CN110072889B - 抗程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开一种针对人类程序性细胞死亡配体1(PD‑L1)的抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸、包括该核酸的载体、经该载体转化的细胞、用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法、以及含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症或传染病的组合物。

Description

抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抗体及其用途
【技术领域】
本公开文本涉及一种针对人类程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸、包括该核酸的载体、经该载体转化的细胞、用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法、以及含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症或传染病的组合物。
【背景技术】
抗原特异性T淋巴细胞的免疫应答是个非常复杂且细微调节的过程。首先，在存于T淋巴细胞表面上的T细胞抗原受体(TCR)识别抗原呈递细胞(APC)的主要组织相容性复合物(MHC)和在人体中结合至HLA(人类白血球抗原)II类分子的抗原时，T淋巴细胞的激活开始。在这种情况下，为了充分激活T淋巴细胞，除了识别抗原以外，还需要共刺激信号，该共刺激信号是在抗原呈递细胞中表达的CD80、CD40等同时结合至CD28、CD40L等(其为存于T淋巴细胞表面上的配体)时获得。因此，激活细胞因子的分泌。T淋巴细胞的激活在共刺激信号的转移不存在时无法实现，但抗原是通过TCR-MHC/表位的结合来识别。
然而，共抑制信号也被激活，使得经激活的T淋巴细胞在一段时间后失活。这可防止因过度免疫刺激造成的组织损伤等。存在多种共抑制信号，并且代表性地，CD80和CD86以及PD-L1(程序性死亡配体1)中涉及T淋巴细胞的细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4和程序性死亡-1(PD-1)以及其相应的抗原呈递细胞配体。CTLA-4作用于通过结合至配体CD80和CD86使幼稚或记忆T淋巴细胞失活。PD-1作用于通过PD-L1和PD-L2调节外周组织中的T淋巴细胞的功能。
人体的免疫功能是识别抗原，并且同时通过调节这些共刺激和共抑制信号来调节整体T淋巴细胞功能。这种调节机制称为“免疫检查点”。人体免疫功能是检测肿瘤细胞中存在的通过变异(例如突变)表达的肿瘤特异性新抗原，并由此消除肿瘤细胞或病毒感染源。
另一方面，为了避免所述免疫攻击，一些肿瘤细胞通过改变肿瘤微环境来抑制免疫功能，或通过T细胞免疫耐受或免疫编辑进行免疫逃逸。
一种免疫逃逸策略是通过改变免疫检查点功能来抑制肿瘤特异性T淋巴细胞的功能。也就是，通过激活肿瘤细胞中的所述抑制性免疫检查点来避免肿瘤特异性T淋巴细胞的攻击。在这方面，通过使用针对PD-1或其配体PD-L1的单克隆抗体抑制经抑制的肿瘤特异性T淋巴细胞的功能来改善该T淋巴细胞的活性和效应，使得可获得抗肿瘤效应。
在这些技术背景下，本发明人已努力研发特异性结合至PD-L1的抗体。因此，本发明人已研发出以高亲和性与PD-L1结合的抗PD-L1抗体，并且已发现，抗PD-L1抗体可通过抑制PD-1/PD-L1复合物的形成而用作所需免疫抗癌剂或针对传染病的治疗剂，由此完成本公开内容。
【公开内容】
【技术问题】
因此，本公开文本的一个目标是提供针对PD-L1或其抗原结合片段的新颖抗体。
本公开文本的另一个目标是提供编码该抗体或其抗原结合片段的核酸。
本公开文本的另一个目标是提供包括该核酸的载体、经该载体转化的细胞以及其制备方法。
本公开文本的另一个目标是提供含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症或传染病的组合物。
【技术方案】
根据本公开文本，上述和其他目标可通过提供结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段来完成，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括重链CDR1，该重链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:1至7中所述的序列组成；重链CDR2，该重链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:8至15中所述的序列组成；和重链CDR3，该重链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:16至25中所述的序列组成；以及轻链可变区，其包括轻链CDR1，该轻链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:88至102中所述的序列组成；轻链CDR2，该轻链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:103至119中所述的序列组成；和轻链CDR3，该轻链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:120至144中所述的序列组成。
根据本公开文本的另一方面，提供编码该抗体或抗原结合片段的核酸。
根据本公开文本的另一方面，提供包括该核酸的表达载体。
根据本公开文本的另一方面，提供经该表达载体转化的细胞。
根据本公开文本的另一方面，提供用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法，包括(a)培养细胞，并且(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。
根据本公开文本的另一方面，提供用于预防或治疗癌症或传染病的组合物，其含有该抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
【附图说明】
根据以下具体实施方式，结合附图，将更清楚地理解本公开文本的上述和其他目标、特征和其他优点，在所述附图中：
图1是显示PD-L1表达载体的示意图；
图2显示PD-L1蛋白纯化的结果；
图2A显示在10％SDS-PAGE凝胶上，在RE(还原性)和NR(非还原性)条件下，关于PD-L1-hFc的蛋白质鉴定的结果；
图2B显示在1ml/min的流速下，且使用PBS作为显影溶剂的G-3000SWXL SEC-HPLC的结果；
图2C显示在10％SDS-PAGE凝胶上，在RE(还原性)和NR(非还原性)条件下，关于PD-L1-mFc的蛋白质鉴定的结果；
图2D显示在1ml/min的流速下，且使用PBS作为显影溶剂的G-3000SWXL SEC-HPLC的结果；
图3显示与PD-L1抗原的结合能力增加的结果，取决于淘选次数；
图4显示用以测量仅对PD-L1-His具有高结合能力的单噬菌体的结合能力的ELISA结果；
图5显示用以鉴定所选PD-L1抗体的SDS-PAGE分析的结果；
图6显示PD-L1抗体的体外效能的评估结果；
图7显示PD-L1抗体的浓度依赖性体外效能评估的结果；
图8显示PD-L1抗体在PD-L1过表达细胞中的结合能力的测量结果；
图9显示PD-L1-hFc与PD-L1-16E12之间的动力学的测量结果；
图10显示优化单克隆的筛选结果；
图11显示关于根据本公开文本的PD-L1抗体的体外效能的评估结果；
图12显示根据本公开文本的PD-L1抗体的浓度依赖性体外效能评估的结果；
图13显示抗体在PD-L1过表达细胞中的结合能力的测量结果；
图14显示关于所选抗体防止PD-1/PD-L2复合物形成的抑制性活性，使用酶免疫吸附的鉴定结果；
图15显示PD-L1-hFc与PD-L1-16E12-4F5之间的动力学的测量结果；
图16显示PD-L1突变型蛋白与单克隆抗体的结合的测量结果；
图17显示关于在异质性MLR(混合淋巴细胞反应)期间PD-L1单克隆抗体活性增加的鉴定结果。
图18显示所选PD-L1单克隆抗体在同基因癌症动物模型中的效能的评估结果；并且
图19显示关于根据本公开文本的抗PD-L1抗体与PD-L2之间的结合的鉴定结果。
【具体实施方式】
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所属领域技术人员所了解的相同的含义。通常，本文中所用的术语为本领域所熟知并且以普通方式使用。
在一个方面中，本公开文本涉及结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括重链CDR1，该重链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:1至7中所述的序列组成；重链CDR2，该重链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQID NO:8至15中所述的序列组成；和重链CDR3，该重链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:16至25中所述的序列组成；以及轻链可变区，其包括轻链CDR1，该轻链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:88至102中所述的序列组成；轻链CDR2，该轻链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:103至119中所述的序列组成；和轻链CDR3，该轻链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:120至144中所述的序列组成。
如本文中所用，术语“PD-L1”是主要在活化T细胞和B细胞中表达的免疫抑制性受体“程序性死亡受体1(PD-1)”的配体，其可负向调节抗原受体信号传导。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)可组成型表达或可衍生至多种细胞类型中，包括非造血细胞组织和多个肿瘤类型。PD-L1在B细胞、T细胞、骨髓细胞和树突细胞(DC)中表达，并且还在非淋巴器官上表达，例如外周细胞、假血管内皮细胞和心脏、肺等。与之相比，PD-L2只在巨噬细胞和树突细胞中发现。PD-1配体的表达模式表明PD-1在维持外周耐受性中的作用，并且可有助于对外周中自体反应性T细胞和B细胞反应的调节。两种配体都是I型跨膜受体，在细胞外结构域中含有IgV样结构域和IgC样结构域。两种配体都包括具有未知信号传导基序的短胞质区。
多个研究已显示，PD-1与其配体之间的相互作用在体外和体内抑制淋巴细胞增殖。已知中断PD-1/PD-L1相互作用改善T细胞的增殖和细胞因子的产生，并且阻断细胞周期的进程。阻断PD-1/PD-L1相互作用可导致改善肿瘤特异性T细胞免疫性，由此有助于用免疫系统清除肿瘤细胞。另外，在慢性HIV感染中，HIV特异性CD8+T细胞功能受损，展现降低的产生细胞因子和效应分子的能力以及降低的增殖能力，并且PD-1在HIV特异性CD8+T细胞中高度表达，此可通过阻断PD-1/PD-L1相互作用，通过增强增殖HIV特异性T细胞的能力和响应HIV肽刺激物产生细胞因子的能力来改善T细胞活性或抗病毒免疫反应。
如本文中所用，术语“抗体”是指特异性结合至PD-L1的抗PD-L1抗体。本公开文本的范围不仅包括特异性结合至PD-L1的完整抗体，还包括该抗体分子的抗原结合片段。
完整抗体是指具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，其中每一轻链通过二硫键与相应重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(ε)型，并且分为以下亚类：伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)型。
该抗体或抗体片段的的抗原结合片段是指至少具有抗原结合能力并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv的片段。在这些抗体片段中，Fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的结构，其各自具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，其进一步包括铰链区，铰链区包括重链CH1结构域C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2是由Fab'铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生Fv的重组技术公开于PCT国际公开案中，例如WO88/01649、WO88/06630、WO88/07085、WO88/07086和WO88/09344。双链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，并且单链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通常通过共价键经由之间的肽连接体连接，或在C末端直接连接，形成像双链Fv一样的二聚体样结构。所述抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，Fab可通过用木瓜蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得，并且F(ab')片段可通过用胃蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得)，并且可通过遗传重组技术来制备。
在一个实施方案中，本公开文本的抗体是Fv形式(例如，scFv)、Fab或完整抗体形式。另外，重链恒定区可选自由伽马(γ)、缪(u)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)或伊普西隆(c)组成的同种型。例如，恒定区可为γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。轻链恒定区可为κ或λ。
如本文中所用，术语“重链”涵盖全长重链和其片段二者，该全长重链包括含有具有足够可变区序列以赋予针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。如本文中所用，术语“轻链”涵盖全长轻链和其片段二者，该全长轻链包括含有具有足够可变区序列以赋予针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。
本公开文本的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、短链Fv(scFV)、短链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fv(sdFV)、抗个体基因型(抗Id)抗体或所述抗体的表位结合片段，或诸如此类。
单克隆抗体是指相同抗体，不包括可能的天然存在的突变，其中从基本上同质的抗体群体获得的抗体(也就是，构成该群体的每一抗体)可以少量存在。单克隆抗体具有高度特异性并且是针对单一抗原位点所诱导。与通常含有针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
术语“表位”意指抗体可特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性表面分子基团构成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。空间和非空间表位的彼此不同之处在于，与空间表位的结合在变性溶剂存在下损失，但与非空间表位的结合不损失。
“人源化”形式的非人类(例如，鼠类)抗体是嵌合抗体，含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基经来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区(供体抗体)的残基替代，具有所需特异性、亲和性和能力。
术语“人类抗体”意指源自人类免疫球蛋白的分子，其中包括互补决定区和结构区的构成该抗体的所有氨基酸序列是由人类免疫球蛋白组成。
一些重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时其余链包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，该“嵌合”抗体与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及所述抗体的展现所需生物活性的片段中的相应序列相同或同源。
如本文中所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链区域，包括互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。
术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。
在本公开文本中，结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括选自下组的重链CDR1，该组由SEQ ID NO:1至7组成；选自下组的重链CDR2，该组由SEQ IDNO:8至15组成；和选自下组的重链CDR3，该组由SEQ ID NO:16至25组成；以及轻链可变区，其包括选自下组的轻链CDR1，该组由SEQ ID NO:88至102组成；选自下组的轻链CDR2，该组由SEQ ID NO:103至119组成；和选自下组的轻链CDR3，该组由SEQ ID NO:120至144组成。
具体而言，根据本公开文本的结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:8的重链CDR2和SEQ IDNO:16的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ IDNO:17的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ IDNO:18的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:3的重链CDR1、SEQ ID NO:10的重链CDR2和SEQ IDNO:19的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:4的重链CDR1、SEQ ID NO:11的重链CDR2和SEQ IDNO:20的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:5的重链CDR1、SEQ ID NO:12的重链CDR2和SEQ IDNO:21的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:6的重链CDR1、SEQ ID NO:13的重链CDR2和SEQ IDNO:22的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ IDNO:23的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:14的重链CDR2和SEQ IDNO:24的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:15的重链CDR2和SEQ IDNO:25的重链CDR3；或
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ IDNO:17的重链CDR3。
另外，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段包括：
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:88的轻链CDR1、SEQ ID NO:103的轻链CDR2和SEQID NO:120的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:121的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:90的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:122的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:91的轻链CDR1、SEQ ID NO:106的轻链CDR2和SEQID NO:123的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:107的轻链CDR2和SEQID NO:124的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:92的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:122的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:93的轻链CDR1、SEQ ID NO:109的轻链CDR2和SEQID NO:125的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:94的轻链CDR1、SEQ ID NO:110的轻链CDR2和SEQID NO:126的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:95的轻链CDR1、SEQ ID NO:111的轻链CDR2和SEQID NO:127的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96的轻链CDR1、SEQ ID NO:112的轻链CDR2和SEQID NO:128的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:129的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:130的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:113的轻链CDR2和SEQID NO:131的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:97的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:132的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:133的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:97的轻链CDR1、SEQ ID NO:114的轻链CDR2和SEQID NO:134的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:92的轻链CDR1、SEQ ID NO:115的轻链CDR2和SEQID NO:135的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:98的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:130的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:116的轻链CDR2和SEQID NO:121的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:136的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:99的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:137的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:117的轻链CDR2和SEQID NO:138的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:118的轻链CDR2和SEQID NO:133的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:119的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:100的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:140的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:141的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:142的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:143的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:101的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:141的轻链CDR3；或
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:102的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:144的轻链CDR3。
在本公开文本的一个实施方案中，根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段可包括以下重链可变区和轻链可变区：
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:8的重链CDR2和SEQ ID NO:16的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:88的轻链CDR1、SEQ ID NO:103的轻链CDR2和SEQID NO:120的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:121的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:18的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:90的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:122的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:3的重链CDR1、SEQ ID NO:10的重链CDR2和SEQ ID NO:19的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:91的轻链CDR1、SEQ ID NO:106的轻链CDR2和SEQID NO:123的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:4的重链CDR1、SEQ ID NO:11的重链CDR2和SEQ ID NO:20的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:107的轻链CDR2和SEQID NO:124的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:5的重链CDR1、SEQ ID NO:12的重链CDR2和SEQ ID NO:21的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:92的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:122的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:6的重链CDR1、SEQ ID NO:13的重链CDR2和SEQ ID NO:22的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:93的轻链CDR1、SEQ ID NO:109的轻链CDR2和SEQID NO:125的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:23的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:94的轻链CDR1、SEQ ID NO:110的轻链CDR2和SEQID NO:126的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:14的重链CDR2和SEQ ID NO:24的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:95的轻链CDR1、SEQ ID NO:111的轻链CDR2和SEQID NO:127的轻链CDR3的轻链可变区；或
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:15的重链CDR2和SEQ ID NO:25的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:96的轻链CDR1、SEQ ID NO:112的轻链CDR2和SEQID NO:128的轻链CDR3的轻链可变区。
根据本公开文本的一个实施方案，通过优化程序对抗体进行进一步筛选，并且本发明的抗体或其抗原结合片段可包括以下重链可变区和轻链可变区：
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:129的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:130的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:113的轻链CDR2和SEQID NO:131的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:97的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:132的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:133的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:97的轻链CDR1、SEQ ID NO:114的轻链CDR2和SEQID NO:134的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:92的轻链CDR1、SEQ ID NO:115的轻链CDR2和SEQID NO:135的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:98的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:130的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:116的轻链CDR2和SEQID NO:121的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:136的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:99的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:137的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:117的轻链CDR2和SEQID NO:138的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:118的轻链CDR2和SEQID NO:133的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:119的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:100的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:140的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:141的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:142的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:143的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:101的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:141的轻链CDR3的轻链可变区；或
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:102的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:144的轻链CDR3的轻链可变区。
具体而言，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可包括以下重链可变区和轻链可变区：
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:121的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:130的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:104的轻链CDR2和SEQID NO:133的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:108的轻链CDR2和SEQID NO:136的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:119的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:139的轻链CDR3的轻链可变区；或
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:9的重链CDR2和SEQ ID NO:17的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:89的轻链CDR1、SEQ ID NO:105的轻链CDR2和SEQID NO:143的轻链CDR3的轻链可变区。
“框架区”(FR)是指除了CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有4个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。
根据本公开文本的一个实施方案，该抗体或其抗原结合片段可包括：
重链可变区FR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:80至34组成；
重链可变区FR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:96至41组成；
重链可变区FR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:114至49组成；或
重链可变区FR4，其选自下组，该组由SEQ ID NO:135至54组成。
另外，该抗体或其抗原结合片段可包括：
轻链可变区FR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:270至163组成；
轻链可变区FR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:295至184组成；
轻链可变区FR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:316至210组成；或
轻链可变区FR4，其选自下组，该组由SEQ ID NO:356至216组成。
“Fv”片段是含有完整抗体识别和结合位点的抗体片段。所述区域包括二聚体，例如scFv，所述二聚体由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，所述重链可变结构域与所述轻链可变结构域相互非常紧密地共价连接。
“Fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段通常包括一对Fab片段，所述Fab片段通过位于其之间的在其羧基端附近的铰链半胱氨酸共价连接。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。Fv多肽可进一步包括VH结构域与VL结构域之间的多肽连接体，以使scFv可形成用于抗原结合的所需结构。
PD-L1抗体为单价或二价，且包括短链或双链。功能上，PD-L1抗体的结合亲和性在10-5M至10-12M范围内。例如，PD-L1抗体的结合亲和性为10-6M至10-12M、10-7M至10-12M、10-8M至10-12M、10-9M至10-12M、10-5M至10-11M、10-6M至10-11M、10-7M至10-11M、10-8M至10-11M、10-9M至10-11M、10-10M至10-11M、10-5M至10-10M、10-6M至10-10M、10-7M至10-10M、10-8M至10-10M、10-9M至10- 10M、10-5M至10-9M、10-6M至10-9M、10-7M至10-9M、10-8M至10-9M、10-5M至10-8M、10-6M至10-8M、10- 7M至10-8M、10-5M至10-7M、10-6M至10-7M或10-5M至10-6M。
结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括重链可变区，该重链可变区包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:57至87中所述的序列组成。结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括重链可变区，该重链可变区选自下组，该组由如SEQ ID NO:57至87中所述的序列组成。在本公开文本的一个实施方案中，结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括SEQ ID NO:58、68、71、76、80、83或85的重链可变区。
另外，结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括轻链可变区，该轻链可变区包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:217至247中所述的序列组成。结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括轻链可变区，该轻链可变区选自下组，该组由如SEQ ID NO:217至247中所述的序列组成。在本公开文本的一个实施方案中，结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括SEQ ID NO:218、228、231、236、240、243或245的轻链可变区。
在根据本公开文本的具体实施方案中，结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可包括：？？？
SEQ ID NO:58的重链可变区和SEQ ID NO:218的轻链可变区；
SEQ ID NO:68的重链可变区和SEQ ID NO:228的轻链可变区；
SEQ ID NO:71的重链可变区和SEQ ID NO:231的轻链可变区；
SEQ ID NO:76的重链可变区和SEQ ID NO:236的轻链可变区；
SEQ ID NO:80的重链可变区和SEQ ID NO:240的轻链可变区；
SEQ ID NO:83的重链可变区和SEQ ID NO:243的轻链可变区；或
SEQ ID NO:85的重链可变区和SEQ ID NO:245的轻链可变区。
“噬菌体展示”是用于展示突变体多肽的技术，该突变体多肽作为与例如噬菌体(例如纤维状噬菌体)颗粒表面上的外壳蛋白的至少一部分的融合蛋白。噬菌体展示的有用性在于快速且有效地对大型随机化蛋白质突变体文库中以高亲和性结合至靶抗原的序列进行分类。已使用在噬菌体上展示肽和蛋白质文库来筛选数百万个多肽，以鉴定具有特异性结合性质的多肽。
噬菌体展示技术已提供用于生成和筛选结合至特异性配体(例如，抗原)的新颖蛋白质的有效工具。使用噬菌体展示技术，可生成大型蛋白质突变体文库，并且可对以高亲和性与靶抗原结合的序列进行快速分类。使编码突变型多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如，基因III蛋白或基因VIII蛋白)的核酸的序列融合。已研发出单相噬菌体展示系统，其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白的一部分的核酸序列融合。在单相展示系统中，融合基因以低水平表达，还表达野生型基因III蛋白，并由此维持颗粒感染性。
对于抗体噬菌体展示文库的研发，重要的是证明肽在纤维状噬菌体表面上的表达以及功能性抗体片段在大肠杆菌(E.coli)的外周细胞质中的表达。通过多种方法制备抗体结合多肽或抗原结合多肽的文库，例如通过插入随机DNA序列或克隆相关基因序列来修饰单一基因的方法。可针对具有所需特征的抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的表达对文库加以筛选。
对于产生具有所需特征的抗体，噬菌体展示技术相对于常规杂交瘤和重组方法具有若干优点。这种技术可在不使用动物的情况下，在短时间内生成具有多个序列的大型抗体文库。杂交瘤的产生和人源化抗体的产生可能需要数月的产生时间。另外，由于不需要免疫力，噬菌体抗体文库可生成针对具有毒性或具有低抗原性的抗原抗体。噬菌体抗体文库还可用于产生和鉴定新颖治疗性抗体。
可使用从未经免疫的人类、种系序列或已使用噬菌体展示文库进行免疫的幼稚B细胞Ig库生成人类抗体的技术。可使用各种淋巴组织来制备天然或非免疫原性抗原结合文库。
用于从噬菌体展示文库鉴定和分离高亲和性抗体的技术对于分离新的治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和性抗体可取决于文库大小、细菌细胞中的生产效率和文库的多样性。文库的大小会因抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的无效折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。在抗体结合结构域或抗原结合结构域没有正确折叠时，可抑制在细菌细胞中的表达。可通过使可变/恒定界面表面上的残基或所选CDR残基交替突变来改善表达。在细菌细胞中生成抗体噬菌体文库时，框架区序列是提供适当折叠的元件。
在高亲和性抗体的分离中，重要的是生成抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的多个文库。已发现CDR3区经常参与抗原结合。由于重链上的CDR3区根据大小、序列和结构维度形态显著变化，可使用其来制备多个文库。
还可通过在每一位置使用所有20种氨基酸随机化可变重链和轻链的CDR区来产生多样性。使用所有20种氨基酸产生多样性增加的抗体序列，并增加鉴定新抗体的机会。
根据本公开文本的抗体或抗体片段可包括本文中所述的本公开文本的抗PD-L1抗体以及其生物等效物的序列，只要该抗体或抗体片段可特异性识别PD-L1即可。例如，可对该抗体的氨基酸序列进行额外变异，以进一步改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学性质。所述变异包括例如抗体氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。所述氨基酸变异是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(同一性)来进行，例如疏水性、亲水性、电荷或大小。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析证明，所有精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似形状。因此，基于这些考虑，将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸视为生物学功能等效物。
在考虑具有生物学等效活性的变异时，根据本公开文本的抗体或其编码核酸也解释为包括显示与相应SEQ ID NO中所述序列具有实质同一性的序列。术语“显示实质同一性的序列”意指，在比对本公开文本的序列以尽可能多地对应于任何其他序列，并使用本领域中常用算法分析所比对序列时，显示至少90％、最优选地至少95％、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同一性的序列。用于序列对比的比对方法为本领域所熟知。NCBI基础局部比对搜索工具(BLAST)可从NBCI获得，并且可与互联网上的序列分析程序诸如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx联合使用。BLSAT可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。使用此程序对比序列同一性的方法可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html找到。
基于此，根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段可具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性(同源性)。所述同一性可通过本领域已知方法对序列进行对比和/或比对来测定。例如，根据本公开文本的核酸或蛋白质的百分比序列同一性可使用序列对比算法(即，BLAST或BLAST 2.0)、人工比对或目测检查来测定。
在另一方面中，本公开文本涉及编码抗体或其抗原结合片段的核酸。
该抗体或其抗原结合片段可通过分离编码根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段的核酸以重组方式产生。分离核酸并插入可复制载体中以实施进一步克隆(DNA扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面中，本公开文本涉及含有核酸的载体。
术语“核酸”旨在涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA两种分子，以及核苷酸，核苷酸是核酸的基础构成单元，包括天然来源的核苷酸以及其中糖或碱基部分经修饰的类似物。编码本公开文本的重链和轻链可变区的核酸的序列可变。所述变异包括核苷酸的添加、缺失或者非保守取代或保守取代。
编码该抗体的DNA可使用常规程序(例如，使用特异性结合至编码抗体重链和轻链的DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。可获得多种载体。载体组分通常包括但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
如本文中所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括：质粒载体；粘粒载体；和病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码该抗体的核酸与启动子可操作连接。
术语“可操作连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，并且是通过核酸序列的转录和/或翻译来调节的。
在使用原核细胞作为宿主时，载体通常包括能实施转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。另外，例如，在使用真核细胞作为宿主时，载体包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类血红蛋白启动子和人类肌酸启动子)，或源自动物病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、埃伯斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子和劳氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)启动子)，且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
任选地，该载体可与另一序列融合，以有利于由其表达的抗体的纯化。待融合序列包括例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6x His(六组氨酸；Quiagen，美国)等。
载体包括本领域中一般用作可选标记物的抗生素抗性基因，并且其例子包括以下各项的抗性基因：氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。
在另一方面中，本公开文本涉及经上文所提到的载体转化的细胞。用于产生本公开文本的抗体的细胞可为原核生物、酵母或高等真核细胞，但不限于此。
可使用芽孢杆菌属(Bacillus，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和土利真杆菌(Bacillus tuligensis))、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas，例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、以及原核宿主细胞例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus，例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))的株系。
对动物细胞的兴趣最大并且有用宿主细胞系的例子包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080。
在另一方面中，本公开文本涉及用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：(a)培养细胞；并且(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。
可以在各种培养基中培养细胞。可无限制地使用任何市售培养基作为培养基。可以适当浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必需补充物。诸如温度和pH等培养条件已用于所选表达用宿主细胞，该条件对于本领域技术人员将显而易见。
对该抗体或其抗原结合片段的回收可通过例如以下方式来实施：离心或超滤以移除杂质，且例如使用亲和层析纯化所得产物。可使用其他纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱等。
在另一方面中，本公开文本涉及含有该抗体作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物。
本公开文本提供例如用于预防或治疗癌症或传染病的组合物，其含有：(a)药学有效量的根据本发明的针对PD-L1的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载剂。本公开文本还涉及用于预防或治疗癌症或传染病的方法，其包括以患者所需的有效量给予根据本公开文本的针对PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
由于组合物使用上述根据本公开文本的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段作为活性成分，故省略关于其的重复描述。
PD-L1与PD-1的结合负向调节对自体免疫性和免疫病理学的耐受和预防重要的T细胞抗原特异性反应。然而，可由慢性抗原刺激诱导的过多PD-L1/PD-1相互作用可引起对T细胞抗原特异性反应的抑制和T细胞的损失，这是T细胞耗尽的特征。T细胞耗尽是T细胞功能障碍的状况，其可在慢性感染和癌症中发生。T细胞耗尽被定义为较差效应物功能、连续表达抑制性受体或与功能性效应物或记忆T细胞不同的转录状态。耗尽干扰感染和肿瘤的进程。
如以下例子中所证明，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和性与PD-L1结合以抑制PD-1与PD-L1复合物的形成，由此可用于治疗逃避抗肿瘤T细胞活性的诱导T细胞耗尽的癌症。
在一些情况下，除了上述抗体以外的抗癌治疗剂可组合使用，以有效靶向过表达PD-L1的肿瘤细胞，增强抗肿瘤T细胞活性，且由此改善靶向肿瘤细胞的免疫应答。上述抗体可与以下各项组合使用：其他抗肿瘤剂或免疫原型剂[例如，弱化癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)]、抗原呈递细胞(例如经肿瘤源抗原或核酸脉冲处理的树突细胞)、经免疫刺激性细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)转染的细胞和编码免疫刺激性细胞因子(包括但不限于GM-CSF)的基因；标准癌症疗法(例如，化学疗法、放射性疗法或手术)或其他抗体(包括但不限于VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其他生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS)。
抗PD-L1抗体可包括细胞凋亡(细胞死亡)。细胞凋亡是由直接或间接机制诱导。例如，抗PD-L1抗体与PD-Ll的结合可引起补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些情况下，抗PD-L1抗体结合至PD-L1并引起二级细胞类型的动员以杀灭表达PD-L1的靶细胞。抗PD-L1抗体通过动员二级细胞类型来介导细胞凋亡的代表性机制包括但不限于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCP)。表达PD-L1的靶细胞类型包括肿瘤和T细胞，例如活化T细胞。
另外，根据本公开文本的抗体或其抗体片段可用于预防或治疗感染和传染病。
如本文中所用，术语“预防”意指通过给予组合物来抑制癌症或传染病或延迟其进展的任何作用，并且如本文中所用，术语“治疗”意指抑制肿瘤发展，或减轻或消除癌症，或抑制、减轻或消除传染病。
癌症，组合物所应用的疾病，通常包括对免疫疗法有反应的癌症，以及迄今尚未涉及免疫疗法的癌症。需要治疗的优选癌症的非限制性例子包括但不限于黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他癌瘤。另外，本公开文本包括使用本发明的抗体可抑制的难治性或复发性癌症生长。
该抗体或抗体片段可单独使用或与刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答的疫苗组合使用。该抗体或其抗原结合片段可用于刺激针对人类感染性病毒的免疫应答，该病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、人巨细胞病毒、人乳头瘤和疱疹病毒。该抗体或其抗原结合片段可用于刺激针对细菌或真菌寄生虫和其他病原体的感染的免疫应答。
本公开文本的组合物中所含的药学上可接受的载剂包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆剂、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，其常规用于药物制备。除了上述组分以外，本公开文本的组合物可进一步含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
本公开文本的药物组合物可经口或非经肠给予。在非经肠给予的情况下，药物组合物可通过以下方式给予：静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予、经直肠给予等。
在经口给予时，蛋白质或肽可被消化。因此，口服组合物应经配制以包被活性剂或防止蛋白质或肽在胃中被消化。另外，药物组合物可通过使得能将活性剂转移至靶细胞的任何装置来给予。
根据本公开文本的组合物的适当剂量可随多种因素而变，例如配制方法、给予方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况和食物、给予时间、给予途径、排泄率和反应性。熟练的医师可容易地确定并开具对所需治疗或预防有效的剂量。例如，本公开文本的药物组合物的日剂量为0.0001至100mg/kg。如本文中所用，术语“药学有效量”意指足以预防或治疗癌症的量。
可通过根据本公开文本所属技术领域的普通技术人员易于实施的方法使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂来配制，将本公开文本的药物组合物制备为单位剂型或纳入多剂量小瓶中。配制品可呈油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液形式，或呈赋形剂、粉剂、栓剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊形式，并且可进一步含有分散剂或稳定剂。
本公开文本的组合物可作为个别治疗剂或与其他治疗剂组合给予，并且可与常规治疗剂依序或同时给予。
在另一方面中，本公开文本涉及含有根据本公开文本的针对PD-L1的抗体或其抗原结合片段的用于诊断癌症的组合物。本公开文本还涉及通过用根据本公开文本的针对PD-L1的抗体或其抗原结合片段处理来诊断癌症的方法。
可通过用根据本公开文本的针对PD-L1的抗体测量样品中的PD-L1表达水平来诊断癌症。表达水平可通过常规免疫分析方法来测量，该常规免疫分析方法包括但不限于放射免疫分析、放射免疫沉淀、免疫沉淀、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附分析(ELISA)、捕获ELISA、抑制或竞争分析、夹心分析、流式细胞术、免疫荧光染色和使用针对PD-L1的抗体的免疫亲和性纯化。
可通过分析免疫分析过程的最终信号强度来诊断癌症。也就是说，在根据本公开文本的标记物的蛋白质于生物学样品中高度表达，且因此生物学样品的信号强于正常生物学样品(例如，正常胃组织、血液、血浆或血清)的信号时，诊断为癌症。
在另一方面中，本公开文本涉及含有用于诊断癌症的组合物的用于诊断癌症的试剂盒。根据本公开文本的试剂盒包括根据本公开文本的针对PD-L1的抗体，并且可通过分析样品与抗体之间反应时生成的信号来诊断癌症。信号可包括但不限于与抗体偶合的酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或细胞色素P450。在这种情况下，在使用碱性磷酸酶作为酶时，作为该酶的底物，使用显色反应底物，例如溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、萘酚-AS-B1-磷酸盐和ECF(增强化学荧光)；并且在使用辣根过氧化物酶时，使用诸如以下各项的底物：氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-荧光素、光泽精(硝酸双-N-甲基吖啶鎓)、苄氧基试卤灵(resorufin benzyl ether)、鲁米诺(luminol)、Amplex Red试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪)、HYR(对苯二胺-HCl和儿茶酚)、TMB(四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-吖嗪-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸])、邻苯二胺(OPD)和萘酚/焦宁(pyronin)、葡萄糖氧化酶、t-NBT(氮蓝四唑)或m-PMS(吩嗪硫酸甲酯)，但本公开文本不限于此。
另外，根据本公开文本的试剂盒还可包括用于生成可检测信号的标记，并且该标记可包括化学(例如，生物素)、酶(碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和细胞色素P450)、放射性物质(例如C14、I125、P32和S35)、荧光物质(例如荧光素)、发光物质、化学发光物质和FRET(荧光共振能量转移)，但不限于此。
用于癌症诊断的酶活性的测量或信号的测量可通过本领域中已知的多种方法来实施。因此，可对PD-L1表达进行定性或定量分析。
实施例
在下文中，将参照实施例更详细地描述本公开文本。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于说明本公开文本，并且不应被视为限制本公开文本的范围。
实施例1：PD-L1抗原的表达和纯化
1.PD-1蛋白表达载体的产生
对于PD-L1的克隆，通过聚合酶链式反应(PCR)，使用在5'和3'处含有限制性酶SfiI位点的用于PD-L1的引物(表1)实施扩增，以使用Jurkat细胞cDNA文库(Stratagene，美国)仅获得细胞外结构域。经扩增PCR产物是通过使用N293F载体将人类Fc(SEQ ID NO:248)和小鼠Fc(SEQ ID NO:249)融合至羧基末端(图1)来制备。
[表1]用于PD-L1表达载体的引物
名称 5'->3'序列 SEQ ID NO
PD-L1-F ccaggatggttcttagactcccc 250
PD-L1-R caccagggtttggaactggc 251
2.PD-L1抗原的表达和纯化
为了在动物细胞中表达抗原，用质粒DNA对HEK-293F细胞进行转染。用于转染的多聚复合物(polyplex)反应溶液是通过以下方式制备：将25μg质粒DNA与3ml的Freestyle293表达培养基混合，并将2mg/ml的PET(聚乙烯亚胺，polyplusA-transfection，美国)与所得混合物再次进一步混合。使多聚复合物反应溶液在室温下反应15分钟，并且然后在40ml培养基(1×106个细胞/ml)中，在37℃和8％CO2下以120rpm培养24小时。在转染24小时后，将Soytone(BD，美国)作为补充物添加至终浓度为10g/L。使用瞬时表达系统，使用HEK-293F经7天产生抗体。进行亲和层析以从培养基获得抗原。通过以5,000rpm离心10分钟以移除细胞来获得上清液，并在第7天从培养基回收细胞碎片。使上清液与用DPBS洗涤的重组蛋白A琼脂糖树脂在4℃下反应16小时。
在使用重组蛋白A琼脂糖树脂时，用0.1M甘氨酸洗脱蛋白质，并用500μl的1MTris-HCl中和，以进行初次纯化。使用Superdex 200(1.5cm*100cm)凝胶过滤层析对经初次纯化的蛋白质进行二次纯化。
通过SDS-PAGE凝胶和尺寸排阻色谱[TSK-GEL G-3000SWXL尺寸排阻色谱(SEC)(Tosoh)]鉴定经纯化蛋白质的纯度。
因此，确认经纯化PD-L1蛋白具有95％或更高的纯度，如图2A至2D中所示。
实施例2：PD-L1人类抗体的筛选
1.抗原制备
将实施例1中制备的PD-L1-hFc和PD-L1-mFc以及购自Sino Biological Inc.的PD-L1-his(目录号，10084-H08H)作为蛋白质抗原以50ug剂量涂布于免疫吸附管上，并且然后加以封阻。
2.生物淘选
通过用细菌感染人类scFv文库(具有2.7x1010各种各样的)并且然后在30℃下培养16小时来获得人类抗体文库噬菌体。在培养后，对培养溶液进行离心，用PEG浓缩上清液，并且然后溶解于PBS缓冲液中，以制备人类抗体文库。将人类抗体文库噬菌体装填至免疫管中，随后在室温下反应2小时。在用1X PBS/T和1X PBS洗涤后，仅洗脱与抗原特异性结合的scFv-噬菌体。用大肠杆菌再次感染经洗脱噬菌体并扩增(淘选过程)，以获得阳性噬菌体池。使用在第一轮淘选中扩增的噬菌体以与上文相同的方式实施第二轮和第三轮淘选过程，但只有PBST洗涤步骤的次数增加。因此，如表2中所示，可见在第三轮淘选期间，与输入噬菌体相比，与抗原结合(输出)的噬菌体数略有增加。
[表2]取决于淘选次数的抗体效价的对比
淘选(次)数 输入噬菌体数 输出噬菌体数
1 3X1013 6X107
2 2X1013 2X106
3 2.3X1013 3X108
3.多聚噬菌体ELISA
将在第一轮至第三轮淘选过程后冷冻的细胞储液添加至含有5ml的2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并且然后在37℃下培养2至3小时(OD600＝0.5至0.7)。感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。将所培养细胞离心(4,500rpm，15min，4℃)，并将上清液转移至新管(第一轮至第三轮淘选的多聚scFv-噬菌体)。将两种抗原各自以100ng/孔的密度用涂布缓冲液涂布于96孔免疫板(NUNC 439454)上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每个孔。
用0.2ml的PBS/T洗涤每个孔，并将100μl第一轮至第三轮淘选的多聚scFv-噬菌体添加至每孔，随后在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP(Amersham 27-9421-01)以1:2000稀释，并在室温下反应1小时。在用PBS/T洗涤后，将OPD片剂(Sigma.8787-TAB)溶解于PC缓冲液中，并以100μl/孔的浓度添加所得溶液，以诱导显色10分钟。然后，在490nm下用分光光度计(Molecular Device)测量吸光度。
结果显示于图3中。如从图3可见，ELISA显示，对两种PD-L1抗原的结合能力在第三多聚scFv-噬菌体中有所加强。
4.阳性噬菌体的筛选
将从具有高结合能力的多克隆噬菌体抗体组(第三轮淘选)获得的菌落在1ml 96深孔板(Bioneer 90030)中在37℃下培养16小时。将由此生长的100至200μl细胞添加至含有2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并添加至含有1ml 2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中，并且然后在96深孔板中在37℃下培养2至3小时至OD600为0.5至0.7。以1:20的MOI感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2、1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。
将抗原PD-L1以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每孔。将用0.2ml PBS/T洗涤并培养16小时的每种单克隆scFv-噬菌体(100scFv-噬菌体)以100μl剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2mlPBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP稀释至1/2000，并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，如图4中所示，获得总计数十种用于PD-L1的单噬菌体克隆作为针对每一抗原具有高结合能力的单噬菌体克隆。
5.阳性噬菌体抗体的碱基序列分析
使用DNA纯化试剂盒(Qiagen，德国)使所选单一克隆经历DNA-prep以获得DNA，并请求对DNA的序列分析(Solgent)。基于序列分析结果鉴定所选抗体的VH和VL的CDR区，并使用NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/上的Ig BLAST程序研究这些抗体与种系抗体组之间的相似性(同一性)。因此，获得10种对PD-L1具有特异性的噬菌体抗体并归纳于下表3中。
Figure GDA0002090987590000271
包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的抗体，以及包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的重链可变区和轻链可变区显示于下表4和5中。[表4]PD-L1克隆的重链可变区
Figure GDA0002090987590000281
/>
Figure GDA0002090987590000291
[表5]PD-L1克隆的轻链可变区
Figure GDA0002090987590000292
/>
Figure GDA0002090987590000301
/>
Figure GDA0002090987590000311
实施例3：PD-L1人类抗体的产生
1.scFv形式至IgG形式的转化
对重链和轻链进行PCR(iCycler iQ，BIO-RAD)以将所选10种针对PD-L1的单克隆噬菌体抗体从噬菌体转化为IgG完整载体。因此，获得重链和轻链，并用限制性酶切割(消化)每种克隆的载体以及重链和轻链。用DNA-凝胶萃取试剂盒(Qiagen)从载体和重链中的每一者洗脱DNA。通过以下方式进行连接：混合1μl(10ng)载体、15μl(100-200ng)重链、2μl的10x缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水，使混合物在室温下静置1至2小时，将所得混合物注射至经转化细胞(感受态细胞，XL1-蓝)中，将细胞置于冰上5分钟并使细胞在42℃下经历90秒热休克。
在热休克后，将1ml培养基添加至细胞，并且然后使细胞在37℃下生长1小时，铺展于LB Amp板上，并在37℃下孵育16小时。将由此获得的菌落用5ml LB Amp培养基接种，在37℃下培养16小时，并使用DNA-prep试剂盒(Nuclogen)使其经历DNA-prep。请求所获得DNA的序列分析(Solgent)。
因此，确认11种针对PD-L1的克隆的重链和轻链序列转化为完整IgG，与噬菌体抗体的序列相对应。为了转染至HEK 293F细胞中，使转化为完整IgG的各个克隆的重链和轻链在100ml的LB Amp培养基中生长，并使用Midi-prep试剂盒(QIAgen)获得DNA。
2.人类抗体产生
将经克隆pNATVH和pNATVL载体以6:4的比率共转染至HEK293F细胞中，并在第7天收集上清液，通过离心和0.22μm顶部滤纸去除细胞和碎片，并收集上清液且对上清液进行蛋白A亲和层析以纯化IgG抗体。在纯化后，经甘氨酸缓冲液分离抗体，并更换缓冲液，使得最终再悬浮缓冲液为PBS。通过BCA和nano drop对经纯化抗体进行定量，并将15种抗体各自以5ug剂量在还原性和非还原性条件下加载，并通过SDS-PAGE分析以测定经纯化蛋白质的纯度和迁移率(图5)。
因此，如图5中所示，在非还原性条件下检测所有10种抗体的分子量为150kDa或更高。
实施例4：PD-L1单克隆抗体的特征
1.抗体活性的评估
对所选抗体的活性的测试是使用PD1/PD-L1阻断生物分析试剂盒(promega，J1250)来实施。将高度表达PD-L1的CHO细胞系铺展于96孔板上，培养16小时或更久，用以恒定浓度连续稀释的每种抗体处理，并且然后与高度表达人类PD-1的Jurkat细胞系一起培养6小时。用分光光度计(SpectraMax M5分光光度计，Molecular Devices，美国)测定抗体抑制的恢复程度，其是根据荧光素酶降解底物产生的发光强度来测定的。基于该值发现10种PD-L1抗体的活性通过形成PD-1/PD-L1复合物而恢复减小的信号，且16E12展现与对照抗体相似的活性(图6)。
为了以浓度依赖性方式测量PD-L1抗体16E12的活性，再次进行连续稀释和PD-1/PD-L1阻断生物分析，以按浓度梯度依赖性方式恢复减小的信号。恢复程度可表示为EC50(在50％恢复信号水平下mAb的有效浓度)，使用Graphpad Prism6进行分析，并且EC50的体外效能抑制恢复能力显示于图7中。
2.PD-L1抗体与过表达细胞的亲和性
关于高度表达PD-L1的转化细胞池，用含有人类PD-L1的质粒pcDNA3.1转化HEK293E，并在含有150ug/ml Zeocin(编号R25001，Thermo Fisher)的选择培养基中进行筛选。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析，使用抗PD-L1鉴定并选择每一细胞池，且将其用于功能性分析，例如FACS结合分析或FACS竞争分析。
从高度表达人类PD-L1的转化细胞池各自制备每个样品0.5至1x106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中。因此，PD-L1抗体16E12特异性结合，并根据通过Graphpad Prism6的分析函数获得的平衡解离常数(Kd)测定其结合能力。
因此，如从图8可见，可通过MFI(平均荧光强度)来发现以浓度依赖性方式与细胞表面上过表达的人类PD-L1结合的抗体的结合能力。
3.使用ProteOn XPR36的PD-L1抗体的亲和性
使用ProteOn XPR36(BioRad)仪器。将GLC传感器芯片(BioRad)安装在该仪器上并用PBST缓冲液洗涤，并用EDC/磺基NHS混合溶液激活羧甲基葡聚糖表面。在GLC传感器芯片上注射并固定以5ug/ml浓度溶解于10mM乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中的PD-L1-hFc。
为了使保持未与PD-L1蛋白反应的活化羧基失活，使1M乙醇胺流入并注射10mM甘氨酸(pH 2.0)，以洗涤保持未与传感器芯片结合的蛋白质。然后，在结合和解离期间随时间收集传感图数据，同时使用PBST缓冲液容许抗体以30μL/min的流速(30nM至0.123nM)流动10min。
平衡解离常数(KD)是通过绘制传感图数据的曲线并根据浓度将传感图数据拟合于平衡状态中来计算。因此，16E12展现0.045nM的KD，指示对PD-L1抗原的高亲和性(图9)。
实施例5：对PD-L1抗体16E12的抗体优化
1.用于优化PD-L1-16E12抗体的文库的产生
对于抗体优化，通过固定重链并注射Ybiologics,Inc所拥有的105-106轻链(LC)池来产生新LC改组文库。还通过以下三种方法来实施抗体优化：LC改组；核心堆积+LC改组，对结构上重要的位点(例如重链的疏水核心、暴露残基、电荷簇、盐桥)的残基进行比较分析，使该残基突变为保守残基，并且然后实施LC改组；以及在抗体可变区中的DNA的情况下，CDR热点+LC改组，包括使可在体内亲和性成熟过程中频繁突变的突变热点随机突变，并且然后实施LC改组。
为了产生LC改组文库，用BstX I切割(消化)16E12抗体的LC基因并且然后将其用作载体，并将Ybiologics,Inc.所拥有的文库池切割(消化)为BstX I并用作插入物。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约1.5×107个不同文库。序列分析的结果显示，所有HC序列相同，并且LC序列彼此不同。
为了产生核心堆积+LC改组文库，用保守氨基酸序列替代16E12抗体的框架(FR)位点，用BstX I切割LC基因并且然后将其用作载体，并用BstX I切割Ybiologics,Inc.拥有的文库池并且然后将其用作插入物。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约8.4x106个不同文库。序列分析的结果显示，HC的FR位点经保守氨基酸序列替代，且LC序列彼此不同。
为了产生核心热点+LC改组文库，用保守氨基酸序列替代16E12抗体的框架(FR)位点，用Sfi I切割CDR1的热点文库并将其用作插入物，并用Sfi I切割Ybiologics,Inc.拥有的文库池并且然后将其用作载体。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约5.6x106个不同文库。序列分析的结果显示，HC的FR位点经保守氨基酸序列替代，CDR1的热点序列发生随机突变，且LC序列彼此不同。
实施例6：PD-L1人类抗体的筛选
1.抗原制备
将Ybiologics,Inc生产的PD-L1-hFc和PD-L1-mFc以及购自Sino BiologicalInc.的PD-L1-his(目录号，10377-H08H)作为蛋白质抗原以50ug剂量涂布于免疫吸附管上，并且然后加以封阻。
2.生物淘选
通过用细菌感染人类scFv文库(具有2.7x1010各种各样的)并且然后在30℃下培养16小时来获得人类抗体文库噬菌体。在培养后，对培养溶液进行离心，用PEG浓缩上清液，并且然后溶解于PBS缓冲液中，以制备人类抗体文库。将人类抗体文库噬菌体装填至免疫管中，随后在室温下反应2小时。在用1X PBS/T和1X PBS洗涤后，仅洗脱与抗原特异性结合的scFv-噬菌体。
用大肠杆菌再次感染经洗脱噬菌体并扩增(淘选过程)，以获得阳性噬菌体池。对于抗体优化，仅实施第一轮淘选。因此，如表6中所示，可见在第一轮淘选期间，与输入噬菌体相比，与抗原结合(输出)的噬菌体数略有增加。[表6]在优化淘选中抗体效价的对比
样品 输入噬菌体数 输出噬菌体数
16E12(LS) 1.3X1013 2.8X107
16E12(核心堆积+LS) 1.1X1013 1.8X106
16E12(CDR热点+LS) 1.1X1013 1.6X106
3.阳性噬菌体的筛选
将从淘选获得的菌落在1ml 96深孔板(Bioneer 90030)中在37℃下培养16小时。将由此生长的100至200μl细胞添加至含有2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并添加至含有1ml 2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中，并且然后在96深孔板中在37℃下培养2至3小时至OD600为0.5至0.7。以1:20的MOI感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。
将抗原PD-L1以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每孔。将用0.2ml PBS/T洗涤并培养16小时的每种单克隆scFv-噬菌体(100scFv-噬菌体)以1μl剂量添加至每孔，并在室温下反应2小时。再次用0.2mlPBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP稀释至1/2000，并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，获得对每种抗原的结合能力高于亲代抗体(16E12，标红色，6D)的单一噬菌体克隆，且结果显示于图10中。
4.阳性噬菌体抗体的碱基序列分析
使用DNA纯化试剂盒(Qiagen，德国)使所选单一克隆经历DNA-prep以获得DNA，并请求对DNA的序列分析(Solgent)。基于序列分析结果鉴定所选抗体的VH和VL的CDR区，并使用NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/上的Ig BLAST程序研究这些抗体与种系抗体组之间的相似性(同一性)。因此，获得21种结合能力高于亲代抗体的噬菌体抗体并归纳于下表7中。
[表7]经优化PD-L1单克隆的特征
克隆名称 VH 同一性 VL 同一性2 组
PDL1-16E12(LS/4A6) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 90.91％ 1
PDL1-16E12(LS/4A7) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 88.89％ 2
PDL1-16E12(LS/4A8) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 85.86％ 3
PDL1-16E12(LS/4A10) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 87.88％ 4
PDL1-16E12(LS/4A11) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 90.91％ 5
PDL1-16E12(LS/4B7) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 88.89％ 6
PDL1-16E12(LS/4B8) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 84.85％ 7
PDL1-16E12(LS/4B11) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 86.87％ 8
PDL1-16E12(LS/4B12) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 89.90％ 9
PDL1-16E12(LS/4C9) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 88.89％ 10
PDL1-16E12(LS/4D4) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 92.93％ 11
PDL1-16E12(LS/4E5) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 90.91％ 12
PDL1-16E12(LS/4E12) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 86.87％ 13
PDL1-16E12(LS/4F5) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 93.94％ 14
PDL1-16E12(LS/4F11) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 94.95％ 15
PDL1-16E12(LS/4G1) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 89.90％ 16
PDL1-16E12(LS/4H5) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 97.98％ 17
PDL1-16E12(LS/4H6) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 88.89％ 18
PDL1-16E12(LS/4H8) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 96.97％ 19
PDL1-16E12(LS/4H9) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 90.91％ 20
PDL1-16E12(LS/4H11) IGHV1-69 92.86％ IGLV1-40 91.92％ 21
包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的抗体，以及包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的重链可变区和轻链可变区显示于下表8和9中。
[表8]PD-L1人类抗体的重链可变区
Figure GDA0002090987590000361
/>
Figure GDA0002090987590000371
/>
Figure GDA0002090987590000381
/>
Figure GDA0002090987590000391
[表9]PD-L1人类抗体的轻链可变区
Figure GDA0002090987590000392
/>
Figure GDA0002090987590000401
/>
Figure GDA0002090987590000411
实施例7：PD-L1人类抗体的产生
1.scFv形式至IgG形式的转化
对重链和轻链进行PCR(iCycle iQ，BIO-RAD)以将所选21种针对PD-L1的单克隆噬菌体抗体从噬菌体转化为IgG完整载体。因此，获得重链和轻链，并用限制性酶切割(消化)每种克隆的载体以及重链和轻链。用DNA-凝胶萃取试剂盒(Qiagen)从载体和重链中的每一者洗脱DNA。通过以下方式进行连接：混合1μl(10ng)载体、15μl(100-200ng)重链、2μl的10x缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水，使混合物在室温下静置1至2小时，将所得混合物注射至经转化细胞(感受态细胞，XL1-蓝)中，将细胞置于冰上5分钟并使细胞在42℃下经历90秒热休克。
在热休克后，将1ml培养基添加至细胞，并且然后使细胞在37℃下生长1小时，铺展于LB Amp板上，并在37℃下孵育16小时。将由此获得的菌落用5ml LB Amp培养基接种，在37℃下培养16小时，并使用DNA-prep试剂盒(Nuclogen)使其经历DNA-prep。请求所获得DNA的序列分析(Solgent)。
因此，确认21种针对PD-L1的克隆的重链和轻链序列转化为完整IgG，与噬菌体抗体的序列相对应。为了转染至HEK 293F细胞中，使转化为完整IgG的各个克隆的重链和轻链在100ml的LB Amp培养基中生长，并使用Midi-prep试剂盒(QIAgen)获得DNA。
2.人类抗体产生
将经克隆pNATVH和pNATVL载体以6:4的比率共转染至HEK293F细胞中，并在第7天收集上清液，通过离心和0.22μm顶部滤纸去除细胞和碎片，并收集上清液且对上清液进行蛋白A亲和层析以纯化IgG抗体。在纯化后，经甘氨酸缓冲液分离抗体，并更换缓冲液，使得最终再悬浮缓冲液为PBS。通过BCA和nano drop对经纯化抗体进行定量，并将21种抗体各自以5ug剂量在还原性和非还原性条件下加载，并通过SDS-PAGE分析以测定经纯化蛋白质的纯度和迁移率。另外，将一些上清液加载于SDS-PAGE上以与亲代抗体对比表达率，大多数抗体的表达多于亲代抗体。
实施例8：PD-L1单克隆抗体的特征
1.抗体活性的评估
对所选抗体的活性的测试是使用PD-1/PD-L1阻断生物分析试剂盒(promega，J1250)来实施。将高度表达PD-L1的CHO细胞系铺展于96孔板上，培养16小时或更久，用以恒定浓度连续稀释的每种抗体处理，并且然后与高度表达人类PD-1的Jurkat细胞系一起培养6小时。用分光光度计(SpectraMax M5分光光度计，Molecular Devices，美国)测定抗体抑制的恢复程度，其是根据荧光素酶降解底物产生的发光强度来测定的。基于该值发现21种PD-L1抗体的活性通过形成PD-1/PD-L1复合物而恢复减小的信号，并且4A7、4A11、4C9、4F5、4H5和4H8展现高于亲代抗体的活性和与对照抗体类似的活性(图11和表10)。
[表10]所选PD-L1抗体突变体的单克隆的活性
Figure GDA0002090987590000421
/>
Figure GDA0002090987590000431
为了以浓度依赖性方式测量6种PD-1抗体(4A7、4A11、4C9、4F5、4H5、4H8)的活性，再次进行连续稀释和PD-1/PD-L1阻断生物分析，以按浓度梯度依赖性方式恢复减小的信号。恢复程度可表示为EC50(在50％恢复信号水平下mAb的有效浓度)，使用GraphpadPrism6进行分析，并且4F5展现最高的EC50体外效能抑制恢复能力(图12)。
2.PD-L1抗体与过表达细胞的亲和性
关于高度表达人类PD-1的转化细胞池，用含有人类PD-1(NM_005018.2)或人类PD-L1(NM_014143.2)的pcDNA3.1质粒转化HEK293E，并在含有400ug/ml Zeocin(编号R25001，Thermo Fisher)的选择培养基中进行筛选。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析，使用抗PD-1(编号557860，BD)鉴定并选择每一细胞池，且将其用于功能性分析，例如FACS结合分析或FACS竞争分析。从高度表达人类PD-L1的转化细胞池制备每个样品0.5至1x106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中(表11)。
[表11]所选PD-L1抗体突变体与细胞表面上表达的PD-L1的结合
Figure GDA0002090987590000441
/>
Figure GDA0002090987590000451
从高度表达人类PD-L1的转化细胞池各自制备每个样品0.5至1x106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中(图13)。
3.通过酶免疫吸附，抗体针对PD-1/PD-L1复合物形成的抑制能力
将人类PD-1-Fc(S1420，Y-Biologics)添加至96孔免疫微量板(编号439454，Thermo)的孔中，并且然后用含有0.05％tween-20的PBS(编号P9416，Sigma-Aldrich)洗涤三次，随后用4％脱脂乳(编号232120，Becton，Dickinson and Company)洗涤，并使其在室温下静置1小时，以阻断非特异性结合。同时，使人类PD-L1-His(S1479，Y-Biologics)与以恒定稀释率连续稀释的抗体在室温下反应1小时，随后使其在经制备微量板中在室温下静置1小时。在使所得产物经历与上文相同的洗涤方法后，将稀释至1:2000的抗生物素His抗体(编号MA1-21315-BTIN，Thermo)添加至微量板的孔中，使其在室温下反应1小时，并将稀释至1:5000的抗生蛋白链菌素聚HRP抗体(编号21140，Pierce)添加至微量板的孔中，在室温下反应1小时，并且然后以相同方式洗涤。将100ul TMB底物溶液(编号T0440，Sigma-Aldrich)添加至反应产物，遮光，并使反应产物在室温下静置3分钟，添加50μL 2.5M硫酸(编号S1478，Samchun)以停止反应，并在450nm下使用分光光度计(编号GM3000，
Figure GDA0002090987590000461
Discover System Promega)测量吸光度。结果显示于图14中。
4.使用ProteOn XPR36的PD-L1抗体的亲和性
使用ProteOn XPR36(BioRad)仪器。将GLC传感器芯片(BioRad)安装在该仪器上并用PBST缓冲液洗涤，并用EDC/磺基NHS混合溶液激活羧甲基葡聚糖表面。在GLC传感器芯片上注射并固定以5ug/ml浓度溶解于10mM乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中的PD-L1-hFc。
为了使保持未与PD-L1蛋白反应的活化羧基失活，使1M乙醇胺流入并注射10mM甘氨酸(pH 2.0)，以洗涤保持未与传感器芯片结合的蛋白质。然后，在结合和解离期间随时间收集传感图数据，同时使用PBST缓冲液容许抗体以30μL/min的流速(30nM至0.123nM)流动10min。
平衡解离常数(KD)是通过绘制传感图数据的曲线并根据浓度将传感图数据拟合于平衡状态中来计算。因此，16E12(4F5)展现0.001nM的KD，指示对PD-L1抗原的高亲和性(图15)。
PDL1-16E12、LS和4F5对人类、猴和小鼠PD-L1蛋白的亲和性的对比如表12中所示。
[表12]所选PD1单克隆抗体(16E12-4F5)的单克隆抗体对人类、猴和小鼠的结合能力
PD-L1来源 KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s)
人类 1.0ⅹ10-12 3.100ⅹ105 1.0ⅹ10-7
小鼠 8.082ⅹ10-10 8.327ⅹ105 6.730ⅹ10-4
短尾猴 1.0ⅹ10-12 2.869ⅹ105 1.0ⅹ10-7
实施例9：PD-L1单克隆抗体的表位的测定
将抗原PD-L1野生型(WT)或若干种突变体以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻各孔。用0.2ml PBS/T洗涤每孔，并且然后将培养16小时的单一克隆scFv-噬菌体(每一100scFv-噬菌体)以100μl剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并且然后将第二抗体抗Fab稀释至1/2000并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，确认对照抗体和PD-L1突变体具有不同结合行为并因此具有不同表位(图16)。
实施例10：PD-L1单克隆抗体在同种异体MLR反应中的活性增加
将T细胞与从不同人类分离的单核细胞源树突细胞以1:10的比率混合并培养5天，并测量培养基中干扰素γ的量。因此，含有16E12的亲代抗体的培养基展现干扰素γ的量的浓度依赖性增加(图17)。
实施例11：对PD-L1单克隆抗体在同基因癌症动物模型中的效能的评估
为了鉴定16E12-2B9PD-L1单克隆抗体的体内效能，将8x106个CT-26细胞作为结肠癌细胞皮下注射至BALb/C小鼠的侧腹中，并观察肿瘤生长，同时从肿瘤大小与粟接近时起，经3周一周两次以5mg/kg剂量给予单克隆抗体。因此，在给予PD-L1单克隆抗体的组中观察到肿瘤大小显著减小(图18)。
实施例11：PD-L1单克隆抗体的热稳定性测试
将抗体蛋白于DPBS中稀释至3uM，45ul，与5ul 200x Sypro橙染料(编号S6650，Thermo)混合，并且然后以50ul剂量等分至qPCR管(编号B77009，B57651，bioplastics)中。使用Biorad CFX96实时PCR系统进行QPCR。qPCR条件给定如下：在25℃下反应30秒，以1℃升温直至99℃，且同时在每一温度下反应1min，且最终在25℃下反应10秒。使用Tm(熔融温度)作为抗体结构未结合的比率常数。结果显示于下表13中。
[表13]抗体的热力学稳定性
Figure GDA0002090987590000471
Figure GDA0002090987590000481
实施例13：与PD-L2的结合的测定
为了鉴定抗PD-L1抗体与PD-L2的结合，将人类PD-L2-Fc(编号10292-H02H，Sino)固定于96孔免疫微量板(编号439454，Thermo)的孔上，在4℃下16小时，并且然后用含有0.05％tween-20(编号P9416，Sigma-Aldrich)的PBS洗涤3次，随后使其在含有4％脱脂乳(编号232120，Becton，Dickinson and Company)的洁净溶液中在室温下静置1小时，以阻断非特异性结合。同时，使以恒定稀释率连续稀释的每一抗体或用作阳性对照的人类PD-1-His(S1352，Y-Biologics)在室温下反应1小时，随后使其在经制备微量板中在室温下静置1小时。在使所得产物经历与上文相同的洗涤方法后，将稀释至1:2000的抗生物素His抗体(编号MA1-21315-BTIN，Thermo)添加至微量板的孔中，使其在室温下反应1小时，并将稀释至1:5000的抗生蛋白链菌素聚HRP抗体(编号21140，Pierce)添加至微量板的孔中，在室温下反应1小时，并且然后以相同方式洗涤。将100ul TMB底物溶液(编号T0440，Sigma-Aldrich)添加至反应产物，遮光，并使反应产物在室温下静置3分钟，添加50μL 2.5M硫酸(编号S1478，Samchun)以停止反应，并在450nm下使用分光光度计(编号GM3000，
Figure GDA0002090987590000482
Discover System Promega)测量吸光度。结果显示于图19中。
工业利用度
根据本公开文本的结合至PD-L1的新颖抗体或其抗原结合片段可以高亲和性结合至PD-1，并抑制PD-1/PD-L1复合物的形成，由此抑制逃避PD-1/PD-L1介导的T细胞活性的T细胞耗尽。因此，根据本公开文本的结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗目标癌症或传染病。
尽管已详细描述本公开文本的具体配置，但本领域技术人员将了解，本描述仅作为优选实施方案来提供用于说明性目的，且不应视为限制本公开文本的范围。因此，本公开文本的实质范围是由随附权利要求和其等效内容来限定。
文本文件
参见所附序列表。
<110> Y生物股份有限公司
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<130> PP-B1908
<150> KR 10-2016-0100211
<151> 2016-08-05
<160> 251
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<220>
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<211> 8
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Ala Arg Asp Phe Val Leu Ser Gly Ser Ala Thr Val Phe Asp Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 30
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<223> 人工序列
<400> 34
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser
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1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 36
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 37
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 37
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 38
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 40
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser
1 5 10 15
Ala
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 41
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 43
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 44
Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Thr Ala Phe Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Asp Tyr Pro Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Thr Gly Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Asp Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Gly Arg Leu Thr Ile Ile Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 48
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<223> 人工序列
<400> 49
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 54
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<213> 人工序列
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Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 58
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Phe Val Leu Ser Gly Ser Ala Thr Val Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 60
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Arg Tyr
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Gly Arg Ile Ile Pro Val Leu Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Arg Lys Phe
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100 105 110
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<210> 61
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu Asn Phe Arg Ser His
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Val Gly Leu Ala Asp Tyr Pro Gln Lys Phe
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Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ser
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Arg Val Ser Ser Val
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 144
Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Gly Val Val
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 145
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser
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<210> 146
<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 146
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 147
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 148
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Ser Ile Ser Cys Ile Gly Ser
20 25
<210> 149
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 149
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 150
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 151
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Pro Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 152
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 153
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 153
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 154
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 154
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 155
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 155
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 156
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
20 25
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 157
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 158
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 159
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 159
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly
20 25
<210> 160
<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 160
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 161
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gly Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asp
20 25
<210> 162
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 162
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Phe Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 163
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 163
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 164
<211> 17
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 164
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1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 165
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1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 166
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Val Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 167
Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 168
Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 169
Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 170
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 171
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 172
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 173
Val His Trp Tyr Gln Ser Leu Pro Gly Thr Val Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 174
Val His Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 175
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 176
Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 177
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 178
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 179
Val Gln Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 180
Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Ile Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 182
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1 5 10 15
Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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1 5 10 15
Tyr
<210> 185
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 185
Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ala Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 186
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 186
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Gly Ala
20 25 30
Asp Tyr His Cys
35
<210> 187
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 187
Asn Arg Pro Ser Gly Val Leu Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Ala
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 188
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 188
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Leu Asp Ile Thr Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala
20 25 30
Tyr Tyr Tyr Cys
35
<210> 189
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 189
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 190
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 190
Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 191
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 191
Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Gly Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 192
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 192
Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 193
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 193
Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 194
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 194
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 195
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 195
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 196
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 196
Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 197
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 197
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 198
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 198
Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu Ala
20 25 30
Asn Tyr Phe Cys
35
<210> 199
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 199
His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Thr
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 200
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 200
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 201
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 201
Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 202
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 202
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 203
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 203
Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Gly Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 204
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 204
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 205
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 205
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Val Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 206
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 206
Asn Arg Pro Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 207
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 207
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 208
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 208
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Thr Asp Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Phe Cys
35
<210> 209
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 209
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 210
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 210
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 211
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 212
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 213
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 214
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 214
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 215
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 215
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 216
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 216
Ile Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 217
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 217
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ala Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 218
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 218
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Gly Ala Asp Tyr His Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Ser Ala His Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 219
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 219
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Thr Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Val Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Leu Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 220
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 220
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Ser Ile Ser Cys Ile Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Thr Pro
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Asp Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Gly Val Ser Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu
<210> 221
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 221
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu
<210> 222
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 222
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 223
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 223
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Gly Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 224
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 224
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Pro Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 225
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 225
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Ile Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 226
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 226
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Gly Gln Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 227
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 227
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ala Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Arg Ser
85 90 95
Arg Ser Gly Ser Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 228
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 228
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Ser Leu Pro Gly Thr Val Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Gly Asn Ser Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser
85 90 95
Leu Ser Glu Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 229
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 229
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Arg
85 90 95
Leu Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 230
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 230
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile His Gly Asn Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 231
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 231
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Arg
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
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Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Val Thr Asn His Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 233
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 233
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile His Gly Asp Arg Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Asn Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 234
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 234
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val Gln Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Leu Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser
85 90 95
Leu Ser Glu Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Gly Asp Thr Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Ser Ala His Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 236
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 236
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Leu Phe Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 237
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ala Pro
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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100 105 110
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 238
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gly Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asp Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg
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Leu Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 239
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1 5 10 15
Lys Val Thr Phe Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Asn Thr Asn Arg Pro Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe
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65 70 75 80
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100 105 110
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<211> 111
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu
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50 55 60
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Ser Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 242
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Leu Phe Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe
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65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 243
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 243
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 244
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Arg Val Ser Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 245
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 245
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 246
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 246
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 247
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 247
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg
85 90 95
Leu Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 248
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 248
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 249
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 249
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
115 120 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
195 200 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 250
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 250
ccaggatggt tcttagactc ccc 23
<210> 251
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 251
caccagggtt tggaactggc 20

Claims (10)

1.一种结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含：
SEQ ID NO:2的重链CDR1；
SEQ ID NO:9的重链CDR2；和
SEQ ID NO:17的重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含：
SEQ ID NO:89的轻链CDR1；
SEQ ID NO:119的轻链CDR2；和
SEQ ID NO:139的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO:27的重链可变区FR1；
SEQ ID NO:36的重链可变区FR2；
SEQ ID NO:43的重链可变区FR3；和
SEQ ID NO:51的重链可变区FR4。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO:149的轻链可变区FR1；
SEQ ID NO:184的轻链可变区FR2；
SEQ ID NO:207的轻链可变区FR3；和
SEQ ID NO:213的轻链可变区FR4。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO:80的序列。
5.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:240的序列。
6.一种核酸，其编码权利要求1至5中任一项的抗体或其抗原结合片段。
7.一种表达载体，其包含根据权利要求6的核酸。
8.一种用根据权利要求7的表达载体转化的细胞。
9.一种用于产生结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：
a)培养根据权利要求8的细胞；并且
b)从细胞培养基回收该抗体或其抗原结合片段。
10.一种组合物在制备用于治疗结肠癌的药物中的用途，其中所述组合物包含权利要求1至5中任一项的抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
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