FR2648712A1 - Vaccin contre le virus de la leucemie bovine - Google Patents
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Abstract
Le vaccin contre le virus de la leucémie bovine BLV, comprend une fraction peptidique, ou un virus recombinant l'exprimant, qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants. La glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire ou à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
Description
Vaccin contre le virus de la leucémie bovine.
La présente invention a trait à un vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), notamment à un vaccin recombinant ou obtenu par recombinaison.
La leucémie bovine ou leucose bovine enzootique est une maladie hautement contagieuse due à un rétrovirus, le virus de la leucémie bovine (BLV). Cette maladie, qui sévit principalement dans les pays de l'Europe de l'Est et en
Amérique du Nord et du Sud, touche essentiellement les ovins et les bovins, conduisant à une infection quasi généralisée des troupeaux. Il s'agit d'une maladie dont l'évolution est relativement lente, mais qui, dans de nombreux cas, induit des tumeurs, entrainant la mort de l'animal infecté. Le développement de cette maladie est d'autant plus préoccupant que l'on ne dispose à l'heure actuelle pratiquement d'aucun moyen pour la combattre et pour éviter la propagation du virus. La solution consistait jusqu'ici à isoler les animaux infectés et à les abattre.
Amérique du Nord et du Sud, touche essentiellement les ovins et les bovins, conduisant à une infection quasi généralisée des troupeaux. Il s'agit d'une maladie dont l'évolution est relativement lente, mais qui, dans de nombreux cas, induit des tumeurs, entrainant la mort de l'animal infecté. Le développement de cette maladie est d'autant plus préoccupant que l'on ne dispose à l'heure actuelle pratiquement d'aucun moyen pour la combattre et pour éviter la propagation du virus. La solution consistait jusqu'ici à isoler les animaux infectés et à les abattre.
Le mouton est l'animal expérimental par excellence pour les études de transmission de la maladie (voir notamment
Mammerickx, M. et al. cité ci-après et Mammerickx , M. et al. dans Leukemia Research, lir 353-358 (1987) dans lequel il est montré que l'injection en quantité mirrime de lymphocytes provenant d'animaux infectés (926 lymphocytes) provoque l'apparition des symptomes de la maladie chez le mouton).
Mammerickx, M. et al. cité ci-après et Mammerickx , M. et al. dans Leukemia Research, lir 353-358 (1987) dans lequel il est montré que l'injection en quantité mirrime de lymphocytes provenant d'animaux infectés (926 lymphocytes) provoque l'apparition des symptomes de la maladie chez le mouton).
On a cherché depuis de nombreuses années à mettre au point un vaccin qui puisse apporter une certaine protection contre la leucémie bovine.
J. MILLER et M. VAN DER MAATEN ont mentionné dans Ann.
Recherche Vét., p. 871 à 877, 9 (1978) la possibilité d'utiliser des glycoprotéines de l'enveloppe du virus BLV inactivé, commme principe actif d'un vaccin.
L.V. PATRASCU et al. ont décrit, dans Rev. Méd.
Virologie, p. 995 à 1002, 31 (1980), la préparation d'un vaccin dénommé BL-VACC-RO contre le virus de la leucémie bovine, obtenu à partir d'un virus BLV inactivé.
M. MAMMERICKX, D. PORTETELLE, A. BURNY et J. LEUEN rapportent, dans Zbl. Vet. Med. B271 p. 291 à 303 (1981), les résultats d'études qui montrent que des anticorps passifs acyrlis par le colostrum protègent les animaux contre une infection.
M. ONUMA et al. signalent dans Am. J. Vet. Res. 45, p.
1212 à 1215 (1984) que les anticorps contre la glycoprotéine d'enveloppe de poids moléculaire 51 000 du virus BLV, désignée par l'abréviation gpSl, montrent une activité neu- tralisante contre le virus BLV. Dans cet article, il est fait état de vaccins réalisés à partir de la glycoprotéine gp51, de la protéine p24 et de cellules de reins d'agneau foetal (FLK) infectées et qui, administrés au mouton, apportent une certaine protection.
PARFANOVICH et al. décrivent dans Br. Vet. J. 139, p.
137 à 146 (1983) la préparation d'un virus BLV inactivé à l'aide de composés aminométhylés provenant de la réaction entre le formaldéhyde et un amino-acide tel que la leucine ou la lysine.
G. H. THEILEN et al. dans Current Topics in Veterinary
Medicine and Animal Science 15, p. 547 à 559 (19S2) indiquent avoir vacciné des bovins avec des cellules vivantes provenant d'une lignée cellulaire BL-3, obtenue à partir de moelle osseuse et de thymus d'un cas sporadique de leucose bovine.
Medicine and Animal Science 15, p. 547 à 559 (19S2) indiquent avoir vacciné des bovins avec des cellules vivantes provenant d'une lignée cellulaire BL-3, obtenue à partir de moelle osseuse et de thymus d'un cas sporadique de leucose bovine.
E. RISTAU et al. dans Arch. Exper. Vet. Med. Leipzig 41, p. 185 à 196, et p. 323 à 331 (1987) font de leur côté état d'expériences de vaccination utilisant ces cellules BL-3.
KONO et al. dans Jpn. J. Vet. Sci. 48, p. 117 à 125 (1986) rapportent les résultats d'une étude montrant que des anticorps acquis passivement ou après injection de la glycoprotéine d'enveloppe gp51 purifiée protègent d'une surinfection ultérieure, à condition que les taux d'anticorps anti-gp51 soient suffisants avant la surinfection par BLV.
Tous ces vaccins ne confèrent toutefois qu'une protection de très courte durée et aucun n'a reçu une application à grande échelle.
Il est connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 induit des anticorps neutralisants.
C. BRUCK et al. dans Virology 122, 342-352 (1982) ont mis en évidence huit régions antigéniques indépendantes sur la glycoprotéine gp51 par compétition d'anticorps monoclonaux anti-BLV.
D. PORTETELLE et al. dans Comm. Eur. Communities (REP)
EUR (1984), EUR 8471, Agriculture, 45-51 précisent que trois de ces épitopes, F, G, H, situés sur un fragment apparemment non glycosylé, de poids moléculaire d'environ 15 000, obtenu par digestion par une solution d'urokinase de la glycoprotéine gp51, sont impliqués dans la neutralisation du virus, et envisagent la possibilité de préparer un vaccin anti-BLV par insertion du gène d'enveloppe gp51 ou d'une région correspondant aux sites biologiquement actifs dans un système d'expression autorisant la glycosylation.
EUR (1984), EUR 8471, Agriculture, 45-51 précisent que trois de ces épitopes, F, G, H, situés sur un fragment apparemment non glycosylé, de poids moléculaire d'environ 15 000, obtenu par digestion par une solution d'urokinase de la glycoprotéine gp51, sont impliqués dans la neutralisation du virus, et envisagent la possibilité de préparer un vaccin anti-BLV par insertion du gène d'enveloppe gp51 ou d'une région correspondant aux sites biologiquement actifs dans un système d'expression autorisant la glycosylation.
D. PORTETELLE et al. dans J. CELL. Biochem. Suppl. 10A (1986) (abrégé) et dans Virology, 169, 27-33 (1989) estiment que les trois épitopes F, G, H peuvent jouer un rôle important dans la conception d'un vaccin de sous-unité anti-BLV.
Ces trois épitopes sont sensibles à la présence d'un agent de réduction, sont localisés sur un fragment faiblement glycosylé sur la partie NH2 terminale de la glycoprotéine et sont les seuls épitopes reconnus sur le virion non dégradé.
Il a été décrit dans la demande de brevet FR-A-87-03881 déposée par le demandeur le 20 mars 1987 des fractions peptidiques induisant la formation d'anticorps protecteurs contre le virus de la leucémie bovine (BLV) qui sont caractérisées par le fait qu'elles comportent une séquence peptidique reproduisant tout ou partie de la séquence du fragment de l'enveloppe glycoprotéique gp51 du virus de la leucémie bovine portant au moins l'un des épitopes F, G, H responsables de l'activité biologique du virus.
Enfin , K. OHISHI et al., dans Vaccine (1988), 7, 428432, ont essayé d'exprimer gpS1 par le gène env en entier.
S'il est donc connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 peut induire la formation d'anticorps neutralisants, et si l'on a pu identifier et localiser sur cette glycoprotéine les épitopes responsables de l'activité biologique du virus, il n'a cependant pas été jusqu'ici possible de développer un vaccin qui puisse conférer une bonne protection contre la leucémie bovine sur une longue période.
Les difficultés rencontrées dans la mise au point d'un vaccin, résident dans l'immunogénicité insuffisante de la glycoprotéine ou de son fragment qui porte les épitopes F,
G, H responsables de l'activité du virus, due à la configuration spatiale fragile de ces épitopes.
G, H responsables de l'activité du virus, due à la configuration spatiale fragile de ces épitopes.
La présente invention a pour objectif de fournir un vaccin dans lequel la gp51 se retrouve dans sa configuration native où les épitopes F, G, H sont présents et bien exposés, comme à la surface d'une particule virale, permettant aux propriétés immunogènes de ces épitopes de pleinement se manifester.
Le vaccin conforme à l'invention comprend une fraction peptidique qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré Ii'vé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gpS1 est associée à une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à la glycoprotéine gpS1 sa configuration native où sont présents les épitopes
F, G et H responsables de l'activité biologique du virus
BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiqie du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
F, G et H responsables de l'activité biologique du virus
BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiqie du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
Ces épitopes sont alors reconnlls par les anticorps monoclonaux dirigés contre eux-memes sur la particule virale.
La glycoprotéine transmembranaire associée à la glycoprotéine d'enveloppe gp51 est avantageusement constituée par la glycoprotéine gp30 du virus BLV, laquelle interagit avec la glycoprotéine gpS1 pour restituer à celle-ci sa configuration native où les épitopes F, G, H sont présents. Ces épitopes retrouvent la configtlration native observée à la surface de la particule virale BLV et présentent, alors, une très grande réactivité avec les anticorps monoclonaux dirigés contre eux.
La glycoprotéine transmembranaire gp30 est un polypeptide fortement glycosylé comportant 214 acides aminés et qui est, en particulier, responsable de la bonne fixation des protéines d'enveloppe dans la membrane de la cellule infectée.
Les deux protéines glycosylées gp51 et gp30, de poids moléculaires apparents 51000, respectivement 30000 daltons, sont codées par le gène env du virus. La séquence en acides aminés de la gp30 est typique des protéines transmembranaires de retrovirus deux régions très hydrophobes dont celle située à l'extrémité -COOH terminale est probablement celle qui traverse la membrane virale. Voir N.R. RICE et al., Virology (1984) 138, 82-93.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on synthétise les glycoprotéines gp51 et gp30 dans un système d'expression qui exprime ensemble, en une molécule unique, la gp51 et la gp30 et qui peut etre, par exemple, un virus recombin.1nt ou une levure.
Le molécule comprenant gp51 et gp30 ainsi exprimée comprend un site de clivage naturel.
Toutefois, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on pourra, selon toute méthode connue, induire une mutation du gène codant pour ladite molécule avant son insertion dans le plasmide, de façon que la molécule contenant gp51 et gp30 soit dépourvue de son site de clivage naturel. Dans ce mode de réalisation, les glycoprotéines gp51 et gp30 resteront donc liées par liaison covalente.
Ceci peut être réalisé par exemple en induisant une mutation de la séquence en acides aminés 268-269 de façon à obtenir Gln-Thr au lieu de Arg-Ser, avec la méthode de Eckstein, pratiquée avec un kit commercial du type Amersham "In vitro Mutagenesis System", code RPN 2322.
Grâce à la technique des virus recombinants, de nombreux gènes étrangers ont pu être insérés et exprimés.
L'insertion des gènes codant pour la gp51 et la gp30 dans le génome du virus s'effectue par les techniques, maintenant bien connues, de construction de recombinants et qui comportent la série d'étapes suivante
- insertion du gène env (gène codant pour la gp51 et la gp30) dans un vecteur plasmidique convenable,
- introduction du plasmide recombinant dans une cellule préalablement infectée par une souche du virus,
- les séquences nucléotidiques étant identiques, une recombinaison in vitre intervient entre les régions homologues du plasmide recombinant et de l'ADN viral ; par cette recombinaison, le gène env se trouve intégré dans le génome du virus dans lequel il est propagé et exprimé.
- insertion du gène env (gène codant pour la gp51 et la gp30) dans un vecteur plasmidique convenable,
- introduction du plasmide recombinant dans une cellule préalablement infectée par une souche du virus,
- les séquences nucléotidiques étant identiques, une recombinaison in vitre intervient entre les régions homologues du plasmide recombinant et de l'ADN viral ; par cette recombinaison, le gène env se trouve intégré dans le génome du virus dans lequel il est propagé et exprimé.
L'insertion du gène codant pour la gp51, en meme temps que du gène codant pour la gp30,dans le génome du virus, peut être, bien entendu, réalisée encore sous des formes très diverses
- gène env provenant d'un variant BLV, par exemple dépourvu de l'un ou de deux des trois sites F, G, H,
- insertion d'un morceau seulement du gène codant pour la gp51, par exemple provenant d'un variant BLV,
- insertion d'une séquence nucléotidique pouvant provenir d'un provirus BLV cloné ou bien d'une copie d'ADNc résultant de la transcription inverse de l'ARN viral,
- ou d'un oligonucléotide synthétique codant pour tout ou partie de la gp51.
- gène env provenant d'un variant BLV, par exemple dépourvu de l'un ou de deux des trois sites F, G, H,
- insertion d'un morceau seulement du gène codant pour la gp51, par exemple provenant d'un variant BLV,
- insertion d'une séquence nucléotidique pouvant provenir d'un provirus BLV cloné ou bien d'une copie d'ADNc résultant de la transcription inverse de l'ARN viral,
- ou d'un oligonucléotide synthétique codant pour tout ou partie de la gp51.
Parmi les virus utilisables, on peut citer notamment les adénovirus, les herpèsvirus, le virus de la vaccine, le virus Fowlpox, le virus Canarypox et les baculovirus. (Pour un vecteur Fowlpox, voir par exemple J. Taylor et E.
Paoletti dans Vaccine (1988), 6, p 466-467 et J. Taylor et al. dans Vaccine (1988), 6, p 497-503).
Les virus recombinants peuvent etre utilisés tels quels comme agents vaccinants contre la leucémie bovine ou pourront être utilisées pour infecter une culture cellulaire et produire in vitro la fraction peptidique, que l'on récupérera et que l'on utilisera comme agent vaccinant.
Bien entendu, dans le cas de vaccins comprenant des virus recombinants, le virus recombinant peut avantageusement exprimer une molécule unique, comprenant gp51 et gp30, dépourvue ou non de site de clivage.
Les vaccins ainsi préparés peuvent être administrés par des voies variées ; en particulier, on peut procéder par voie intradermique, sous-cutanée ou intramusculaire. Ils peuvent etre administrés avec des supports pharmaceutiques connus et comporter, en outre, des adjuvants.
Pour la préparation de vaccins, si les virus recombinants constituent un moyen particulièrement commode pour que soient exprimées ensemble la gp51 et la gp30, de nombreux autres systèmes d'expression peuvent être également utilisés tels que les levures, notamment la levure
S. cerevisiae.
S. cerevisiae.
La présente invention s'étend donc aussi, d'une façon générale, à tout vaccin comprenant un système d'expression qili permet d'exprimer ensemble la gp51 et la gp30.
On peut également obtenir des préparations vaccinales selon l'invention à base de liposomes dans lesquels la fraction gp51 et gp30 serait insérée dans les couches lipidiques.
Les glycoprotéines gp51 et gp30 peuvent être également insérées dans des préparations type ISCOM ("Immunostimulating complex") telles que celles qui ont été décrites par B.
MOREIN et al. dans Immunology Today, Vol. 8, n 11, p. 333 à 338 (1987).
Les glycoprotéines gp51 et gp30 peuvent être encore insérées d.ns des polyélectrolytes (copolymère d'acide acrylique et de N-vinylpyrrolidone), servant notamment à à gp51 et gp30 (voir Petrov et al., Immmunology
Letters (1986), 12, 237-242).
Letters (1986), 12, 237-242).
L'invention concerne encore des vaccins contre la leucémie bovine obtenus à partir de ces préparations ISCOM ou de ces polyélectrolytes.
Les inventeurs ont constaté que l'on pouvait également, dans une certaine mesure, redonner à la gp51 sa configuration native, en fixant sur cette glycoprotéine un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes.
Une variante de réalisation de l'invention consisterait donc en un vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV) comprenant @ une fraction peptidique comportant la glycoprotéine d'enveloppe yp51 du virus BLV et induisant à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
L'anticorps monoclonal que l'on fixe à la 51 est avantageusement constitué par l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A.
Unc variante de réalisation de l'invention consisterait donc à fixer sur la glycoprotéine gp51 un anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A.
L'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou contre le site A interagit avec la gp51, à la manière de la gap30, restituant à la gp51 sa configuration native.
La gp51 sur laquelle on a fixé un anticorps monoclonal dirigé contre les épitopes E ou A, est reconnue par les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G, H.
La gp51 et l'anticorps monoclonal dirigé contre le site
E ou A peuvent être exprimés dans un système d'expression.
E ou A peuvent être exprimés dans un système d'expression.
Un tel système d'expression peut être constitué par un virus recombinant dans lequel on a inséré le gène codant pour la gp51 et des gènes codant pour l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou le site A.
On peut aussi envisager d'insérer dans des préparations type "ISCOM" l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E ou le site A et qui capte, ensuite, l'antigène gp51 à sa surface.
L'invention s'étendrait, également, aux vaccins obtenus à partir d'un, ou contenant un virus recombinant exprimant la gp51 liée à son anticorps monoclonal E ou A, ou encore réalisés à partir des préparations type IOM dans lequelles est inséré l'anticorps monoclonal qui captera, ensuite, la gaps 1.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de l'exemple de mise en oeuvre de l'invention donné, ci-après, à titre non limitatif.
Sur les figures annexées
- la figure 1 représente la courbe de titration des anticorps gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombin.lnts qui expriment d'une part la gp51 seule, et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble;
- les figures 2, 3 et 4 représentent les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombinants qui expriment d'une part la gp51 et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble, avec respectivement les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes
F, G et H liés à l'enzyme peroxydase.
- la figure 1 représente la courbe de titration des anticorps gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombin.lnts qui expriment d'une part la gp51 seule, et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble;
- les figures 2, 3 et 4 représentent les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombinants qui expriment d'une part la gp51 et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble, avec respectivement les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes
F, G et H liés à l'enzyme peroxydase.
EXEMPLE
On dispose notamment
- d'un recombinant vaccine exprimant la qp51 seule : VP391;
- de recombinants vaccine exprimant la gpS1 et la gp30
VP392 et VP459;
- d'un recombinant vaccine exprimant la gp51 et la gp30, en l'absence du site de clivage naturel entre ces deux glycoprotéines : VP482 ; et
- d'un recombinant obtenu à partir du plasmide pGS20 et exprimant la gp51 et la gp30 VV-ENV1 (voir construction ci-après)
CONSTRUCTION DU RECOMBINANT OBTENU A PARTIR DU PLASMIDE pGS20 (gp51 + gp30)
a) Obtention d'une banque d'ADNc dans Agit10
Les ARNs totaux ont été extraits de cellules de poumon de chauve-souris produisant de façon chronique du virus BLV.
On dispose notamment
- d'un recombinant vaccine exprimant la qp51 seule : VP391;
- de recombinants vaccine exprimant la gpS1 et la gp30
VP392 et VP459;
- d'un recombinant vaccine exprimant la gp51 et la gp30, en l'absence du site de clivage naturel entre ces deux glycoprotéines : VP482 ; et
- d'un recombinant obtenu à partir du plasmide pGS20 et exprimant la gp51 et la gp30 VV-ENV1 (voir construction ci-après)
CONSTRUCTION DU RECOMBINANT OBTENU A PARTIR DU PLASMIDE pGS20 (gp51 + gp30)
a) Obtention d'une banque d'ADNc dans Agit10
Les ARNs totaux ont été extraits de cellules de poumon de chauve-souris produisant de façon chronique du virus BLV.
Les ARNs poly A+ ont été sélectionnés sur une colonne d'oligo-dT-cellulose afin d'etre copiés en ADNc bicaténaires et liés au site EcoRI de l'ADN du phage XgtlO.
b) Recherche d'ADNc correspondant à l'ARN messager de l'enveloppe
Des bactéries C600 HFL sont infectées par les bactériophages de la banque d'ADNc et étalées sur boites de
Petri. Chaque phage recombinant produit une plage de lyse.
b) Recherche d'ADNc correspondant à l'ARN messager de l'enveloppe
Des bactéries C600 HFL sont infectées par les bactériophages de la banque d'ADNc et étalées sur boites de
Petri. Chaque phage recombinant produit une plage de lyse.
Une empreinte de la boite de Petri est réalisée sur un filtre de nitrocellulose. Après dénaturation et neutralisation, l'ADN fixé sur le filtre est hybridé avec une sonde "BLV provirale" marquée au 32P par la technique de "déplacements de coupures" (Nick-translation). Le filtre est ensuite autoradiographié.
La sonde "BLV provirale" permet de repérer les clones renfermant de l'ADNc du BLV. Les phages contenant une information provirale sont ensuite purifiés, digérés par l'enzyme de restriction EcoRI ; les fragments sont séparés par électrophorèse, transférés sur filtre en nitrocellulose, selon la méthode de "Southern".
L'hybridation moléculaire réalisée avec une sonde spécifique de la région env du virus BLV et une analyse par enzymes de restriction permettent de repérer et purifier les phages recombinants porteurs de l'information complète pour le gène env.
c) Clonage dans le plasmide pas20
Le plasmide pCS20 a été décrit dans Mackett et al. J. of Virology (1984) 49, 857-863. Il est constitué d'une partie du plasmide pBR328 et du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine (gène TK). Le promoteur 7,5 K de ce Poxvirus, suivi de deux sites de clonage, est inséré dans le gène TK.
c) Clonage dans le plasmide pas20
Le plasmide pCS20 a été décrit dans Mackett et al. J. of Virology (1984) 49, 857-863. Il est constitué d'une partie du plasmide pBR328 et du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine (gène TK). Le promoteur 7,5 K de ce Poxvirus, suivi de deux sites de clonage, est inséré dans le gène TK.
Pour obtenir l'insert de 2,3 kb contenant la phase de lecture des 2 glycoprotéines, l'AON d'un phage recombinant intéressant est digéré par l'endonucléase de restriction
Xho I. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose. Le fragment de 2,3 kb est récupéré par électrophorèse et ses extrémités 5' en saillie sont rendues franches par un traitement par le fragment de
Klenow de l'ADN polymérase I.
Xho I. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose. Le fragment de 2,3 kb est récupéré par électrophorèse et ses extrémités 5' en saillie sont rendues franches par un traitement par le fragment de
Klenow de l'ADN polymérase I.
Le vecteur pGS20 est linéarisé par l'endonucléase de restriction Sma I et traité à la phosphatase alcaline.
L'insert "ENV" de 2,3 kb est lié au site Sma I du plasmide pGS2O. Des bactéries E. coli (souche MM294) rendues compétentes sont transformées. La sélection des bactéries transformées est réalisée sur ampicilline.
Un clone renfermant l'insert, dans le sens 5'-3' derrière le promoteur P7,5K, est choisi. Le sens de l'insert est vérifié par la double digestion Eco RI-Pvu II.
On obtient le plasmide pGS20-ENV. La suite des opérations est résumée avantageusement dans le schéma I cijoint.
d) Infection de cellules CVî par le virus de la vaccine sauvage et transfection avec le plasmide recombinant pGS20
ENV.
d) Infection de cellules CVî par le virus de la vaccine sauvage et transfection avec le plasmide recombinant pGS20
ENV.
Des cellules CV1 (fibroblastes de singe) sont cultivées en couche monocellulaire. D'autre part, des particules de virus de la vaccine sauvage sont produites sur cellules confluentes.
Les fibroblastes sont infectés, à raison d'une particule virale par cellule. Le plasmide recombinant pGS20-ENV est précipité en présence de phosphate de calcium sur les fibroblastes infectés. Après 43 heures de culture, le virus est libéré des cellules par une alternance gel-dégel.
e) Sélection et purification d'un virus recombinant de la vaccine contenant le gène env.
e) Sélection et purification d'un virus recombinant de la vaccine contenant le gène env.
Des cellules confluentes dépourvues de l'activité thymidine kinase (TK-) sont infectées par le virus obtenu après transfection. Après 48 heures d'infection, les cellules sont recouvertes de gélose contenant de la bromodésoxyuridine. Le phénotype TK+ est létal en présence de bromodésoxyuridine.
Seules des plages constituées par du virus TK (ayant inséré un gène étanger lors de la recombinaison homologue à l'étape de transfection) se forment.
Après 2 ou 3 jours, les plages de lysc sont visualisées après coloration des cellules vivantes au rouge neutre. Le virus correspondant aux plages observées est prélevé, multiplié ; l'ADN des clones isolés est extrait et hybridé à la sonde "ENV".
Seuls le ou les clones hybridant à la sonde "ENV" sont conservés pour les clonages ultérieurs et les tests d'expression de gp51 et de gp30.
Nous avons ainsi sélectionné le virus recombinant VV
ENV1 exprimant à la fois gp51 et gp30.
ENV1 exprimant à la fois gp51 et gp30.
PREPARATION ET CARACTERISATION DES ANTICORPS MONO
CLONAUX DIRIGES CONTRE LES EPITOPES DE LA GP51
Immunisation des souris
On a injecté à des souris Balb/c par voie sous-cutanée et intrapéritonéale 50 tg de gp51 en présence d'adjuvant complet de Freund. Cette injection a été répétée 2 semaines aprés en présence d'adjuvant incomplet de Freund, puis 4 semaines après sans adjuvant. On a procédé, deux mois après, à une dernière injection par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse.
CLONAUX DIRIGES CONTRE LES EPITOPES DE LA GP51
Immunisation des souris
On a injecté à des souris Balb/c par voie sous-cutanée et intrapéritonéale 50 tg de gp51 en présence d'adjuvant complet de Freund. Cette injection a été répétée 2 semaines aprés en présence d'adjuvant incomplet de Freund, puis 4 semaines après sans adjuvant. On a procédé, deux mois après, à une dernière injection par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse.
Fusion des cellules
On a préparé les hybrides par fusion de cellules de myélome de souris avec les splénocytes des souris immunisées selon la technique décrite par HERZENBERG L.A. et al. dans
Handbook of Experimental Immunology (D. WEIR, ed.) 25.1-25 (Blackwell, London).
On a préparé les hybrides par fusion de cellules de myélome de souris avec les splénocytes des souris immunisées selon la technique décrite par HERZENBERG L.A. et al. dans
Handbook of Experimental Immunology (D. WEIR, ed.) 25.1-25 (Blackwell, London).
Les hybrides obtenus ont été répartis en plaques de 96 puits et sélectionnés sur milieu HAT en présence de thymocytes et de macrophages de souris. Les hybrides producteurs d'anticorps anti-gp51 ont été détectés à l'aide d'un radioimmuno-essai en phase liquide avec l'antigène gp51 marqué à l'iode 125 ou à l'aide d'un radio-immuno-essai en phase solide avec du virus BLV adsorbé dans les puits des microplaques. Dans ce dernier cas, les anticorps spécifiques adsorbés sur le virus ont été détectés avec une antiimmunoglobuline de souris marquée à l'iode 125. Après lavage, la radioactivité adsorbée sur les complexes spécifiques est révélée par autoradiographie.
Les clones producteurs sélectionnés ont été transférés sur des plaques de 24 puits et sous-clonés en milieu semisolide d'agarose.
Les cellules hybrides obtenues ont été injectées dans la cavité intrapéritonéale de souris préalablement traitées au pristane. Après 10 à 15 jours, on a récolté les ascites qui contenaient des quantités importantes des anticorps monoclonaux recherchés.
Purification et caractérisation des anticorps monoclonaux
On a purifié ces anticorps monoclonaux par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Affigel Blue selon la méthode décrite par Bruck et al. dans . Immunological Methods 53, 313-319 (1982).
On a purifié ces anticorps monoclonaux par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Affigel Blue selon la méthode décrite par Bruck et al. dans . Immunological Methods 53, 313-319 (1982).
Ces anticorps monoclonaux ont été marqués par l'iode 125 par le procédé à la chloramine T décrit par GREENWOOD
F.C. et al. dans Biochemical Journal, 89, 114-123 (1963).
F.C. et al. dans Biochemical Journal, 89, 114-123 (1963).
La spécificité des différents anticorps monoclonaux obtenus pour des épitopes donnés a été déterminée par des essais de compétition entre les anticorps pour de l'antigène gp51 adsorbé dans les puits des plaques de microtitration.
A cet effet, un microgramme d'anticorps monoclonal purifié non marqué radioactivement est incubé, pendant une nuit à 4 C, dans un volume de 50 rl dans les puits d'une plaque de microtitration en matière plastique contenant la gp51 adsorbée (50 ng).
De l'anticorps marqué radioactivement à l'iode 125 (10 ng-100.000 cpm) est alors ajoute. et l'incubation se poursuit 6 heures de plus à 4-C.
Les microplaques sont alors lavées intensivement et la radioactivité accrochée à la matière plastique de chaque puits est mesurée dans un compteur de typez
On interprète les résultats en sachant que, si deux sites antigéniques sont très proches ou identiques, la liaison de l'un des anticorps (non marqué) à son épitope, va gêner ou empêcher la liaison du second anticorps (marqué) à son épitope.
On interprète les résultats en sachant que, si deux sites antigéniques sont très proches ou identiques, la liaison de l'un des anticorps (non marqué) à son épitope, va gêner ou empêcher la liaison du second anticorps (marqué) à son épitope.
Les essais de compétition entre les anticorps monoclonaux purifiés permettent de définir sur la molécule de gp51 huit sites antigéniques indépendants désignés par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H.
CARACTERISATION DES RECOMBINANTS A L'AIDE DES ANTICORPS
MONOCLONAUX
La mise en évidence des épitopes F, G, H à la surface des cellules infectées par les recombinants est effectuée par l'une ou l'autre des deux méthodes suivantes
1. IMMUNOFLUORESCENCE
Des cellules sensibles (cellules VERO) sont ensemencées dans des tubes de Leighton. Après croissance, elles sont infectées dans un ordre de multiplicité de 5 à l'aide des différents recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 et de VTK79 (vaccine sauvage). Après 20 heures d'infection, les lames sont récupérées et incubées avec chacun des anticorps monoclonaux anti-gp51, dirigés respectivement contre les sites définis A, 8, B', C, D, D', E, F, G et H.
MONOCLONAUX
La mise en évidence des épitopes F, G, H à la surface des cellules infectées par les recombinants est effectuée par l'une ou l'autre des deux méthodes suivantes
1. IMMUNOFLUORESCENCE
Des cellules sensibles (cellules VERO) sont ensemencées dans des tubes de Leighton. Après croissance, elles sont infectées dans un ordre de multiplicité de 5 à l'aide des différents recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 et de VTK79 (vaccine sauvage). Après 20 heures d'infection, les lames sont récupérées et incubées avec chacun des anticorps monoclonaux anti-gp51, dirigés respectivement contre les sites définis A, 8, B', C, D, D', E, F, G et H.
Après 1 heure d'incubation, les lames sont lavées plusieurs fois avec du tampon isotonique PBS, puis incubées avec le conjugué anticorps anti-immunoglobulines murines marquées à la fluorescéine.
Après 1 heure d'incubation, les cellules sont lavées, puis les lames sont montées pour être examinées avec un microscope avec lampe U.V., à l'aide de l'objectif à immersion.
Les résultats sont interprétés comme négatifs (-) si aucune fluorescence n'est observée. Une fluorescence est signalée par +/- (lorsque le cas est douteux) ou par + ou +++ (lorsqu'ils sont positifs) selon l'intensité observée.
Les résultats obtenus ont été rassemblés dans le
Tableau I.
Tableau I.
On note une très bonne immunofluorescence sur les sites
F, G, H sur le recombinant VV-ENV1.
F, G, H sur le recombinant VV-ENV1.
On note que l'on obtient une très bonne immunofluorescence pour les sites F et H sur le recombinant VP392 alors que le recombinant VP391 présente une immunofluorescence très faible pour ces mêmes épitopes. L'immunofluorescence sur VP391 et VP392 est d'intensité égale pour tous les sites
A, B, B', D, D', E.
A, B, B', D, D', E.
On observe l'absence du site G sur les recombinants
VP391 et VP392. L'absence de cet épitope s'explique par le fait que le clone T 15-2 à partir duquel le gène codant pour la gp51 a été introduit dans le virus est un variant G-, non reconnu par l'anticorps monoclonal MONO G.
VP391 et VP392. L'absence de cet épitope s'explique par le fait que le clone T 15-2 à partir duquel le gène codant pour la gp51 a été introduit dans le virus est un variant G-, non reconnu par l'anticorps monoclonal MONO G.
Ces résultats montrent donc que, pour présenter au système immunitaire des animaux un antigène gp51 à'aide d'un virus recombinant, il importe que la gp30 soit associée à la gp51, de façon à avoir un antigène gp51 possédant la configuration native observée sur une particule virale BLV, où les sites F, G, H sont les mieux exposés.
2. TEST ELISA
Le test permet de mettre en évidence la présence des sites A, B, B' , C, D, D', E, F, G et H définis par les anticorps monoclonaux sur la gp51.
Le test permet de mettre en évidence la présence des sites A, B, B' , C, D, D', E, F, G et H définis par les anticorps monoclonaux sur la gp51.
Un extrait cellulaire ou de surnageants de culture de cellules infectées par un virus recombinant ou bien par le virus BLV est pris en sandwich entre l'anticorps monoclonal capteur anti E et un anticorps monoclonal de révélation conjugué à la peroxydase. La présence finale d'une coloration est le signe de la présence du site antigénique reconnu par l'anticorps monoclonal de révélation.
Cette technique montre bien, par exemple, que le site G est absent sur les préparations VP391 et VP392 obtenues avec le variant provirus BLV T15-2 ; mais qu'il est, par contre, présent lorsque le recombinant est obtenu en insérant l'information codant pour la gp51 et la gp30 à partir de l'ADNc copié sur l'ARN viral du virus BLV produit par les cellules de chauve-souris BL.
ADAPTATION DES RECOMBINANTS VACCINE SUR CELLULES OVINES
On a mené une expérience d'adaptation du recombinant
VP392 (gp51 + gp30), par passages répétés sur une lignée cellulaire d'origine OVK (ovine kidney cells).
On a mené une expérience d'adaptation du recombinant
VP392 (gp51 + gp30), par passages répétés sur une lignée cellulaire d'origine OVK (ovine kidney cells).
L'expérience a été conduite du 17 avril 1987 au 21 juin 1987 en subcultivant deux fois par semaine les cellules OVK et les cellules VERO (utilisées comme contrôle), en boites de Roux 25 cm2. Arrivées à confluence, les cellules étaient lavées et infectées avec VP392 provenant de l'infection du passage antérieur (55 yll prélevées du ml de suspension virale provenant de la boite de Roux 25 cm2). Par boite de
Roux 25 cm2, on dénombre à confluence 3 x 106 cellules OVK contre 9 x 106 cellules VERO.
Roux 25 cm2, on dénombre à confluence 3 x 106 cellules OVK contre 9 x 106 cellules VERO.
Les différentes suspensions virales ont été conservées à -20-C. On a déterminé leur titre en virus par titration en boites de 24 puits0 selon la méthode des dilutions limites (quatre répétitions par dilution, table de calcul de DL 50 selon Read-Muench). Lors des titrations, le recombinant a été, à chaque fois, testé sur cellules VERO et sur cellules
OVK.
OVK.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tab]eau II. Les titres en virus (DL50) rapportés ont été obtenus après respectivement 30 jours (16/5), 35 jours (21/5), 45 jours (1/6) et 60 jours (15/6) d'adaptation sur cellules
OVK.
OVK.
Ces résultats montrent que les titres observés sur OVK sont plus faibles que ceux obtenus sur VERO. Cette différence s'expliquc par le fait que la quantité de cellules OVK mise en oeuvre est trois fois moindre par boite de
Roux 25cm2.
Roux 25cm2.
On note que, si le virus recombinant VP392 se réplique un peu moins bien sur cellules OVK que sur cellules VERO, sa réplication sur cellules OVK reste, néanmoins, bonne.
IMMUNISATION OE LAPINS A L'AIDE DE RECOMBINANTS VACCINE
Plusieurs lapins ont été immunisés à l'aide de suspensions de recombinants vaccine0 soit par voie intradermique (ID) seule, soit par voie intraveineuse (IV) (50 s de la dose) et par voie intradermique (50 s de la dose). Les doses de virus infectieux par immunisation étaient de l'ordre de 107 pfu/ml. Un rappel a été effectué dans les mêmes conditions six semaines après le premier traitement.
Plusieurs lapins ont été immunisés à l'aide de suspensions de recombinants vaccine0 soit par voie intradermique (ID) seule, soit par voie intraveineuse (IV) (50 s de la dose) et par voie intradermique (50 s de la dose). Les doses de virus infectieux par immunisation étaient de l'ordre de 107 pfu/ml. Un rappel a été effectué dans les mêmes conditions six semaines après le premier traitement.
Des prélèvements de sérum sanguin ont été effectués à plusieurs moments. Plusieurs tests ont été effectués sur ces sérums.
1. TEST ELISA
Ce test, utilisé pour la détection des anticorps dans le sérum sanguin, a été réalisé dans les conditions suivantes:
- fixation de 100 ng d'anticorps monoclonal MONO E purifié sur les parois des puits d'une plaque de microtitration ; incubation pendant 16 heures à 4'C;
- après lavage et saturation avec une protéine inerte, la sérumalbumine bovine, introduction (en présence de la protéine inerte) d'une préparation de protéines virales traitée au détergent Tween 80 2 t (la préparation et le surnageant de culture des cellules FLK productrices de façon chronique du virus BLV);
- après incubation de 48 heures minimum à 4-C et lavages, introduction dans les puits de 200 tel des dilutions progressives d'antisérum à tester (8 dilutions de 3 en 3 à partir de la dilution 20) ; incubation pendant 16 heures à 4 C;
- après lavage, addition de 100 + par puits de tampon contenant 200 ng de fragment Fab d'immunoglobulines de chèvre purifiés par chromatographie d'affinité, dirigés spécifiquement contre les immunoglobulines de lapin et couplés à l'enzyme peroxydase ; incubation pendant 1 heure à 4 C;
- après lavage, révélation de l'activité enzymatique associée aux parois, à l'aide de substrat H2 O2 + tétraméthylbenzidine;
- après 20 mn, arrêt de la réaction avec H1 504 2 N et lecture des densités optiques D.O. à l'aide d'un spectrophotomètre pour microplaques de titration.
Ce test, utilisé pour la détection des anticorps dans le sérum sanguin, a été réalisé dans les conditions suivantes:
- fixation de 100 ng d'anticorps monoclonal MONO E purifié sur les parois des puits d'une plaque de microtitration ; incubation pendant 16 heures à 4'C;
- après lavage et saturation avec une protéine inerte, la sérumalbumine bovine, introduction (en présence de la protéine inerte) d'une préparation de protéines virales traitée au détergent Tween 80 2 t (la préparation et le surnageant de culture des cellules FLK productrices de façon chronique du virus BLV);
- après incubation de 48 heures minimum à 4-C et lavages, introduction dans les puits de 200 tel des dilutions progressives d'antisérum à tester (8 dilutions de 3 en 3 à partir de la dilution 20) ; incubation pendant 16 heures à 4 C;
- après lavage, addition de 100 + par puits de tampon contenant 200 ng de fragment Fab d'immunoglobulines de chèvre purifiés par chromatographie d'affinité, dirigés spécifiquement contre les immunoglobulines de lapin et couplés à l'enzyme peroxydase ; incubation pendant 1 heure à 4 C;
- après lavage, révélation de l'activité enzymatique associée aux parois, à l'aide de substrat H2 O2 + tétraméthylbenzidine;
- après 20 mn, arrêt de la réaction avec H1 504 2 N et lecture des densités optiques D.O. à l'aide d'un spectrophotomètre pour microplaques de titration.
2. TEST ENLISA DE COMPETITION
Le test permet de déterminer la présence d'anticorps de lapins entrant en compétition avec les anticorps monoclonaux conjugués à la peroxydase.
Le test permet de déterminer la présence d'anticorps de lapins entrant en compétition avec les anticorps monoclonaux conjugués à la peroxydase.
Le test a été réalisé dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites à propos du test ELISA, avec cette différence que l'enzyme peroxydase est couplée avec des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre les épitopes A à H de la gpS1.
A cette fin, on additionne, par puits, 100 l de tampon contenant 200 ng d'anticorps purifiés par chromatographie d'affinité et dirigés spécifiquement contre les sites antigéniques A, B, B' . .F, G, H.
3. TEST D'INHIBITION DEt PSEUDOTYPES VSV/BLV
Ce test, décrit par ZAVADA J. et al. dans J. Natl.
Ce test, décrit par ZAVADA J. et al. dans J. Natl.
Cancer Inst., p. 95 à 101 (1979), a été utilisé afin de déterminer la capacité qu'ont les sérums de lapins auxquels ont été injectés des recombinants, de neutraliser l'activité biologique du virus BLV.
Le test d'inhibition de pseudotypes est basé sur des observations de J. ZAVADA et al. montrant que l'infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) de cellules chroniquement infectées par le virus BLV fournit des particules virales dont le génome est constitué dc celui du virus
VSV et dont ltenveloppe est celle du virus BLV (pseudotype).
VSV et dont ltenveloppe est celle du virus BLV (pseudotype).
Ces pseudotypes VSV/BLV possèdent les propriétés spécifiques liées à la glycoprotéine d'enveloppe gpS1 du virus BLV comme la neutralisation et la spécificité d'hôte.
Le génome VSV inclus dans ces pseudotypes rend les particules capables de former rapidement (24-36 heures) des plages de lyse sur les cellules de singe qu'on a infectées par ces pseudotypes.
Brievement, pour la neutralisation des pseudotypes avec les sérums à tester, on mélange 1 ml d'une préparation de pseudotypes pouvant former 200 plages de lyse sur les cel lules à tester (10 1 , 10 , 10 @ , 104 et d'autres dilutions intermédiaires). Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56'C) pendant 30 minutes.
Après une heure d'incubation à 20'C, on inocule 0,5 ml de chaque mélange sur un tapis de cellules de singe se trouvant dans une boite de Petri. Après 90 mn d'incubation, l'inoculum est enlevé par lavage avec du tampon isotonique stérile et les cellules sont recouvertes d'une couche d'agas
Après 24-36 heures d'incubation à 37-C, les cellules sont colorées au rouge neutre et les plages de lyse résiduelles sont comptée.
Après 24-36 heures d'incubation à 37-C, les cellules sont colorées au rouge neutre et les plages de lyse résiduelles sont comptée.
Le titre en anticorps neutralisants contre le virus BLV est obtenu en déterminant la dilution de sérum avec laquelle on n'obtient seulement que 50 X. des plages de lyse obtenues en l'absence de sérum à tester.
4. TEST D'INHIBITION DE SYNCYTIA
Ce test repose sur la constatation faite que des anticorps neutralisants peuvent empêcher la fusion des membranes cellulaires, mais non des membranes nucléaires, entre cellules ayant reçu BLV par injection et cellules indica t:rices de chat CC81 (le test a été utilisé pour ratactériser les anticorps monoclonaux par BRUCK et al. dans Virology (1982) 122 p. 353-362). Les résultats représentent la dilution maximale de sérum pour laquelle on observe une diminution de 50 % du nombre de syncytia.
Ce test repose sur la constatation faite que des anticorps neutralisants peuvent empêcher la fusion des membranes cellulaires, mais non des membranes nucléaires, entre cellules ayant reçu BLV par injection et cellules indica t:rices de chat CC81 (le test a été utilisé pour ratactériser les anticorps monoclonaux par BRUCK et al. dans Virology (1982) 122 p. 353-362). Les résultats représentent la dilution maximale de sérum pour laquelle on observe une diminution de 50 % du nombre de syncytia.
Brièvement, pour obtenir l'inhibition des syncytia avec les sérums à tester, on incube dans les puits d'une plaque de microtitration les dilutions de sérum (2, 4 8, 16 ...) avec les cellules FLK productrices de virus BtV. Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56-C) pendant 30 minutes.
Après trois heures d'incubation à 37'C, le milieu de culture est enlevé et les noyaux de cellules adhérentes sont colorés à l'aide du réactif de Giemsa.
Les cellules contenant plus de 5 noyaux sont considérées comme syncytia. Les dilutions de sérum neutralisant au moins à 50 % la formation de syncytia sont considérées comme positives.
5. RESULTATS
Dans le Tableau III, on a rassemblé les résultats, de ces 4 tests, obtenus avec VP391, VP392, VV-ENV1, VP459 (gp51 + gp30) et VP482.
Dans le Tableau III, on a rassemblé les résultats, de ces 4 tests, obtenus avec VP391, VP392, VV-ENV1, VP459 (gp51 + gp30) et VP482.
On a représenté sur la figure 1 des courbes de titration des anticorps anti-gp51, obtenues par la méthode ELISA précédemment décrite. On a porté en abscisses les dilutions du sérum et en ordonnées la densité optique D.O. mesurée à 460 nm.
Les courbes référencées 4-4 et 5-5 sont les courbes obtenues avec les lapins qui ont reçu le virus recombinant
VP391 (gp51 seule) - lapins n 4 et 5.
VP391 (gp51 seule) - lapins n 4 et 5.
Les courbes référencées 7-7, 8-8 et 1C-10 sont les courbes obtenues avec les lapins qui ont reçu le virus recombinant VP392 (gp51 et gp30)-lapins n 7, 8 et 10.
La courbe référencée 11-11 est la courbe obtenue avec un lapin qui a reçu la gp51 purifiée dans l'adjuvant complet de Freund (ACF) - lapin n 2670.
La courbe référencée 12-12 est la courbe obtenue avec un lapin normal.
Sur les figures 2, 3 et 4, on a représenté les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapin respectivement avec les anticorps monoclonaux F, G et H couplés à la peroxydase.
L'ensemble des résultats obtenus montre donc que, lorsque l'on administre à un lapin le virus recombinant qui exprime la gp51 et la gp30 (VP392, VP459, VP482, VV-ENV1), les anticorps formés
- présentent une activité neutralisante ; les anticorps du lapin n 10 ont meme un pouvoir neutralisant supérieur à celui des anticorps de lapin n 2670 ayant reçu la gp51 purifiée
- entrent très bien en compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les sites biologiques F, G, H.
- présentent une activité neutralisante ; les anticorps du lapin n 10 ont meme un pouvoir neutralisant supérieur à celui des anticorps de lapin n 2670 ayant reçu la gp51 purifiée
- entrent très bien en compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les sites biologiques F, G, H.
On constate, par contre, qu'aucune compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G, H n'est apparente avec les anticorps des lapins 4 et 5 qui ont reçu le recombinant qui exprime la gp51 seule (VP391).
De plus, aucune activité neutralisante et protectrice des anticorps de ces lapins n'a pu être mise en évidence.
Il apparait dans le tableau III que seules les associations gp51 et gp30 sont capables d'induire les hauts taux d'anticorps neutralisants dans les deux tests pratiqués. Les tests de compétition ELISA montrent que ces associations ont conservé les sites biologiques F, G, H décrits précédemment et impliqués dans la neutralisation du BLV.
IMMUNISATION DE MOUTONS A L'AIDE DE RECOMBINANTS
Un lot de moutons a été vacciné à l'aide des virus recombinants VP459, VP482 ainsi que la vaccine sauvage
VP452. Ces moutons ont reçu deux fois par injection des recombinants avant d'être surinfectés par BLV à l'aide des cellules sanguines infectées provenant d'un animal leucémique.
Un lot de moutons a été vacciné à l'aide des virus recombinants VP459, VP482 ainsi que la vaccine sauvage
VP452. Ces moutons ont reçu deux fois par injection des recombinants avant d'être surinfectés par BLV à l'aide des cellules sanguines infectées provenant d'un animal leucémique.
Les moutons sont des moutons d'un an maximum dont le statut sérologique a été vérifié négatif pour le BLV. Les moutons 44 et 99 servent ici de contrôle à l'expérience de surinfection BLV.
Les recombinants de la vaccine ont été inoculés lors de la première injection par voie intradermique (ID) et par voie sous-cutanée (SC) lors de la deuxième injection. Chaque mouton a reçu à chaque fois 2 doses de 10 recombinants vaccine le long de la colonne vertébrale.
L'intervalle de temps entre les injections de recombinants et la surinfection par BLV est chaque fois de 6 semaines.
On a réalisé la surinfection à l'aide de sang entier 3 d'un animal bovin (31700 globules blancs par mm dont 86 de lymphocytes). Le sang, d'abord recueilli sur EDTA, a été dilué 10 fois en citrate ; 0,5 ml de cette solution, soit l'équivalent de SOjl de sang entier, a été injecté en 4 points intradermiques. Le virus BLV produit à partir des cellules sanguines mises en culture "short-term" s'est avéré être un variant G , tous les autres sites étant conservés.
On a effectué des prises de sang toutes les semaines, parfois meme à une fréquence plus grande, par exemple dans les jours suivant une inoculation du virus recombinant. On a réalisé des comptages de globules blancs et des formules sanguines. On a recueilli à chaque fois du sérum qui a été conservé à -20*C.
La recherche des anticorps anti-gp51 a été effectuée par des tests ELISA. Ces tests ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites toutefois, dans la recherche des anticorps, les antiimmunoglobulines bovines ou ovines ont été couplées à l'enzyme -galactosidase. Dans le test ELISA de compétition, utilisé également pour la recherche des anticorps, la compétition a lieu avec l'anticorps monoclonal contre l'épitope G couplé à l'enzyme peroxydase.
Du sang a été prélevé sur EDTA deux à trois mois après la surinfection par les cellules infectées par le virus BLV.
Les lymphocytes ont été recueillis par lyse différentielle et placés en culture in vitro pour une période de 96 heures.
Le surnageant de culture a été dès lors recueilli et la présence des protéines virales gap51 et p24 a été recherchée par test ELISA.
Les moutons ont été suivis après la surinfection par
BLV pendant une période de 6 mois après celle-ci pour la détection d'anticorps antip241 signe de l'infection par le virus BLV, les animaux n'ayant vu avant la surinfection que les protéines gp51 et gap30.
BLV pendant une période de 6 mois après celle-ci pour la détection d'anticorps antip241 signe de l'infection par le virus BLV, les animaux n'ayant vu avant la surinfection que les protéines gp51 et gap30.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau
IV.
IV.
Ces résultats montrent
- que des anticorps antigp5î ont été détectés à haut titre chez les moutons ayant reçu les recombinants VP459 et
VP482.
- que des anticorps antigp5î ont été détectés à haut titre chez les moutons ayant reçu les recombinants VP459 et
VP482.
Ces anticorps ont été détectés dans un test de compétition avec l'anticorps monoclonal G couplé à la peroxydase. Ces résultats sont en accord avec ceux observés dans l'article de Portetelle, D. et al. dans J. Virol.
Methods, 23, 211-222 (1989) où la compétition existe avec l'anticorps monoclonal contre G, même si l'animal testé a été infecté par un variant BLV G
Dans des expériences préliminaires chez les moutons avec le recombinant VP391 (gp51 seule), aucune compétition n'avait pu être montrée avec l'anticorps monoclonal contre G (ou F ou H), comme cela est d'ailleurs décrit pour les lapins dans le tableau III
- que le virus BLV est détectable uniquement à partir des lymphocytes de moutons contrôles ou ayant reçu la vac cine sauvage VP452
- que les recombinants exprimant gpS1 et gp30 (VP459 et
VP482) diminuent fortement le nombre de cellules infectées ou empêchent l'infection lors d'une surinfection par BLV la méthode utilisée (culture in vitro des lymphocytes) ne permet pas d'identifier le virus BLV dans ces cas
- que des anticorps antip24, signe d'infection par BLV, sont observés chez tous les contrôles et tous ceux ayant reçu VP452
- qu'un seul mouton, ayant reçu VP459, présente un taux élevé persistant en anticorps antip24 et semble donc infecté;
- qu'un pouvoir neutralisant est observé chez les moutons ayant reçu VP459 ou VP4a2
- qu'après surinfection, un pouvoir neutralisant élevé et ne décroissant pas est signe de l'infection par BLV ; un pouvoir neutralisant faible ou qui décroit dans le temps est signe d'une protection.
Dans des expériences préliminaires chez les moutons avec le recombinant VP391 (gp51 seule), aucune compétition n'avait pu être montrée avec l'anticorps monoclonal contre G (ou F ou H), comme cela est d'ailleurs décrit pour les lapins dans le tableau III
- que le virus BLV est détectable uniquement à partir des lymphocytes de moutons contrôles ou ayant reçu la vac cine sauvage VP452
- que les recombinants exprimant gpS1 et gp30 (VP459 et
VP482) diminuent fortement le nombre de cellules infectées ou empêchent l'infection lors d'une surinfection par BLV la méthode utilisée (culture in vitro des lymphocytes) ne permet pas d'identifier le virus BLV dans ces cas
- que des anticorps antip24, signe d'infection par BLV, sont observés chez tous les contrôles et tous ceux ayant reçu VP452
- qu'un seul mouton, ayant reçu VP459, présente un taux élevé persistant en anticorps antip24 et semble donc infecté;
- qu'un pouvoir neutralisant est observé chez les moutons ayant reçu VP459 ou VP4a2
- qu'après surinfection, un pouvoir neutralisant élevé et ne décroissant pas est signe de l'infection par BLV ; un pouvoir neutralisant faible ou qui décroit dans le temps est signe d'une protection.
TABLEAU I
VP391 <SEP> VP392
<tb> VTK79 <SEP> VV-ENV1
<tb> gp51 <SEP> (gp30 <SEP> + <SEP> gp51)
<tb> MONO <SEP> A <SEP> 2,2 <SEP> mg/ml <SEP> dil. <SEP> 1/50 <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> B <SEP> 1,97 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> B' <SEP> 1,8 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> C <SEP> 1,6 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> # <SEP> + <SEP> #
<tb> MONO <SEP> D <SEP> 1,51 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> D' <SEP> 1,80 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> (E) <SEP> 2,2 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> F <SEP> 1,95 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> T.F. <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> MONO <SEP> G <SEP> 1,3 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++
<tb> MONO <SEP> H <SEP> 2,83 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> T.F. <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> T.F. = très faible TABLEAU II
<tb> VTK79 <SEP> VV-ENV1
<tb> gp51 <SEP> (gp30 <SEP> + <SEP> gp51)
<tb> MONO <SEP> A <SEP> 2,2 <SEP> mg/ml <SEP> dil. <SEP> 1/50 <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> B <SEP> 1,97 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> B' <SEP> 1,8 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> C <SEP> 1,6 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> # <SEP> + <SEP> #
<tb> MONO <SEP> D <SEP> 1,51 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> D' <SEP> 1,80 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> (E) <SEP> 2,2 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> MONO <SEP> F <SEP> 1,95 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> T.F. <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> MONO <SEP> G <SEP> 1,3 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++
<tb> MONO <SEP> H <SEP> 2,83 <SEP> mg/ml <SEP> " <SEP> " <SEP> - <SEP> + <SEP> T.F. <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> T.F. = très faible TABLEAU II
Titre <SEP> en <SEP> virus <SEP> (DL50) <SEP> au
<tb> 16/5 <SEP> 21/5 <SEP> 1/6 <SEP> 15/6
<tb> VP392 <SEP> cultivé <SEP> sur <SEP> VERO
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> VERO <SEP> 7,87 <SEP> 7,53 <SEP> 8,08
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> OVK <SEP> 6,55 <SEP> 6,53
<tb> VP392 <SEP> cultivé <SEP> sur <SEP> OVK
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> VERO <SEP> 7,02 <SEP> 7,02 <SEP> 7,33 <SEP> 7,08
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> OVK <SEP> 6,08 <SEP> 6,08 <SEP> 6,33
<tb> Tableau III
<tb> 16/5 <SEP> 21/5 <SEP> 1/6 <SEP> 15/6
<tb> VP392 <SEP> cultivé <SEP> sur <SEP> VERO
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> VERO <SEP> 7,87 <SEP> 7,53 <SEP> 8,08
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> OVK <SEP> 6,55 <SEP> 6,53
<tb> VP392 <SEP> cultivé <SEP> sur <SEP> OVK
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> VERO <SEP> 7,02 <SEP> 7,02 <SEP> 7,33 <SEP> 7,08
<tb> Titre <SEP> sur <SEP> cellules <SEP> OVK <SEP> 6,08 <SEP> 6,08 <SEP> 6,33
<tb> Tableau III
Lapin <SEP> Numéro <SEP> du <SEP> Antigénes <SEP> Mode <SEP> Titre <SEP> anti-gp51 <SEP> Compétition <SEP> ELISA <SEP> Neutrahsation <SEP> Inhibition
<tb> recombinant <SEP> exprimés <SEP> d'inoculation <SEP> 15 <SEP> jours <SEP> après <SEP> avec <SEP> MONOS <SEP> anti <SEP> gp51 <SEP> pseudotypes <SEP> syncytia
<tb> injecté <SEP> 2 <SEP> injection <SEP> Titre <SEP> Titre
<tb> 2670 <SEP> gp51 <SEP> purifié <SEP> ID/ACF <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> B <SEP> B' <SEP> C <SEP> D <SEP> D' <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> 7900 <SEP> > 16
<tb> contrôle <SEP> très <SEP> prononcée
<tb> 4 <SEP> VP391 <SEP> gp51 <SEP> seule <SEP> ID <SEP> +++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> FH <SEP> très <SEP> faible <SEP> 200
<tb> @ <SEP> nulle
<tb> @ <SEP> VP391 <SEP> gp51 <SEP> seule <SEP> IV <SEP> + <SEP> ID <SEP> +++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> H <SEP> très <SEP> faible <SEP>
F.G <SEP> faible
<tb> 7 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> H <SEP> très <SEP> faible. <SEP> 630 <SEP> 2
<tb> F.G <SEP> prononcée
<tb> 8 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> prononcée, <SEP> 1250 <SEP> 8
<tb> FGH <SEP> tres <SEP> prononcée
<tb> 10 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> (+) <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H. <SEP> très <SEP> 12600 <SEP> > 16
<tb> prononcée
<tb> 29 <SEP> VV-ENVI <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> +++ <SEP> A <SEP> prononcée <SEP> 390 <SEP> 4
<tb> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> prononcée
<tb> 30 <SEP> VP459 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> très <SEP> 660 <SEP> 8
<tb> prononcée
<tb> 34 <SEP> VP482 <SEP> gp51 <SEP> solidaire <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> très
<tb> de <SEP> gp30 <SEP> prononcée <SEP> 700 <SEP> 8
<tb> Tableau IV
<tb> recombinant <SEP> exprimés <SEP> d'inoculation <SEP> 15 <SEP> jours <SEP> après <SEP> avec <SEP> MONOS <SEP> anti <SEP> gp51 <SEP> pseudotypes <SEP> syncytia
<tb> injecté <SEP> 2 <SEP> injection <SEP> Titre <SEP> Titre
<tb> 2670 <SEP> gp51 <SEP> purifié <SEP> ID/ACF <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> B <SEP> B' <SEP> C <SEP> D <SEP> D' <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> 7900 <SEP> > 16
<tb> contrôle <SEP> très <SEP> prononcée
<tb> 4 <SEP> VP391 <SEP> gp51 <SEP> seule <SEP> ID <SEP> +++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> FH <SEP> très <SEP> faible <SEP> 200
<tb> @ <SEP> nulle
<tb> @ <SEP> VP391 <SEP> gp51 <SEP> seule <SEP> IV <SEP> + <SEP> ID <SEP> +++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> H <SEP> très <SEP> faible <SEP>
F.G <SEP> faible
<tb> 7 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> faible, <SEP> H <SEP> très <SEP> faible. <SEP> 630 <SEP> 2
<tb> F.G <SEP> prononcée
<tb> 8 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> ++++ <SEP> A <SEP> prononcée, <SEP> 1250 <SEP> 8
<tb> FGH <SEP> tres <SEP> prononcée
<tb> 10 <SEP> VP392 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> (+) <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H. <SEP> très <SEP> 12600 <SEP> > 16
<tb> prononcée
<tb> 29 <SEP> VV-ENVI <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> +++ <SEP> A <SEP> prononcée <SEP> 390 <SEP> 4
<tb> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> prononcée
<tb> 30 <SEP> VP459 <SEP> gp51 <SEP> et <SEP> gp30 <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> très <SEP> 660 <SEP> 8
<tb> prononcée
<tb> 34 <SEP> VP482 <SEP> gp51 <SEP> solidaire <SEP> ID <SEP> + <SEP> IV <SEP> ++++ <SEP> A. <SEP> F. <SEP> G. <SEP> H <SEP> très
<tb> de <SEP> gp30 <SEP> prononcée <SEP> 700 <SEP> 8
<tb> Tableau IV
ANTI-gp51 <SEP> ANTI-p24 <SEP> Neutralisation <SEP> des <SEP> psendolypes
<tb> Mouton <SEP> Souche <SEP> Antigènes <SEP> Au <SEP> moment <SEP> de <SEP> Au <SEP> moment <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> Au <SEP> moment <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> Présence <SEP> BLV <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> CONCLUSION
<tb> N <SEP> vaccine <SEP> exprimés <SEP> 2eme <SEP> inoculation <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> après <SEP> culture <SEP> lère <SEP> inoc. <SEP> 2éme <SEP> inoc <SEP> surinfection <SEP> surinfection
<tb> 44 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1600 <SEP> 1800 <SEP> INFECTE
<tb> 99 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> +++ <SEP> + <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> INFECTE
<tb> 45 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> +++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 550 <SEP> 1500 <SEP> INFECTE
<tb> 74 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++++ <SEP> - <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1000 <SEP> 6000 <SEP> INFECTE
<tb> 47 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 600 <SEP> 2600 <SEP> INFECTE
<tb> 90 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 390 <SEP> 630 <SEP> INFECTE
<tb> 40 <SEP> VP459 <SEP> gp51 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 350 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> PROTECE
<tb> 50 <SEP> VP459 <SEP> et <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 6100 <SEP> 790 <SEP> 670 <SEP> PROTECE
<tb> 29 <SEP> VP459 <SEP> gp30 <SEP> - <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 650 <SEP> 1000 <SEP> INFECTE
<tb> 68 <SEP> VP459 <SEP> séparées <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> 40 <SEP> 20 <SEP> PROTECE
<tb> 41 <SEP> VP482 <SEP> gp51 <SEP> +++ <SEP> +++++ <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 1860 <SEP> 190 <SEP> 110 <SEP> PROTECE
<tb> 43 <SEP> VP482 <SEP> et <SEP> +++ <SEP> ++++++ <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 710 <SEP> 320 <SEP> 90 <SEP> PROTECE
<tb> 30 <SEP> VP482 <SEP> gp30 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 980 <SEP> 4400 <SEP> 50 <SEP> Pbl <SEP> PROTECE
<tb> 31 <SEP> VP482 <SEP> solidaires <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 360 <SEP> 390 <SEP> 60 <SEP> PROTECE.
<tb>
<tb> Mouton <SEP> Souche <SEP> Antigènes <SEP> Au <SEP> moment <SEP> de <SEP> Au <SEP> moment <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> Au <SEP> moment <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> Présence <SEP> BLV <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> sem. <SEP> après <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> après <SEP> CONCLUSION
<tb> N <SEP> vaccine <SEP> exprimés <SEP> 2eme <SEP> inoculation <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> surinfection <SEP> après <SEP> culture <SEP> lère <SEP> inoc. <SEP> 2éme <SEP> inoc <SEP> surinfection <SEP> surinfection
<tb> 44 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1600 <SEP> 1800 <SEP> INFECTE
<tb> 99 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> +++ <SEP> + <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> INFECTE
<tb> 45 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> +++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 550 <SEP> 1500 <SEP> INFECTE
<tb> 74 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++++++ <SEP> - <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1000 <SEP> 6000 <SEP> INFECTE
<tb> 47 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 600 <SEP> 2600 <SEP> INFECTE
<tb> 90 <SEP> VP452 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++++++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 390 <SEP> 630 <SEP> INFECTE
<tb> 40 <SEP> VP459 <SEP> gp51 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 350 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> PROTECE
<tb> 50 <SEP> VP459 <SEP> et <SEP> - <SEP> +++++ <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 6100 <SEP> 790 <SEP> 670 <SEP> PROTECE
<tb> 29 <SEP> VP459 <SEP> gp30 <SEP> - <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 650 <SEP> 1000 <SEP> INFECTE
<tb> 68 <SEP> VP459 <SEP> séparées <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> 40 <SEP> 20 <SEP> PROTECE
<tb> 41 <SEP> VP482 <SEP> gp51 <SEP> +++ <SEP> +++++ <SEP> ++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 1860 <SEP> 190 <SEP> 110 <SEP> PROTECE
<tb> 43 <SEP> VP482 <SEP> et <SEP> +++ <SEP> ++++++ <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 710 <SEP> 320 <SEP> 90 <SEP> PROTECE
<tb> 30 <SEP> VP482 <SEP> gp30 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++++ <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 980 <SEP> 4400 <SEP> 50 <SEP> Pbl <SEP> PROTECE
<tb> 31 <SEP> VP482 <SEP> solidaires <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 360 <SEP> 390 <SEP> 60 <SEP> PROTECE.
<tb>
Claims (23)
1. Vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), comprenant une fraction peptidique qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épit i F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprol:eine transmembranaire est la glycoprotéine gp30 du virus BLV.
3. Vaccin selon la revendication 2, caractérisé en ce que les glycoprotéines gpS1 et gp30 sont exprimées en une molécule unique dans un système d'expression.
4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce que la molécule comprenant gp51 et gp30 est dépourvue de site de clivage.
5. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les glycoprotéines gp51 et gp30 sont exprimées à l'aide d'un virus recombinant.
6. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce que le virus recombinant est choisi parmi le virus de la vacciner le virus Fowlpoxr le virus Canarypox, les adénovirus, les herpèsvirus et les baculovirus.
7. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les glycoprotéines gp51 et gp30 sont exprimées dans une levure.
8. Vaccin selon la revendication 7, caractérisé en ce que la levure est Saccharomices cerevisiae.
9. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les glycoprotéines gp51 et gp30 sont insérées dans des liposomes.
10. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 caractérisé en ce que les glycoprotéines gpS1 et gp30 sont insérées dans des polyélectrolytes.
11. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que les glycoprotéines gp51 et gp30 sont insérées dans une préparation de type ISCOM.
12. Vaccin recombinant contre le virus de la leucémie bovine, caractérisé en ce qu'il comprend des virus recombinants exprimant une fraction peptidiqiie qui associe la glycoprotéine gp51 et la glycoprotéine transmembranaire gp30 qui restitue à la glycoprotinc gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés dans la constitution de vaccins.
13. Vaccin recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il exprime gène molécule unique, comprenant gp51 et gp30, dépourvue ou non de site de clivage.
14. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en (:e que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus correspondant tout ou partie des gènes codant pour les glycoprotéines gp51 et gp30 provenant du virus BLV ou d'un variant BLV.
15. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus corre;-pondant la séquence provenant d'un provirus BLV cloné.
16. Vaccin recombinant selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le virus recombinant est obtenu en insérant dans le virus correspondant une copie ADNc ou un oligonucléotide codant pour tout ou partie de la gp51 et de la gp30.
17. Vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV) comprenant une fraction peptidique comportant la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et induisant à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à un anti.orps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents 1.;:. épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins.
18. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope E est fixé siir la glycoprotéine gp51.
19. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope A est fixé sur la glycoprotéine gpSî.
20. Vaccin selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 et l'anticorps monoclonal E ou A sont exprimés dans un système d'expression.
21. Vaccin selon la revendication 20, caractérisé en ce que la glycoprotéine gpS1 et l'anticorps monoclonal E ou A sont exprimés à l'aide d'un virus recombinant, dans lequel sont insérés le gène codant pour la gpS1 et des gènes codant pour l'anticorps monoclonal contre l'épitope E ou A.
22. Vaccin selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'on insère dans une préparation de type ISCOM l'anticorps monoclonal E ou A, ledit anticorps captant ensuite la glycoprotéine gp51.
23. Vaccin contre la leucémie bovine, caractérisé en ce qu'il contient des virus recombinants tels que définis dans la revendication 21.
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Patent Citations (3)
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| Medline Abstract No: 89073944 BRANTL S. et al: "Expression of ENV sequences of the bovine leukemia virus (BLV) in the yeast saccharomyces cerevisiae." & YEAST, 3/1988, Vol 4, No 1, p 47-59 * |
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