ES2920677T3 - Anticuerpos y fragmentos anti-VISTA - Google Patents

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ES2920677T3 ES20159500T ES20159500T ES2920677T3 ES 2920677 T3 ES2920677 T3 ES 2920677T3 ES 20159500 T ES20159500 T ES 20159500T ES 20159500 T ES20159500 T ES 20159500T ES 2920677 T3 ES2920677 T3 ES 2920677T3
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Gordon Powers
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Janssen Pharmaceutica NV
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Abstract

La presente invención se relaciona con nuevos anticuerpos y fragmentos que se unen a un supresor de Ig de Dominio V de la activación de células T (VISTA) y métodos para hacer y usar el mismo. Los métodos de uso incluyen métodos de tratamiento del cáncer, incluidas leucemias, linfomas, tumores sólidos y melanomas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos y fragmentos anti-VISTA
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La expresión de reguladores de punto de control inmunitario negativos por parte de células cancerosas o células inmunitarias en el microentorno tumoral puede suprimir la respuesta inmunitaria del hospedador frente al tumor. Para combatir el cáncer de forma eficaz, es deseable bloquear la supresión mediada por tumores de la respuesta inmunitaria del hospedador. Por lo tanto, existe la necesidad de agentes terapéuticos nuevos y eficaces que inhiban reguladores de punto de control inmunitario negativos en el microentorno tumoral que supriman respuestas inmunitarias antitumorales. El documento de patente WO 2011/120013 se refiere a una proteína, denominada PD-L3 o supresor de inmunoglobulina de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), que se asemeja a miembros de la familia PD-L1.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a anticuerpos aislados y fragmentos de anticuerpo de los mismos que se unen a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 37 y un polipéptido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 44. VISTA es un regulador de punto de control que suprime negativamente respuestas inmunitarias. Véase Wang et al., "VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses", J. Exp. Med., 208 (3) 577-92 (2011). Se expresa en subconjuntos de neutrófilos, monocitos y linfocitos T humanos normales. Además, las células de mono cinomolgo expresan VISTA con un patrón similar al de las células humanas normales. VISTA también se expresa en las células de sangre periférica de pacientes con cáncer.
La unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a VISTA modula o aumenta una respuesta inmunitaria. El fragmento de anticuerpo puede incluir, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2, o scFv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender una región constante de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede unir a VISTA que se expresa en una célula hematopoyética, por ejemplo, una célula mieloide y/o un linfocito, un monocito o un neutrófilo, un linfocito T, un linfocito citolítico natural (NK), un linfocito T citolítico natural (NKT), una célula tumoral, y/o en el microentorno tumoral (TME). El microentorno tumoral es el entorno celular del tumor. Puede incluir células inmunitarias circundantes, fibroblastos, vasos sanguíneos, otras células, moléculas de señalización, y la matriz extracelular.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las 3 CDR de cadena ligera de los anticuerpos anti-VISTA, VSTB112 (S2), VSTB140, VSTB149, o VSTB174. En el presente documento se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que pueden comprender una o más CDR de cadena pesada y/o una o más CDR de cadena ligera, incluyendo una o más CDR (por ejemplo, las tres CDR de cadena pesada, las 3 CDR de cadena ligera o las 6 CDR) de cualquiera de los otros anticuerpos anti-VISTA que se describen en el presente documento, incluyendo los anticuerpos denominados VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) y VSTB60 (S47). En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se seleccionan entre el grupo que consiste en VSTB112, VSTB140, VSTB149, y VSTB174. En el presente documento se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos o fragmentos de los mismos que se seleccionan entre el grupo que consiste en VSTB95, VSTB116, VSTB50, VSTB53 y VSTB60. En una realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera del anticuerpo anti-VISTA, VSTB112 (S2), VSTB140, VSTB149, o VSTB174. En el presente documento se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que pueden comprender además al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera de cualquiera de los otros anticuerpos anti­ VISTA que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una cadena pesada que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEQ ID NO: 37, y al menos una cadena ligera que comprende la secuencia de región variable de cadena ligera SEQ ID NO: 44. El anticuerpo, como se define en las reivindicaciones adjuntas, comprende una región marco humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo completo. En algunas realizaciones, el fragmento es un miembro de unión a anti-VISTA. También desveladas en el presente documento, pero no reivindicadas, las CDR de cadena pesada del anticuerpo están representadas en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y las CDR de cadena ligera están representadas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6. También desveladas en el presente documento, pero no reivindicadas, las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y cadena ligera están representadas en las SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente.
En el presente documento también se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos anti-VISTA que son sustancialmente similares a anticuerpos que se describen en el presente documento; por ejemplo, un anticuerpo o fragmento que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una CDR1 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a s Eq ID NO: 1, una CDR2 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 3, y que comprende además un dominio VL de anticuerpo que comprende una CDR1 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 6.
En el presente documento también se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos anti-VISTA que inhiben competitivamente, o compiten por la unión a, los anticuerpos anti-VISTA que se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VISTA son parte de un conjugado, por ejemplo, un conjugado que comprende una molécula citotóxica u otro agente que se describe en el presente documento. En la técnica se conocen bien tales moléculas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región constante humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para un epítopo de VISTA, por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un epítopo de VISTA con una afinidad de al menos 1 x 10'7 litros/mol, por ejemplo, al menos 1 x 10'8 litros/mol, por ejemplo, al menos 1 x 10'9 litros/mol.
En algunas realizaciones, la modulación de la respuesta inmunitaria comprende un aumento de leucocitos CD45+, linfocitos T CD4+, y/o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, la modulación de la respuesta inmunitaria comprende un aumento de la producción de citoquinas (por ejemplo, linfocitos T) (por ejemplo, IFNy, IL-10, TNFa, IL-17), aumento de la respuesta de linfocitos T, y/o expresión de Foxp3 modulada.
La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-VISTA) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede comprender un antagonista de VISTA que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región de unión a antígeno que se une a VISTA, y una vacuna (tal como una vacuna de vector viral, vacuna bacteriana, vacuna de ADN, vacuna de ARN, vacuna peptídica). En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica y la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a VISTA modula o aumenta una respuesta inmunitaria.
La invención también se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o composición como se define en las reivindicaciones adjuntas para uso en el tratamiento o prevención de cáncer que comprende administrar, a un individuo (por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un animal no humano) que lo necesita, una cantidad eficaz del al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o composición que se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a VISTA, modulando o aumentando de ese modo una respuesta inmunogénica al cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es una leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásico y/o mieloma. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser cualquier clase o tipo de leucemia, incluyendo una leucemia linfocítica o una leucemia mielógena, tal como, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia de linfocitos grandes granulares, o leucemia de linfocitos T del adulto. En algunas realizaciones, el linfoma es un linfoma histocítico, y, en algunas realizaciones, el cáncer es un mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo, un melanoma, o cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de pulmón (por ejemplo, un carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM)). Algunos usos comprenden además la administración de una vacuna (tal como una vacuna de vector viral, vacuna bacteriana, vacuna basada en células, vacuna de ADN, vacuna de ARN, vacuna peptídica o vacuna proteica). La invención también se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o composición, como se define en las reivindicaciones adjuntas, para uso en la supresión del crecimiento tumoral en un individuo que lo necesita, comprendiendo dicho uso administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o composición eficaz que se describe en el presente documento.
La composición, anticuerpo o fragmento u otro agente farmacéutico (por ejemplo, una vacuna) se puede administrar por cualquier medio parenteral o no parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa (IV), por vía subcutánea (SQ) o por vía oral (PO).
En algunas realizaciones, la composición, anticuerpo o fragmento se administra de forma trimestral, de forma semanal, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En algunas realizaciones, otros agentes farmacéuticos o terapéuticos se coadministran antes, durante o después de los anticuerpos, fragmentos y composiciones que se describen en el presente documento. El agente coadministrado se puede administrar por la misma vía que el anticuerpo, fragmento o composición, o por una vía diferente.
La invención también incluye métodos para preparar los anticuerpos, fragmentos y composiciones, por ejemplo, un método para producir un anticuerpo o fragmento de la invención que comprende cultivar células hospedadoras en condiciones para la producción de dicho anticuerpo. El método puede comprender además aislar el anticuerpo. La invención también se refiere a ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica los anticuerpos y fragmentos, vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos, por ejemplo, unidos operativamente a un promotor, y células hospedadoras transformadas con tal vector de expresión.
La invención también se refiere a kits y artículos de fabricación que comprenden una composición que comprende el anticuerpo anti-VISTA y un recipiente, y que comprende además un prospecto o etiqueta que indica que la composición se puede usar para tratar cáncer.
El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo, como se define en las reivindicaciones adjuntas, comprende una región de unión a antígeno que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), en donde el anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 37 que comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27, y que comprende además un dominio VL de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 44 que comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como se define en las reivindicaciones adjuntas, comprende una o más regiones marco, humanizadas o humanas. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 37 y un dominio VL de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 44. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada (por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana) y/o una región constante de cadena ligera (por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana, tal como la región constante de cadena ligera presente en SEQ ID NO: 56). Preferentemente, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG1 (por ejemplo, la región constante de cadena pesada de IgG1 presente en SEQ ID NO: 61). En una realización particular, la región constante de cadena pesada de IgG1 se ha modificado para aumentar la resistencia a proteasa del anticuerpo. Un ejemplo de una región constante de cadena pesada de IgG1 que se ha modificado para aumentar la resistencia a proteasa es la región constante de cadena pesada de IgG1 presente en SEQ ID NO: 60. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 60 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 56; o una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 56. En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se expresa en una célula que es deficiente en enzimas de fucosilación (por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) que es deficiente en enzimas de fucosilación).
La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, como se define en las reivindicaciones adjuntas, que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 37 que comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27, y que comprende además un dominio VL de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 44 que comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30; y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), como se define en las reivindicaciones adjuntas, en donde el anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 37 que comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27, y que comprende además un dominio VL de anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 44 que comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30, para uso para tratar cáncer en un individuo que lo necesita. En una realización particular, el cáncer es un cáncer de pulmón. En una realización adicional, el cáncer de pulmón es un carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM). En algunas realizaciones, el uso comprende además administrar un segundo tratamiento para el cáncer (por ejemplo, cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia biológica, terapia inmunomoduladora, y combinaciones de las mismas).
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región de unión a antígeno que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), como se define en las reivindicaciones adjuntas, se une a un epítopo conformacional en VISTA (por ejemplo, VISTA humano). Desvelado en el presente documento, pero no reivindicado, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región de unión a antígeno que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA) se une al epítopo conformacional que comprende, o está presente en, los restos 103-111 (NLTLLDSGL (SEQ ID NO: 62)) y 136-146 (VQTGKDAPSnC (SEQ ID NO: 63)) de VISTA humano (SEQ ID NO: 46). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región de unión a antígeno que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), como se define en las reivindicaciones adjuntas, se une al epítopo conformacional que comprende, o está presente en, los restos 24-36 (LLGPVd Kg HDVTF (SEQ ID NO: 64)), 54-65 (RRPIRNLTFQDL (SEQ ID NO: 65) y 100-102 (TMR) de VISTA humano (SEQ ID NO: 46), así como el bucle FG de VISTA humano (SEQ ID NO: 46).
Además, la invención se refiere al anticuerpo que se une un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), o un fragmento de anticuerpo del mismo, que comprende una región de unión a antígeno que se une a VISTA, como se define en las reivindicaciones adjuntas, para uso para aumentar una respuesta inmunitaria en un individuo que lo necesita, aumentando de ese modo una respuesta inmunitaria frente al cáncer. En una realización particular, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria antitumoral.
En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), o un fragmento de anticuerpo del mismo, que comprende una región de unión a antígeno que se une a VISTA, como se define en las reivindicaciones adjuntas, para uso para provocar una respuesta biológica en un individuo que lo necesita, aumentando de ese modo una respuesta inmunitaria frente al cáncer. Algunos ejemplos de respuestas biológicas incluyen activación de monocitos; inducción de proliferación de linfocitos T y secreción de citoquinas; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos
(ADCC) de células que expresan VISTA; y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) de células que expresan VISTA.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo o dibujos en color tras la solicitud y el pago de la tasa necesaria.
Figura 1A-1C: gráficos que muestran la expresión de VISTA en células TF1 de LMA. La expresión de proteína VISTA por citometría de flujo se muestra en la línea celular TF-1 de LMA.
Figura 2A-2E: gráficos que muestran estrategias de tinción y selección para la identificación de subconjuntos linfoides y mieloides humanos.
Figura 3A-3G: gráficos que muestran la expresión de VISTA en subconjuntos linfoides y mieloides humanos a partir de un donante normal sano.
Figura 4: gráfico que muestra la expresión de VISTA en subconjuntos linfoides y mieloides humanos en múltiples donantes normales sanos.
Figura 5A-5B: gráfico que muestra estrategias de tinción y selección para la identificación de expresión de VISTA en monocitos y macrófagos humanos.
Figura 6A-6C: gráficos que muestran la expresión de VISTA en monocitos y macrófagos humanos.
Figura 7A-7E: gráficos que muestran estrategias de tinción y selección para la identificación de expresión de VISTA en subconjuntos de linfocitos T y NK humanos.
Figura 8A-8G: gráficos que muestran la expresión de VISTA en subconjuntos de linfocitos T y NK humanos a partir de un donante normal sano.
Figura 9: gráfico que muestra la expresión de VISTA en subconjuntos de linfocitos T y NK humanos en múltiples donantes normales sanos.
Figura 10A-10D: gráficos que muestran estrategias de tinción y selección para la identificación de expresión de VISTA en subconjuntos de células dendríticas humanas.
Figura 11A-11C: gráficos que muestran la expresión de VISTA en subconjuntos de células dendríticas humanas y basófilos a partir de un donante normal sano.
Figura 12: gráfico que muestra la expresión de VISTA en subconjuntos de células dendríticas humanas y basófilos en múltiples donantes normales sanos.
Figura 13A-13D: análisis de expresión de VISTA en células de sangre periférica humanas sanas. Perfil de expresión de VISTA en células de sangre periférica humanas sanas usando análisis de citometría de flujo multicolor: se analizaron muestras de sangre completa de 2 individuos diferentes para determinar la expresión de VISTA en (Figura 13A) monocitos SSCbaj°CD11balt°CD14alt°CD16-veCD33+veHLA-DR+veCD19-ve) (Figura 13B) neutrófilos (SSCalt°CD177+CD11balt°CD14baj°CD16+veCD33+veHLA-DR'veCD19've). Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron usando gradiente de Ficoll para el análisis de (Figura 13C) linfocitos T CD4+ (CD3+veCD4+ve), y (Figura 13D) linfocitos T CD8+ (CD3+veCD8+ve).
Figura 14A-14C: análisis de expresión de VISTA en células de sangre periférica de un paciente con cáncer de pulmón y un donante de control sano. Perfil de expresión de VISTA en células de sangre periférica de paciente con cáncer de pulmón usando análisis de citometría de flujo multicolor: se muestra una representación de FACS representativa (Figura 14A) de un individuo. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica por Ficoll y se analizaron para determinar la expresión de VISTA en (Figura 14B) monocitos (CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-) y (Figura 14C) células supresoras derivadas de mieloides (CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
Figura 15A-15C: Perfil de expresión de VISTA en células de sangre periférica de un paciente con cáncer de colon, usando análisis de citometría de flujo multicolor: se muestra una representación de FACS representativa (Figura 15A) de un individuo. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica por Ficoll y se analizaron para determinar la expresión de VISTA en (Figura 15B) monocitos (CD14+ CD11b+ CD33+ HlAd R+ CD15-) y (Figura 15C) células supresoras derivadas de mieloides (CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
Figura 16A-16D: perfil de expresión de VISTA en células de sangre periférica de mono cinomolgo usando análisis de citometría de flujo multicolor: se analizó sangre completa de 4 monos diferentes para determinar la expresión de VISTA en (Figura 16A) monocitos (SSCbaj°CD11balt°CD14alt°HLA-DRalt°CD16'veCD19've y (Figura 16B) neutrófilos CDIIb^CDM ^HLA-DR-'^CD^-'^CD^-''® Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de tres monos usando gradiente de Ficoll para el análisis de (Figura 16C) linfocitos T CD4+ (TCRa/p+veCD4+ve) y (Figura 16D) linfocitos T CD8+ (TCRa/p+veCD8+ve).
Figura 17: gráfico que muestra valores absolutos de expresión de ARN de VISTA en líneas de células Hemo. Figura 18: se transfectaron células A20 de ratón de forma estable con GFP o VISTA humano. Se incubaron con péptidos de ova y con linfocitos T DO11.10. La expresión de CD25 por parte de los linfocitos T se midió 24 horas después de iniciada la incubación. Las células A20-VISTAhu suprimen la expresión de CD25 por parte de los linfocitos T, pero esta lectura se restablece significativamente por incubación con VSTB95.
Figura 19A-19F: gráficos que muestran resultados de ELISA de VISTA humano.
Figura 20A-20F: resultados de FACS de VISTA humano, que muestran la unión de anticuerpos anti-VISTA a células que expresan VISTA humano.
Figura 21A-21D: estudio de dilución de 6 candidatos a anticuerpos anti-VISTA en la reacción de linfocitaria mixta de 30 |jg/ml a 0,0 jg/ml.
Figura 22A-22B: estudios de dilución de 6 candidatos a anticuerpos anti-VISTA en el ensayo de SEB (recuentos de CPM individuales y concentraciones de IFN-g) de 30 jg/ml a 0,0 jg/ml.
Figura 23: representación de sensograma que usa anticuerpo VSTB85 anti-VISTA revestido sobre un chip de SPR Proteon y proteína VISTA con los competidores indicados desarrollados sobre el chip (competidores enumerados en la Tabla 16).
Figura 24: diseño experimental para el modelo tumoral de vejiga murino MB49.
Figura 25A-25B: crecimiento tumoral MB49 en ratones hembra C57Bl/6. Los gráficos ilustran el crecimiento tumoral en ratones individuales tratados con anticuerpo anti-VISTA de ratón (Figura 25B) o IgG de control (Figura 25A).
Figura 26: secuencia de aminoácidos de VISTA humano (SEQ ID NO: 46).
Figura 27: alineamiento de secuencias múltiples de ortólogos de VISTA.
Figura 28: regiones de VISTA humano unido por anticuerpos VSTB50 y VSTB60 (parte superior) o anticuerpos VSTB95 y VSTB112 (parte inferior), tal como se determina por HDX.
Figura 29: epítopo de VISTA unido por VSTB112. (Parte superior) Se muestra VISTA como viñeta con hebras marcadas. Los restos que tienen al menos un átomo dentro de 5 A de VSTB112 en el complejo están coloreados de azul. Las esferas de colores azul y naranja resaltan una ruptura de cadena, y las esferas de colores azul verdoso y verde marcan los extremos N y C terminales de la estructura de VISTA, respectivamente. (Parte inferior) Secuencia del constructo de VISTA usado para determinar la estructura. Los círculos debajo de la secuencia se usan para indicar restos que solo hacen contactos de la cadena principal con VSTB112, los triángulos indican un contacto de la cadena lateral y los cuadrados indican que el contacto de la cadena lateral da como resultado un enlace de hidrógeno o interacción de puente salino tal como se calcula por PISA. Las formas están coloreadas para indicar la CDR que tiene el mayor número de átomos en contacto con el resto dado, con los colores de CDR definidos en la Figura 59. Los elementos estructurales secundarios son como se definen en el programa MOE con flechas de color amarillo que representan hebras p y rectángulos de color rojo que indican hélices a.
Figura 30: parátopo de VSTB112. (Parte superior) En la ilustración se muestra antígeno de VISTA y se muestra VSTB112 dentro de 5 angstrom (A) de VISTA en la superficie con colores usados para designar la identidad de CDR tal como se especifica en la secuencia que sigue a continuación. Los restos de marco de contacto adyacentes a una CDR están coloreados de forma similar a la CDR correspondiente. (Parte inferior) Secuencia de la región de Fv de VSTB112. Los fondos coloreados especifican las CDR de acuerdo con las definiciones de Kabat. Los círculos debajo de la secuencia se usan para indicar restos que hacen que la cadena principal solo contacte con VISTA, los triángulos indican un contacto de la cadena lateral y los cuadrados indican que el contacto de la cadena lateral da como resultado un enlace de hidrógeno o una interacción de puente salino tal como se calcula por PISA.
Figura 31: comparación de regiones epitópicas identificadas por cristalografía e intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX). Secuencia del constructo de VISTA usado para determinar la estructura. Los círculos debajo de las secuencias se usan para indicar restos que hacen que la cadena principal solo contacte con VSTB112, los triángulos indican un contacto de la cadena lateral y los cuadrados indican que el contacto de la cadena lateral da como resultado un enlace de hidrógeno o una interacción de puente salino tal como se calcula por PISA.
Figura 32: activación de monocitos CD14+ en PBMC completas por VSTB174 (derivado de VSTB112). En cada parte del experimento, las células se incubaron con PBS, anticuerpo de control IgG1, o VSTB174 a 1, 0,1 o 0,01 ug/ml. El panel izquierdo muestra MFI de CD80; el panel derecho muestra MFI de HLA-DR (dos donantes sometidos a ensayo con resultados representativos mostrados).
Figura 33: gráfico que muestra la actividad de ADCC de VSTB174 dirigido frente a células K562-VISTA.
Figura 34: gráfico que muestra la actividad de ADCP de VSTB174 dirigido frente a células K562-VISTA. Ambos anticuerpos representados tienen el mismo Fab, pero VSTB174 tiene un Fc de IgG1 y VSTB140 tiene Fc de IgG2 silenciosa.
Figura 35: gráfico que muestra fagocitosis mediada por los AcM, VSTB174, VSTB149 o VSTB140, frente a K562-VISTA. Cada AcM se sometió a ensayo con 7 dosis medias logarítmicas, que variaban de 0,0008 pg/ml a 0,56 ug/ml.
Figura 36: gráfico que muestra fagocitosis mediada por los AcM, VSTB174, VSTB149 o VSTB140, frente a células K562 de línea celular de mieloma. Cada AcM se sometió a ensayo con 7 dosis medias logarítmicas, que variaban de 0,0008 pg/ml a 0,56 ug/ml.
Figura 37: estudio de eficacia tumoral MB49 que evalúa 1, 5, 7,5 y 10 mg/kg de VSTB123 en ratones VISTA-KI hembra. Los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 50 mm3 cuando la dosificación comenzó el día 6 después del implante. VSTB123 es el Fab de VSTB112 injertado sobre un armazón de Fc de ratón y se une a VISTA humano en el ratón VISTA-KI.
Figura 38: gráfico muestra que las células CD14+ que expresan niveles altos/intermedios de VISTA se encuentran en 13/13 muestras de cáncer de pulmón, así como en tejido pulmonar distante y sangre periférica de pacientes.
Figura 39: tinción con IHC para VISTA en cáncer de pulmón usando GG8.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación sigue una descripción de realizaciones de la invención a modo de ejemplo.
La divulgación se refiere a anticuerpos frente al nuevo ligando de la familia de inmunoglobulinas denominado supresor de inmunoglobulina de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA (acrónimo del inglés: V-domain Immunoglobulin Suppressor of T cell Activation)) (Genbank: JN602184) (Wang et al., 2010, 2011). VISTA presenta homología con PD-L1 pero muestra un patrón de expresión único que está restringido al compartimiento hematopoyético. Específicamente, VISTA está constitutivamente y altamente expresado en células mieloides CD11balto, y está expresado a niveles menores en linfocitos T CD4+ y CD8+. El homólogo humano comparte aproximadamente un 85 % de homología con VISTA murino y tiene patrones de expresión similares (Lines et al., Cancer Research 74: 1924, 2014). VISTA, expresado en células presentadoras de antígenos (APC), suprime la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ y la producción de citoquinas a través de un receptor afín independiente de PD-1. En un modelo de enfermedad EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) pasiva, un anticuerpo monoclonal específico de VISTA aumentó las respuestas inmunitarias dependientes de linfocitos T y exacerbó la enfermedad. La sobreexpresión de VISTA en células tumorales deterioró la inmunidad antitumoral protectora en hospedadores portadores de tumores. Los estudios de VISTA humano confirmaron su función supresora en linfocitos T humanos (Lines et al., Cancer Research 74: 1924, 2014. Los estudios de Flies et al., también identificaron a VISTA (denominado PD-1H) como una molécula inmunosupresora potente (Flies et al., 2011). VISTA se describe con mayor detalle en el documento de solicitud de patente publicada de Estados Unidos US 20130177557 A1 y en los documentos de patente de Estados Unidos con N.os 7.919.585 y 8.236.304.
VISTA es un nuevo regulador de punto de control negativo que suprime respuestas inmunitarias. Como se describe en el Ejemplo 12, en el presente documento, se ha mostrado que el tratamiento con un anticuerpo monoclonal específico de VISTA en modelos de tumores murinos revierte el carácter supresor del microentorno inmunitario del tumor y aumenta la inmunidad antitumoral protectora, demostrando de ese modo el potencial de un anticuerpo monoclonal de VISTA como una nueva estrategia terapéutica para inmunoterapia del cáncer.
ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (AcM), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), así como fragmentos, regiones o derivados de los mismos, proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Los anticuerpos anti-VISTA de la presente invención son capaces de unirse a partes de VISTA que modulan, regulan o aumentan una respuesta inmunitaria. En el presente documento se desvelan, pero no se reivindican, anticuerpos que inhiben de forma competitiva uno o más de los anticuerpos anti-VISTA que se describen en el presente documento. En la técnica se conocen métodos para determinar si dos o más anticuerpos compiten por unirse a la misma diana. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de unión competitiva para determinar si un anticuerpo bloquea la unión de otro anticuerpo a la diana. Generalmente, un ensayo de unión competitiva implica el uso de antígeno diana purificado (por ejemplo, PD-1) unido a un sustrato sólido o células, una molécula de unión de ensayo sin marcar y una molécula de unión de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marca unida a la superficie sólida o a células en presencia de la molécula de unión de ensayo. Normalmente, la molécula de unión de ensayo está presente en exceso. Habitualmente, cuando una molécula de unión competidora está presente en exceso, inhibirá la unión específica de una molécula de unión de referencia a un antígeno común en al menos un 50-55 %, un 55-60 %, un 60-65 %, un 65-70 %, un 70-75 %, o más. La inhibición competitiva se puede determinar usando un ensayo ELISA de inhibición competitiva.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, población que contiene sitios de unión a epítopos sustancialmente similares. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante métodos conocidos por las personas con experiencia en la materia. Véase, por ejemplo Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); documento de Estados Unidos N.° 4.376.110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); y Harlow y Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede cultivar in vitro, in situ o in vivo.
También se desvelan, pero no se reivindican, fragmentos de digestión, partes específicas y variantes de los mismos, incluyendo miméticos de anticuerpo o que comprenden partes de anticuerpo que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento específico o parte del mismo, incluyendo anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antígeno que se unen a una proteína VISTA de mamífero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a VISTA o partes del mismo, incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de Fab (por ejemplo, por digestión con papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión con pepsina y reducción parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión con pepsina), facb (por ejemplo, por digestión con plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión con pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular), están incluidos en la invención (véase, por ejemplo, Colligan, Immunology, mencionado anteriormente). Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención también incluyen los que se discuten y se describen en Aaron L. Nelson, mAbs 2: 1, 77-83 (enero/febrero de 2010).
Tales fragmentos se pueden producir, por ejemplo, mediante técnicas de escisión enzimática, sintéticas o recombinantes, tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los que se han introducido uno o más codones de parada cadena arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen de combinación que codifica una parte de la cadena pesada de F(ab')2 para que incluya secuencias de ADN que codifiquen el dominio CH1 y/o región bisagra de la cadena pesada. Las diversas partes de anticuerpo se pueden unir por vía química mediante técnicas convencionales, o se pueden preparar como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética.
En el presente documento también se desvelan, pero no se reivindican, secuencias de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina, o parte de la misma (por ejemplo, región variable, CDR) que tiene aproximadamente un 70­ 99 % de identidad (por ejemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o cualquier intervalo o valor entre los mismos) con la secuencia de aminoácidos de la cadena de secuencia variable correspondiente que se describe en el presente documento. Preferentemente, la identidad de aminoácidos de un 70-99 % (por ejemplo, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o cualquier intervalo o valor entre los mismos) se determina usando un algoritmo informático adecuado, como se conoce en la técnica.
En el presente documento se proporcionan ejemplos de secuencias de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera.
Los anticuerpos de la presente invención, o variantes especificadas de los mismos, pueden comprender cualquier número de restos de aminoácido contiguos de un anticuerpo de la presente invención, en donde ese número se selecciona entre el grupo de números enteros que consiste en un 10-100 % del número de restos contiguos en un anticuerpo anti-TNF. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos tiene una longitud de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o más aminoácidos, o cualquier intervalo o valor entre los mismos. Además, el número de tales subsecuencias puede ser cualquier número entero seleccionado entre el grupo que consiste en 1 a 20, tal como al menos 2, 3, 4 o 5.
Como apreciarán los expertos, la presente invención incluye al menos un anticuerpo biológicamente activo de la presente invención. Los anticuerpos biológicamente activos tienen una actividad específica de al menos un 20 %, un 30 %, o un 40 %, y preferentemente al menos un 50 %, un 60 %, o un 70 %, y lo más preferentemente al menos un 80 %, un 90 %, o un 95 %-100 % del anticuerpo nativo (no sintético), endógeno correlacionado y conocido. Las personas con experiencia en la materia conocen bien algunos métodos para someter a ensayo y cuantificar medidas de actividad enzimática y especificidad de sustrato.
Similitud sustancial se refiere a un compuesto que tiene al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 95 %) de identidad y al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 95 %) de actividad del anticuerpo nativo (no sintético), endógeno o relacionado y conocido.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente cada parte de la proteína (por ejemplo, CDR, marco, CL, dominios CH (por ejemplo, CH1, c H2, CH3), bisagra, (VL, VH)) es sustancialmente no inmunogénico en seres humanos, solo con cambios o variaciones de secuencia menores. De forma similar, los anticuerpos designados como primate (mono, babuino, chimpancé y similares), roedores (ratón, rata y similares) y otros mamíferos designan tales anticuerpos específicos de especie, subgénero, género, subfamilia y familia. Además, los anticuerpos quiméricos pueden incluir cualquier combinación de los mencionados anteriormente. Tales cambios o variaciones retienen o reducen opcional y preferentemente la inmunogenicidad en seres humanos u otras especies con respecto a anticuerpos no modificados. Por lo tanto, un anticuerpo humano es distinto de un anticuerpo quimérico o humanizado. Se señala que una célula animal no humana o procariota o eucariota que es capaz de expresar genes de inmunoglobulina humana funcionalmente reorganizados (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera) puede producir un anticuerpo humano. Además, cuando un anticuerpo humano es un anticuerpo monocatenario, puede comprender un péptido conector que no se encuentre en anticuerpos humanos nativos. Por ejemplo, un Fv puede comprender un péptido conector, tal como de dos a aproximadamente ocho restos de glicina u otros aminoácidos, que conecta la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Se considera que tales péptidos conectores son de origen humano.
También se pueden usar anticuerpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados o similares que son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para al menos una proteína VISTA, la otra es para cualquier otro antígeno. En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se puede basar en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Véase también el documento de patente WO 93/08829, los documentos de patente de Estados Unidos con N.os 6.210.668, 6.193.967, 6.132.992, 6.106.833, 6.060.285, 6.037.453, 6.010.902, 5.989.530, 5.959.084, 5.959.083, 5.932.448, 5.833.985, 5.821.333, 5.807.706, 5.643.759, 5.601.819, 5.582.996, 5.496.549, 4.676.980, documento de patente WO 91/00360, documento de patente WO 92/00373, documento de patente EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que tiene a VISTA como diana, como se define en las reivindicaciones adjuntas, y una segunda proteína diana (por ejemplo, una proteína de punto de control inmunitario), tales anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo incluyen un anticuerpo biespecífico que tiene a VISTA y PD-L1 como dianas y un anticuerpo biespecífico que tiene a VISTA y PD-L2 como dianas.
Los anticuerpos humanos que son específicos para proteínas VISTA humanas o fragmentos de las mismas se pueden generar frente a un antígeno inmunogénico apropiado, tal como proteína VISTA o una parte de la misma (incluyendo moléculas sintéticas, tales como péptidos sintéticos).
De forma similar, se pueden generar otros anticuerpos de mamífero específicos o generales. La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales se pueden llevar a cabo usando cualquier técnica adecuada.
Por ejemplo, un hibridoma se produce mediante la fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como, pero sin limitarse a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, o similares, o heteromilomas, productos de fusión de los mismos, o cualquier célula o célula de fusión derivada de las mismas, o cualquier otra línea celular adecuada conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, www.atcc.org, con células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos pueden incluir bazo aislado o clonado, sangre periférica, linfa, amígdalas u otras células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos B), o cualquier otra célula que exprese secuencias constantes o variables o marco o de región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera o pesada. Tales células productoras de anticuerpos pueden ser células recombinantes o endógenas, y también pueden ser procarióticas o eucarióticas (por ejemplo, de mamífero, tales como, roedores, equinos, ovinos, caprinos, ovejas, primates). Véase, por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente, y Colligan, Immunology, mencionado anteriormente, capítulo 2.
Las células productoras de anticuerpos también se pueden obtener a partir de la sangre periférica o, preferentemente, del bazo o de los ganglios linfáticos, de seres humanos u otros animales adecuados que se hayan inmunizado con el antígeno de interés. También se puede usar cualquier otra célula hospedadora adecuada para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifique un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente invención. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas u otros métodos conocidos adecuados, y pueden clonarse mediante dilución limitante o clasificación celular, u otros métodos conocidos. Se pueden seleccionar células que producen anticuerpos con la especificidad deseada mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA)).
Para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida se pueden usar otros métodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, métodos que seleccionan anticuerpos recombinantes de una biblioteca de péptidos o proteínas (por ejemplo, pero sin limitarse a, un bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN, ADNc, o similares, biblioteca de presentación; por ejemplo, tal como está disponible en Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Escocia, Reino Unido; Bioinvent, Lund, Suecia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/U594/1234; WO92/18619; WO96/07754; EP 614 989; WO95/16027; WO88/06630; WO90/3809; documento de patente de Estados Unidos con N.° 4.704.692; documentos de patente PCT/US91/02989; WO89/06283; EP 371 998; EP 550400; EP 229046; PCT/US91/07149; o péptidos o proteínas generados de forma estocástica -- documentos de patente de Estados Unidos con N.os 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862; WO 86/05803, EP 590689, o que dependen de la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol.
16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998)) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se conoce en la técnica y/o como se describe en el presente documento. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, presentación de ribosomas (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (mayo de 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14130-14135 (noviembre de 1998)); tecnologías de producción de anticuerpos de una sola célula (documento de patente de Estados Unidos con N.° 5.627.052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 (1996)); microgotita de gel y citometría de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8: 333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, Mass.; Gray et al., J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selección de linfocitos B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Países Bajos (1988)).
También se pueden usar métodos para diseñar por ingeniería o humanizar anticuerpos no humanos o humanos y se conocen bien en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado o diseñado tiene uno o más restos de aminoácido de una fuente que no es humana, por ejemplo, pero sin limitarse a, ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. A menudo, estos restos de aminoácido humanos se denominan restos "importados", que se toman generalmente de un dominio variable, constante u otro dominio "importado" de una secuencia humana conocida. Algunas secuencias de Ig humana conocidas se desvelan, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html.
Tales secuencias importadas se pueden usar para reducir la inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar la unión, afinidad, avidez, especificidad, semivida o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en la técnica. Generalmente, parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que parte o la totalidad de las secuencias no humanas de las regiones marco y/o constantes se reemplazan con aminoácidos humanos u otros aminoácidos. Los anticuerpos también se pueden humanizar opcionalmente con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables usando modelos tridimensionales de inmunoglobulinas que conocen las personas con experiencia en la materia. Existen programas informáticos disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los restos de marco (FR) se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias consenso e importadas para lograr la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los restos de CDR están directa y sustancialmente implicados en la influencia de la unión a antígeno. La humanización o diseño por ingeniería de anticuerpos de la presente invención se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido, tal como, pero sin limitarse a, los que se describen, por ejemplo, en Winter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), documentos de patente de Estados Unidos con N.os 5.723.323, 5.976862, 5.824514, 5.817483, 5.814476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567.
El anticuerpo anti-VISTA también se puede generar opcionalmente por inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, primate no humano y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la técnica. Las células que producen un anticuerpo anti-VISTA humano se pueden aislar de dichos animales e inmortalizar usando métodos adecuados, tales como los métodos que se describen en el presente documento.
Se pueden producir animales transgénicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a antígenos humanos mediante métodos conocidos (por ejemplo, pero sin limitarse a, documentos de patente de Estados Unidos con N.os 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 y 5.789.650 asignados a Lonberg et al.; Jakobovits et al., documento de patente WO 98/50433, Jakobovits et al., documento de patente WO 98/24893, Lonberg et al., documento de patente WO 98/24884, Lonberg et al., documento de patente WO 97/13852, Lonberg et al., documento de patente Wo 94/25585, Kucherlapate et al., documento de patente WO 96/34096, Kucherlapate et al., documento de patente EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al., documento de patente EP 0710 719 A1, Surani et al., documento de patente de Estados Unidos con N.° 5.545.807, Bruggemann et al., documento de patente WO 90/04036, Bruggemann et al., documento de patente EP 0438 474 B1, Lonberg et al., documento de patente EP 0814 259 A2, Lonberg et al., documento de patente GB 2 272 440 A, Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) , Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1): 65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7): 845-851 (1996)). Generalmente, estos ratones comprenden al menos un transgén que comprende ADN de al menos un locus de inmunoglobulina humana que está funcionalmente reordenado, o que puede sufrir un reordenamiento funcional. Los locus de inmunoglobulina endógenos en dichos ratones se pueden alterar o experimentar deleción para eliminar la capacidad del animal para producir anticuerpos codificados por genes endógenos.
La identificación sistemática de anticuerpos para unión específica a proteínas o fragmentos similares se puede lograr de forma conveniente usando bibliotecas de presentación de péptidos. Este método implica la identificación sistemática de grandes colecciones de péptidos para miembros individuales que tengan la función o estructura deseada. La selección de anticuerpos de bibliotecas de presentación de péptidos se conoce bien en la técnica. Las secuencias peptídicas presentadas pueden tener una longitud de 3 a 5000 o más aminoácidos, con frecuencia una longitud de 5 a 100 aminoácidos y, a menudo, una longitud de de aproximadamente 8 a 25 aminoácidos. Además de los métodos de síntesis química directa para generar bibliotecas peptídicas, se han descrito varios métodos de ADN recombinante. Un tipo implica la presentación de una secuencia peptídica en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia peptídica presentada en particular. Tales métodos se describen en las publicaciones de patente PCT con N.os 91/17271, 91/18980, 91/19818, y 93/08278. Otros sistemas para generar bibliotecas peptídicas tienen aspectos tanto de síntesis química in vitro como de métodos recombinantes. Véanse, publicaciones de patente PCT con N.os 92/05258, 92/14843, y 96/19256. Véanse también los documentos de patente de Estados Unidos con N.os 5.658.754; y 5.643.768. Algunas bibliotecas de presentación de péptidos, vectores y kits de identificación sistemática están disponibles en el mercado en proveedores tales como Invitrogen (Carlsbad, Calif.), y Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Véanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos con N.os 4.704.692, 4.939.666, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030, 5.518.889, 5.534.621, 5.656.730, 5.763.733, 5.767.260, 5.856.456; 5.223.409, 5.403.484, 5.571.698, 5.837.500, asignados a Dyax, 5.427.908, 5.580.717; 5.885.793, asignados a Cambridge antibody Technologies; 5.750.373, asignados a Genentech, 5.618.920, 5.595.898, 5.576.195, 5.698.435, 5.693.493, and 5.698.417.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden preparar usando al menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-VISTA para proporcionar animales transgénicos, tales como cabras, vacas, ovejas y similares, que producen tales anticuerpos en su leche. Tales animales se pueden proporcionar usando métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, pero sin limitarse a, los documentos de patente de Estados Unidos con N.os 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489, y similares.
Los anticuerpos anti-VISTA de la presente invención también se pueden producir usando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos. Véase también, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (octubre, 1999), Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994).
Los anticuerpos de la invención se pueden unir a VISTA humano con una amplia gama de afinidades (Kd). En una realización preferente, al menos un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se puede unir opcionalmente a VISTA humano con alta afinidad. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano se puede unir a VISTA humano con una Kd igual o inferior a aproximadamente 10'7 M, tal como, pero sin limitarse a, 0,1-9,9 (o cualquier intervalo o valor entre los mismos) x 10'7, 10'8, 10'9, 10'10, 10-11, 10'12, 10'13 o cualquier intervalo o valor entre los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede unir a VISTA humano con una afinidad de al menos 1 x 10'7 litros/mol, por ejemplo, al menos 1 x 10'8 litros/mol, por ejemplo, al menos 1 x 10'9 litros/mol.
La afinidad o avidez de un anticuerpo para un antígeno se puede determinar de forma experimental usando cualquier método adecuado. (Véanse, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman y Company: Nueva York, N.Y. (1992); y métodos que se describen en el presente documento). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno en particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración salina, pH). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (por ejemplo, Kd, Ka, Kd) se realizan preferentemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.
MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO
Usando la información proporcionada en el presente documento, tal como las secuencias nucleotídicas que codifican al menos un 70-100 % de los aminoácidos contiguos de al menos uno de los fragmentos, variantes o secuencias consenso especificados de los mismos, o un vector depositado que comprende al menos una de estas secuencias, se puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente invención, como se define en las reivindicaciones, que codifica al menos un anticuerpo anti-VISTA que comprende todas las regiones CDR variables de cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y/o todas las regiones CDR variables de cadena ligera de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 usando métodos que se describen en el presente documento o tal como se conoce en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNnh, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, que incluye, pero no se limita a, ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El a Dn puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier parte de al menos una hebra de ADN o ARN puede ser la hebra codificante, también conocida como hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, también denominada hebra antisentido.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificante de un anticuerpo o fragmento anti-VISTA, por ejemplo, un fragmento que comprende una región variable; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican al menos un anticuerpo anti-VISTA como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la técnica. Para una persona con experiencia en la materia podría ser rutinario generar tales variantes de ácido nucleico degeneradas que codifiquen anticuerpos anti-VISTA específicos de la presente invención. Véase, por ejemplo, por ejemplo, Ausubel, et al., mencionado anteriormente, y tales variantes de ácido nucleico están incluidas en la presente invención.
Como se indica en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-VISTA pueden incluir, pero no se limitan a, las que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento de anticuerpo; la secuencia codificante del anticuerpo completo o de una parte del mismo; la secuencia codificante de un anticuerpo, fragmento o parte, así como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un péptido líder de señal o péptido de fusión, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como al menos un intrón, junto con secuencias no codificantes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias no traducidas y transcritas que desempeñan un papel en la transcripción, procesamiento de ARNm, que incluye señales de corte y empalme y poliadenilación (por ejemplo -- unión al ribosoma y estabilidad del ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, la secuencia que codifica un anticuerpo se puede fusionar con una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento o parte de anticuerpo.
Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos, fragmentos y regiones de la presente invención se pueden derivar de una biblioteca de hígado fetal humano, mediante métodos conocidos. Los genes de las regiones C humanas se pueden derivar de cualquier célula humana, incluyendo las que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región Ch humana se puede derivar de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de cadenas H humanas, que incluyen y, M, a, 8 o y subtipos de las mismas, tales como G1, G2, G3 y G4. Dado que el isotipo de la cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región Ch estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación de complementos o actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
COMPOSICIONES
Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento se preparan de acuerdo con procedimientos estándar y se administran en dosificaciones que se seleccionan para tratar, por ejemplo, reducir, prevenir o eliminar, o para retrasar o detener la progresión de la afección que se está tratando (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, y Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y., para una descripción general de los métodos para administrar diversos agentes para terapia humana). Las composiciones que comprenden los anticuerpos y agentes desvelados se pueden administrar usando sistemas de liberación controlada o sostenida (por ejemplo, cápsulas, matrices biodegradables). Algunos ejemplos de sistemas de administración de liberación retardada para la administración de fármacos que podrían ser adecuados para la administración de las composiciones de los compuestos desvelados se describen, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos con N.os US 5.990.092; 5.039.660; 4.452.775; y 3.854.480.
Para preparar composiciones farmacéuticas a partir de los anticuerpos y/o fragmentos anti-VISTA de la presente invención, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden estar en forma de polvo para reconstitución en el momento de la administración. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes de disgregación de comprimidos o un material de encapsulación. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se mezcla con el ingrediente activo finamente dividido.
Los polvos y comprimidos contienen preferentemente de aproximadamente un uno a aproximadamente un setenta por ciento del ingrediente activo. Algunos vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, caboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los comprimidos, polvos, sellos, pastillas para chupar, tiras de fusión rápida, cápsulas y píldoras se pueden usar como formas de dosificación sólidas que contienen el ingrediente activo adecuado para administración oral.
Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones, enemas de retención y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones acuosas de propilenglicol. Para inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución en solución acuosa de polietilenglicol.
La composición farmacéutica se puede presentar en forma de dosificación unitaria. De tal forma, la composición se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del ingrediente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades separadas de dosis unitarias. Las dosificaciones pueden variar dependiendo de los requisitos del paciente, la gravedad de la afección que se está tratando, el compuesto y la vía de administración que se está empleando. La determinación de la dosificación apropiada para una situación en particular está dentro de los conocimientos de la técnica.
Además, la composición farmacéutica puede contener, si se desea, otros agentes compatibles, por ejemplo, agentes farmacéuticos, terapéuticos o profilácticos. Los agentes terapéuticos o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas. Algunos ejemplos de las clases de tales agentes (por ejemplo, agentes anticáncer) incluyen, pero no se limitan a, citotoxinas, inhibidores de la angiogénesis, agentes inmunomoduladores, agentes inmunooncológicos y agentes usados para proporcionar alivio para el dolor o para contrarrestar los efectos nocivos perjudiciales de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, uso de bisfosfonatos para reducir los efectos hipercalcémicos de los glucocorticoides).
Algunos inhibidores de la angiogénesis, agentes y terapias que son adecuados para uso en las composiciones y usos que se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, angiostatina (fragmento de plasminógeno); antitrombina III antiangiogénica; angiozima. Los bisfosfonatos incluyen, pero no se limitan a, alendronato, clodronato, etidronato, ibandronato, pamidronato, risedronato, tiludronato y zoledronato.
Los agentes inmunomoduladores y terapias que son adecuados para uso en las composiciones y usos que se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-receptor de linfocitos T, tales como anticuerpos anti-CD3 (por ejemplo, Nuvion (Protein Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), o anticuerpos anti-CD20 Rituxan (IDEC)), anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticuerpos anti-CD1 1a (por ejemplo, Xanelim (Genentech)); anti-citoquina o anticuerpos receptores anti-citoquina y antagonistas tales como anticuerpos receptores anti-IL-2 (Zenapax (Protein Design Labs)), anticuerpos receptores anti-IL-6 (por ejemplo, MRA (Chugai)), y anticuerpos anti-IL-12 (CNTO1275(Janssen)), anticuerpos anti-TNFalfa (Remicade (Janssen)) o antagonista del receptor de TNF (Enbrel (Immunex)), anticuerpos anti-IL-6 (BE8 (Diaclone) y siltuximab (CNTO32 (Centocor)), y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a antígenos asociados a tumores (por ejemplo, trastuzimab (Genentech)).
Algunos agentes de inmunooncología que son adecuados para uso en las composiciones y usos que se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, ipilimumab (anti-CTLA-4), nivolumab (anti-PD-1), pembrolizumab (anti-PD-1), anticuerpos anti-PD-Ll, y anticuerpos anti-LAG-3.
La composición se prepara preferentemente en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento. Algunos ejemplos de unidades de dosificación son comprimidos y cápsulas. Para fines terapéuticos, los comprimidos y cápsulas pueden contener, además del ingrediente activo, vehículos convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo, goma arábiga, gelatina, polivinilpirrolidona, sorbitol o tragacanto; cargas, por ejemplo, fosfato de calcio, glicina, lactosa, almidón de maíz, sorbitol o sacarosa; lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, polietilenglicol, sílice o talco; agentes disgregantes, por ejemplo, almidón de patata, agentes saborizantes o colorantes, o agentes humectantes aceptables. Las preparaciones líquidas orales generalmente en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes no acuosos, conservantes, colorantes y aromatizantes. Algunos ejemplos de aditivos para preparaciones líquidas incluyen goma arábiga, aceite de almendras, alcohol etílico, aceite de coco fraccionado, gelatina, jarabe de glucosa, glicerina, grasas comestibles hidrogenadas, lecitina, metilcelulosa, parahidroxibenzoato de metilo o propilo, propilenglicol, sorbitol o ácido sórbico.
En la técnica se conocen bien otros detalles generales con respecto a métodos de preparación y uso de los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento. Véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos con N.° 7.820.169.
TRATAMIENTOS
Alguien con experiencia en la materia, por ejemplo, un médico, puede determinar la dosificación y la vía de administración adecuadas para un anticuerpo, fragmento o composición en particular para administración a un individuo, teniendo en cuenta los agentes elegidos, la formulación farmacéutica y la vía de administración, diversos factores del paciente y otras consideraciones. Preferentemente, la dosificación no causa o produce efectos secundarios adversos mínimos o nulos. En los regímenes estándar de dosis múltiples, un agente farmacológico se puede administrar en un programa de dosificación diseñado para mantener una concentración plasmática determinada previamente u óptima en el sujeto que se somete al tratamiento. Los anticuerpos, fragmentos y composiciones se pueden añadir en cualquier intervalo de dosificaciones apropiado o cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10,0 mg/kg, 11,0 mg/kg, 12,0 mg/kg, 13,0 mg/kg, 14,0 mg/kg, 15,0 mg/kg, 16,0 mg/kg, 17.0 mg/kg, 18,0 mg/kg, 19,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg y 100 mg/kg. En una realización, la dosificación de la composición, anticuerpo o fragmento administrados es 0,1-15 mg/kg por administración.
El anticuerpo o fragmento se puede administrar una vez, al menos una vez, dos veces, al menos dos veces, tres veces, o al menos tres veces al día. El anticuerpo o fragmento se puede administrar una vez, al menos una vez, dos veces, al menos dos veces, tres veces, al menos tres veces, cuatro veces, al menos cuatro veces, cinco veces, al menos cinco veces, seis veces a la semana, o al menos seis veces a la semana. El anticuerpo o fragmento se puede administrar una vez al mes, al menos una vez al mes, dos veces al mes, al menos dos veces al mes, tres veces al mes o al menos tres veces al mes. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede administrar una vez al año, al menos una vez al año, dos veces al año, al menos dos veces al año, tres veces al año, al menos tres veces al año, cuatro veces al año, al menos cuatro veces al año, cinco veces al año, al menos cinco veces al año, seis veces al año o al menos seis veces al año.
Los anticuerpos, fragmentos y composiciones anti-VISTA se pueden administrar, por ejemplo, a través de medios parenterales o no parenterales, que incluyen, pero no se limitan a, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía oral, por vía rectal, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía transmucosal, por vía transdérmica, por vía intratecal, por vía nasal o por vía tópica. Alguien con una experiencia habitual en la materia reconocerá que las siguientes formas de dosificación pueden comprender, como ingrediente activo, compuestos o una sal farmacéuticamente aceptable correspondiente de un compuesto de la presente invención. En algunas realizaciones, las formas de dosificación pueden comprender, como ingrediente activo, un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable correspondiente de un compuesto.
Los anticuerpos anti-VISTA de la invención se pueden administrar como parte de una terapia de combinación (por ejemplo, entre sí, o con uno u otros agentes terapéuticos más). Los compuestos de la invención se pueden administrar antes, después o al mismo tiempo que uno u otros agentes terapéuticos más. En algunas realizaciones, un compuesto de la invención y otro agente terapéutico se pueden coadministrar de forma simultánea (por ejemplo, al mismo tiempo) como formulaciones separadas o como una formulación conjunta. Alternativamente, los agentes se pueden administrar de forma secuencial, como composiciones separadas, dentro de un marco de tiempo apropiado, tal como lo determine el médico experto (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir una superposición de los efectos farmacéuticos de las terapias). Un compuesto de la invención y uno u otros agentes terapéuticos más se pueden administrar en una dosis única o en dosis múltiples, en un orden y en un programa adecuado para lograr un efecto terapéutico deseado.
La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o composición como se define en las reivindicaciones adjuntas para uso en la modulación o el tratamiento de al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente. En algunas realizaciones, los compuestos y composiciones de la presente invención se usan para tratar o prevenir el cáncer. El cáncer puede incluir cualquier tumor maligno o benigno de cualquier órgano o sistema corporal. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: cánceres de mama, digestivo/gastrointestinal, endocrino, neuroendocrino, ocular, genitourinario, de células germinales, ginecológico, de cabeza y cuello, hematológico/sanguíneo, musculoesquelético, neurológico, respiratorio/torácico, vejiga, colon, rectal, pulmón, endometrio, riñón, pancreático, hígado, estómago, testicular, esófago, próstata, cerebro, cuello uterino, ovario y tiroides. Otros cánceres pueden incluir leucemias, melanomas, y linfomas, y cualquier cáncer que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor sólido está infiltrado con células mieloides y/o linfocitos T. En algunas realizaciones, el cáncer es una leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásico y/o mieloma. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser cualquier clase o tipo de leucemia, incluyendo una leucemia linfocítica o una leucemia mielógena, tal como, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia de linfocitos grandes granulares, o leucemia de linfocitos T del adulto. En algunas realizaciones, el linfoma es un linfoma histocítico, linfoma folicular o linfoma de Hodgkin, y, en algunas realizaciones, el cáncer es un mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo, un melanoma, o cáncer de vejiga. En una realización particular, el cáncer es un cáncer de pulmón, tal como un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o composición, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, para uso en la modulación o el tratamiento de al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos uno de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de linfocitos B, linfocitos T o FAB, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de neoplasia maligna, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, reabsorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer y similares. En algunas realizaciones, el tumor sólido está infiltrado con células mieloides y/o linfocitos T. En una realización particular, el tumor sólido es un cáncer de pulmón, tal como un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
En algunas realizaciones, los compuestos y terapias de la invención se coadministran con una vacuna (tal como una vacuna de vector viral, vacuna bacteriana, vacuna basada en células, vacuna de ADN, vacuna de ARN, vacuna peptídica o vacuna proteica). En la técnica se conocen bien tales vacunas. Véase, por ejemplo, Jeffrey Schlom, "Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward", J Natl Cancer Inst; 104: 599-613 (2012).
En algunas realizaciones, los compuestos y terapias de la invención se coadministran con agentes de quimioterapia, terapias hormonales y terapias biológicas, y/o bisfosfonatos. En algunas realizaciones, el agente o agentes para quimioterapia incluyen uno o más de los siguientes: arboplatino (Paraplatin), cisplatino (Platinol, Platinol-AQ), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), doxorrubicina (Adriamycin), etopósido (VePesid), fluorouracilo (5-FU), gemcitabina (Gemzar), irinotecán (Camptosar), paclitaxel (Taxol), topotecán (Hycamtin), vincristina (Oncovin, Vincasar PFS), vinblastina (Velban).
En otras realizaciones, los compuestos anti-VISTA y terapias de la invención se coadministran con uno o más anticuerpos de punto de control inmunitario, tales como, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab, tremelimumab, ipilimumab, anticuerpo anti-PD-Ll, anticuerpo anti-PD-L2, anticuerpo anti-TIM-3, anti-LAG-3v, anticuerpo anti-OX40 y anticuerpo anti-GITR.
En otra realización los compuestos y terapias anti-VISTA se coadministran con un inhibidor de molécula pequeña de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO).
Los compuestos anti-VISTA y composición de la invención se pueden administrar a un sujeto que lo necesita para prevenir (incluyendo la prevención de la recurrencia del cáncer) o tratar (por ejemplo, gestionar o mejorar un cáncer o uno o más síntomas del mismo) el cáncer. Cualquier agente o terapia (por ejemplo, quimioterapias, radioterapias, terapias dirigidas, tales como imatinib, sorafenib y vemurafenib, terapias hormonales, y/o terapias biológicas o inmunoterapias) que se sabe que es útil, o que se ha usado o se usa actualmente para la prevención, tratamiento, gestión o mejora del cáncer o uno o más síntomas del mismo se puede usar en combinación con un compuesto o composición de la invención que se describe en el presente documento. Algunos agentes anticáncer, incluyen, pero no se limitan a: 5-fluoruracilo; acivicina; aldesleukina; altretamina; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastato; bicalutamida; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleuquina II (incluyendo la interleuquina II recombinante, o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-m; interferón alfa-n3; interferón beta-I a; interferón gamma-I b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; ormaplatino; paclitaxel; pegaspargasa; porfromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; rogletimida; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; esparsomicina; espiromustina; espiroplatino; estreptongrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; topotecán; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorrubicina. Las terapias dirigidas incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de tirosina quinasa (por ejemplo, imatinib, sorafenib y vemurafenib). La invención también incluye la administración de un compuesto anti-VISTA de la invención en combinación con radioterapia que comprende el uso de rayos X, rayos gamma y otras fuentes de radiación para destruir las células cancerosas. En la técnica se conocen algunos tratamientos para el cáncer y se han descrito en bibliografía tal como Physician's Desk Reference (57a ed., 2003).
Los anticuerpos anti-VISTA que se describen en el presente documento también son útiles, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas crónicas, tales como VIH, VHB, VHC y VHS, entre otras.
En las Tablas 1A, 1B y 2 del presente documento se proporciona información sobre diversas propiedades y secuencias para seleccionar anticuerpos anti-VISTA.
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Tabla 1B: Secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-VISTA humano, totalmente humanos o humanizados seleccionados
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Tabla 2: Constante de disociación Kd ara anticuer os anti-VISTA seleccionados
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EJEMPLOS EJEMPLO 1: ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE VISTA EN CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS HUMANAS Métodos:
Preparación y tinción de las PBMC humanas recién preparadas para expresión de VISTA
La expresión de VISTA se sometió a ensayo en PBMC (células mononucleares de sangre periférica) humanas recién aisladas de varios donantes. Para la tinción se usó biotina anti-VISTA humano (GA-1) (5 |jg/ml). Como control de isotipo se usó K-biotina, IgG1 de ratón, (Clon MOPC-21 a 5 jg/ml).
Material de donante
Las muestras de sangre se obtuvieron en Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) y se recogieron y analizaron el mismo día. Se enviaron por mensajería 10 ml de sangre completa que contenía sulfato de heparina para su análisis. Preparación de la muestra
La sangre se diluyó a 1:1 en PBS estéril. Se depositaron en capas 22 ml de sangre de cordón diluida sobre 20 ml de Ficoll-Hypaque estéril (GE Healthcare n.° de Cat. 17-144003) en tubos cónicos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 1800 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares en la interfaz después de la centrifugación se obtuvieron usando una pipeta de 1 ml y se combinaron en dos tubos cónicos de 50 ml. Se añadió PBS estéril a cada tubo para aumentar el volumen hasta 50 ml y las células se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartó. Las células se resuspendieron en 50 ml de PBS estéril y los tubos se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartó. Las células se combinaron y se resuspendieron en 50 ml de PBS estéril antes del recuento.
Protocolo de tinción: se usó un vial congelado que contenía 5 x 107 PBMC para los controles de compensación y como control para la tinción.
Se usaron los siguientes reactivos y/o consumibles:
Tampón de tinción para FACS (BSA) de BD Biosciences (n.° de Cat. 554657) suplementado con EDTA al 0,2 %; solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco n.° de cat. 14190); placa de fondo redondo de polipropileno de 96 pocillos (BD n.° 3077); tubos de agrupación de polipropileno de 1,2 ml (Coming n.° 4451); clon Ga -1 anti-VISTA biotinado de ImmunoNext n.° de lote 080612B (usado a 5 pg/ml); control de isotipo K, mIgG1 biotinada (Clon MOPC-21); Biolegend n.° de cat. 400104, n.° de lote B116649 (usado a 5 pg/ml); anticuerpos anti-humanos (véase la tabla de tinción que sigue a continuación); colorante vivo/muerto de infrarrojo cercano (Invitrogen, n.° de cat. L10119); y reactivos de estreptavidina que incluyen STP-APC (BD Biosciences n.° de cat. 554067, n.° de lote 04251) (usado a una dilución de 1:200 en tampón para FACS), STP-PE (Biolegend n.° de cat. 405203, n.° de lote B139688) (usado a una dilución de 1:200 en tampón para FACS), STP-PE Cy7 (mostró una unión no específica en muestras de control de isotipo), STP-Q605 (Invitrogen n.° de cat. Q10101MP, n.° de lote 53449A) (usado a una dilución de 1:200 en tampón para FACS).
Protocolo de tinción de superficie celular
Antes de la tinción, se transfirieron 1 x 106 células a placas de fondo redondo de 96 pocillos y se lavaron con 150 pl de PBS. A continuación, las placas se centrifugaron a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos.
Posteriormente, las células se lavaron de nuevo en PBS y se centrifugaron como se ha descrito anteriormente. A continuación, se llevó a cabo la tinción vivo/muerto en 50 pl de PBS que contenían 0,25 pl de colorante vivo/muerto de infrarrojo cercano. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron con 150 pl de tampón de tinción para FACS y se centrifugaron a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos. El sobrenadante se descartó.
Las células se bloquearon con suero humano a 1:100 en 50 pl de tampón de tinción para FACS. Las placas se incubaron a 4 °C durante 15 minutos. A continuación, los pocillos se lavaron con 150 pl de tampón de tinción para FACS y se centrifugaron a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos. El sobrenadante se descartó.
A continuación, se añadió un cóctel que contenía los siguientes anticuerpos a cada pocillo para tinción superficial: los cócteles se describen en las Tablas 3-6 que siguen a continuación. Cada cóctel se podría utilizar por separado de los demás dependiendo de las poblaciones de interés.
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Después de la tinción superficial, las células se lavaron dos veces como se ha descrito anteriormente con tampón de tinción FACS y se centrifugaron a 1300 rpm a 4 °C durante 5 minutos. Las muestras se resuspendieron en 50 j l de tampón de tinción para FACS que contenía la estreptavidina marcada con fluorescencia apropiada. Las muestras se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron con 150 j l de tampón de tinción para FACS y se centrifugaron a 1300 rpm a 4 °C durante 5 minutos. Esta etapa de lavado se repitió antes de resuspender las muestras en 250 j l de tampón de tinción para FACS. Las muestras se analizaron en un analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences) el mismo día.
Análisis de datos
Los datos de citometría de flujo se volvieron a analizar usando versión 9 del software FlowJo para seleccionar poblaciones fenotípicas específicas. La enumeración de la media geométrica se usó para comparar la expresión de VISTA en diferentes subconjuntos celulares. Cada población se normalizó para el fondo restando los valores de control de isotipo de los valores medios de las muestras tratadas con anti-VISTA. Los gráficos se prepararon en Prism y las estadísticas se llevaron a cabo usando el ensayo T de Student si se comparaban solo dos muestras, o ANOVA unilateral con ensayos posteriores de Bonferroni.
Resultados:
Expresión de VISTA en subconjuntos linfoides y mieloides humanos:
Como se muestra en las Figuras 2A-2E, 3A-3G, 4, 5A-5B y 6A-6C, la expresión de VISTA en monocitos CD14+ fue significativamente diferente a la de las demás poblaciones (p < 0,001). No se observaron diferencias significativas entre otras poblaciones. Los monocitos expresaron los niveles de VISTA más altos en sangre periférica, teniendo el subconjunto CD14+CD16' una expresión significativamente mayor que las células CD14bajoCD16+. Aunque las APC mostraron una expresión moderada de VISTA, los subconjuntos linfoides mostraron niveles de expresión menores. Expresión de VISTA en subconjuntos de linfocitos T y NK humanos:
Como se muestra en las Figuras 7A-7E, 8A-8G y 9, con subconjuntos de linfocitos NK, las células CD56bajo exhibieron niveles de expresión de VISTA significativamente mayores que los linfocitos NK CD56Alto. De los subconjuntos de linfocitos T, las células de memoria CD8+ expresaron los niveles de expresión más altos, aunque no son significativamente más altos que los de los linfocitos T c D8+ sin tratamiento previo o CD4+.
Expresión de VISTA en subconjuntos de células dendríticas humanas:
Como se muestra en las Figuras 10A-10D, 11A-11C y 12, no se observan diferencias significativas en la expresión de VISTA; las DC (células dendríticas) y los basófilos exhibieron baja expresión de VISTA, siendo las células dendríticas plasmocitoides (pDC) generalmente más altas pero hasta un alcance significativo.
Conclusión: estos resultados muestran expresión de VISTA en diversos subconjuntos de células inmunitarias, y que VISTA se expresa más en monocitos de la forma más alta, con cierta expresión en diferentes subconjuntos de linfocitos T y linfocitos NK, y poca o ninguna expresión en linfocitos B.
EJEMPLO 2: EXPRESIÓN DE VISTA EN CÉLULAS DE SANGRE PERIFÉRICA
Métodos:
Tinción de sangre completa: se tiñó sangre completa recién aislada (100 jl) con cócteles de anticuerpos tal como se indica a continuación por incubación durante 30 minutos a 4 °C. Los glóbulos rojos (RBC) se sometieron a lisis con tampón de lisis de RBC y las células restantes se lavaron 1x con tampón de tinción. Las células se resuspendieron en 200 j l de tampón de tinción. Los datos se recogieron usando un citómetro de flujo MACSQuant y se analizaron usando el software de análisis FlowJo.
Tinción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC): las células mononucleares de sangre periférica se aislaron a partir de sangre completa usando gradiente de Ficoll. Las 1 x 106 PBMC recién teñidas se aislaron con cócteles de anticuerpos en 100 j l de tampón de tinción. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4 °C y a continuación se lavaron una vez con tampón de tinción. Las células se resuspendieron en 100 j l de tampón de tinción. Los datos se recogieron usando un citómetro de flujo MACSQuant® (Miltenyi Biotec) y se analizaron usando el software de análisis FlowJo.
Los anticuerpos usados fueron los anticuerpos CD11b, CD33, CD177, CD16, CD15, CD14, CD20, HLADR, CD3, CD4, CD8, CD127, CD69, y FOXP3 (Biolegend, San Diego, CA). ImmuNext (Lebanon, NH) preparó el anti-VISTA humano de ratón conjugado con APC (clon GG8).
Conclusiones:
Expresión de VISTA en células de sangre periférica humana sanas
La expresión de VISTA se analizó en células mononucleares de sangre completa y sangre periférica usando citometría de flujo multicolor. Como se muestra en las Figuras 15A y 15B, el nivel de expresión de VISTA más alto se detectó en monocitos seguido por neutrófilos. Los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ expresaron niveles bajos de VISTA tal como se muestra en la Figura 13C y 13D.
Expresión de VISTA en células de sangre periférica de pacientes con cáncer
Como se muestra en las Figuras 14A-C, se analizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer de pulmón. La Figura 14A es una representación de flujo representativa que muestra el análisis de monocitos CD14+ y células supresor a las derivadas de mieloide CD15+ (MDSC). Los resultados sugieren que las células CD15+ fenotípicamente son MDSC derivadas de neutrófilos. Además, estas células están ausentes en muestras de sangre sana. La Figura 14B es un histograma representativo de la expresión de VISTA en monocitos derivados de pacientes con cáncer y sanos, lo que sugiere un nivel de expresión de VISTA más alto en células de pacientes con cáncer en comparación con controles sanos. De forma similar, se encontró un nivel mayor de VISTA en las MDSC en pacientes con cáncer, tal como se muestra en la Figura 14C.
La Figura 15A es una representación de FACS representativa que muestra la presencia de MDSC derivadas de neutrófilos en la sangre de pacientes con cáncer de colon. Las Figuras 15B y 15C son histogramas representativos que muestran un nivel más alto de la expresión de VISTA en monocitos de pacientes con cáncer en comparación con muestras de sangre de donantes sanos.
Expresión de VISTA en células de sangre periférica de mono cinomolgo
Como se muestra en la Figura 16A y 16B, el análisis de citometría de flujo de sangre completa de mono reveló un patrón de expresión de VISTA similar al de células humanas. Tanto monocitos como neutrófilos expresaron el nivel de VISTA más alto en comparación con linfocitos T CD4+ (Figura 16C) y CD8+ (Figura 16D).
EJEMPLO 3: EXPRESIÓN DE VISTA EN LÍNEAS CELULARES DE NEOPLASIA MALIGNA HEMO A NIVEL DEL ARN Y A NIVEL PROTEICO
Dado que VISTA se expresa en neoplasias malignas hemo, un anticuerpo anti-VISTA podría ser potencialmente la diana de las células malignas para destrucción, así como para bloquear VISTA y promover respuestas inmunitarias antitumorales.
Los datos incluyen análisis de sec. de ARN de ~140 líneas celulares de neoplasias malignas hemo (algunas líneas celulares se repiten en el análisis). Los datos se muestran en la Figura 17.
Los valores de sec. de ARN se enumeran como valores de FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos cartografiados).
En esencia, esto significa que se hizo el recuento de todas las lecturas que entran en las regiones exónicas de un gen y se normalizaron tanto por la longitud del gen como por el número total de lecturas por muestra (para tener en cuenta diferencias entre muestras). El valor de corte es 1; por encima de 1 es positivo para la expresión de VISTA (a nivel de ARN), por debajo de 1 es negativo para la expresión de VISTA.
Los resultados indicaron que muchas líneas celulares son positivas a nivel de ARN, principalmente leucemias mieloides agudas y leucemias mielógenas crónicas. Esto se puede esperar ya que VISTA está altamente expresado en células mieloides normales y porque se cree que su función amortigua respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas inmunitarias antitumorales.
EJEMPLO 4: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE A VISTA
Selección de fagos
Se llevaron a cabo veinticuatro experimentos de selección de fagos para enriquecer en fagos reactivos a VISTA cino-His. La proteína VISTA de cinomolgo se usó para estos experimentos ya que mostraba mejor conjugación de biotina que la proteína VISTA humana. Para determinar el éxito de los experimentos con fagos, se añadieron combinaciones de fagos de las rondas de selección individuales a placas de neutravidina revestidas con VISTA cino-His biotinado y se detectaron con un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP. Se recogieron colonias individuales de las rondas de selección de fagos y se produjeron proteínas de Fab en placas de 96 pocillos. Se sometió a ensayo la unión de los sobrenadantes de Fab expresados a VISTA cino-His biotinado. Esto dio como resultado más de 200 coincidencias.
Las regiones VH y VL de las placas de Fab se amplificaron, se presentaron para secuenciación de ADN y se exportaron como archivos FASTA. Al elegir los clones que se deberían convertir y someter al ensayo tales como AcM, los clones se recogieron basándose en la diversidad de secuencias así como en tener riesgos limitados de modificación después de la traducción y la menor cantidad posible de restos hidrófobos.
Las regiones VH y VL de los clones de fago se subclonaron en lectores de expresión IgG1/kappa de mamífero y se transfectaron en células HEK293. Los anticuerpos se purificaron en resina de afinidad de flujo rápido Sepharose de Proteína A. La concentración de AcM de fago se determinó mediante ELISA cuantitativo usando mediciones de Nanodrop. El panel de anticuerpos se expresó en niveles altos. El análisis SDS-PAGE demostró la integridad de cada variante de anticuerpo expresada.
La maduración en línea de los anticuerpos de fago se realizó por amplificación de los dominios VH de las mezclas de anticuerpos policlonales de la última ronda de selección para clonación en vectores de fago que tienen diversidad en la VL. Esto dio como resultado un grupo de VH enriquecido que se muestreó con diversidad adicional en la VL. Los fagos se sometieron a 1-2 rondas de selección rigurosa con la expectativa de identificar aglutinantes de afinidad muy alta por la proteína VISTA ECD His. Se desarrolló un ELISA de Fab monoclonal para determinar el éxito de la maduración. Los datos de expresión y ELISA se normalizaron con respecto a un clon de referencia fijado al 100 % del experimento original de selección de novo y se identificaron clones madurados por afinidad con una señal de unión al antígeno de VISTA de cino más alta que el clon de referencia. Este proceso generó varios clones que demostraron una unión de hasta un 200 % cuando se identificaron sistemáticamente a una concentración de antígeno baja (1 nM), los clones con la afinidad más alta se secuenciaron y se produjeron como AcM.
Generación de hibridomas
Un grupo de ratones BALB/cAnNCrl recibió una inyección intraperitoneal (IP) de 50 |jg de proteína recombinante VISTA Hu-Ig (Sino) emulsionada en adyuvante completo de Freund seguida dos semanas más tarde por una inyección IP de 50 jg de proteína recombinante VISTA Hu-Ig emulsionada en adyuvante de Freund incompleto. Dos semanas después, los ratones recibieron una inyección IP de 50 jg de proteína recombinante VISTA cino-Fc emulsionada en adyuvante de Freund incompleto. Todos los ratones recibieron una inyección final de 25 jg de VISTA humano y 25 jg de VISTA cino en la base de la cola en PBS, cinco días antes de extraer el bazo para fusión.
Otro grupo de ratones BALB/cAnNCrl recibió una inyección IP de 50 jg de proteína recombinante VISTA Hu-His emulsionada en adyuvante completo de Freund. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron una inyección IP de 50 jg de proteína recombinante VISTA Hu-His emulsionada en adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron una inyección IP de 50 jg de proteína recombinante VISTA cino-His emulsionada en adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas más tarde, todos los ratones recibieron una inyección final de 25 jg de VISTA Hu-His y 25 jg de VISTA cino-His en PBS, tres días antes de extraer el bazo para fusión.
El día de la fusión, los ratones se sacrificaron por asfixia con CO2, se extirparon los bazos y se colocaron en 10 ml de solución salina fría tamponada con fosfato. Se preparó una suspensión unicelular de esplenocitos triturando bazos a través de un tamiz de malla fina con un pequeño mortero y enjuagando con PBS a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez en PBS y se sometieron a lisis de RBC. En resumen, las células se resuspendieron en 3 ml de con tampón de lisis de RBC (Sigma n.° R7757) por cada bazo y se colocaron en hielo durante 5 minutos. De nuevo, las células se lavaron una vez en PBS a temperatura ambiente y se marcaron para clasificación magnética. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, a continuación las células se marcaron con perlas magnéticas de Thy1.2 anti-murino, CD11b anti-murino y IgM anti-murino (Miltenyi Biotec n.os 130-049-101, 130-049­ 601 y 130-047-301, respectivamente) se clasificaron usando una columna MS con un Midi MACS. Las fracciones de células negativas (las fracciones de células positivas se descartaron) se fusionaron con células FO. La fusión se llevó a cabo en una proporción de 1:1 de células de mieloma murino con respecto a células de bazo viables. En resumen, las células de bazo y mieloma se mezclaron juntas, se sedimentaron y se lavaron una vez en 50 ml de PBS. El sedimento se resuspendió con 1 ml de solución de polietilenglicol (PEG) (2 g de PEG de peso molecular 4.000, 2 ml de DMEM, 0,4 ml de DMSO) por 10e8 esplenocitos a 37 °C durante 30 segundos. A continuación, la mezcla de células/fusión se sumergió en un baño de agua a 37 °C durante aproximadamente 60 segundos con agitación suave. La reacción de fusión se detuvo añadiendo lentamente DMEM a 37 °C durante 1 minuto. Se permitió que las células fusionadas reposaran durante 5 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. A continuación, las células se resuspendieron en Medio E-HAT (MediumE (StemCell Technologies n.° de cat. 03805) que contenía HAT (Sigma n.° de cat. H0262) y se sembraron en placas de cultivo tisular de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos (Corning n.° 3997).
Se usó EIA de captura para identifica sistemáticamente sobrenadantes de hibridoma en busca de anticuerpos específicos para VISTA de cino. En resumen, las placas (Nunc-Maxisorp n.° 446612) se revistieron a 4 jg/ml durante al menos 60 minutos con anticuerpo (Fc) de cabra anti-IgG ratón (Jackson n.° 115-006-071) en tampón de revestimiento (Thermo 28382). Las placas se bloquearon con 200 jl/pocillo de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,4 % (p/v) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez y se añadieron 50 jl/pocillo de sobrenadante de hibridoma y se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Las placas se lavaron una vez y se añadieron 50 jl/pocillo de 0,1 jg/ml de VISTA cino-huIg y se incubaron a TA durante 30 minutos. Las placas se lavaron una vez y se añadió conjugado de estreptavidina y HRP (Jackson 016­ 030-084) a 1:40.000 en BSA/PBS al 0,4 % y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3x y posteriormente se desarrollaron usando 100 pl/pocillo de sustrato TMB Turbo (Thermo Scientific 34022) incubando aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo usando 25 pl/pocillo de ácido sulfúrico 4 N y la absorbancia se midió a 450 nm usando un espectrofotómetro de placa automatizado. Se seleccionaron quince de las coincidencias primarias para subclonación por dilución limitante y se identificaron sistemáticamente en el mismo formato de pantalla principal.
Todas las líneas celulares de hibridoma reactivas de VISTA de cino se identificaron sistemáticamente de forma cruzada usando VISTA-Ig humana para evaluar la reactividad cruzada. En resumen, las placas (Nunc-Maxisorp n.° 446612) se revistieron a 4 pg/ml con anti-Fc ms de cabra (Jackson n.° 115-006-071) en tampón de carbonatobicarbonato sódico 0,1 M, pH 9,4 (Pierce 28382 BupH™) durante la noche (O/N) a 4 °C. Sin lavar, los pocillos se bloquearon con 200 pl de bloque (BSA al 0,4 % (Sigma) (p/v) en PBS (Invitrogen)) durante la noche a 4 °C. Después de retirar la solución de bloque, los sobrenadantes de hibridoma sin diluir se incubaron en placas revestidas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez con PBST (Tween 20 al 0,02 % (Sigma) (p/v) en PBS), y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos con VISTA Hu-Ig diluido a 100 ng/ml en bloque. Las placas se lavaron una vez y se sometieron a ensayo con anti-Fc humano de cabra-HRP (Jackson n.° 109-036-098) diluido a 1:10.000 en bloque durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y posteriormente se desarrollaron usando 100 pl/pocillo de sustrato TMB Turbo (Thermo Scientific 34022) incubando aproximadamente 10 minutos a TA. La reacción se detuvo usando 25 pl/pocillo de ácido sulfúrico 4 N y la absorbancia se midió a 450 nm usando un espectrofotómetro de placa automatizado.
Los hibridomas que mostraron ser reactivos, tanto para VISTA humano como cinomolgo, tenían clonadas sus secuencias de anticuerpo de la región V. Las células de hibridoma se prepararon antes de las reacciones de transcriptasa inversa (RT) con el sistema de ADNc directo de células SuperScript III de Invitrogen. En resumen, se descartó el medio de cultivo y la placa se colocó en hielo y se resuspendió en 200 pl de PBS frío. Se transfirieron cuarenta microlitros a una placa de PCR de reacción de 96 pocillos rápida MicroAmp y la placa se colocó sobre una base metálica fría, se selló con una película de plástico y se centrifugó a 700 rpm durante 3 minutos. El PBS se descartó y en cada pocillo se añadieron 10 pl de tampón de resuspensión y 1 pl de potenciador de lisis. La placa se selló y se incubó a 75 °C durante 10 min y se almacenó a -80 °C.
Para la reacción de RT, cada pocillo contenía 5 pl de agua, 1,6 pl de tampón de ADNasa 10X, 1,2 pl de EDTA 50 mM, 2 pl ml de Oligo(dT)20 (50 mM) y 1 pl de mezcla de dNTP 10 mM. La placa se incubó a 70 °C durante 5 min, seguido por incubación en hielo durante 2 min, y a continuación se añadieron los siguientes reactivos para cada pocillo; 6 pl de tampón RT 5X, 1 pl de RNaseOUT™ (40 U/pl), 1 pl de SuperScript™ III RT (200 U/pl) y 1 pl de DTT 0,1 M. La placa se selló y se colocó en un termociclador precalentado a 50 °C y se incubó a 50 °C durante 50 minutos, seguido de inactivación (5 min de incubación a 85 °C). La reacción se enfrió en hielo y el ADNc monocatenario se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Para las amplificaciones de la región V, se prepararon reacciones de PCR de 20 pl. Cada pocillo contenía 16,2 pl de agua, 2,0 pl de tampón de reacción de PCR 10X, 0,8 pl de MgSO4 (50 mM), 0,4 pl de dNTP 10 mM, 0,15 pl de mezcla de cebador directo 100 uM, 0,05 pl de cebador inverso 100 uM, 0,2 pl de enzima marcadora HiFi. El ADNc, preparado como se ha descrito anteriormente, se transfirió (2 pl/pocillo) a la mezcla de componentes de la PCR, la placa se selló y se desarrolló una reacción de amplificación; para VH el programa fue (i) 94 °C durante 1 min (ii) 94 °C durante 15 s (iii) 55 °C durante 30 s (iv) 68 °C durante 1 min. Las etapas (ii - iv) se repitieron para un total de 35 ciclos seguido por una extensión final a 68 °C durante 3 min. Para el programa de VL fue (i) 94 °C durante 1 min (ii) 94 °C durante 15 s (iii) 55 °C durante 30 s (iv) 65 °C durante 30 s, (v) 68 °C durante 1 min. Las etapas (ii - v) se repitieron para un total de 35 ciclos seguido por una extensión final a 68 °C durante 3 min.
Los cebadores directos se mezclaron anteriormente y tal mezcla se usó en una proporción de 3:1 con el cebador inverso. Los productos de PCR se verificaron en un gel de agarosa. Las reacciones se prepararon para clonación por infusión mediante la adición de potenciador (kit de clonación In-Fusion HC, n.° de cat. 639650, Clontech). Se transfirieron cinco microlitros de la reacción de PCR a una placa de PCR seguido por la transferencia de 2 pl de potenciador/pocillo. La placa se selló y se incubó en un termociclador (15 min a 37 °C y 15 min a 80 °C). El vector de destino (vDR243 o vDR301) se preparó por digestión con Esp3I; (se digirieron 1,5 pg de vector en 35 pl de tampón Tango, 2 l de Esp3I y agua en una reacción de 30 pl a 37 °C durante 2 horas).
Para clonación por infusión, se mezclaron 2 pl de producto de PCR tratado con potenciador con 100 ng de vector digerido con Esp3I y 2 p de enzima de infusión 5X (Clontech). La reacción de infusión se realizó en formato de placa de PCR de 96 pocillos. La placa se incubó durante 15 min a 50 °C en una máquina de PCR y las células competentes de Stella se transformaron por choque térmico durante 40 segundos a 42 °C sin agitación y se esparcieron en placas de agar LB con antibiótico seleccionado y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las colonias se recogieron en placas de pocillos profundos de 96 pocillos que contenían medio LB/Carbenicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las soluciones de reserva congeladas se prepararon a partir de cultivos durante la noche mezclando con un volumen igual de glicerol al 30 % p/v. Las regiones V se secuenciaron usando el cebador de secuenciación SPF0052. Las secuencias se analizaron, se seleccionó un pocillo positivo por vH y vL de hibridoma, se volvieron a disponer en placas nuevas y se cultivaron durante la noche en medio rico con ampicilina. A continuación, se preparó el ADN miniprep de los clones para transfección a pequeña escala en una placa de 96 pocillos.
Se adaptaron cuarenta y ocho secuencias de hibridoma de ratón seleccionadas para cadena tanto pesada como ligera al marco humano usando un programa de software interno. Se eligió un marco humano para cada uno de vH o vL de ratón. Las secuencias de ADN de la región V se obtuvieron mediante retrotraducción. Las regiones de ADN sintético correspondientes a las secuencias de aminoácidos de HFA se encargaron a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). La clonación se llevó a cabo en vDR149 y vDR157 cortados anteriormente, IgG1 humana y kappa humana respectivamente. Para preparar el ADN se usaron kits Qiagen Endo-free Maxi-prep. Para expresar este panel de anticuerpos se usaron cultivos Expi293 (100 ml).
EJEMPLO 5: PROTOCOLO PARA ENSAYO DE SUPRESIÓN DE LINFOCITOS T VISTA-IG HUMANOS IN VITRO Se transfectaron células A20 de ratón de forma estable con GFP o VISTA humano. Se incubaron con óvulos peptídicos y con linfocitos T DO11.10. La expresión de CD25 por parte de los linfocitos T se midió 24 horas después de iniciada la incubación. Las células A20-VISTAhu suprimen la expresión de CD25 por parte de los linfocitos T, pero esta lectura se restablece significativamente por incubación con VSTB95 (Figura 18).
EJEMPLO 6: ADAPTACIÓN DE REGIONES MARCO HUMANAS DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA
Las secuencias de hibridoma de ratón para cadena pesada y ligera se adaptaron al marco humano por injerto de CDR (Jones, et al., Nature, 321: 522-525 (1986) usando un programa de software interno. El programa delinea las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las secuencias de la región V de acuerdo con las definiciones de Kabat (Wu, T. T. y Kabat, E. A. (1970). J Exp Med, 132, 211-50) y compara las regiones marco con los genes de la línea germinal humana usando Blast. La línea germinal humana con la identidad de secuencia más alta para los marcos de ratón se eligió como el gen aceptor para adaptación del marco humano (HFA). En algunos casos, se eligieron genes de línea germinal humana estrechamente relacionados, basándose en la experiencia previa con marcos humanos bien expresados. Las secuencias de ADN para los marcos humanos elegidos para cada una de las regiones V vH o vL de ratón se obtuvieron mediante retrotraducción. Las regiones de ADN sintético correspondientes a las secuencias de aminoácidos de HFA se encargaron en Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). La clonación se llevó a cabo en IgG1 y kappa humana, respectivamente.
EJEMPLO 7: CONSTRUCTOS DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA
Información de plásmido y secuencia de las moléculas para desarrollo de líneas celulares: se generaron constructos plasmídicos para anticuerpos anti-VISTA que tienen las regiones variables VSTB112 y una región constante IgG1K (VSTB174, nuevo número debido a un cambio alotípico en la región constante), una región constante IgG2sigma (VSTB140) o una región constante resistente a proteasa de IgG1 (VSTB149).
Vectores Lonza
El sistema de vector de expresión de ovario de hámster chino (CHO) pEE6.4 y pEE12.4 (Lonza Biologics, PLC) se estableció en Biologics Research (BR) y Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences (PDMS) como principal sistema de expresión para generación de AcM terapéuticos en líneas celulares de expresión de mamíferos. Cada vector contiene un promotor de citomegalovirus humano (huCMV-MIE) para impulsar la expresión de la cadena pesada (HC) o la cadena ligera (LC) y contiene el gen de resistencia a ampicilina. El vector pEE12.4 también incluye el gen que codifica la enzima glutamina sintetasa (GS). Las condiciones de crecimiento que requieren actividad de glutamina sintetasa ejercen una presión selectiva en las células para mantener el vector de expresión (Versión 4.0 del manual de sistema de expresión génica GS). Para clonar el gen de HC se usó pEE6.4 y para clonar el gen de LC se usó pEE12.4 como vectores de un solo gen. El plásmido de gen doble de Lonza se crea a partir de estos dos vectores de un solo gen de Lonza.
Secuencias de aminoácidos de regiones de cadena pesada variable de los AcM de VISTA seleccionados > cadena pesada de VSTB112 (SEQ ID NO: 37)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG
LEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
ARSSYGWSYEFDYWGQGTLVTVSS
> cadena pesada de VSTB50 (SEQ ID NO: 38)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLNWVRQAPGQ
GLEWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVY
YCAREGYGNYIFPYWGQGTLVTVSS
> cadena pesada de VSTB53 (SEQ ID NO: 39)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYT1HWVRQAPGQ
GLEWMGY1IPSSGYSEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY
YCARGAYDDYYDYYAMDYWGQGTLVTVSS
> cadena pesada de VSTB95 (SEQ ID NO: 40)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYGMSWVRQAPGK
GLEWVASIISGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARIYDHDGDYYAMDYWGQGTTVTVSS
Secuencias de aminoácidos de regiones de cadena ligera variable de los AcM de VISTA seleccionados > cadena ligera de VSTB50 (SEQ ID NO: 41)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASESVDTYANSLMHWYLQKPG
qppqlliyrasnlesgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqqtne DPRTFGQGTKLEIK
> cadena ligera de VSTB53 (SEQ ID NO: 42)
D1VMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQT1VHSNGNTYLEWYLQKPG
QSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASH
VPWTFGQGTKLEIK
> cadena ligera de VSTB95 (SEQ ID NO: 43)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPG
QSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSH
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> cadena ligera de VSTB112 (SEQ ID NO: 44)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQSIDTRLNWYQQKPGKAPK
LLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYNPITFG
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> cadena ligera de VSTB116 (SEQ ID NO: 45)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINTNLNWYQQKPGKAPK
LLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARDTPITFG
QGTKVEIK EJEMPLO 8: ELISA E IDENTIFICACIÓN SISTEMÁTICA POR FACS DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA
Estos experimentos se realizaron para determinar la capacidad de los anticuerpos producidos para unirse a proteína VISTA humana o de cinomolgo en un ELISA, así como para determinar, usando identificación sistemática por FACS, la capacidad de los anticuerpos para unirse a proteína VISTA en la superficie de células K562 (línea celular de leucemia mielógena humana) que expresan proteínas VISTA humanas o de cinomolgo.
Métodos:
Resumen del procedimiento de ELISA: las placas se revistieron durante la noche a 4 °C con 1 pg/ml de proteínas SB0361 (humana) o SB0361 (cino (cinomolgo)), que son los dominios extracelulares de VISTA de las respectivas especies. Los anticuerpos se diluyeron a 1 pg/ml como concentración inicial con diluciones escalonadas a 1:4 para un total de 4 concentraciones y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 2 horas. Para la detección se usó anti-IgG1 humana-HRP (peroxidasa de rábano picante) de ratón y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los lavados se llevaron a cabo usando PBS-Tween (0,05 %).
Resumen del procedimiento de FACS: 2 x 105 células K562-G8 (humanas) o K562-C7 (cino) se tiñeron con 5 pg/ml de cada anticuerpo de ensayo y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Como anticuerpo de detección secundario se usó anticuerpo anti-IgG1 humana-PE (ficoeritrina) de cabra a 5 pg/ml. Las células se desarrollaron en un BD Fortessa y se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashlang, OR) para MFI (intensidad de fluorescencia media) de la población viva.
Análisis de datos/resultados: para cada anticuerpo, se otorgó una puntuación subjetiva (Sí/No) con respecto a si el anticuerpo se unía de forma robusta o no tanto para el análisis tanto ELISA como FACS para cada uno de los 4 ensayos. Si un anticuerpo daba un resultado "No" para la unión en cualquiera de los ensayos, se repetía para confirmar que era negativo. Los resultados se muestran en la Tabla 7 que sigue a continuación y en las Figuras 19A-19F y 20A-20F.
Tabla 7.
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EJEMPLO 9: RESULTADOS DE IDENTIFICACION SISTEMATICA DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA HUMANO USANDO LOS ENSAYOS DE REACCIÓN LINFOCITARIA MIXTA (MLR) Y ACTIVACIÓN DE ENTEROTOXINA B DE STAPHYLOCOCCUS (SEB)
La finalidad de este estudio fue presentar datos que respaldaran la identificación de múltiples anticuerpos a-VISTA funcionales que aumenten las respuestas inmunitarias celulares en el ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR), así como en el ensayo de activación de enterotoxina B de Staphylococcus (SEB).
La reacción linfocitaria mixta (MLR) es un ensayo inmunológico estándar que depende de la falta de coincidencias de las clases I y II de MHC para impulsar una respuesta de linfocitos T alogénicos. Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan de dos individuos con falta de coincidencias, se incuban juntas y, como resultado de estas faltas de coincidencias, se produce la proliferación y la producción de citoquinas.
Material y Métodos:
Se preparó medio AB al 10 % combinando 500 ml de RPMI con 50 ml de suero AB humano, 5 ml de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml), 5 ml de L-glutamina (100x) y 10 ml de HEPES (1 M). El medio se almacenó durante no más de 14 días. Se preparó 1 mCi de timidina tritiada diluyendo 0,2 ml de solución de reserva de timidina (1 mCi/ml) en 9,8 ml de RPMI.
Los anticuerpos VISTA solubles se diluyeron a 20 |jg/ml en medio de suero AB al 10 %. Se añadieron 100 |jl de las soluciones de anticuerpo adecuadas a los pocillos apropiados de una placa de fondo en U de 96 pocillos (producto Falcon n.° 353077 o equivalente). Después de añadir las diversas poblaciones celulares, la concentración final fue de 10 jg/ml.
Aislamiento de glóbulos blancos: Los donantes tenían al menos 18 años de edad, generalmente sanos y seleccionados de forma aleatoria a partir de la población local. Se transfirió sangre del donante desde tubos de aislamiento a cónicos de 50 ml. Se reforzó con 15 ml de Ficoll 1077 por cada 25 ml de sangre con cuidado de no mezclar con la sangre. Se centrifugaron las células a 1250 g durante 25 minutos a temperatura ambiente sin freno. Se aislaron glóbulos blancos en la interfase del Ficoll y el suero y se diluyeron las células en 40 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se centrifugaron las células a 453 g (1500 rpm) durante 10 minutos a 4 °C. Se resuspendieron las células en 50 ml de HBSS y se hizo su recuento transfiriendo 500 j l a un tubo separado.
Configuración de placa de 96 pocillos de reacción linfocitaria mixta (MLR): se determinó el número apropiado de "células estimuladoras" y "células que responden favorablemente" necesarias para el ensayo basándose en el número de muestras que se van a analizar. La población estimuladora se siembra a 0,5 x 105 células/pocillo y la población que responde favorablemente se siembra a 1,0 x 105 células/pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Todas las condiciones se deben llevar a cabo por triplicado. Se pipeteó el número apropiado de "células estimuladoras" en un tubo cónico nuevo y se centrifugó como se ha descrito anteriormente. Se resuspendieron las células en 10 ml y se irradiaron con 4000 rad. Las células se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron a una concentración de 1,0 x 106/ml en medio de suero AB al 10 % y se añadieron 50 j l a los pocillos apropiados. Se aisló el número requerido de células que respondían favorablemente y se centrifugó como se al descrito anteriormente y se resuspendió a una concentración de 2 x 106/ml en medio de suero AB al 10 % y se añadieron 50 j l a los pocillos apropiados. Las células se incubaron durante 5 días a 37 °C y CO2 al 5 %. Al quinto día, se retiraron 30 j l de sobrenadante para análisis de producción de interferón gamma (|FN-y). Al quinto día, se añadieron 25 j l de una solución de timidina tritiada de 40 jCi/ml a cada pocillo y se incubó durante 8 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se transfirieron a la placa de microcentelleo de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recuento se realizó usando el contador de microcentelleo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de IFN-y se determinó por ELISA (eBioscience n.° de cat. 88-7316-88) usando el protocolo del fabricante.
Análisis de datos: se calculan el promedio de recuentos por minuto (CPM) o concentración de IFN-y para los pocillos sin tratar. Se calcula el promedio de CPM o IFN-y para cada uno de los grupos de ensayo. Se realiza la transformación log10 del conjunto de datos. Usando 12 puntuaciones de MLR para cada compuesto, se calcula el promedio para el conjunto de 12 grupos de ensayo de cada compuesto. Puntuación promedio para 12 experimentos = I [(log10 (CPM promedio por triplicado para el compuesto de ensayo)) -(log10 (CPM promedio por triplicado para Sin Tratamiento))]/12.
Criterios de aceptación: todos los reactivos de ensayo y controles apropiados se sometieron al ensayo para detectar endotoxinas antes de realizar el ensayo y tienen niveles < 0,1 UE/mg. Las células que responden favorablemente solas tenían recuentos de CPM inferiores a 700 CPM como promedio, lo que indica que las células estaban inactivas cuando se incubaron solas. El CPM para el grupo de MLR fue al menos 2 veces mayor que el CPM para las células que responden favorablemente incubadas solas, lo que indica que se había producido una reacción y que los donantes presentan falta de coincidencia. Todos los ensayos de MLR incluyeron una proteína de control negativo de IgG1 humana. El resultado del control negativo de IgG1 humana no fue estadísticamente diferente del de las muestras sin tratar basándose en el uso del ensayo t de Student.
Identificación sistemática de anticuerpos anti-VISTA en la MLR: identificación sistemática inicial de todos los compuestos. Antes de desarrollar la MLR con los anticuerpos anti-VISTA, se confirmó que los anticuerpos se unen tanto a VISTA unido a células mediante análisis FACS como a proteína VISTA mediante ELISA. Los anticuerpos S26 (VSTB77), S30 (VSTB86), S31 (VSTB88), S32 (VSTB90) y S39 (VSTB74) fallaron en esta identificación sistemática inicial, pero aún se probaron en el ensayo. Con la finalidad de la identificación sistemática inicial, todos los anticuerpos se sometieron a la ensayo a 10 jg/ml en la MLR siendo la proliferación y el IFN-y los parámetros medidos (Figuras 21A-21D y 22A-22B).
Selección de seis anticuerpos principales. A partir de la identificación sistemática inicial, se eligieron seis candidatos para su análisis posterior: VSTB112 (S2), VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) y VSTB60 (S47).
Estudios de dilución de los seis mejores candidatos en la MLR: Ajustes del protocolo. El protocolo es idéntico al descrito anteriormente con el ajuste de que los anticuerpos se diluyeron a las siguientes concentraciones: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 y 0 jg/ml.
Determinación de los valores de CI50: se usaron recuentos de CPM sin procesar y concentraciones de IFN-y para determinar la CI50 para cada uno de los anticuerpos. Los cálculos de CI50 se determinaron mediante el uso del programa "EZ-R stats". Se usaron seis candidatos que responden favorablemente individuales para determinar los valores de CI50. Recuentos de CPM individuales y concentraciones de IFN-y en la MLR con titulaciones de dosis de los candidatos principales.
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Conclusión: La identificación sistemática inicial indicó que múltiples anticuerpos específicos de VISTA eran capaces de aumentar la respuesta inmunitaria celular de MLR. A continuación, los anticuerpos se clasificaron basándose en la eficacia y la varianza y, en función de estos resultados, se eligieron VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 y VSTB60 para su evaluación en experimentos de titulación de dosis. VSTB60 indujo una respuesta más débil que los otros cinco anticuerpos en los experimentos de titulación de dosis.
Ensayo de activación de enterotoxina B de Staphylococcus (SEB): SEB es un superantígeno bacteriano que induce la activación de linfocitos T Vp+ específicos. Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan e incuban con el antígeno SEB en cultivo, lo que induce una producción robusta de citoquinas. Este ensayo se realizó en los cinco candidatos principales.
La preparación de medio AB al 10 %, la preparación de 1 mCi de timidina tritiada, la preparación de anticuerpos VISTA solubles y el aislamiento de glóbulos blancos se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente en la MLR.
Configuración de placa de 96 pocillos para SEB: se determinó el número apropiado de células que responden favorablemente necesarias para el ensayo basándose en la cantidad de muestras que se van a analizar. La población que responde favorablemente se siembra a 2,0 x 105 células/pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Todas las condiciones se deben llevar a cabo por triplicado. Las células se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron a una concentración de 4 x 106/ml en medio de suero AB al 10 % y se añadieron 50 |jl a los pocillos apropiados. Se añadieron 50 |jl de medio de suero AB al 10 % que contenía el antígeno SEB a una concentración de 40 ng/ml. En los experimentos descritos, SEB se obtuvo en Sigma Aldrich (n.° de cat. S0812). La concentración final en el pocillo fue de 10 ng/ml. Las células se incubaron durante 3 días a 37 °C y CO2 al 5 %. Al tercer día, se retiraron 30 j l de sobrenadante para análisis de producción de IFN-y. Se añadieron 25 j l de una solución de timidina tritiada de 1 mCi/ml a cada pocillo y se incubaron durante 8 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se transfirieron a la placa de microcentelleo de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recuento se realizó usando el contador de microcentelleo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de IFN-y se determinó por ELISA (eBioscience n.° de cat. 88-7316-88) usando el protocolo del fabricante.
Protocolo: las de datos. Se calcula el promedio de recuentos por minuto (CPM) o concentración de IFN-y para cada uno de los anticuerpos en todas las concentraciones. Los criterios de aceptación se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. La determinación de los valores de CI50 se llevó a cabo como se ha descrito. Recuentos de CPM individuales y concentraciones de IFN-y en el ensayo de SEB con titulaciones de dosis de los candidatos principales.
Tabla 9: Valores de CI50 tanto ara CPM como ara IFN- en el SEB.
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Conclusiones: los anticuerpos específicos de VISTA aumentaron la producción y proliferación de citoquinas de forma dependiente de la dosis en el ensayo de SEB. Los valores de CI50 del estudio de SEB fueron generalmente similares a los resultados de los estudios de dilución de MLR.
EJEMPLO 10: ENSAYO DE CLASIFICACIÓN POR GRUPOS DE EPÍTOPOS
Métodos: se usó el sistema ProteOn XPR36 (BioRad) para llevar a cabo la clasificación por grupos de epítopos. Los chips de ProteOn GLC (BioRad, n.° de Cat.176-5011) se revistieron con dos conjuntos de 6 anticuerpos monoclonales (AcM) usando las instrucciones del fabricante para química de acoplamiento de aminas (BioRad, n.° de cat. 176-2410).
Se incubaron previamente AcM competidores en exceso (concentración final de 250 nM) con VISTA humano (concentración final de 25 nM) durante 4 horas a temperatura ambiente y se desarrollaron 6 a la vez sobre el chip revestido con los paneles de AcM revestidos con un tiempo de asociación de 4 minutos seguido de disociación durante 5 minutos. Después de cada desarrollo, los chips se regeneraron con ácido fosfórico 100 mM.
El análisis de datos implicó el ago lpamiento de todos los sensogramas por ligando y la aplicación de un asistente de alineamiento, que lleva a cabo automáticamente un alineamiento de los ejes X e Y, y retirada de artefactos. A continuación, se aplicó una corrección Interspot a los datos.
Se definió un AcM no competidor era el que tenía una señal de unión igual o > que la señal A1 (solo se une a VISTA humano).
Se definió que un AcM competidor A era el que tenía una señal de unión << señal A1 (es decir, solo se une a VISTA humano).
Resultados: en el sensograma a modo de ejemplo que se muestra en la Figura 23, el anticuerpo VSTB85 se revistió sobre el chip Proteon SPR y la proteína VISTA incubada previamente con los competidores indicados se desarrolló sobre el chip. VSTB50 es un ejemplo de un anticuerpo no competitivo, ya que se observó una respuesta positiva cuando se desarrolló el complejo VISTA/VSTB50. GG8, VSTB49 y VSTB51 complejados con VISTA no se unieron al VSTB85 revestido sobre el chip y, por lo tanto, se clasificaron como competidores por el mismo sitio de unión en VISTA que VSTB85.
Tabla 10:
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EJEMPLO 11: DETERMINACION DE AFINIDAD DE PROTEON
Los anticuerpos se capturaron en chips ProteOn usando superficies revestidas con anti-Fc IgG. Se sometió a ensayo la unión de los anticuerpos a dominios extracelulares (ECD) de VISTA humano y de cinomolgo (cino) a concentraciones de proteínas VISTA que variaban entre 0,39 nM y 100 nM. Se permitió que los antígenos se unieran/asociaran a los chips revestidos con anticuerpo durante 4 minutos, tras lo cual la disociación se monitorizó durante 30 minutos. Los chips se regeneraron con dos tratamientos de ácido fosfórico 100 mM durante 18 segundos. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C y los datos se ajustaron al modelo de unión de Langmuir a 1:1.
EJEMPLO 12: EFECTOS DEL TRATAMIENTO ANTI-VISTA EN UN MODELO DE TUMOR DE VEJIGA MURINO MB49
Métodos:
A los ratones C57Bl/6 se les inyectaron células tumorales MB49. Una vez establecidos los tumores, se inició el tratamiento anti-VISTA. A continuación, el crecimiento tumoral se controló 3 veces/semana. Los ratones se sacrificaron, de acuerdo con las regulaciones de IACUC, una vez que los tumores alcanzaron 15 mm en cualquier dimensión.
Para cada experimento, un vial congelado de células MB49 se descongeló y se cultivó en RPMI 1640 (+ L-Glut) con suero al 10 % y antibióticos penicilina/estreptomicina. Después de tres días de cultivo, las células se obtuvieron usando StemPro Accutase y se resuspendieron en RPMI a una concentración de 5 x 106 células/ml y se inyectaron 50 |jl por ratón.
Se adquirieron ratones C57BI/6 hembra, de 6 a 8 semanas de edad, en el National Cáncer Institute. A su llegada, se les permitió aclimatarse durante un día antes de afeitarse el flanco derecho y sus colas se marcaron con tinta. A continuación fueron inyectados tres o cinco días después.
Inyección tumoral (intradérmica): a los ratones se les inyectaron, por vía intradérmica (i.d.) en su flanco afeitado, 50 |jl de suspensión de células MB49 (~250.000 células).
Monitorización del crecimiento tumoral: el crecimiento tumoral se midió usando calibradores electrónicos en primer lugar en la dimensión más ancha (L) y en segundo lugar en un ángulo de 90° con respecto a la primera medición (W). Volumen del tumor se derivó de la siguiente manera:
Volumen = (L2*W2)/2
Los tumores se consideraron establecidos una vez que alcanzaron ~5 mm de diámetro (~60 mm3 de volumen). Una vez establecido, se inició el tratamiento. El crecimiento tumoral se midió tres veces a la semana durante el transcurso del tratamiento y hasta que terminó el experimento.
Tratamiento anti-VISTA: se inyectó anticuerpo monoclonal 13F3-mIgG2a quimerizado por vía intraperitoneal a 10 mg/kg. Los programas de inyección fueron tres veces a la semana durante cuatro semanas.
Sacrificio de ratones: de acuerdo con los requisitos de IACUC, los animales se sacrificaron una vez que sus tumores alcanzaron 15 mm en la dimensión más larga.
Eficacia del análisis: los volúmenes tumorales de ratón se analizaron usando Excel para gestión de datos, y GraphPad Prism para representación gráfica. El análisis estadístico se llevó a cabo usando una macro para el software informático estadístico R.
El diseño experimental se muestra en la Figura 24.
Resultados:
El tratamiento con Ch13F3-mIgG2a en ratones hembra condujo a un rechazo tumoral completo (RC) en un 70 % de los animales y una remisión parcial (RP) en un 30 % (n = 7) (Tabla 13 y Figura 25B). Por el contrario, todos los ratones tratados con mIgG2a de control mostraron un crecimiento progresivo de los tumores (6/6) (Figura 25A). Estos datos demuestran que el tratamiento anti-VISTA puede tener un profundo efecto en el crecimiento tumoral.
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La secuencia de VISTA humano se muestra en las Figuras 26 y 27, adaptado a partir de Wang et al., 2011, mencionado anteriormente.
EJEMPLO 13: CARTOGRAFÍA DE EPÍTOPOS DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA USANDO ESTUDIOS DE INTERCAMBIO HIDRÓGENO/DEUTERIO (H/D)
Para identificar los epítopos para VSTB50, 60, 95 y 112 en VISTA humano, se llevó a cabo una espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio en solución (HDX-MS) usando los Fab correspondientes. Para el intercambio de H/D, los procedimientos usados para analizar la perturbación de Fab fueron similares a los descritos anteriormente (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14: 171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45: 8488-8498, 2006) con algunas modificaciones. Los Fab se prepararon a partir de las IgG con digestión con papaína y captura de Proteína A usando el kit de preparación de Fab Pierce (Thermo Scientific, n.° de Cat. 44985). La secuencia de la proteína VISTA humana contiene seis sitios de glicosilación unidos a N. Para mejorar la cobertura de la secuencia, la proteína se desglicosiló con PNGasa F. La proteína VISTA desglicosilada se incubó en una solución de agua deuterada durante tiempos determinados previamente dando como resultado la incorporación de deuterio en átomos de hidrógeno intercambiables. La proteína VISTA deuterada estaba formando complejo con Fab de cualquiera de VSTB50, VSTB60, VSTB95 o VSTB112 en 46 j l de óxido de deuterio (D2O) a 4 °C durante 30 s, 2 min, 10 min y 60 min. La reacción de intercambio se interrumpió con un pH bajo y las proteínas se digirieron con pepsina. Los niveles de deuterio en los péptidos identificados se monitorizaron a partir del cambio de masa en LC-Ms . Como control de referencia, la proteína VISTA se procesó de forma similar excepto porque no estaba formando complejo con las moléculas Fab. Se infirió que las regiones unidas al Fab eran aquellos sitios relativamente protegidos del intercambio y, por lo tanto, que contenían una fracción mayor de deuterio que la proteína VISTA de referencia. Aproximadamente un 94 % de la proteína se pudo cartografiar para péptidos específicos.
Las cartografías de perturbación de HDX-MS en solución de VISTA con VSTB50 / VSTB60, y VSTB95 / VSTB112 se muestran arriba y abajo en la Figura 28, respectivamente. Se identificaron dos grupos de epítopos. VSTB50 anti­ VISTA reconoce el mismo epítopo que VSTB60; VSTB95 se une a otra región del epítopo como lo hace VSTB112 en VISTA. VSTB50 y 60 anti-VISTA comparten el mismo epítopo que comprende los segmentos, 103NLTLLDSGL111 (SEQ ID NO: 62), y 136VQTGKDAPSNC146 (SEQ ID NO: 63) (parte superior de la Figura 28). Parece que VSTB95 y 112 anti-VISTA tienen como diana epítopos similares, que comprenden los segmentos 27PVDKGHDVTF36 (SEQ ID NO: 75), y 54RRPIRNLTFQDL65 (SEQ iD NO: 65) (parte inferior de la Figura 28). Hay otros dos segmentos que muestran una perturbación débil por VSTB95 y 112, incluidos los restos 39-52 y 118-134. Sin embargo, los niveles de reducción no son tan fuertes como en las regiones anteriores (27-36 y 54-65) en la cartografía diferencial. Aunque un péptido, 100TMR102 que muestra una fuerte perturbación por VSTB95 y 112, está ubicado en la otra cara de la superficie de VISTA, está distante de las regiones epitópicas, 27-36 y 54-65. Esta perturbación se podría deber al efecto alostérico. Estos resultados de HDX-MS proporcionan los epítopos de nivel de péptido para anticuerpos anti­ VISTA. No hubo regiones epitópicas solapantes para estos dos grupos de epítopos. Estos resultados están de acuerdo con los datos de clasificación por grupos de competición previa en el sentido de que no compiten entre sí. EJEMPLO 14: DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DEL COMPLEJO DE FAB ECD:VSTB112 DE VISTA HUMANO MEDIANTE CRISTALOGRAFÍA DE PROTEÍNAS
En un esfuerzo para determinar la estructura de VISTA y delinear el epítopo y el parátopo que definen la interacción entre el dominio extracelular (ECD) de VISTA y el fragmento Fab del anticuerpo principal VSTB112, el complejo se cristalizó y la estructura se determinó con una resolución de 1,85 A. La estructura del ECD de VISTA humano en complejo con el fragmento Fab del VSTB112 requerido se determinó en un esfuerzo tanto para determinar la estructura del propio ECD de VISTA como para definir el epítopo/parátopo para esta interacción. La estructura revela que VISTA adopta un plegamiento de IgV con una topología de cadena similar a la de la cadena Va de TCR. Además del enlace disulfuro canónico que une por puente las hebras B y F en las caras posterior y frontal del sándwich p, la estructura revela que el ECD tiene dos enlaces disulfuro adicionales, uno que une el bucle CC' a la lámina frontal y un segundo entre las hebras A' y G'. Aunque están presentes contactos cristalinos entre moléculas de VISTA, son menores y no hay evidencia de un dímero de ECD de VISTA basado en esta estructura. Se muestra que el epítopo VSTB112 comprende las partes de los bucles BC, CC' y FG de VISTA junto con restos de la lámina beta frontal (C'CFG) más cercana a esos bucles. El parátopo está sesgado en gran medida hacia las interacciones de cadena pesada con L3 de CDR haciendo un contacto mínimo.
Epítopo/parátopo que define la interacción VISTA:VSTB112
El Fab de VSTB112 oculta un área superficial de 1024,3 A2 al unirse al ECD de VISTA, representando la ocultación de la superficie de la cadena pesada 715,3 A2 de este total. Se forman siete enlaces de hidrógeno y 4 interacciones de puente salino entre la cadena ligera de VISTA y VSTB112 e interacciones de 10 hidrógenos y 2 puentes salinos entre la cadena pesada de VISTA y VSTB112. VSTB112 reconoce restos en las hebras de la lámina frontal C', C, F y G en los extremos proximales al bucle FG, así como restos en los bucles BC, FG y CC' (Figuras 29 y 30). Las interacciones con el bucle CC' representan la mayoría de los contactos con la cadena ligera de Fab y solo los restos E125 y R127 en el bucle FG generan interacciones adicionales con la cadena ligera. Los restos 119 a 127 correspondientes al bucle FG de VISTA representan un 38 % del total de 1034,8 A2 de superficie oculta tras la unión a VSTB112. En particular, este bucle es muy polar y está compuesto por la siguiente secuencia -IRHHHSEHR-(SEQ ID NO: 76). Además, W103 en H3 de CDR de VSTB112 se empaqueta muy bien frente a la estructura principal de los restos H122 y H123 de VISTA, y H121 de VISTA tiene una ventaja en la interacción con el anillo aromático de F55 en H2 de CDR.
En la Figura 31 se muestra una comparación de regiones epitópicas identificadas por cristalografía y HDX.
EJEMPLO 15: ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T Y MONOCITOS POR ANTICUERPOS ANTI-VISTA
El efecto funcional de los anticuerpos anti-VISTA se evaluó en dos ensayos in vitro, reacción leucocitria mixta (MLR) y SEB (enterotoxina B de Staphylococcus). Ambos ensayos miden la proliferación de linfocitos T y la inducción de citoquinas como sus lecturas principales, pero estos efectos se deben a diferentes mecanismos. En la MLR, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dos donantes humanos diferentes se incuban juntas, y la falta de coincidencias del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) entre linfocitos T de un donante y células dendríticas del otro donante da como resultado proliferación de linfocitos T y producción de interferón (IFNy). En el ensayo de SEB, las PBMC de un solo donante se incuban con un superantígeno bacteriano, que une directamente la proteína de Clase II de MHC en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) con el receptor de linfocitos T (TCR) en linfocitos T, causando activación de linfocitos T, proliferación y secreción de citoquinas. En ambos ensayos, VSTB112, que es la molécula precursora de VSTB174, demostró una inducción dependiente de la dosis de la proliferación de linfocitos T y producción de citoquinas, y fue el más potente entre los candidatos (Figuras 21A-21D, Tabla 12).
Tabla 12. Valores de CE50 para las lecturas del ensayo de MLR. VSTB112 (precursor de VSTB174) fue la molécula m n
Figure imgf000041_0001
Ensayos de activación de monocitos
Los datos del ensayo, que se muestran en la Tabla 12, se generaron con VSTB112, la molécula precursora de VSTB174. Para comprender mejor la actividad de VSTB174, se realizaron ensayos de activación de monocitos. Los resultados mostraron que la incubación de VSTB174 con las PBMC completas indujo una regulación al alza de los marcadores de activación (CD80 y HLA-DR) en los monocitos CD14+, lo que indica un efecto de la unión de anticuerpos a un subconjunto de células inmunitarias que se sabe que expresan niveles elevados de VISTA (Figura 32). Una pregunta adicional es si los efectos con respecto al la activación de monocitos en PBMC completas los podría facilitar cualquier anticuerpo que se una a VISTA y tenga un Fc de IgG1. Los anticuerpos VSTB103 y VSTB63 se unen a VISTA con gran afinidad (Kd 6,36E-10 y 8,30E-10, respectivamente) y a células que expresan la proteína VISTA, de forma similar a VSTB112 y VSTB111. VSTB103 está en la misma clasificación por grupos de epítopos que VSTB112, mientras que VSTB63 está en una clasificación por grupos de epítopos diferente; ninguno de los anticuerpos facilitó la activación de los monocitos. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que un mecanismo por el cual VSTB174 puede ejercer su efecto en la activación/proliferación de linfocitos T es mediante la activación de monocitos facilitada por linfocitos NK.
Preparación del medio
Se combinaron 500 ml de RPMI 1640 (Coming, 10-040-CV) con 50 ml de suero AB humano (Valley Biomedical, Inc, lote n.° 3C0405), 5 ml de penicilina/estreptomicina (Lonza, 17-602E) 10.000 U/ml, 5 ml de L-glutamina (100x) (Gibco, 25030-081) y 10 ml de HEPES (1 M) (Fisher BP299-100, n.° de lote -1). El medio se almacenó durante un período de tiempo no superior a 14 días a 4 °C.
Preparación de VISTA soluble y anticuerpos de control
Los anticuerpos se diluyeron a 2X la concentración deseada en medio de suero AB al 10 %: VSTB174: lote VSTB174.003
Se añadieron 100 pl de las soluciones de anticuerpos apropiadas a los pocillos apropiados de una placa de fondo en U de 96 pocillos (Falcon, 353077). Después de añadir las diversas poblaciones celulares en 100 pl, la concentración final de cada anticuerpo fue de 1, 0,1 o 0,01 g/ml. El anticuerpo de control de IgG1, CNTO 3930 (Lote 6405, ENDO < 0,1 UE/mg) se añadió a una concentración final de 1 pg/ml.
Las PBMC se aislaron
Los donantes tenían al menos 18 años de edad, generalmente sanos y se seleccionaron de forma aleatoria a partir de la población local.
La sangre del donante se transfirió del tubo de aislamiento a cónicos de 50 ml.
Se colocaron como base 15 ml de Ficoll 1077 (SIGMA, 10771) teniendo cuidado de no mezclarlo con la sangre. Esto se realizó por 25 ml de sangre.
Las células se centrifugaron a 1250 g durante 25 minutos a temperatura ambiente sin freno.
Los glóbulos blancos se aislaron en la interfase del Ficoll y el suero y las células se diluyeron en 40 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS).
Las células se centrifugaron a 453 g (1500 rpm) durante 10 minutos a 4 °C.
Las células se resuspendieron en 50 ml de HBSS y se hizo su recuento transfiriendo 500 1 a un tubo Eppendorf separado.
Además, para aislar linfocitos CD14+ por selección negativa en varios grupos de tratamiento se usó un kit de aislamiento Pan Monocyte de Miltenyi de acuerdo con instrucciones del fabricante (n.° de cat. 130-096-537).
Configuración de cultivo in vitro
Se determinó el número apropiado de células necesarias para el ensayo basándose en el número de muestras a analizar. La población que responde favorablemente se sembró a 2,0 x 105 células/pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Para la población seleccionada negativamente de CD14, se sembraron 0,5 x 105 células. Todas las condiciones se llevaron a cabo por triplicado.
Las células se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron a una concentración de 2 x 106/ml para toda la población de PBMC y de 0,5 x 106/ml para la población seleccionada negativamente de CD14 en medio de suero AB al 10 % y se añadieron 100 l de anticuerpo de ensayo a los pocillos apropiados llevando el volumen total en cada pocillo a 200 l.
Las células se incubaron durante 1, 2 o 3 días a 37 °C y CO2 al 5 %.
Tinción de anticuerpos y citometría de flujo
La placa de fondo en U de 96 pocillos se centrifugó durante 5 minutos a 453 g y se retiró el sobrenadante.
Las células se lavaron con 200 pl de PBS y se centrifugaron como en la etapa 5.5.1.
El sobrenadante se descartó y se resuspendió en 50 pl de PBS que contenía los siguientes anticuerpos:
• CD14-APC (clon HCD14) 1:250 (Biolegend n.° de cat. 325608)
• HLADR-PE Cy7 (clon L243) 1:250 (Biolegend cat n.° de cat. 307616)
• CD80-PE (clon 2D10) 1:250 (Biolegend n.° de cat. 305208)
• inhibidor de unión de Hu FcR (eBioscience n.° de cat. 14-9161-73)
Se incubó durante 20 minutos en hielo húmedo en la oscuridad.
Se añadieron 150 pl de PBS y se centrifugó como en la etapa 5.5.1.
Se añadieron 150 l de tampón PBS y se analizó mediante FACS.
Las muestras se desarrollaron en un citómetro de flujo de 10 parámetros MACSQuant de Miltenyi y se analizaron usando FlowJo 9.7.5 para expresión de HLA-DR y c D80 en la población de CD14+. La intensidad de fluorescencia media geométrica (MFl), una estadística que define la tendencia central de un conjunto de números, se usó como estadística definitoria para comparar tratamientos.
Análisis estadístico
Todas las estadísticas se llevaron a cabo en Prism GraphPad, versión 6. Se realizaron comparaciones por pares entre los grupos en cada uno de los puntos temporales usando ANOVA unilateral con corrección de Tukey para multiplicidad. Los valores de p inferiores a 0,05 para todos los ensayos y comparaciones se consideraron significativos. Para todos los gráficos y tablas, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.
EJEMPLO 16: ACTIVIDADES ADCC Y ADCP DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA
VSTB174 tiene un Fc de IgG1, que puede conferir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y actividad de fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP). Ambos tipos de ensayos se realizaron y mostraron que VSTB174 podía producir lisis o fagocitar células K562-VISTA (Figuras 33-34), pero no células precursoras de la línea celular de mieloma K562 (datos no mostrados). Un mecanismo de acción adicional de VSTB174 para modular la acción inhibidora de VISTA puede ser la lisis o la absorción de células que expresan niveles altos de VISTA, retirando las de ese modo del microentorno local.
EJEMPLO 17: ACTIVIDADES DE ADCP DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA ADICIONALES
Para estudiar el aumento de fagocitosis mediada por macrófagos de células que expresan VISTA de forma ectópica por los AcM anti-VISTA humano (VSTB173 y VSTB174) se usó un ensayo de fagocitosis in vitro. Estos AcM se clonaron en diferentes cadenas principales de Fc (IgG1 WT (tipo natural), IgG1 PR (resistente a proteasa) e IgG2a) y se postuló que tenían potencialmente diferentes actividades con respecto al aumento de fagocitosis. Las cadenas principales de de IgG1 e IgG1 PR son capaces de unirse a los receptores de Fc y tienen el potencial de causar ADCP, mientras que IgG2a no se une a receptores de Fc y no debería mediar en ADCP.
Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-VISTA en ensayos de ADCP con células precursoras K562 y diana K562-VISTA. Como se muestra en las Figuras 35-36, VsTb 174, VSTB149, VSTB173 y VSTB145 aumentaron la fagocitosis de hMac de células K562-VISTA. Los anticuerpos de VISTA, VSTB140 o v St B132, con el Fc de IgG2a que no se unía a receptores de Fc, no aumentaron la fagocitosis tal como se esperaba. Los AcM de VISTA, VSTB174 y VSTB173, con Fc de IgG1 mostraron una fagocitosis más robusta que VSTB149 y VSTB145 con Fc de IgGIPR (véanse las Tablas 13 y 14 para conocer los valores de CE50).
Tabla 13. Valores de CE50 de AcM anti-VISTA humano.
Figure imgf000043_0002
Tabla 14. Valores de CE50 de AcM anti-VISTA humano.
Figure imgf000043_0003
VSTB174 y VSTB173 mostraron un aumento débil de la fagocitosis de células precursoras K562 a la concentración más alta (Figuras 35-36), lo que se puede deber a la baja expresión de VISTA por las células K562. Los otros anticuerpos anti-VISTA no aumentaron la fagocitosis de las células K562.
Cada uno de los anticuerpos de control negativo se sometieron a ensayo a dos concentraciones diferentes en el ensayo de fagocitosis de K562-VISTA, pero no indujeron fagocitosis. Este resultado indica que la fagocitosis mediada por los anticuerpos anti-VISTA es específica y se debe a la expresión antigénica de VISTA por las células K562-VISTA.
EJEMPLO 18: ACTIVIDADES DE ADCC DE ANTICUERPOS ANTI-VISTA ADICIONALES
Para someter a ensayo su capacidad para inducir ADCC, se sometieron a ensayos los tres anticuerpos anti-VISTA siguientes:
VSTB174 (IgG1)
VSTB149 (IgG1 PR)
VSTB174.LF (IgG1 LF (bajo contenido de fucosa)).
Cada anticuerpo se sometió a ensayo a seis concentraciones diferentes dentro de la misma placa, por triplicado en dos experimentos separados para un total de seis puntos de datos.
VSTB174, VSTB149 y VSTB174.LF demostraron cada uno una actividad de ADCC medible a 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml, mientras que solo el anticuerpo LF demostró una actividad de ADCC medible a 0,001 pg/ml; ninguno de los anticuerpos demostró ADCC a 0,0001 pg/ml. Como cada uno de estos anticuerpos tiene una IgG1 o un Fc variante de IgG1, este resultado es el esperado. El anticuerpo LF demostró un aumento de la potencia de ADCC, tal como lo evidencia el valor de CE50 menor para la curva de anticuerpos de LF (0,002293 pg/ml) en comparación con la curva de anticuerpos IgG1 normal (0,02381 pg/ml). La curva de anticuerpos IgG1 PR tenía un valor de CE50 similar al de la curva de IgG1 normal (0,01846 pg/ml).
Tabla 15. Valores de CE50 (pg/ml) de tres anticuerpos anti-VISTA sometidos a ensayo
Figure imgf000043_0001
Los anticuerpos IgG1 humana, IgG1 PR humana e IgG1 LF humana mostraron destrucción mediada por ADCC medible a las concentraciones de anticuerpo de 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml, mientras que solo el anticuerpo LF mostró destrucción a la concentración de anticuerpo de 0,001 pg/ml. Ninguno de los anticuerpos anti-VISTA mostró destrucción a la concentración de anticuerpo de 0,0001 pg/ml.
El anticuerpo LF mostró una destrucción de ADCC aproximadamente 10 veces más potente que el anticuerpo IgG1 normal o el anticuerpo IgG1 PR, como se observa en los valores de CE50.
EJEMPLO 19: AFINIDAD DE VSTB174 PARA VISTA HUMANO Y DE CINOMOLGO
La afinidad de VSTB174 por el dominio extracelular (ECD) de VISTA humano y de mono cinomolgo se determinó mediante métodos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento ProteOn. VSTB174 mostró valores de Kd muy similares para cada proteína, 1,56e-10 M para ECD de VISTA humano y 8,66E-11 M para VISTA de cinomolgo.
EJEMPLO 20: LOS ANTICUERPOS VISTA EXHIBEN EFICACIA EN MODELOS TUMORALES MURINOS Cepas de ratón, reactivos y modelos tumorales
Para los estudios in vivo, se usaron ratones con inserción génica de VISTA humano (VISTA-KI) retrocruzados sobre un fondo de C57Bl/6.
Se generó un anticuerpo anti-VISTA humano para permitir el ensayo en los ratones VISTA-KI, usando la región variable VSTB174 injertada en IgG2a de Fc de ratón (VSTB123).
El cáncer de vejiga MB49 se evaluó en los ratones VISTA KI.
Además de los estudios publicados que demuestran que la terapia con anticuerpo anti-VISTA inhibe el crecimiento tumoral en ratones de tipo natural (Le Mercier et al., 2014), la eficacia antitumoral se ha demostrado con el anticuerpo de hámster sustituto en ratones wt usando diferentes programas de dosificación, y en los ratones VISTA-KI tratados con VSTB123.
Estudios de eficacia in vivo en el modelo tumoral MB49 en ratones VISTA-KI
Se realizaron estudios de eficacia de MB49 en ratones VISTA-KI hembra, sometiendo a ensayo VSTB123 a varias dosis que variaban entre 1- 10 mg/kg. A los ratones se les inyectaron, por vía intradérmica, 250.000 células tumorales MB49 el día 0. El día 6, la dosificación comenzó como se indica en la Figura 37 (cualquiera de 10 mg/kg del mIgG2a de control de isotipo, o las dosis indicadas de VSTB123; 10 ratones/grupo).
VSTB123 fue más eficaz en dosis mayores que en dosis menores, tal como se muestra en la Figura 37. Las dosis de 10 mg/kg y 7,5 mg/kg fueron equivalentes, mientras que los tumores crecieron más rápidamente en los ratones que recibieron dosis de 5 o 1 mg/kg.
EJEMPLO 21: DETECCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE VISTA EN TUMORES HUMANOS CON ANTICUERPOS ANTI­ VISTA
La Figura 1 muestra la expresión de VISTA por una línea de células tumorales de LMA; esto y los datos de expresión de secuenciación de ARN en la Figura 17 respaldan la idea de que las células de LMA expresan VISTA y que el fármaco anti-VISTA es eficaz al fijarse como diana directamente en estas células para modulación inmunitaria o destrucción mediada por anticuerpo.
Los datos para evaluar la expresión de VISTA en cáncer de pulmón se obtuvieron a partir de muestras de tumores de pulmón de resecciones quirúrgicas. Las células se disociaron y caracterizaron para expresión de VISTA y otros muchos marcadores. Los resultados mostraron que 13/13 tumores de pulmón (escamosos o adenocarcinomas) contenían células mieloides CD14+ VISTA+, (Figura 38).
EJEMPLO 22: DETECCIÓN DE EXPRESIÓN DE VISTA EN TUMORES DE PULMÓN USANDO ANTICUERPOS ANTI-VISTA
Se desarrolló un ensayo de inmunohistoquímica usando el clon GG8, una IgG1 de ratón anti-VISTA humano. Este AcM se usó para investigar la tinción de VISTA en secciones de tumores FFPE de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
Las secciones de tumor FFPE se trataron con métodos estándar de recuperación de antígenos antes de la tinción. Se usó anticuerpo anti-VISTA humano de ratón GG8 a una dilución de 1:500. La unión de GG8 se detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón, seguido de HRP polimérico anti-conejo. A continuación, se realizó una contratinción con hematoxilina y a continuación se puntuaron las secciones tumorales.
La expresión de VISTA en cáncer de pulmón se restringió principalmente al infiltrado inmunitario (ejemplo que se muestra en la Figura 39) y había presencia de altos niveles de células positivas para VISTA en muchas muestras de cáncer de pulmón.
EJEMPLO 23: ESTRUCTURA DEL DOMINIO EXTRACELULAR (ECD) DE VISTA HUMANO EN COMPLEJO CON EL FRAGMENTO FAB DE VSTB174
Se generaron variantes de antígeno de VISTA y se purificaron para cristalografía. El Fab de VSTB174 recombinante marcado con his se expresó internamente y se purificó. Se generaron cristales y se usaron para recoger datos de mayor resolución para el complejo de Fab ECD de VISTA:VSTB174 usando radiación de sincrotrón y la determinación estructural se resolvió usando combinaciones de modelos de homología y análisis de densidad electrónica (Figura 29 (parte superior)).
La estructura del complejo de Fab ECD de VISTA:VSTB174 se determinó mediante cristalografía de rayos X a una resolución de 1,85 A, proporcionando la primera estructura del ECD de VISTA y delineando el epítopo y parátopo VSTB174. El ECD de VISTA adopta un plegamiento de IgV con una topología similar al ECD de CTLA-4, pero posee una hebra G' única que extiende la lámina frontal del sándwich p. A' y G' se unen químicamente mediante un puente disulfuro formado entre los restos C12 en la hebra A' y C146 en la hebra G'. Se encontró que participaban seis cisteínas en tres enlaces disulfuro intramoleculares, y, basándose en contactos cristalinos, no hay evidencias de un VISTA dimérico.
VSTB174 reconoce restos en las hebras de la lámina frontal C', C, F y G en los extremos proximales al bucle FG, así como restos en los bucles BC, FG y CC'.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a un supresor de Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende un polipéptido de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 37 y un polipéptido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 44.
2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende además:
(a) una región constante de cadena pesada humana, que es opcionalmente una región constante de IgG1 humana; y/o
(b) una región constante de cadena ligera humana, que es opcionalmente una región constante de cadena ligera kappa humana.
3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dicha región constante de cadena pesada humana comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana que se ha modificado para aumentar la resistencia a proteasa del anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera.
5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende:
(a) un polipéptido de cadena pesada de SEQ ID NO: 60 o 61; y
(b) un polipéptido de cadena ligera de SEQ ID NO: 56.
6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende:
(a) un polipéptido de cadena pesada de SEQ ID NO: 55 o 59; y
(b) un polipéptido de cadena ligera de SEQ ID NO: 56.
7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo IgG completo, en donde: (i) el polipéptido de cadena pesada consiste en SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de cadena ligera consiste en SEQ ID NO: 56; (VSTB112);
(ii) el polipéptido de cadena pesada consiste en SEQ ID NO: 59 y el polipéptido de cadena ligera consiste en SEQ ID NO: 56; (VSTB140);
(iii) el polipéptido de cadena pesada consiste en SEQ ID NO: 60 y el polipéptido de cadena ligera consiste en SEQ ID NO: 56; (VSTB149); o
(iv) el polipéptido de cadena pesada consiste en SEQ ID NO: 61 y el polipéptido de cadena ligera consiste en SEQ ID NO: 56 (VSTB174).
8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se expresa en una célula que es deficiente en enzimas de fucosilación, opcionalmente en donde la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, opcionalmente en un vector de expresión.
11. Una célula recombinante que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un método de expresión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 11 en condiciones que promueven la expresión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
13. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para uso en el tratamiento de cáncer, en donde el tratamiento comprende administrar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un sujeto que lo necesita.
14. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cáncer es leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásico, mieloma, o un tumor sólido,
opcionalmente en donde el tumor sólido es cáncer de vejiga o cáncer de pulmón, opcionalmente cáncer de pulmón no microcítico (CPNM),
opcionalmente además en donde el tumor sólido está rodeado por un estroma tumoral que comprende células mieloides, linfocitos T, o una combinación de células mieloides y linfocitos T o está infiltrado con células mieloides, linfocitos T o una combinación de células mieloides y linfocitos T,
opcionalmente además en donde dicha leucemia es leucemia linfocítica, leucemia mielógena, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia de linfocitos grandes granulares, o leucemia de linfocitos T del adulto,
y opcionalmente además en donde se administra al sujeto además una vacuna y/o un segundo tratamiento para cáncer.
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