JP6529498B2 - EGFRvIIIに対して特異的な抗体結合部位 - Google Patents
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(i)配列識別番号1と配列識別番号2
(ii)配列識別番号3と配列識別番号4
(iii)配列識別番号5と配列識別番号6
(iv)配列識別番号7と配列識別番号8
(v)配列識別番号9と配列識別番号10
(vi)配列識別番号11と配列識別番号12
(vii)配列識別番号13と配列識別番号14
(viii)配列識別番号15と配列識別番号16
(ix)配列識別番号17と配列識別番号18
(x)配列識別番号19と配列識別番号20
(xi)配列識別番号21と配列識別番号22、又は、
(xii)配列識別番号25と配列識別番号26。
(i)VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3);又は
(ii)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);又は
(iii)VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);又は
(iv)VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvII)。
Li3G30の開示:
EGFRvIIIに対して特異的なバインダをエンリッチするために、IgMに基づく起源のヒトscFv配列のファージディスプレイライブラリーを2〜3のパニングラウンドにかけた。バインダをEGFRの野生型又は融合タンパク質のFc部分まで枯渇させるために、各パニングラウンドの前に、前記ライブラリーをEGFR-Fc上でプレインキュベートした。EGFRvIII被覆固相上と溶液中とにおいて選択を平行して行った。2及び3パニングラウンド後、単一コロニーを取り出し、溶解性scFvの発現を誘導し、抽出物のEGFRvIII-FcとEGFR-Fcに対する結合をスクリーニングした。
抗体フレームワーク対VH5-51/VL3-25のためのライブラリーを、DistributedBioから注文したアルゴリズムによって設計した。Li3G30からの特異性決定残基が同定され、前記ライブラリー設計に含められた。前記設計は、そのそれぞれがアミノ酸の個別に定義された分布を有する、52のランダム化されたCDR位置を含んでいた。3種類のループ長がVL-CDR3に組み込まれた。VHとVLの前記ランダム化位置をコードする遺伝子フラグメントを、Geneart/Lifetechnologiesからオーダーし、TRIM技術を介して合成した。これらフラグメントを、前記ファージディスプレイベクターpEXHAM(Schwarz et al. 2004)にクローニングし、3.7E+8トランスフォームE.coli細胞の最終ライブラリーサイズとした。前記ライブラリーをファージ粒子にパッケージ化し、パニング及びスクリーニング処理にかけて、改善された親和性と保持された特異性、EGFRvIIIに対する、を備えるバリアントを単離した。前記パニングは、タンパク質結合プラスチック表面上に固定されたEGFRvIII-Fc抗原によって行われた。前記パニング手順は、以下の工程を実行することによって、遅い解離速度(KOFF)のEGFRvIII結合scFvに対して有利なものとすることを目的とするものであった。洗浄手順は、ゆっくりと解離するscFvの選択に有利とするために30分間以内の複数の洗浄緩衝液インキュベーション工程を含むものであった。もう一つの手順は、溶解性EGFRvIIIとの一晩での競合に基づくものであった。第1回目のパニング工程の前の親和性成熟の処理においてEGFR-EGFRvIII交叉反応性抗体又はFcに対して結合する抗体が選択されることのないように、野生型EGFR-Fcに対するプレインキュベーションによって前記ライブラリーから可能な野生型EGFRバインダを枯渇させた。更に、前記スクリーニングプロトコルによって、固定EGFRvIII上での前記パニング手順中に溶解性EGFRの存在による交叉反応性バインダにとって不利になるようにした。
抗ヒト(anti-hu)FcIgG CM5-チップの調製:
抗ヒトFcIgG CM5-チップを製造業者の指示に従って、Amine-Coupling-Kit(GE)を使用して共有アミンカップリングによって調製した。前記IgGを提供された固定緩衝液(10mM 酢酸ナトリウム、pH 5.0)中で2.5μg/mLで希釈した。前記カップリング手順のために、Biacore T200制御ソフトウエアの所定の方法”Amine”を使用した。すべての4つのフローセルにおいて5000〜10000RUの標的レベルが到達された。前記組み換えタンパク質溶液を注入する前に、前記チップの表面をEDC/NHSによって活性化させた。表面上のフリー結合部位をエタノールアミンによってブロッキングした。1×HBS-P+を前記カップリング手順全体のためのランニング緩衝液として選択した。
Nandropを使用したA280測定によってSPR測定前にScFv濃度をチェックした。ストック溶液の濃度(c)を下記の式によって計算した。
c[mg/mL]=(A280)/(2.25[cm2/mg]×1[cm])
EGFRvIII-Fcと野生型EGFR-Fc融合タンパク質を、1×HBS-P+中で6.25nMの濃度にまで希釈した。両方の抗原を、10μL/分の流速でEGFRvIII-Fc については75秒間、野生型EGFR-Fcについては90秒間、注入した。EGFRvIII-Fcは、フローセル2上に注入され、野生型EGFR-Fcはフローセル4上に注入された。フローセル1と3はブランクとされた。
親和性成熟には、一般に、結合エピトープの小さな変化がしばしば伴い、これらによって特異性/交叉反応性が影響される可能性がある(Barbas et al, 1994, Parsons et al., 1996, Winkler et al., 2000)。野生型EGFRの細胞外ドメイン(エクソン2〜7)の269のアミノ酸のインフレーム欠失によって、野生型EGFRに対するEGFRvIIIネオ-エピトープが形成されるが、これはかなり小さなものであると予想され、それはアミノ酸の新規な近接配置(juataposition)(アミノ酸5がアミノ酸274に融合する)と、前記欠失部位での単一の新規なGLYアミノ酸とから成る。このケースにおける結合エピトープのたとえ小さな変化であってもEGFRvIIIに対する精巧な特異性がすぐに破壊されてしまうと予想され、それによって天然EGFRも認識する交叉反応性バインダが生じる可能性がある。
材料(培地、緩衝液、及び試薬):
抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invitrogen)、Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare)、FITCコンジュゲート(conj.) ヤギ抗ヒトIgG(Dianova)、FITCコンジュケート ヤギ抗マウスIgG、mix X (Dianova)、L-グルタミン(Invitrogen)、NaN3 (Carl Roth)、PBS(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)、ヨウ化プロピジウム(Sigma)、RPMI-1640(Invitrogen)
F98ラット神経膠腫細胞、EGFRを過剰発現するF98細胞(F98EGFR)、EGFRvIIIを過剰発現するF98細胞(F98EGFRvIII)をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から購入し、推奨されているプロトコルに従って培養した。
F98 (ATCC CRL-2397)
F98EGFR (ATCC CRL-2948)
F98npEGFRvIII (ATCC CRL-2949)
氷上で45分間のFACS緩衝液中での100μg/mL(〜3300nM)から開始して表示のscFv抗体の100μLの段階希釈で細胞をインキュベートした。FACS緩衝液での3回の洗浄後、細胞を0.1mLの10μg/mLマウスモノクローナル抗His抗体クローン13/45/31と、同じ緩衝液中で氷上で45分間インキュベートした。第2の洗浄サイクル後、前記細胞を、上述したのと同じ条件下で、0.1mLの15μg/mL FITCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体とインキュベートした。対照として、細胞を、前記抗His IgG 13/45/31とインキュベートし、その後、scFvs無しのFITCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体によってインキュベートした。次に、前記細胞を、再び洗浄し、死滅細胞を除外するために、2μg/mLのヨウ化プロピジウムを含有する0.2mLのFACS緩衝液中に再懸濁させた。1×104生細胞の蛍光を、MXPソフトウエア(Beckman-Coulter、Krefeld、Germany)を利用するBeckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータ又は、Incyteソフトウエア(Merck Millipore、Schwalbach、Germany)を利用するMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータを使用して測定した。前記細胞サンプルの平均蛍光強度を、CXPソフトウエア(Beckman-Coulter、Krefeld、Germany)又はIncyteソフトウエア(Merck Millipore、Schwalbach、Germany)を使用して計算した。
EGFRvIII抗原に対する異なる結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの結合特異性をテストするとともに、野生型EGFR抗原に対する結合の欠如を示すために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)とウェスタンブロッティング分析を行う。
ELISA手順:
96ウェルELISAプレート(Immuno MaxiSorp; Nunc)を100mMの炭酸水素塩緩衝液中でEGFRvIII-Fc、野生型EGFR-Fc又はCD3γε組み換え抗原によって一晩4℃でコーティングする。およそ同じモル量の抗原のコーティング密度を得るために、EGFRvIII-Fcを4μg/mLの濃度で、EGFR-Fcは6μg/mLの濃度で、又は、CD3γε抗原は1.5μg/mLの濃度で、それぞれコーティングする。PBS中に溶解された3% (w/v)のスキムミルクパウダー(Merck)によるブロッキング工程の後、0.3% (w/v)のスキムミルクパウダー(Merck)を含むPBS中で200ng/μL〜6.5×10-6 ng/μLの範囲の前記種々のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの11の段階希釈物を、25℃で1.5時間、プレート上でインキュベートする。インキュベーションに続いて、プレートを0.1%(v/v)Tween 20(Serva)を含むPBSの各ウェル300μLで3回洗浄する。50ng/mLのProtein L-HRPを添加し25℃で1時間プレート上でインキュベートした。0.1%(v/v)Tween 20を含むPBSの各ウェル300μLで3回洗浄した後、検出のためにテトリラメチルベンジジン(TMB)基質(Seramum)を添加する。各ウェル当たり100μLの0.5 M H2SO4の添加によって約2分後に反応を停止させる。前記ウェルの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー(Victor、Perkin Elmer)によって450nmで測定する。
抗ヒト(anti-hu)Fc IgG CM5-チップの作成
抗ヒトFc IgG CM5-チップを上述したように作成した(例2)。
タンデムダイアボディ濃度を、SPR測定の前に、Nandropを使用したA280測定によってチェックした。ストック溶液の濃度(c)は、下記の等式によって計算した。
c[mg/mL]=(A280)/(2.25[cm2/mg]×1 [cm])
EGFRvIII-Fc融合タンパク質を、1×HBS-P+中で6.25nMの濃度にまで希釈した。前記抗原溶液を、EGFRvIII-Fcについては、10μL/分の流速で40秒間注入した。前記抗原はフローセル2に注入された。フローセル1は参照セルであった。
二つのEGFRvIII結合ドメインを、前記EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディのような二価又は多価又は多重特異性分子と組み合わせることの影響を分析するために、EGFRvIII抗原に対するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの見かけ上の親和性をBiacore X100を使用するSPRによって測定した(図6)。
健全な組織上に広く発現される野生型EGFRと対照的に、変異レセプタEGFRvIIIの発現は高度に腫瘍特異的である。膠芽腫においてEGFRvIIIが高頻度で発現されることについては文献において常に記載されているが、他の腫瘍におけるEGFRvIIIの発現有病率(expression prevalence)とその発現の均質性はいまだに論争の的となっている。
前記親又は親和性成熟EGFRvIII特異性ドメインと、種々のCD3結合ドメインとが組み合わされて含まれ、及び/又は、タンデムダイアボディ分子において異なる順序の個々の結合ドメインを有するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディ抗体を、細胞ベース細胞傷害性アッセイで分析した(図8)。タンデムダイアボディの標的媒介性依存、特異性と、T細胞媒介性死滅を、CHO細胞(CHOEGFRvIII)、野生型EGFR発現CHO細胞(CHOEGFR)、及び非トランスフェクションCHO細胞を標的細胞として使用することによって分析した。
DMSO(Sigma)、EasySep(商標) Human T Cell Enrichment Kit(Stem Cell Technologies)、EasySep(商標)HumanCD4+T Cell Enrichment Kit (Stem Cell Technologies)、EasySep(商標) Human CD8+T Cell Enrichment Kit(Stem Cell Technologies)、The Big Easy EasySep(商標) Magnet(Stem Cell Technologies)、FCS(Invitrogen)、Lymphoprep(Stem Cell)、L-グルタミン(Invitrogen)、mIgG1 FITC(ADG)、CD16-FITC(MEM-154)(Thermo Fisher Scientific)、mIgG1-FITC/mIgG1-PE/mIG1-ECD(Bechman Coulter)、mIgG1-PE (Beckman Coulter)、mIgG1-PC5(Beckman Coulter)、mIgG1-PC7(Beckman Coulter)、CD8-FITC/CD4-PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD16-PC5(Beckman Coulter)、CD19-PC7(Beckman Coulter)、CD16-FITC/CD56-PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD14-PC7(Beckman Coulter)、CD33-PE(MACS Milteny Botech)、NaN3 (Roth)、PBS(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Midi Kit(Sigma)、GammanormヒトIgG(Octapharma)、プロピジウムイオダイド(Sigma)、RPM1-1640 (Invitrogen)。
バッフィーコートを、採血の当日にDeutsches Rotes Kreuz, DRK-Blutspendedienst Baden-Wurtemberg-Hessen(Mannheim、Germany)から購入した。PBMCを密度勾配遠心分離によって単離する前に、バッフィーコート調製物を一晩室温で保存した。前記バッフィーコートサンプルを、2〜3倍量のPBSで希釈し、Lymphoprepのクッション上に重ね、800×gで、25分間、室温w/o brakeで遠心分離にかけた。界面に位置するPBMCを収集し、それらをT細胞エンリッチメント又はフロサイトメトリー分析に使用する前にPBSで3回洗浄した。T細胞を、非接触のヒトT細胞の免疫磁気分離用のEasySep(商標) Human T Cell Enrichment KitとBig Easy EasySep(商標) Magnetを製造業者の指示に従って使用して、前記PBMC集団からエンリッチした。
PBMCのサブポピュレーションの分布とエンリッチされたPBMC又はT細胞サブセットの純度を評価するためにPBMCの染色を行った。
エフェクタ細胞として使用されたT細胞を、上述したようにフローサイトメトリーによって特徴付けた。細胞傷害性アッセイに使用された標的細胞は、EGFRvIIIを過剰発現するように安定的にトランスフェクションされたCHO細胞(CHOEGFRvIII)、野生型EGFRを発現するように安定的にトランスフェクションされたCHO細胞(CHOEGFR)又は非トランスフェクションCHO細胞(CHO)であった。前記細胞ラインは、前述したように生成され、前述したように標準条件下で培養された。前記細胞傷害性アッセイのために、標的細胞を収集し、FCS無しのRPMI1640培地で2回洗浄し、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Midi Kit内に提供された希釈物C中で2×107/mLの密度に再懸濁した。次に、前記細胞懸濁液を、同量の2倍濃度PKH67-標識溶液(例えば、250μL希釈物C中1μLのPKH67)と混合し、製造業者の指示に従って、周期的混合により2〜5分間RTでインキュベートした。染色反応を、同量のFCSの添加と1分間のインキュベーションによって停止させた。標識された標的細胞を完全RPMI培地で洗浄後、細胞を計数し、完全RPMI培地中で2×105/mLの密度に再懸濁させた。
[1-(生存標的の数(サンプル)/(生存標的(自然発生))×100%。
シグモイド用量反応曲線とEC50値をGraphPad Prismソフトウエア(Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US)を使用して非線型回帰/4パラメータロジスティックフィットによって計算した。
所与の抗体濃度について得られる溶解値は反復測定され、そしてGraphPad Prismソフトウエア(Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US)を使用してシグモイド用量反応/4-パラメータロジスティックフィットによって分析され、そしてEC50値平均及び溶解率の反復のSDの算出のために使用された。
EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによるEGFRvIII調節の評価のために、組み換えEGFRvIIIを発現するCHO(CHOEGFRvIII)、又は組み換えEGFRvIIIを発現するF98細胞(F98EGFRvIII)を、10% FCS、2mM L-グルタミン、100IU/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、100μg/mLピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI 1640培地(ここでは完全RPMI培地と称する、すべての成分はInvitrogenから得た)中で、増加する濃度のEGFRvIII/CD3ダイアボディ抗体と共に、37℃、5%CO2の加湿されたインキュベータ内で24時間、丸底98ウェルマイクロプレートの個々のウェルに2.5×105細胞のアリコート内でインキュベートした。細胞の複数のアリコートを、抗体不在で培養し、これは最大EGFRvIII細胞表面レベルの検出のための対照サンプルとして、そして、第2試薬のみでの染色のための陰性対照として使用された。インキュベーション後、細胞を、2%熱不活性化FCS(Invitrogen)と0.1%アジ化ナトリウム(Roth、Karlsruhe、Germany)とを添加した氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS、Invitrogen)(ここではFACS緩衝液と称する)で2回洗浄し、その後、細胞表面上の残存のEGFRvIII抗原に対応する最大抗体結合を評価するために調節培養中にそれらとともにインキュベーションされた同じ抗体の飽和濃度(10μg/mL)で染色した。細胞表面上での最大測定可能EGFRvIIIレベルに対応する最大抗体結合能力を測定するために飽和濃度の同じ抗体で、抗体不在で培養された細胞のアリコートを染色した。FACS緩衝液での3回の洗浄後、細胞をタンデムダイアボディで処理し、10μg/mL、抗His mAb(Dia910、Dianova)で染色し、その後、15μg/mL FITCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG(Dianova)で染色した。FACS緩衝液による反復洗浄後、細胞を、2μg/mLのヨウ化プロピジウム(Sigma)を含有するFACS緩衝液中に再懸濁させて死滅細胞を除去した。各サンプルから〜5×103ヨウ化プロピジウム陰性細胞を、MXPソフトウエアを使用してFC500MPLフローサイトメータ(Beckman-Coulter、Krefeld、Germany)で分析し、測定されたサンプルの平均蛍光強度(MFI)を、前記CXPソフトウエア(Beckman-Coulter)で測定するか、或いは、細胞を、Incyteソフトウエア(Merck MIlipore、Schwalbach、Germany)を使用したMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータで分析した。
EGFRvIII/CD3(又は、EGFRvIII/CD16A)タンデムダイアボディが、EGFRvIII+標的細胞の不在下においてT細胞の活性化と、その後の増殖を誘導するか否かを評価するために、ヒトPBMCを増大する濃度のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの存在下で培養した。増殖は、5日間のインキュベーションの後のBrdU取り込みアッセイで評価された。
FCS(Invitrogen)、ヒト血清(Sigma)、Lymphoprep(Stemcell Technologies)、L-グルタミン(Invitrogen)、OKT3(Biolegend)、PBS (Invitrogen)、β-メルカプトエタノール(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)、RPMI-1640(Invitrogen)、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、BrdU Cell Proliferation ELISA (Roche)。
バッフィーコートを、採血の当日にDeutsches Rotes Kreuz、DRK-Blutspendedienst Baden-Wurtemberg-Hessen (Mannheim、 Germany)から購入した。PBMCを単離する前に、バッフィーコート調合物を一晩室温で保存した。
PBMCを密度勾配遠心分離によってバッフィーコートから単離した。前記バッフィーコートサンプルを、2〜3倍の量のPBSで希釈し、Lymphoprepのクッション上に重ね、800×gで、25分間、室温w/o brakeで遠心分離にかけた。界面に位置するPBMCを収集し、それらを増殖アッセイに使用する前に、PBSで3回洗浄した。
全てのアッセイプレートを、10%熱不活性化ヒト血清、4mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMのベータ-メルカプエタノールを添加したRPMI培地(ここでは完全RPMI培地と称する)で、2時間RTでブロックし、抗体の前記プラスチック表面に対する非特異的結合を防止した。前記ブロッキング培地の除去後、4×105 のPBMCを、示される濃度のテスト及び対照品と共に200μL/ウェルの総量で、平底96ウェルマイクロプレートの個々のウェルに、完全RPMI培地中に3重に播種した。IgG抗CD3クローンOKT3を陽性対照として使用した。自発的増殖を評価するために、増殖細胞を6重で抗体の不在下で培養した。次に、プレートを、加湿雰囲気中で37℃、5%CO2で4日間インキュベートした。インキュベーションの終わりの18時間前に、細胞培養に、100μM BrdUをパルシングした。取り込まれたBrdUを、製造業者の指示に従ってBrdU Proliferation ELISA kitを使用して定量した。100mM H2SO4を添加することによって発色現象を停止させた後、マルチラベルプレートリーダ(Victor 3、Perkin Elmer)によって450nmで吸光度を測定した。吸光度値を分析し、平均値をSDと共に、GraphPad Prismソフトウエア(Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US)を使用してプロットした。
CD3 T細胞抗原に対する親和性の範囲を有する異なるCD3結合ドメインと組み合わされた同じEGFRvIII結合ドメイン(Li3G30)を含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを構築し、発現させ、CD3+Jurkat細胞とEGFRvIII+CHOEGFRvIII細胞への結合を測定し、更に、標的細胞としてCHOEGFRvIII細胞、そしてエフェクタ細胞としてPBMCを使用した細胞傷害性アッセイを行った。この例でテストされた全てのテストタンデムダイアボディは、個々のVH及びVL(重鎖と軽鎖)ドメインの同じ順序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3を有している。
抗His IgG 13/45/31 (Dianova)、FCS(Invitrogen)、FITCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG min X (Dianova)、L-グルタミン(Invitrogen)、NaN3(Carl Roth)、PBS(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)、ヨウ化プロピジウム(Sigma)、RPMI-1640 (Invitrogen)
Jurkat細胞(Dr. G. Moldenhauer、DKFZ、Heidelberg、Germanyのご厚意によって提供された)を2mM L-グルタミンと100 IU/mLペニシリンGナトリウムと100μg/mL硫酸ストレプトマイシンとを添加したRPMI 1640培地中(すべての成分はInvitrogenから、ここで完全RPMI 1640培地と称する)で培養した。
細胞を、2%熱不活性化FCSと0.1%アジ化ナトリウムとを添加した氷冷PBS(ここではFACS緩衝液と称する)中で100μg/mL(〜1000nM)からの示された抗体の100μLの段階希釈物で45分間、氷上でインキュベートした。FACS緩衝液での3回の洗浄後、前記細胞を、同じ緩衝液中で45分間、氷上で、0.1mLの10μg/mLマウスモノクローナル抗His抗体クローン13/45/31とインキュベートした。第2回目の洗浄サイクル後、前と同じ条件下で0.1mLの15μg/mL FITC Cコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体とインキュベートした。対照として、細胞を、前記抗His IgG 13/45/31と、その後、FTTCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体と、一次抗体無しでインキュベートした。その後、前記細胞を、再び洗浄し、死滅細胞を除去するために、2μg/mLヨウ化プロピジウムを含む0.2mLのFACS緩衝液中に再懸濁させた。1×104の生存細胞の蛍光を、MXPソフトウエアを使用するBeckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータ(Beckman-Coulter、Krefeld、Germany)、又は、Incyteソフトウエアを使用するMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータ(Merck MIlipore、Schwalbah、Germany)で測定した。前記細胞サンプルの平均蛍光強度を、前記CXPソフトウエア(Beckman-Coulter、Krefeld、Germany)又は前記Incyteソフトウエア(Merck MIlipore、Schwalbah、Germany)を使用して計算した。Beckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータによる分析の場合には0.5×106細胞/染色、Milipore Guava EasyCyteフローサイトメータの場合には、0.25×106細胞/染色のみが使用された。二次試薬及び三次試薬のみで染色された細胞の蛍光強度値を減算した後、それらの値を、GraphPad Prism ソフトウエア(Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US)の1サイト結合(双曲線:hyperbola)の等式でのKD値の計算に使用した。
9の実験群の免疫不全NOD/scidマウス(NOD/MrbBom Tac-Prkdcscid, Taconic Denmark)を、第0日目(d0)に健全なドナーからの1×107精製ヒトPBMCと混合した4×106のF98npEGFRvIII細胞の懸濁液を皮下(s.c.)注射によって異種移植した。PBMCの潜在的ドナー可変性(variability)を説明するために、前記実験群のそれぞれを、1の個人のみのドナーのPBMCをそれぞれ受ける二つのコホートに分割した。動物に、腫瘍細胞接種2時間後に尻尾の静脈(i.v.)に注入し、その後、各タンデムダイアボディテスト品100μg、10μg、1μgを24時間、48時間、72時間、及び96時間に、注入した。対照群はビヒクルのみを受けた。別の対照には、1mgのセツキシマブ(アービタックス)をi.p.で、d0からはじめて週2回投与した。表6に投与群とドナー割り当てを要約する。腫瘍の大径と小径とをキャリパで測定することによって、腫瘍の体積(volume)を毎週3回、第3日目から第52日目までモニタした。腫瘍体積は、下記の式によって直径から計算された。
Vol. =(小径)2×大径×0.5
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Claims (21)
- 抗体可変重鎖ドメイン及び抗体可変軽鎖ドメインを含む、少なくとも1つのEGFRvIII結合部位を備えるEGFRvIII結合タンパク質であって、
ここで、
(a)
(a1)配列認識番号27のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号30のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号31のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号32のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a2)配列認識番号33のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号34のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号31のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号35のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a3)配列認識番号33のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号36のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号31のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号37のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a4)配列認識番号33のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号38のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号39のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号41のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a5)配列認識番号42のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号43のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号44のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号45のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a6)配列認識番号46のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号47のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号48のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a7)配列認識番号49のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号50のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号51のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号52のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a8)配列認識番号53のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号54のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号44のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号55のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a9)配列認識番号53のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号56のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号57のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号58のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a10)配列認識番号46のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号28のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号59のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号60のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
(a11)配列認識番号33のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号61のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号44のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号40のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号62のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、又は、
(a12)アミノ酸配列YDFSSYWIGを有するCDR1、配列認識番号63のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号29のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号64のアミノ酸配列を有するCDR1、配列認識番号31のアミノ酸配列を有するCDR2、及び、配列認識番号65のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体可変軽鎖ドメイン、を含むEGFRvIII結合タンパク質。 - 前記EGFRvIII結合部位は、フローサイトメトリー(FACS)アッセイでは、EGFRvIII陽性細胞に結合するが、EGFR陽性細胞に結合しない、請求項1に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 配列識別番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、及び、25から成るグループから選択される抗体可変重鎖ドメイン、及び、配列識別番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、及び、26から成るグループから選択される抗体可変軽鎖ドメイン、とを含む請求項1又は2に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 配列認識番号5、7、及び25からなるグループから選択される抗体可変重鎖ドメイン、又は、配列認識番号6、8、及び、26からなるグループから選択される抗体可変軽鎖ドメインを含む請求項1〜3のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの前記EGFRvIII結合部位は、以下の(i)〜(xii)のグループから選択される請求項3に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
(i)配列認識番号1及び配列認識番号2
(ii)配列認識番号3及び配列認識番号4
(iii)配列認識番号5及び配列認識番号6
(iv)配列認識番号7及び配列認識番号8
(v)配列認識番号9及び配列認識番号10
(vi)配列認識番号11及び配列認識番号12
(vii)配列認識番号13及び配列認識番号14
(viii)配列認識番号15及び配列認識番号16
(ix)配列認識番号17及び配列認識番号18
(x)配列認識番号19及び配列認識番号20
(xi)配列認識番号21及び配列認識番号22
(xii)配列認識番号25及び配列認識番号26 - 37℃で24時間の、結合タンパク質の飽和条件における前記EGFRvIII結合タンパク質に対する細胞の露出後、前記細胞の表面上で、未処理細胞上のEGFRvIIIレセプタ分子の少なくとも80%がまだ使用可能である請求項1〜5のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 少なくとも1つの別の機能的ドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 前記少なくとも1つの別の機能的ドメインは、エフェクタドメインである請求項7に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 前記エフェクタドメインは、T細胞、又は、NK細胞に対して特異的である請求項8に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 前記エフェクタドメインは、CD3に対する抗原結合部位を形成する、少なくとも1つの抗体可変重鎖ドメインと少なくとも1つの可変軽鎖ドメインとを含むCD3結合部位である請求項8又は9に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 前記CD3結合部位は、配列識別番号23のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインと配列識別番号24のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインとを含む請求項10に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 多重特異性である請求項1〜11のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 三重特異性である請求項12に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- 二量体タンパク質である請求項1〜13のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- EGFRvIII及びCD3(EGFRvIII/CD3)に対して特異的であるタンデムダイアボディ(tandem diabody)、又は、EGFRvIII及びCD16A(EGFRvIII/CD16A)に対して特異的であるタンデムダイアボディ(tandem diabody)である請求項14に記載のEGFRvIII結合タンパク質。
- タンデムダイアボディ(tandem diabody)であって、各ポリペプチドにおいて、4つの可変鎖ドメインは、ペプチドリンカーL1、L2、及びL3によって以下の順序で互いに融合されている請求項15に記載の二量体EGFRvIII結合タンパク質。
(i)VL(CD3)―L1−VH(EGFRvIII)−L2−VL(EGFRvIII)−L3−VH(CD3)、又は、
(ii)VH(CD3)−L1−VL(EGFRvIII)−L2−VH(EGFRvIII)−L3−VL(CD3)、又は、
(iii)VL(EGFRvIII)−L1−VH(CD3)−L2−VL(CD3)−L3−VH(EGFRvIII)、又は、
(iv)VH(EGFRvIII)−L1−VL(CD3)−L2−VH(CD3)−L3−VL(EGFRvIII) - 前記ペプチドリンカーL1、L2及びL3は、12以下のアミノ酸残基からなる請求項16に記載のタンデムダイアボディ。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質、又は、請求項15〜17のいずれか一項に記載のタンデムダイアボディをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項18に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項19に記載のベクターでトランスフォーム、又はトランスフェクションされた宿主細胞。
- (i)請求項1〜14のいずれか一項に記載のEGFRvIII結合タンパク質、請求項15〜17のいずれか一項に記載の二重特異性タンデムダイアボディ、請求項19に記載のベクター、又は、請求項20に記載の宿主細胞、及び、
(ii)薬用的許容可能キャリア、を含む薬用組成物。
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