BR112016014966B1 - Anticorpos humanizados isolados anti-vista ou seus fragmentos,composição, uso e artigo - Google Patents

Anticorpos humanizados isolados anti-vista ou seus fragmentos,composição, uso e artigo Download PDF

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Abstract

anticorpos e fragmentos anti-vista. a presente invenção diz respeito a novos anticorpos e fragmentos que ligam a um supressor ig de domínio v de ativação de célula t (vista), e métodos de fazer e usar os mesmos. métodos de uso incluem métodos de tratamento de câncer, incluindo leucemias, linfomas, tumores sólidos e melanomas.

Description

PEDIDO(S) RELACIONADO(S)
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US No. 61/920.695, depositado em 24 de dezembro de 2013 e Pedido Provisório US No. 62/085,086, depositado em 26 de novembro de 2014. Todos os ensinamentos das aplicações acima são incorporados aqui por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] A expressão de reguladores de ponto de verificação imune negativo por células de câncer ou células imunes no microambiente do tumor podem suprimir a resposta imune do hospedeiro contra o tumor. Para combater de forma eficaz o câncer, é desejável bloquear a supressão mediada por tumor da resposta imune do hospedeiro. Consequentemente, existe uma necessidade de agentes terapêuticos novos e eficazes que inibem os reguladores de pontos de verificação imune negativos no microambiente tumoral que suprimem as respostas imunes anti-tumor.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno que se liga a um supressor Ig de domínio da ativação das células T (VISTA). VISTA é um regulador negativo do ponto de verificação que suprime as respostas imunes. Veja Wang et al, "VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses", J. Exp. Med., 208 (3) 577-92 (2011). Ela é expressa em neutrófilos humanos normais, monócitos e subconjuntos de células T. Além disso, células de macaco cinomólogo expressam VISTA em um padrão semelhante para células humanas normais. VISTA também se expressa nas células do sangue periférico de pacientes com câncer.
[0004] A ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo para o VISTA modula ou aumenta uma resposta imune. O fragmento de anticorpo pode incluir, por exemplo, um fragmento Fab, F (ab')2, ou um fragmento de anticorpo scFv. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender uma região constante de anticorpo. O anticorpo ou fragmento de anticorpo se pode ligar para o VISTA que é expresso em uma célula hematopoiética, por exemplo, uma célula mielóide e/ou um linfócito, monócito ou um neutrófilo, uma célula T, uma célula assassina natural (K), um células T assassinas naturais (NKT), uma célula de tumor, e/ou no microambiente tumoral (TME). O microambiente do tumor é o ambiente celular do tumor. Pode incluir células circundantes imunes, fibroblastos, vasos sanguíneos, outras células, moléculas de sinalização, e a matriz extracelular.
[0005] O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender uma ou mais regiões de cadeia pesada determinante de complementaridade (CDRs) e/ou uma ou mais CDRs da cadeia leve, incluindo uma ou mais CDR (por exemplo, todas as três CDR de cadeias pesadas, as 3 CDR da cadeia leve, ou todas as 6 CDRs) de qualquer um dos anticorpos antiVISTA aqui descrito, incluindo os anticorpos designados VSTB112 (S2), VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) e VSTB60 (S47). Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos são selecionados dentre o grupo que consiste em VSTB112, VSTB95, VSTB116, VSTB50, VSTB53 e VSTB60. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento compreende uma ou mais das CDR de cadeia pesada e uma ou mais CDRs de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos antiVISTA aqui descritos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ainda compreender, pelo menos, uma cadeia pesada e, pelo menos, uma cadeia leve de qualquer um dos anticorpos anti-VISTA aqui descritos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende a sequência da região variável da cadeia pesada, e/ou, pelo menos, uma cadeia leve que compreende a sequência da região variável da cadeia leve. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região de estrutura humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo completo. Em algumas modalidades, o fragmento é um membro de ligação anti-VISTA. Em algumas modalidades, as CDRs de cadeia pesada do anticorpo estão representadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3 e as CDR de cadeia leve estão representadas nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. Em algumas modalidades, a cadeia pesada e leve sequências de aminoácidos da região variável da cadeia estão representadas nas SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente.
[0006] A invenção também abrange anticorpos anti-VISTA que são substancialmente semelhantes aos anticorpos aqui descritos. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento compreende um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR1 VH tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de VH possuindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 2 e uma CDR3 VH com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 3, e que compreende adicionalmente um domínio VL de anticorpo compreendendo uma CDR1 de VL possuindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 4, uma CDR2 de VL tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 de VL possuindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente semelhante a SEQ ID NO: 6.
[0007] A invenção também se refere a anticorpos anti-VISTA que inibem competitivamente, ou competem para a ligação a, os anticorpos anti-VISTA aqui descritos.
[0008] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-VISTA são parte de um conjugado, por exemplo, um conjugado que compreende uma molécula citotóxica ou outro agente aqui descrito. Tais moléculas são bem conhecidos na arte.
[0009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região constante humana. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é específico para um epitopo do VISTA, por exemplo, dentro da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a um epitopo de VISTA com uma afinidade de pelo menos 1x10- 7 litros/mol, por exemplo, pelo menos, 1x10-8 litros/mol, por exemplo, pelo menos, 1x10-9 litros/mole.
[0010] Em algumas modalidades, a modulação da resposta imune compreende um aumento nos leucócitos CD45 +, células T CD4 + e/ou células T CD8 +. Em algumas modalidades, a modulação da resposta imune compreende a produção de (por exemplo, células T) (por exemplo, IFNy, IL-10, TNFα, IL-17) a resposta de células T, melhorada, e/ou a expressão de Foxp3 citocinas modulada.
[0011] A presente invenção também se refere a composições compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo aqui descrito (p.ex., um anticorpo anti-VISTA) e um transportador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição pode compreender um antagonista VISTA compreendendo um anticorpo ou fragmento desse anticorpo, que compreende uma região de ligação ao antígeno que se liga ao VISTA, e uma vacina (tais como uma vacina de vetor viral, vacina bacteriana, a vacina de DNA, vacina de RNA, a vacina de peptídeo). Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo para VISTA modula ou aumenta uma resposta imune.
[0012] A invenção também se refere a métodos para o tratamento ou prevenção do câncer que compreende a administração a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano ou um animal não-humano) em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de, pelo menos, um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou composição aqui descrita.
[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga-se ao VISTA, modulando desse modo ou aumentando uma resposta imunogênica ao câncer. Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia, linfoma, síndrome de Down e/ou mieloma mielodisplásica. Em algumas modalidades, o câncer pode ser qualquer espécie ou tipo de leucemia, incluindo a leucemia linfocítica ou uma leucemia mielóide, tais como, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL), mielóide aguda (mielóide) leucemia (AML), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica grande granular, ou leucemia de células T do adulto. Em algumas modalidades, o linfoma é linfoma histocítico, e em algumas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido, por exemplo, um melanoma, ou câncer da bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer do pulmão (por exemplo, um carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC)). Alguns métodos de tratamento compreendem ainda a administração de uma vacina (tais como uma vacina de vetor viral, vacina bacteriana, vacina baseada em célula, a vacina de DNA, RNA vacina, vacina de peptídeos, ou vacina de proteína). A invenção também se refere a um método para suprimir o crescimento tumoral num indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo o referido método a administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo eficaz ou composição aqui descrita.
[0014] A composição, o anticorpo ou seu fragmento ou outro agente farmacêutico (por exemplo, uma vacina) pode ser administrado por qualquer meio parentérica ou não parenteral, por exemplo, por via intravenosa (IV), por via subcutânea (SQ) ou por via oral (PO).
[0015] Em algumas modalidades, a composição, o anticorpo ou fragmento é administrado trimestral, semanais, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas. Em algumas modalidades, outros agentes farmacêuticos ou terapêuticos são co-administrados, antes, durante ou depois de os anticorpos, fragmentos e composições aqui descritos. O agente co-administrado pode ser administrado pela mesma via que o anticorpo, fragmento ou composição, ou por uma via diferente.
[0016] A invenção também inclui métodos de preparação dos anticorpos, fragmentos e composições, por exemplo, um método de produção de um anticorpo ou um seu fragmento aqui descrito, compreendendo a cultura de células hospedeiras sob condições para a produção do referido anticorpo. O método pode ainda compreender o isolamento do anticorpo. A invenção também se refere a ácidos nucleicos, por exemplo, ácidos nucleicos isolados que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica os anticorpos e fragmentos, vetores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos, por exemplo, operacionalmente ligado a um promotor, e células hospedeiras transformadas com um tal Vetor de expressão.
[0017] A invenção também diz respeito a kits e artigos de fabricação compreendendo uma composição compreendendo um anticorpo anti-VISTA e um recipiente, e compreendendo ainda uma bula ou rótulo que indica que a composição pode ser utilizada para tratar o câncer.
[0018] A invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado, compreendendo uma região de ligação ao antígeno que se liga a um Supressor Ig de domínio V de Ativação de células T (VISTA), em que o anticorpo compreende um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR1 VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR2 VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma VH CDR3 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e que compreende adicionalmente um domínio VL do anticorpo compreende uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma CDR2 VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma ou mais regiões de estrutura humanas ou humanizadas. Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio VH de anticorpo que compreende a SEQ ID NO: 37 e/ou um domínio VL do anticorpo compreende a SEQ ID NO: 44. Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada (por exemplo, uma região constante da cadeia pesada humana) e/ou uma região constante de cadeia leve (por exemplo, uma região constante da cadeia leve humana, tais como a região constante da cadeia leve presente em SEQ ID NO: 56). De preferência, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgG1 (por exemplo, a região constante de cadeia pesada de IgG1 presente na SEQ ID NO: 61). Em uma modalidade particular, a região constante da cadeia pesada de IgG1 foi modificada para aumentar a resistência à protease do anticorpo. Um exemplo de uma região constante de cadeia pesada de IgG1, que foi modificada para aumentar a resistência a protease é a região constante da cadeia pesada IgG1 presente na SEQ ID NO: 60. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO.60 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 56; ou uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 61 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 56. Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é expresso em uma célula que é deficiente em enzimas de fucosilação (por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) que é deficiente em enzimas de fucosilação).
[0019] A invenção também se refere a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo, compreendendo um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR1 VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR2 VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 26 e uma CDR3 VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID nO: 27, e que compreende adicionalmente um domínio VL do anticorpo compreende uma CDR1 VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma CDR2 VL tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e um transportador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0020] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo o referido método a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um Supressor Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA), em que o anticorpo compreende um domínio VH de anticorpo compreendendo uma CDR1 VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR2 VH tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma CDR3 VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e que compreende adicionalmente um domínio VL do anticorpo compreende uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e um CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade particular, o câncer é um câncer do pulmão. Em uma outra modalidade, o câncer do pulmão é um carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um segundo tratamento de câncer (por exemplo, cirurgia, quimioterapia, terapia de radiação, terapia biológica, a terapia imunomoduladora, e combinações dos mesmos).
[0021] A invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento desse anticorpo, que compreende uma região de ligação ao antígeno que se liga a um Supressor Ig de domínio V de Ativação das células T (VISTA), em que o anticorpo se liga a um epitopo conformacional no VISTA (por exemplo, vista humana ). Em algumas modalidades, o epitopo conformacional compreende, ou está presente dentro, os resíduos 103-111 (NLTLLDSGL (SEQ ID N062)) e 136-146 (VQTGKDAPSNC (SEQ ID NO: 63)) do VISTA humana (SEQ ID NO: 46). Em outra modalidade, o epitopo conformacional compreende, ou está presente dentro de, resíduos 24-36 (LLGPVDKGHDVTF (SEQ ID NO: 64)), 54-65 (RRPIRNLTFQDL (SEQ ID NO: 65) e 100-102 (TMR) de VISTA humana (SEQ ID NO: 46.) Ainda em outra modalidade, o epitopo conformacional compreende os resíduos de aminoácido no laço FG de VISTA humana (SEQ ID NO: 46).
[0022] Além disso, a invenção refere-se a um método de melhorar uma resposta imune em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao supressor Ig de domínio da ativação das células T (VISTA), ou um fragmento desse anticorpo, que compreende uma região de ligação ao antígeno que se liga ao VISTA, aumentando, assim, uma resposta imune para o câncer. Em uma modalidade particular, a resposta imune é uma resposta imune anti-tumoral.
[0023] Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método para desencadear uma resposta biológica num indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao supressor Ig de domínio da ativação das células T (VISTA) , ou um fragmento desse anticorpo, que compreende uma região de ligação ao antígeno que se liga ao VISTA, aumentando, assim, uma resposta imune para o câncer. Exemplos de respostas biológicas incluem a ativação de monócitos; indução de proliferação das células T e a secreção de citocina; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) de células que expressam VISTA; e fagocitose celular dependente do anticorpo (ADCP) de células que expressam VISTA.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] A patente ou pedido de patente contém pelo menos um desenho executado a cores. Cópias desta patente ou patente de publicação do pedido com o desenho(s) colorido serão fornecidas pelo Instituto mediante pedido e pagamento da taxa necessária.
[0025] A Figura 1A-1-C: Os gráficos que mostram a expressão de VISTA em expressão de células AML VISTA TF1 da proteína por citometria de fluxo é mostrado na linha celular TF-1 LMA.
[0026] Figura 2A-2E: Gráficos que mostram estratégias de coloração e propagação para identificação de Mielóide Humana e Subconjuntos linfóides.
[0027] Figura 3A-3G: Os gráficos mostrando a expressão de VISTA em Mielóide humano e Subconjuntos de linfóides de um dador normal saudável.
[0028] Figura 4: Gráfico que mostra a expressão do VISTA em Mielóide Humana e os subconjuntos linfóides em vários dadores normais saudáveis.
[0029] Figura 5A-5B: Gráfico mostrando estratégias de coloração e propagação para identificação de expressão do VISTA em monócitos humanos e macrófagos.
[0030] Figura 6 A-6c: Gráficos mostrando expressão de VISTA de monócitos e macrófagos humanos.
[0031] Figura 7A-7E: Gráficos que mostram estratégias de coloração e propagação para identificação de expressão do VISTA em T Humana e subconjuntos de células NK.
[0032] Figura 8A-8G: Gráficos que mostram expressão de VISTA em T Humana e Subconjuntos de células NK de um dador normal saudável.
[0033] Figura 9: Gráfico que mostra a expressão do VISTA em T Humana e subconjuntos de células NK através de múltiplos doadores normais saudáveis.
[0034] Figura 10A-10D: Gráficos que mostram estratégias de coloração e propagação para identificação de expressão do VISTA em subpopulações de células dendríticas humanas.
[0035] Figura 11 A- 11 C: Gráficos mostrando expressão de VISTA de subpopulações de células dendríticas humanas e basófilos de um dador normal saudável.
[0036] Figura 12: Gráfico que mostra a expressão do VISTA em subpopulações de células dendríticas humanas e basófilos através de múltiplos doadores normais saudáveis.
[0037] A Figura 13A-13D: Análise da expressão VISTA em células de sangue periférico humanos saudáveis. Perfil de expressão VISTA em células saudáveis humanas do sangue periférico usando fluxo multicolor análise de citometria: Amostras de sangue total a partir de 2 indivíduos diferentes foram analisadas para a expressão VISTA em (Figura 13 A) monócitos SSCtoCD11bhiCD14hiCD16-veCD33+veHLA-DR+veCD19-ve) (Figura 13B) neutrófilos (SSChiCD177+CD11bhiCD14loCD16+veCD33+veHLA-DR-veCD19-ve). As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas utilizando gradiente de Ficoll para análise de (Figura 13C) células T CD4 + (CD3+veCD4+ve), e células T (Figura 13D) CD8 + (células CD3+veCD8+ve).
[0038] A Figura 14A-14C: Análise da expressão VISTA em células do sangue periférico de um paciente de câncer do pulmão e um dador de controle saudável. Perfil de expressão VISTA em células sanguíneas de pacientes com câncer do pulmão periféricos usando análise de citometria de fluxo multicolor: Lote Representante FACS (Figura 14 A) de um indivíduo é mostrado. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por Ficoll e analisadas para a expressão VISTA ON (Figura 14b) monócitos (CD14+ CD11b+ CD33 + HLADR+CD15-) e (Figura 14C) mielóides derivadas de células supressoras (CD14-CD11b+CD33-HLADR-CD15+CD16+).
[0039] Figura 15A-15C: Perfil de expressão VISTA em células do sangue periférico de um paciente com câncer de cólon, usando fluxo multicolor citometria análise: gráfico representativo de FACS (Figura 15 A) a partir de um indivíduo é mostrado. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por Ficoll e analisados para a expressão VISTA em (Figura 15b) monócitos (CD14+CD11b+CD33+HLADR+CD15-) e (Figura 15C) células supressoras derivadas de mielóide (CD14-CD11b+CD33-HLADR- CD15+CD16+).
[0040] Figura 16A-16D: Perfil de expressão VISTA em células do sangue periférico macacos cinomólogos usando análise de citometria de fluxo multicolor: sangue total a partir de 4 macacos diferentes foi analisado para a expressão VISTA em monócitos (Figura 16a) (SSChiCD11bhiCD14hiHLA-DR-hiCD16-veCD19-ve) e (Figura 16B) neutrófilos CD11bhiCD14loHLA-CR-veCD16-veCD19-ve. As células mononucleares do sangue periférico de três macacos foram isoladas utilizando gradiente de Ficoll para análise da (Figura 16C), as células T CD4 + (TCRα/β+veCD4+ve) e ( Figura 16D) células T CD8 +( TCRα/β+veCD8+ve).
[0041] Figura 17: Representação gráfica que mostra os valores absolutos de expressão de VISTA RNA em linhas celulares de heme.
[0042] Figura 18: células do rato A20 foram estavelmente transfectadas com GFP ou VISTA humano. Eles foram incubados com o peptídeo de óvulos e com células T DOL 1.10. Expressão de CD25 pelas células T foi medida 24 horas após a incubação iniciar. As células A20-huVISTA suprimem a expressão de CD25 pelas células T, mas esta leitura é significativamente restaurada por incubação com VSTB95.
[0043] Figura 19A- 19F: Gráficos mostrando resultados ELISA de VISTA Humano.
[0044] A Figura 20A-20F: resultados FACS de VISTA Humana, mostrando anticorpos anti-VISTA que se ligam a células que expressam VISTA humano.
[0045] Figura 21A-21D: estudo de diluição de 6 anticorpos anti-VISTA candidatos em reação mista de linfócitos de 30 μg/ml a 0,0 μg/ml.
[0046] Figura 22 A-22B: estudos diluição de 6 candidatos de anticorpos anti-VISTA no ensaio SEB (CPM contagens individuais e as concentrações de IFN-g) de 30 μg ml a 0,0 μg/ml.
[0047] Figura 23: Plotagem de sensorgrama usando anticorpo anti-VISTA VSTB85 revestido em um chip Proteon SPR e proteína VISTA com os concorrentes indicados correm sobre o chip (concorrentes listadas na Tabela 16).
[0048] Figura 24: Projeto Experimental para o modelo de tumor de bexiga de murino MB49
[0049] Figura 25 A-25B: MB49 do crescimento do tumor em ratinhos fêmea C57B1/6. Os gráficos ilustram o crescimento de tumores em ratinhos individuais tratados com anticorpo anti-ratinho VISTA (Figura 25B) ou IgG de controle (Figura 25A).
[0050] Figura 26: Sequência de aminoácidos do VISTA humana (SEQ ID NO: 46).
[0051] Figura 27: alinhamento de sequência múltipla de ortólogos VISTA
[0052] Figura 28: Regiões de VISTA humano ligadas por anticorpos VSTB50 e VSTB60 (topo) ou VSTB95 e VSTB112 anticorpos (inferior), tal como determinado por HDX
[0053] Figura 29: VISTA epitopo ligado por VSTB112. (Top) VISTA é mostrado em desenhos animados com cadeias marcadas. Os resíduos que têm pelo menos um átomo de dentro 5 de um VSTB112 no complexo é de cor azul. Esferas azuis e alaranjadas destacam uma ruptura da cadeia, e o ciano e esferas verdes marcam o N- e C-terminais da estrutura VISTA, respectivamente. (Inferior) Sequência de construto VISTA utilizada na determinação da estrutura. Círculos abaixo da sequência são usados para indicar os resíduos que fazem apenas contatos principais de cadeias com VSTB112, triângulos indicam um contato cadeia lateral, e quadrados indicam os resultados de contato cadeia lateral em qualquer uma ligação de hidrogênio ou interação por ponte salina como calculado pelo PISA. Formas são coloridas para indicar a CDR que tem o maior número de átomos de contactados pelo resíduo dado com cores CDR definidos na Figura 59. Os elementos estruturais secundários são como definidos no programa MOE com setas amarelas representam fios-β e retângulos vermelhos indicando hélices-a.
[0054] Figura 30: paratopo VSTB112. Antígeno (Superior) VISTA é mostrado na ilustração e VSTB112 dentro de 5 Angstrom (Â) de VISTA é mostrado na superfície com cores utilizadas para designar identidade CDR, tal como especificado na sequência abaixo. Contactar os resíduos estruturais adjacentes a uma CDR são coloridos de modo semelhante à correspondente sequência CDR (inferior) da região Fv VSTB112. Fundos coloridos especificam CDRs de acordo com definições de Kabat. Círculos abaixo da sequência são usados para indicar os resíduos que fazem cadeia principal apenas contatam com o VISTA, triângulos indicam um contato da cadeia lateral, e quadrados indicam os resultados de contato cadeia lateral em qualquer uma ligação de hidrogênio ou interação ponte salina como calculado pelo PISA.
[0055] Figura 31: Comparação das regiões identificadas de epitopo por troca de hidrogênio e cristalografia de deutério (HDX). Sequência de construto de VISTA utilizada na determinação da estrutura. Círculos abaixo da sequência são usados para indicar os resíduos que fazem apenas contatos com cadeias principais com VSTB112, triângulos indicam um contato da cadeia lateral, e quadrados indicam os resultados de contato da cadeia lateral em tano uma ligação de hidrogênio ou interação por ponte salina como calculado por PISA.
[0056] Figura 32: A ativação de monócitos CD14 + em PBMC intergal por VSTB174 (derivado a partir VSTB112). Em cada parte da experiência, as células foram incubadas com PBS, anticorpos de controle IgG1, ou VSTB174 em 1, 0,1 ou 0,01 ug/ml. Painel esquerdo mostra CD80 IFM; painel direito mostra a HLA-DR MFI (dois doadores testados com resultados representativos mostrados).
[0057] Figura 33: Gráfico mostrando a atividade de ADCC VSTB174 dirigida contra células K562-VISTA.
[0058] Figura 34: Gráfico mostrando atividade ADCP de VSTB174 dirigida contra células K562-VISTA. Ambos os anticorpos representados têm o mesmo Fab, mas VSTB174 tem um IgG1 Fc e VSTB140 tem Fc IgG2 silencioso.
[0059] Figura 35: Gráfico mostrando a fagocitose mediada por VSTB 174, VSTB149 ou VSTB 140 mAbs contra K562-VISTA. Cada mAb foi testado com 7 doses metade de log, que varia de 0,0008 μg/ml a 0,56 ug/ml.
[0060] Figura 36: Gráfico mostrando a fagocitose mediada por VSTB 174, VSTB 149 ou 140 VSTB mAbs contra as células K562 da linha de células de mieloma. Cada mAb foi testado com doses 7 de metade de log, que varia de 0,0008 μg/ml a 0,56 ug/ml.
[0061] Figura 37: estudo de eficácia MB49 tumor avaliando VSTB 123 1, 5, 7,5, e 10 mg/kg em ratos fêmea VISTA-KI. Os volumes tumorais foram aproximadamente 50 mm3 quando o tratamento começou no dia 6 após o implante. VSTB123 é o VSTB1 12 Fab enxertado em um andaime rato Fc e se liga a VISTA humano no rato VISTA-KI.
[0062] Figura 38: O gráfico mostra que as células CD 14+ que expressam níveis de VISTA altos/intermediários são encontrados em 13/13 amostras de câncer do pulmão, bem como em tecido de pulmão e distante do sangue periférico dos pacientes.
[0063] Figura 39: Coloração IHC para o VISTA no câncer de pulmão usando GG8.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0064] Uma descrição de exemplos de modalidades da invenção segue.
[0065] A presente invenção refere-se a anticorpos contra o novo ligante da família designado Supressor de Imuniglobulina de domínio-V de Ativação de célula T (VISTA) (GenBank: 602184 J) (Wang et al, 2010, 2011.). VISTA carrega homologia com PD-L1, mas exibe um padrão de expressão único que é restrito para o compartimento hematopoiético. Especificamente, o VISTA é constitutivamente e altamente expresso em células mielóides CD11balto, e expressos em níveis mais baixos em células T CD4+ e CD8+. As ações do homólogo humano de aproximadamente 85% de homologia com murino VISTA e tem padrões de expressão similares (Lines et al, Câncer Research 74: 1924, 2014). VISTA expresso em células apresentadoras de antígenos (APCs) suprime proliferação de células T CD4+ e CD8+ e produção de citoquinas por meio de um receptor cognato de independente de PD-1. Em um modelo de doença EAE passiva (encefalomielite experimental auto-imune), respostas imunes dependentes de célula T intensificadas de anticorpo monoclonal específico de VISTA e doenças exacerbadas. Sobre-expressão de VISTA em células tumorais deficientes imunidade antitumoral protetora em hospedeiros portadores de tumor. Estudos de VISTA humana confirmou a sua função supressora de células T humanas (Linhas et al Câncer Research 74: 1924, 2014, estudos de Moscas et al também identificou VISTA (chamado PD-1H) como uma molécula de supressão imune potente (Flies et al., 201 1). VISTA é descrito em maior detalhe no pedido publicado US 20130177557 A1 dos EUA e na Patente dos EUA nos. 7.919.585 e 8.236.304, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[0066] VISTA é um novo regulador de ponto de verificação negativo que suprime as respostas imunes. Tal como descrito no Exemplo 12 aqui, o tratamento com um anticorpo monoclonal específico para o VISTA em modelos de tumores de murinos, tem sido demonstrado para inverter o caráter supressor do microambiente imunológico do tumor e aumentar a imunidade anti-tumoral protetora, assim, demonstrando o potencial de um anticorpo monoclonal VISTA como um agente terapêutico novo para a imunoterapia do câncer.
[0067] ANTICORPOS E FRAGMENTOS DA PRESENTE INVENÇÃO
[0068] O termo "anticorpo" pretende incluir anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), bem como fragmentos, regiões ou os seus derivados, fornecidos por qualquer técnica conhecida, tal como, mas não se limitando a, clivagem enzimática, síntese de peptídeos ou técnicas recombinantes. Os anticorpos anti-VISTA da presente invenção são capazes de porções de VISTA que modulam, regulam, ou aumentar uma resposta imune de ligação. Em algumas modalidades, os anticorpos inibem competitivamente a um ou mais dos anticorpos anti-VISTA aqui descritos. Os métodos para determinar se dois ou mais anticorpos que competem para a ligação ao mesmo alvo são conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de ligação competitiva pode ser utilizado para determinar se um anticorpo bloqueia a ligação de outro anticorpo para o alvo. Tipicamente, um ensaio de ligação competitiva envolve a utilização de antígeno alvo purificado (por exemplo, DP-1) ligado quer a um substrato sólido, ou células, uma molécula de ligação de teste não marcado, e uma molécula de ligação de referência marcada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da molécula de ligação de teste. Normalmente, a molécula de ligação de teste está presente em excesso. Normalmente, quando uma molécula ligação concorrente está presente em excesso, irá inibir a ligação específica de uma molécula de ligação de referência a um antígeno comum em pelo menos 5055%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou mais. Em algumas modalidades, a inibição competitiva é determinada usando um ensaio de ELISA de inibição competitiva.
[0069] Os anticorpos policlonais são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas dos soros de animais imunizados com um antígeno. Um anticorpo monoclonal contém uma população substancialmente homogênea de anticorpos específicos para antígenos, cuja população contém locais de ligação a epítopos que são substancialmente similares. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por métodos conhecidos dos peritos na arte. Ver, por exemplo Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); Pat EUA. No. 4,376,1 10; Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); e Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual de Harbor Laboratory Cold Spring (1988); Colligan et al., Eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), o conteúdo de todas as quais são incorporadas integralmente neste documento por referência. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD e qualquer subclasse das mesmas. Um hibridoma que produza um anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser cultivado in vitro, in situ ou in vivo.
[0070] A invenção também abrange fragmentos da digestão, porções especificadas e as suas variantes, incluindo os miméticos de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que mimetizam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento especificado ou sua parte, incluindo anticorpos de cadeia simples fragmentos áridos destes. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a uma proteína de mamífero VISTA. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de se ligar a VISTA ou porções dos mesmos, incluindo, mas não limitado a Fab (por exemplo, por digestão com papaína), Fab'(por exemplo, por digestão com pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (por exemplo, , por digestão com pepsina), FACB (por exemplo, por digestão com plasmina), pFc' (por exemplo, por digestão com pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, por digestão da pepsina, redução parcial e reagregação), fragmentos Fv ou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), estão abrangidas pela invenção (ver, por exemplo, Colligan, Immunology, supra). Os fragmentos de anticorpos do presente invento também incluem os discutidos e descrito em Aaron L. Nelson, mAbs de 2: 1, 77-83 (Janeiro/Fevereiro 2010), cujos conteúdos são incorporados por referência na sua totalidade.
[0071] Tais fragmentos podem ser produzidos, por exemplo, por clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, como conhecido na especialidade e/ou como aqui descrito, os anticorpos podem igualmente ser produzidos numa variedade de formas truncadas utilizando genes de anticorpos em que um ou mais códons de terminação foram introduzidos a montante do local de terminação natural. Por exemplo, um gene que codifica uma combinação de F(ab')2 porção de cadeia pesada pode ser concebido para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CHI e/ou a região charneira da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua utilizando técnicas de engenharia genética.
[0072] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina, ou uma sua porção (por exemplo, região variável, CDR) tem cerca de 70100% de identidade (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer gama ou valor nesse) para a sequência de aminoácidos da sequência variável da cadeia correspondente aqui descrita. Preferencialmente, 70-100% de identidade de aminoácidos (por exemplo, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nesse) é determinada utilizando um computador adequado algoritmo, tal como é conhecido na arte.
[0073] Exemplos de sequências de regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada são aqui proporcionados.
[0074] Os anticorpos da presente invenção, ou variantes dos mesmos especificados, pode compreender qualquer número de resíduos de aminoácidos contíguos a partir de um anticorpo do presente invento, em que o número é selecionado a partir do grupo de inteiros consistindo em 10100% de o número de resíduos contíguos de um anticorpo anti- TNF. Opcionalmente, esta subsequência de aminoácidos contíguos é pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos em comprimento, ou qualquer gama ou valor nele. Além disso, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em de 1 a 20, tal como pelo menos 2, 3, 4, ou 5.
[0075] Como os especialistas compreenderão, a presente invenção inclui, pelo menos, um anticorpo biologicamente ativo da presente invenção. Anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20%, 30%, ou 40%, e de preferência pelo menos 50%, 60%, ou 70%, e mais preferencialmente pelo menos 80%, 90%, ou 95% - 100% do referido do nativo (não sintético), endógena ou relacionado e anticorpo conhecido. Métodos de ensaio e medidas de quantificar a atividade enzimática e especificidade para o substrato, são bem conhecidos dos peritos na arte.
[0076] Similaridade substancial refere-se a um composto possuindo pelo menos 85% (por exemplo, pelo menos 95%) de identidade e pelo menos 85% (por exemplo, pelo menos 95%) da atividade do anticorpo nativo (não sintéticos), endógeno ou afins e conhecido.
[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo em que substancialmente todas as partes da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, domínios CL, CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), dobradiça, (VL, VH)) é substancialmente não-imunogênico em seres humanos, com alterações de sequência apenas pequenas ou variações. primata Da mesma forma, os anticorpos designados (macaco, babuíno, chimpanzé, e semelhantes), roedores (rato, ratazana, e semelhantes) e outros mamíferos designar tais espécies, sub-gênero, gênero, sub-família, os anticorpos específicos da família. Além disso, os anticorpos quiméricos podem incluir qualquer combinação dos anteriores. Tais mudanças ou variações opcionalmente e de um modo preferido manter ou reduzir a imunogenicidade em humanos ou outras espécies relativas a anticorpos não modificados. Assim, um anticorpo humano distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado. Salienta-se que um anticorpo humano pode ser produzido por um animal não humano ou uma célula procariótica ou eucariótica que seja capaz de expressar genes de imunoglobulina humana funcionalmente rearranjados (p.ex., cadeia leve e/ou cadeia pesada). Além disso, quando um anticorpo humano um anticorpo de cadeia simples, que pode compreender um peptídeo de ligação que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv pode compreender um peptídeo ligante, tal como duas a cerca de oito glicinas ou outros resíduos de aminoácidos, que liga a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Tais peptídeos ligantes são considerados como sendo de origem humana.
[0078] Anticorpos biespecíficos, heteroespecífico, heteroconjugados ou semelhantes podem também ser usados que são anticorpos monoclonais, preferivelmente humanos ou humanizados, anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é pelo menos uma proteína VISTA, a outra é para qualquer outro antígeno. Os métodos para preparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. A produção recombinante de anticorpos biespecíficos pode basear-se na co-expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Ver também WO 93/08829, Pat EUA. Nos. 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al, Methods in Enzymology 121: 210 (1986), cada um aqui inteiramente incorporado por referência.
[0079] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico alvejando VISTA e uma segunda proteína alvo (por exemplo, uma proteína de checkpoint imune). Anticorpos biespecíficos exemplificativos incluem um anticorpo biespecífico alvejando VISTA e PD-L1 e um anticorpo biespecífico alvejando VISTA e PD-L2.
[0080] Os anticorpos humanos que são específicos para as proteínas humanas VISTA ou seus fragmentos podem ser criados contra um antígeno imunogênico adequado, tal como a proteína VISTA ou uma sua porção (incluindo moléculas sintéticas, tais como peptídeos sintéticos).
[0081] Outros anticorpos de mamíferos específicos ou gerais podem ser levantados de forma semelhante. Preparação de antígenos imunogênicos e produção de anticorpo monoclonal pode ser realizada utilizando qualquer técnica adequada.
[0082] Por exemplo, um hibridoma que é produzido por fusão de uma linha celular imortal adequada (por exemplo, uma linha celular de mieloma, tais como, mas não se limitando a, células Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE 1, L.5,>243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI , NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ou semelhantes, ou heteromilomas, produtos de fusão dos mesmos, ou qualquer célula a célula ou fusão deles derivados, ou qualquer outra linha celular adequada, como conhecido na técnica, ver, por exemplo, www.atcc.org, com células produtoras de anticorpo. As células produtoras de anticorpos podem incluir isolado ou clonado do baço, do sangue periférico, linfa, amígdalas, ou outras células imunes (por exemplo, células B), ou quaisquer outras células que expressam ou pesada cadeia leve da região constante ou variável, enquadramento ou determinante de complementaridade (CDR) sequências. Tais células produtoras de anticorpos podem ser células recombinantes ou endógenos, e também pode ser procariótica ou eucariótica (por exemplo, mamíferos, tais como, de roedor, equino, ovino, caprino, ovino, primata). Ver, p.ex., Ausubel, supra, e Colligan, Immunology, supra, capítulo 2, aqui inteiramente incorporadas por referência.
[0083] As células produtoras de anticorpos podem também ser obtidos a partir do sangue periférico ou, de preferência o baço ou nodos linfáticos, de seres humanos ou outros animais adequados que tenham sido imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada também pode ser utilizada para a expressão de ácido nucleico heteróloga ou endógena que codifica um anticorpo, especificado fragmento ou uma sua variante, da presente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou as células recombinantes podem ser isoladas utilizando condições de cultura seletivas ou outros modos conhecidos adequados e clonadas por diluição limitante ou separação de células, ou outros métodos conhecidos. As células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA)).
[0084] Outros métodos adequados podem ser utilizados para produzir ou isolar anticorpos com a especificidade requerida, incluindo, mas não limitado a, métodos que selecionam anticorpo recombinante a partir de uma biblioteca de peptídeo ou proteína (por exemplo, mas não limitado a, um bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou, biblioteca de apresentação como, por exemplo, conforme disponível a partir Technologies anticorpos Cambridge, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, dE; Biovation, Aberdeen, Escócia, Reino Unido;BioInvent, Lund, Suécia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Califórnia; Ixsys. Ver, por exemplo, PCT/GB91/01 134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; ; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/U594/1234; W092/18619; WO96/07754; EP 614 989; WO95/16027; WO88/06630; WO90/3809; Pat EUA. No. 4.704.692; PCT/US91/02989; WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; EP 229 046; PCT/US91/07149; ou peptídeos estocasticamente gerados ou proteínas fora da Patente EUA. N °s 5.723.323.; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862; WO 86/05803, EP 590 689, cada um aqui inteiramente incorporado por referência, ou que dependem de imunização de animais transgênicos (por exemplo, murganhos SCID, Nguyen et al, Microbiol Immunol 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit Rev. Biotechnol. 16: 95-1 18 (1996); Eren et al, Immunol. 93: 154-161 (1998), cada um inteiramente incorporado por referência, assim como patentes e pedidos de relacionados) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como conhecido na especialidade e/ou como aqui descrito. Essas técnicas, incluem, mas não estão limitados a, apresentação de ribossoma (Hanes et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 94: 4937-4942 (Maio, 1997); Hanes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 95: 14130-14135 (Novembro, 1998)); anticorpo de célula única produzindo tecnologias (Patente US N ° 5.627.052, Wen et al, J. Immunol 17: 887-892 (1987); Babcook et al, Proc Natl Acad Sci EUA 93: 7843-7848 (1996)); microgotículas de gel e citometria de fluxo (Powell et al, Biotechnol. 8: 333-337 (1990); Sistemas celulares, Cambridge, Mass; Gray et al., J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); Selecção de células B (Steenbakkers et al, Molec Biol Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et ai, Progress Biotech, Vol 5, imunização in vitro, em Hibridoma Tecnologia, Borrebaeck, ed, Elsevier Cience Publishers BV, Amesterdão, Países Baixos (1988)).
[0085] Os métodos para a engenharia ou anticorpos não humanos ou humanos humanizados também podem ser usados e são bem conhecidos na arte. Geralmente, um anticorpo humanizado ou manipulado tem um ou mais resíduos de aminoácidos de uma fonte que é não-humano, por exemplo, mas não limitado a ratinho, rato, coelho, primata não humano ou outro mamífero. Estes resíduos de aminoácidos humanos são muitas vezes referidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de uma "importação" variável, constante ou outro domínio de uma sequência humana conhecida. Sequências Ig humanas conhecidas são divulgadas, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html, cada um aqui inteiramente incorporado por referência.
[0086] Tais sequências importadas podem ser utilizadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aumentar ou modificar a ligação, afinidade, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, como conhecido na arte. Geralmente parte ou a totalidade das sequências de CDR humanas ou não-humanas são mantidas enquanto que parte ou a totalidade das sequências não-humanas do quadro e/ou as regiões constantes são substituídas com aminoácidos humanos ou outros. Os anticorpos podem também, opcionalmente, ser humanizados com retenção de elevada afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis utilizando modelos tridimensionais de imunoglobulinas que são conhecidos dos peritos na arte. Os programas de computador estão disponíveis que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, p.ex., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antígeno. Desta maneira, os resíduos de esqueleto (FR) podem ser selecionados e combinados a partir das sequências de consenso e importadas de modo a que o anticorpo desejado característico, tal como maior afinidade para o antígeno (s) alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos CDR estão diretamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno. Humanização ou engenharia de anticorpos da presente invenção pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido, tal como, mas não limitados aos descritos em, por exemplo, de Inverno (Jones et ai, Nature 321:. 522 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et ai, Science 239: 1534 (1988)), Sims et al, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), Pat EUA. Nos. 5723323, 5,976862, 5,824514, 5,817483, 5,814476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567, cada um aqui inteiramente incorporado por referência, incluídas nas referências aí citadas.
[0087] O anticorpo anti-VISTA pode também ser opcionalmente gerado por imunização de um animal transgênico (por exemplo, ratinho, rato, coelho, hamster, primata não- humano, e semelhantes) capaz de produzir um repertório de anticorpos humanos, como aqui descrito e/ou como conhecido na técnica descrita. As células que produzem um anticorpo anti-VISTA humano podem ser isoladas a partir de tais animais e imortalizadas utilizando métodos adequados, tais como os métodos aqui descritos.
[0088] Os animais transgênicos que podem produzir um repertório de anticorpos humanos que se ligam a podem ser produzidos por métodos conhecidos (por exemplo, antígenos humanos, mas não se limitando a, US Pat. Nos. 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 e 5.789.650, concedida a Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. documento EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. documento EP 0710 719 A1, Surani et al. Pat. No. 5.545.807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al EP 0438 474 B1, Lonberg et al EP 0814 259 A2, Lonberg et al GB 2 272 440 A, Lonberg et al Nature 368:. 856-859 (1994), Taylor et al, Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Taylor et al, Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al, Proc Natl Acad Sci EUA 90 (8) 3720-3724 (1993), Lonberg et al, Int Immunol Rev. 13 (l): 65-93 (1995) e Fishwald et al, Nat Biotechiiol 14 (7): 845-851 (1996), que são, cada um aqui inteiramente incorporado por referência). Em geral, estes murganhos compreendem, pelo menos, um transgene compreendendo DNA de, pelo menos, um locus de imunoglobulina humana funcionalmente rearranjada que é, ou que pode sofrer rearranjo funcional. Os loci de imunoglobulina endógena nestes ratinhos podem ser interrompidos ou suprimidos para eliminar a capacidade do animal para produzir anticorpos codificados por genes endógenos.
[0089] Os anticorpos de rastreio para ligação específica a proteínas ou fragmentos semelhantes podem ser convenientemente conseguida utilizando bibliotecas de apresentação de peptídeos. Este método envolve o rastreio de grandes coleções de peptídeos para os membros individuais tendo a função ou estrutura desejada. Rastreio de anticorpos de bibliotecas de apresentação de peptídeos é bem conhecido na arte. As sequências peptídicas indicadas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos de comprimento, frequentemente de 5-100 aminoácidos de comprimento, e frequentemente de cerca de 8 a 25 aminoácidos de comprimento. Além de direcionar métodos sintéticos químicos para a geração de bibliotecas de peptídeos, foram descritos vários métodos de DNA recombinante. Um tipo envolve a exibição de uma sequência de peptídeo na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência peptídica mostrada em particular. Tais métodos estão descritos na Publicação de Patente PCT N° s. 91/17271, 91/18980, 91/19818, 93/08278 e. Outros sistemas para gerar bibliotecas de peptídeos têm aspectos tanto a síntese química in vitro e de métodos de recombinação. Ver, Pedido de Patente PCT N ° s. 92/05258, 92/14843, 96/19256 e. Ver também, Patente dos EUA N ° s 5.658.754.; e 5.643.768. Bibliotecas de apresentação de peptídeos, vetor, e kits de rastreio estão comercialmente disponíveis a partir de fornecedores tais como Invitrogen (Carlsbad, CA), e Cambridge anticorpo Technologies (Cambridgeshire, UK). Ver, e.g., Patente EUA N ° s. 4.704.692, 4.939.666, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030, 5.518.889, 5.534.621, 5.656.730, 5.763.733, 5.767.260, 5.856.456; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, atribuído a Dyax, 5.427.908, 5.580.717; 5.885.793, atribuída a Technologies anticorpos Cambridge; 5.750.373, atribuída a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, e 5698417.
[0090] Os anticorpos da presente invenção também podem ser preparados utilizando, pelo menos, um anticorpo anti-VISTA que codifica ácido nucleico para proporcionar animais transgênicos, tais como cabras, vacas, ovelhas, e semelhantes, que produzem tais anticorpos no seu leite. Tais animais podem ser proporcionados utilizando modos conhecidos. Ver, por exemplo, mas não limitado a, EUA Pat. Nos 5.827.690.; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5304489, e semelhantes, cada uma das quais é aqui inteiramente incorporada por referência.
[0091] Os anticorpos anti-VISTA da presente invenção também podem ser produzidos utilizando as plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Ver também, por exemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Outubro, 1999), Cramer et al., Curr. Topo. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) e referências aí citadas; Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soe. Trans. 22: 940-944 (1994); e as referências aí citadas. Cada uma das referências acima é aqui inteiramente incorporada por referência.
[0092] Os anticorpos da invenção podem ligar a VISTA humana com uma ampla faixa de afinidades (Ko). Em uma modalidade preferida, pelo menos um anticorpo monoclonal humano da presente invenção pode, opcionalmente, ligar-se a VISTA humana com elevada afinidade. Por exemplo, um anticorpo monoclonal humano pode ligar-se VISTA humano com uma KD igual ou inferior a cerca de 10-7 M, tal como, mas não limitado a, 0,1-9,9 (ou qualquer gama ou valor nesse) x 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, ou qualquer faixa ou valor nele. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode se liga VISTA humano com uma afinidade de pelo menos 1x10-7 litros/mol, por exemplo, pelo menos, 1x 10-8 litros/mol, por exemplo, pelo menos, 1x10-9 litro/mol litro/mol.
[0093] A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente utilizando qualquer método adequado. (Veja, por exemplo, Berzofsky, et al, "Antibody-Antigen Interactions" Em Fundamental Immunology, Paul, WE, Ed, Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, WH Freeman and Company: nova Iorque, NY (1992); e modos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno particular pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são de preferência feitos com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno, e um tampão normalizado.
[0094] MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO
[0095] Utilizando a informação aqui fornecida, tal como as sequências de nucleotídeos que codifica, pelo menos, 70-100% dos aminoácidos contígua de pelo menos um dos fragmentos especificados, ou variantes de sequências de consenso dos mesmos, ou um Vetor depositado compreendendo, pelo menos, um desses sequências, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que codifica pelo menos um anticorpo anti-VISTA compreendendo a totalidade das regiões CDR variáveis de cadeia pesada de SEQ ID NOS: 1, 2 e 3 e/ou todas as regiões CDR variável de cadeia leve de SEQ ID NOS: 4, 5 e 6 podem ser obtidos utilizando métodos aqui descritos ou como conhecidos na arte.
[0096] Moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção pode estar na forma de RNA, tal como RNAm, RNAnh, RNAt ou qualquer outra forma, ou na forma de DNA, incluindo, mas não se limitando a, DNAc e DNA genômico obtido através clonagem ou produzido sinteticamente, ou quaisquer suas combinações. O DNA pode ser de cadeia tripla, de cadeia dupla ou de cadeia simples, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de, pelo menos, uma cadeia do DNA ou RNA pode ser a cadeia de codificação, também conhecida como a cadeia com sentido, ou pode ser a cadeia não codificante, também referida como a cadeia anti-sentido.
[0097] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma estrutura de leitura aberta (ORF), por exemplo, mas não limitados a, pelo menos uma parte especificada de, pelo menos, uma CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de, pelo menos, uma cadeia leve ou de cadeia pesada; As moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência codificante para um anticorpo anti-VISTA ou fragmento, p.ex., um fragmento compreendendo uma região variável; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeos diferente daqueles descritos acima, mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam, pelo menos, um anticorpo anti-VISTA como aqui descrito e/ou como conhecido na técnica descrita. Seria de rotina para um perito na arte para gerar tais variantes degeneradas de ácidos nucleicos que codificam para anticorpos anti-VISTA específicos da presente invenção. Ver, p.ex., Ausubel, et al., Supra, e as variantes de ácidos nucleicos estão incluídos na presente invenção.
[0098] Tal como aqui indicado, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-VISTA podem incluir, mas não estão limitados a, aqueles que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento de anticorpo; a sequência de codificação inteira para o anticorpo ou uma sua porção; a sequência de codificação para um anticorpo, fragmento ou porção, bem como sequências adicionais, tais como a sequência codificante de, pelo menos, um líder do peptídeo de sinal ou de fusão, com ou sem as sequências de codificação adicionais acima mencionadas, tais como, pelo menos, um íntron, em conjunto com , as sequências não codificantes adicionais, incluindo mas não se limitando a, sequências 5' e 3' não codificantes, tais como a transcrição, sequências não traduzidas N- que desempenham um papel na transcrição, processamento de RNAm, incluindo sinais de processamento e poliadenilação (por exemplo de ligação ao ribossomo e estabilidade de mRNA); uma sequência de codificação adicional que codifica para aminoácidos adicionais, tais como aqueles que proporcionam funcionalidades adicionais. Assim, a sequência que codifica um anticorpo pode ser fundida com uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do anticorpo fundido compreendendo um fragmento de anticorpo ou porção.
[0099] Os genes humanos que codificam as regiões constantes (C) dos anticorpos, fragmentos e regiões do presente invento podem ser derivados de uma biblioteca de fígado fetal humano, por métodos conhecidos. Genes de regiões C humanas podem ser derivados de qualquer célula humana, incluindo aquelas que expressam e produzem imunoglobulinas humanas. A região CH humana pode ser derivada de qualquer uma das classes ou isotipos conhecidos de cadeias H humanas, incluindo y, μ, α, δ ou ε e subtipos destes, tais como G1, G2, G3 e G4. Uma vez que o isotipo da cadeia H é responsável pelas várias funções efetoras de um anticorpo, a escolha da região CH irá ser guiada pelas funções efetoras desejadas, tais como a fixação de complemento, ou atividade na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
COMPOSIÇÕES
[0100] As composições farmacêuticas aqui descritas são preparadas de acordo com procedimentos convencionais e são administradas em dosagens que são selecionadas para o tratamento de, por exemplo, reduzir, prevenir ou eliminar, ou para retardar ou parar a progressão de, a condição a ser tratada (Ver , por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences de, Mack Publishing Company, Easton, PA, e Goodman e Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova Iorque, N. Y., os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência, para uma descrição geral dos métodos para a administração de vários agentes para terapia humana). As composições que compreendem os anticorpos e os agentes divulgados podem ser entregues usando (por exemplo, cápsulas, matrizes biodegradáveis) sistemas de entrega de liberação sustentada ou controlada. Exemplos de sistemas de entrega de liberação retardada para a entrega de drogas que seriam adequados para administração das composições dos compostos revelados são descritos em, por exemplo, Patente EUA N ° s US 5.990.092.; 5.039.660; 4.452.775; e 3,854,480, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporadas por referência.
[0101] Para a preparação de composições farmacêuticas a partir dos anticorpos anti-VISTA e/ou fragmentos da presente invenção, os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser sólidos ou líquidos. As preparações na forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, hóstias, supositórios, e grânulos dispersíveis. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem estar na forma de pó para reconstituição no momento da entrega. Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem atuar como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, ligantes, conservantes, agentes de desintegração de comprimidos, ou um material encapsulante. Nos pós, o veículo é um sólido finamente dividido que está numa mistura com o ingrediente ativo finamente dividido.
[0102] Os pós e comprimidos contêm de preferência desde cerca de uma a cerca de setenta por cento do ingrediente ativo. Os veículos adequados são carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, caboximetilcelulose de sódio, uma cera de ponto de fusão baixo, manteiga de cacau, e semelhantes. Os comprimidos, pós, hóstias, pastilhas, tiras de desintegração rápida, cápsulas e as pílulas podem ser utilizados como formas de dosagem sólidas que contêm o ingrediente ativo adequado para a administração oral.
[0103] As preparações de forma líquida incluem soluções, suspensões, enemas de retenção, e emulsões, por soluções exemplo, água ou propileno glicol água. Para injeção parentérica, as preparações líquidas podem ser formuladas em solução em solução aquosa de polietileno glicol.
[0104] A composição farmacêutica pode estar na forma de dosagem unitária. Em tal forma, a composição é subdividida em doses unitárias contendo quantidades apropriadas do ingrediente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação embalada, contendo a embalagem quantidades discretas de doses unitárias. As dosagens podem ser variadas dependendo dos requisitos do doente, da gravidade da condição a ser tratada, o composto e da via de administração a ser empregue. A determinação da dosagem adequada para uma situação particular está dentro da perícia na arte.
[0105] Além disso, a composição farmacêutica pode conter, se desejado, outros agentes compatíveis, por exemplo, produtos farmacêuticos, agentes terapêuticos ou profiláticos. Os agentes terapêuticos ou profilácticos incluem, mas não estão limitados a peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, as moléculas inorgânicos, e moléculas orgânicas. Exemplos das classes de tais agentes (por exemplo, agentes anti- câncer) incluem, mas não estão limitados a, citotoxinas, inibidores de angiogênese, agentes imunomoduladores, agentes imuno-oncologia, e os agentes utilizados para proporcionar alívio da dor ou para compensar os efeitos deletérios de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, o uso de bisfosfonatos para reduzir os efeitos hipercalcêmicos de glicocorticoides).
[0106] Inibidores de angiogênese, agentes e terapias que são adequados para utilização nas composições e métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a angiostatina (fragmento de plasminogênio); antitrombina antiangiogênico III; angiozima. Os bisfosfonatos incluem, mas não estão limitados a alendronato, clodronato, etidronato, ibandronato, pamidronato, risedronato, tiludronato, e zoledronato.
[0107] Agentes imunomoduladores e terapias que são adequados para utilização nas composições e métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos receptores de células anti-T, tais como anticorpos anti-CD3 (por exemplo, Nuvion (Protein Design Labs), OKT3 ( Johnson & Johnson), ou anticorpos anti-CD20 Rituxan (IDEC)), anticorpos anti-CD52 (por exemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticorpos anti-CD11a (por exemplo, Xanelim (Genentech)); anti-citocina ou anticorpos anti-citocina e antagonistas tais como anticorpos anti-receptor IL-2 do receptor (Zenapax (Protein Design Labs)), anticorpos anti-receptor da IL-6 (por exemplo, MRA (Chugai)), e anticorpos anti-IL-12 (CNT01275 (Janssen)), anticorpos anti-TNFalfa (Remicade (Janssen)) ou antagonista de receptor de TNF (Enbrel (Immunex)), anticorpos anti-IL-6-anticorpos (BE8 (Diaclone) e siltuximab (CNT032 (Centocor)), e anticorpos que se ligam imunoespecificamente a antígenos associados a tumores (p.ex., trastuzimab (Genentech)).
[0108] Agentes de imuno-oncologia que são adequados para utilização nas composições e métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a ipilimumab (anti-CTLA-4), nivolumab (anti-DP-1), pembrolizumab (anti- PD-1), anticorpos anti-PD-L1, e anticorpos anti-LAG-3.
[0109] A composição é de preferência feita na forma de uma unidade de dosagem contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento. Exemplos de unidades de dosagem são os comprimidos e as cápsulas. Para fins terapêuticos, os comprimidos e as cápsulas podem conter, em adição ao ingrediente ativo, transportadores convencionais tais como agentes ligantes, por exemplo, goma de acácia, gelatina, polivinilpirrolidona, sorbitol ou tragacanto; enchimentos, por exemplo, fosfato de cálcio, glicina, lactose, amido de milho, sorbitol ou sacarose; lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, polietileno glicol, sílica ou talco; desintegrantes, por exemplo amido de batata, agentes aromatizantes ou corantes, ou agentes umectantes aceitáveis. As preparações líquidas orais geralmente na forma de soluções aquosas ou oleosas, suspensões, emulsões, xaropes ou elixires podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, agentes emulsionantes, agentes não-aquosos, conservantes, agentes corantes e agentes aromatizantes. Exemplos de aditivos para preparações fluidas incluem goma acácia, óleo de amêndoa, álcool etílico, óleo de coco fraccionado, gelatina, xarope de glucose, glicerina, gorduras comestíveis hidrogenadas, lecitina, metil celulose, metila ou para- hidroxibenzoato de propila, propileno glicol, sorbitol, ou ácido sórbico.
[0110] Outros detalhes gerais relativos aos métodos de preparar e utilizar os compostos e as composições aqui descritos são bem conhecidos na arte. Ver, p.ex., Patente EUA N ° 7.820.169, cujos conteúdos são incorporados na sua totalidade.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0111] Um perito na arte, por exemplo, um médico, pode determinar a dosagem apropriada e a via de administração, para um determinado anticorpo, fragmento ou composição para administração a um indivíduo, considerando os agentes escolhidos, formulação farmacêutica e via de administração, vários fatores do paciente e outras considerações. De preferência, a dosagem não causa ou produz pouco ou nenhum efeito secundário adverso. Em regimes de dosagem de múltiplos padrões, um agente farmacológico pode ser administrado em um horário de dosagem, que é concebido para manter uma concentração no plasma predeterminada ou ideal no tratamento sujeito submetido. Os anticorpos, fragmentos e composições podem ser adicionados em quaisquer faixas de dosagem apropriadas ou quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, de 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10,0 mg/kg, 11,0 mg/kg, 12,0 mg/kg, 13,0 mg/kg, 14,0 mg/kg, 15,0 mg/kg, 16,0 mg/kg, 17,0 mg/kg, 18,0 mg/kg, 19,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 60 mg/kg, 70 mg/kg , 80 mg/kg, 90 mg/kg e 100 mg/kg. Em uma modalidade, a dosagem da composição administrada, ou fragmento de anticorpo é 0,1-15 mg/kg por administração.
[0112] O anticorpo ou fragmento pode ser administrado uma vez, pelo menos uma vez, duas vezes, pelo menos duas vezes, três vezes, ou, pelo menos, três vezes por dia. O anticorpo ou fragmento pode ser administrado uma vez, pelo menos uma vez, duas vezes, pelo menos duas vezes, três vezes, pelo menos, três vezes, quatro vezes, pelo menos quatro vezes, cinco vezes, pelo menos cinco vezes, seis vezes por semana, ou em pelo menos seis vezes por semana. O anticorpo ou fragmento pode ser administrado uma vez por mês, pelo menos uma vez por mês, duas vezes por mês, pelo menos, duas vezes por mês, três vezes por mês ou, pelo menos, três vezes por mês. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado uma vez por ano, pelo menos uma vez por ano, duas vezes por ano, pelo menos duas vezes por ano, três vezes por ano, pelo menos três vezes por ano, quatro vezes por ano, pelo menos quatro vezes por ano, cinco vezes por ano, pelo menos cinco vezes por ano, seis vezes por ano ou, pelo menos, seis vezes por ano.
[0113] Os anticorpos anti-VISTA, fragmentos e composições podem, por exemplo, ser administrado através de meios parenterais ou não parenteral, incluindo, mas não se limitando a, intravenosamente, subcutaneamente, oralmente, retalmente, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via transmucosa, transdérmica, intratecal, por via nasal, ou por via tópica. Um vulgar perito na arte reconhecerá que as seguintes formas de dosagem podem compreender como ingrediente ativo, ou compostos ou um correspondente sal farmaceuticamente aceitável de um composto da presente invenção. Em algumas modalidades, as formas de dosagem podem compreender como o componente ativo, quer um composto ou um seu sal farmaceuticamente aceitável de um composto.
[0114] Os anticorpos anti-VISTA da invenção podem ser administrados como parte de uma terapia de combinação (por exemplo, uns com os outros, ou com um ou mais outros agentes terapêuticos). Os compostos da invenção podem ser administrados antes, depois ou simultaneamente com um ou mais outros agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, um composto da invenção e outro agente terapêutico podem ser co-administrados simultaneamente (por exemplo, concomitantemente) quer como formulações separadas ou como uma formulação conjunta. Alternativamente, os agentes podem ser administrados sequencialmente, na forma de composições separadas, dentro de um período de tempo apropriado, tal como determinado pelo médico especialista (por exemplo, um tempo suficiente para permitir uma sobreposição dos efeitos farmacêuticos das terapias). Um composto da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados numa dose única ou em doses múltiplas, segundo uma ordem e em uma programação adequada para conseguir um efeito terapêutico desejado.
[0115] A presente invenção também proporciona um método para modular ou tratar, pelo menos, uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou doente. Em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são utilizados para tratar ou prevenir o câncer. Câncer pode incluir qualquer tumor maligno ou benigno de qualquer órgão ou sistema do corpo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: cânceres da mama, digestivo/gastrintestinal, endócrino, neuroendócrino, olho, genito-urinário, células germinativas, ginecológica, cabeça e pescoço, hematológica/sangue, músculo-esquelético, neurológica, respiratória/torácica, bexiga, cólon, retal, do pulmão, do endométrio, do rim, pâncreas, fígado, estômago, testículo, esôfago, próstata, cérebro, útero, ovário e da tiróide. Outros cânceres podem incluir leucemias, melanomas, linfomas e, e qualquer tipo de câncer é aqui descrito. Em algumas modalidades, o tumor sólido é infiltrado com mielóide e/ou células-T. Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia, linfoma, síndrome de Down e/ou mieloma mielodisplásica. Em algumas modalidades, o câncer pode ser qualquer espécie ou tipo de leucemia, incluindo a leucemia linfocítica ou uma leucemia mielóide, tais como, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielóide aguda (mielóide) (AML), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de células T, Leucemia linfocítica granular T, ou leucemia de célula T do adulto. Em algumas modalidades, o linfoma é linfoma histocítico, linfoma folicular ou linfoma de Hodgkin, e, em algumas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido, por exemplo, um melanoma, ou câncer da bexiga. Numa modalidade particular, o câncer é um câncer do pulmão, tal como um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
[0116] A presente invenção também proporciona um método para modular ou tratar, pelo menos, uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou doente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos, um de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de células B, células T ou FAB, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma não-Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, do sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma da nasofaringe, histiocitose maligna, síndrome paraneoplástica/hipercalcemia da malignidade, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, câncer relacionado reabsorção óssea, dor óssea relacionada com o câncer, e outros semelhantes. Em algumas modalidades, o tumor sólido é infiltrado com mielóide e/ou células-T. Em uma modalidade particular, o tumor sólido é um câncer do pulmão, tal como um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
[0117] Em algumas modalidades, os compostos e as terapias aqui descritos são co-administrados com uma vacina (tais como uma vacina de vetor viral, vacina bacteriana, vacina baseada em célula, a vacina de DNA, vacina de RNA, vacina de peptídeos, ou vacina de proteína). Tais vacinas são bem conhecidas na arte. Veja, por exemplo, Jeffrey Schlom, "Therapeutic Câncer Vaccines: Current Status and Moving Forward", J Natl Câncer Inst; 104: 599-613 (2012), cujos conteúdos são aqui incorporados na sua totalidade.
[0118] Em algumas modalidades, os compostos e as terapias aqui descritas são co-administradas com agentes para quimioterapia, terapias hormonais e terapias biológicas, e/ou bisfosfonatos. Em algumas modalidades, o agente (s) de quimioterapia incluem um ou mais dos seguintes procedimentos: arboplatin (Paraplatin), cisplatina (Platinol, Platinol-AQ), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), doxorrubicina (adriamicina), etoposido (VePesid), fluorouracilo (5-FU), a gemcitabina (Gemzar), irinotecano (Camptosar), o paclitaxel (Taxol), topotecano (HYCAMTIN), vincristina (Oncovin, Vincasar PFS), vinblastina (Velban).
[0119] Em outras modalidades, os compostos anti-VISTA e terapias aqui descritas são co-administradas com um ou mais anticorpos imunes do ponto de verificação, tais como, por exemplo, nivolumab, pembrolizumab, tremelimumabe, ipilimumab, anticorpo-LL anti-TP, anti anticorpo -PD-L2, anticorpo anti-TIM-3, anti-LAG-3V, anticorpo anti-OX40 e o anticorpo anti-GITR.
[0120] EM uma outra modalidade, os compostos anti-VISTA e terapias aqui descritos são co-administrados com um inibidor de molécula pequena de indoleamina 2,3- dioxigenase (IDO).
[0121] Os compostos anti-VISTA e composição da invenção podem ser administrados a um sujeito em necessidade do mesmo para evitar (incluindo a prevenção da recorrência de câncer) ou tratar (por exemplo, gerir ou melhorar um câncer ou um ou mais dos seus sintomas) câncer . Qualquer agente ou terapia (por exemplo, quimioterapias, terapias de radiação, terapias-alvo, tais como imatinib, sorafenib e vemurafenib, terapias hormonais e/ou terapias biológicas ou imunoterapias), que é conhecida por ser útil, ou que tenha sido utilizada ou está atualmente sendo usada para a prevenção, tratamento, controle ou melhoria de câncer ou de um ou mais dos seus sintomas pode ser utilizado em combinação com um composto ou composição da invenção aqui descrita. Os agentes anti-câncer, mas não se limitando a: 5- fluorouracila; acivicina; aldesleucina; altretamina; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; bicalutamida; sulfato de bleomicina; brequinar de sódio; bropirimina; busulfan; carboplatina; carmustina; cloridrato carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; cloridrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; cloridrato de doxorrubicina; droloxifeno; droloxifene citrato; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; enloplatina; enpromato; epipropidina; cloridrato de epirrubicina; erbulozole; cloridrato de esorrubicina; estramustina; fosfato de sio de estramustina; etanidazole; etoposide; fosfato de etoposido; fazarabina; fenretinide; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódico; gemcitabina; cloridrato de gemcitabina; hidroxiureia; cloridrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluindo interleucina II recombinante, ou rIL2), interferon alfa-2a; interferão alfa-2b; interferão alfa-m; interferão alfa-n3; interferon beta-I a; interferão gama-I b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolido; cloridrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustine; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; cloridrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalano; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sódio; metoprina; meturedepa; mitomicina; mitosper; mitotano; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazole; ormaplatina; paclitaxel; pegaspargase; porfromycin; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; rogletimida; cloridrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tegafur; cloridrato de teloxantrona; temoporfm; tenipii^ido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurin; tirapazamina; topotecano; trimetrexato; trimetrexato glucuronato; triptorelina; mostarda de uracilo; uredepa; vaprotídeo; verteporfn; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartarato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozole; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorrubicina. Terapias específicas incluem, mas não estão limitados a inibidores da tirosina cinase (por exemplo, imatinib, sorafenib, e vemurafenib). A invenção também abrange a administração de um composto antiVISTA da invenção em combinação com a terapia de radiação que compreende a utilização de raios-x, raios gama e outras fontes de radiação para destruir as células câncerosas. Tratamentos de câncer são conhecidos na técnica e têm sido descritos em tal literatura como Physician’s Desk Reference (57 ed., 2003).
[0122] Os anticorpos anti-VISTA aqui descritos também são úteis, por exemplo, no tratamento de doenças infecciosas crônicas, tais como HIV, HBV, HCV, HSV e, entre outros.
[0123] As várias propriedades e informação da sequência para detecção de anticorpos selecionados antiVISTA da invenção são fornecidos nas Tabelas 1A, 1b e 2 aqui.
[0124] Tabela 1A: sequências CDR de anticorpos VISTA anti-humano humanizados ou Humano totalmente selecionado
[0125] Tabela 1B: Sequências de Cadeia pesada e leve de anticorpos VISTA anti-humano humanizado ou humano totalmente selecionado * Sequências de região constante em VSTB140, VSTB149 e VSTB174 são sublinhados. Δ Resíduos de aminoácido conferindo resistência à protease na cadeia pesada de VSTB149 são indicados em negrito.
[0126] Tabela 2: Constante de Dissociação (KD) para anticorpos anti-VISTA selecionados
EXEMPLOS
[0127] EXEMPLO 1: ANÁLISE DE EXPRESSÃO VISTA EM CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS HUMANAS
[0128] Métodos:
[0129] Preparação e coloração de PBMC humano fresco para Expressão de VISTA
[0130] A expressão de VISTA foi testada em PBMCs humanas frescas (células mononucleares do sangue periférico) isoladas de a partir de vários doadores. Anti-Humano VISTA- biotina (GA-1) foi utilizado para a coloração (5 μg/ml). Mouse IgGl, K-biotina (clone MOPC-21 a 5 μg/ml) foi usado como um controle do isotipo.
[0131] Doador de material
[0132] As amostras de sangue foram obtidas a partir Biológica Corp. especializada (Colmar, PA) e foram recolhidos e analisados no mesmo dia. 10 ml de sulfato de heparina sangue total contendo foram levados para análise.
[0133] Preparação da Amostra
[0134] O sangue foi diluído 1: 1 em PBS estéril. 22 ml diluídos sangue do cordão umbilical foi mergulhado em 20 ml estéril Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Cat # 17-144003) em 50 ml tubos cônicos. Os tubos foram centrifugados a 1800 rpm durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células mononucleares na interface após centrifugação foram colhidas utilizando uma pipeta de 1 ml e combinados em dois tubos de 50 mL cônicos. PBS estéril foram adicionados a cada tubo para perfazer o volume para 50 ml e as células foram centrifugadas a 300 g durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 50 ml de PBS estéril e os tubos foram centrifugados a 300 g durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado. As células foram combinadas e ressuspensas em 50 ml de PBS estéril, antes da contagem.
[0135] Protocolo de coloração: Um frasco congelado contendo 5x107 PBMCs foi usado para os controles de compensação e como um controle para coloração.
[0136] Os seguintes reagentes e/ou materiais de consumo foram utilizados:
[0137] FACS Coloração Buffer (BSA) da BD Biosciences (Cat # 554657) suplementado com 0,2% de EDTA; solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco Cat # 14190); Placa de 96 poços de polipropileno de fundo redondo (BD # 3077); 1,2 ml de tubos de polipropileno de fragmentação (Corning # 4451); clone biotinilado anti-VISTA GA-1 a partir de ImmunoNext Lote # 080612B (usado, a 5 μg/ml); biotinilado mlgGl, controle de isotipo K (clone MOPC-21); BioLegend Cat # 400104, Lote # B116649 (utilizada a 5 μg/ml); anticorpos anti-humanos (ver tabela coloração abaixo); corante próximo infravermelho vivo/morto (Invitrogen, cat# L10119); e reagentes de estreptavidina incluindo STP-APC (BD Biosciences cat # 554067, Lote # 04251) (utilizada a diluição 1: 200 em tampão de SCAF), STP-PE (BioLegend Cat # 405203, Lote # B 139688) (utilizada a 1: 200 diluição em tampão de SCAF), STP-PE Cy7 (mostrou a ligação não específica nas amostras de controle de isotipo), STP-Q605 (Invitrogen cat # Q10101MP, Lote # 53449A) (utilizada a diluição de 1: 200 em tampão de SCAF).
[0138] Protocolo de Coloração da superfície celular
[0139] Antes da coloração, as células foram transferidas para lxlO6 placas de 96 poços de fundo redondo e foram lavadas com 150 μl de PBS. As placas foram então centrifugadas a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos.
[0140] Em seguida, as células foram novamente lavadas em PBS e centrifugada tal como descrito acima.
[0141] Coloração viva/morta foi então realizada em 50 μl de PBS contendo 0,25 μl de corante próximo a infravermelho vivo/morto. Após 10 minutos à temperatura ambiente os poços foram lavados com 150 μl de tampão de coloração FACs e centrifugada a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos. O sobrenadante foi descartado.
[0142] As células foram bloqueadas com soro humano a 1: 100 em 50 μl de tampão de coloração FACS. As placas foram incubadas a 4 °C durante 15 minutos. Os poços foram então lavados com 150 μl de tampão de coloração FACs e centrifugada a 1300 rpm a 4 °C durante 3 minutos. O sobrenadante foi descartado.
[0143] Um coquetel contendo os seguintes anticorpos foi então adicionado a cada poço para a coloração de superfície: Os coquetéis estão descritos nas Tabelas 3-6 abaixo. Cada coquetel seria utilizado separadamente dos outros, dependendo das populações de interesse.
[0144] Tabela 3: Coloração da linhagem
[0145] Tabela 4: Coloração Célula T
[0146] Tabela 5: Coloração DC
[0147] Tabela 6: Coloração Mielóide
[0148] A seguir a coloração da superfície, as células foram lavadas duas vezes como previamente descrito com tampão de coloração de FACS e centrifugada a 1300 rpm a 4 °C durante 5 minutos. As amostras foram ressuspensas em 50 μl de tampão de coloração de FACS contendo a estreptavidina fluorescente marcado adequado. As amostras foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As células foram lavadas com 150 μl tampão de coloração de FACS e centrifugada a 1300 rpm a 4 °C durante 5 minutos. Este passo de lavagem foi repetido antes de as amostras foram ressuspensas em 250 μl de tampão de coloração de FACS. As amostras foram analisadas num analisador de células BD LSRFortessa ™ (BD Biosciences) no mesmo dia.
[0149] Análise de Dados
[0150] A citometria de fluxo de dados foi novamente analisadas usando FlowJo Versão 9 software para as populações fenotípicas específicas portão. Enumeração de média geométrica foi utilizado para comparar a expressão VISTA em diferentes subpopulações de células. Cada população foi normalizada para fundamentos subtraindo valores de controle de isotipo a partir dos valores médios das amostras tratadas anti-VISTA. Os gráficos foram preparados em Prism e estatísticas foram realizadas utilizando o teste T de qualquer estudante se apenas duas amostras foram comparadas, ou one-way ANOVA com Bonferroni pós-testes.
[0151] Resultados:
[0152] A expressão do VISTA em Mielóide Humana e Subconjuntos linfóides:
[0153] Conforme mostrado nas Figuras 2A-2E, 3A- 3G, 4, 5A-5B e 6A-6C, a expressão VISTA em monócitos CD14+ foi significativamente diferente de todas as outras populações (p <0,001). Não houve diferenças significativas entre outras populações foram vistos. Monócitos expressaram os mais altos níveis de VISTA no sangue periférico, com o subconjunto CD14+CD16- tendo expressão significativamente maior do que células CD14loCD16+. Enquanto APCs mostraram expressão moderada de VISTA, subconjuntos linfóides mostraram baixos níveis de expressão.
[0154] A expressão do VISTA em Subconjuntos de T e NK humanos:
[0155] Conforme mostrado nas Figuras 7A-7E, 8A- 8G e 9, com subconjuntos NK, células CD56lo exibiram níveis de expressão significativamente mais elevados de VISTA do que as células NK CD56Hi. De subconjuntos de células T, células de memória CD8+ expressaram os níveis mais altos de expressão, embora eles não são significativamente mais elevados do que T CD8+ ingênuo ou células T CD4+.
[0156] A expressão do VISTA em subpopulações de células dendríticas humanas:
[0157] Conforme mostrado nas Figuras 10A-10D, 11a-11C e 12, não há diferenças significativas na expressão VISTA visto; DCs e basófilos exibiram baixa expressão do VISTA, com células dendríticas plasmocitoides (PDCs) sendo geralmente mais elevado, mas não em uma extensão significativa.
[0158] Conclusão: Estes resultados mostram a expressão de VISTA em vários subconjuntos de células imunes, e que VISTA é expresso em monócitos mais altamente, com alguma expressão em diferentes subpopulações de células T e células NK, e pouca ou nenhuma expressão em células B.
[0159] Exemplo 2: Expressão VISTA em células do sangue periférico
[0160] Métodos:
[0161] Coloração de sangue total: sangue completo isolado fresco (100 μl) foi corado com misturas de anticorpos, tal como indicado abaixo por incubação durante 30 minutos a 4 °C. Os glóbulos vermelhos (RBC) foram lisados com tampão de lise de RBC e as células restantes foram lavados 1x com tampão de coloração. As células foram re- suspensas em 200 μl de tampão de coloração. Os dados foram coletados por meio de um citometria de fluxo MACSQuant e analisados utilizando software de análise FlowJo.
[0162] A coloração das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs): As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas a partir de sangue total, utilizando o gradiente de Ficoll. Recém isolado 1x106 PBMC foram coradas com cquetéis de anticorpos em 100 μl de tampão de coloração. As amostras foram incubadas durante 30 minutos a 4 °C e depois lavadas uma vez com tampão de coloração. As células foram re-suspensas em 100 μl de tampão de coloração. Os dados foram coletados por meio de citômetro de fluxo MACSQuant® (Miltenyi Biotec) e analisados utilizando software de análise FlowJo.
[0163] Os anticorpos utilizados foram CD11b, CD33, CD177, CD16, CD15, CD14, CD20, HLADR, CD3, CD4, CD8, CD 127, CD69, e anticorpos FOXP3 (BioLegend, San Diego, CA).O VISTA anti-humano de ratinho conjugado com APC (clone GG8) foi feito por ImmuNext (Lebanon, NH).
[0164] Conclusões:
[0165] A expressão do VISTA em células do sangue periférico humanos saudáveis
[0166] células mononucleares do sangue do sangue e periféricas inteiras foram analisados para a expressão VISTA usando citometria de fluxo multicolor. Como mostrado na Fig. 15 A e 15B, o maior nível de expressão VISTA foi detectada em monócitos seguido por neutrófilos. Tanto as células T CD4+ e CD8+ expressaram baixo nível de VISTA como mostrado na Figura 13C e 13D.
[0167] A expressão do VISTA em células do sangue periférico de pacientes com câncer
[0168] Conforme mostrado nas Figuras 14A-C, as células foram analisadas mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doentes de câncer do pulmão. A Figura 14A é um representante lote de fluxo mostrando a análise de monócitos CD14+ e células supressoras CD15+ mielóides derivadas (MDSCs). Os resultados sugerem que as células CD15+ fenotipicamente são neutrófilos derivado de MDSCs. Além disso, estas células estão ausentes nas amostras de sangue saudáveis. A Figura 14B é um histograma representativo de expressão de VISTA em monócitos derivados de paciente saudável ou com câncer, sugerindo um nível mais elevado de expressão de VISTA em células de doentes com câncer, em comparação com controles saudáveis. Da mesma forma maior nível de VISTA foi encontrado no MDSCs em doentes com câncer, como mostrado na Figura 14C.
[0169] A Figura 15 é um gráfico representativo de FACS mostrando a presença de MDSCs derivados de neutrófilos no sangue de pacientes com câncer do cólon. Figura 15B e 15C são histogramas representativos que apresentaram maior nível de expressão VISTA em monócitos de pacientes com câncer comparar com amostras de sangue de doadores saudáveis.
[0170] A expressão do VISTA em células do sangue periférico macacos cinomólogo
[0171] Conforme mostrado na Figura 16A e 16B análise de citometria de fluxo de sangue total do macaco revelou o padrão de expressão semelhante ao VISTA em células humanas. Ambos os monócitos e neutrófilos expressam ao mais alto nível de VISTA em comparação com células T CD4+ (Figura 16C) e CD8+ (Figura 16D).
[0172] EXEMPLO 3: EXPRESSÃO VISTA EM LINHAS CELULARES HEME DE MALIGNIDADE NO NÍVEL DO RNA E DO NÍVEL DE PROTEÍNA
[0173] Uma vez que é expresso em VISTA malignidades heme, um anticorpo anti-VISTA poderia potencialmente alvejar as células malignas para a destruição, bem como o bloco VISTA e promover as respostas imune anti-tumor.
[0174] A análise de dados inclui análise de RNAseq de ~140 linhas de célula de malignidade heme (algumas linhas celulares são repetidas na análise). Os dados são mostrados na Figura 17.
[0175] Os valores de RNA-Seq são listados como valores FPKM (fragmentos por quilobases do éxon por milhão de fragmentos mapeados).
[0176] Em essência, isto significa que todas as leituras que se incluam nas regiões de um gene exônico foram contadas e normalizada por ambos o comprimento do gene e o número total de leituras por amostra (para ter em conta diferenças inter-amostra). O valor limite é de 1; acima de 1 é positiva para a expressão VISTA (ao nível do RNA), abaixo de 1 é negativa para a expressão VISTA.
[0177] Os resultados indicaram que muitas linhas de células são positivas ao nível do RNA, leucemias mielóides agudas, principalmente e leucemias mielóide crônica. Isto pode ser esperado uma vez que VISTA é altamente expresso em células mielóides normais, e porque a sua função é acreditada para amortecer as respostas imunes, incluindo respostas imunes antitumorais.
[0178] EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA VISTA
[0179] Filtração de Fago
[0180] Vinte e quatro experimentos de filtração de fagos foram realizados para enriquecer para fago reativo para Cyno VISTA-His. A proteína cinomóloga VISTA foi utilizada para estas experiências, uma vez que mostrou uma melhor conjugação de biotina do que a proteína humana VISTA. Para determinar o sucesso das experiências de fagos, foram adicionados conjuntos de fagos a partir das rondas de filtração individuais para placas de neutravidina revestidas com Cyno VISTA-His biotinilado e detectada com um anticorpo de HRP-anti-M13 conjugado. As colônias individuais foram colhidas a partir das fases de seleção de fagos e proteínas Fabs foram produzidas em placas de 96 poços. Os sobrenadantes de Fab expressos foram testados quanto à ligação a cyno VISTA-His biotinilado. Isto resultou em mais de 200 hits.
[0181] As regiões VH e VL a partir das placas de Fab foram amplificadas, apresentados por sequenciação de DNA e foram exportadas como arquivos FASTA. Ao escolher os clones que devem ser convertidos e testado como mAb, os clones foram escolhidos com base na diversidade de sequências, bem como ter riscos de modificação pós-tradução limitados e o menor número de resíduos hidrofóbicos quanto possível.
[0182] O VH e VL a partir dos clones de fagos foram sub-clonados em vetores de expressão IgG1/kappa de mamífero e transfectados em células HEK293. Os anticorpos foram purificados sobre resina de afinidade proteína A- Sepharose Fast Flow. A concentração dos mAbs de fago foi determinada por ELISA quantitativo utilizando medições NanoDrop, O painel de anticorpos foi expresso em níveis elevados. A análise por SDS-PAGE demonstrou a integridade de cada variante de anticorpo expressa.
[0183] Maturação em linha dos anticorpos do fago foi feita, amplificando os domínios VH a partir das misturas de anticorpos policlonais a partir do último ciclo de prospecção para clonagem em vetores de fagos que têm diversidade na VL. Isto resultou em um agrupamento de VH enriquecido, que foi amostrado com diversidade adicional na VL. Os fagos foram tomados através de 1-2 ciclos de filtração rigorosos com a expectativa de identificar ligantes de afinidade muito alta à proteína VISTA ECD His. Um ELISA de Fab monoclonal foi executado para determinar o sucesso da maturação. ELISA e os dados de expressão foram normalizados para um clone de referência fixado a 100% a partir do original de nova filtração de clones da experiência e maturados por afinidade com o maior sinal de ligação ao antígeno CYNO VISTA do que o clone de referência foram identificados. Este processo gerou vários clones que demonstraram até a ligação de 200% quando exibido em concentração de antígeno baixa (1 nM), os clones com maior afinidade foram sequenciados e produzido como MABs.
[0184] Geração de Hibridoma
[0185] Um grupo de ratinhos BALB/cAnNCrl recebeu uma injeção intraperitoneal (IP) de 50 μg Hu VISTA- Ig da proteína recombinante (Sino) emulsificado em adjuvante completo de Freund seguido de duas semanas mais tarde por uma injeção IP de 50 μg de proteína recombinante Hu VISTA- Ig emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas mais tarde, os ratinhos receberam uma injeção IP de 50 μg proteína recombinante Cyno VISTA-Fc emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. Todos os ratinhos receberam uma injeção final de 25 μg VISTA Cyno humano e 25 μg na base da cauda em PBS, cinco dias antes da coleta do baço para a fusão.
[0186] Um outro grupo de ratinhos BALB/cAnNCrl recebeu uma injeção ip de 50 μg Hu VISTA-His recombinante emulsificado em adjuvante completo de Freund. Duas semanas mais tarde, os ratinhos receberam uma injeção IP de 50 μg de Hu VISTA-His recombinante emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas mais tarde, os ratinhos receberam uma injeção IP de 50 μg de Cyno VISTA-His recombinante Protem emulsificado em adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas depois, todos os ratos receberam uma injeção final de 25 μg de Hu VISTA-His e 25 μg de Cyno VISTA- A em PBS, três dias antes da coleta do baço para a fusão.
[0187] No dia da fusão, os camundongos foram sacrificados por asfixia com CO2, os baços foram removidos e colocados em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato fria. Uma única suspensão celular de esplenócitos foi preparada por moagem dos baços através de uma peneira de malha fina com um pequeno pilão e enxaguar com PBS à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez em PBS e submetidas a lise de glóbulos vermelhos. Resumidamente, as células foram ressuspensas em 3 mL de tampão de lise de RBC (Sigma # R7757) por cada baço e colocado em gelo durante 5 minutos. As células foram novamente lavadas uma vez em PBS à temperatura ambiente e rotulado para triagem magnética. De acordo com as instruções do fabricante, as células foram marcadas com anti-murino Thy1.2, anti-murino CD11b e esferas magnéticas de murinos anti-IgM (Miltenyi Biotec # 130-049101, 130-049-601 e 130-047-301, respectivamente ), então classificados usando uma coluna MS com um Midi MACS. As frações de células negativas (frações de células positivas foram descartadas) foram fundidas com células FO. A fusão foi efetuada a uma razão de 1: 1 de células de mieloma de murino a células de baço viáveis. Resumidamente, células de baço e de mieloma foram misturadas em conjunto, sedimentadas e lavadas uma vez em 50 ml de PBS. O sedimento foi ressuspenso em 1 ml de glicol (PEG) solução de polietileno (2 g de PEG de peso molecular 4000, 2 mL de DMEM, 0,4 mL de DMSO) por esplenócitos 10E8 a 37 °C durante 30 segundos. A mistura de célula/fusão foi então imersa em um banho de água a 37 °C durante aproximadamente 60 segundos com agitação suave. A reação de fusão foi interrompida pela adição lenta de 37 °C durante 1 minuto DMEM. As células fundidas foram deixadas em repouso durante 5 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugada a 150 x g durante 5 minutos. As células foram então ressuspensas em meio E-HAT (MediumE (StemCell Technologies Cat # 03805) contendo meio HAT (Sigma Cat # H0262) e semeadas em placas de 96 poços de fundo plano de cultura de tecidos de poliestireno (Corning # 3997).
[0188] Um EIA de captura foi utilizado para pesquisar sobrenadantes de hibridoma para anticorpos específicos para o VISTA cyno. Resumidamente, placas Maxisorp (Nunc-# 446612) foram revestidas a 4 μg/mL durante pelo menos 60 minutos com anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (Fc) (Jackson # 1 15-006-071) em tampão de revestimento (Thermo 28382). As placas foram bloqueadas com 200 μl/poço de 0,4% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS a durante 30 minutos à TA. As placas foram lavadas uma vez e foi adicionado 50 μl/poço de sobrenadante de hibridoma e incubou-se à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos. As placas foram lavadas uma vez e 50 μl/poço de 0,1 μg /mL de Cyno VISTA-huIg foi adicionado e incubou à TA durante 30 minutos. As placas foram lavadas uma vez e 1: 40000 de estreptavidina HRP (Jackson 016-030-084) em 0,4% de BSA/PBS foram adicionados a placas e incubou-se durante 30 minutos à TA. As placas foram lavadas 3x e subsequentemente desenvolvida utilizando substrato 100 μl/poço de TMB Turbo (Thermo Scientific 34022) incubadas aproximadamente 10 minutos à TA. A reação foi parada utilizando ácido sulfúrico 4N 25μl/poço e a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um espectrofotômetro de placas automatizado. Quinze dos acessos primários foram selecionados para subclonagem por diluição limitante e foram rastreados no mesmo formato de triagem primária.
[0189] Todas as VISTA linhas celulares de hibridoma reativa Cyno eram cruz rastreados usando humana VISTA-Ig para avaliar a reatividade cruzada. Resumidamente, placas (Nunc Maxisorp-# 446612) foram revestidas a 4 μg/ml com anticorpo de cabra anti-Fc MS (Jackson # 15-006-071 G) em 0,1 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio, pH 9,4 (Pierce 28382 BupH™) O/N a 4 °C. Sem lavagem, os poços foram bloqueados com 200 μl de bloco (0,4% de BSA (Sigma) (p/v) em PBS (Invitrogen)) durante a noite a 4 °C. Após a remoção solução bloco, os sobrenadantes de hibridoma não diluídas foram incubadas em placas revestidas durante 30 minutos à TA. As placas foram lavadas uma vez com PBST (Tween 20 a 0,02% (Sigma) (p/v) em PBS), e, em seguida, incubadas durante 30 minutos com Hu VISTA-Ig diluído para 100 ng/mL em bloco. As placas foram lavadas uma vez com e sondadas com antihumana de cabra-Fc-HRP (Jackson # 109-036-098) diluído 1:10000 em bloco durante 30 minutos à TA. As placas foram novamente lavadas e subsequentemente desenvolvida utilizando substrato 100 μl/poço de TMB Turbo (Thermo Scientific 34022) incubar aproximadamente 10 minutos à TA. A reação foi parada utilizando 25μ/poço de ácido sulfúrico 4N e a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um espectrofotômetro de placas automatizado.
[0190] Hibridomas que foram mostrados para ser reativo para ambos VISTA humana e cinomólogo tiveram suas sequências de anticorpos de região V clonado. As células de hibridoma foram preparadas antes das reações de transcriptase reversa (RT) com células Superscript III directa Sistema de cDNA da Invitrogen. Resumidamente, o meio de cultura foi rejeitado e a placa colocada sobre gelo e ressuspenso em 200 μl de PBS frio. Quarenta microlitros foram transferidos para uma placa MicroAmp de reação de PCR de 96 poços e a placa foi colocada sobre uma base de placa de metal fria, vedadas com filme plástico e centrifugadas a 700 rpm durante 3 minutos. O PBS foi descartado e a cada poço, 10 μl de Tampão de ressuspensão e foi adicionado 1 μl de insntificador de lise. A placa foi vedada e incubada a 75 °C durante 10 min e armazenadas a -80 °C.
[0191] Para a reação de RT, cada poço continha 5 μl de água, 1,6 μl de tampão de DNAase 10X, EDTA 1,2 μl de EDTA 50 mM, 2 μl de Oligo (dT) 20 (50 mM) e 1 μl de mistura de dNTP 10 mM. A placa foi incubada a 70 °C durante 5 min, seguido de incubação em gelo durante 2 min, em seguida os seguintes reagentes foram adicionados em cada poço; 6 μl de tampão de RT 5X, 1 μl de RNaseOUT ™ (40 U/μl), 1 μl de Superscript ™ III RT (200 U/μl) e 1 μl de 0,1 M de DTT. A placa foi vedada e colocada em um termociclador pré-aquecido a 50 °C e incubou-se a 50 °C durante 50 minutos, seguido de inativação (5 min de incubação a 85 °C). A reação foi resfriada em gelo e o cDNA de cadeia simples foi armazenado a -80 °C até à sua utilização.
[0192] Para amplificações da região V, reações de 20 μl de PCR foram criadas. Cada poço continha 16,2 μl de água, 2,0 μl de 10X tampão de reação de PCR, 0,8 μl de MgSO4 (50 mM), 0,4 μl de dNTP 10 mM, 0,15 μl de 100 uM de iniciador para a mistura 0,05 μl de 100 uM de iniciador inverso, 0,2 μl de enzima Tag HiFi. O cDNA, preparado como descrito acima, foi transferido (2 μl/poço) à mistura de componentes de PCR, a placa foi vedada e uma reação de amplificação foi executada; o VH para programa foi (i) 94 °C durante 1 min (ii) 94 °C durante 15 seg (III) a 55 °C durante 30 s (IV) a 68 °C durante 1 min. Passos (II - IV) foram repetidos para um total de 35 ciclos seguido por uma extensão final a 68 °C durante 3 min. para VL o programa era (i) 94 °C durante 1 min (ii) 94 °C durante 15 seg (III) a 55 °C durante 30 seg (IV) 65 °C durante 30 seg, (v) a 68 °C durante 1 min. Passos (ii - v) foram repetidos para um total de 35 ciclos seguido por uma extensão final a 68 °C durante 3 min.
[0193] Iniciadores diretos eram pré-misturados e esta mistura foi utilizada em razão de 3:1 com o iniciador inverso. Os produtos de PCR foram verificados em um gel de agarose. As reações foram preparadas por clonagem de infusão pela adição de realçador (Kit de Clonagem de Infusão de HC, Cat # 639650, Clontech). Cinco microlitros da reação de PCR foi transferido para uma placa de PCR, seguida pela transferência de 2 μl de potenciador/poço. A placa foi vedada e incubada em um termociclador (15 min a 37 °C e 15 min a 80 °C). O Vetor de destino (vDR243 ou vDR301) foi preparado por digestão Esp3I; (1,5 μg de Vetor foi digerido em 3 μl de Tampão Tango, 2 1 Esp3I e água em uma reação de 30 μl a 37 °C durante 2 horas).
[0194] Para clonagem de infusão, 2 μl de intensificador tratado produto da PCR foi misturado com 100 ng de Esp3I digerido Vetor e 2 μl de enzima infusão 5X (Clontech). A reacção de infusão foi feito em placa de 96 poços de PCR. A placa foi incubada durante 15 min a 50 °C em uma máquina de PCR e as células competentes de Stella foram transformadas por choque térmico durante 40 segundos a 42 °C sem agitação e espalhadas em placas de agar LB com antibiótico selecionado e incubadas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as colônias foram repicadas para placas de 96 poços de poços profundos contendo meio LB/carbenicilina e cultivados durante a noite a 37 °C. Cargas congeladas foram feitas a partir da cultura durante a noite a mistura com um volume igual de 30% p/v de glicerol. As regiões V foram sequenciadas usando sequenciação SPF0052. As sequências foram analisadas, um poço positivo por hibridoma VH e VL foi escolhido, revestido de novas placas e crescido durante a noite em meio rico com ampicilina. Clones, em seguida, tinha DNA miniprep preparado para transfecção de pequena escala em uma placa de 96 poços.
[0195] Quarenta e oito sequências de hibridoma de rato selecionadas para tanto da cadeia pesada e leve foram estrutura humana adaptada utilizando um programa de software interno. Uma estrutura humana foi escolhida para cada um de VH ou VL de rato. Sequências de DNA da região V foram obtidas através de translação reversa. Regiões de DNA sintéticos correspondentes às sequências de aminoácidos de HFA foram encomendados a partir de DNA Integrated Technologies (Coralville, IA). A clonagem foi realizada em vDR149 pré- cortados e vDR157, IgG1 humano e kappa humano, respectivamente. Kits Mari-prep livre de Qiagen Endo foram utilizados para preparar o DNA. Culturas Expi293 (100 ml) foram usadas para expressar este painel de anticorpos.
[0196] EXEMPLO 5: PROTOCOLO PARA ENSAIO IN VITRO DE SUPRESSÃO DE CÉLULA T VISTA-IG HUMANA
[0197] Células do rato A20 foram estavelmente transfectadas com GFP ou VISTA humano. Eles foram incubados com o peptídeo de óvulos e com células T DO 11,10. Expressão de CD25 pelas células T foi medida 24 horas após a incubação ter início. As células A20-huVISTA suprimiram a expressão de CD25 pelas células T, mas esta leitura é significativamente restaurada por incubação com VSTB95 (Figura 18).
[0198] EXEMPLO 6: REGIÕES DE ESTRUTURA HUMANA DE ADAPTAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-VISTA
[0199] Sequências de hibridoma de ratinho para ambas cadeia pesada e leve foram estrutura humana adaptada por enxerto de CDR (Jones, et al, Nature, 321: 522-525 (1986), utilizando um programa de software interno. O programa delineia regiões determinantes da complementaridade (CDRs) das sequências da região V de acordo com as definições de Kabat (Wu, TT & Kabat, eA (1970). J. Exp Med, 132, 21150) e compara as regiões estruturais com os genes da linha germinal humana usando Blast. A linha germinal humana com a maior identidade de sequência com os quadros de ratinho foi escolhida como o gene receptor de adaptação estrutural humano (HFA). Em alguns casos, os genes de linha germinal humanos estreitamente relacionados foram escolhidos em vez disso, com base em experiência anterior com estruturas humanas bem expressas. As sequências de DNA para as estruturas humanas escolhidas para cada uma das regiões VH ou vL V de rato foram obtidos por meio de translação reversa. Regiões de DNA sintéticos correspondentes às sequências de aminoácidos de HFA foram encomendadas a partir de DNA Integrated Technologies (Coralville, IA). A clonagem foi realizada em IgG1 humana e kapa humana, respectivamente.
[0200] EXEMPLO 7: CONSTRUTOS DE ANTICORPO ANTIVISTA
[0201] O plasmídeo e informação da sequência para as moléculas para desenvolvimento de linhas celulares: os construtos de plasmídeos foram gerados para os anticorpos anti-VISTA possuindo as regiões variáveis VSTB112 e uma região constante IgG1K (VSTB174, novo número devido a uma mudança alotípica na região constante), uma região constante IgG2sigma (VSTB140) ou uma protease resistente a região constante de IgG1 (VSTB149).
[0202] Vetores Lonza
[0203] O sistema de expressão de Vetor do ovário de hamster chinês pEE6.4 e pEE12.4 (CHO) (Lonza Biologics, PLC) foi criado em Biologics Research (BR) e Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences (PDMS) como o sistema de expressão primário para geração de mAbs terapêuticos em linhas de células de expressão de mamífero. Cada Vetor contém um promotor de citomegalovírus humano (huCMV-MIE) para dirigir a expressão da cadeia pesada (HC) ou cadeia leve (LC) e contém o gene de resistência à ampicilina. Vetor pEE12.4 também inclui o gene que codifica a enzima glutamina sintetase (GS). As condições de crescimento que requerem atividade de glutamina sintetase coloca a pressão seletiva sobre as células para manter o Vetor de expressão (GS Gene Expression System versão manual 4.0). pEE6.4 foi utilizado para clonar o gene de HC e pEE12.4 para clonar o gene de LC como vetores de um único gene. O plasmídeo de gene duplo Lonza é criado a partir destes dois vetores de genes únicos Lonza.
[0204] Sequências de Aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada de mAbs VISTA selecionado
[0205] > VSTB112 cadeia pesada (SEQ ID NO: 37)
[0206] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQ APGQG LEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARSSYGWSYEFDYWGQGTLVTVSS
[0207] > VSTB50 cadeia pesada (SEQ ID NO: 38)
[0208] QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLNWVRQ APGQGLEWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVYYCAR EGYGNYIFPYWGQGTLVTVSS
[0209] > VSTB53 cadeia pesada (SEQ ID NO: 39)
[0210] QVQLVQSGAEVK PGASVKVSCKASGYTFTHYTIHWVRQAPGQ GLEWMGYIIPSSGYSEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCARGAYDDYYDYYAMDYWGQGTLVTVSS
[0211] > VSTB95 cadeia pesada (SEQ ID NO: 40)
[0212] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYGMSWVRQ APGK GLEWVASIISGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARIYDHDGDYYAMDYWGQGTTVTVSS
[0213] Sequências de Aminoácidos das Regiões variável da cadeia leve de mAbs VISTA Selecionado
[0214] > VSTB50 cadeia leve (SEQ ID NO: 41)
[0215] DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASESVDTYANSLMHW YLQKPGQPPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQTNED PRTFGQGTKLEIK
[0216] > VSTB53 cadeia leve (SEQ ID NO: 42)
[0217] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASH VPWTFGQGTKLEIK
[0218] > VSTB95 cadeia leve (SEQ ID NO: 43)
[0219] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPG QSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSH VPWTFGQGTKLEIK
[0220] > VSTB1 12 cadeia leve (SEQ ID NO: 44)
[0221] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDTRLNWYQQK PGKAPK LLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYNPITFG QGTKVEIK
[0222] > VSTB116 cadeia leve (SEQ ID NO: 45)
[0223] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINTNLNWYQQK PGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARDTPITF GQGTKVEIK
[0224] EXEMPLO 8: TRIAGEM ELISA e FACS DE ANTICORPOS ANTI-VISTA
[0225] Estas experiências foram para determinar a capacidade dos anticorpos produzidos para ligar a proteína VISTA humano ou cinomólogo, em um teste ELISA, bem como para determinar, utilizando rastreio de FACS, a capacidade dos anticorpos para se ligarem a proteína VISTA na superfície de células K562 (A linha celular de leucemia mielóide humana) expressando proteínas VISTA humanas ou cinomólogas.
[0226] Métodos:
[0227] Resumo de procedimento ELISA: As placas foram revestidas durante a noite a 4 °C com 1 μg/ml de proteínas SB0361 (humano) ou SB0361 (cyno (cinomólogo)), que são os domínios extracelulares de VISTA a partir das respectivas espécies. Os anticorpos foram diluídos a 1 μg/ml, como uma concentração de partida de 1: 4 diluições passo a passo para um total de 4 concentrações e incubaram-se à temperatura ambiente à temperatura ambiente (TA) durante 2 horas. Anti-IgG1 humano-HRP de ratinho (peroxidase de rábano) foi utilizado para a detecção e incubaram-se durante 1 hora à TA. Todas as lavagens foram realizadas utilizando PBS-Tween (0,05%).
[0228] Resumo de procedimento FACS: 2 x 105 células K562-G8 (humana) ou células K562-C7 (cyno) foram coradas com 5 μg/ml de cada anticorpo de teste e incubou-se durante 30 minutos a 4 °C. Anticorpo de cabra anti-humano de IgG1-PE (ficoeritrina) foi utilizado como um anticorpo de detecção secundário, a 5 μg/ml. As células foram executadas em um BD Fortessa e analisadas utilizando software FlowJo (Árvore Star, Inc., Ashlang, OR) para o MFI (intensidade de fluorescência média) da população ao vivo.
[0229] Análise de Dados/Resultados: Para cada um dos anticorpos, foi atribuída uma pontuação subjetiva (sim/não), relativa a se o anticorpo ligado com firmeza ou não, tanto para a análise de ELISA e FACS para cada um dos 4 ensaios. Se um anticorpo deu um "n" resultado para ligação em qualquer ensaio, foi repetido para confirmar que era negativo. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo e nas Figuras 19A-19F e 20A-20F.
[0230] Tabela 7.
[0231] EXEMPLO 9: RESULTADOS DA TRIAGEM PARA ANTICORPOS ANTI-HUMANO VISTA UTILIZANDO A REAÇÃO MISTA DE LINFÓCITOS (MLR) E ENSAIOS DE ATIVAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS ENTEROTOXJN B (SEB)
[0232] O objetivo deste estudo foi apresentar dados apoiando a identificação de múltiplos anticorpos α- VISTA funcionais que melhoram as respostas imunes celulares no ensaio de reação mista de linfócitos (MLR), bem como o ensaio de ativação de enterotoxina B de estafilococos (SEB).
[0233] A reação linfocitária mista (MLR) é um ensaio imunológico padrão que depende de MHC de descasamento de classe I e II para acionar uma resposta de células T alogênica. As células mononucleares de sangue periférico são isoladas a partir de dois indivíduos não correspondentes, incubados em conjunto e, como um resultado destes desfasamentos, ocorre a proliferação e produção de citocinas.
[0234] Material e Métodos:
[0235] Meio 10% AB foi preparado por combinação de 500 ml de RPMI com 50 mL de soro AB humano, de 5 ml de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml), 5 mL de L-glutamina (100x) e 10 ml de HEPES (1M). Meio foi conservado durante o período de 14 dias. 1 mCi de timidina tritiada foi preparado por diluição de 0,2 ml de estoque de timidina (1 mCi/ml) em 9,8 ml de meio RPMI.
[0236] Anticorpos VISTA solúvel foram diluídos para 20 μg/ml em meio de soro AB 10%. 100 μl das soluções de anticorpos apropriados foram adicionados aos poços apropriados de uma placa de 96 poços de fundo em U (Falcon produto # 353077 ou equivalente). Após as várias populações celulares serem adicionadas, a concentração final foi de 10 g/ml.
[0237] O isolamento de células brancas do sangue: os doadores tinham pelo menos 18 anos de idade, geralmente saudáveis e selecionados aleatoriamente a partir da população local. Sangue de doador transferido de tubos de isolamento para 50 ml cônicos. 15 ml subestabelecido de Ficoll 1077 por 25 ml de sangue tendo o cuidado de não se misturar com o sangue. Centrifugada as células a 1250 g durante 25 minutos à temperatura ambiente sem freio. Os glóbulos brancos foram isolados na interfase do Ficoll e o soro e diluiu-se as células em 40 ml de Solução Salina de Hanks Equilibra (HBSS). As células foram centrifugadas a 453g (1500 rpm) durante 10 minutos a 4 °C. As células ressuspensas em 50 ml de HBSS e contadas por transferência de 500 μl para um tubo separado.
[0238] Configuração da placa de 96 poços de reação mista de linfócitos (MLR): Determinou-se o número apropriado de "células estimuladoras" e "células respondedoras" necessárias para o ensaio com base no número de amostras a serem analisadas. A população estimuladora é semeada a 0,5 x 105 células/poço e a população respondedor é semeadas a 1,0 x 105 células/poço de uma placa de fundo em U de 96 poços. Todas as condições devem ser realizadas em triplicado. O número apropriado de "células estimuladoras" foram pipetados para um novo cônico e centrifugou-se como anteriormente descrito. As células ressuspensas em 10 ml e irradiadas com 4000 rads. As células centrifugadas como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 1 x 106/ml em meio de soro AB a 10% e adicionou-se 50 μl aos poços apropriados. Isolou-se o número necessário de células de resposta e centrifugou-se como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 2 x 106/ml em meio de soro AB 10% e acrescentou 50 μl aos poços apropriados. Incubou- se as células durante 5 dias a 37 °C e 5% de CO2. No quinto dia, removeu 30 μl do sobrenadante para análise de interferon gama (IFN-y) produção. No quinto dia, adicionou-se 25 μl de uma solução de timidina tritiada 40 μCi/ml a cada poço e incubou-se durante 8 horas a 37 °C e 5% de CO2. As células transferidas para a placa de 96 poços de micro cintilação de acordo com as instruções do fabricante. Contadas utilizando o contador de cintilação de micro acordo com as instruções do fabricante. Concentração de IFN-Y foi determinada por ELISA (eBioscience cat # 88-7316-88), utilizando o protocolo do fabricante.
[0239] Análise dos dados: Calculada a média das contagens por minuto (CPM) ou a concentração de IFN-y para os poços não tratados. Calculado o CPM médio ou IFN-y para cada um dos grupos de teste. Log10 transforma o conjunto de dados. Usando pontuação dobrada 12 MLR para cada composto, calculada a média para o conjunto de 12 grupos de teste de cada pontuação média composto por 12 experimentos = ∑ [(log10(COM médio de triplicado para o composto de teste))- (log10(CPM médio de triplicado para sem tratamento))]/12
[0240] Critérios de aceitação: todos os reagentes de teste e controles apropriados foram testados para a endotoxina antes de executar o ensaio e têm níveis de <0,1 UE/mg. As células de resposta só tinham contagens de CPM abaixo de 700 CPM, em média, indicando que as células eram de repouso quando incubadas sozinhas. O CPM para o grupo MLR era, pelo menos duas vezes maior do que o CPM de células de resposta incubadas sozinhas, indicando que a reação ocorreu e que os dadores são uma incompatibilidade. Todos os ensaios de MLR incluíram um controle negativo de proteína de IgG1 humana. O resultado do controle negativo IgG1 humana não foi estatisticamente diferente das amostras não tratadas com base na utilização de um teste t de student.
[0241] Rastreio de anticorpos anti-VISTA no MLR: triagem inicial de todos os compostos. Antes de executar o MLR com os anticorpos anti-VISTA, os anticorpos foram confirmados para se ligar tanto ligando às células VISTA através de análise FACS e proteína VISTA através de ELISA. Anticorpos S26 (VSTB77), S30 (VSTB86), S31 (VSTB88), S32 (VSTB90) e S39 (VSTB74) falharam esta triagem inicial, mas ainda foram testados no ensaio. Para efeitos de rastreio inicial, todos os anticorpos foram testados a 10 μg/ml em MLR com proliferação e de IFN-Y sendo os parâmetros medidos (Figuras 21 A-21D e 22A-22B).
[0242] Seleção de seis anticorpos liderando. A partir da triagem inicial, seis candidatos foram escolhidos para análise posterior: VSTB112 (S2), VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) e VSTB60 (S47).
[0243] Estudos de diluição dos seis principais candidatos em MLR: ajustes de Protocolo. O protocolo é idêntico ao anteriormente descrito com o ajuste que os anticorpos foram diluídos para as seguintes concentrações: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 e 0 μg/ml.
[0244] Determinação dos valores de IC50: contagens de CPM Bruto e concentrações de IFN-y foram usadas para determinar o IC50 para cada um dos anticorpos. Cálculos de IC50 foram determinados através da utilização do programa "EZ-R stats." Seis respondedores individuais foram usados para determinar os valores de IC50. Contagens de CPM individuais e as concentrações de IFN-y na MLR com titulações dose dos candidatos principais.
[0245] Tabela 8: Valores de IC50 para ambos CPM e IFN-y na MLR
[0246] ** Valores estão em log10 de concentrações de anticorpos.
[0247] Conclusão: A triagem inicial indicou que múltiplos anticorpos específicos para o VISTA eram capazes de aumentar a resposta imune celular MLR. Os anticorpos foram então classificados com base na eficácia e variância e com base nesses resultados, VSTB1 12, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 e VSTB60 foram escolhidos para avaliar em experiências de titulação de dose. VSTB60 induziu uma resposta mais fraca do que os outros cinco anticorpos para as experiências de titulação da dose.
[0248] O ensaio de ativação de enterotoxina B de estafilococos (SEB): SEB é um super-antígeno bacteriano que induz a ativação de células T + Vβ específico. As células mononucleares de sangue periférico são isoladas e incubadas com o antígeno SEB em cultura, o que induz a produção de citocinas robustas. Este ensaio foi realizado sobre os cinco candidatos principais.
[0249] Preparação de meio 10% AB, a preparação de 1 mCi de timidina tritiada, a preparação de anticorpos VISTA solúveis, e o isolamento de células brancas do sangue foram todos realizados como descrito acima anterior na MLR.
[0250] configuração da placa de 96 poços SEB: Determinou-se o número adequado de células de resposta necessárias para o ensaio com base no número de amostras a serem analisadas. A população respondedora é semeada a 2,0 x 105 células/poço de uma placa de fundo em U-96. Todas as condições foram realizadas em triplicado. As células centrifugadas como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 4 x 106/ml em meio de soro AB a 10% e adicionou-se 50 μl aos poços apropriados. Adicionado 50 μl de 10% de meio de soro AB contendo o antígeno SEB a uma concentração de 40 ng/ml. Nas experiências descritas, SEB foi obtido a partir de Sigma Aldrich (Cat # S0812). A concentração final no poço foi de 10 ng/ml. Incubou-se as células durante 3 dias a 37 °C e 5% de CO2. No terceiro dia, removeu-se 30 μl de sobrenadante para análise da produção de IFN-Y. Adicionou-se 25 μl de 1 mCi/ml de solução de timidina tritiada a cada poço e incubou-se durante 8 horas a 37 °C e 5% de CO2. As células foram transferidas para a placa de 96 poços de micro cintilação de acordo com as instruções do fabricante. Contadas utilizando o contador de cintilação de micro acordo com as instruções do fabricante. Concentração de IFN-Y foi determinada por ELISA (eBioscience cat # 887316-88), utilizando o protocolo do fabricante.
[0251] Protocolo: A análise dos dados. Calculou-se a média das contagens por minuto (CPM) ou a concentração de IFN-Y para cada um dos anticorpos em todas as concentrações. Os critérios de admissão foram realizados como previamente descrito. Determinação de valores de IC50 foi realizada como descrito. CPM contagens individuais e as concentrações de IFN-gama no ensaio de SEB com titulações dose dos candidatos de chumbo.
[0252] Tabela 9: Valores de IC50 para ambos CPM e IFN-Y no SEB.
[0253] ** Valores estão em log10 de concentrações de anticorpos.
[0254] Conclusões: anticorpos específicos VISTA melhoraram produção de citoquina e proliferação de um modo dependente da dose no ensaio de SEB. Os valores de IC50 a partir do estudo SEB foi geralmente semelhante aos resultados de estudos de diluição de MLR.
[0255] EXEMPLO 10: ENSAIO DE DEPÓSITO DE EPITOPO
[0256] Métodos: sistema XPR36 ProteOn (BioRad) foi usado para realizar depósito de epitopo. Chipes Proteon GLC (Biorad, Cat # 176-5011) foram revestidos com dois conjuntos de 6 anticorpos monoclonais (mAbs), utilizando as instruções do fabricante para a química de acoplamento de amina(BioRad, Cat # 176-2410).
[0257] mAbs competindo foram pré-incubados em excesso (250 nM de concentração final) com o VISTA humano (25 nM de concentração final) durante 4 horas à temperatura ambiente e 6 de cada vez foram executados sobre o chip revestido com os painéis de mAbs revestidos com um tempo de associação de 4 minutos, seguida de dissociação durante 5 minutos. Após cada corrida, os chips foram regenerados com 100 n M de ácido fosfórico.
[0258] A análise dos dados envolvidos agrupando todos sensogramas por ligante e aplicando um assistente de alinhamento, que realiza automaticamente um alinhamento do eixo X e Y, e remoção de artefato. Uma correção inter pontos foi então aplicada aos dados.
[0259] Um mAb não concorrente foi definido como tendo um sinal de ligação o mesmo ou sinal > A1 (ligação para apenas VISTA humano).
[0260] Um mAb competindo foi definido como tendo ligação de sinal << sinal A1 (isto é, a ligação a apenas VISTA humano).
[0261] Resultados: No sensorgrama de exemplo mostrado na Figura 23, o anticorpo VSTB85 foi revestido sobre o chip SPR Proteon e proteína VISTA pré-incubada com os competidores indicados foi executado sobre o chip. VSTB50 é um exemplo de um anticorpo não-competitivo, como uma resposta positiva foi observada quando o complexo VISTA/VSTB50 foi executado. GG8, VSTB49 e VSTB51 complexado com VISTA não se ligou ao VSTB85 revestido no chip e, portanto, foram classificados como concorrentes para o mesmo local de ligação no VISTA como VSTB85.
[0262] Tabela 10: mAb imobilizado no sensor Y = Sim competiu (sinal << que A1 - humano VISTA apenas) N = Não competiu (sinal > que A1-humano VISTA apenas) I = Inconclusivo (sinal semelhante a A1-humano VISTA apenas)
[0263] EXEMPLO 11: DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE A PROTEON
[0264] Os anticorpos foram capturados em chips Proteon utilizando superfícies revestidas Fc anti-IgG. Os anticorpos foram testados quanto à ligação dos domínios extracelulares (cyno) VISTA humano e cinomólogo (ECD) nas concentrações de proteínas VISTA que variam de 0,39 nM a 100 nM. Os antígenos foram deixados ligar/associados aos chips revestidos com anticorpo durante 4 minutos após o que o tempo de dissociação foi monitorizada durante 30 minutos. Chips foram regenerados com dois tratamentos de ácido fosfórico 100 mM para 18 segundos. Todas as experiências foram realizadas a 25 °C e de dados estava apto a modelo de ligação de Langmuir 1: 1
[0265] Exemplo 12: EFEITOS DE TRATAMENTO ANTI VISTA EM UM MODELO DE TUMOR DE BEXIGA EM MURINO MB49
[0266] Métodos:
[0267] Ratinhos C57B1/6 foram injetados com células tumorais MB49. Uma vez que os tumores foram estabelecidos, o tratamento anti-VISTA foi iniciado. O crescimento do tumor foi monitorizado em seguida 3 vezes/semana. Os ratinhos foram sacrificados, de acordo com os regulamentos IACUC, uma vez que os tumores atingiram 15 mm de qualquer dimensão.
[0268] Para cada experiência, um frasco congelado de células MB49 foi descongelado e cultivadas em meio RPMI 1640 (+L-Glut) com soro a 10% e antibióticos de penicilina/estreptomicina. Depois de três dias em cultura, as células foram colhidas utilizando Accutase StemPro e ressuspensas em meio RPMI a uma concentração de 5x106 células/ml e 50 μl injetado por ratinho.
[0269] Fêmea C57B1/6 de ratos, com idade de 68 semanas foram adquiridas a partir do National Câncer Institute. Após a chegada, eles foram deixados a se aclimatar por um dia antes de ter seu flanco direito raspado e suas caudas tatuadas. Eles foram depois injetados três e cinco dias mais tarde.
[0270] Injeção do tumor (intradérmica): Os ratinhos foram injetados por via intradérmica (i.d.) no seu flanco rapado com 50 μl de suspensão de células MB49 (~ 250,000 células).
[0271] Monitoramento de Crescimento do Tumor: O crescimento do tumor foi medido utilizando calibradores electrônicos primeiro através da mais ampla dimensão (L) e por outro lado a um ângulo de 90 ° para a primeira medição (W). O volume de tumor derivado da seguinte forma:
[0272] Volume = (L2 * W2)/2
[0273] Os tumores foram considerados estabelecidos uma vez que atingiu ~ 5 mm de diâmetro (volume de ~60 mm3). Uma vez estabelecido, o tratamento foi iniciado. O crescimento do tumor foi medido três vezes por semana durante o decurso do tratamento e até que a experiência foi terminada.
[0274] Tratamento Anti-VISTA: anticorpo monoclonal 13F3 quimerizado-mIgG2a foi injetado por via intraperitoneal a 10 mg/kg. Horários de injeção foram de três vezes por semana durante quatro semanas.
[0275] Eutanásia dos ratos: Como por exigências IACUC, os animais foram sacrificados uma vez que seus tumores atingiram 15mm de maior dimensão.
[0276] Analisando Eficácia: os volumes dos tumores de ratos foram analisados usando o Excel para gerenciamento de dados, e GraphPad Prism para a representação gráfica. A análise estatística foi realizada utilizando uma macro para o software de computação estatística R.
[0277] A concepção experimental é apresentada na Figura 24.
[0278] Resultados:
[0279] Tratamento Chl3F3-mIgG2a em ratinhos fêmea levou a concluir rejeição tumoral (CR) em 70% dos animais e remissão parcial (PR) em 30% (n = 7) (Tabela 13 e Figura 25B). Em contraste, todos os ratinhos tratados com mIgG2a de controle mostraram um crescimento progressivo de tumores (6/6) (Figura 25 A). Estes dados demonstram que o tratamento anti-VISTA pode ter um efeito profundo no crescimento do tumor.
[0280] A Tabela 11: A remissão completa (CR) versus remissão parcial (PR)
[0281] A sequência de VISTA humano é mostrada nas Figuras 26 e 27, adaptado de Wang et al., 2011, supra, os conteúdos das quais são aqui incorporadas na sua totalidade.
[0282] EXEMPLO 13: MAPEAMENTO DE EPITOPOS DE ANTICORPOS ANTI VISTA UTILIZANDO ESTUDOS DE TROCA DE HIDROGÊNIO/DEUTÉRIO (H/D)
[0283] Para identificar os epitopos para VSTB50, 60, 95 e 112 em VISTA humano, espectrometria de troca em massa desolução de hidrogênio/deutério (HDX-MS) foi realizada utilizando os Fabs correspondentes. Por troca de H/D, os procedimentos usados para analisar a perturbação Fab foram semelhantes ao descrito anteriormente (Hamuro et al, J. Biomol Techniques 14: 171-182, 2003; Horn et al, Biochemistry 45: 8488-8498, 2006) com algumas modificações. Fabs foram preparados a partir das IgGs com digestão com papaína e Proteína A captura utilizando Kit de Preparação Fab de Pierce (Thermo Scientific, Cat # 44985). A sequência da proteína humana VISTA contém seis sítios de glicosilação N-ligados. Para melhorar a cobertura da sequência, a proteína foi desglicosilada com PNGase F. A proteína VISTA desglicosilada foi incubada em uma solução de água deuterada para tempos predeterminados, resultando na incorporação de deutério em átomos de hidrogênio trocáveis. A proteína VISTA foi deuterada em complexo com qualquer Fab de VSTB50, VSTB60, VSTB95 ou VSTB112 em 46 μl de óxido de deutério (D2O), a 4 °C durante 30 seg, 2 min, 10 min e 60 min. A reação de troca foi extinta por pH baixo e as proteínas foram digeridas com pepsina. Os níveis de deutério nos peptídeos identificados foram monitorados a partir do deslocamento de massa de LC- MS. Como controle de referência, proteína VISTA foi processada de forma semelhante exceto que não estava em complexo com as moléculas de Fab. Regiões ligadas ao Fab foram inferidas a serem aquelas locais relativamente protegidas de troca e, assim, que contém uma fração mais elevada de deutério do que a proteína VISTA de referência. Cerca de 94% da proteína pode ser mapeada para peptídeos específicos.
[0284] Mapas de perturbação da solução HDX-MS de VISTA com VSTB50/VSTB60, e VSTB95/VSTB112 são mostrados na Figura 28, superior e inferior, respectivamente. Foram identificados dois grupos de epítopos. Anti-VISTA VSTB50 reconhecendo o mesmo epítopo que faz VSTB60; VSTB95 se liga a outra região epitopo que VSTB 112 faz no VISTA. Anti-VISTA VSTB50 e 60 dividem o mesmo epitopo que compreende os segmentos, 103NLTLLDSGL111 (SEQ ID NO: 62), e 316VQTGKDAPSNC146 (SEQ ID NO: 63) (Figura 28, em cima). Anti-VISTA VSTB95 e 112 parecem ter como alvo epitopos semelhantes, compreendendo segmentos 27PVDKGHDVTF36 (SEQ ID NO: 75), e 54RRPIRNLTFQDL65 (SEQ ID NO: 65) (Figura 28, inferior). Existem dois outros segmentos que mostram perturbação fraca por VSTB95 e 112, incluindo resíduos 39-52 e 118-134. No entanto, os níveis de redução não são tão fortes como as regiões anteriores (27-36 e 54-65) no mapa diferencial. Embora um peptídeo, 100TMR102 mostrando forte perturbação por VSTB95 e 112, está localizado sobre a outra face da superfície VISTA, fica distante das regiões de epítopo, 2736 e 54-65. Esta perturbação pode ser devido ao efeito alostérico. Estes resultados HDX-MS fornecem os epitopos de nível de peptídeos para detecção de anticorpos anti-VISTA. Não foram observadas regiões de epitopos sobrepostos para estes dois grupos de epitopo. Estes resultados estão de acordo com os dados da concorrência de filtração anteriores em que eles não competem uns com os outros.
[0285] EXEMPLO 14: DETERMINAÇÃO DE ESTRUTURA DO VISTA HUMANO ECD: COMPLEXOS FAB VSTB112, CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS
[0286] Em um esforço para determinar a estrutura VISTA e delinear o epitopo e paratopo definir a interação entre o VISTA de domínio extracelular (ECD) e o fragmento Fab do anticorpo principal VSTB112, o complexo foi cristalizado e a estrutura determinada a resolução de 1,85 Â. A estrutura do ECD de VISTA humana em complexo com o fragmento Fab do anticorpo VSTB112 foi determinada em um esforço tanto para determinar a estrutura do próprio VISTA ECD e para definir o epitopo/paratopo para esta interação. A estrutura revela VISTA a adotar uma IgV vezes com uma topologia em cadeia semelhante à cadeia TCR Vα. Para além da ligação dissulfureto canônica em ponte B e fios F na parte de trás e as faces frontais do β-sanduiche, a estrutura revela o ECD tendo duas ligações de dissulfureto adicionais, uma amarrada o loop CC para a folha frontal e uma segunda entre as vertentes A' e G'. Embora os contatos de cristal entre as moléculas VISTA estão presentes, eles são pequenos e não há nenhuma evidência de um dímero de VISTA ECD com base nesta estrutura. O epitopo VSTB112 é mostrado como compreendendo as porções de volta VISTA BC, CC’, e FG juntamente com os resíduos da folha beta da frente (C'CFG) mais próximas a essas voltas. O paratopo é tendencioso em grande parte em direção das interações da cadeia pesada com CDR L3 fazendo contato mínimo.
[0287] Epitopo/paratopo definindo VISTA: interação VSTB112
[0288] VSTB112 Fab enterra uma superfície de 1.024,3 Â 2 após a ligação VISTA ECD, com o enterro da superfície cadeia pesada representando 715,3 Â2 deste total. Sete pontes de hidrogênio e 4 interações de ponte salina são formadas entre VISTA e cadeia leve VSTB112 e 10 hidrogênios e 2 interações de ponte salina entre o VISTA e cadeia pesada VSTB112. VSTB112 reconhece os resíduos nas cadeias folha frontal C’, C, F, e G nas extremidades proximais à volta FG, bem como resíduos nas voltas BC, FG, e CC’ (Figuras 29 e 30). Interações com a conta de volta CC para a maioria dos contatos com a cadeia leve Fab com apenas resíduos E125 e R127 no circuito FG as interações da cadeia leve adicionais. Os resíduos 119-127 correspondentes à conta de circuito VISTA FG para 38% do total 1034,8 Â2 da área de superfície oculta após ligação VSTB112. Notavelmente, este laço é altamente polar, composto pela seguinte sequência -IRHHHSEHR- (SEQ ID NO: 76). Além disso, W 103 na VSTB112 CDR H3 embala bem contra a estrutura principal de resíduos VISTA H122 e H123, H121 e VISTA faz uma vantagem sobre a interação com o anel aromático de F55 em CDR H2.
[0289] Uma comparação das regiões de epitopos identificados por cristalografia e HDX é mostrado na Figura 31.
[0290] EXEMPLO 15: ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T E MONÓCITOS POR ANTICORPOS ANTI-VISTA
[0291] O efeito funcional de anticorpos antiVISTA foi avaliado em dois ensaios in vitro, a reação de leucócitos mista (MLR) e SEB (Staphylococcus enterotoxina B). Ambos os ensaios medem a proliferação das células T e a indução de citoquinas como as suas leituras primárias, mas estes efeitos são devidos a mecanismos diferentes. Na MLR, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de dois dadores humanos diferentes são incubadas em conjunto, e complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de incompatibilidadentre as células T de um dador e células dendríticas dos outros resultados dos doadores na proliferação de células T e Produção de interferon (IFNy) . No ensaio de SEB, as PBMC de um único dador são incubadas com um superantígeno bacteriano, que liga directamente a proteína de MHC de Classe II na superfície de células apresentadoras de antígenos (APC) ao receptor de células T (TCR) sobre as células T, causando ativação da célula T, proliferação e a secreção de citocina. Em ambos os ensaios, VSTB L 12, que é a molécula mãe de VSTB 174, demonstraram a indução dependente da dose da proliferação de células T e produção de citoquinas, e foi mais potente entre os
[0292] Tabela 12. Valores de EC50 para as leituras do ensaio MLR. VSTB112 (precursor de VSTB 174) foi a molécula mais potente.
[0293] Ensaios de ativação de monócitos
[0294] Os dados do ensaio, apresentados na Tabela 12, foi gerado com VSTB112, a molécula progenitora de VSTB 174. Para melhor compreender a atividade de VSTB 174, foram realizados ensaios de ativação de monócitos. Os resultados mostraram que a incubação de PBMC com 174 VSTB inteiros induziu regulação positiva de marcadores de ativação (CD80 e HLA-DR) em monócitos CD14+, indicando um efeito de ligação do anticorpo a um subconjunto de células imunes conhecido por expressar elevados níveis de VISTA (Figura 32). Uma outra questão é se os efeitos sobre a ativação de monócitos no todo PBMC pode ser facilitada por qualquer anticorpo que se liga a VISTA e tem um Fc IgG1. Anticorpos VSTB103 e VSTB63 ligam-se a VISTA com elevada afinidade (KD 6.36E-10 8.30E-10 e respectivamente) e de células que expressam a proteína VISTA, semelhante ao VSTB112 e VSTB111. VSTB103 está na mesma posição que epitopo como VSTB112, enquanto é VSTB63 em um epitopo diferente; nem o anticorpo facilitou a ativação de monócitos. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que um mecanismo pelo qual VSTB174 pode exercer o seu efeito na ativação de células T/proliferação é através de ativação de monócitos facilitada por células NK.
[0295] Preparação de Meio
[0296] 500 ml de meio RPMI 1640 (Corning, 10- 040-C V) foi combinado com 50 mL de soro AB humano (Vale Biomedical, Inc., Lote # 3C0405), 5 ml de Penicilina/estreptomicina (Lonza, 17-602E) 10000 U/ml, 5 ml de L-glutamina (loox) (Gibco, 25030-081) e 10 ml de HEPES (1 M) (Fisher BP299-100, lote # -L) . O meio foi armazenado durante não mais de 14 dias a 4 °C.
[0297] Preparação de anticorpos VISTA e de Controle solúveis
[0298] Os anticorpos foram diluídos para 2X a concentração desejada em meio de soro AB 10%: VSTB174: lote VSTB174.003
[0299] Adicionados 100 μl das soluções de anticorpos apropriados aos poços apropriados de uma placa de 96 poços de fundo U (Falcon, 353077). Após as várias populações celulares serem adicionadas em 100 μl, a concentração final de cada anticorpo foi de 1, 0,1 ou 0,01 g/ml. Anticorpo de controle IgG1 CNTO 3930 (Lote 6405, ENDO <0,1 EU/mg) foi adicionado a uma concentração final de 1 μg/ml.
[0300] Os PBMC foram isolados
[0301] Os doadores tinham pelo menos 18 anos de idade, geralmente saudáveis e selecionados aleatoriamente da população local.
[0302] Sangue do doador foi transferido do tubo de isolamento para 50 ml cônicos.
[0303] 15 mls de Ficoll 1077 (SIGMA, 10771) estavam sob-colocado com cuidado para não misturar com o sangue. Este foi por 25 mls de sangue.
[0304] As células foram centrifugadas a 1250g durante 25 minutos a temperatura ambiente sem parada.
[0305] As células brancas do sangue foram isoladas na interfase do Ficoll e o soro e as células foram diluídos em 40 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS).
[0306] As células foram centrifugadas a 453g (1500 rpm) durante 10 minutos a 4 °C.
[0307] As células foram ressuspensas em 50 mis de HBSS e foram contadas por transferência de 500 um para um tubo de Eppendorf separado.
[0308] Além disso, um kit de isolamento de monócitos a partir de Pan Miltenyi foi usado segundo as instruções do fabricante (cat # 130-096-537) para isolar células CD14+ por seleção negativa em vários grupos de tratamento.
[0309] Configuração de cultura In vivo
[0310] O número adequado de células necessário foi determinado para o ensaio com base no número de amostras a serem analisadas. A população respondedora foi semeada a 2.0x105cells/poço de uma placa com 96 poços com fundo em U. Para a população CD14 selecionadas negativamente, 0,5x105 células foram semeadas. Todas as condições foram realizadas em triplicado.
[0311] As células foram centrifugadas como descrito atrás e ressuspensas a uma concentração de 2x106/ml durante toda a população de PBMC e 0,5x106/ml para a população CD14 selecionada negativamente em meio de soro AB a 10% e adicionou-se 100 l de um anticorpo de teste a poços adequados elevando o volume total em cada poço a 200 um.
[0312] As células foram incubadas durante 1, 2, ou 3 dias a 37 °C e 5% de CO2.
[0313] Coloração de anticorpos e citometria de fluxo
[0314] A placa de fundo em U de 96 poços foi centrifugada durante 5 minutos a 453g e o sobrenadante removido.
[0315] As células foram lavadas com PBS e 200 μl centrifugados tal como no passo 5.5.1.
[0316] O sobrenadante foi descartado e ressuspensas em 50 μl de PBS contendo os seguintes anticorpos: • CD14-APC (HCD14 clone) 1: 250 (BioLegend cat # 325608) • HLA-DR-PE Cy7 (clone L243) 1: 250 (BioLegend Cat # 307616) • CD80-PE (clone 2D10) 1: 250 (BioLegend Cat # 305208) • a ligação do inibidor Hu FcR (eBioscience cat # 14-9161-73)
[0317] Foi incubada durante 20 minutos em gelo molhado no escuro.
[0318] 150 μl de PBS foram adicionados e centrifugados tal como no passo 5.5.1.
[0319] 150 l de tampão de PBS foi adicionado e analisado por FACS.
[0320] As amostras foram executadas em um citômetro de fluxo parâmetro 10 Miltenyi MACSQuant e analisadas utilizando FlowJo 9.7.5 para a expressão de HLA- DR e CD80 sobre a população CD14+. Média geométrica da intensidade de fluorescência (IMF), uma estatística que define a tendência central de um conjunto de números, foi utilizada como a estatística de definição para comparar tratamentos.
[0321] Análise Estatística
[0322] Todas as estatísticas foram realizadas em Prism GraphPad, versão 6. Comparações de pares entre os grupos foram feitas em cada um dos pontos de tempo utilizando One-Way ANOVA com correção de Tukey para a multiplicidade. Os valores de p inferiores a 0,05 para todos os testes e comparações foram consideradas significativas. Para todos os gráficos e tabelas, * p <0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, **** p <0,0001.
[0323] EXEMPLO 16: ATIVIDADES ADCC e ADCP DOS ANTICORPOS ANTI-VISTA
[0324] VSTB174 tem um IgG1 Fc, que pode conferir citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células (ADCC) e a atividade de fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP). Ambos os tipos de ensaios foram realizados e mostraram que VSTB 174 pode lisar as células ou fagocitar as células K562-VISTA (Figuras 33-34), mas as células da linha de células de mieloma parentais não K562 (dados não mostrados). Um mecanismo adicional de ação de 174 VSTB para modular a ação inibidora de VISTA pode ser a lise ou imersão das células que expressam elevados níveis de VISTA, removendo-os assim do microambiente local.
[0325] EXEMPLO 17: ATIVIDADES ADCP DOS ANTICORPOS ANTI VISTA ADICIONAIS
[0326] Um ensaio de fagocitose in vitro foi usado para estudar o aumento da fagocitose mediada por macrófagos de células que expressam ectopicamente VISTA por mAbs VISTA anti-humano (VSTB 173 e VSTB 174). Estes mAbs foram clonadas em diferentes estruturas de Fc (IgG1 WT (tipo selvagem), IgG1 PR (resistente à protease), e IgG2o) e foram postuladas para potencialmente ter atividades diferentes em relação ao reforço da fagocitose. As estruturas principais de IgG1 e IgG1 PR são capazes de se ligar a receptores de Fc e têm o potencial de causar ADCP, enquanto o IgG2o não se liga a receptores Fc e não deve mediar ADCP.
[0327] Os anticorpos anti-VISTA foram testados em ensaios ADCP com K562 células alvo parentais e K562-VISTA. Como mostrado nas Figuras 35-36, VSTB 174, 149 VSTB, VSTB 173 e 145 VSTB reforçam fagocitose hMac de células K562- vista. Anticorpos VISTA VSTB 140 ou VSTB 132, com o IgG2o Fc que não se ligam receptores Fc, não aumentou a fagocitose como esperado. VISTA mAbs VSTB 174 e 173 VSTB com IgG1 Fc mostraram fagocitose mais robusta do que VSTB 149 e VSTB145 com o IgG1 PR Fc (ver Tabelas 13 e 14 para valores EC50).
[0328] Tabela 13. Valores EC50 de mAb VISTA anti- humanos.
[0329] Tabela 14.
[0330] VSTB174 e VSTB173 mostraram fraco aumento da fagocitose de células parentais K562 na concentração mais elevada (Figuras 35-36), o que pode ser devido a baixa expressão do VISTA pelas células 562. Os outros anticorpos anti-VISTA não aumentaram a fagocitose das células K562.
[0331] Os anticorpos de controle negativo foram, cada um testado em duas concentrações diferentes no ensaio de fagocitose K562- VISTA, mas não induziu qualquer fagocitose. Este resultado indica que a fagocitose mediada pelos anticorpos anti-VISTA é específica e, devido à expressão do antígeno pelas células VISTA K562-vista.
[0332] EXEMPLO 18: ACTIVIDADES ADCC DOS ANTICORPOS ANTI-VISTA ADICIONAIS
[0333] A fim de testar a sua capacidade para induzir ADCC, os seguintes três anticorpos anti-VISTA humanos foram testados: VSTB 174 (IgGl) VSTB 149 (IgGl PR) VSTB174.LF (IgG1 LF (low fucose)).
[0334] Cada anticorpo foi testado em seis concentrações diferentes dentro de uma mesma placa, em triplicado ao longo de duas experiências separadas para um total de seis pontos de dados.
[0335] VSTB 174, VSTB 149, e VSTB174.LF cada demonstrou atividade ADCC mensurável a 10, 1, 0,1 e 0,01 ao passo que apenas o anticorpo LF demonstrou atividade ADCC mensurável a 0,001 μg/mL; nenhum dos anticorpos demonstrou ADCC 0, 0001 μg/mL. Como cada um desses anticorpos tem uma variante de IgG1 ou IgG1 Fc, este resultado é esperado. O anticorpo LF demonstrou uma potência aumentada de ADCC como evidenciado pelo valor de EC50 menor para a curva de anticorpo LF (0,002293 μg/ml) em comparação com a curva normal de anticorpo IgG1 (0,02381 μg/ml). A curva de anticorpo IgG1 PR tinha um valor de CE50 similar à curva de IgG1 regular (0,01846 μg/ml).
[0336] Tabela 15. Valores de EC50 (μg/mL) de três testados anticorpos anti-VISTA como determinado por análise de ADCC.
[0337] Os anticorpos IgG1 humano, IgG1 PR humano e IgG1 LF humano todos mostraram ADCC morte mediada mensurável nas concentrações de 10, 1, 0,1 e 0,01 μg/ml de anticorpo, enquanto que apenas o anticorpo LF mostrou matando pelo anticorpo 0,001 μg/mL de concentração. Nenhum dos anticorpos anti-VISTA mostraram matar na concentração de anticorpo de 0,0001 μg/mL.
[0338] O anticorpo LF mostrou aproximadamente 10 vezes mais potente do que qualquer morte de ADCC do anticorpo IgGl regular ou o anticorpo IgG1 PR, como pode ser visto nos valores de EC50.
[0339] EXEMPLO 19: AFINIDADE DO VSTB 174 PARA HUMANOS E VISTA CINOMÓLOGO
[0340] A afinidade de VSTB 174 de domínio extracelular VISTA de macaco cinomólogo e humano (ECD) foi determinado por métodos de ressonância de plasma de superfície (SPR) sobre um instrumento Proteon. VSTB 174 exibiu valores KD muito semelhantes para cada proteína, 1.56E-10 M para o ECD VISTA humano e 8.66E-11 M para o VISTA cinomólogo.
[0341] EXEMPLO 20: ANTICORPOS VISTA EXIBEM EFICÁCIA EM MODELOS DE TUMOR DE MURINO
[0342] Cepas de rato, reagentes e modelos de tumor
[0343] Para os estudos in vivo, ratos de VISTA humano (VISTA-KI) cruzados novamente C57B1/6 fundo foram utilizados.
[0344] Um anticorpo anti-humano VISTA foi gerado para permitir o teste nos ratinhos VISTA-Ki, utilizando a região variável da VSTB174 enxertada Fc de IgG2a de rato (VSTB123).
[0345] O câncer de bexiga MB49 foi avaliado em camundongos VISTA KI,
[0346] Em adição aos estudos publicados que demonstram que a terapia com anticorpos anti-VISTA inibe o crescimento do tumor em murganhos de tipo selvagem (Le Mercier et al., 2014), a eficácia anti-tumoral foi demonstrada com o anticorpo de hamster substituto em ratinhos WT utilizando diferentes dosagens e horários, e nos ratos VISTA-Ki tratados com VSTB123.
[0347] Estudos de eficácia In vivo no Modelo de Tumor MB49 em ratos VISTA-Ki
[0348] Estudos de eficácia MB49 foram realizados em ratinhos fêmea VISTA-KI, testando VSTB123 em várias doses compreendidas entre 1 e 10 mg/kg. Os ratos foram injetados intradermicamente com MB49 250.000 células de tumor no dia 0. No dia 6, a administração começou como indicado na Figura 37 (ou 10 mg/kg do isotipo mIgG2a controle, ou as doses indicadas de VSTB123; 10 ratinhos/grupo).
[0349] VSTB123 foi mais eficaz na maior dose vs mais baixas, como mostrado na Figura 37. As doses de 10 mg/kg e 7,5 mg/kg foram equivalentes, enquanto que os tumores cresceram mais rapidamente nos ratos que receberam doses de 5 ou de 1 mg/kg.
[0350] EXEMPLO 21: DETECÇÃO DE EXPRESSÃO VISTA EM TUMORES HUMANOS COM ANTICORPOS ANTI-VISTA A Figura 1 mostra a expressão VISTA por uma linha de célula tumoral AML - este e os dados de expressão de RNA- Seq na Figura 17 apoiam a ideia de que o VISTA é expresso por células AML e que a droga anti-VISTA é eficaz através diretamente destas células para a modulação imunológica ou morte mediada por anticorpo.
[0351] Dados para avaliar a expressão VISTA no câncer do pulmão foi obtido a partir de amostras de tumor de pulmão de ressecções cirúrgicas. As células foram dissociadas e caracterizadas por expressão do VISTA e muitos outros marcadores. Os resultados mostraram que 13/13 tumores de pulmão (escamosas ou adenocarcinomas) continha CD14 + VISTA + células mielóides, (Figura 38).
[0352] EXEMPLO 22: DETECÇÃO DE VISTA EXPRESSÃO NOS TUMORES DO PULMÃO UTILIZANDO ANTICORPOS ANTI VISTA
[0353] Um ensaio imuno-histoquímico foi desenvolvido utilizando clone GG8, um IgG1 de rato de VISTA anti-humano. Este mAb foi utilizado para investigar a coloração de VISTA, em seções tumorais FFPE de câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC).
[0354] Seções tumorais FFPE foram tratadas com métodos de recuperação de antígeno padrão, antes da coloração. Anticorpo VISTA anti-humano de rato GG8 foi usado a uma diluição de 1: 500. Ligação GG8 foi detectada utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-ratinho, seguido de polímero HRP anti-coelho. Contracoloração com hematoxilina seguido, então seções de tumor foram marcados.
[0355] Expressão VISTA no câncer do pulmão foi principalmente restrita ao infiltrado imunológico (exemplo mostrado na Figura 39) e altos níveis de células positivas VISTA estavam presentes em muitas amostras de câncer de pulmão
[0356] EXEMPLO 23: ESTRUTURA DO DOMÍNIO EXTRACELULAR (ECD) DE VISTA HUMANO, EM COMPLEXO COM O FRAGMENTO FAB DE VSTB174
[0357] Variantes de antígenos VISTA foram geradas e purificadas por cristalografia. VSTB 174 Fab marcada com His recombinante foi expressa internamente e purificada. Os cristais foram gerados e usados para coletar dados de alta resolução para o VISTA ECD: VSTB174 Fab complexa usando radiação síncrotron e a determinação estrutural foi resolvida utilizando combinações de análises de modelagem de homologia e densidade eletrônica (Figura 29 (Top)).
[0358] A estrutura do complexo VISTA ECD:VSTB174 Fab foi determinada por cristalografia de raios- x para uma resolução de 1,85 A, proporcionando a primeira estrutura da VISTA ECD e delinear epitopo e paratopo VSTB 174. A VISTA ECD adota um IgV vezes com uma topologia semelhante ao CTLA-4 ECD, mas possui vertente um G único "que se estende a folha frontal do β-sanduiche. A' e G' são ainda amarrados quimicamente através de uma ponte de dissulfeto formada entre os resíduos C12 em filamento A’ e C146 no filamento G'. Seis cisteínas foram encontradas para serem engatadas em três ligações de dissulfureto intramoleculares, e, com base em contatos de cristais, não há nenhuma evidência de uma VISTA dimérica.
[0359] VSTB174 reconhece os resíduos nas cadeias da folha frontal C’, C, F, e G nas extremidades proximais à volta FG, bem como resíduos nas voltas BC, FG, e CC’.
[0360] Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos publicados e as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade.
[0361] Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências a exemplos de modalidades da mesma, será compreendido pelos peritos na arte que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem nos afastarmos do escopo da invenção abrangidos pelas reivindicações anexas.

Claims (33)

1. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo deste caracterizado por consistir em uma região de ligação a antígeno que se liga a um Supressor Ig de domínio V de Ativação de Célula T (VISTA) humano, em que a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo ao VISTA humano modula ou intensifica uma resposta imune por antagonizar o VISTA humano, e ainda em que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado a partir de: (i) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; (ii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 1, 2 e 3; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 4, 5 e 6; (iii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 7, 8 e 9; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 10, 11 e 12; (iv) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 13, 14 e 15; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 16, 17 e 18; (v) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 19, 20 e 21; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 22, 23 e 24; e (vi) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e cujas CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 34, 35 e 36.
2. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consiste nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30.
3. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado a partir de: (i) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; (ii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 1, 2 e 3; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 4, 5 e 6; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (iii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 7, 8 e 9; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 10, 11 e 12; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (iv) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 13, 14 e 15; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 16, 17 e 18; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo de cadeia VH da SEQ ID NO: 51 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo de cadeia VL compreendido em SEQ ID NO: 52; (v) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 19, 20 e 21; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 22, 23 e 24; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (vi) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 34, 35 e 36; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo de cadeia VH da SEQ ID NO: 57 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
4. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e o polipeptídeo de cadeia VH consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e o polipeptídeo de cadeia VL consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
5. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado a partir de: (i) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consiste nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (ii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consiste nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (iii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (iv) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consiste nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (v) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consiste nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 1, 2 e 3; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consiste nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 4, 5 e 6; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vi) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consiste nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 7, 8 e 9; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 10, 11 e 12; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e um polipeptídeo de cadeia VL consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; (vii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 13, 14 e 15; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 16, 17 e 18; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; (viii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 19, 20 e 21; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 22, 23 e 24; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e (ix) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consiste nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 34, 35 e 36; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
6. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado a partir de: (i) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consiste nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (ii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (iii) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; e (iv) um cujas CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e um polipeptídeo de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
7. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as CDRs de VH do domínio de cadeia pesada variável (VH) consistem nas CDRs de VH de SEQ ID NO: 25, 26 e 27; e as CDRs de VL do domínio de cadeia leve variável (VL) consistem nas CDRs de VL de SEQ ID NO: 28, 29 e 30; e um polipeptídeo de cadeia pesada consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e um polipeptídeo de cadeia leve consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
8. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento de anticorpo Fab, F(ab’)2 ou scFv.
9. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de anticorpo humano.
10. Anticorpo isolado humanizado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo de VISTA com uma afinidade de pelo menos 1x10-9 litros/mol.
11. Anticorpo isolado humanizado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a modulação da resposta imune compreende um aumento nos leucócitos CD45+, células T CD4+ ou células T CD8+, ou uma combinação destas, ou uma diminuição nas células imunes que expressam VISTA, ou a modulação da resposta imune compreende produção intensificada de citocinas, resposta de célula T intensificada e/ou modula a expressão de Foxp3.
12. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender uma região constante da cadeia pesada de IgG1 que foi modificada para aumentar a resistência à protease do anticorpo.
13. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região constante da cadeia pesada de IgG1 que foi modificada para aumentar a resistência à protease do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de IgG1 presente na SEQ ID NO: 60.
14. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender uma região constante de cadeia leve.
15. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região constante da cadeia leve humana compreende a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve presente na SEQ ID NO: 56.
16. Composição caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
17. Uso do anticorpo ou fragmento de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou da composição, conforme definida na reivindicação 16, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo em necessidade deste.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásica ou mieloma, ou uma combinação destes.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a leucemia é leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielóide (mielógena) aguda (AML), leucemia mielógena crônica (CML); leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica grande granular ou leucemia de células T do adulto.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é circundado por um estroma do tumor compreendendo células mielóides, células-T ou uma combinação de células mielóides e células- T.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 22, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é infiltrado por células mielóides, células T ou uma combinação de células mielóides e células-T.
24. Uso do anticorpo ou fragmento de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para suprimir o crescimento tumoral em um indivíduo em necessidade deste.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser conforme definido na reivindicação 2.
26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser conforme definido na reivindicação 6.
27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser conforme definido na reivindicação 8.
28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser conforme definido na reivindicação 9.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de pulmão, câncer de bexiga ou câncer de mama.
30. Uso de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imune contra o câncer em um indivíduo com necessidade deste.
31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é uma resposta imune antitumoral.
32. Uso de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para desencadear uma resposta biológica em um indivíduo em necessidade deste, em que a resposta biológica é selecionada a partir do grupo consistindo em: a. ativação de monócitos; b. indução de proliferação das células T e secreção de citocina; c. aumento da sobrevivência de monócitos; d. indução de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) em células que expressam VISTA; e e. indução de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) em células que expressam VISTA.
33. Artigo de fabricação caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 13, e um recipiente, e compreender ainda uma bula ou rótulo indicando que a composição pode ser utilizada para tratar câncer.
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