Oxford)에 따라서 진행하였다. 보다 구체적으로, 자동합성기 (ASP48S, Peptron, Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 N-말단부터 하나씩 커플링 (coupling)하였다.

펩타이드 변이체 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 트리틸 (trityl, Trt), tert-부틸옥시카보닐 (t-Boc), t-부틸 (t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다.

커플링제 (Coupling reagent)로는 HBTU (2-(1H-Benzotirazloe-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate / HOBt (Hydroxybenzotriazloe) / NMM (N-Methylmorpholine)을 사용하였다.

또한 아래 사용되는 일부 펩타이드들에 대하여, 최종 peptide의 N-말단은 acetylation (-CH₃CO) 시키고, C-말단은 amidation (-NH₂) 시켜, 각각의 말단을 보호할 수 있도록 하였다.

(1) 보호된 아미노산(8당량)과 커플링제 HBTU(8당량) / NMM(16당량)을 DMF (Dimethyl formamide)에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. (2) Fmoc 제거는 20%(v/v) Piperidine / DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다. 상기 (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드를 만들었다.

이후, Resin 및 아미노산 보호기에서의 펩타이드 분리는 TFA (Trifluoroacetic acid) / EDT(1,2-ethanedithiol) / Thioanisole / TIS (Triisopropylsilane) / H₂O (혼합비(중량기준)= 90 / 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5)을 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰고, 얻어진 침전물을 원심 분리시켜 완전히 침전시킨 후 과량의 TFA, EDT, Thioanisole 및 TIS 등을 1차로 제거하였다. 동일한 절차를 2회 반복하여 고형화 시킨 침전물을 얻었다. 얻은 침전물을 C18 column (250mm × 22 mm, 10μm, Vydac Everest, USA)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 기기(Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1% (v/v) TFA를 포함하는 Water - Acetonitrile liner gradient (Acetonitrile 농도: 10~75%(v/v)) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩타이드의 분자량은 LC/MS(Shimadzu LC/Mass-2020, Japan)로 확인하였고, 순수 정제된 분획물을 동결 건조시켜 백색 분말형태의 펩타이드를 얻었다.

위와 같은 방법을 통하여 하기 실험에 사용될 펩타이드들을 합성하였다.

실시예 2. 펩타이드의 N-말단에 S-nitrosylation을 통한 펩타이드 합성

실시예 2-1. NO-CPP-0xNLS: Acetyl-C(SNO)GRKKRRQRRR-NH ₂ (서열번호 33)

시스테인의 티올기에 니트로화 반응이 필요한 상기 펩타이드(서열번호 33) 30 mg 를 물과 아세토니트릴 (1:19 부피 비) 30 ml에 녹이고 4℃로 냉각한 후 t-BuNO₂100 μl를 적가하여 60 분동안 교반하며 반응시켰다. 구체적으로 본 실시예에서 사용된 상기 펩타이드는 N-말단의 시스테인을 아세틸화하고 C-말단을 아미드화하여 말단을 보호한 것을 사용하였다. 모든 반응은 암막 조건 하에 수행되었으며, 반응 후에 동결 건조하여 미색의 분말 형태인 펩타이드를 얻었다.

구체적으로, 합성된 펩타이드의 서열과 머무름 시간 및 분자량을 하기 및 도 1에 나타내었다.

Rt= 8.392 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 1568.8 m/e, [M+Na⁺] = 1588

위 확인할 수 있는 바와 같이, 합성된 펩타이드의 정확한 질량값을 통해 N-말단에 S-nitrosylation이 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 2-2. NO-CPP-1xNLS : Acetyl-C(SNO)GRKKRRQRRRPKKKRKV-NH ₂ (서열번호 30)

시스테인의 티올기에 니트로화 반응이 필요한 상기 펩타이드(서열번호 30) 30 mg 를 물과 아세토니트릴 (1:19 부피 비) 30 ml에 녹이고 4℃로 냉각한 후 t-BuNO₂100 μl를 적가하여 60 분동안 교반하며 반응시켰다. 구체적으로 본 실시예에서 사용된 상기 펩타이드는 N-말단의 시스테인을 아세틸화하고 C-말단을 아미드화하여 말단을 보호한 것을 사용하였다. 모든 반응은 암막 조건 하에 수행되었다. 그리고 나서, 동결 건조하여 미색의 분말 형태인 펩타이드를 얻었다.

구체적으로, 합성된 펩타이드의 서열과 머무름 시간 및 분자량을 하기 및 도 2에 나타내었다.

Rt= 6.158 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 2433.4 m/e, [M+Na⁺] = 2455

실시예 2-3. NO-CPP-2xNLS : Acetyl-C(SNO)GRKKRRQRRRPKKKRKVPKKKRKV-NH ₂ (서열번호 31)

시스테인의 티올기에 니트로화 반응이 필요한 상기 펩타이드(서열번호 31) 30 mg 를 물과 아세토니트릴 (1:19 부피 비) 30 ml에 녹이고 4℃로 냉각한 후 t-BuNO₂100 μl를 적가하여 60 분동안 교반하며 반응시켰다. 구체적으로 본 실시예에서 사용된 상기 펩타이드는 N-말단의 시스테인을 아세틸화하고 C-말단을 아미드화하여 말단을 보호한 것을 사용하였다. 모든 반응은 암막 조건 하에 수행되었다. 그리고 나서, 동결 건조하여 미색의 분말 형태인 펩타이드를 얻었다.

구체적으로, 합성된 펩타이드의 서열과 머무름 시간 및 분자량을 하기 및 도 3에 나타내었다.

Rt= 5.983 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 3298.0 m/e, [M+H+] = 3319

실시예 3. 형광인자가 구비된 세포 내 핵으로 이동하는 펩타이드의 제조

상기 실시예 2에서와 유사한 방법을 이용하여 로다민이 세포 투과성 펩타이드에 연결된 융합 폴리펩타이드와 대조군 융합 폴리펩타이드를 제조하였다.

실시예 3-1. Rhodamine-CPP (Cell permeable peptide)-0xNLS (nuclear localization sequence): Rhodamine B-CGRKKRRQRRR-NH ₂

Rt (room temperature)= 5.525 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW (distilled water)/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 1922.4 m/e, [M+H+] = 1922

실시예 3-2. Rhodamine-CPP-1xNLS: Rhodamine B-CGRKKRRQRRRPKKKRKV-NH ₂

Rt= 5.417 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 2787.0 m/e, [M+H+] = 2787

실시예 3-3. Rhodamine-CPP-2xNLS: Rhodamine B-CGRKKRRQRRRPKKKRKVPKKKRKV-NH ₂

Rt= 5.358 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 3651.6 m/e, [M+H+] = 3652

실시예 3-4. Rhodamine-CPP-3xNLS: Rhodamine B-CGRKKRRQRRRPKKKRKVPKKKRKVPKKKRKV-NH ₂

Rt= 5.317 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 4516.2 m/e, [M+H+] = 4516

실시예 3-5. CPP-2xNLS (peptide only): Acetyl-CGRKKRRQRRRPKKKRKVPKKKRKV-NH ₂

Rt= 6.325 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 3269.1 m/e, [M+H+] = 3270

실시예 4. 세포질 및 세포 내 핵으로 이동하는 펩타이드의 확인

위 실시예 3-1 내지 3-5에서 합성한 펩타이드를 이용하여, 이들 펩타이드가 세포 내 핵으로 이동하는지 여부를 확인하였다.

Rhodamine-CPP 펩타이드(실시예 3-1 내지 3-5)를 편도유래 중간엽 줄기세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSCs)에 3시간 동안 5 μM로 처리하고 난 후 세포를 획득하여 FACS 기기를 이용하여 세포 내 rhodamine의 양을 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각각의 Rhodamine-CPP 펩타이드들(0x: 실시예 ３-1, 1x: 실시예 3-2, 2x: 실시예 3-3, 3x: 실시예 3-4)의 경우 세포 내 투과력에 차이 없이 모두 세포를 투과하여 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 확인하였다.

또한, 이러한 세포내 투과 및 핵 내 도달을 confocal microscopy를 이용하여 확인하였다. 위와 유사하게 편도유래 중간엽 줄기세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSCs)에 2시간 동안 20 μM로 처리하고 나서 confocal microscopy를 이용하여 세포를 확인하였다. 또한, 세포 핵은 Hoechst 33342로 염색하여 핵내 펩타이드의 도달을 확인하였다.

그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 서열은 핵 내로 이동한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시예 3-3에 따른 서열이 핵 내로 가장 많이 도달한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 처리 시간에 따른 세포내 투과 및 핵 내 도달을 confocal microscopy를 이용하여 확인하고, 이를 도 7 및 8에 나타내었다.

도 7 및 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 약 2시간에 세포의 핵 내로 도달하는 펩타이드의 양이 가장 많았음을 확인하였다.

상기 결과들로부터 세포 투과성 서열, 또는 세포 투과성 서열 및 세포 소기관 표적 서열을 포함하는 경우 세포 내 및/또는 세포 내 세포 소기관으로 융합 폴리펩타이드 서열의 전달이 이루어지는 것을 확인하였다.

실시예 5. S-니트로실화(S-nitrosylation)시킨 펩타이드의 NO 방출 확인

실온 상태의 PBS buffer (pH 7.4)에 용해된 50 μM의 농도의 각각의 상기 실시예 2-1 내지 2-3에서 합성된 펩타이드들의 일산화질소 방출을 NO sensor (ISO-NOP, World Precision Instruments (WPI), Sarasota, USA)를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 확인되는 바와 같이 N-말단의 시스테인을 S-니트로실화(S-nitrosylation)시킨 본 발명에 따른 펩타이드들은 일산화질소를 방출함으로써 일산화질소 공여체로 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 6. 세포 핵에서 일산화질소 (nitric oxide, NO)를 발생시키는 펩타이드의 확인

각각의 상기 실시예 2-1 내지 2-3에서 합성된 펩타이드들의 핵 내 일산화질소 방출을 확인하였다. 구체적으로, 각각의 실시예 2-1 내지 2-3의 NO-CPP-NLS 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 4시간 처리하고 씻어낸 후, NO를 염색하는 4-Amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM diacetate)를 이용하여 염색을 수행하였다. 그리고 나서, 핵내 NO 발생을 확인하여 이를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2-1의 펩타이드는 세포질 내에서 NO를 발생시키는 것을 보여주었다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 2-2 및 2-3의 펩타이드(1x: 실시예 2-2, 2x: 실시예 2-3)들은 세포 핵에 NO를 발생시키는 것을 보여주었다.

실시예 7. 펩타이드의 세포 독성 확인

실시예 2-3(NO-CPP-2xNLS) 및 실시예 3-5(CPP-2xNLS)의 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 농도별로 처리한 후 살아있는 세포 및 죽어있는 세포를 확인하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, NO 치환 유무에 상관없이 본 발명에 따른 펩타이드는 정상 세포를 사멸하지 않음을 보여주었다.

실시예 8. 본 발명에 따른 펩타이드의 편도 유래 중간엽 줄기세포 성장에 미치는 영향 확인

실시예 2-3(NO-CPP-2xNLS) 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 여러 농도(1, 10, 100 μM)로 4시간 동안 처리한 후, 이를 씻어내었다. 그리고 나서, 24시간 혹은 48시간 동안 세포 배양하여 BrdU assay를 수행하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포에 실시예 2-3(NO-CPP-2xNLS) 펩타이드의 처리는 100 μM 농도로 처리하였을 때 세포 증식을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 본 발명에 따른 펩타이드의 편도 유래 중간엽 줄기세포 분화에 미치는 영향 확인

실시예 2-3에서 합성된 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 100 μM의 농도로 4시간 처리하고 씻어낸 후, 4일, 7일, 14일 동안 뼈 분화 배양액 (osteogenic differentiation medium, (StemPro™ Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco, cat no. A1007201)))으로 배양시키고 Alizarin red S로 염색하여 뼈 분화 정도를 분석하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 기존에 널리 사용되는 NO donor인 S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)는 분화에 효과가 없었지만, 본발명에 따른 NO-CPP-2xNLS 펩타이드는 매우 빠른 시간에 뼈 분화를 촉진시키는 것을 확인하였다.

또한, 편도 유래 중간엽 줄기세포 이외에 다른 세포에서 본 발명에 따른 펩타이드의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 지방유래 중간엽 줄기세포 (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, AMSCs)와 골수유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)에 100 μM 농도의 NO-CPP-2xNLS 펩타이드를 4시간 처리하고 씻어 낸 후, 7일 동안 뼈 분화를 시키고 Alizarin red S 염색을 수행하였다.

그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드가 성체줄기세포로 지방 유래 및 골수 유래 중간엽 줄기세포에서도 빠른게 뼈 분화를 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 본 발명에 따른 펩타이드의 중간엽 줄기세포 유전자 발현에 미치는 영향 분석

실시예 2-3의 펩타이드와 실시예 3-5의 펩타이드를 100 μM의 농도로 편도 유래 중간엽 줄기세포에 4시간 동안 처리하고 씻어 낸 후, 7일 동안 뼈 분화 배양액으로 배양시키고 뼈 세포의 표지 유전자인 osteocalcin과 osteopontin mRNA의 발현양을 quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)로 분석하였다.

그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2-3의 펩타이드이 처리는 osteocalcin을 약 3배, osteopontin을 약 9배의 수준으로 증진시키는 효과를 보여주었다.

실시예 11. 본 발명에 따른 펩타이드의 중간엽 줄기세포 분화 유도 인자 확인

위 실시예들에서 확인할 수 있는 바와 같이, 핵에서 NO를 발생시키는 실시예 2에 펩타이드들이 줄기세포에서 매우 빠른 (4 혹은 7일) 기간에 뼈 세포로의 분화를 촉진시키는 것과 함께 뼈 세포 염색 표지자 및 유전자의 발현 증가를 시키는 것을 확인하였다.

이러한 현상은 줄기세포의 분화와 관련된 신호전달물질의 발현조절에 따라 일어날 것으로 예상되기 때문에, 줄기세포의 분화와 관련된 유전자의 발현 분석하였다.

특히, 여러 논문에서 보고한 Yes-associated protein (YAP)이 embryonic stem cells과 같은 pluripotent stem cells의 분화능 (stemness)을 조절하는 중요한 인자이고, 또한 이 유전자의 발현이 특정 세포로 분화하는데 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 또한 YAP은 현재 줄기세포뿐만 아니라 암세포의 전이, 성장, 암줄기세포 (cancer stem cells)의 자가증식(self-renewal)에도 매우 중요하다고 보고되어 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 YAP과 뼈 세포 유전자 특히 osteocalcin 혹은 osteopontin 발현을 조절한다고 알려진 전사 물질인 Runx2의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 2-3에 따른 펩타이드를 편도 유래 중간엽 줄기세포에 4시간 동안 처리한 후 이의 발현 변화를 확인하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, Runx2는 증가되고 YAP은 현저하게 감소됨을 확인하였다. YAP은 배아줄기세포 및 암줄기세포의 분화능을 유지시켜 줄기세포의 분화를 억제하는데 본 발명에 따른 NO 발생 펩타이드를 처리하면 매우 빠른 시간에 YAP의 발현을 억제시켜 뼈 세포로의 분화 속도를 빠르게 앞당기는 것을 보여주는 것이다.

실시예 12. 본 발명에 따른 펩타이드의 항암 효과 확인

위 실시예 2-3에 따른 펩타이드를 유방암 세포주 MDA-MB-231 에 여러 농도로 처리하고 4시간 동안 처리하고나서, 48시간 동안 세포 배양하여 BrdU assay를 수행하였다.

그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 NO 발생 펩타이드의 경우 암세포에서 농도 의존적으로 이의 성장을 억제하였다.

또한, 40 μM로 1시간 동안 유방암 세포주 MDA-MB-231 에 처리하고나서 세포 질 및 핵에서 YAP 및 PARP의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, YAP의 단백질 발현이 세포질과 핵에서 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 일산화질소의 핵 내 전달용 융합 펩타이드는 일산화질소를 핵 내 특이적으로 전달하는 것을 보여준다.

이를 통해 줄기세포가 다양한 세포로 분화하는 것을 조절할 수 있고, 암줄기세포의 분화에 적용된다면 (예컨대, 암세포가 더 이상 암화 기능이 없는 1차 세포로 완전히 분화되는 경우 등), 향후 암치료제 등의 개발에도 이용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 줄기세포 분화 촉진, 특히 조골세포로의 분화능이 우수함을 확인하였다. 그리고 펩타이드 자체가 항암 효과를 가짐으로서 항암제로 이용도 확인하였다.

이외에도 핵내 일산화질소 전달을 통해 일산화질소가 관여할 수 있는 생체 내 다양한 생리현상 (예를 들어, 혈관 확장, 세포 성장 조절) 등에 적용하여, 다양한 용도로 이용될 수 있다.

위 결과들을 고려할 때, 본 발명의 융합 펩타이드는 세포 내 및/또는 세포 내 소기관으로 일산화질소를 특이적 및 효율적으로 전달할 수 있다. 이에 따라 줄기세포가 다양한 세포로 분화하는 것을 조절할 수 있고, 암줄기세포의 분화에 적용된다면 향후 암 치료제 등의 개발에도 이용될 수 있다. 더욱이, 줄기세포 분화 촉진, 특히 조골세포로의 분화능이 우수하며, 그 자체로써 항암제로 이용도 가능하다. 즉, 세포 내 및/또는 세포 내 소기관 내 일산화질소 전달을 통해 일산화질소가 관여할 수 있는 생체 내 다양한 생리현상을 조절하여 다양한 응용이 가능하다는 장점을 가진다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Fusion peptide for nitric oxide delivery and use thereof <130> ewha164 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-1 Tat <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Penetratin <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV VP22 <400> 3 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTS <400> 4 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transportan <400> 5 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-1 <400> 6 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly arginine <400> 7 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD-5 <400> 8 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 NLS <400> 9 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoplasmin NLS <400> 10 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc NLS <400> 11 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc NLS <400> 12 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRNPA1 M9 NLS <400> 13 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IBB Domain NLS <400> 14 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myoma T NLS <400> 15 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myoma T NLS <400> 16 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 NLS <400> 17 Pro Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-abl IV NLS <400> 18 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus NS1 NLS <400> 19 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus NS1 NLS <400> 20 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis delta virus antigen NLS <400> 21 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mx1 NLS <400> 22 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(ADP-ribose) polymerase NLS <400> 23 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Steroid hormone receptor glucocorticoid NLS <400> 24 Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys 1 5 10 15 Lys <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mitochondria target sequence derived from mitochondrial 3-oxoacyl-coenzyme-A <400> 25 Met Ala Leu Leu Arg Gly Val Phe Ile Val Ala Ala Lys Arg Thr Pro 1 5 10 15 Phe Gly Ala Tyr Gly Cys 20 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endoplasmic reticulum target sequence <400> 26 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 27 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peroxisome target sequence <400> 27 Ser Lys Leu 1 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peroxisome target sequence <400> 28 Pro Glu Ala Leu Ile Lys Ser Met Thr Ser Lys Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysosome target sequence <400> 29 Lys Phe Glu Arg Gln 1 5 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NO-CPP-1xNLS <220> <221> MUTAGEN <222> (1) <223> S-H -> S-NO <400> 30 Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NO-CPP-2xNLS <220> <221> MUTAGEN <222> (1) <223> S-H -> S-NO <400> 31 Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NO-CPP-3xNLS <220> <221> MUTAGEN <222> (1) <223> S-H -> S-NO <400> 32 Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 30 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NO-CPP-0xNLS <220> <221> MUTAGEN <222> (1) <223> S-H -> S-NO <400> 33 Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine Mutation (S-H -> S-NO) <400> 34 Cys 134

Claims

N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 소기관 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인은 시스테인의 SH기를 S-NO기로 치환한 것인 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열인 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 세포 내 소기관 표적 펩타이드는 세포내 소기관으로 핵, 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 리소좀 및 퍼옥시좀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 표적하는 것인 세포 내 소기관 표적 펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 세포 내 소기관 표적 펩타이드는 서열번호 9 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열이며, 선택된 서열을 1개, 2개 또는 3개 반복하여 포함하는 것인 세포 내 소기관 표적 펩타이드.
제1항에 있어서, N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 세포 투과성 펩타이드; 및 적어도 하나의 세포 내 핵 표적 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 세포 내 소기관 표적 펩타이드는 서열번호 9 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포 내 핵 표적 서열이며, 선택된 서열을 1개, 2개 또는 3개 반복하여 포함하는 것인 세포 내 소기관 표적 펩타이드.
N-말단의 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
제8항에 있어서, 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열인 융합 폴리펩타이드.
제8항 또는 제9항에 따른 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 일산화질소 전달용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내 소기관 표적 일산화질소 전달용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드를 포함하는 염증성 질환, 암, 혈관질환 또는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
제13항에 있어서, 상기 서열번호 9의 아미노산 서열을 2개 포함하는 융합 폴리펩타이드.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 핵 표적 일산화질소 전달용 조성물.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 백혈병, 골수증식 장애, 골수이형성 증후군, 림프종, 고환암, 두경부암, 식도암, 위암, 간암, 소장암, 담낭암, 직장암, 항문암, 육종, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 골암, 신장암, 흑색종, 결장암, 난소암, 폐암, 중추 신경계암, 다발성 골수종, 피부암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물.
제18항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 및 표피줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분화 조절용 조성물.
N-말단에 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 시스테인, 서열번호 1의 아미노산 서열, 및 적어도 1개에서 3개의 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함하는 시험관 내 암세포의 증식 억제용 조성물.