WO1991000105A1 - Vaccin contre le virus de la leucemie bovine - Google Patents

Vaccin contre le virus de la leucemie bovine Download PDF

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WO1991000105A1
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recombinant
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Daniel Georges Joseph Ghislain Portetelle
Arsène Léon Ghislain BURNY
Véronique Josette Jacqueline Marie VONECHE
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Rhone Merieux
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    • C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • Bovine leukemia virus vaccine The Bovine leukemia virus vaccine.
  • Bovine leukemia or enzootic bovine leukosis is a highly contagious disease caused by a retrovirus, the bovine leukemia virus (BLV).
  • BLV bovine leukemia virus
  • This disease which rages mainly in the countries of Eastern Europe and in North and South America, mainly affects sheep and cattle, leading to an almost generalized infection of herds. It is a disease whose evolution is relatively slow, but which, in many cases, induces tumors, leading to the death of the infected animal.
  • the development of this disease is all the more worrying as. there is currently virtually no way to combat it and prevent the spread of the virus. The solution so far has been to isolate infected animals and slaughter them.
  • the sheep is the experimental animal par excellence for studies of disease transmission (see in particular Mammerickx, M. et al. Cited below and Mammerickx, M. and al. in Leukemia Research, 11, 353-358 (1987) in which it is shown that the injection of minimal quantities of lymphocytes from infected animals (926 lymphocytes) causes the appearance of symptoms of the disease in sheep).
  • KONO et al. in Jpn. J. Vet. Sci. 48, p. 117 to 125 (1986) report the results of a study showing that antibodies acquired passively or after injection of the purified gp51 envelope glycoprotein protect against subsequent superinfection, provided that the levels of anti-gp51 antibodies are sufficient prior to BLV secondary infection.
  • the gp51 glycoprotein can induce the formation of neutralizing antibodies, and if it has been possible to identify and locate on this glycoprotein the epitopes responsible for the biological activity of the virus, it n Hitherto, however, it has not been possible to develop a vaccine which can provide good protection against bovine leukemia over a long period.
  • the difficulties encountered in the development of a vaccine reside in the insufficient immunogenicity of the glycoprotein or of its fragment which carries the epitopes F, G, H responsible for the activity of the virus, due to the fragile spatial configuration of these epitopes.
  • the present invention aims to provide a vaccine in which gp51 is found in its native configuration where the epitopes F, G, H are present and well exposed, as on the surface of a viral particle, allowing the immunogenic properties of these epitopes to fully manifest.
  • the vaccine according to the invention comprises a peptide fraction which includes the envelope glycoprotein gp51 of the BLV virus and which induces to a high degree the formation of neutralizing antibodies, characterized in that the glycoprotein gp51 is associated with a transmembrane glycoprotein, so as to restore to the glycoprotein gp51 its native configuration where the epitopes are present
  • BLV in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type used for making up vaccines.
  • the transmembrane glycoprotein associated with the envelope glycoprotein gp51 is advantageously constituted by the glycoprotein gp30 of the BLV virus, which interacts with the glycoprotein gp51 to restore it to its native configuration where the epitopes F, G, H are present. These epitopes return to the native configuration observed on the surface of the BLV viral particle and therefore exhibit very high reactivity with the monoclonal antibodies directed against them.
  • the transmembrane glycoprotein gp30 is a highly glycosylated polypeptide comprising 214 amino acids and which is, in particular, responsible for the good fixation of the envelope proteins in the membrane of the infected cell.
  • the two glycosylated proteins gp51 and gp30 are encoded by the env gene of the virus.
  • the amino acid sequence of gp30 is typical of retrovirus transmembrane proteins: two very hydrophobic regions, the one located at the -COOH end is probably the one that crosses the viral membrane. See N.R. RICE et al., Virology (1984) 138, 82-93.
  • glycoproteins gp51 and gp30 synthesizes the glycoproteins gp51 and gp30 in an expression system which expresses together, in a single molecule, gp51 and gp30 and which can be, for example, a recombinant virus or a yeast.
  • the molecule comprising gp51 and gp30 thus expressed comprises a natural cleavage site.
  • the nucleotide sequences being identical, in vitro recombination takes place between the homologous regions of the recombinant plasmid and of the viral DNA; by this recombination, the env gene is integrated into the genome of the virus in which it is propagated and expressed.
  • nucleotide sequence which may come from a cloned BLV provirus or else from a copy of cDNA resulting from reverse transcription of viral RNA
  • adenoviruses herpesviruses
  • vaccinia virus Fowlpox virus
  • Canarypox virus baculoviruses.
  • Fowlpox vector see for example J. Taylor and E. Paoletti in Vaccine (1988), 6, p 466-467 and J. Taylor et al. In Vaccine (1988), 6, p 497-503.
  • the recombinant viruses can be used as such as vaccinating agents against bovine leukemia or could be used to infect a cell culture and produce in vitro the peptide fraction, which will be recovered and which will be used as a vaccinating agent.
  • the recombinant virus can advantageously express a single molecule, comprising gp51 and gp30, without or without a cleavage site.
  • the vaccines thus prepared can be administered by various routes; in particular, it can be carried out intradermally, subcutaneously or intramuscularly. They can be administered with known pharmaceutical carriers and also contain adjuvants.
  • the recombinant viruses constitute a particularly convenient means for the expression of gp51 and gp30 together
  • numerous other expression systems can also be used such as yeasts, in particular the yeast S. cerevisiae.
  • the present invention therefore also extends, in general, to any vaccine comprising an expression system which makes it possible to express gp51 and gp30 together.
  • glycoproteins gp51 and gp30 can also be inserted into ISCOM ("Immunostimulating complex") type preparations such as those which have been described by B.
  • glycoproteins gp51 and gp30 can also be inserted into polyelectrolytes (copolymer of acrylic acid and N-vinylpyrrolidone), serving in particular as an adjuvant to gp51 and gp30 (see Petrov et al., Immunology
  • the invention also relates to vaccines against bovine leukemia obtained from these ISCOM preparations or from these polyelectrolytes.
  • the inventors have found that it is also possible, to a certain extent, to restore gp51 to its native configuration, by fixing to this glycoprotein a monoclonal antibody specific for one of the epitopes.
  • An alternative embodiment of the invention would therefore consist of a vaccine against the bovine leukemia virus (BLV) comprising a peptide fraction comprising the envelope glycoprotein gp51 of the BLV virus and inducing to a high degree the formation of neutralizing antibodies, characterized in that the gp51 glycoprotein is associated with a monoclonal antibody specific for one of the gp51 epitopes, so as to restore to the gp51 glycoprotein its native configuration in which the F, G and H epitopes responsible for the activity are present biological of the BLV virus, in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type used for making vaccines.
  • the monoclonal antibody which is fixed to the yp51 is advantageously constituted by the monoclonal antibody directed against site E or against site A.
  • An alternative embodiment of the invention would therefore consist in attaching to the glycoprotein gp51 a monoclonal antibody directed against site E or against site A.
  • the monoclonal antibody directed against site E or against site A interacts with gp51, like gp30, restoring gp51 to its native configuration.
  • the gp51 to which a monoclonal antibody directed against the epitopes E or A has been fixed, is recognized by the monoclonal antibodies directed against the epitopes F, G, H.
  • the gp51 and the monoclonal antibody directed against the E or A site can be expressed in an expression system.
  • Such an expression system can consist of a recombinant virus into which the gene coding for gp51 and genes coding for the monoclonal antibody directed against site E or site A have been inserted.
  • the invention would also extend to vaccines obtained from, or containing a recombinant virus expressing gp51 linked to its monoclonal antibody E or A, or else produced from ISCOM type preparations in which the monoclonal antibody which will then capture gp51.
  • FIG. 1 shows the titration curve of gp51 antibodies from rabbits which have received recombinant viruses which express on the one hand gp51 alone, and on the other hand gp51 and gp30 together;
  • FIGs 2, 3 and 4 show the competition curves of anti-gp51 antibodies from rabbits which have received recombinant viruses which express on the one hand gp51 and on the other hand gp51 and gp30 together, with the antibodies respectively monoclonals directed against epitopes F, G and H linked to the enzyme peroxidase.
  • VV-ENV1 VV-ENV1
  • RNAs were extracted from bat lung cells producing chronic BLV virus.
  • the poly A + RNAs were selected on an oligo-dT-cellulose column in order to be copied into double-stranded cDNAs and linked to the EcoRI site of the phage DNA ⁇ gt10.
  • C600 HFL bacteria are. infected with bacteriophages from the cDNA bank and spread on Petri dishes. Each recombinant phage produces a lysis range. An impression of the Petri dish is made on a nitrocellulose filter. After denaturation and neutralization, the DNA fixed on the filter is hybridized with a "proviral BLV” probe marked with 32 P by the "nick-translation” technique. The filter is then autoradiographed. The "proviral BLV” probe makes it possible to identify clones containing BLV cDNA. The phages containing proviral information are then purified and digested with the restriction enzyme EcoRI; the fragments are separated by electrophoresis, transferred to a nitrocellulose filter, according to the "Southern” method.
  • the plasmid pGS20 has been described in Mackett et al. J. of Virology (1984) 49, 857-863. It consists of a part of the plasmid pBR328 and the thymidine kinase gene of the vaccinia virus (TK gene). The 7.5 K promoter of this Poxvirus, followed by two cloning sites, is inserted into the TK gene.
  • the DNA of a recombinant phage of interest is digested with the restriction endonuclease Xho I.
  • the digestion products are separated by gel electrophoresis of agarose.
  • the 2.3 kb fragment is recovered by electrophoresis and its projecting 5 ′ ends are made blunt by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I.
  • the vector pGS20 is linearized by the restriction endonuclease Sma I and treated with alkaline phosphatase.
  • E. coli bacteria strain MM294 made competent are transformed. The selection of transformed bacteria is carried out on ampicillin.
  • the direction of the insert is verified by the Eco RI-Pvu II double digestion.
  • CV1 monkey broblasts
  • CV1 monkey broblasts
  • particles of wild vaccinia virus are produced on confluent cells.
  • the fibroblasts are infected, at the rate of one viral particle per cell.
  • the recombinant plasmid pGS20-ENV is precipitated in the presence of calcium phosphate on the infected fibroblasts. After 48 hours of culture, the virus is released from the cells by a freeze-thaw cycle.
  • TK thymidine kinase
  • the lysis ranges are visualized after coloring the living cells with neutral red.
  • the virus corresponding to the ranges observed is sampled, multiplied; the DNA of the isolated clones is extracted and hybridized to the "ENV" probe.
  • Balb / c mice were injected subcutaneously and intraperitoneally with 50 ⁇ g of gp51 in the presence of complete Freund's adjuvant. This injection was repeated 2 weeks later in the presence of incomplete Freund's adjuvant, then 4 weeks later without adjuvant. Two months later, a final injection was administered intraperitoneally and intravenously.
  • the hybrids were prepared by fusion of mouse myeloma cells with the splenocytes of immunized mice according to the technique described by HERZENBERG L.A. et al. in Handbook of Experimental Immunology (D. WEIR, ed.) 25.1-25 (Blackwell, London).
  • the hybrids obtained were distributed in 96-well plates and selected on HAT medium in the presence of thymocytes and mouse macrophages.
  • the hybrids producing anti-gp51 antibodies were detected using a liquid phase radioimmunoassay with the gp51 antigen labeled with iodine 125 or using a radioimmunoassay in solid phase with BLV virus adsorbed in microplate wells. In the latter case, the specific antibodies adsorbed on the virus were detected with a mouse anti-immunoglobulin labeled with iodine 125. After washing, the radioactivity adsorbed on the specific complexes is revealed by autoradiography.
  • the selected producer clones were transferred to 24-well plates and subcloned in semisolid agarose medium.
  • the hybrid cells obtained were injected into the intraperitoneal cavity of mice previously treated with pristane. After 10 to 15 days, the ascites were harvested which contained significant amounts of the desired monoclonal antibodies.
  • the specificity of the various monoclonal antibodies obtained for given epitopes was determined by tests of competition between the antibodies for gp51 antigen adsorbed in the wells of the microtitration plates.
  • a microgram of purified monoclonal antibody which is not radioactively labeled is incubated overnight at 4 ° C. in a volume of 50 ⁇ l in the wells of a plastic microtiter plate containing the adsorbed gp51 (50 ng).
  • Antibody radioactively labeled with iodine 125 (10 ng-100,000 cpm) is then added and the incubation continues for a further 6 hours at 4oC.
  • microplates are then washed intensively and the radioactivity attached to the plastic of each well is measured in a type tripleur counter.
  • Sensitive cells are seeded in Leighton tubes. After growth, they are infected in an order of multiplicity of 5 using the different recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 and VTK79 (wild vaccinia). After 20 hours of infection, the slides are recovered and incubated with each of the anti-gp51 monoclonal antibodies, directed respectively against the defined sites A, B, B ', C, D, D', E, F, G and H.
  • the cells are washed, then the slides are mounted to be examined with a microscope with UV lamp, using the immersion objective.
  • the test makes it possible to demonstrate the presence of sites A, B, B ', C, D, D', E, F, G and H defined by the monoclonal antibodies on gp51.
  • a cell extract or culture supernatants from cells infected with a recombinant virus or else with the BLV virus is sandwiched between the anti-E sensor monoclonal antibody and a revelation monoclonal antibody conjugated to peroxidase.
  • the final presence of a coloration is the sign of the presence of the antigenic site recognized by the revelation monoclonal antibody.
  • VP392 (gp51 + gp30), by repeated passages on a cell line of OVK origin (ovine kidney cells).
  • the experiment was carried out from April 17, 1987 to June 21, 1987 by subculturing twice a week the OVK cells and the VERO cells (used as control), in 25 cm 2 Roux dishes. Arrived at confluence, the cells were washed and infected with VP392 originating from the infection of the anterior passage (55 ⁇ l taken from the ml of viral suspension originating from the Roux dish 25 cm 2). Per Roux 25 cra2 box, there are 3 ⁇ 10 6 OVK cells at confluence against 9 ⁇ 10 6 VERO cells.
  • the various viral suspensions were stored at -20oC. Their virus titer was determined by titration in 24-well dishes, according to the limit dilution method (four repetitions per dilution, LD 50 calculation table according to Read-Muench). During the titrations, the recombinant was each time tested on VERO cells and on OVK cells.
  • the results obtained are collated in Table II.
  • the virus titers (LD50) reported were obtained after respectively 30 days (16/5), 35 days (21/5), 45 days (1/6) and 60 days (15/6) of adaptation on cells.
  • This test used for the detection of antibodies in blood serum, was carried out under the following conditions: - fixation of 100 ng of purified MONO E monoclonal antibody on the walls of the wells of a microtiter plate; incubation for 16 hours at 4oC;
  • the test makes it possible to determine the presence of antibodies from rabbits competing with the monoclonal antibodies conjugated to peroxidase.
  • the test was carried out under the same conditions as those previously described with respect to the ELISA test, with the difference that the peroxidase enzyme is coupled with monoclonal antibodies specifically directed against the epitopes A to H of gp51.
  • the pseudotype inhibition test is based on observations by J. ZAVADA et al. showing that infection with vesicular stomatitis virus (VSV) of cells chronically infected with the BLV virus provides viral particles whose genome consists of that of the VSV virus and whose envelope is that of the BLV virus (pseudotype) .
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • VSV / BLV pseudotypes have the specific properties linked to the envelope glycoprotein gp51 of the BLV virus such as neutralization and host specificity.
  • the VSV genome included in these pseudotypes makes the particles capable of rapidly forming (24-36 hours) lysis plaques on the monkey cells that have been infected with these pseudotypes.
  • 1 ml of a preparation of pseudotypes can be mixed which can form 200 lysis plaques on the cells to be tested (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 and other intermediate dilutions). These sera were previously inactivated with heat (56oC) for 30 minutes.
  • the titre of neutralizing antibodies against the BLV virus is obtained by determining the dilution of serum with which only 50% of the lysis ranges obtained are obtained in the absence of serum to be tested.
  • This test is based on the observation that neutralizing antibodies can prevent the fusion of cell membranes, but not nuclear membranes, between cells having received BLV by injection and CC81 cat indicator cells (the test was used to characterize the monoclonal antibodies by BRUCK et al. In Virology (1982) 122 p. 353-362). The results represent the maximum dilution of serum for which a decrease of 50% in the number of syncytia is observed.
  • the dilutions of serum (2, 4, 8, 16 7) are incubated in the wells of a microtiter plate with BLK virus-producing FLK cells . These sera were previously inactivated with heat (56oC) for 30 minutes.
  • the culture medium is removed and the nuclei of adherent cells are stained using the Giemsa reagent.
  • Cells containing more than 5 nuclei are considered syncytia. Dilutions of serum neutralizing at least 50% the formation of syncytia are considered positive.
  • FIG. 1 shows the titration curves for anti-gp51 antibodies, obtained by the ELISA method previously described. The dilutions of the serum are plotted on the abscissa and the optical density DO measured on the ordinate 460 nm.
  • the curves referenced 4-4 and 5-5 are the curves obtained with the rabbits which received the recombinant virus VP391 (gp51 alone) - rabbits 4 and 5.
  • the curves referenced 7-7, 8-8 and 10-10 are the curves obtained with rabbits which have received the recombinant virus VP392 (gp51 and gp30) -bunnies 7, 8 and 10.
  • the curve referenced 11-11 is the curve obtained with a rabbit which received the purified gp51 in the complete Freund's adjuvant (ACF) - rabbit no 2670.
  • the curve referenced 12-12 is the curve obtained with a normal rabbit.
  • Figures 2, 3 and 4 show the competition curves of rabbit anti-gp51 antibodies respectively with the F, G and H monoclonal antibodies coupled to peroxidase.
  • the set of results obtained therefore shows that when we administer. to a rabbit the recombinant virus which expresses gp51 and gp30 (VP392, VP459, VP482, VV-ENV1), the antibodies formed
  • rabbit antibodies no. 10 even have a greater neutralizing power than rabbit antibodies no. 2670 which have received purified gp51;
  • a batch of sheep was vaccinated using the recombinant viruses VP459, VP482 as well as the wild vaccinia VP452. These sheep were injected twice with recombinants before being super-infected with BLV using infected blood cells from a leukemia animal.
  • Sheep are sheep up to one year old whose serological status has been verified negative for BLV. Sheep 44 and 99 are used here as a control for the BLV superinfection experiment.
  • the recombinants of. the vaccinia were inoculated during the first injection by the intradermal route (ID) and by the subcutaneous route (SC) during the second injection.
  • ID intradermal route
  • SC subcutaneous route
  • Each sheep received 2 doses of 10 8 vaccinia recombinants along the spine each time.
  • the time interval between injections of recombinants and BLV secondary infection is 6 weeks each.
  • the secondary infection was carried out using whole blood from a bovine animal (31,700 white blood cells per mm 3 , 86% of which were lymphocytes).
  • the blood first collected on EDTA, was diluted 10 times to citrate; 0.5 ml of this solution, the equivalent of 50 ⁇ l of whole blood, was injected at 4 intradermal points.
  • the BLV virus produced from blood cells cultured "short-term" was found to be a G- variant, all other sites being preserved.
  • Blood samples were taken weekly, sometimes even more frequently, for example in the days following inoculation with the recombinant virus. We counted white blood cells and blood counts. Serum was collected each time and stored at -20oC.
  • Blood was drawn from EDTA two to three months after superinfection with cells infected with the BLV virus.
  • the lymphocytes were collected by differential lysis and placed in culture in vitro for a period of 96 hours. The culture supernatant was therefore collected and the presence of the viral proteins gp51 and p24 was sought by ELISA test.
  • the recombinants expressing g ⁇ 51 and gp30 strongly reduce the number of infected cells or prevent infection during a secondary infection with BLV: the method used (in vitro culture of lymphocytes) does not make it possible to identify the BLV virus in these cases;

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Abstract

Le vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), comprend une fraction peptidique, ou un virus recombinant l'exprimant, qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants. La glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire ou à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.

Description

Vaccin contre le virus de la leucémie bovine.
La présente invention a trait à un vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), notamment à un vaccin recombinant ou obtenu par recombinaison.
La leucémie bovine ou leucose bovine enzootique est une maladie hautement contagieuse due à un rétrovirus, le virus de la leucémie bovine (BLV). Cette maladie, qui sévit principalement dans les pays de l'Europe de l'Est et en Amérique du Nord et du Sud, touche essentiellement les ovins et les bovins, conduisant à une infection quasi généralisée des troupeaux. Il s'agit d'une maladie dont l'évolution est relativement lente, mais qui, dans de nombreux cas, induit des tumeurs, entrainant la mort de l'animal infecté. Le développement de cette maladie est d'autant plus préoccupant que. l'on ne dispose à l'heure actuelle pratiquement d'aucun moyen pour la combattre et pour éviter la propagation du virus. La solution consistait jusqu'ici à isoler les animaux infectés et à les abattre.
Le mouton est l'anima] expérimental par excellence pour les études de transmission de la maladie (voir notamment Mammerickx, M. et al. cité ci-après et Mammerickx , M. et al. dans Leukemia Research, 11, 353-358 (1987) dans lequel il est montré que l'injection en quantité minime de lymphocytes provenant d'animaux infectés (926 lymphocytes) provoque l'apparition des symptômes de la maladie chez le mouton).
On a cherché depuis de nombreuses années à metbre au point un vaccin qui puisse apporter une certaine protection contre la leucémie bovine.
J. MILLER et M. VAN DER MAATEN ont mentionné dans Ann. Recherche Vét., p. 871 à 877, 9 (1978) la possibilité d'utiliser des glycoproteines de l'enveloppe du virus BLV inactivé, commme principe actif d'un vaccin.
L.V. PATRASCU et al. ont décrit, dans Rev. Méd. Virologie, p. 995 à 1002, 31 (1980), la préparation d'un vaccin dénommé BL-VACC-RO contre le virus de la leucémie bovine, obtenu à partir d'un virus BLV inactivé.
M. MAMMERICKX, D. PORTETELLE, A. BURNY et J. LEUEN rapportent, dans Zbl. Vet. Med. B27, p. 291 à 303 (1981), les résultats d'études qui montrent que des anticorps passifs acquis par le colostrum protègent les animaux contre une infection.
M. ONUMA et al. signalent dans Am. J. Vet. Res. 45, p. 1212 à 1215 (1984) que les anticorps contre la glycoprotéine d'enveloppe de poids moléculaire 51 000 du virus BLV, désignée par l'abréviation gp51, montrent une activité neutralisante contre le. virus BLV. Dans cet article, il est fait état de vaccins réalisés à partir de la glycoprotéine gp51, de la protéine p24 et de cellules de reins d'agneau foetal (FLK) infectées et qui, administrés au mouton, apportent une certaine protection.
PARFANOVICH et al. décrivent dans Br . Vet. J. 139, p.
137 à 146 (1983) la préparation d'un virus BLV inactivé à l'aide de composés aminométhylés provenant de la réaction entre le formaldéhyde et un amino-acide tel que la leucine ou la lysine.
G. H. THEILEN et al. dans Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science 15, p. 547 à 559 (1982) indiquent avoir vacciné des bovins avec des cellules vivantes provenant d'une lignée cellulaire BL-3, obtenue à partir de moelle osseuse et de thymus d'un cas sporadique de leucose bovine.
E. RISTAU et al. dans Arch. Exper. Vet. Med. Leipzig 41, p. 185 à 196, et p. 323 à 331 (1987) font de leur côté état d'expériences de vaccination utilisant ces cellules BL-3.
KONO et al. dans Jpn . J. Vet. Sci. 48, p. 117 à 125 (1986) rapportent les résultats d'une étude montrant que des anticorps acquis passivement ou après injection de la glycoprotéine d'enveloppe gp51 purifiée protègent d'une surinfection ultérieure, à condition que les taux d'anticorps anti-gp51 soient suffisants avant la surinfection par BLV .
Tous ces vaccins ne confèrent toutefois qu'une protection de très courte durée et aucun n'a reçu une application à grande échelle.
II est connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 induit des anticorps neutralisants.
C. BRUCK et al. dans Virology 122, 342-352 (1982) ont mis en évidence huit régions antigéniques indépendantes sur la glycoprotéine gp51 par compétition d'anticorps monoclonaux anti-BLV.
D. PORTETELLE et al. dans Comm. Eur . Communities (REP) EUR (1984), EUR 8471, Agriculture, 45-51 précisent que trois de ces épitopes, F, G, H, situés sur un fragment apparemment non glycosylé, de poids moléculaire d'environ 15 000, obtenu par digestion par une solution d'urokinase de la glycoprotéine gp51, sont impliqués dans la neutralisation du virus, et envisagent la possibilité de préparer un vaccin anti-BLV par insertion du gène d'enveloppe gp51 ou d'une région correspondant aux sites biologiquement actifs dans un système d'expression autorisant la glycosylation.
D. PORTETELLE et al. dans J. CELL . Biochem. Suppl. 10A (1986) (abrégé) et dans Virology, 169, 27-33 (1989) estiment que les trois épitopes F, G, H peuvent jouer un rôle important dans la conception d'un vaccin de sous-unité anti-BLV. Ces trois épitopes sont sensibles à la présence d'un agent de réduction, sont localisés sur un fragment faiblement glycoεylé sur la partie NH2 terminale de la glycoprotéine et sont les seuls épitopes reconnus sur le virion non dégradé.
Il a été décrit dans la demande de brevet FR-A-87-03881 déposée par le demandeur le 20 mars 1987 des fractions peptidiques induisant la formation d'anticorps protecteurs contre le virus de la leucémie bovine (BLV) qui sont caractérisées par le fait qu'elles comportent une séquence peptidique reproduisant tout ou partie de la séquence du fragment de l'enveloppe glycoprotéique gp51 du virus de la leucémie bovine portant au moins l'un des épitopes F, G, H responsables de l'activité biologique du virus.
Enfin , K. OHISHI et al., dans Vaccine (1988), 7, 428432, ont essayé d'exprimer gρ51 par le gène env en entier.
S'il est donc connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 peut induire la formation d'anticorps neutralisants, et si l'on a pu identifier et localiser sur cette glycoprotéine les épitopes responsables de l'activité biologique du virus, il n'a cependant pas été jusqu'ici possible de développer un vaccin qui puisse conférer une bonne protection contre la leucémie bovine sur une longue période. Les difficultés rencontrées dans la mise au point d'un vaccin, résident dans l'immunogénicité insuffisante de la glycoprotéine ou de son fragment qui porte les épitopes F, G, H responsables de l'activité du virus, due à la configuration spatiale fragile de ces épitopes.
La présente invention a pour objectif de fournir un vaccin dans lequel la gp51 se retrouve dans sa configuration native où les épitopes F, G, H sont présents et bien exposés, comme à la surface d'une particule virale, permettant aux propriétés immunogènes de ces épitopes de pleinement se manifester. Le vaccin conforme à l'invention comprend une fraction peptidique qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes
F, G et H responsables de l'activité biologique du virus
BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
Ces épitopes sont alors reconnus par les anticorps monoclonaux dirigés contre eux-mêmes sur la particule virale.
La glycoprotéine transmembranaire associée à la glycoprotéine d'enveloppe gp51 est avantageusement constituée par la glycoprotéine gp30 du virus BLV, laquelle interagit avec la glycoprotéine gp51 pour restituer à celle-ci sa configuration native où les épitopes F, G, H sont présents. Ces épitopes retrouvent la configuration native observée à la surface de la particule virale BLV et présentent, alors, une très grande réactivité avec les anticorps monoclonaux dirigés contre eux.
La glycoprotéine transmembranaire gp30 est un polypeptide fortement gϋycosylé comportant 214 acides aminés et qui est, en particulier, responsable de la bonne fixation des protéines d'enveloppe dans la membrane de la cellule infectée.
Les deux protéines glycosylées gp51 et gp30, de poids moléculaires apparents 51000, respectivement 30000 daltons, sont codées par le gène env du virus. La séquence en acides aminés de la gp30 est typique des protéines transmembranaires de retrovirus : deux régions très hydrophobes dont celle située à l'extrémité -COOH terminale est probablement celle qui traverse la membrane virale. Voir N.R. RICE et al., Virology (1984) 138, 82-93.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on synthétise les glycoproteines gp51 et gp30 dans un système d'expression qui exprime ensemble, en une molécule unique, la gp51 et la gp30 et qui peut être, par exemple, un virus recombinant ou une levure.
Le molécule comprenant gp51 et gp30 ainsi exprimée comprend un site de clivage naturel.
Toutefois, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on pourra, selon toute méthode connue, induire une mutation du gène codant pour ladite molécule avant son insertion dans le plasmide, de façon que la molécule contenant gp51 et gp30 soit dépourvue de son site de clivage naturel. Dans ce mode de réalisation, les glycoproteines gp51 et gp30 resteront donc liées par liaison covalente.
Ceci peut être réalisé par exemple en induisant une mutation de la séquence en acides aminés 268-269 de façon à obtenir Gln-Thr au lieu de Arg-Ser, avec la méthode de Eckstein, pratiquée avec un kit commercial du type Amersham "In vitro Mutagenesis System", code RPN 2322.
Grâce à la technique des virus recombinants, de nombreux gènes étrangers ont pu être insérés et exprimés.
L'insertion des gènes codant pour la gp51 et la gp30, dans le génome du virus s'effectue par les techniques, maintenant bien connues, de construction de recombinants et qui comportent la série d'étapes suivante :
- insertion du gène env (gène codant pour la gp51 et la gp30) dans un vecteur p] a.smi.dique convenable,
- introduction du plasmide recombinant dans une cellule préalablement infectée par une souche du virus,
- les séquences nucléotidiques étant identiques, une recombinaison in vitro intervient entre les régions homologues du plasmide recombinant et de l'ADN viral ; par cette recombinaison, le gène env se trouve intégré dans le génome du virus dans lequel il est propagé et exprimé.
L'insertion du gène codant pour la gp51, en même temps que du gène codant pour la gp30, dans le génome du virus, peut être, bien entendu, réalisée encore sous des formes très diverses :
- gène env provenant d'un variant BLV, par exemple dépourvu de l'un ou de deux des trois sites F, G, H,
- insertion d'un morceau seulement du gène codant pour la gp51, par exemple provenant d'un variant BLV,
- insertion d'une séquence nucléotidique pouvant provenir d'un provirus BLV clone ou bien d'une copie d'ADNc résultant de la transcription inverse de l'ARN viral,
- ou d'un oligonucléotide synthétique codant pour tout ou partie de la gp51.
Parmi les virus utilisables, on peut citer notamment les adénovirus, les herpèsvirus, le virus de la vaccine, le virus Fowlpox, le virus Canarypox et les baculovirus. (Pour un vecteur Fowlpox, voir par exemple J. Taylor et E. Paoletti dans Vaccine (1988), 6, p 466-467 et J. Taylor et al. dans Vaccine (1988), 6, p 497-503).
Les virus recombinants peuvent être utilisés tels quels comme agents vaccinants contre la leucémie bovine ou pourront être utilisés pour infecter une culture cellulaire et produire in vitro la fraction peptidique, que l'on récupérera et que l'on utilisera comme agent vaccinant.
Bien entendu, dans le cas de vaccins comprenant des virus recombinants, le virus recombinant peut avantageusement exprimer une molécule unique, comprenant gp51 et gp30, dépourvue ou non de site de clivage.
Les vaccins ainsi préparés peuvent être administrés par des voies variées ; en particulier, on peut procéder par voie intradermique, sous-cutanée ou intramusculaire. Ils peuvent être administrés avec des supports pharmaceutiques connus et comporter , en outre , des adjuvants .
Pour la préparation de vaccins, si les virus recombinants constituent un moyen particulièrement commode pour que soient exprimées ensemble la gp51 et la gp30, de nombreux autres systèmes d'expression peuvent être également utilisés tels que les levures, notamment la levure S. cerevisiae. La présente invention s'étend donc aussi, d'une façon générale, à tout vaccin comprenant un système d'expression qui permet d'exprimer ensemble la gp51 et la gp30.
On peut également obtenir des préparations vaccinales selon l'invention à base de liposomes dans lesquels la fraction gp51 et gp30 serait insérée dans les couches lipidiques.
Les glycoproteines gp51 et gp30 peuvent être également insérées dans des préparations type ISCOM ("Immunostimulating complex") telles que celles qui ont été décrites par B.
MOREIN et al. dans Immunology Today, Vol. 8, nº 11, p. 333 à
338 (1987).
Les glycoproteines gp51 et gp30 peuvent être encore insérées dans des polyélectrolytes (copolymère d'acide acrylique et de N-vinylpyrrolidone), servant notamment d'adjuvant à gp51 et gp30 (voir Petrov et al., Immmunology
Letters (1986), 12, 237-242).
L'invention concerne encore des vaccins contre la leucémie bovine obtenus à partir de ces préparations ISCOM ou de ces polyélectrolytes.
Les inventeurs ont constaté que l'on pouvait également, dans une certaine mesure, redonner à la gp51 sa configuration native, en fixant sur cette glycoprotéine un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes.
Une variante de réalisation de l'invention consisterait donc en un vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV) comprenant une fraction peptidique comportant la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et induisant à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. L'anticorps monoclonal que l'on fixe à la yp51 est avantageusement constitué par l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A.
Une variante de réalisation de l'invention consisterait donc à fixer sur la glycoprotéine gp51 un anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A.
L'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A interagit avec la gp51, à la manière de la gp30, restituant à la gp51 sa configuration native.
La gp51 sur laquelle on a fixé un anticorps monoclonal dirigé contre les épitopes E ou A, est reconnue par les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G, H.
La gp51 et l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou A peuvent être exprimés dans un système d'expression.
Un tel .système d'expression peut être constitué par un virus recombinant dans lequel on a inséré le gène codant pour la gp51 et des gènes codant pour l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou le site A.
On peut aussi envisager d'insérer dans des préparations type "ISCOM" l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou le site A et qui capte, ensuite, l'antigène gp51 à sa surface.
L'invention s'étendrait, également, aux vaccins obtenus à partir d'un, ou contenant un virus recombinant exprimant la gp51 liée à son anticorps monoclonal E ou A, ou encore réalisés à partir des préparations type ISCOM dons lequelles est inséré l'anticorps monoclonal qui captera, ensuite, la gp51.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple de mise en oeuvre de l'invention donné, ci-après, à titre non limitatif.
Sur les figures annexées :
- la figure 1 représente la courbe de titration des anticorps gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombinants qui expriment d'une part la gp51 seule, et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble; - les figures 2, 3 et 4 représentent les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombinants qui expriment d'une part la gp51 et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble, avec respectivement les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G et H liés à l'enzyme peroxydase.
EXEMPLE
On dispose notamment :
- d'un recombinant vaccine exprimant la gρ51 seule : VP391; - de recombinants vaccine exprimant la gp51 et la gp30 :
VP392 et VP459;
- d'un recombinant vaccine exprimant la gp51 et la gp30, en l'absence du site de clivage naturel entre ces deux glycoproteines : VP482 ; et
- d'un recombinant obtenu à partir du plasmide pGS20 et exprimant la gp51 et la gp30 : VV-ENV1 (voir construction ci-après) .
CONSTRUCTION DU RECOMBINANT OBTENU A PARTIR DU PLASMIDE
pGS20 (gp51 + gp30)
a) Obtention d'une banque d'ADNc dans λgt10
Les ARNs totaux ont été extraits de cellules de poumon de chauve-souris produisant de façon chronique du virus BLV. Les ARNs poly A+ ont été sélectionnés sur une colonne d'oligo-dT-cellulose afin d'être copiés en ADNc bicaténaires et liés au site EcoRI de l'ADN du phage Λgt10.
b) Recherche d'ADNc correspondant à l'ARN messager de l'enveloppe
Des bactéries C600 HFL sont. infectées par les bactériophages de la banque d'ADNc et étalées sur boîtes de Petri. Chaque phage recombinant produit une plage de lyse. Une empreinte de la boîte de Petri est réalisée sur un filtre de nitrocellulose. Après dénaturation et neutralisation, l'ADN fixé sur le filtre est hybride avec une sonde "BLV provirale" marquée au 32P par la technique de "déplacements de coupures" (Nick-translation). Le filtre est ensuite autoradiographié. La sonde "BLV provirale" permet de repérer les clones renfermant de l'ADNc du BLV. Les phages contenant une information provirale sont ensuite purifiés, digérés par l'enzyme de restriction EcoRI ; les fragments sont séparés par électrophorèse, transférés sur filtre en nitrocellulose, selon la méthode de "Southern".
L'hybridation moléculaire réalisée avec une sonde spécifique de la région env du virus BLV et une analyse par enzymes de restriction permettent de repérer et purifier les phages recombinants porteurs de l'information complète pour le gène env.
c) Clonage dans le plasmide pGS20
Le plasmide pGS20 a été décrit dans Mackett et al. J. of Virology (1984) 49, 857-863. Il est constitué d'une partie du plasmide pBR328 et du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine (gène TK). Le promoteur 7,5 K de ce Poxvirus, suivi de deux sites de clonage, est inséré dans le gène TK .
Pour obtenir l'insert de 2,3 kb contenant la phase de lecture des 2 glycoproteines, l'ADN d'un phage recombinant intéressant est digéré par l'endonucléase de restriction Xho I. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose. Le fragment de 2,3 kb est récupéré par électrophorèse et ses extrémités 5' en saillie sont rendues franches par un traitement par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I.
Le vecteur pGS20 est linéarisé par l'endonucléase de restriction Sma I et traité à la phosphatase alcaline.
L'insert "ENV" de 2,3 kb est lié au site Sma I du plasmide pGS20. Des bactéries E. coli (souche MM294) rendues compétentes sont transformées. La sélection des bactéries transformées est réalisée sur ampicilline.
Un clone renfermant l'insert, dans le sens 5'-3' derrière le promoteur P7,5K, est choisi. Le sens de l'insert est vérifié par la double digestion Eco RI-Pvu II.
On obtient le plasmide pGS20-ENV. La suite des opérations est résumée avantageusement dans le schéma I ci-joint.
d) Infection de cellules CV1 par le virus de la vaccine sauvage et transfection avec le plasmide recombinant pGS20-ENV.
Des cellules. CV1 (fi broblastes de singe) sont cultivées en couche monocellulaire. D'autre part, des particules de virus de la vaccine sauvage sont produites sur cellules confluentes.
Les fibroblastes sont infectés, à raison d'une particule virale par cellule. Le plasmide recombinant pGS20-ENV est précipité en présence de phosphate de calcium sur les fibroblastes infectés. Après 48 heures de culture, le virus est libéré des cellules par une alternance gel-dégel.
e) Sélection et purification d'un virus recombinant de la vaccine contenant le gène env.
Des cellules confluentes dépourvues de l'activité thymidine kinase (TK") sont infectées par le virus obtenu après transfection. Après 48 heures d'infection, les cellules sont recouvertes de gélose contenant de la bromodésoxyuridine. Le phénotype TK+ est létal en présence de bromodésoxyuridine. Seules des plages constituées par du virus TK- (ayant inséré un gène étanger lors de la recombinaison homologue à l'étape de transfection) se forment.
Après 2 ou 3 jours, les plages de lyse r.ont visualisées après coloration des cellules vivantes au rouge neutre. Le virus correspondant aux plages observées est prélevé, multiplié ; l'ADN des clones isolés est extrait et hybride à la sonde "ENV".
Seuls le ou les clones hybridant à la sonde "ENV" sont conservés pour les clonages ultérieurs et les tests d'expression de gp51 et de gp30.
Nous avons ainsi sélectionné le virus recombinant VV-ENV1 exprimant à la fois gp51 et gp30.
PREPARATION ET CARACTERISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LES EPITOPES DE LA GP51 Immunisation des souris
On a injecté à des souris Balb/c par voie sous-cutanée et intrapéritonéale 50 fiq de gp51 en présence d'adjuvant complet de Freund. Cette injection a été répétée 2 semaines après en présence d'adjuvant incomplet de Freund, puis 4 semaines après sans adjuvant. On a procédé, deux mois après, à une dernière injection par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse.
Fusion des cellules
On a préparé les hybrides par fusion de cellules de myélome de souris avec les splénocytes des souris immunisées selon la technique décrite par HERZENBERG L.A. et al. dans Handbook of Expérimental Immunology (D. WEIR, éd.) 25.1-25 (Blackwell, London).
Les hybrides obtenus ont été répartis en plaques de 96 puits et sélectionnés sur milieu HAT en présence de thymocytes et de macrophages de souris. Les hybrides producteurs d'anticorps anti-gp51 ont été détectés à l'aide d'un radioimmuno-essai en phase liquide avec l'antigène gp51 marqué à l'iode 125 ou à l'aide d'un radio-immuno-essai en phase solide avec du virus BLV adsorbé dans les puits des microplaques. Dans ce dernier cas, les anticorps spécifiques adsorbés sur le virus ont été détectés avec une antiimmunoglobuline de souris marquée à l'iode 125. Après lavage, la radioactivité adsorbée sur les complexes spécifiques est révélée par autoradiographie.
Les clones producteurs sélectionnés ont été transférés sur des plaques de 24 puits et sous-clonés en milieu semisolide d'agarose.
Les cellules hybrides obtenues ont été injectées dans la cavité intrapéritonéale de souris préalablement traitées au pristane. Après 10 à 15 jours, on a récolté les ascites qui contenaient des quantités importantes des anticorps monoclonaux recherchés.
Purification et caractérisation des anticorps monoclonaux On a purifié ces anticorps monoclonaux par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Affigel Blue selon la méthode décrite par Bruck et al. dans J. Immunological Methods 53, 313-319 (1982).
Ces anticorps monoclonaux ont été marqués par l'iode 125 par le procédé à la chloramine T décrit par GREENWOOD F.C. et al. dans Biochemical Journal, 89, 114-123 (1963).
La spécificité des différents anticorps monoclonaux obtenus pour des épitopes donnés a été déterminée par des essais de compétition entre les anticorps pour de l'antigène gp51 adsorbé dans les puits des plaques de microtitration.
A cet effet, un microgramme d'anticorps monoclonal purifié non marqué radioactivement est incubé, pendant une nuit à 4ºC, dans un volume de 50 ul dans les puits d'une plaque de microtitration en matière plastique contenant la gp51 adsorbée (50 ng).
De l'anticorps marqué radioactivement à l'iode 125 (10 ng-100.000 cpm) est alors ajouté et l'incubation se poursuit 6 heures de plus à 4ºC.
Les microplaques sont alors lavées intensivement et la radioactivité accrochée à la matière plastique de chaque puits est mesurée dans un compteur de type ɣ.
On interprète les résultats en sachant que, si deux sites antigéniques sont très proches ou identiques, la liaison de l'un des anticorps (non marqué) à son épitope, va gêner ou empêcher la liaison du second anticorps (marqué) à son épitope.
Les essais de compétition entre les anticorps monoclonaux purifiés permettent de définir sur la molécule de gp51 huit sites antigéniques indépendants désignés par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H.
CARACTERISATION DES RECOMBINANTS A L'AIDE DES ANTICORPS MONOCLONAUX
La mise en évidence des épitopes F, G, H à la surface des cellules infectées par les recombinants est effectuée par l'une ou l'autre des deux méthodes suivantes : 1. IMMUNOFLUORESCENCE
Des cellules sensibles (cellules VERO) sont ensemencées dans des tubes de Leighton. Après croissance, elles sont infectées dans un ordre de multiplicité de 5 à l'aide des différents recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 et de VTK79 (vaccine sauvage). Après 20 heures d'infection, les lames sont récupérées et incubées avec chacun des anticorps monoclonaux anti-gp51, dirigés respectivement contre les sites définis A, B, B', C, D, D', E, F, G et H.
Après 1 heure d'incubation, les lames sont lavées plusieurs fois avec du tampon isotonique PBS, puis incubées avec le conjugué anticorps anti-immunoglobulines murines marquées à la fluorescéine.
Après 1 heure d'incubation, les cellules sont lavées, puis les lames sont montées pour être examinées avec un microscope avec lampe U.V., à l'aide de l'objectif à immersion.
Les résultats sont interprétés comme négatifs (-) si aucune fluorescence n'est observée. Une fluorescence est signalée par +/- (lorsque le cas est douteux) ou par + ou +++ (lorsqu'ils sont positifs) selon l'intensité observée.
Les résultats obtenus ont été rassemblés dans le Tableau I.
On note une très bonne immunofluorescence sur les sites F, G, H sur le recombinant VV-ENV1.
On note que l'on obtient une très bonne immunofluorescence pour les sites F et H sur le recombinant VP392 alors que le recombinant VP391 présente une immunofluorescence très faible pour ces mêmes épitopes. L ' immunofluorescence sur VP391 et VP392 est d'intensité égale pour tous les sites A, B, B', D, D', E.
On observe l'absence du site G sur les recombinants
VP391 et VP392. L'absence de cet épitope s'explique par le fait que le clone T 15-2 à partir duquel le gène codant pour la gp51 a été introduit dans le virus est un variant G-, non reconnu par l'anticorps monoclonal MONO G. Ces résultats montrent donc que, pour présenter au système immunitaire des animaux un antigène gp51 à l'aide d'un virus recombinant, il importe que la gp30 soit associée à la gp51, de façon à avoir un antigène gp51 possédant la configuration native observée sur une particule virale BLV, où les sites F, G, H sont les mieux exposés.
2. TEST ELISA
Le test permet de mettre en évidence la présence des sites A, B, B' , C, D, D', E, F, G et H définis par les anticorps monoclonaux sur la gp51.
Un extrait cellulaire ou de surnageants de culture de cellules infectées par un virus recombinant ou bien par le virus BLV est pris en sandwich entre l'anticorps monoclonal capteur anti E et un anticorps monoclonal de révélation conjugué à la peroxydase. La présence finale d'une coloration est le signe de la présence du site antigénique reconnu par l'anticorps monoclonal de révélation.
Cette technique montre bien, par exemple, que le site G est absent sur les préparations VP391 et VP392 obtenues avec le variant provirus BLV T15-2 ; mais qu'il est, par contre, présent lorsque le recombinant est obtenu en insérant l'information codant pour la gp51 et la gp30 à partir de
1 ' ADNc copié sur l'ARN viral du virus BLV produit par les cellules de chauve-souris BL .
ADAPTATION DES RECOMBINANTS VACCINE SUR CELLULES OVINES
On a mené une expérience d'adaptation du recombinant
VP392 (gp51 + gp30), par passages répétés sur une lignée cellulaire d'origine OVK (ovine kidney cells).
L'expérience a été conduite du 17 avril 1987 au 21 juin 1987 en subcultivant deux fois par semaine les cellules OVK et les cellules VERO (utilisées comme contrôle), en boîtes de Roux 25 cm2. Arrivées à confluence, les cellules étaient lavées et infectées avec VP392 provenant de l'infection du passage antérieur (55 μl prélevées du ml de suspension virale provenant de la boîte de Roux 25 cm2). Par boîte de Roux 25 cra2, on dénombre à confluence 3 × 106 cellules OVK contre 9 × 106 cellules VERO.
Les différentes suspensions virales ont été conservées à -20ºC. On a déterminé leur titre en virus par titration en boîtes de 24 puits, selon la méthode des dilutions limites (quatre répétitions par dilution, table de calcul de DL 50 selon Read-Muench). Lors des titrations, le recombinant a été, à chaque fois, testé sur cellules VERO et sur cellules OVK.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau II. Les titres en virus (DL50) rapportés ont été obtenus après respectivement 30 jours (16/5), 35 jours (21/5), 45 jours (1/6) et 60 jours (15/6) d'adaptation sur cellules
OVK.
Ces résultats montrent que les titres observés sur OVK sont plus faibles que ceux obtenus sur VERO. Cette différence s'explique, par le fait que la quantité de cellules OVK mise en oeuvre est trois fois moindre par boîte de Roux 25cm2.
On note que, si le virus recombinant VP392 se réplique un peu moins bien sur cellules OVK que sur cellules VERO, sa réplication sur cellules OVK reste, néanmoins, bonne.
IMMUNISATION DE LAPINS A L'AIDE DE RECOMBINANTS VACCINE Plusieurs lapins ont été immunisés à l'aide de suspensions de recombinants vaccine, soit par voie intradermique (ID) seule, soit par voie intraveineuse (IV) (50 % de la dose) et par voie intradermique (50 % de la dose). Les doses de virus infectieux par immunisation étaient de l'ordre de 10 pfu/ml. Un rappel a été effectué dans les mêmes conditions six semaines après le premier traitement.
Des prélèvements de sérum .sanguin ont été effectués à plusieurs moments. Plusieurs tests ont été effectués sur ces sérums.
1. TEST ELISA
Ce test, utilisé pour la détection des anticorps dans le sérum sanguin, a été réalisé dans les conditions suivantes: - fixation de 100 ng d'anticorps monoclonal MONO E purifié sur les parois des puits d'une plaque de microtitration ; incubation pendant 16 heures à 4ºC;
- après lavage et saturation avec une protéine inerte, la sérumalbumine bovine, introduction (en présence de la protéine inerte) d'une préparation de protéines virales traitée au détergent Tween 80 2 % (la préparation et le surnageant de culture des cellules FLK productrices de façon chronique du virus BLV);
- après incubation de 48 heures minimum à 4ºC et lavages, introduction dans les puits de 200 ul des dilutions progressives d'antiserum à tester (8 dilutions de 3 en 3 à partir de la dilution 20) ; incubation pendant 16 heures à 4ºC;
- après lavage, addition de 100 μI par puits de tampon contenant 200 ng de fragment Fab d'immunoglobulines de chèvre purifiés par chromatographie d'affinité, dirigés spécifiquement contre les immunoglobulines de lapin et couplés à l'enzyme peroxydase ; incubation pendant 1 heure à 4ºC;
- après lavage, révélation de l'activité enzymatique associée aux parois, à l'aide de substrat H2 O2 + tétraméthylbenzidine;
- après 20 mn, arrêt de la réaction avec H2, SO4 2 N et lecture des densités optiques D.O. à l'aide d'un spectrophotomètre pour microplaques de titration.
2. TEST ELISA DE COMPETITION
Le test permet de déterminer la présence d'anticorps de lapins entrant en compétition avec les anticorps monoclonaux conjugués à la peroxydase.
Le test a été réalisé dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites à propos du test ELISA, avec cette différence que l'enzyme peroxydase est couplée avec des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre les épitopes A à H de la gp51.
A cette fin, on additionne, par puits, 100 μl de tampon contenant 200 ng d'anticorps purifiés par chromatographie d'affinité et dirigés spécifiquement contre les sites antigéniques A, B, B' ......F, G, H.
3. TEST D'INHIBITION DES PSEUDOTYPES VSV/BLV
Ce test, décrit par ZAVADA J. et al. dans J. Natl. Cancer Inst., p. 95 à 101 (1979), a été utilisé afin de déterminer la capacité qu'ont les sérums de lapins auxquels ont été injectés des recombinants, de neutraliser l'activité biologique du virus BLV.
Le test d'inhibition de pseudotypes est basé sur des observations de J. ZAVADA et al. montrant que l'infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) de cellules chroniquement infectées par le virus BLV fournit des particules virales dont le génome est constitué de celui du virus VSV et dont l'enveloppe est celle du virus BLV (pseudotype).
Ces pseudotypes VSV/BLV possèdent les propriétés spécifiques liées à la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV comme la neutralisation et la spécificité d'hôte. Le génome VSV inclus dans ces pseudotypes rend les particules capables de former rapidement (24-36 heures) des plages de lyse sur les cellules de singe qu'on a infectées par ces pseudotypes.
Brièvement, pour la neutralisation des pseudotypes avec les sérums à tester, on mélange 1 ml d'une préparation de pseudotypes pouvant former 200 plages de lyse sur les celIules à tester (10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et d'autres dilutions intermédiaires). Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56ºC) pendant 30 minutes.
Après une heure d'incubation à 20ºC, on inocule 0,5 ml de chaque mélange sur un tapis de cellules de singe se trouvant dans une boîte de Petri. Après 90 mn d'incubation, l'inoculum est enlevé par lavage avec du tampon isotonique stérile et les cellules sont recouvertes d'une couche d'agar.
Après 24-36 heures d'incubation à 37ºC, les cellules sont colorées au rouge neutre et les plages de lyse résiduelles sont comptées.
Le titre en anticorps neutralisants contre le virus BLV est obtenu en déterminant la dilution de sérum avec laquelle on n'obtient seulement que 50 % des plages de lyse obtenues en l'absence de sérum à tester.
4. TEST D'INHIBITION DE SYNCYTIA
Ce test repose sur la constatation faite que des anticorps neutralisants peuvent empêcher la fusion des membranes cellulaires, mais non des membranes nucléaires, entre cellules ayant reçu BLV par injection et cellules indicatrices de chat CC81 (le test a été utilisé pour caractériser les anticorps monoclonaux par BRUCK et al . dans Virology (1982) 122 p. 353-362). Les résultats représentent la dilution maximale de sérum pour laquelle on observe une diminution de 50 % du nombre de syncytia.
Brièvement, pour obtenir l'inhibition des syncytia avec les sérums à tester, on incube dans les puits d'une plaque de microtitration les dilutions de sérum (2, 4, 8, 16 ...) avec les cellules FLK productrices de virus BLV. Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56ºC) pendant 30 minutes.
Après trois heures d'incubation à 37ºC, le milieu de culture est enlevé et les noyaux de cellules adhérentes sont colorés à l'aide du réactif de Giemsa.
Les cellules contenant plus de 5 noyaux sont considérées comme syncytia. Les dilutions de sérum neutralisant au moins à 50 % la formation de syncytia sont considérées comme positives.
5. RESULTATS
Dans le Tableau III, on a rassemblé les résultats, de ces 4 tests, obtenus avec VP391, VP392, VV-ENV1, VP459 (gp51 + gp30) et VP482.
On a représenté sur la figure 1 des courbes de titration des anticorps anti-gp51, obtenues par la méthode ELISA précédemment décrite. On a porté en abscisses les dilutions du sérum et en ordonnées la densité optique D.O. mesurée à 460 nm .
Les courbes référencées 4-4 et 5-5 sont les courbes obtenues avec les lapins qui ont reçu le virus recombinant VP391 (gp51 seule) - lapins nº 4 et 5.
Les courbes référencées 7-7, 8-8 et 10-10 sont les courbes obtenues avec les lapins qui ont reçu le virus recombinant VP392 (gp51 et gp30)-lapins nº 7, 8 et 10.
La courbe référencée 11-11 est la courbe obtenue avec un lapin qui a reçu la gp51 purifiée dans l'adjuvant complet de Freund (ACF) - lapin nº 2670.
La courbe référencée 12-12 est la courbe obtenue avec un lapin normal.
Sur les figures 2, 3 et 4 , on a représenté les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapin respectivement avec les anticorps monoclonaux F, G et H couplés à la peroxydase.
L'ensemble des résultats obtenus montre donc que, lorsque l'on administre. à un lapin le virus recombinant qui exprime la gp51 et la gp30 (VP392, VP459, VP482, VV-ENV1 ) , les anticorps formés
- présentent une activité neutralisante ; les anticorps du lapin nº 10 ont même un pouvoir neutralisant supérieur à celui des anticorps de lapin nº 2670 ayant reçu la gp51 purifiée ;
- entrent très bien en compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les sites biologiques F, G, H.
On constate, par contre, qu'aucune compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G, H n'est apparente avec les anticorps des lapins 4 et 5 qui ont reçu le recombinant qui exprime la gp51 seule (VP391).
De plus, aucune activité neutralisante et protectrice des anticorps de ces lapins n'a pu être mise en évidence.
Il apparaît dans le tableau III que seules les associations gp51 et gp30 sont capables d'induire les hauts taux d'anticorps neutralisants dans les deux tests pratiqués. Les tests de compétition ELISA montrent que ces associations ont conservé les sites biologiques F, G, H décrits précédemment et impliqués dans la neutralisation du BLV.
IMMUNISATION DE MOUTONS A L'AIDE DE RECOMBINANTS
Un lot de moutons a été vacciné à l'aide des virus recombinants VP459, VP482 ainsi que la vaccine sauvage VP452. Ces moutons ont reçu deux fois par injection des recombinants avant d'être surinfectés par BLV à l'aide des cellules sanguines infectées provenant d'un animal leucémique.
Les moutons sont des moutons d'un an maximum dont le statut sérologique a été vérifié négatif pour le BLV. Les moutons 44 et 99 servent ici de contrôle à l'expérience de surinfection BLV.
Les recombinants de. la vaccine ont été inoculés lors de la première injection par voie intradermique (ID) et par voie sous-cutanée (SC) lors de la deuxième injection. Chaque mouton a reçu à chaque fois 2 doses de 108 recombinants vaccine le long de la colonne vertébrale.
L'intervalle de temps entre les injections de recombinants et la surinfection par BLV est chaque fois de 6 semaines.
On a réalisé la surinfection à l'aide de sang entier d'un animal bovin (31700 globules blancs par mm3 dont 86 % de lymphocytes). Le sang, d'abord recueilli sur EDTA, a été dilué 10 fois en citrate ; 0,5 ml de cette solution, soit l'équivalent de 50 ul de sang entier, a été injecté en 4 points intradermiques. Le virus BLV produit à partir des cellules sanguines mises en culture "short-term" s'est avéré être un variant G-, tous les autres sites étant conservés.
On a effectué des prises de sang toutes les semaines, parfois même à une fréquence plus grande, par exemple dans les jours suivant une inoculation du virus recombinant. On a réalisé des comptages de globules blancs et des formules sanguines. On a recueilli à chaque fois du sérum qui a été conservé à -20ºC.
La recherche des anticorps anti-gp51 a été effectuée par des tests ELISA. Ces tests ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites ; toutefois, dans la recherche des anticorps, les anti-immunoglobulines bovines ou ovines ont été couplées à l'enzyme β-galactosidase. Dans le test ELISA de compétition, utilisé également pour la recherche des anticorps, la compétition a lieu avec l'anticorps monoclonal contre l'épitope G, couplé à l'enzyme peroxydase.
Du sang a été prélevé sur EDTA deux à trois mois après la surinfection par les cellules infectées par le virus BLV. Les lymphocytes ont été recueillis par lyse différentielle et placés en culture in vitro pour une période de 96 heures. Le surnageant de culture a été dès lors recueilli et la présence des protéines virales gp51 et p24 a été recherchée par test ELISA.
Les moutons ont été suivis après la surinfection par
BLV pendant une période de 6 mois après celle-ci pour la détection d'anticorps antip24, signe de l'infection par le virus BLV, les animaux n'ayant vu avant la surinfection que les protéines gp51 et gp30.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV.
Ces résultats montrent :
- que des anticorps antigp51 ont été détectés à haut titre chez les moutons ayant reçu les recombinants VP459 et VP482.
Ces anticorps ont été détectés dans un test de compétition avec l'anticorps monoclonal G couplé à la peroxydase. Ces résultats sont en accord avec ceux observés dans l'article de Portetelle, D. et al. dans J. Virol. Methods, 23, 211-222 (1989) où la compétition existe avec l'anticorps monoclonal contre G, même si l'animal testé a été infecté par un variant BLV G-.
Dans des expériences préliminaires chez les moutons avec le recombinant VP391 (gp51 seule), aucune compétition n'avait pu être montrée avec l'anticorps monoclonal contre G (ou F ou H), comme cela est d'ailleurs décrit pour les lapins dans le tableau III ;
- que le virus BLV est détectable uniquement à partir des lymphocytes de moutons contrôles ou ayant reçu la vaccine sauvage VP452 ;
- que les recombinants exprimant gρ51 et gp30 (VP459 et VP482) diminuent fortement le nombre de cellules infectées ou empêchent l'infection lors d'une surinfection par BLV : la méthode utilisée (culture in vitro des lymphocytes) ne permet pas d'identifier le virus BLV dans ces cas ;
- que des anticorps antip24, signe d'infection par BLV, sont observés chez tous les contrôles et tous ceux ayant reçu VP452 ;
- qu'un seul mouton, ayant reçu VP459, présente un taux élevé persistant en anticorps antip24 et semble donc infecté;
- qu'un pouvoir neutralisant est observé chez les moutons ayant reçu VP459 ou VP482 ;
- qu'après surinfection, un pouvoir neutralisant élevé et ne décroissant pas est signe de l'infection par BLV ; un pouvoir neutralisant faible ou qui décroît dans le temps est signe d'une protection.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), comprenant une fraction peptidique qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épllopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprohéine transmembranaire est la glycoprotéine gp30 du virus BLV.
3. Vaccin selon la revendication 2, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont exprimées en une molécule unique dans un système d'expression.
4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce que la molécule comprenant gp51 et gp30 est dépourvue de site de clivage.
5. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont exprimées à l'aide d'un virus recombinant.
6. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce que le virus recombinant est choisi parmi le virus de la vaccine, le virus Fowlpox, le virus Canarypox, les adénovirus, les herpèsvirus et les baculovirus.
7. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont exprimées dans une levure.
8. Vaccin selon la revendication 7, caractérisé en ce que la levure est Saccharomices cerev.isiae.
9. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont insérées dans des liposomes.
10. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont insérées dans des polyélectrolytes.
11. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les glycoproteines gp51 et gp30 sont insérées dans une préparation de type ISCOM.
12. Vaccin recombinant contre le virus de la leucémie bovine, caractérisé en ce qu'il comprend des virus recombinants exprimant une fraction peptidique qui associe la glycoprotéine gp51 et la glycoprotéine transmembranaire gp30 qui restitue à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés dans la constitution de vaccins.
13. Vaccin recombinant selon 3a revendication 12, caractérisé en ce qu'il exprime une molécule unique, comprenant gp51 et gp30, dépourvue ou non de site de clivage.
14. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus correspondant tout ou partie des gènes codant pour les glycoproteines gp51 et gp30 provenant du virus BLV ou d'un variant BLV.
15. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus correspondant la séquence provenant d'un provirus BLV cloné.
16. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus correspondant une copie ADNc ou un oligonucléotide codant pour tout ou partie de la gp51 et de la gp30.
17. Vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV) comprenant une fraction peptidique comportant la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et induisant à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
18. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope E est fixé sur la glycoprotéine gρ51.
19. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope A est fixé sur la glycoprotéine gp51.
20. Vaccin selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 et l'anticorps monoclonal E ou A sont exprimés dans un système d'expression.
21. Vaccin selon la revendication 20, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 et l'anticorps monoclonal E ou A sont exprimés à l'aide d'un virus recombinant, dans lequel sont insérés le gène codant pour la gp51 et des gènes codant pour l'anticorps monoclonal contre l'épitope E ou A.
22. Vaccin selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'on insère dans une préparation de type ISCOM l'anticorps monoclonal E ou A, ledit anticorps captant ensuite la glycoprotéine gp51.
23. Vaccin contre la leucémie bovine, caractérisé en ce qu'il contient des virus recombinants tels que définis dans la revendication 21.
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