WO2005097180A1 - Antigene tat dimerique et ses applications pour la vaccination anti-vih. - Google Patents

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WO2005097180A1
WO2005097180A1 PCT/FR2005/000796 FR2005000796W WO2005097180A1 WO 2005097180 A1 WO2005097180 A1 WO 2005097180A1 FR 2005000796 W FR2005000796 W FR 2005000796W WO 2005097180 A1 WO2005097180 A1 WO 2005097180A1
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PCT/FR2005/000796
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Pascal Drevet
Evelyne Lajeunesse
Alain Lecoq
Michel Leonetti
André Menez
Gervaise Moine
Robert Thai
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Commissariat A L'energie Atomique
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a dimeric Tat antigen and to its applications for anti-HIV vaccination.
  • Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is a sexually transmitted disease caused by the human immunodeficiency virus (HIV type 1 (HIV-1) or type 2 (HIV-2)). This disease is in constant progression and to date more than 42 million people are infected worldwide. This is why the development of a vaccine represents an absolute emergency to fight against this pandemic. Many vaccine approaches have been developed over the past twenty years without leading to the development of an effective vaccine. However, the ever-deeper knowledge of the infectious cycle and of the viral proteins responsible for progression to the AIDS stage has opened the way to the use of promising new vaccine targets: the regulatory proteins of HIV.
  • Tat is a transcription factor essential for viral replication, (Fisher et al, Nature, 1986, 320: 367-371) which can both activate latent HIV and deregulate the expression of other cellular genes, to the extent where it has the particularity of being released by infected cells and incorporated into other infected or uninfected cells (transcellular transport; Ensoli et al., J Virol, 1993, 67: 277-287; Chang et al., Aids, 997, 11: 1421-1431). Tat has been shown to have toxic effects in vitro.
  • Tat has many biological activities and could play a role, both in viral dissemination and in pathogenesis: progression to the AIDS stage and pathologies associated with AIDS, such as Kaposi's sarcoma.
  • the Tat gene includes 2 exons coding for a protein of 99 to 103 amino acids depending on the strains of HIV.
  • Exon 1 which codes for the first 72 amino acids, has total transactivation activity, and includes 5 domains: (1) the N-terminal domain rich in acid residues (positions 1 to 21), which is important for interaction with cellular proteins, (2) the cysteine-rich domain (positions 22 to 37) containing 7 highly conserved cysteine residues (positions 22, 25, 27, 30, 31, 34 and 37), involved in transactivation, ( 3) the central domain (core) corresponding to positions 38 to 48, also involved in transactivation, (4) the basic domain (positions 49 to 57), which includes the sequences involved in nuclear localization, transcellular transport and binding to the TAR response element (Trans-activation response) of the viral LTR, which is also involved in the binding of Tat to heparin, and (5) the domain rich in glutamines (positions 50 to 72).
  • Exon 2 of variable size code for the C-terminal domain (positions 73 at the C-terminal end) which does not have transactivation activity but contains the RGD motif (arginine-glycine-aspartate; positions 78 to 80) , necessary for the binding of Tat to integrin receptors.
  • the Tat protein of 99 to 103 amino acids
  • a Tat derivative inactivated by substitution of cysteines 22 and 37 with serines is immunogenic (Caselli et al., J. Immunol., 1999, 162, 5631-5638) and a Tat derivative inactivated by carboxymethylation of cysteines using hydrophilic groups is immunogenic and capable of inducing a slowdown in the progression of the disease in monkeys (Pauza et al., PNAS, 2000, 97, 3515-3519).
  • Tat capable of inducing protective immunity in a reproducible manner
  • the recombinant or synthetic Tat protein isolated and purified, combines in solution to form very stable oligomers (dimers and trimers), particularly resistant to denaturation and reduction (100 mM DTT; Tosi et al., Eur. J; Immunol., 2000, 30: 1120-1126).
  • the preparations of Tat are heterogeneous and include a mixture of monomers, dimers and trimers (US Patent Application 2003/0158134).
  • Tat oligomers have been suggested; the existence of disulfide bridges notably involving cysteine at position 37 or other strong chemical interactions, notably involving polyvalent cations, preferably divalent (zinc, cadmium) has been suggested (Battaglia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 701, 708; Frankel et al., Science, 1988, 240: 70-73).
  • disulfide bridges notably involving cysteine at position 37 or other strong chemical interactions, notably involving polyvalent cations, preferably divalent (zinc, cadmium) has been suggested (Battaglia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 701, 708; Frankel et al., Science, 1988, 240: 70-73).
  • the relative role of different forms of Tat in viral infection has not been elucidated and their role in anti-viral immunity has not been studied.
  • the Tat oligomers have no biological activity insofar as, on the one hand, the extracellular Tat protein produced from mammalian cells is monomeric and, on the other hand, the inhibition of the Transactivating activity of Tat using antibodies specifically recognizing the different forms of Tat, indicates that only the monomer is capable of entering cells and of transactivating viral LTR (Rice et al, Virology, 1991, 185: 451 -454; Tosi et al., Supra).
  • a non-immunogenic monomeric Tat derivative can become immunogenic in the absence of adjuvant, provided that it forms a dimer, indicating that the self-adjuvant property of Tat results from its mediated oligomerization, in particular by a disulfide bridge.
  • These results could in particular explain the protective effect of Tat in the absence of adjuvant, previously observed in a vaccination trial in monkeys (Cafaro et al., Cited above).
  • the inventors have shown that the self-adjuvant property of Tat is independent of its transactivation activity.
  • several Tat derivatives lacking transactivation activity are immunogenic in the absence of adjuvant. Such characteristics are found in particular in a dimer derived from a Tat protein.
  • the dimeric form of Tat represents a potentially more effective vaccine than the vaccines of the prior art, insofar as it contains only the immunogenic form of Tat but not the monomer which is inactive in the absence of adjuvant .
  • the Tat dimer represents a homogeneous and perfectly defined vaccine, making it possible to obtain reproducible results.
  • a subject of the present invention is therefore an anti-HIV vaccine composition comprising a Tat antigen, characterized in that said antigen consists of a homo- or hetero-dimer of Tat protein (s) and / or of fragment ( s) at least 20 amino acids of said proteins.
  • Tat antigen is understood to mean a Tat protein or a fragment of this protein of at least 20 amino acids, capable of inducing a specific humoral and / or cellular response in a human or animal mammal; said Tat antigen is either biologically active or inactivated by: (i) mutation of the Tat gene sequence, in particular by substitution in serine (s), of cysteine residue (s) from the region rich in cysteines (International Applications WO 95/31999, WO 03/057885 and WO 99/27958, Caselli et al., Cited above), (ii) physical (uradiation) or chemical treatment (action of an aldehyde, oxidation), (International Applications WO 96/27389) , WO 99/33872, Patent application US 2003/0215797 and Cohen et al., PNAS, 1999, 96, 10842-10847), (iii) purification of the recombinant Tat protein by a process allowing the elimination of RNA and contamin
  • the invention encompasses vaccine compositions comprising a dimeric Tat antigen derived from a Tat protein or from a Tat fragment, modified by: - substitution and / or deletion, and / or addition of one or more amino acids in the sequence Tat protein, modification of at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain of Tat, in particular by replacement with a bond different from the bond -CO-NH- (methylene amino, carba, ketomethylene, thioamide, etc.) or by introduction of a link of retro or retro-inverso type, and / or, - substitution of at least one amino acid of the peptide chain of
  • non-proteinogenic amino acid residue is meant any amino acid which does not form part of a natural protein or peptide, in particular any amino acid whose carbon carrying the side chain R, namely the group - CHR-, located between -CO- and -NH- in the natural peptide chain, is replaced by a motif which does not form part of the constitution of a natural protein or peptide.
  • Tat dimer The term Tat dimer is understood to mean a homo- or hetero-dimer formed from the association of Tat monomers (proteins and / or fragments) identical or different from one another, by one or more covalent bonds and / or not covalent.
  • covalent dimers result in particular from the formation of one of the following bonds: (i) a disulfide bridge, (ii) a pseudo-peptide bond, for example oxime or acylhydrazone, (iii) an amide or thioether bond , formed for example using a hetero-bifunctional reagent such as the N- (alpha-maleimido-acetoxy) succimide ester.
  • a disulfide bridge e.g., oxime or acylhydrazone
  • an amide or thioether bond formed for example using a hetero-bifunctional reagent such as the N- (alpha-maleimido-acetoxy) succimide ester.
  • the covalent dimer can result from the action of homo- or hetero-bifunctional reagents known to those skilled in the art.
  • the sulfhydrile group of each of the two Tat molecules which allows the formation of the intermolecular disulfide bridge is located either on a cysteine present in the amino acid sequence of Tat, or on a cysteine or a cysteine derivative introduced into said sequence, in particular by addition or by substitution of an amino acid of said sequence for cysteine or a cysteine derivative or by modification of a cysteine for a cysteine derivative, or alternatively on another amino acid residue which is modified by a homo- or hetero-reactant bifunctional.
  • - non-covalent bond The non-covalent dimers can be formed by means of leucine-zipper type units or polyvalent, preferably divalent cations, such as zinc or cadmium.
  • Tat protein or Tat is meant the Tat protein of any strain of HIV (HIV-1 or HIV-2), corresponding to a sequence of approximately 86 to 103 amino acids, depending on the strains .
  • the Tat dimer is formed by the covalent association of Tat protein (s) and / or fragment (s) of said proteins.
  • the Tat dimer comprises at least one intermolecular disulfide bond.
  • said intermolecular disulfide bond involves cysteine residues (identical or different) of said Tat proteins and / or of said fragments, preferably said cysteine residues are chosen from those located in position 22, 25, 27, 30, 31, 34, and 37 of the amino acid sequence of Tat, preferably among the cysteine residues in position 22, 34 and 37.
  • the cysteine residues of Tat which are not involved in said disulfide bond intermolecular are either blocked by a bond, in particular with an S-tert-butyl group, or else by an interaction, in particular with polyvalent cations, preferably divalent, or substituted by another amino acid residue not comprising a group sulfhydrile, especially a serine.
  • the Tat dimer is formed by the non-covalent association of Tat protein (s) and / or fragment (s) of said proteins.
  • said non-covalent association is formed by means of polyvalent cations, preferably divalent ones such as in particular zinc or cadmium.
  • said Tat proteins and the fragments of said proteins are previously inactivated, in particular by substitution of at least one of the cysteine residues in position 22, 25, 27, 30, 31 , 34 and 37, in serine; preferably at least one of the cysteine residues in position 25, 27, 30 and 31 is substituted in serine.
  • the dimer is formed from the association by a disulfide bridge between the residues of cysteine in position 34, of Tat protein (s) and / or of fragment (s) of said proteins including the substitution of the six cysteine residues in position 22, 25, 27, 30, 31 and 37, in serines.
  • the dimer is formed from the association by a disulfide bridge between the cysteine residues in position 22, Tat proteins and / or fragments of said proteins including the substitution of the six cysteine residues in position 25, 27, 30, 31, 34 and 37, in serines.
  • said Tat protein is the Tat protein of 101 amino acids (Tat101; positions 1 to 101).
  • said Tat protein is the Tat protein of 86 amino acids (Tat86; positions 1 to 86).
  • said fragment of Tat includes at least one B epitope and one T epitope which are immunodominant.
  • said immunodominant B epitope is located in the N-terminal domain (positions 1 to 21) and / or said immunodominant T epitope is located in the central domain (positions 38 to 48).
  • the Tat dimer when the Tat dimer consists of the non-covalent association of Tat fragment (s) or of a Tat fragment with a Tat protein, by means of polyvalent cations, preferably divalent, the or said fragment (s) also include the domain rich in cysteines (positions 22 to 37).
  • said Tat fragment comprises from 20 to 50 amino acids, preferably between 25 and 35 amino acids.
  • said Tat fragment is fragment 1 to 48.
  • said dimeric Tat antigen is derived from the protein of sequence SEQ ID NO: 1 and / or from a fragment of at least 20 amino acids of this sequence, as defined above.
  • said vaccine composition comprises at least one other HIV antigen, in particular Rev, Nef, Gag, Env or a fragment of at least 11 amino acids of said antigens.
  • it consists of a dimeric Tat antigen as defined above, a pharmaceutically acceptable vehicle, and / or a carrier substance, and optionally another HIV antigen, such as defined above.
  • the vaccine composition according to the invention is immunogenic in the absence of adjuvant. It comes in a dosage form suitable for parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous), enteral (oral, sublingual), or local (rectal, vaginal) administration.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles and the carrier substances are those conventionally used.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unila ellary or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral-like particles (virus-like particles), saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide)) or gold, and nanoparticles.
  • the present invention also relates to a dimeric Tat antigen as defined above, as a vaccine intended for the prevention and / or treatment of an HIV infection in humans.
  • the present invention also relates to the use of a dimeric Tat antigen as defined above, for the preparation of a vaccine intended for the prevention and / or treatment of an HIV infection in humans. .
  • the present invention also relates to an isolated Tat dimer, selected from the group consisting of: a) a heterodimer of Tat proteins or of fragments of said proteins, as defined above, b) a homodimer of fragments of Tat proteins such as defined above; said Tat proteins being defined by proteins of 86 to 103 amino acids as specified above, this definition notably excludes the non-covalent dimer of the Tat protein of 86 amino acids (Tat86), formed via zinc or cadmium;
  • said isolated Tat dimer it is a homodimer of fragments of Tat proteins or a heterodimer of a Tat protein and of a Tat fragment, associated by a disulfide bridge between the residues of cysteine in position 22 or 34, each of said proteins and said fragments including the substitution in serines, of the six cysteine residues, respectively in position 25, 27, 30, 31, 34 and 37, and in position 22, 25, 27, 30 , 31 and 37.
  • the Tat protein and its fragments, as well as the Tat dimers derived from the above, as defined above, are prepared by the conventional techniques known to those skilled in the art. More specifically: - the Tat protein and its fragments can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Me ⁇ ifield et al. (J. Am. Chem.
  • the Tat protein and its fragments can also be produced from the corresponding cDNAs, obtained by any appropriate means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the host cells modified by the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography, - the covalent dimers of Tat are prepared by oxidation of the cysteine residues of a preparation of Tat protein (s) and / or fragment (s) of said proteins as defined above, and non-covalent Tat dimers are prepared by contacting a preparation of Tat protein (s) and / or fragment (s) of said proteins as defined above, with polyvalent cations, preferably divalent such as zinc and cadmium, at a pH of approximately 6 to 9.
  • polyvalent cations preferably divalent such as zinc and cadmium
  • the dimeric Tat antigens according to the invention have the following advantages compared to the antigens of the prior art: - they are immunogenic in the absence of adjuvant, - they are homogeneous (preparation by reproducible processes) and well defined.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of use of the dimeric Tat antigen of the present invention, as well as to the drawings annexed in which: - Figure 1 illustrates the anti-Tat antibody response of BALB / c mice immunized in the presence of adjuvant. Groups of four mice were immunized subcutaneously with the Tat101 protein emulsified in complete Freund's adjuvant or aluminum hydroxide.
  • FIG. 1 illustrates the anti-Tat antibody response of BALB / c mice, immunized in the presence or absence of an adjuvant. Groups of four mice were immunized with Tat101, either in PB S (Tat101) or emulsified in aluminum hydroxide (Tat101 / alum). The animals received two injections 14 days apart, either subcutaneously or intraperitoneally.
  • FIG. 3 illustrates the T cell response of BALB / c mice immunized with Tat101.
  • BALB / c mice were immunized with two injections per route subcutaneous, 14 days apart, Tat101 in PBS.
  • the spleens were harvested and the splenocytes were tested by serial dilutions of Tat or chicken egg lyzozyme (HEL).
  • FIG. 5 illustrates the identification of molecular determinants involved in the self-adjuvant property of Tat101.
  • FIG. 5 A represents the amino acid sequence of Tat101 (wild type) and the substitutions made in the five derivatives of Tat101.
  • FIGS. 5 A represents the amino acid sequence of Tat101 (wild type) and the substitutions made in the five derivatives of Tat101.
  • 5B and 5C represent the anti-Tat antibody response, measured by the reverse of the antibody titers in ELISA, in BALB / c mice immunized with (B), Tat101, Tat101C (22-37) S, Tat101RGD, GE and TatlOlpolyQ and (C) TatlOl, TatlOlcore and Tatl01D5I, P6L.
  • B the anti-Tat antibody response
  • Tat101C 22-37
  • S Tat101RGD
  • GE and TatlOlpolyQ and
  • C TatlOl, TatlOlcore and Tatl01D5I, P6L.
  • the mice received two injections, subcutaneously, 14 days apart, and blood samples were taken 14 and 28 days after the second injection.
  • - Figure 6 illustrates the role of cysteine residues of Tat101 in the induction of the humoral response .
  • FIG. 7 illustrates the role of Tat oligomers formed by disulfide bonds in the anti-Tat antibody response, in the absence of adjuvant.
  • FIG. 7 A illustrates the electrophoresis of Tat101 C (22-37) S after denaturation, and of Tat101 after denaturation in the presence or in the absence of reducing agent.
  • FIG. 7B represents the anti-Tat antibody response after immunization of BALB / c mice with Tat101, Tat101C (22-37) S or Tat101C (22-31; 37) S, C34dimer in the absence of adjuvant.
  • the mice received two injections, subcutaneously, 14 days apart and blood samples were taken 14 and 28 days after the second injection.
  • FIG. 8 illustrates the absence of co ⁇ elation between the transactivating activity and the self-adjuvant property of Tat101.
  • a Hela cell line stably transfected with a reporter plasmid coding for the green fluorescent protein EGFP under the control of the HIV-1 LTR promoter, was transiently transfected with plasmids coding for Tat101 or its Tat101C derivatives.
  • Tatl01RGD (22-37) S, Tatl01RGD, KGE, TatlOlpolyQ, Tatl01C (25,27) S, and Tatl01C (30,31) S.
  • the cells were trypsinized and the expression of EGFP was measured on living cells, by flow cytometry.
  • Figure 9 illustrates the analysis by electrophoresis using a non-crosslinked gel, of a preparation of oligomeric forms of Tat.
  • Tat101 is incubated in PBS buffer, pH 7.4, for different times (T), at room temperature, in the dark, without shaking.
  • the Tat samples incubated in PBS are then incubated with maleimide (20 mM), so as to block the reactive cysteines and avoid the formation of disulfide bridges during denaturation or migration of the samples in the gel.
  • the Tat samples are then denatured in the presence of SDS, at 95 ° C, for 7 minutes before loading onto the chip.
  • Tat protein corresponds to that of the NDK isolate of HIV-1 (Groenink et al., J. Virol., 1991, 65, 1968-1975), which represents the consensus sequence obtained from 66 sequences of primary HIV-1 isolates reported in the SWISSPROT and TrEMBL databases between 1999 and 2000.
  • This protein hereinafter called Tat101, corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 in the list of sequences attached in the appendix.
  • each amino acid Fmoc is carried out using the dicyclohexylcarboiimide / 1-hydroxy-7azabenzotriazole pair; the coupling is carried out in the presence of 0.25M diisopropylethylamine / N-methyl py ⁇ olidone.
  • the incorporation of the glutamine residue (Gin 54 ) was carried out manually, twice, as follows: 1 mmol of Fmoc Gln 54 (Trt) - OH and 522 ⁇ l of diisopropylethylamine (3 mmoles) in 2 ml of dimethylsulfoxide anhydrous were added to the resin, then 1 mmol of 2- (l-hydroxy-7-azabenzotriazol- l-yl) -1, l, 3.3 tetramethyluronium hexafluorophosphate in 2 ml of N-methyl py ⁇ olidone, and the coupling a one hour at room temperature.
  • the cleavage of the resin and the deprotection (1 h and 30 min) are carried out by mixing the dried resin (under vacuum overnight), with 10 ml of a solution of trifluoroacetic acid (TFA: 9.5) / triisopropylsilane (0.25) / water (0.25; V / V / V). After filtration on a frit, the reaction mixture is precipitated twice in 100 ml of cooled tert-butyl methyl ether (4 ° C), centrifuged for 15 minutes at 2500 rpm. The solid obtained is dissolved in 50 ml of a 15% aqueous solution of acetic acid, then lyophilized.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the crude synthesis obtained is purified by high performance liquid chromatography (HPLC) in reverse phase, on a semi-preparative column C4 (21x 250 mm, 5 ⁇ M, 300 ⁇ JUPITER).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the homogenized fraction for each synthesized derivative protected by S (tBu) is characterized by its amino acid composition and by mass spectrometry.
  • the deprotection of blocked cysteines was carried out by incubating, at room temperature, 1 mg of Tat protein in 1 ml of phosphate buffer. 0.1 M degassed sodium, pH 8.5, containing 6M urea and dithiothreitol (50 equivalents of dithiothreitol per cysteine residue).
  • the reaction progress is monitored by high performance liquid chromatography (CHLP) in reverse phase, on a C4 semi-preparative column (21 ⁇ 250 mm, 5 ⁇ M, 300 ⁇ JUPITER). After 2 hours, the reaction appears quantitative, the reaction mixture is acidified to pH 2.2 with an aqueous solution of TFA / H 2 O (50/50; NN), then diluted with an aqueous solution of TFA H 2 O (1/999; NN) in a final volume of 50 ml. The reaction mixture is then purified by high performance liquid chromatography (CHLP) in reverse phase, on a C4 semi-preparative column (21x 250 mm, 5 ⁇ M, 300 ⁇ JUPITER).
  • CHLP high performance liquid chromatography
  • TatlOl derivatives The homogenized fraction for each derivative synthesized is characterized by its amino acid composition and by mass spectrometry. Aliquots were prepared and the protein was lyophilized and stored at -20 ° C. A similar strategy was used to produce the following TatlOl derivatives: Tatl01C (22-37) S, Tatl01RGD, KGE and TatlOlpolyQ, TatlOlcore and Tatl01D5I, P6L Tatl01C (25.27) S, Tatl01C (30.31) S, Tatl01C (22,34,37) S and Tat101C (22-31; 37) S, C34 dimer, as well as the 18 peptides of 15 amino acids in length, with an overlap of 5 amino acids, representing the sequence of Tat101.
  • Tat101 or of the mutant derivatives Tat101C (22-37) S, Tat101RGD, KGE and Tat101PolyQ, Tat101C (25.27 ) S and Tat101C (30,31) S was reconstituted from 8 overlapping synthetic nucleotide primers, representing the sequence of the entire Tat gene coding for one of the abovementioned proteins, flanked by the Nco I restriction sites and Hind III.
  • the primers were hybridized by their complementary regions, then the hybridization product obtained was amplified by polymerase chain reaction (PCR), using the primers above, corresponding to the 5 'and 3' ends of the Tat gene. , flanked by Nco I or Hind III restriction sites.
  • the PCR amplification fragment was then digested with Nco I and Hind III and the restriction fragment of 304 bp thus obtained was cloned at the same sites of the expression vector pTriEx-1 ( ⁇ OVAGE ⁇ ) to give the recombinant plasmid called p3X -TAT.
  • This vector allows the expression of Tat in E.
  • the covalent Tat dimers are prepared by oxidation of the cysteine residues in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8, at ambient temperature (approximately 20 ° C.).
  • the non-covalent Tat dimers are prepared by contacting a preparation of the Tat protein or of a fragment of said protein as defined above, with polyvalent cations, preferably divalent ones such as zinc and cadmium. , at a pH of approximately 6 to 9.
  • Example 2 Tat immunogenicity 1
  • Methods a) Immunization of mice To evaluate the humoral response, BALB / c mice 6 to 8 weeks old (IFFA CREDO) received, either by intraperitoneally, either subcutaneously at the base of the tail, 100 ⁇ l of a solution containing 5 ⁇ g of Tat101, or of a derivative of Tat, prepared as described in Example 1.
  • the proteins were previously- ment dissolved in PBS just before preparation of the emulsions with Freund's adjuvant or aluminum hydroxide (reference 77120, PIERCE). A second injection was made after 14 days and blood samples were then taken at different intervals after this immunization.
  • Tat was first injected into a complete adjuvant emulsion and then into an incomplete adjuvant emulsion.
  • BALB / c mice received two injections, 14 days apart, of Tat101 in PBS, subcutaneously at the base of the tail. The rats were taken 10 days after immunization of the mice.
  • b) Titration of the antibodies in ELISA The protein Tat101 or one of its derivatives, prepared as described in example 1, were adsorbed on an ELISA plate, overnight at + 4 ° C., at 0.1 ⁇ g / well in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.4.
  • the plates were then saturated with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.3% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the antisera were diluted serially in the same buffer containing 0.1% BSA and incubated in the wells overnight at 4 ° C.
  • Antibody binding is measured using a goat anti-mouse antibody conjugated to peroxidase and ABTS as a substrate.
  • the titers are defined by the highest dilution of serum for which the absorbance value is at least 0.6 greater than that of the negative control consisting of a mixture of sera collected before the immunization of the mice.
  • T cell stimulation test The spleens of the immunized mice were removed and dilated.
  • the splenocytes were suspended in a proliferation medium containing 1% fetal calf serum.
  • the cells 5 ⁇ 10 5 cells / well) were cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere with 7% CO 2 , in the presence of serial dilutions of the various antigens.
  • the presence of IL-2 in the culture supernatants was determined after a 24-hour period by measuring the proliferation of an IL-2 dependent cytotoxic T cell line (CTLL), using tritiated thymidine. ([ 3 H] TdR, 5 Ci / mmol, AMERSHAM). Cell proliferation was measured after 3 days of culture, followed by an 18 hour incubation in the presence of methyl 3 H thymidine.
  • FIG. 2 shows that an anti-Tat antibody response is observed when Tat101 is injected in the absence of adjuvant.
  • the highest immune response was obtained when Tat101 is injected alone by the subcutaneous route, whereas this route is not very effective when the protein is premixed with aluminum hydroxide.
  • intraperitoneal injections induce similar anti-Tat antibody responses, in the presence or absence of an adjuvant.
  • FIG. 3 shows that the cells of immunized mice produce IL-2 when they are incubated in the presence of Tat101 but not in the presence of HEL. On the contrary, no secretion of IL-2 was observed with the splenocytes of naive mice. Although they secrete IL-2, the spleen cells of mice immunized with Tat do not proliferate in the presence of Tat (Figure 3B). The reason for this difference between IL-2 production and proliferation remains unknown. However, the results indicate that, in the absence of an adjuvant, Tat can induce specific T cells which are functional for the secretion of IL-2.
  • Example 3 Mapping of Tat B Epitopes in the Presence or in the Absence of Adjuvant
  • FIG. 4A shows that the sera of mice immunized with Tat without adjuvant mainly bind peptides 1 and 2, and to a lesser extent peptide 18, indicating that the 1-20 region of Tat101 is an immuno-dominant region B when the protein is injected in the absence of an adjuvant.
  • the additional recognition of peptides 15 and 16 by the sera of mice immunized with Tat previously mixed with Freund's adjuvant or aluminum hydroxide indicates that other antigenic sites are located in the region 71-90 ( Figure 4B and 4C).
  • the detection of other epitopes in the 71-90 region may be related to denaturation of the immunogen by the adjuvants.
  • Example 4 Identification of the molecular determinants of Tat involved in its capacity to induce an immune response in the absence of adjuvant 1) Method To identify the molecular determinants involved in the self-adjuvant property of Tat101, mutations were introduced into the regions of Tat responsible for some of its biological and immunological properties. Most of Tat's activities involve molecular determinants located in five distinct regions of the molecule: the N-terminal region (positions 1 to 9), the cysteine-rich region (positions 22-37), the core (positions 38-48) , the basic region (positions 49-57) and the integrin receptor binding region (positions 78-80). A series of five Tat derivatives, each substituted in one of the abovementioned regions, was prepared (FIG.
  • Aspartic acid at position 5 and proline at position 6 were respectively substituted by an isoleucine and a leucine in the derivative Tat101D5I, P6L.
  • the 7 cysteine residues have been replaced by 7 serines in the Tat101C (22-37) S derivative.
  • the charged and hydrophobic residues of the core have been replaced by glutamines, while the residues of serine and threonine have been replaced by alanines in the derivative Tat101 core.
  • the 2 lysine residues and the 6 arginine residues from the basic region were replaced by 8 glutamines in the Tat1010polyQ derivative.
  • FIG. 5B shows that the TatlOlpolyQ and TatlOlRDG.KGE derivatives are as immunogenic as wild-type TatlOl, indicating that the basic region and the integrin receptor binding sequence are not involved in the self-adjuvant property.
  • cysteines 25 and 27 which form a motif of CXC chemokines involved in the antagonism of CXCR4 in humans, have been replaced by two serines.
  • the cysteines 30 and 31 which form a motif of CC chemokines involved in the chemotaxis of monocytes and polynuclear cells, have been replaced by two serines.
  • the three cysteines have been replaced by three serines.
  • Tat protein and its derivatives were separated by electrophoresis on a gel consisting of a non-crosslinked polymer forming dynamic pores and analyzed on a bioanalyzer (Agilent 2100, AGILENT TECHNOLOGIES), using the Protein 50 Plus LabChip kit (AGILENT TECHNOLOGIES).
  • the chips were prepared according to the protocol provided by the manufacturer; the channels of the chip were filled with the mixture of gel and fluorescent marker used for the detection of proteins.
  • Tat101 and its derivatives were dissolved in PBS buffer, then denatured in the presence of SDS, at 95 ° C., for 7 minutes before their loading onto the chip.
  • FIG. 6 shows that the anti-Tat antibody responses obtained with Tat101C (25.27) S and Tat101C (30.31) S are not significantly different from that obtained against the wild-type protein.
  • Tat101C (22-37) S which is devoid of self-adjuvant activity, consists of a homogeneous monomeric form ( Figure 7A).
  • Tat101 consists of a monomeric form and two oligomeric forms ( Figure 7A).
  • these oligomeric forms are not observed when Tat101 is incubated in the presence of an excess of reducing agent, which indicates that the oligomers result from the spontaneous formation of intermolecular disulfide bridges ( Figure 7A).
  • Tat101C (22-37) S could become immunogenic in the absence of adjuvant when it became dimeric.
  • serine residue 34 of Tat101C (22-37) S was replaced by a cysteine, in order to prepare a dimer mediated by a disulfide bridge (Tat101C (22-31; 37) S, C34dimer).
  • Tat101C (22-31; 37) S, C34 dimer migrates in a single band co ⁇ esponding to a Tat dimer which is reduced in the presence of 'an excess of reducing agent.
  • the immunogenicity of Tat101, Tat101 C (22-37) S and Tat101C (22-31; 37) S, C34 dimer was then compared in BALB / c mice.
  • FIG. 7B shows that no anti-Tat antibody response is observed with Tat101C (22-37) S while Tat101C (22-31; 37) S, C34 dimer induces a humoral response close to that observed with the Tat protein wild.
  • a non-immunogenic monomeric Tat derivative can become immunogenic in the absence of adjuvant, provided that it forms a dimer mediated by a disulfide bridge indicating that the self-adjuvant property of Tat results from its spontaneous oligomerization mediated by a disulfide bridge.
  • Example 6 Analysis of the Possible Role of Transactivation in the Self-Adjuvanting Property of Tat101 1) Methods A reporter plasmid, called pLTR-G, comprising the gene of the green fluorescent protein EGFP under the transcriptional control of the LTR of HIV-1, was constructed and stably transfected into Hela cells. More specifically, the LTR sequence of the AVR-2 isolate of HIV-1 (Jones et al., Cu ⁇ . Opin.
  • Hela cells were stably transfected with the plasmid pLTR-G, cloned by limiting dilution and then transiently transfected with a plasmid expressing Tat101.
  • the clone best overexpressing EGFP in the presence of Tat101 was selected.
  • the Hela cell line stably transfected with the reporter plasmid was then transiently transfected, with an expression plasmid, either of wild-type Tat protein or for one of its mutants (300 ng of plasmid for 2x10). 4 cells), as described in Example 1. After 45 hours of incubation at 37 ° C., the fluorescence of the transfected cells was analyzed by flow cytometry. 2) Results
  • the main activity of Tat being the transactivation of the viral genome, the relationship between the self-adjuvant effect of Tat and the transactivation activity was studied.
  • Figure 8 shows that EGFP is overexpressed in cells
  • the protein Tat 101 prepared as described in Example 1 is diluted in PBS buffer, pH 7.4 (58 ⁇ M final), then incubated for different times, at room temperature, in the dark, without shaking.
  • the appearance of the oligomeric forms is examined by electrophoresis using a non-crosslinked gel, as described in Example 5, except that before the denaturation step (heating at 95 ° C. for 7 min , in the presence of SDS), the Tat samples are preincubated with maleimide (20 mM), so as to block the reactive cysteines and avoid the formation of disulfide bridges during denaturation or migration of the samples in the gel.

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Abstract

La présente invention est relative à une composition vaccinale anti-VIH comprenant un antigène Tat dimérique et à ses applications pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme.

Description

ANTIGENE TAT DIMERIQUE ET SES APPLICATIONS POUR LA VACCINATION ANTI-VIH La présente invention est relative à un antigène Tat dimérique et à ses applications pour la vaccination anti-VIH. Le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) est une maladie sexuellement transmissible provoquée par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH de type 1 (VIH-1) ou de type 2 (VIH-2)). Cette maladie est en progression constante et à ce jour plus de 42 millions de personnes sont infectées dans le monde. C'est pourquoi la mise au point d'un vaccin représente une urgence absolue pour lutter contre cette pandémie. De nombreuses approches vaccinales ont été développées depuis près de vingt ans sans aboutir à la mise au point d'un vaccin efficace. Cependant, la connaissance toujours plus approfondie du cycle infectieux et des protéines virales responsables de la progression vers le stade SIDA a ouvert la voie vers l'utilisation de nouvelles cibles vaccinales prometteuses : les protéines régulatrices du VIH. Ces protéines, qui avaient tout d'abord été délaissées, font depuis quelques années l'objet de nombreux travaux en raison de leur rôle dans la réplication virale. Parmi ces protéines, le régulateur transcriptionnel Tat de VIH, représente une cible vaccinale particulièrement intéressante, dans la mesure où l'absence de progression vers le stade SIDA est coπélée à la présence d'anticorps anti-Tat de haut titre et de cellules cytotoxiques spécifiques (Zagury et al., J Hum Virol 1998,1 : 282-292 ; Re et al., J Clin Virol, 2001, 21 : 81-89 ; Van Baalen et al., J Gen Virol 1997, 78: 1913-1918). Tat est un facteur de transcription essentiel à la réplication virale, (Fisher et al, Nature, 1986, 320:367-371) qui peut à la fois activer le VIH latent et déréguler l'expression d'autres gènes cellulaires, dans la mesure où il possède la particularité d'être libéré par les cellules infectées et incorporé dans d'autres cellules infectées ou non (transport transcellulaire ; Ensoli et al., J Virol, 1993, 67:277-287 ; Chang et al., Aids, 997, 11:1421-1431). Il a été montré que Tat a des effets toxiques in vitro. Ces effets comprennent : la dérégulation des signaux cellulaires impliqués dans l'apoptose, la dérégulation de l'expression de parties de gènes du système immunitaire tel que le gène de l'interleukine 2 et de l'interféron alpha, ou des gènes codant pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et de classe II, et/ou l'induction d'angiogénèse. Ainsi, Tat possède de nombreuses activités biologiques et pouπait jouer un rôle, tant dans la dissémination virale que dans la pathogenèse : progression vers le stade SIDA et pathologies associées au SIDA, comme le sarcome de Kaposi. Le gène Tat comprend 2 exons codant pour une protéine de 99 à 103 acides aminés selon les souches de VIH. L'exon 1 qui code pour les 72 premiers acides aminés, possède une activité de transactivation totale, et comprend 5 domaines : (1) le domaine N-terminal riche en résidus acides (positions 1 à 21), qui est important pour l'interaction avec des protéines cellulaires, (2) le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37) contenant 7 résidus de cystéine fortement conservées (positions 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37), impliqué dans la transactivation, (3) le domaine central (core) coπespondant aux positions 38 à 48, également impliqué dans la transactivation, (4) le domaine basique (positions 49 à 57), qui comprend les séquences impliquées dans la localisation nucléaire, le transport transcellulaire et la liaison à l'élément de réponse TAR (Trans-activation response) du LTR viral, et qui est également impliqué dans la liaison de Tat à l'héparine, et (5) le domaine riche en glutamines (positions 50 à 72). L'exon 2 de taille variable, code pour le domaine C- terminal (positions 73 à extrémité C-terminale) qui ne possède pas d'activité de transactivation mais contient le motif RGD (arginine-glycine-aspartate ; positions 78 à 80), nécessaire pour la liaison de Tat aux récepteurs des intégrines. Outre, la protéine Tat de 99 à 103 acides aminés, il existe également une protéine tronquée de 86 acides aminés, produite in vitro par génération d'un codon stop en position 87, du fait de la mutation du VIH, lors du passage en culture cellulaire. Il a été montré qu'une protéine Tat biologiquement active (Cafaro et al, Nat. Med., 1999, 5, 643-650 et Demande Internationale PCT WO 99/27958) ) ou une protéine Tat dont l'aptitude à transactiver la transcription du génome viral et éventuellement l'effet suppresseur sur la prolifération des cellules T ont été préala- blement inactivés, peuvent contribuer à la mise en place d'un vaccin anti-VIH efficace. En particulier, un dérivé de Tat inactivé par substitution des cystéines 22 et 37 par des serines est immunogène (Caselli et al., J. Immunol., 1999, 162, 5631-5638) et un dérivé de Tat inactivé par carboxyméthylation des cystéines à l'aide de groupements hydrophiles est immunogène et capable d'induire un ralentissement de la progression de la maladie chez le singe (Pauza et al., P.N.A.S., 2000, 97, 3515-3519). Toutefois, la structure moléculaire de Tat capable d'induire une immunité protectrice, et ce de façon reproductible n'est pas connue. En effet, il a été montré que la protéine Tat recombinante ou synthétique, isolée et purifiée, s'associe en solution pour former des oligomères (dimères et trimères) très stables, particulièrement résistants à la dénaturation et à la réduction (100 mM DTT ; Tosi et al., Eur. J ; Immunol. , 2000, 30 : 1120-1126). Ainsi, les préparations de Tat sont hétérogènes et comprennent un mélange de monomères, de dimères et de trimères (Demande de Brevet US 2003/0158134). Néanmoins, la nature exacte des interactions impliquées dans la formation des oligomères de Tat n'est pas connue ; l'existence de ponts disulfures impliquant notamment la cystéine en position 37 ou d'autres interactions chimiques fortes, impliquant notamment des cations polyvalents, de préférence divalents (zinc, cadmium) a été suggérée (Battaglia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 701, 708 ; Frankel et al., Science, 1988, 240 : 70-73). En outre, le rôle relatif des différentes formes de Tat dans l'infection virale n'a pas été élucidé et leur rôle dans l'immunité anti-virale n'a pas été étudié. En effet, il semblerait que les oligomères de Tat ne possèdent aucune activité biologique dans la mesure où, d'une part la protéine Tat extracellulaire produite à partir de cellules de mammifère est monomérique et que, d'autre part l'inhibition de l'activité transactivatrice de Tat à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement les différentes forme de Tat, indique que seul le monomère est capable d'entrer dans les cellules et de transactiver le LTR viral (Rice et al, Virology, 1991, 185 : 451-454 ; Tosi et al., précité). Les Inventeurs ont montré que de façon surprenante un dérivé de Tat monomérique non immunogène peut devenir immunogène en l'absence d'adjuvant, à condition de former un dimère, indiquant que la propriété auto-adjuvante de Tat résulte de son oligomérisation, médiée, notamment par un pont disulfure. Ces résultats pouπaient notamment expliquer l'effet protecteur de Tat en l'absence d'adjuvant, précédemment observé dans un essai de vaccination chez le singe (Cafaro et al., précité). En outre, les Inventeurs ont montré que la propriété auto-adjuvante de Tat est indépendante de son activité de transactivation. Ainsi, plusieurs dérivés de Tat dépourvus d'activité de transactivation sont immunogènes en l'absence d'adjuvant. De telles caractéristiques, sont en particulier retrouvées chez un dimère dérivé d'une protéine Tat. Par conséquent la forme dimérique de Tat, représente un vaccin potentiellement plus efficace que les vaccins de l'art antérieur, dans la mesure où il ne contient que la forme immunogène de Tat mais pas le monomère qui est inactif en l'absence d'adjuvant. En outre, le dimère de Tat représente un vaccin homogène et parfaitement défini, permettant d'obtenir des résultats reproductibles. La présente invention a en conséquence pour objet, une composition vaccinale anti-VIH comprenant un antigène Tat, caractérisée en ce que ledit antigène est constitué d'un homo- ou hétéro-dimère de protéine(s) Tat et/ou ou de fragment(s) d'au moins 20 acides aminés desdites protéines. Définitions • antigène Tat On entend par antigène Tat, une protéine Tat ou un fragment de cette protéine d'au moins 20 acides aminés, capable d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire spécifique chez un mammifère humain ou animal ; ledit antigène Tat est, soit biologiquement actif, soit inactivé par : (i) mutation de la séquence du gène Tat, notamment par substitution en sérine(s), de résidu(s) de cystéine de la région riche en cystéines (Demandes Internationales WO 95/31999, WO 03/057885 et WO 99/27958, Caselli et al., précité), (ii) traitement physique (uradiation) ou chimique (action d'une aldéhyde, oxydation), (Demandes Internationales WO 96/27389), WO 99/33872, Demande de brevet US 2003/0215797 et Cohen et al., P.N.A.S., 1999, 96, 10842-10847), (iii) purification de la protéine Tat recombinante par un procédé permettant l'élimination de l'ARN et de l'endotoxine contaminants (Demande Internationale WO 03/073984). L'invention englobe les compositions vaccinales comprenant un antigène Tat dimérique dérivé d'une protéine Tat ou d'un fragment de Tat, modifiés par : - substitution et/ou suppression, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la protéine Tat, - modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique de Tat, notamment par remplacement par une liaison différente de la liaison -CO-NH- (méthylène amino, carba, cétométhylène, thioamide....) ou par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso, et/ou, - substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de
Tat, par un résidu d'acide aminé non protéinogénique. Par résidu d'acide aminé non protéinogénique, on entend tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel, notamment tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer la Norleucine (Nie) et la cyclohexylalanine (CHA). - modification d'acides aminés de la séquence de Tat : les résidus d'acides aminés de Tat ou du fragment de Tat qui sont modifiés possèdent une chaîne latérale comprenant une fonction réactive : -OH [serine (S), thréonine (T) ou tyrosine (Y)], -SH [cystéine (C)], -NH2 [lysine (K) ou arginine (R)], -COOH [acide aspartique (D) ou acide glutamique (E)]. • Dimère de Tat On entend par dimère de Tat, un homo- ou hétéro-dimère formé de l'association de monomères de Tat (protéines et/ou fragments) identiques ou différents entre eux, par une ou plusieurs liaisons covalentes et/ou non covalentes. - liaison covalente Les dimères covalents résultent notamment de la formation d'une des liaisons suivantes : (i) un pont disulfure, (ii) une liaison pseudo-peptidique, par exemple oxime ou acylhydrazone, (iii) une liaison amide ou thio-éther, formée par exemple à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel tel que le N-(alpha-maléimido- acétoxy) succimide ester. De manière générale, le dimère covalent peut résulter de l'action de réactifs homo- ou hétéro-bifonctionnels connus de l'Homme du métier. En outre, le groupement sulfhydrile de chacune des deux molécules de Tat qui permet la formation du pont disulfure intermoléculaire est situé, soit sur une cystéine présente dans la séquence en acides aminés de Tat, soit sur une cystéine ou un dérivé de cystéine introduit dans ladite séquence, notamment par addition ou par substitution d'un acide aminé de ladite séquence en cystéine ou en dérivé de cystéine ou par modification d'une cystéine en dérivé de cystéine, ou bien encore sur un autre résidu d'acide aminé qui est modifié par un réactif homo- ou hétéro-bifonctionnel. - liaison non-covalente Les dimères non-covalents peuvent être formés par l'intermédiaire de motifs du type leucine-zipper ou de cations polyvalents, de préférence divalents, comme le zinc ou le cadmium. • protéine Tat On entend par protéine Tat (ou Tat), la protéine Tat de n'importe quelle souche de VIH (VIH-1 ou VIH-2), coπespondant à une séquence d'environ 86 à 103 acides aminés, selon les souches. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, le dimère de Tat est formé par l'association covalente de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines. De préférence le dimère de Tat comprend au moins une liaison disulfure intermoléculaire. De manière préférée, ladite liaison disulfure intermoléculaire implique des résidus de cystéine (identiques ou différents) desdites protéines Tat et/ou desdits fragments, de préférence lesdits résidus de cystéine sont choisis parmi ceux situés en position 22, 25, 27, 30, 31, 34, et 37 de la séquence en acides aminés de Tat, de manière préférée parmi les résidus de cystéine en position 22, 34 et 37. Conformément à l'invention, les résidus de cystéine de Tat qui ne sont pas impliqués dans ladite liaison disulfure intermoléculaire sont, soit bloqués par une liaison, notamment avec un groupement S-tertio-butyle, ou bien par une interaction, notamment avec des cations polyvalents, de préférence divalents, soit substitués par un autre résidu d'acide aminé ne comprenant pas de groupement sulfhydrile, notamment une serine. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, le dimère de Tat est formé par l'association non-covalente de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines. De préférence, ladite association non-covalente est formée par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents comme notamment le zinc ou le cadmium. Selon une disposition avantageuse des modes de réalisation précé- dents de ladite composition, lesdites protéines Tat et les fragments desdites protéines sont préalablement inactivés, notamment par substitution d'au moins un des résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en serine ; de préférence au moins un des résidus de cystéine en position 25, 27, 30 et 31 est substitué en serine. Par exemple, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 34, de protéine(s) Tat et/ou ou de fragment(s) desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37, en serines. Alternativement, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en serines. Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ladite protéine Tat est la protéine Tat de 101 acides aminés (TatlOl ; positions 1 à 101). Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ladite protéine Tat est la protéine Tat de 86 acides aminés (Tat86 ; positions 1 à 86). Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ledit fragment de Tat inclus au moins un épitope B et un épitope T immunodominants. De préférence, ledit épitope B immunodominant est situé dans le domaine N-terminal (positions 1 à 21) et/ou ledit épitope T immunodominant est situé dans le domaine central (positions 38 à 48). En outre, lorsque le dimère de Tat est constitué par l'association non-covalente de fragment(s) de Tat ou d'un fragment de Tat avec une protéine Tat, par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents, le ou lesdit(s) fragment(s) incluent également le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37). Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ledit fragment de Tat comprend de 20 à 50 acides aminés, de préférence entre 25 et 35 acides aminés. De préférence, ledit fragment de Tat est le fragment 1 à 48. Selon encore une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ledit antigène Tat dimérique dérive de la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 et/ou d'un fragment d'au moins 20 acides aminés de cette séquence, tel que défini ci-dessus. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition vaccinale, elle comprend au moins un autre antigène du VIH, notamment Rev, Nef, Gag, Env ou un fragment d'au moins 11 acides aminés desdits antigènes. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition vaccinale, elle est constituée par un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse, et éventuellement un autre antigène du VIH, tel que défini ci-dessus. La composition vaccinale selon l'invention est immunogène en l'absence d'adjuvant. Elle se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (rectale, vaginale). Les véhicules pharmaceutiquement acceptables et les substances porteuses sont ceux classiquement utilisés. Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unila ellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les particules de type viral (virus-like particles), les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules. La présente invention a également pour objet un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, comme vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. La présente invention a également pour objet un dimère de Tat isolé, sélectionné dans le groupe constitué par : a) un hétérodimère de protéines Tat ou de fragments desdites protéines, tel que défini ci-dessus, b) un homodimère de fragments des protéines Tat tel que défini ci- dessus ; lesdites protéines Tat étant définies par des protéines de 86 à 103 acides aminés comme précisé ci-dessus, cette définition exclut notamment le dimère non- covalent de la protéine Tat de 86 acides aminés (Tat86), formé par l'intermédiaire de zinc ou de cadmium ; Selon un mode de réalisation avantageux dudit dimère de Tat isolé, il s'agit d'un homodimère de fragments de protéines Tat ou un hétérodimère d'une protéine Tat et d'un fragment de Tat, associés par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22 ou 34, chacune desdites protéines et desdits fragments incluant la substitution en serines, des six résidus de cystéine, respectivement en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, et en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37. La protéine Tat et ses fragments, ainsi que les dimères de Tat dérivés des précédents, tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier. De manière plus précise : - la protéine Tat et ses fragments peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Meπifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) (1964) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, - la protéine Tat et ses fragments peuvent également être produits à partir des ADNc coπespondants, obtenus par tout moyen approprié connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procary ote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules hôtes modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité, - les dimères covalents de Tat sont préparés par oxydation des résidus de cystéine d'une préparation de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines tels que définis ci-dessus, et les dimères non-covalents de Tat sont préparés par mise en contact d'une préparation de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines tels que définis ci-dessus, avec des cations polyvalents, de préférence divalents comme le zinc et le cadmium, à pH d'environ 6 à 9. Les antigènes Tat dimériques selon l'invention présentent les avantages suivants par rapport aux antigènes de l'art antérieur : - ils sont immunogènes en l'absence d'adjuvant, - ils sont homogènes (préparation par des procédés reproductibles) et bien définis. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'antigène Tat dimérique de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la réponse en anticorps anti-Tat de souris BALB/c immunisées en présence d'adjuvant. Des groupes de quatre souris ont été immunisés par voie sous-cutanée avec la protéine TatlOl émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine. 14 jours plus tard, les animaux ont reçu une seconde injection constituée de Tat émulsifiée dans de l'adjuvant incomplet de Freund (en blanc) ou de l'hydroxyde d'alumine (en gris). Des échantillons de sang on été prélevés 11, 21, 33 et 70 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat dans les sérums a été analysée en ELISA. Les valeurs indiquées coπespondent à l'inverse des titres en anticorps. - la figure 2 illustre la réponse en anticorps anti-Tat de souris BALB/c, immunisées en présence ou en l'absence d'adjuvant. Des groupes de quatre souris ont été immunisés avec TatlOl, soit dans du PB S (TatlOl), soit émulsifiée dans de l'hydroxyde d'alumine (TatlOl/alum). Les animaux ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle, soit par voie sous-cutanée, soit par voie intrapéritonéale. Des échantillons de sang on été prélevés 14, 28, 45 et 60 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat dans les sérums a été analysée en ELISA. Les valeurs indiquées coπespondent à l'inverse des titres en anticorps. - la figure 3 illustre la réponse cellulaire T de souris BALB/c immunisées avec TatlOl. Des souris BALB/c ont été immunisées par deux injections par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle, de TatlOl dans du PBS. Dix jours après la seconde injection, les rates ont été récoltées et les splénocytes ont été éprouvés par des dilutions en série de Tat ou de lyzozyme d'œuf de poule (HEL). Après une période de culture de 24 heures : (A) chaque surnageant a été testé pour sa capacité à stimuler l'incorporation de 3H thymidine par des cellules CTLL dépendantes de l'IL-2, et (B) la prolifération des splénocytes a été mesurée après 3 jours de culture, suivis de 18 heures d'incubation avec de la H thymidine. - la figure 4 illustre la cartographie des épitopes B de la protéine TatlOl. Dix huit peptides chevauchants de TatlOl, d'une longueur de 15 acides aminés chacun, ont été adsorbés sur les puits d'une plaque ELISA. La capacité des sérums, dilués au 1/120, à se fixer sur ses peptides a été mesurée en ELISA, après une nuit d'incubation à 4°C. Les sérums testés sont les suivants : sérum dirigé contre TatlOl dans du PBS (A), sérum dirigé contre TatlOl émulsifiée dans de l'hydroxyde d'alumine (B), ou de l'adjuvant de Freund (C), et sérum contrôle (D). - la figure 5 illustre l'identification des déterminants moléculaires impliqués dans la propriété auto-adjuvante de TatlOl. La figure 5 A représente la séquence en acides aminés de TatlOl (type sauvage) et les substitutions effectuées dans les cinq dérivés de TatlOl. Les figures 5B et 5C représentent la réponse en anticorps anti-Tat, mesurée par l'inverse des titres en anticorps en ELISA, chez des souris BALB/c immunisées avec (B), TatlOl, Tatl01C(22-37)S, Tatl01RGD, GE et TatlOlpolyQ et (C) TatlOl, TatlOlcore et Tatl01D5I,P6L. Dans chacun des cas, les souris ont reçu deux injections, par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle, et des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection. - la figure 6 illustre le rôle des résidus de cystéine de TatlOl dans l'induction de la réponse humorale. Des groupes de quatre souris BALB/c ont été immunisés par voie sous-cutanée avec TatlOl, Tatl01C(25,27)S, Tatl01C(30,31)S ou Tatl01c(22,34,37)s- Les souris ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle, des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat a été analysée en ELISA. - la figure 7 illustre le rôle des oligomères de Tat formés par des liaisons disulfures dans la réponse en anticorps anti-Tat, en l'absence d'adjuvant. La figure 7 A illustre l'électrophorèse de TatlOl C(22-37)S après dénaturation, et de TatlOl après dénaturation en présence ou en l'absence d'agent réducteur. La figure 7B représente la réponse anticorps anti-Tat après immunisation de souris BALB/c avec TatlOl, Tatl01C(22-37)S ou Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère en l'absence d'adjuvant. Les souris ont reçu deux injections, par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle et des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection. - la figure 8 illustre l'absence de coπélation entre l'activité transactivatrice et la propriété auto-adjuvante de TatlOl. Une lignée de cellules Hela transfectée de façon stable avec un plasmide rapporteur codant pour la protéine fluo- rescente verte EGFP sous le contrôle du promoteur du LTR de VIH-1, a été transfectée de façon transitoire avec des plasmides codant pour TatlOl ou ses dérivés Tatl01C(22-37)S, Tatl01RGD,KGE, TatlOlpolyQ, Tatl01C(25,27)S, et Tatl01C(30,31)S. Après 45 heures d'incubation, les cellules ont été trypsinées et l'expression de l'EGFP a été mesurée sur les cellules vivantes, par cytométrie de flux. - la figure 9 illustre l'analyse par électrophorèse à l'aide d'un gel non réticulé, d'une préparation de formes oligomériques de Tat. TatlOl est incubée dans du tampon PBS, pH 7,4, pendant différents temps (T), à température ambiante, dans le noir, sans agitation. Les échantillons de Tat incubés dans du PBS sont ensuite incubés avec du maléimide (20 mM), de façon à bloquer les cystéines réactives et éviter la formation de ponts disulfure lors de la dénaturation ou de la migration des échantillons dans le gel. Les échantillons de Tat sont ensuite dénaturés en présence de SDS, à 95°C, pendant 7 minutes avant leur chargement sur la puce. Ligne 1 : T= 0 min ; Ligne 2 : T= 1 heure ; Ligne 3 : T= 24 heures ; Ligne 4 : T= 5 jours. Au bout de 5 jours, la préparation de Tat est majoritairement constituée du dimère ; le monomère est indétectable et la proportion de trimère est très faible. Exemple 1 : Préparation de Tat et de ses dérivés La protéine Tat coπespond à celle de l'isolât NDK du VIH-1 (Groenink et al., J. Virol., 1991, 65, 1968-1975), qui représente la séquence consensus obtenue à partir de 66 séquences d'isolats primaires de VIH-1 rapportées dans les bases de données SWISSPROT et TrEMBL entre 1999 et 2000. En outre, dans cette séquence, la méthionine N-terminale qui peut-être oxydée de façon spontanée au cour des étapes de purification, a été remplacée par une Norleucine qui est isostérique et non-oxydable. Cette protéine, dénommée ci-après TatlOl, coπespond à la séquence SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquences jointe en annexe. 1) Synthèse chimique de Tat et de ses dérivés La synthèse chimique de Tat et de ses dérivés est réalisée en phase solide sur un appareil APPLIED BIOSYSTEMS 433A, en utilisant la stratégie Fmoc/tert-butyle connue de l'Homme du métier. Les sept résidus de cystéine de la région riche en cystéines sont protégés par un groupement S-tertio-butyle (S(tBu)). Brièvement, l'échelle de synthèse est de 1 mM, soit 500 mg de résine Fmoc- Asp(OtBu)-PAL-PEG-PS à 0,2 mmol/g pour TatlOl et 1 mM de chaque acide aminé protégé est utilisé à chaque cycle de couplage. L'activation de chaque acide aminé Fmoc est réalisée en utilisant le couple dicyclohexylcarboiimide/l-hydroxy-7azabenzotriazole ; le couplage est réalisé en présence de 0,25M diisopropyléthylamine/N-méthyle pyπolidone. L'incorporation du résidu de glutamine (Gin54) a été réalisée manuellement, à deux reprises, de la manière suivante : 1 mmole de Fmoc Gln54(Trt)- OH et 522 μl de diisopropyléthylamine (3 mmoles) dans 2 ml de diméthylsufoxyde anhydre ont été ajoutés à la résine, puis 1 mmole de 2-(l-hydroxy-7-azabenzotriazol- l-yl)-l,l,3,3 tétraméthyluronium hexafluorophosphate dans 2 ml de N-méthyle pyπolidone, et le couplage a été réalisé une heure à température ambiante. Le clivage de la résine et la déprotection (1 h et 30 min) sont réalisés en mélangeant la résine séchée (sous vide pendant une nuit), à 10 ml d'une solution d'acide trifluoroacétique (TFA : 9,5)/triisopropylsilane (0,25)/eau (0,25 ; V/V/V). Après filtration sur fritte, le mélange réactionnel est précipité deux fois dans 100 ml d'éther tertio-butyle méthylique refroidi (4° C), centrifugé 15 minute à 2500 tours/min. Le solide obtenu est dissous dans 50 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 15 %, puis lyophilisé. Le brut de synthèse obtenu est purifié par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse, sur une colonne semi- préparative C4 (21x 250 mm, 5 μM, 300 Â JUPITER). La fraction homogénéisée pour chaque dérivé synthétisé protégé par S(tBu) est caractérisée par sa composition en acides aminés et par spectrométrie de masse. La déprotection des cystéines bloquées a été réalisée en incubant, à température ambiante, 1 mg de protéine Tat dans 1 ml de tampon phosphate de sodium dégazé à 0,1 M, pH 8,5, contenant 6M urée et du dithiothréitol (50 équivalents de dithiothréitol par résidu de cystéine). L'avancement réactionnel est suivi par chromatographie liquide haute performance (CHLP) en phase inverse, sur une colonne semi-préparative C4 (21x 250 mm, 5 μM, 300 Â JUPITER). Après 2 heures, la réac- tion apparaît quantitative, le mélange réactionnel est acidifié jusqu'à pH 2,2 avec une solution aqueuse de TFA/H2O (50/50 ; NN), puis diluée avec une solution aqueuse de TFA H2O (1/999 ; NN) dans un volume final de 50 ml. Le mélange réactionnel est alors purifié par chromatographie liquide haute performance (CHLP) en phase inverse, sur une colonne semi-préparative C4 (21x 250 mm, 5 μM, 300 Â JUPITER). La fraction homogénéisée pour chaque dérivé synthétisé est caractérisée par sa composition en acides aminés et par spectrométrie de masse. Des fractions aliquotes ont été préparées et la protéine a été lyophilisée et conservée à -20°C. Une stratégie similaire a été utilisée pour produire les dérivés suivants de TatlOl : Tatl01C(22-37)S, Tatl01RGD,KGE et TatlOlpolyQ, TatlOlcore et Tatl01D5I,P6L Tatl01C(25,27)S, Tatl01C(30,31)S, Tatl01C(22,34,37)S et Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère , ainsi que les 18 peptides de 15 acides aminés de longueur, avec un chevauchement de 5 acides aminés, représentant la séquence de TatlOl. 2) Construction de plasmides recombinants d'expression de la protéine Tat et des mutants dérivés La séquence nucléotidique de la protéine Tat (TatlOl) ou des mutants dérivés Tatl01C(22-37)S, Tatl01RGD,KGE et TatlOlpolyQ, Tatl01C(25,27)S et Tatl01C(30,31)S a été reconstituée à partir de 8 amorces nucléo- tidiques synthétiques chevauchantes, représentant la séquence de la totalité du gène Tat codant pour l'une des protéine précitées, flanquée des sites de restrictions Nco I et Hind III. Les amorces ont été hybridées par leurs régions complémentaires puis le produit d'hybridation obtenu a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), à l'aide des amorces ci-dessus, coπespondant aux extrémités 5' et 3' du gène Tat, flanquées des sites de restrictions Nco I ou Hind III. Le fragment d'amplification PCR a ensuite été digéré par Nco I et Hind III et le fragment de restriction de 304 pb ainsi obtenu a été clone aux mêmes sites du vecteur d'expression pTriEx-1 (ΝOVAGEΝ) pout donner le plasmide recombinant dénommé p3X-TAT. Ce vecteur permet l'expression de Tat dans E. coli, dans des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères, sous le contrôle, respectivement, du promoteur T7, du promoteur plO, et d'un promoteur hybride entre l'activateur du promoteur précoce du cytomégalo virus et le promoteur de la β-actine de poulet. 3) Préparation de dimères de Tat Les dimères covalents de Tat sont préparés par oxydation des résidus de cystéine en tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 8, à température ambiante (environ 20° C). Les dimères non-covalents de Tat sont préparés par mise en contact d'une préparation de la protéine Tat ou d'un fragment de ladite protéine tel que défini ci-dessus, avec des cations polyvalents, de préférence divalents comme le zinc et le cadmium, à pH d'environ 6 à 9. Exemple 2 : Immunogénicité de Tat 1) Méthodes a) Immunisation des souris Pour évaluer la réponse humorale, des souris BALB/c de 6 à 8 semaines (IFFA CREDO) ont reçu, soit par voie intrapéritonéale, soit par voie sous- cutanée à la base de la queue, 100 μl d'une solution contenant 5 μg de TatlOl, ou d'un dérivé de Tat, préparés comme décrits à l'exemple 1. Les protéines ont été préalable- ment dissoutes dans du PBS juste avant la préparation des émulsions avec de l'adjuvant de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine (référence 77120, PIERCE). Une seconde injection a été réalisée après 14 jours et des échantillons de sang ont alors été prélevés à différents intervalles après cette immunisation. Pour les injections réalisées avec de l'adjuvant de Freund, Tat a d'abord été injecté dans une émulsion d'adjuvant complet puis dans une émulsion d'adjuvant incomplet. Pour évaluer la réponse cellulaire T en l'absence d'adjuvant, les souris BALB/c ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle de TatlOl dans du PBS, par voie sous-cutanée à la base de la queue Les rates ont été prélevées 10 jours après l'immunisation des souris. b) Titrage des anticorps en ELISA La protéine TatlOl ou l'un de ses dérivés, préparés comme décrit à l'exemple 1, ont été adsorbés sur une plaque ELISA, pendant une nuit à +4°C, à raison de 0,1 μg/puits dans du tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4. Les plaques ont ensuite été saturées avec du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4, contenant 0,3 % de sérum albumine bovine (BSA). Les antisérums ont été dilués en série dans le même tampon contenant 0,1 % de BSA et incubés dans les puits toute la nuit à 4°C. La fixation des anticorps est mesurée en utilisant un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la péroxidase et de l'ABTS comme substrat. Les titres sont définis par la plus forte dilution de sérum pour laquelle la valeur d'absorbance est supérieure d'au moins 0,6 à celle du contrôle négatif constitué d'un mélange de sérums prélevés avant l'immunisation des souris. c) Test de stimulation des cellules T Les rates des souris immunisées ont été prélevées et dilacérées. Les splénocytes ont été mis en suspension dans un milieu de prolifération contenant 1% de sérum de veau fœtal. Les cellules (5xl05 cellules/puits) ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humide avec 7% de CO2, en présence de dilutions en série des diffé- rents antigènes. La présence d'IL-2 dans les surnageants de culture a été déterminée après une période de 24 heures en mesurant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxiques dépendante de l'IL-2 (CTLL), en utilisant de la thymidine tritiée ([3H] TdR, 5 Ci/mmole, AMERSHAM). La prolifération des cellules a été mesurée après 3 jours de culture, suivis d'une incubation de 18 heures en présence de méthyl 3H thymidine. Les données sont exprimées en coups par minutes (cpm). 2) Résultats a) réponse humorale Dans un premier temps, la réponse en anticorps anti-Tat a été analysée chez des souris BALB/c immunisées avec la protéine TatlOl préalablement émulsifiée avec de l'hydroxyde d'alumine ou de l'adjuvant de Freund. La figure 1 montre qu'une réponse anticorps anti-Tat est observée chez les souris immunisées avec le mélange contenant de l'hydroxyde d'alumine mais que les titres sont approximativement 10 fois plus élevés lorsque la protéine est injectée avec de l'adjuvant de Freund. Dans un deuxième temps, pour déterminer si Tat peut induire une réponse immunitaire en l'absence d'adjuvant, des souris BALB/c ont été immunisées avec la protéine TatlOl dans du PBS, soit par voie intrapéritonéale, soit par voie sous- cutanée. Comme contrôle positif, deux autres groupes de souris ont été immunisées avec la protéine TatlOl préalablement émulsifiés dans de l'hydroxyde d'alumine. La figure 2 montre qu'une réponse anticorps anti-Tat est observée lorsque TatlOl est injectée en l'absence d'adjuvant. De façon surprenante, la réponse immunitaire la plus élevée a été obtenue lorsque TatlOl est injectée seule par la voie sous-cutanée alors que cette voie est peu efficace lorsque la protéine est préalablement mélangée avec de l'hydroxyde d'alumine. Au contraire, les injections intrapéritonéales induisent des réponses en anticorps anti-Tat similaires, en présence ou en l'absence d'adjuvant. Ensuite, dans le but de comparer le pouvoir immunogène de Tat en l'absence d'adjuvant à celui d'autres antigènes protéiques, des souris BALB/c ont été immunisées avec TatlOl, du lysozyme d'œuf de poule (HEL), de l'ovalbumine (OVA) ou de la glutathion-S-transférase (GST) Seule la protéine TatlOl est capable d'induire une réponse en anticorps en l'absence d'adjuvant, indiquant que le pouvoir immunogène en l'absence d'adjuvant est une propriété particulière de Tat que ne possède pas d'autres antigènes protéiques. Enfin, pour évaluer la réponse en anticorps anti-Tat chez des souris non-consanguines, deux groupes de quatre souris SWISS ont été immunisées avec 5 ou 50 μg de TatlOl dans du PBS. Un très faible titre en anticorps a été observé avec une injection de 5 μg d'antigène Tat (1/60, 14 jours après la seconde immunisation), mais une réponse humorale significative a été observée lorsque 10 fois plus de protéine ont été utilisés (1/1650 et 1/850 à 14 et 28 jours). En conséquence, l'aptitude à induire une réponse immunitaire humorale en l'absence d'adjuvant n'est pas liée au fond génétique des souris utilisées, b) Réponse cellulaire T La capacité de Tat à induire une réponse cellulaire T en l'absence d'adjuvant a été analysée chez des souris BALB/c. Des souris BALB/c ont été immunisées par deux injections, par voie sous-cutanée, de TatlOl dans du PBS. Dix jours après la seconde injection, les rates ont été prélevées et la capacité des splénocytes à sécréter de l'IL-2 et à proliférer en présence de TatlOl a été analysée. La figure 3 montre que les cellules de souris immunisées produisent de l'IL-2 lorsqu'elles sont incubées en présence de TatlOl mais pas en présence de HEL. Au contraire, aucune sécrétion d'IL-2 n'a été observée avec les splénocytes de souris naïves. Bien qu'ils sécrètent de l'IL-2, les splénocytes des souris immunisées avec Tat ne prolifèrent pas en présence de Tat (figure 3B). La raison de cette différence entre la production d'IL-2 et la prolifération reste inconnue. Cependant, les résultats indiquent que, en l'absence d'adjuvant, Tat peut induire des cellules T spécifiques qui sont fonctionnelles pour la sécrétion d'IL-2. Exemple 3 : Cartographie des épitopes B de Tat en présence ou en l'absence d'adjuvant
1) Méthode Dix huit peptides synthétiques chevauchants de TatlOl d'une longueur de 15 acides aminés chacun, préparés comme décrit à l'exemple 1, ont été adsorbés sur une plaque ELISA, pendant une nuit à +4°C, à raison de 1 μg/puits dans du tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4. Les plaques ont ensuite été saturées avec du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,4 contenant 0,3 % de BSA. Les antisérums prélevés chez les souris BALB/c immunisées avec TatlOl dans du PBS, dans de l'hydroxyde d'alumine ou dans de l'adjuvant de Freund, ont été dilués en série dans le même tampon contenant 0,1 % de BSA et incubés dans les puits, toute la nuit à 4°C. La fixation de l'anticorps a été mesurée à l'aide d'un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase et de l' ABTS comme substrat.
2) Résultats La figure 4A montre que les sérums de souris immunisées avec Tat sans adjuvant lient principalement les peptides 1 et 2, et dans une moindre mesure le peptide 18, indiquant que la région 1-20 de TatlOl est une région B immuno- dominante lorsque la protéine est injectée en l'absence d'adjuvant. La reconnaissance supplémentaire des peptides 15 et 16 par les sérums des souris immunisées avec Tat préalablement mélangée avec de l'adjuvant de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine indique que d'autres sites antigéniques sont localisés dans la région 71-90 (Figure 4B et 4C). La mise en évidence d'autres épitopes dans la région 71-90 est peut être en relation avec une dénaturation de l'immunogène par les adjuvants. Exemple 4 : Identification des déterminants moléculaires de Tat impliqués dans sa capacité à induire une réponse immunitaire en l'absence d'adjuvant 1) Méthode Pour identifier les déterminants moléculaires impliqués dans la propriété auto-adjuvante de TatlOl, des mutations ont été introduites dans les régions de Tat responsables de certaines de ses propriétés biologiques et immunologiques. La plupart des activités de Tat impliquent des déterminants moléculaires localisés dans cinq régions distinctes de la molécule : la région N terminale (positions 1 à 9), la région riche en cystéine (positions 22-37), le core (postions 38-48), la région basique (positions 49-57) et la région de liaison aux récepteurs des intégrines (positions 78- 80). Une série de cinq dérivés de Tat, chacun étant substitué dans l'une des régions précitées, a été préparée (figure 5 A). L'acide aspartique en position 5 et la proline en position 6 ont été respectivement substitués par une isoleucine et une leucine dans le dérivé Tatl01D5I,P6L. Les 7 résidus de cystéines ont été substitués par 7 serines dans le dérivé Tatl01C(22-37)S. Les résidus chargés et hydrophobes du core ont été remplacés par des glutamines, tandis que les résidus de serine et de thréonine ont été substitués par des alanines dans le dérivé TatlOl core. Les 2 résidus de lysine et les 6 résidus d'arginine de la région basique ont été substitués par 8 glutamines dans le dérivé TatlOlpolyQ. Enfin, la séquence RGD de liaison aux récepteurs des intégrines a été remplacée par une séquence KGE incapable de se lier aux récepteurs des intégrines, dans le dérivé Tatl0lRDG,KGE- Des groupes de quatre souris BALB/c ont ensuite été immunisées avec TatlOl ou ses dérivés dans du PBS, par deux injections à 14 jours d'intervalle, par voie sous-cutanée. La réponse en anticorps anti-Tat a été analysée en ELISA, à différents temps après la seconde injection. 2) Résultats La figure 5B montre que les dérivés TatlOlpolyQ et TatlOlRDG.KGE, sont aussi immunogènes que TatlOl de type sauvage, indiquant que la région basique et la séquence de liaison aux récepteurs des intégrines ne sont pas impliquées dans la propriété auto-adjuvante. Au contraire, la légère diminution de la réponse anticorps observée avec Tatl01D5I,P6L, 14 jours après la seconde immunisation, et l'absence de réponse observée avec TatlOlcore et Tatl01C(22-37)S (figure 5B et 5C) indiquent que le phénomène implique principalement la région du core et la région riche en cystéines de la molécule, et dans une moindre mesure, la partie N-terminale de TatlOl. Exemple 5: Rôle des cystéines dans la propriété auto-adjuvante de Tat 1) Méthode a) Obtention de dérivés de Tat substitués au niveau des résidus de cystéine Afin de définir plus précisément le rôle des différentes cystéines dans la propriété auto-adjuvante de Tat, l'immimogénicité d'une autre série de 3 dérivés de Tat a été analysée de façon similaire à celle des dérivés de l'exemple 4. Dans le dérivé Tatl01C(25,27)S, les cystéines 25 et 27, qui forment un motif de chimiokines CXC impliqué dans l'antagonisme de CXCR4 chez l'homme, ont été substituées par deux serines. Dans le dérivé Tatl01C(30,31)S, les cystéines 30 et 31 qui forment un motif de chimiokines CC impliqué dans le chimiotactisme des monocytes et des polynucléaires, on été remplacés par deux serines. Dans le dérivé Tatl01C(22,34,37)S, les trois cystéines on été substituées par trois serines. b) Analyse électrophorétique de Tat et des dérivés de Tat La protéine Tat et ses dérivés ont été séparés par électrophorèse sur un gel constitué d'un polymère non-réticulé formant des pores dynamiques et analysés sur un bioanalyseur (Agilent 2100, AGILENT TECHNOLOGIES), à l'aide du kit Protein 50 Plus LabChip (AGILENT TECHNOLOGIES). Les puces ont été préparées selon le protocole fourni par le fabricant ; les canaux de la puce ont été remplis avec le mélange de gel et de marqueur fluorescent utilisé pour la détection des protéines. TatlOl et ses dérivés ont été dissous dans du tampon PBS, puis dénaturés en présence de SDS, à 95°C, pendant 7 minutes avant leur chargement sur la puce. En parallèle, une fraction de la solution de TatlOl a été incubée en présence d'un excès d'agent réducteur, puis en présence de SDS et de β-mercaptoéthanol à 95°C pendant 7 minutes, et enfin chargée sur la puce. La puce a ensuite été chargée sur le bioanalyseur et chaque échantillon a été séparé dans le canal de séparation et détecté par mesure de la fluorescence (670 nm-700 irai) en 45 secondes. Les résultats obtenus sont présentés sous la forme d'un électrophorégramme avec le temps en abscisse et les unités de fluorescence en ordonnées. 2) Résultats La figure 6 montre que, les réponses en anticorps anti-Tat obtenues avec Tatl01C(25,27)S et Tatl01C(30,31)S ne sont pas significativement différentes de celle obtenue contre la protéine de type sauvage. A l'inverse, lorsque Tatl01c(22,34,37)s est utilisée comme immunogène, la réponse en anticorps anti-Tat est significativement diminuée (p<0,02). Ces résultats indiquent que la propriété autoadjuvante implique les résidus de cystéine en position 22, 34 et 37 mais pas les autres cystéines des motifs de chimiokines CXC et CC. Etant donné que les cystéines s'oxydent spontanément et peuvent donc contribuer à la formation de ponts disulfures intra- ou intermoléculaires, la coπélation entre la propriété auto-adjuvante de TatlOl et la tendance de Tat à former des oligomères médiés par des ponts disulfures a été analysée. L'électrophorégramme de Tat sauvage et du dérivé Tatl01C(22- 37)S substitué par des cystéines non immunogènes montre une relation entre la propriété auto-adjuvante et la présence de formes oligomériques de la molécule. Ainsi, Tatl01C(22-37)S qui est dépourvu d'activité auto-adjuvante, est constitué d'une forme monomérique homogène (Figure 7A). En revanche, TatlOl est constitué d'une forme monomérique et de deux formes oligomériques (Figure 7A). De plus, ces formes oligomériques ne sont pas observées lorsque TatlOl est incubée en présence d'un excès d'agent réducteur, ce qui indique que les oligomères résultent de la formation spontanée de ponts disulfures intermoléculaires (Figure 7A). Pour coπoborer l'hypothèse du rôle de l'oligomérisation médiée par des ponts disulfures dans la propriété auto-adjuvante, il a été vérifié que le dérivé Tatl01C(22-37)S monomérique non immunogène pouvait devenir immunogène en l'absence d'adjuvant lorsqu'il devenait dimérique. Pour ce faire, le résidu de serine 34 de Tatl01C(22-37)S a été remplacé par une cystéine, dans le but de préparer un dimère médié par un pont disulfure (Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère). L'analyse en acides aminés et l'analyse par spectrométrie de masse montrent que le nouveau dérivé est totalement dimérique puisque Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère migre en une seule bande coπespondant à un dimère Tat qui est réduite en présence d'un excès d'agent réducteur. L'immunogénicité de TatlOl, TatlOl C(22-37)S et Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère a ensuite été comparée chez des souris BALB/c. La figure 7B montre qu'aucune réponse en anticorps anti-Tat n'est observée avec Tatl01C(22-37)S alors que Tatl01C(22-31; 37)S,C34dimère induit une réponse humorale proche de celle observée avec la protéine Tat sauvage. En conséquence, un dérivé de Tat monomérique non immunogène peut devenir immunogène en l'absence d'adjuvant, à condition de former un dimère médié par un pont disulfure indiquant que la propriété auto-adjuvante de Tat résulte de son oligomérisation spontanée, médiée par un pont disulfure. Exemple 6 : Analyse du rôle éventuel de la transactivation dans la propriété auto-adjuvante de TatlOl 1) Méthodes Un plasmide rapporteur, dénommé pLTR-G, comprenant le gène de la protéine fluorescente verte EGFP sous le contrôle transcriptionnel du LTR de VIH- 1, a été construit et transfecté de façon stable dans des cellules Hela. De manière plus précise, la séquence du LTR de l'isolât AVR-2 du VIH-1 (Jones et al., Cuπ. Opin. Cell. BioL, 1993, 5, 461-468 et numéro d'accès GenBank K02007) couvrant les positions -137 à +58, relativement au site d'initiation de la transcription a été synthétisée selon la méthode décrite dans Stemmer et al., Gène, 1995, 164, 49-53. Le LTR synthétique ainsi obtenu a été digéré par Hindlll et Sacïl et clone aux mêmes sites du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH), en amont du gène EGFP dépourvu de promoteur, pour donner le plasmide pLTR-G. Des cellules Hela ont été transfectées de façon stable par le plasmide pLTR-G, clonées par dilution limite puis transfectées de façon transitoire par un plasmide exprimant TatlOl. Le clone surexprimant le mieux l'EGFP en présence de TatlOl a été sélectionné. La lignée de cellules Hela transfectées de façon stable par le plasmide rapporteur a ensuite été transfectée de façon transitoire, avec un plasmide d'expression, soit de la protéine Tat sauvage, soit pour l'un de ses mutants (300 ng de plasmide pour 2xl04 cellules), tel que décrit à l'exemple 1. Après 45 heures d'incubation à 37°C, la fluorescence des cellules transfectées a été analysée en cytométrie de flux. 2) Résultats L'activité principale de Tat étant la transactivation du génome viral, la relation entre l'effet auto-adjuvant de Tat et l'activité de transactivation a été étudiée. La figure 8 montre que l'EGFP est surexprimée dans les cellules
Hela transfectées avec les plasmides codant pour des molécules Tat immunogènes, TatlOl et Tatl01RGD,KGE,- indiquant que ces cellules sont actives pour la transactivation. L'EGFP n'est pas exprimée dans les cellules transfectées avec le plasmide codant pour le dérivé non immunogène Tatl01C(22-37)S mais aussi pour celui qui code pour les dérivés immunogènes Tatl01C(25,27)S, Tatl01C(30,31)S et TatlOlpolyQ. En conséquence, l'effet auto-adjuvant n'est pas lié à l'activité de transactivation de Tat. Exemple 7 : Préparation de formes oligomériques de Tat
1) Méthodes La protéine Tat 101 préparée comme décrit à l'exemple 1 est diluée dans du tampon PBS, pH 7,4 (58μM finale), puis incubée pendant différents temps, à température ambiante, dans le noir, sans agitation. L'apparition des formes oligomériques est examinée par électrophorèse à l'aide d'un gel non-réticulé, comme décrit à l'exemple 5, mis à part qu'avant l'étape de dénaturation (chauffage à 95°C pendant 7 min, en présence de SDS), les échantillons de Tat sont préincubés avec du maléimide (20 mM), de façon à bloquer les cystéines réactives et éviter la formation de ponts disulfure lors de la dénaturation ou de la migration des échantillons dans le gel.
2) Résultats L'analyse de l'apparition des formes oligomériques de Tat (figure 9) montre qu'après 5 jours d'incubation (ligne 4), deux bandes sont présentes. La première est majoritaire et coπespond à des formes dimériques, alors que la seconde coπespond à des formes trimériques. La forme monomérique qui est observable aux lignes 1, 2 et 3 a, quant à elle, quasiment disparu. Il suffit donc d'incuber Tat pendant 5 jours en tampon PBS dans le noir pour obtenir des formes oligomériques principalement composées de dimères résultant de la formation de ponts disulfure intermoléculaire. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Composition vaccinale anti-VIH comprenant un antigène Tat, caractérisée en ce que ledit antigène est constitué d'un homo- ou hétéro-dimère de protéine(s) Tat et/ou ou de fragments) d'au moins 20 acides aminés desdites protéines. 2°) Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dimère de Tat est formé par l'association covalente desdites protéines Tat et/ou desdits fragments. 3°) Composition vaccinale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le dimère de Tat comprend au moins une liaison disulfure intermoléculaire. 4°) Composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite liaison disulfure intermoléculaire implique des résidus de cystéine desdites protéines Tat et/ou desdits fragments. 5°) Composition vaccinale selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits résidus de cystéine sont choisis parmi ceux situés en position 22, 25, 27, 30, 31, 34, et 37 de la séquence en acides aminés de Tat, de préférence parmi les résidus de cystéine en position 22, 34 et 37. 6°) Composition vaccinale selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que les résidus de cystéine de Tat qui ne sont pas impliqués dans ladite liaison disulfure intermoléculaire sont bloqués par une liaison ou une interaction ou substitués par un autre résidu d'acide aminé ne comprenant pas de groupement sulfhydrile. 7°) Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dimère de Tat est formé par l'association non-covalente de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines. 8°) Composition vaccinale selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite association non-covalente est formée par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents comme notamment le zinc ou le cadmium. 9°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites protéines Tat et les fragments desdites protéines sont préalablement inactivés, notamment par substitution d'au moins un des résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en serine, de préférence d'au moins un des résidus de cystéine en position 25, 27, 30 et 31. 10°) Composition vaccinale selon la revendication 9, caractérisée en ce que, le dimère de Tat est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 34, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30,
31 et 37, en serines. 1 1 °) Composition vaccinale selon la revendication 9, caractérisée en ce que, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en serines. 12°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit fragment de Tat inclus au moins un épitope B et un épitope T immunodominants. 13°) Composition vaccinale selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit épitope B immunodominant est situé dans le domaine N-terminal (positions 1 à 21) et/ou ledit épitope T immunodominant est situé dans le domaine central (positions 38 à 48). 14°) Composition vaccinale selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que lorsque le dimère de Tat est constitué par l'association non-covalente de fragment(s) de Tat ou d'un fragment de Tat avec une protéine Tat, par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents, tel que défini à la revendication 8, le ou lesdit(s) fragment(s) incluent également le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37). 15°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite protéine Tat est la protéine Tat de 101 acides aminés ou la protéine Tat de 86 acides aminés. 16°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 14, caractérisée en ce que ledit fragment de Tat comprend de 20 à 50 acides aminés, de préférence, entre 25 et 35 acides aminés. 17°) Composition vaccinale selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit fragment de Tat est le fragment 1 à 48. 18°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que ledit antigène Tat dimérique dérive de la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 et/ou d'un fragment d'au moins 20 acides aminés de cette séquence. 19°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un autre antigène du VIH, notamment Rev, Nef, Gag, Env ou un fragment d'au moins 11 acides aminés desdits antigènes. 20°) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou d'une substance porteuse, et éventuellement d'un autre antigène du VIH, tel que défini à la revendication 19. 21°) Antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18 comme vaccin pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. 22°) Utilisation d'un antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. 23°) Dimère de Tat isolé, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : a) un hétérodimère de protéines Tat ou de fragments desdites protéines, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, et b) un homodimère de fragments de protéines Tat, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18.
24°) Dimère de Tat isolé, selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un homodimère de fragments de protéines Tat ou un hétérodimère d'une protéine Tat et d'un fragment de Tat, associés par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22 ou 34, chacune desdites protéines et desdits fragments incluant substitution en serines, des six résidus de cystéine, respectivement en position 25,, 30, 31, 34 et 37, et en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37.
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