UA125490C2 - Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент - Google Patents

Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент Download PDF

Info

Publication number
UA125490C2
UA125490C2 UAA201607766A UAA201607766A UA125490C2 UA 125490 C2 UA125490 C2 UA 125490C2 UA A201607766 A UAA201607766 A UA A201607766A UA A201607766 A UAA201607766 A UA A201607766A UA 125490 C2 UA125490 C2 UA 125490C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
cells
sho
mizta
still
Prior art date
Application number
UAA201607766A
Other languages
English (en)
Inventor
Лінда Снайдер
Линда Снайдер
Гордон Паверс
Original Assignee
Янссен Фармасеутіка Нв
Янссен Фармасеутика Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52444326&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA125490(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Янссен Фармасеутіка Нв, Янссен Фармасеутика Нв filed Critical Янссен Фармасеутіка Нв
Publication of UA125490C2 publication Critical patent/UA125490C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла або його антигензв’язувального фрагмента, що зв'язується з V-доменом Ig супресора Т-клітинної активації (VISTA), а також способу одержання і їх застосування. Способи застосування включають способи лікування раку, включаючи лейкози, лімфоми, щільні пухлини і меланоми.

Description

Винахід стосується антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з М- доменом ід супресора Т-клітинної активації (МІЗТА), а також способу одержання і їх застосування.
Способи застосування включають способи лікування раку, включаючи лейкози, лімфоми, щільні пухлини і меланоми.
СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ЇО0ОО1| Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою Мо. 61/920,695, поданою 24 грудня 2013 року, і попередньою заявкою Мо. 62/085,086, поданою 26 листопада 2014 року. Всі відомості вищевказаних заявок включені в дану заявку за допомогою посилань.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
І0002| Експресія негативних регуляторів імунних контрольних точок раковими клітинами або імуноцитами в мікросередовище пухлини може пригнічувати імунну відповідь хазяїна проти пухлини. Для ефективної боротьби з раком бажано блокувати пухлино-опосередковану супресію імунної відповіді хазяїна. Відповідно, існує потреба в нових і ефективних терапевтичних засобах, які інгібують негативні регулятори імунних контрольних точок у мікросередовищі пухлини, які пригнічують протипухлинні імунні відповіді.
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
ЇО0ООЗ| Даний винахід відноситься до антитіл і фрагментів антитіл, що включають у себе антигензв'язуючу ділянку, яка зв'язується з М-доменом Ід супресора Т клітинної активації (МІЗТА). МІЗТА являє собою регулятор контрольної точки, який негативно пригнічує імунну відповідь. Див. УмМапо еї аї., "МІ5ТА, а поме! тоизе Ід зирепатіїу Ідапа (паї педаїїмеїу тедшаїез Т сеї! гезроп5е5," У. Ехр. Мейа., 208(3) 577-92 (2011). Вона експресується на нормальних нейтрофілах, моноцитах і субпопуляції Т клітин людини. Крім того, клітини яванської макаки експресують МІЗТА аналогічно до нормальних людських клітин. МІЗТА також експресується в клітинах периферичної крові людей, хворих раком.
Ї0004| Зв'язування антитіла або фрагмента антитіла з МІЗТА модулює або підсилює імунну відповідь. Фрагмент антитіла може включати, наприклад, аб, Е(ар)»2 або 5сЕм фрагмент антитіла. Антитіло або фрагмент антитіла може містити константну ділянку антитіла. Антитіло або фрагмент антитіла може зв'язуватися з МІЗТА, який експресувався на гемопоетичній клітині, наприклад, мієлоїдній клітині і/або лімфоциті, моноциті або нейтрофілі, Т клітині, природних клітинах-кілерах (МК), Т-клітинах з функціями природніх кілерів (МКТ), пухлинній клітині і/або мікросередовищі пухлини (ТМЕ). Мікросередовище пухлини являє собою клітинне середовище пухлини. Воно може містити в собі прилеглі імунні клітини, фібробласти, кровоносні судини, інші клітини, сигнальні молекули і позаклітинний матрикс.
Зо ЇО0О5| Антитіло і фрагмент антитіла може містити в собі одну або декілька гіперваріабельних ділянок (СОМК5) важкого ланцюга і/або одну або декілька СОК5 легкого ланцюга, що включає одну або декілька СОК5 (наприклад, усі три важкі ланцюги СОК»5, усі З легкі ланцюги СОР, або всі 6 СОМ») будь-якого з анти-МІ5ТА антитіл, описаних у даній заявці, включаючи антитіла, позначені М5ТВ112 (52), М5ТВ116 (55), М5Т895 (516), М5ТВ50 (541),
У5ТВ53 (543) і МУ5ТВб6О (547). У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіла або їх фрагменти вибрані із групи, що складається з М5ТВ112, 57895, М5ТВ116, М5ТВ50, М5ТВ53 і
УЗТВбО. В одному варіанті здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент включає одну або декілька СОК5 важкого ланцюга і одну або декілька СОК5 легкого ланцюга будь-якого з анти-МІЗТА антитіл, описаних у даному винаході. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло або фрагмент антитіла може додатково включати, щонайменше, один важкий ланцюг і, щонайменше, один легкий ланцюг будь-якого з анти-МІЗТА антитіл, описаних у даному винаході. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла включає, щонайменше, один важкий ланцюг, що включає послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, і/або щонайменше один легкий ланцюг, що включає послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло включає людську каркасну ділянку. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло являє собою бівалентне антитіло. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, фрагмент являє собою анти-мМІЗТА зв'язуючий елемент. У деяких варіантах здійснення даного винаходу,
СОК5 важкого ланцюга антитіла представлений в 5ЕО ІЮ МОЗ5:1, 2 і 3, а СОК5 легкого ланцюга представлений в 5ЕБО ІЮО МО»5: 4, 5 і 6. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга представлені в ЗЕО ІЮО МОБ: 7 і 8, відповідно.
ІЇО00О6| Даний винахід також включає анти-мІ5ТА антитіла, які є в сутності аналогічними до антитіл, що описані в даному винаході. Наприклад, в одному варіанті здійснення винаходу, антитіло або фрагмент включає МН домен антитіла що включає СОКІ МН, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті аналогічною до 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті аналогічною до ЗЕО ІЮ МО:2, і МН СОКЗ, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті аналогічною до 5ЕО ІЮ МО:3, і яка додатково включає
МІ. домен антитіла, що включає СОКІ Мі, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті 60 аналогічною до ЗЕО ІЮ МО4, СОК2 МІ, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті аналогічною до ЗЕО ІЮ МО:5, і СОКЗ МІ, що має амінокислотну послідовність, яка є по суті аналогічною до ЗЕО ІЮ МО:6.
ЇО007| Даний винахід також відноситься до анти-МІЗТА антитіл, які конкурентно інгібують, або конкурують за зв'язування з анти-МІЗТА антитілами, описаними в даному описі.
ЇО00О8| У деяких варіантах здійснення даного винаходу, анти-МІЗТА антитіла являють собою частину кон'югата, наприклад, кон'югата, який включає цитотоксичну молекулу або іншу речовину, описану в даному винаході. Такі молекули добре відомі в області техніки.
ЇО0О09| У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло являє собою химерне, гуманізоване або людське антитіло. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла включає людську константну ділянку. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла є специфічним для епітопа МІ5ТА, наприклад, у межах амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 9. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла зв'язується з епітопом
МІ5ТА з афінністю, щонайменше, 1х1077 л/моль, наприклад, щонайменше, їх109 л/моль, наприклад, щонайменше, 1х107 л/моль.
ЇОО10| У деяких варіантах здійснення даного винаходу, модуляція імунної відповіді включає збільшення в СО45-- лейкоцитів, СО4-- Т клітин і/або СО8-- Т клітин. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, модуляція імунної відповіді включає підсилення вироблення (наприклад, Т-клітиною) цитокінів (наприклад, ІЄМУу, І/-10, ТМЕс, 1-17), підсилення Т-клітинної відповіді і/або модульовану експресію ГРохр3.
ЇОО11| Даний винахід також відноситься до композицій, що включають антитіло або фрагмент антитіла, описані в даній заявці (наприклад, анти-МмІ5ТА антитіло), і фармацевтично прийнятний носій, розчинник або наповнювач. Наприклад, композиція може містити в собі антагоніст МІ5ТА, що містить антитіло або фрагмент такого антитіла, що включає антигензв'язуючу область, яка зв'язується з МІЗТА, і вакцину (таку як вакцина на основі вірусного вектора, бактеріальну вакцину, ДНК вакцину, ДНК вакцину, пептидну вакцину). У деяких варіантах здійснення даного винаходу, композиція являє собою фармацевтичну композицію і зв'язування антитіла або фрагмента антитіла з МІЗТА модулює або підсилює імунну відповідь.
ЇО012| Даний винахід також відноситься до способів лікування або попередження раку, що включають введення індивідуумові (наприклад, ссавцю, наприклад, людині або нелюдиноподібній тварині), що має таку потребу, ефективної кількості, щонайменше, одного антитіла, фрагмента антитіла або композиції, що описані в даному винаході.
ЇО0О13| У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла зв'язується з МІЗТА, тим самим модулюючи або підсилюючи імуногенну відповідь на рак. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою лейкоз, лімфому, мієлодиспластичний синдром і/або мієлому. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою будь-який вид або тип лейкозу, у тому числі лімфоцитарний лейкоз або мієлогенний лейкоз, такий як, наприклад, гострий лімфобластний лейкоз (АГ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СГ3, гострий мієлоцитарний (мієлогенний) лейкоз (АМІ), хронічний гранулоцитний лейкоз (СМІ)), лейкоз ворсистих клітин, Т-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, лейкоз із великих зернистих лімфоцитів, або Т-клітинний лейкоз дорослих. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, лімфома являє собою гістоцитарну лімфому, а в деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою множинну мієлому. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою щільну пухлину, наприклад, меланому або рак сечового міхура. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою рак легенів (наприклад, недрібноклітинну карциному легенів (М5СІ С)). Деякі способи лікування додатково містять у собі введення вакцини (такої як вакцина на основі вірусного вектора, бактеріальної вакцини, вакцини на основі клітин, ДНК вакцини, РНК вакцини, пептидної вакцини або білкової вакцини). Даний винахід також відноситься до способу придушення росту пухлини у індивідуума, що має таку потребу, що включає введення ефективного антитіла або фрагмента антитіла або композиції, описані в даному винаході.
Ї0014| Композиція, антитіло або фрагмент або інші фармацевтичні речовини (наприклад, вакцина) може вводитися будь-яким парентеральним або непарентеральним способами, наприклад, внутрішньовенно (ІМ), підшкірно (502) або перорально (РО).
ЇОО15)| У деяких варіантах здійснення даного винаходу, композиція, антитіло або фрагмент вводять кожні три місяці, щотижня, один раз у два тижні, один раз у три тижні або один раз у чотири тижні. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, інші фармацевтичні або 60 терапевтичні речовини вводять спільно, до, у ході або після антитіл, фрагментів або композицій,
описаних у даному винаході. Речовина, що спільно вводиться, може бути введена таким же шляхом як антитіло, фрагмент або композиція, або іншим шляхом.
ЇО016| Даний винахід також включає способи одержання антитіл, фрагментів або композицій, наприклад, спосіб одержання антитіла або фрагмента, описаного в даному винаході, що включає культивування клітин-хазяїв в умовах для одержання зазначеного антитіла. Спосіб може додатково включати виділення антитіла. Даний винахід також відноситься до нуклеїнових кислот, наприклад, виділених нуклеїнових кислот, які включають нуклеотидну послідовність, що кодує антитіла і фрагменти, експресійні вектори, що включають у себе такі нуклеїнові кислоти, наприклад, функціонально зв'язані із промотером, і клітини-хазяї, трансформовані з таким експресійним вектором.
ЇО0О17| Даний винахід також відноситься до наборів і готових виробів, що включають композицію, що містить анти-мі5ТА антитіло і контейнер, і додатково містить листівку- вкладиш або етикетку, що вказує, що композиція може бути використана для лікування раку.
ЇО018| Даний винахід також відноситься до виділеного антитіла або фрагмента такого антитіла, що включає антигензв'язуючу область, яка зв'язується з М-доменом Ід супресора Т клітинної активації (МІ5ТА), де антитіло включає МН домен антитіла, що містить СОКІ МН, що має амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО:25, СОК2 МН, що має амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:26 і СОКЗ МН, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:27, і який додатково включає Мі. домен антитіла, що містить СОКІ1 Мі, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО:28, СОК2 Мі, що має амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮО МО:29, ії СОКЗ МІ, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:30. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла включає одну або декілька гуманізовану або людську каркасну ділянку. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла включає МН домен антитіла, який містить ЗЕО ІЮ МО:37 і/або Мі домен антитіла, що містить
ЗЕО ІО МО:44. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло включає константну ділянку важкого ланцюга (наприклад, константну ділянку людського важкого ланцюга) і/або константну ділянку легкого ланцюга (наприклад, константну ділянку людського легкого ланцюга, такого як константна ділянка легкого ланцюга, що представлено в 5ЕО ІЮ МО:56). Переважно, константна ділянка важкого ланцюга являє собою константну ділянку важкого ланцюга Ідс!1
Зо (наприклад, константну ділянку важкого ланцюга Ідс1, що представлено в 5ЕО ІЮ МО:61). У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 була змінена для підсилення протеазної резистентності антитіла. Прикладом константної ділянки важкого ланцюга Ідс1, яка була змінена для підсилення протеазної резистентності, є константна ділянка важкого ланцюга Ідс1, представлена в 5ЕО ІЮ МО:60. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла включає важкий ланцюг, що містить 5ЕО ІЮ МО:60, і легкий ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО:56; або важкий ланцюг, що містить 5ЕО ІЮ МО:61, і легкий ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО:56. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла експресується в клітині, у якій дефіцит фукозилювання ферментів (наприклад, клітина яєчника китайського хом'ячка (СНО), у якій дефіцит фукозилювання ферментів).
ЇО019| Даний винахід також відноситься до композиції, що включає в себе антитіло або фрагмент цього антитіла, що містить МН домен антитіла, що включає СОКІ МН, що має амінокислотну послідовність з«ЕО ІО МО:25, СОК2 МН, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
І МО:26, і СОКЗ МН, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:27, і яке додатково включає Мі. домен антитіла, що містить СОК1 МІ, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ
МО:28, СОК2 Мі, що має амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО:29, і СОКЗ МІ, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:30; і фармацевтично прийнятний носій, розчинник або наповнювач.
І0020О| В іншому варіанті здійснення даного винаходу, винахід відноситься до способу лікування раку у індивідуума, що має таку потребу, що включає введення суб'єктові ефективної кількості антитіла або фрагмента цього антитіла, що зв'язується з М-доменом Ід супресора Т клітинної активації (МІ5ТА), причому антитіло включає МН домен антитіла, що містить СОКІ МН, що має амінокислотну послідовність 5ЕБЕО І МО:25, СОК2 МН, що має амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:26, і СОКЗ УН, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:27, і яке додатково включає Мі домен антитіла, що містить СОКІ Мі, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:28, СОК2 Мі, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:29, і
СОКЗ Мі, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:30. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, рак являє собою рак легенів. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, рак легенів являє собою недрібноклітинну карциному легенів (М5СІ С). У 60 деяких варіантах здійснення даного винаходу, спосіб додатково включає введення другої протипухлинної терапії (наприклад, операції, хіміотерапії, променевої терапії, біологічної терапії, імуномодулюючої терапії і їх комбінації).
І0021| Даний винахід також забезпечує антитіло або фрагмент цього антитіла, що включає антигензв'язуючу область, яка зв'язується з М-доменом Ід супресора Т клітинної активації (МІЗТА), причому антитіло зв'язується з конформаційним епітопом в МІЗТА (наприклад, людського МІЗТА). У деяких варіантах здійснення даного винаходу, конформаційний епітоп включає або є присутнім у межах залишків 103-111 (МТ О501 (5ЕО І МОб62)) і 136-146 (МОТОКОАРБМСОС (ЗЕБЕО ІЮ МО:63)) людських МІЗТА (ЗЕО ІЮ МО:46). В іншому варіанті здійснення даного винаходу, конформаційний епітоп включає або є присутнім у межах залишків 24-36 (ПП аРУЮКОаНОМТтЕ (5ЕО І МО:64)), 54-65 (КЕРІКОГТРОБІ (ЗЕО ІЮ МО:65) і 100-102 (ТМК) людських МІЗТА (5ЕО ІО МО:46). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, конформаційний епітоп включає амінокислотні залишки в ЕС петлі людських МІЗТА (ЗЕО ІЮ
МО:46).
І0022| Крім того, даний винахід відноситься до способу підсилення імунної відповіді у індивідуума, що має таку потребу, що включає введення індивідуумові терапевтично ефективної кількості антитіл, які зв'язуються з М-доменом Ід супресора Т клітинної активації (МІЗТА), або фрагмента цих антитіл, що включає антигензв'язуючу область, яка зв'язується з
МІЗТА, тим самим підсилюючи імунну відповідь на рак. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, імунна відповідь являє собою протипухлинну імунну відповідь.
І0023| В іншому варіанті здійснення даного винаходу, винахід пропонує спосіб викликати біологічну відповідь у індивідуума, що має таку потребу, що включає введення індивідуумові терапевтично ефективної кількості антитіла, яка зв'язує М-домен Ід супресора Т клітинної активації (МІЗТА), або фрагмента цього антитіла, що включає антигензв'язуючу область, яка зв'язується з МІЗТА, тим самим підсилюючи імунну відповідь на рак. Приклади біологічних відповідей включають активацію моноцитів; індукцію проліферації Т-клітин і секрецію цитокінів; антитілозалежну клітиннопосередковану цитотоксичність (АОСС) клітин, експресуючих МІЗТА; і анти клітинний фагоцитоз (АОСР) клітин, експресуючих МІ5ТА.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
І0024| Патент або комплект матеріалів заявки містить, щонайменше, одне креслення,
Зо виконане у кольорі. Копії даного патенту або комплекту матеріалів заявки з кольоровим кресленням будуть представлені у Відомство на першу вимогу і при оплаті необхідного мита. 0025) На Фігурах 1А-1С представлені графіки, що показують експресію МІ5ТА на ТЕ1 АМГІ. клітинах, експресія білка МІЗТА за допомогою проточної цитометрії показана в ТЕ-1 АМІ. клітинній лінії.
І0026б| На Фігурах 2А-2Е представлені графіки, що показують забарвлення і стратегія гейтирування для встановлення людських мієлоїдних і лімфоїдних субпопуляцій.
І0027| На Фігурах ЗА-30 представлені графіки, що показують експресію МІЗ5ТА на людських мієлоїдних і лімфоїдних субпопуляціях від одного здорового донора.
І0028| На Фігурі 4 представлені графіки, що показують експресію МІЗТА на людських мієлоїдних і лімфоїдних субпопуляціях від декількох здорових нормальних донорів.
І0029| На Фігурах 5А-5В8 представлено графік, що показує забарвлення і стратегія гейтирування для визначення експресії МІЗТА на людських моноцитах і макрофагах.
І0ОЗО| На Фігурах 6А-6С представлені графіки, що показують експресію МІЗТА на людських моноцитах і макрофагах.
Ї0ОЗ31| На Фігурах 7А-7Е представлені графіки, що показують забарвлення і стратегія гейтирування для визначення експресії МІЗТА на людських Т і МК клітинних субпопуляціях. 0032) На Фігурах вВА-80 представлені графіки, що показують експресію МІЗ5ТА на людських
Т і МК клітинних субпопуляціях від одного здорового нормального донора.
І00З3| На Фігурі 9 представлено графік, що показує експресію МІЗТА на людських Т і МК клітинних субпопуляціях від декількох нормальних донорів.
Ї00О34| На Фігурах Т0А-100 представлені графіки, що показують забарвлення і стратегія гейтирування для визначення експресії МІЗТА на субпопуляціях людських дендритних клітин.
І0035| На Фігурах 11А-11С представлені графіки, що показують експресію МІЗТА на субпопуляціях людських дендритних клітинах і базофілах від одного здорового донора.
Ї0ООЗ6| На Фігурі 12 представлені графіки, що показують експресію МІ5ТА на субпопуляціях людських дендритних клітинах і базофілах від декількох здорових нормальних донорів.
І0037| На Фігурах 13А-130 представлено аналіз експресії МІ5ТА на клітинах периферичної крові здорової людини. Профіль експресії МІЗТА на клітинах периферичної крові здорової людини з застосуванням аналізу багатокольорової проточної цитометрії: зразки цільної крові від бо 2 різних індивідуумів були проаналізовані на експресію МІЗТА на (Фігура 13А) моноцитах звБОСеСрітр"Срі4нор16СОо33иеНІ А-ЮОВНАеСО19-е) (Фігура 138) нейтрофілах (55207001776р11р'"СО1495016иеС033еНІ А-ОВНОеСО19 хе), Мононуклеари периферичної крові були виділені з застосуванням градієнта Фіколла для аналізу (Фігура 1302) СО4. Т клітин (Срзмебрае), і (Фігура 1303 СО8 Т клітин (СОЗИеСОв не).
І00ОЗ8| На Фігурах 14А-14С представлено аналіз експресії МІ5ТА на клітинах периферичної крові від пацієнта, що хворіє раком легенів, і здорового донора в якості контролю. Профіль експресії МІЗТА на клітинах периферичної крові пацієнта, що хворіє раком легенів, з застосуванням аналізу багатокольорової проточної цитометрії: показовий пліт РАС5З (Фігура 14А) представлений від одного індивідуума. Мононуклеари периферичної крові були виділені з застосуванням Фіколла і проаналізовані на експресію МІ5ТА на (Фігура 148) моноцитах (СО14-
Ср116-- 2033- НГ АОВ-- СО15-) і (Фігура 14С) мієлоїдних супресорних клітинах (СО0О14- СО11р--
СО033-Н АОВ-С015- СО16-).
І00З39| На Фігурах 15А-15С представлено профіль експресії МІ5ТА у клітинах периферичної крові від пацієнта, що хворіє раком товстої кишки, з застосуванням аналізу багатокольорової проточної цитометрії: показовий пліт ЕАС5 (Фігура 15А) представлений від одного індивідуума.
Мононуклеари периферичної крові були виділені з застосуванням Фіколла і проаналізовані на експресію МІ5ТА на (Фігура 158) моноцитах (С0О14- СО1156- Сб033- НІ АОА- СО15-) і (Фігура 15С) мієлоїдних супресорних клітинах (СО0О14- СО116-- 2О0О33-НІ АОВ-С0О15- СО16-).
І0040| На Фігурах 16А-160 представлено профіль експресії МІ5ЗТА на клітинах периферичної крові яванської макаки з застосуванням аналізу багатокольорової проточної цитометрії: була досліджена цільна кров від 4 різних макак на експресію МІЗТА на (Фігура 16А) моноцитах (55СеСОІ11р"СОТА"НІіА-ОВНИ"СО16еС019е 1! (Фігура 168) нейтрофілах
СО1ТЬиСО149НІ А-ОВеСО167еС0019-е, Мононуклеари периферичної крові від трьох макак були виділені з застосуванням градієнта Фіколла для аналізу (Фігура 16С) СО4- Т клітин (ТСКа/реебра-е) і (Фігура 160) СО8ч- Т клітин (ТСКа/риеСОв хе).
Ї0041| На Фігурі 17 представлено графік, що показує абсолютні значення експресії РНК
МІ5ТА клітинних лініях Нете. 00421 На Фігурі 18 показані мишачі клітини А20, які стабільно трасфіковані з або СЕР або людським МІЗТА. Вони були інкубовані з пептгидом овальбуміну і з 0О11.10 Т клітинами.
Зо Експресію СО25 Т клітинами вимірювали через 24 години після початку інкубації. Клітини А20- пПиМІЗТА пригнічують експресію СО25 Т клітинами, але ці показання значно відновлюються шляхом інкубації з У5ТВО5.
І0043| На Фігурах 19А-19Е представлені графіки, що показують результати ІФА людських
МІ5ТА.
І0044| На Фігурах 20А-20Е представлені результати ЕАС5 людських МІ5ТА, що показують зв'язування анти-МміІ5тТА антитіл із клітинами, що експресують людський МІ5ТА.
Ї0045| На Фігурах 21А-210 представлене дослідження розведення 6 кандидатів анти-МІЗТА антитіл у реакції змішаної культури лімфоцитів від 30 мг/мл до 0,0 мкг/мл.
ІЇ0046| На Фігурах 22А-22В представлені дослідження розведення 6 кандидатів анти-МІЗТА антитіл в аналізі ЕВ (одиничні СРМ імпульси і концентрації ІЕМ-9) від 30 мкг/мл до 0.0 мкг/мл.
Ї0047| На Фігурі 23 представлена сенсограма плоту з застосуванням УЗТВ85 анти-МІЗТА антитіла, покритих на чипі Ргоїеоп 5РЕ, і білка МІЗТА із зазначеними конкурентами, що біжать по чипу (конкуренти перераховані в Таблиці 16). 0048) На Фігурі 24 представлено експериментальний дизайн для моделі мишачої пухлини
МВа49 сечового міхура.
І0049| На Фігурах 25А-258 показаний ріст пухлини МВ49 в С57ВІ/б мишей жіночої статі.
Графіки показують ріст пухлини в окремих мишей, яким вводили анти-мишачі МІЗТА антитіла (Фігура 258) або контрольні Ідс (Фігура 25А).
Ї0О0О50| На Фігурі 26 представлена амінокислотна послідовність людських МІЗТА (ЗЕО ІЮ
МО:46).
ЇО0О51| На Фігурі 27 представлене множинне вирівнювання послідовностей ортологічних
МІ5ТА.
І0052| На Фігурі 28 представлені ділянки людських МІ5ТА, зв'язані з М5ТВ50 і М5ТВбОо антитілами (зверху) або М5ТВО5 і М5ТВ112 антитілами (знизу), як визначено за допомогою НОХ
ІЇ0053| На Фігурі 29 представлений епітоп МІЗ5ТА, пов'язаний з М5ТВ112. (Зверху) МІЗТА представлений у карикатурному виді з позначеними нитками. Залишки, що мають, щонайменше, один атом у межах 5 А М5ТВ112 у комплексі, пофарбовані синім. Сині і помаранчеві області вказують на розрив ланцюга, а блакитними і зеленими областями відзначені М- ії С-кінці МІЗТА структури, відповідно. (Знизу) Послідовність конструкції МІЗТА бо застосовується у визначенні структури. Кола під послідовністю застосовували для позначення залишків, які складають тільки основний ланцюг, що контактує з М5ТВ112, трикутниками позначають контакт на бічному ланцюзі, а квадратами позначають контакт на бічному ланцюзі, що призводить до або взаємодії водневого зв'язку, або іонного зв'язку, як розраховується за допомогою РІЗА. Області пофарбовані для позначення СОК, що має найбільше число атомів, що зв'язують даний залишок з СОК, кольороами, зазначеними на Фігурі 59. Вторинні структурні елементи, як позначено в програмі МОЕ, з жовтими стрілками, що позначають р-нитки, і червоні прямокутники, що позначають а-спіралі. 0054 На Фігурі 30 представлений паратоп М5Т8112. (Зверху) Антиген МІ5ТА представлений в ілюстрації і М5ТВ112 МІ5ТА у межах 5 ангстрем (А) показаний на поверхні із квітами, використовуваними для позначення ідентичності СОК, відповідно до послідовності нижче. Контактування каркасних залишків, що прилягають до СОК, пофарбовані аналогічно до відповідної послідовності СОК (нижня частина) Ем ділянки М5ТВ112. Пофарбований задній план вказували СОКз5 відповідно до визначень Кабаї. Кола нижче послідовності застосовувалися для позначення залишків, які складають основний ланцюг, що контактує з МІ5ТА, трикутники позначають контакт на бічному ланцюзі, а квадрати позначають контакт на бічному ланцюзі, що призводить до взаємодії або водневого зв'язку, або іонного зв'язку, який розраховується за допомогою РІЗА.
ЇО055| На Фігурі 31 представлене порівняння ділянок епітопа, визначених за допомогою кристалографії і водень-дейтерієвого обміну (НОХ). Послідовність конструкції МІЗТА застосовували у визначенні структури. Кола нижче послідовності застосовували для позначення залишків, які складали тільки основний ланцюг, що контактує з М5ТВ112, трикутники позначають контакт на бічному ланцюзі, а квадрати позначають контакт на бічному ланцюзі, що призводить до взаємодії або водневого зв'язку, або іонного зв'язку, як розраховується за допомогою РІЗА. 0056) На Фігурі 32 представлена активація СО14-- моноцитів у цілих РВМС за допомогою
УЗТВІ174 (отриманого від М5ТВ112). У кожній частині експерименту, клітини інкубували з РВ5, контрольні ІдДО1 антитіла, або М5ТВ174 при 1, 0,1 або 0.01 мкг/мл. На лівій панелі показані СО8О
МЕЇ; на правій панелі показані НСА-ОК МЕЇ (показані дослідження двох донорів з достовірними результатами).
Зо Ї0057| На Фігурі 33 представлені графіки, що показують активність АОСС М5ТВ174, направлену проти К562-МІЗТА клітин.
Ї0058| На Фігурі 34 представлені графіки, що показують активність АЮСР МУ5ТВ174, направлену проти К562-МІЗТА клітин. Зображені обидва антитіла мають однакові Бар, але
М5ТВІ174 має Ес ІдО1 ії М5ТВ140 має Ес мовчазного Ідса2.
Ї0059| На Фігурі 35 представлено графік, що показує фагоцитоз, опосередкований
У5ТВ174, М5Т8149 або М5Т8140 тАБ5 проти К562-МІЗТА. Кожну тАр досліджували з 7 половиною логарифма доз у межах від 0.0008 мкг/мл до 0.56 мкг/мл.
ІЇОО60О| На Фігурі 36 представлено графік, що показує фагоцитоз, опосередкований
УЗТВ174, М5ТВ149 або М5ТВ140 тАбБ»5 проти К562 клітин мієломної клітинної лінії. Кожну тАб досліджували з 7 половиною логарифма доз у межах від 0.0008 мкг/мл до 0.56 мкг/мл.
ІЇОО61| На Фігурі 37 представлене дослідження ефективності пухлини МВ49, оцінюваної
М5ТВ123 1, 5, 7.5, і 10 мг/кг в МІЗТА-КІ мишей жіночої статі. Об'єми пухлин складали приблизно 50 мм3, коли починали дозування на 6 день після імплантації. М5ТВ123 являють собою ЕРар
У5ТВІ112, трансплантовані в мишачий кістяк Ес і зв'язувалися з людськими МІЗТА в МІБТА-КІ мишах. 0062) На Фігурі 38 представлено графік, що показує, що СО14-- клітини, що експресують високі/проміжні рівні МІЗ5ТА, виявлені в 13/13 зразках раку легенів, а також у вилученій легеневій тканині і периферичній крові пацієнтів.
Ї0ОО6З| На Фігурі 39 показане ІНС забарвлення для МІ5ТА у раку легенів з застосуванням сК»ив8.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Ї0064| Нижче приводиться опис приблизних варіантів здійснення даного винаходу.
Ї0065| Даний винахід відноситься до антитіл до нового ліганду сімейства імуноглобулінів, призначеному М-домену імуноглобуліну супресора Т клітинної активації (МІ5ТА) (Сепбрапк:
УМ602184) (Умапд еї аїІ., 2010, 2011). МІЗТА має гомологію до РО-11, але показує унікальний профіль експресії гена, який обмежений у гемопоетичному відділенні. Зокрема, МІЗТА конститутивно і найвищою мірою експресується на СО11р'о" мієлоїдних клітинах, і експресується на більш низьких рівнях на СО4: і СО8: Т клітинах. Частка людських гомологів приблизно 8595 гомології з мишачими МІЗТА і мають подібний профіль експресії генів (І іпе5 еї бо аІ!., Сапсег Кезеагсп 74:1924, 2014). МІЗТА експресується на антиген-презентуючих клітинах
(АРС5), пригнічуючи проліферацію СО4: і СО8: Т клітин і вироблення цитокінів за допомогою спорідненого рецептора незалежно від РО-1. У пасивній ЕАЕ (експериментальний аутоімунний енцефаломієліт) моделі захворювання, МІЗТА специфічні моноклональні антитіла підсилюють
Т-клітково-залежні імунні відповіді і загострюють захворювання. МІЗТА зверх-експресується на пухлинних клітинах з порушенням захисного протипухлинного імунітету в пухлинонесучих хазяїв. Дослідження людських МІЗТА підтвердили його пригнічуючу функцію на людські Т клітини (Гіпе5 еї а. Сапсег Кезеагсп 74:1924, 2014,. зщшаїев їот Ніїез евї аї. аізо ідепійіва МІЗТА (патей РО-1Н) аз а роїепі іттипе зирргеззіме тоїесціе (Ріез еї аїЇ., 2011). МІЗТА описаний більш докладно в 20130177557 А1 і патентах США Мох. 7,919,585 і 8,236,304, всі з яких включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному об'ємі.
Ї0О6б6| МІ5ТА являє собою новий негативний регулятор контрольної точки, який пригнічує імунні відповіді. Як описано в Прикладі 12 даної заявки, лікування з МІЗТА-специфічними моноклональними антитілами в мишачих моделях пухлин показало повну зміну пригнічуючого характеру імунного мікросередовища пухлини і підсилення захисного протипухлинного імунітету, таким чином, показуючи потенціал моноклонального антитіла МІ5ТА в якості нового терапевтичного засобу для імунотерапії раку.
І0067| АНТИТІЛА і ФРАГМЕНТИ
Ї0О0О68| Термін "антитіло" означає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАбв5), химерні антитіла, гуманізовані антитіла, людські антитіла і антиідіотипові (анти-Іа) антитіла, а також фрагменти, ділянки і їх похідні, отримані будь-яким відомим способом, такими як, але не обмежуючись ними, ферментативне розщеплення, пептидний синтез або рекомбінантні методи.
Анти-МІЗТА антитіла за даним винаходом здатні зв'язувати ділянки МІ5ТА, які модулюють, регулюють або підсилюють імунну відповідь. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіла конкурентно інгібують одну або декілька анти-мМІ5ТА антитіл, описаних у даному описі.
Способи для визначення того, два або більше антитіл конкурують за зв'язування з тією самою мішенню, відомі з рівня техніки. Наприклад конкурентно-зв'язуючий аналіз можна застосовувати для визначення того, чи блокує одне антитіло зв'язування іншого антітела з мішенню. Як правило конкурентно-зв'язуючий аналіз включає застосування очищеного антигена-мішені (наприклад, РО-1), зв'язаного або з твердим субстратом,або з клітинами, непозначену
Зо досліджувану зв'язуючу молекулу і мічену референсну зв'язуючу молекулу. Конкурентне зв'язування вимірюють за допомогою кількості міток зв'язування із твердим субстратом або клітинами в присутності досліджуваної зв'язуючої молекули. Зазвичай, досліджувана зв'язуюча молекула присутня в надлишку. Як правило коли конкуруюча зв'язуюча молекула присутня в надлишку, вона буде інгібувати специфічне зв'язування референсної зв'язуючої молекули з гетерогенним антигеном, щонайменше, на 50-5595, 55-6095, 600-655, 65Б-7095, 70-7595, або більше. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, конкурентне зв'язування визначають за допомогою аналізу конкурентного інгібування твердофазного ІФА.
Ї0О69| Поліклональні антитіла являють собою гетерогенні популяції молекул антитіл, отриманих із сироватки тварин, імунізованих антигеном. Моноклональні антитіла містять по суті однорідну сукупність антитіл специфічних до антигенів, де популяція містить по суті аналогічні ділянки зв'язування епітопа. Моноклональні антитіла можуть бути отримані способами, відомими фахівцям у даній області техніки. Див., наприклад, Копіег апа Міїсієїп, Маїшиге, 256:495- 497 (1975); патент США. Мо. 4,376,110; А!,зирбеї еї аї!., еаз., Ситепі Ргоїосої!5 іп МоїІесшаг Віоіоду,
Сгеепе Рибії5піпуд Авб5ос. апа Умйеу Іпіегесіепсе, М.М., (1987, 1992); і Напоум/ апа Іапе АМТІВОБІЕ5: А І арогаюгту Мапиа! Соїй ріпа Натог І арогаюгу (1988); Соїїїдап еї аї., едв.,
Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду, Стеєпе Рибіїзпіпуд Авзос. апа УМіеєу Іпіегесівєпсе, М.У., (1992, 1993), весь вміст яких включено в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі. Такі антитіла можуть бути будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ДМ, ІДЕ, ІДдЗА, ССО і будь-якого їх підкласу. Гібридома, що робить моноклональні антитіла за даним винаходом, може бути культивована іп міїго, іп 5йи або іп мімо.
ІЇ0О070| Даний винахід також включає фрагменти, визначені ділянки і їх варіанти, включаючи антитіла міметики або ділянки, що включають, антитіла, які копіюють структуру і/або функцію антитіла або визначеної або її ділянки, у тому числі одноланцюгові антитіла і їх фрагменти.
Функціональні фрагменти містять у собі антиген-зв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з білком
МІ5ТА ссавців. Наприклад, фрагменти антитіл, здатні зв'язуватися з МІЗТА або його ділянками, включаючи, але не обмежуючись ними, Бар (наприклад, шляхом розщеплення папаїіну), Бар' (наприклад, шляхом розщеплення пепсину і неповного відновлення) і Е(аб)г2 (наприклад, шляхом розщеплення пепсину), Тасб (наприклад, шляхом розщеплення плазміну), рЕс (наприклад, шляхом розщеплення пепсину або плазміну), га (наприклад, шляхом розщеплення бо пепсину, неповного відновлення і реагрегації), Ем або 5сЕм (наприклад, за допомогою молекулярно-біологічних методів) фрагменти, що включені в даний винахід (див., наприклад,
Соїїїдап, Іттипоїіоду, зирга). Фрагменти антитіл за даним винаходом також містять у собі ті, які описані в Аагоп ЇМ. Меїбоп, тАбБ5 2:1, 77-83 (Січень/Лютий 2010), вміст якого включено за допомогою посилання в повному об'ємі.
Ї00О71| Такі фрагменти можуть бути отримані шляхом, наприклад, ферментативного розщеплення, синтетичними або рекомбінантними методами, як відомо з області техніки і/або як описано в даній заявці. Антитіла можуть також бути отримані в різних процесійованих формах з застосуванням генів антитіла, у яких один або більше стоп-кодонів були введені до природної стоп-ділянки. Наприклад, комбінація генів, що кодують ділянку Е(аб)» важкого ланцюга, може бути призначена для включення послідовностей ДНК, що кодує домен СНІ і/або шарнір важкого ланцюга. Різні ділянки антитіл можуть бути з'єднані один з одним хімічно за допомогою загальноприйнятих методів або можуть бути отримані у вигляді суміжного білка з застосуванням методів генетичної інженерії.
І0072| В одному варіанті здійснення даного винаходу, амінокислотна послідовність ланцюга імуноглобуліну або його частини (наприклад, варіабельна ділянка, СОК) має приблизно 700-100 95 ідентичності (наприклад, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 або будь-який діапазон або їх значення) до амінокислотної послідовності відповідної варіабельної послідовності ланцюга, як описано в даному винаході. Переважно, 70-100 95 ідентичних амінокислот (наприклад, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 або будь-який діапазон або їх значення) визначають з застосуванням підходящого комп'ютерного алгоритму, як відомо в даній області техніки.
Ї0073| Приклади послідовностей варіабельних ділянок важкого ланцюга і легкого ланцюга наведені в даному описі.
Ї0074| Антитіла за даним винаходом або конкретні їхні варіанти, можуть включати будь-яку кількість залишків замінних амінокислот від антитіла за даним винаходом, де кількість вибрана із групи цілих чисел, що складається з 10-100 95 від кількості замінних залишків в анти- ТМЕ антитілі. Необов'язково, дана підпослідовність замінних амінокислот складає, щонайменше, приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 або більше амінокислот у ланцюзі або будь-який діапазон або їх значення. Крім того, кількість таких підпослідовностей може бути будь-яким цілим числом, вибраним із групи, що складається з від 1 до 20, таким як, щонайменше, 2, 3, 4, або 5.
Ї0075| Як буде зрозуміло фахівцям, даний винахід включає, щонайменше, одне біологічно активне антитіло за даним винаходом. Біологічно активне антитіло має специфічну активність, щонайменше, 20 95, 30 95, або 40 95, і переважно, щонайменше, 50 95, 60 95, або 70 95, і найбільше переважно, щонайменше, 80 95, 90 95, або 95 995-100 95 від нативного (не синтетичного), ендогенного або спорідненого і відомого антитіла. Способи дослідження і кількісних вимірювань ферментативної активності і субстратної специфічності добре відомі фахівцям у даній області техніки.
Ї0076| Значна подібність відноситься до сполуки, що має, щонайменше, 85 95 (наприклад, щонайменше, 95 95) ідентичності і) щонайменше, 85 95 (наприклад, щонайменше, 95 9б) активності від нативного (не синтетичного), ендогенного або спорідненого і відомого антитіла.
Ї0077| У контексті даного опису, термін "людське антитіло" відноситься до антитіла, в якому по суті кожна частина білка (наприклад, СОК, каркас, СІ, СН домени (наприклад, СНІ, СНІ,
СНЗ), шарнір, (МІ, МН)) практично не імуногенні для людини, лише з незначними змінами або варіаціями послідовності. Аналогічним чином, позначаються антитіла приматів (мавпа, бабуїн, шимпанзе і таке інше), гризунів (миші, пацюка і таке інше) і інших ссавців позначають такий вид, підклас, клас, підродину, сімейство специфічних антитіл. Крім того, химерні антитіла можуть включати будь-яку комбінацію перерахованих вище. Такі зміни або варіанти необов'язкові і переважно зберігають або зменшують імуногенність у людей або інших видів у порівнянні з не модифікованими антитілами. Таким чином, людське антитіло відрізняється від химерного або гуманізованого антитіла. Це вказує на те, що людське антитіло може бути отримане за допомогою нелюдиноподібної тварини або прокаріотичної або еукаріотичної клітини, яка здатна експресувати функціонально реаранжовані гени імуноглобуліну людини (наприклад, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг). Крім того, коли людське антитіло являє собою одноланцюгове антитіло, воно може містити лінкерний пептид, який відсутній у нативних людських антитілах.
Наприклад, Ем може містити лінкерний пептид, такий як від двох до приблизно восьми гліцину або інших амінокислотних залишків, який з'єднує варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга. Такі лінкерні пептиди вважаються людського походження.
ІЇ0078| Біспецифічні, гетероспецифічні, гетерокон'югатні або схожі антитіла можуть також 60 застосовуватися, які являють собою моноклональні, переважно людські або гуманізовані,
антитіла, які мають зв'язуючу специфічність у відношенні, щонайменше, двох різних антигенів. У розглянутому випадку, одна зі специфічності зв'язування для, щонайменше, одного МІ5ТА білка, а інша буде для будь-якого іншого антигену. Способи одержання біспецифічних антитіл відомі з рівня техніки. Рекомбінанте одержання біспецифічних антитіл може бути засновано на спільній експресії двох пар важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобуліну, де два важкі ланцюги мають різну специфічність (Міїсїеіп апа СцепПо, Маїиге 305:537 (1983)). Див. також МО 93/08829, патенти США МОз5. 6,210,668, 6,193,967, 6,132,992, 6,106,833, 6,060,285, 6,037,453, 6,010,902, 5,989,530, 5,959,084, 5,959,083, 5,932,448, 5,833,985, 5,821,333, 5,807,706, 5,643,759, 5,601,819, 5,582,996, 5,496,549, 4,676,980, МО 91/00360, МО 92/00373, ЕР 03089, ТгайпескКег єї анІ., ЕМВО
У. 10:3655 (1991), Бигезп еї аіІ., Мешоавз іп Епгуптоїіоду 121:210 (1986), кожна з яких включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному об'ємі.
Ї0079| В одному варіанті здійснення даного винаходу, винахід відноситься до біспецифічних антитіл, що націлені на МІ5ТА і іншого білка-мішені (наприклад, білок імунних контрольних точок). Приблизні біспецифічні антитіла включають біспецифічне антитіло, націлене на МІЗТА і РО-1 1 і біспецифічне антитіло, націлене на МІЗТА і РО-1 2.
Ї0О80| Людські антитіла, які специфічні для людських білків МІЗТА або їх фрагментів, можуть бути індуковані проти відповідного імуногенного антигену, такого як білок МІЗТА або його ділянки (включаючи синтетичні молекули, такі як синтетичні пептиди).
ІЇ0081| Інші специфічні або загальні антитіла ссавців можуть бути індуковані аналогічним способом. Підготовка імуногенних антигенів і одержання моноклональних антитіл можуть здійснюватися з застосуванням будь-якого підходящого способу.
І0082| Наприклад, гібридому одержують шляхом злиття підходящої іморталізованої лінії клітин (наприклад, лінія мієломних клітин таких як, але не обмежуючись ними, 5рг2/0, Зр2/0-
АсІ14, МБО, М51, М52, АБ-1, І.5, 5243, РЗХбЗА98.653, 5р2 ЗАЗ, 5р2 МАЇ, 5р2 551, 5р2 АБ, 0937, МГ А 144, АСТ ІМ, МОЇ Т4, ВА-1, "ОВКАТ, МЕНІ, К-562, СО5, ВАШІ, МІН ЗТ, НІ-60, МІ А 144, МАМАЇМУА, МЕШКО 2А, або тому подібне, або гетеромієломою, їх продукти злиття, або будь-які клітини або злиття клітин, отримане з них, або будь-яка інша придатна клітинна лінія, відома з рівня техніки, Див., наприклад, м/м/м/.агсс.ого, мій апіроду-ргодисіпо сеїІв.
Антитілопродукуючі клітини можуть включати виділення або клонування селезінки,
Зо периферичної крові, лімфи, мигдалини або інші імунні клітини (наприклад, В клітини), або будь- які інші клітини, що експресують послідовності константної або варіабельної або каркасної або гіперваріабельної ділянки (СОК) важкого або легкого ланцюга. Такі антитілопродукуючі клітини можуть бути рекомбінантними або ендогенними клітинами і можуть також бути прокаріотичними або еукаріотичними (наприклад, ссавців, таких як, гризуни, коні, вівці, кози, барани, примати).
Див., наприклад, А!зибеї, зирга, апа Соїїїдап, Іттипоїіоду, зирга, спаріег 2, повністю включене в даний опис за допомогою посилання.
І0083| Антитілапродукуючі клітини також можуть бути отримані з периферичної крові або переважно із селезінки або лімфатичних вузлів, людини або інших підходящих тварин, які були імунізовані антигеном, який цікавить. Будь-яка інша підходяща клітина-хазяїн може також застосовуватися для експресії гетерологічної або ендогенної нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, специфічний фрагмент або його варіанти, за даним винаходом. Клітини, що злилися (гібридоми) або рекомбінантні клітини можуть бути виділені з застосуванням селективних умов культивування або іншими підходящими відомими способами, і клоновані шляхом граничного розведення або клітинного сортингу або інших відомих способів. Клітини, які виробляють антитіла з бажаною специфічністю, можуть бути вибрані за допомогою підходящого аналізу (наприклад, твердофазного імуноферментного аналізу (твердофазного ІФА)).
Ї0084| Можуть застосовуватися інші підходящі способи одержання або виділення антитіл з необхідною специфічністю, що включають, але не ообмежувані ними, способи, які застосовуються для вибору рекомбінантного антитіла з бібліотеки пептидів або білків
БО (наприклад, але не обмежуючись ними, бактеріофаг, рибосома, олігонуклеотид, РНК, кДНК, або тому подібне, бібліотека дисплея; наприклад, як доступні з Сатбгідде апіїбоду Тесппоїодіев5,
Сатбгіддевпіге, ОК; Могрпобуз, Мапіпзгеід/Ріапеда, ОЕ; Віомайоп, АБрегдеєп, 5сойМПапа, ОК;
Віоіїпмепі, Гипа, Змедеп; Ббуах Согр., Еп2оп, АйПутах/Віозйе; Хота, ВегкеїІеу, Саїйї.; Іх5уб5. Див., наприклад, РСТ/ЗВ91/01134; РСТ/5892/01755; РСТ/5892/002240; РСТ/5892/00883;
РСТ/2893/00605; РСТ/2894/01422; РСТ/24894/02662; РСТ/24897/01835; МО 90/14443; МО 90/144247 МО 90/14430; РСТ/0594/1234; МО 92/18619; МО 96/07754; ЕР 614 989; МО 95/16027;
УМО 88/06630; УМО 90/3809; патент США Мо. 4,704,692; РСТ/О591/02989; МО 89/06283; ЕР 371 998; ЕР 550 400; ЕР 229 046; РСТ/О591/07149; або випадково отримані пептиди або білки - патенти США Мов. 5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,8627/МО 86/05803, 60 ЕР 590 689, кожний з яких повністю включений у даний опис за допомогою посилання, або які залежать від імунізації трансгенних тварин (наприклад, 5СІЮО миші, Мдиуеп еї аї., Місгобіої.
Іттипої. 41:901-907 (1997); Запанпи еї аї., Стї. Вем. Віоїеснпої. 16:95-118 (1996); Егеп еї аї.,
Ітітипої. 93:154-161 (1998), кожний з яких повністю включений у даній опис за допомогою посилання, а також відсильні патенти і заявки), які здатні робити набір людських антитіл, як відомо з даної області техніки і/або як описано в даному описі. Такі методи включають, але не обмежуються ними, рибосомний дисплей (Напез еї аї!., Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА, 94:4937-4942 (Мау 1997); Напез еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 95:14130-14135 (Мометрбег 1998)); методи одержання антитіл з одиничної клітини (патент США Мо. 5,627,052, Меп еї аї., 9. Іттипої. 17:887-892 (1987); Варсоок еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 93:7843-7848 (1996)); мікропланшети з гелем їі проточна цитометрія (Ромеї! еї аї., Віоїесппої. 8:333-337 (1990); Опе Сеї!Ї Зузіветв,
Сатьгідде, Мазв.; Стгау еї аї., У. Ітт. Меїй. 182:155-163 (1995); Кеппу евї а!., Віо/Тесппої!. 13:787- 790 (1995)); відбір В-клітин (Зіеепраккегз еї а!., Моїес. Вісі. Верогів 19:125-134 (1994); допак єї аІ., Ргодге55 Віоїесп, Мої. 5, п Міо Іттипігайоп іп Нубгідота Тесппоіоду, ВогебаескК, ед.,
ЕІземівї Зсіепсе РибіїзНег5 В.М., Ат5івгадат, МеїПпепапаз (1988)).
Ї0085| Способи інженерії або гуманізації нелюдських або людських антитіл можуть також застосовуватися, і відомі з рівня техніки. Як правило, гуманізоване або сконструйоване антитіло має одну або декілька амінокислотних залишків від джерела, яке не є людським, наприклад, але не обмежуючись ними, миші, пацюка, кролика, нижчого примата або інших ссавців. Ці людські амінокислотні залишки часто називають "імпортовані" залишки, які як правило беруть від "Імпортованого" варіабельного, константного або іншого домену відомої людської послідовності.
Відомі послідовності людського Ід розкриті, наприклад, улмум/.побрі.піт.піп.дом/епіге7/диегу.сді; милим. аїсс.ого/рпаде/пар.піті, кожна включена в даний винахід за допомогою посилання в повному об'ємі. 0086) Такі імпортовані послідовності можуть застосовуватися для зниження імуногенності або зниження, підсилення або зміни зв'язування, афінності, авидності, специфічності, періоду напіврозпаду або іншої відповідної характеристики, відомої з даної області техніки. Як правило, частина або всі нелюдські або людські послідовності СОК зберігаються, при цьому частина або всі каркасні і/або константні ділянки нелюдських послідовностей замінені людськими або іншими амінокислотами. Антитіла можуть також при бажанні бути гуманізовані зі збереженням високої
Зо афінності для антигену і інших сприятливих біологічних властивостей, з застосуванням тривимірних моделей імуноглобуліну, які відомі фахівцям у даній області техніки. Існують комп'ютерні програми, які ілюструють і показують можливі тривимірні конформаційні структури вибраних варіантів послідовностей імуноглобуліну. Вивчення цих відображень дозволяє аналізувати ймовірні ролі залишків у функціонуванні потенційної послідовності імуноглобуліну, тобто, аналіз залишків, які впливають на здатність потенційного імуноглобуліну зв'язуватися з антигеном. Таким чином, каркасні (ЕК) залишки можуть бути вибрані і об'єднані з консенсусних або імпортованих послідовностей, щоб досягалися бажані характеристики антитіла, такі як підвищена афінність до антигену-мішені. Загалом, залишки СОК безпосередньо і найбільш суттєво беруть участь у впливі на зв'язування антигену. Гуманізація або інженерія антитіл за даним винаходом може бути виконана з застосуванням будь-якого відомого способу, такого як, але не обмежуючись ними, описаний в, наприклад, Уміпієг (допез еї аї., Маїшге 321:522 (1986);
Віеєсптапт еї а!., Маште 332:323 (1988); Метовєуеп вї а!., Зсієпсе 239:1534 (1988)), 5ітзв еї аї., у.
Ітітипої. 151: 2296 (1993); Споїпіа апа І! ев5К, у. Мої. Віої. 196:901 (1987), Сапег єї аї., Ргос. Май).
Асай. сі. О.5.А. 89:4285 (1992); Ргезіа еї аї., 9. Іттипої. 151:2623 (1993), патентах США МОз5. 5,723,323, 5,976862, 5,824514, 5,817483, 5,814476, 5,763,192, 5,723,323, 5,766,886, 5,714,352, 6б,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, кожна включена в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі, включаючи посилання, зазначені в них.
Ї0087| Анти-МІЗТА антитіло може також бути, при бажанні, отримане шляхом імунізації трансгенної тварини (наприклад, миші, пацюка, кролика, хом'яка, нижчого примата і тому подібного), здатного виробляти сукупність людських антитіл, як описано в даній заявці і/або відомо з даного рівня техніки. Клітини, які виробляють людське анти-міІЗзтТА антитіло, можуть бути виділені з таких тварин і іморталізовані з застосуванням підходящих способів, таких як способи, описані в даному описі. 0088) Трансгенні тварини, які виробляють сукупність людських антитіл, які зв'язуються з людськими антигенами, можуть бути отримані відомими способами (наприклад, але не обмежуючись ними, патенти США Мо5. 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 і 5,789,650, виданих ГІ опрего еї а1ї.; хакороміїв5 еї ам. М/О 98/50433, Чдакоромії5 еї ам. МО 98/24893, І опрего єї аІ. МО 98/24884, І опрего єї а. МО 97/13852, І опрегу єї а. МО 94/25585, Киспепараїеє єї а!. МО 96/34096, Киспепарагїе еїгаї. ЕР 0463 151 ВІ, Киспепараїеє ес! аї. 60 ЕР 0710 719 АТ, Бигапі єї аім. ШО.5. Раї. Мо. 5,545,807, Віодетапп еї ам. УМО 90/04036,
Вгиддетапп єї аї. ЕР 0438 474 ВІ, І опрего еї а. ЕР 0814 259 Аг, І опрегоу вї аї. СВ 2 272 440 А,
Ї опбего еї аї. Маїшге 368:856-859 (1994), Тауїог єї аї., Ійї. Іттипої. 6(4)579-591 (1994), Стееп єї аї, Майте Сепеїїсв5 7:13-21 (1994), Мепаеє? евї аї!., Маїште Сепеїййсв 15:146-156 (1997), Тауог еї аї.,
Мисівєїс Асіаз Везеагсй 20(23):6287-6295 (1992), Тоайоп еї а!., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 90(8)3720- 3724 (1993), І опрега еї аї., Іпї Нем Іттипої! 13(1):65-93 (1995) і Різпулаід еї аї., Маї Віотесппої 14(7):845-851 (1996), кожний з яких включений в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі). Як правило, ці миші включають, щонайменше, один трансген, що включає ДНК від, щонайменше, одного локусу людського імуноглобуліну, який є функціонально перебудованим, або який може зазнати функціонального перебудування. Ендогенні локуси імуноглобуліну в такій миші можуть бути порушені або вилучені, щоб усунути здатність тварини виробляти антитіла, що кодуються ендогенними генами.
Ї0О89| Скринінг антитіл на специфічне зв'язування з подібними білками або фрагментами може бути легко досягнутий з застосуванням відображення пептидних бібліотек. Даний спосіб включає скринінг більших колекцій пептидів для окремих членів, що мають бажану функцію або структуру. Скринінг антитіл відображених пептидних бібліотек дисплеїв відомі з даного рівня техніки. Послідовності відображених пептидів можуть бути від З до 5000 або більше амінокислот у довжину, нерідко від 5-100 амінокислот у довжину, а часто від приблизно 8 до 25 амінокислот у довжину. У доповненні до прямих хімічних синтетичних способів для одержання пептидних бібліотек, деякі способи з рекомбінантною ДНК були описані. Один тип включає відображену пептидну послідовності на поверхні бактеріофага або клітині. Кожний бактеріофаг або клітина містить нуклеотидну послідовність, що кодують певні відображувані пептидні послідовності. Такі способи описані в публікаціях патентів РСТ Мо5. 91/17271, 9118980, 91/19818, і 93/08278. Інші системи для одержання пептидних бібліотек мають аспекти як хімічного синтезу іп міїго, так і рекомбінантних способів. Див., публікації патентів РСТ Мо5. 92/05258, 92/14843, і 96/19256.
Див., також патенти США Мов. 5,658,754; і 5,643,768. Відображення пептидних бібліотек, вектор, і набори для скринінгу є комерційно доступними від таких постачальників як Іпмігодеп (Сагівбай,
Саїї), і Сатьгідде апіїбоду Тесппоіодіе5 (Сатргіддезпіге, ОК). Див., наприклад, патенти США
Мо5. 4,704,692, 4,939,666, 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 5,518,889, 5,534,621, 5,656,730, 5,763,733, 5,767,260, 5,856,456; 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,837,500, переуступлений
Оуах, 5,427,908, 5,580,717; 5,885,793, переуступлений Сатрбгідде апібоду Тесппоїіодіев; 5,750,373, переуступлений Сепепіесії, 5,618,920, 5,595,898, 5,576,195, 5,698,435, 5,693,493, і 5,698,417.
ЇО0О90О| Антитіла за даним винаходом можуть бути також отримані із застосуванням, щонайменше, одного анти-МІЗТА антитіла, що кодує нуклеїнову кислоту для одержання трансгенних тварин, таких як кози, корови, барани і таке інше, які виробляють такі антитіла в їх молоці. Такі тварини можуть бути отримані з застосуванням відомих способів. Див., наприклад, не обмежуючись ними, патенти США Мо5. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, і подібні, кожний з яких включений в даний опис за допомогою посилання.
Ї0091| Анти-мІЗТА антитіла за даним винаходом можуть бути отримані з застосуванням трансгенних рослин згідно з відомими способами. Див., також, наприклад, Рібспег еї аї.,
Віотесппої. Аррі. Віоспет. 30:99-108 (Осіобег, 1999), Статег еї аї., Сшит. Тор. Місгоброї. Іттипої. 240:95-118 (1999) і наведені в них посилання; Ма еї а!., Тгепаз Віоїтесппої. 13:522-7 (1995); Ма єї а!І., Ріапі Рпувзіої. 109:341-6 (1995); МУнієЇїат єї аї., Віоспет. бос. Тгтапев. 22:940-944 (1994); і наведені в них посилання. Кожне з вищенаведених посилань включені в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі.
І0092| Антитіла за даним винаходом можуть зв'язуватися з людськими МІЗТА з різної афінністю (КО). У переважному варіанті здійснення даного винаходу, щонайменше, одне моноклональне антитіло за даним винаходом може додатково зв'язуватися з людським МІ5ТА з високою афінністю. Наприклад, людське моноклональне антитіло може зв'язуватися з людським
БО МІ5ТА з Ко що дорівнює або менше ніж приблизно 107 М, таким як, але не обмежуючись, 0,1-9,9 (або будь-який діапазон або значення в них) х 107, 108, 109, 1079, 1071, 1072, 1073 або будь-який діапазон або значення в них. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, антитіло або фрагмент антитіла може зв'язуватися з людським МІЗТА з афінністю, щонайменше, 1х10-7 л/моль, наприклад, щонайменше, 1х103 л/моль, наприклад, щонайменше, 1х1079 л/моль.
Ї0093| Афінність або авидність антитіла для антигену може бути визначена експериментально з застосуванням будь-якого підходящого способу. (Див., наприклад,
Веггої5Ку, єї аї., "Апібоду-Апіїдеп Іпіегасіп5," п Рипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ. Е., Еа.,
Вамеп Ргезв: Мем/ Моїк, М.У. (1984); Кибу, дапів Іттипоіоду, М.Н. Егеетап апа Сотрапу: Мем
Уогк, М.У. (1992); і способи, описані в даному винаході). Вимірювана афінність конкретної бо взаємодії антитіло-антигсен може варіювати, якщо вимірювали при різних умовах (наприклад,
концентрація солі, рН). Таким чином, вимірювання афінності і інших антигензв'язуючих параметрів (наприклад, Ко, Ка, Ка) переважно здійснюються зі стандартними розчинами антитіла і антигену і стандартизованим буфером. (0094 МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВОЇ КИСЛОТИ
ЇО095| При використанні інформації, що приводиться в даному описі, такі нуклеотидні послідовності, що кодують, щонайменше, 700-100 95 замінних амінокислот, щонайменше, одного із зазначених фрагментів, варіантів або їх консенсусних послідовностей або внесеного вектора, що містить, щонайменше, одну із цих послідовностей, молекулу нуклеотидної кислоти за даним винаходом, що кодує щонайменше, одне анти-МІЗТА антитіло, що включає всі варіабельні ділянки важкого ланцюга СОМ ЗЕО ІЮ МО5:1, 2 і З і/або всі варіабельні ділянки легкого ланцюга
СОМ ЗЕО ІЮ МО5:4, 5 і 6 можуть бути отримані з застосуванням способів, описаних у даному винаході або відомих з даного рівня техніки.
ЇО096| Молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть бути у формі РНК, такі як
МРАК, гяЯРНК, тРНК або лююбая інша форма, або у формі ДНК, включаючи, але не обмежуючись ними, кКДНК і геномна ДНК, отримані шляхом клонування або виготовлені синтетично, або будь-які їх комбінації. ДНК може бути трьохспіральною, двоспіральною або односпіральною або будь-яка їх комбінація. Будь-яка частина, щонайменше, одна нитка ДНК або РНК може бути кодуючим ланцюгом, також відомим як нетранскрибована нитка, або вона може бути некодуючим ланцюгом, також називаним анти-змістовним ланцюгом.
Ї0097| Виділені молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть містити в собі молекули нуклеїнової кислоти, що містять відкриту рамку зчитування (ОКЕ), наприклад, але не обмежуючись ними, щонайменше, одну зазначену частину, щонайменше, одного СОК, як СОКІ,
СОК2 і/або СОКЗ, щонайменше, одного важкого ланцюга або легкого ланцюга; молекули нуклеїнової кислоти, що містить кодуючу послідовність для анти-мі5ТА антитіла або фрагмента, наприклад, фрагмент, що містить варіабельну ділянку; і молекули нуклеїнової кислоти, які включають нуклеотидну послідовність відмінну від описаних вище, але яка у зв'язку з виродженістю генетичного коду ще кодує, щонайменше, одне анти-міІ5ТА антитіло, як описано в даному описі і/або відомо з рівня техніки. Для фахівців у даній області техніки є звичайним одержання таких варіантів виродженої нуклеїнової кислоти, які кодують специфічні анти-МІЗТА антитіла за даним винаходом. Див., наприклад, А!йзирбеї, еї а!., вище, і такі варіанти нуклеїнових кислот включені в даний винахід.
ЇО098| Як зазначено в даному описі, молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом, яка включає нуклеїнову кислоту, що кодує анти-МІЗТА антитіло, може включати, але не обмежуватися ними кодуючу амінокислотну послідовність фрагмента антитіла; кодуючу послідовність цілого антитіла або його частини; кодуючу послідовність антитіла, фрагмента або частини, а також додаткові послідовності, такі як послідовності, що кодують, щонайменше, одного лідерного сигналу або пептиду злиття, що містить або ні вищевказані додаткові кодуючі послідовності, такі як, щонайменше, один інтрон, разом з додатковими, некодуючими послідовностями, включаючи, але не обмежуючись ними, 5' і 3' некодуючі послідовності, такі як транскрибовані, нетранскрибовані послідовності, які відіграють роль в транскрипції, процесінгі
МРАК, включаючи сплайсинг і сигнали поліаденювання (наприклад-зв'язування рибосом і стабільність МРНК); додаткова кодуюча послідовність, яка кодує додаткові амінокислоти, такі, котрі забезпечують додаткові можливості. Таким чином, послідовність, що кодує антитіло, може бути злита з маркерною послідовністю, такою як послідовність, що кодує пептид, який полегшує очищення злитих антитіл, що містить фрагмент антитіла або частину.
Ї0О099| Люодські гени, які кодують константні (С) ділянки антитіл, фрагментів або ділянок за даним винаходом, можуть бути отримані з бібліотеки ембріональної печінки людини за допомогою відомих способів. Ділянки С людських генів можуть бути отримані з будь-яких людських клітин, включаючи ті, які експресують або виробляють людські імуноглобуліни.
БО Людська Сн ділянка може бути отримана з будь-якого відомого класу або ізотипу людських Н ланцюгів, включаючи у, |, с, 6 або є і їх підтипів, таких як С1, 52, 3 і 54. оскільки Н ланцюг ізотипу відповідає за різні ефекторні функції антитіла, вибір Сн ділянки буде визначатися бажаними ефекторними функціями, такими як фіксація комплементу або активність в антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (АЮОСС). (00100) КОМПОЗИЦІЇ
Ї00101| Фармацевтичні композиції що розкриті в даному винаході, одержують у відповідності зі стандартними методиками і вводяться в дозах, які вибрані для лікування, наприклад, зниження, запобігання або усунення, або вповільнення або зупинки прогресування, стану, що зазнає лікування (Див., наприклад, Кетіпдіоп'є РПагтасешіса! Зсіеєпсе5, Маск 60 Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавзіоп, РА, і бСоодтап апа Сйтапе Те РВагтасешііса! Вабіб5 ої
ТНнегарешісв, МеСтам/-пії, Мем Мо, М.М., вміст яких включено в даний опис за допомогою посилання, для загального опису способів введення різних речовин для терапії людини).
Композиції, що містять описані в даному винаході антитіла і речовини можуть бути доставлені з застосуванням контрольованих або вповільненого вивільнення систем доставки (наприклад, капсули, біорозкладані матрикси). Приклади систем доставки з уповільненим вивільненням для доставки лікарських засобів, які підходять для введення композицій заявлених сполук описані, наприклад, в патентах США Моз. 05 5,990,092; 5,039,660; 4,452,775; і 3,854,480, повний вміст яких включено в даний винахід за допомогою посилання.
І00102| Для приготування фармацевтичних композицій з анти-МІЗТА антитіл і/або фрагментів за даним винаходом, фармацевтично прийнятні носії можуть бути твердими або рідкими. Препарати у твердій формі містять у собі порошки, таблетки, пігулки, капсули, облатки, супозиторії і дисперговані гранули. Наприклад, сполуки за даним винаходом можуть бути у формі порошку для відновлення в момент доставки. Твердий носій може являти собою одну або декілька речовин, які можуть також впливати як розчинники, ароматизатори, солюбілізатори, змащувальні речовини, суспендуючі речовини, зв'язувальні речовини, консерванти, речовини для поліпшення розпадаваності таблеток, або інкапсулюючий матеріал. У порошках носій являє собою дрібнодисперсну тверду речовину, яка в суміші з дрібнодисперсною активною речовиною.
ЇО010О3| Порошки і таблетки переважно містять від приблизно одного до приблизно сімдесяти відсотків активної речовини. Підходящі носії являють собою карбонат магнію, стеарат магнію, тальк, цукор, лактоза, пектин, декстрин, крохмаль, желатин, трагакант, метилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза натрію, легко-плавкий віск, масло какао і таке інше. Таблетки, порошоки, облатки, пастилки, швидко-плавкі смужки, капсули і пілюлі можуть застосовуватися в якості твердих лікарських форм, що містять активну речовину, придатну для перорального введення. 00104) Препарати в рідкій лікарській формі включають розчини, суспензії, що втримують клізми і емульсії, наприклад, водні або водно-пропіленгліколеві розчини. Для парентерального введення рідкі препарати можуть бути отримані у вигляді розчину у водному пропіленгліколевому розчині.
Зо 00105) Фармацевтична композиція може бути в одиничній лікарській формі. У такій формі композиція підрозділяється на одиничні дози, що містять відповідні кількості активної речовини.
Одинична лікарська форма може бути впакованим препаратом, пакування містить дискретні кількості одиничних доз. Дозування можуть змінюватися залежно від потреб пацієнта, тяжкості стану, що зазнає лікування, сполуки і застосовуваного шляху введення. Визначення правильної дози для конкретної ситуації відомо фахівцеві в даній області техніки. 00106) Також, фармацевтична композиція може містити при бажанні інші сумісні речовини, наприклад, фармацевтичні, терапевтичні або профілактичні речовини. Терапевтичні або профілактичні речовини містять у собі, але не обмежуються ними, пептиди, поліпептиди, білки, білки злиття, молекули нуклеїнових кислот, малі молекули, речовини міметики, синтетичні лікарські засоби, молекули неорганічної сполуки і молекули органічної сполуки. Приклади класів таких речовин (наприклад, протипухлинні речовини) включають, але не обмежуються ними, цитотоксини, інгібітори ангіогенезу, імуномодулюючі речовини, імуноонкологічні речовини і речовини, застосовувані для допомоги від болю або для відшкодування шкідливого впливу однієї або декількох терапевтичних речовин (наприклад, бісфосфонат застосовують для зниження ефектів гіперкальцимії глюкокортикоїдів). 00107) Інгібітори ангіогенезу, речовини і терапії, які придатні для застосування в композиціях і способах, описаних у даному описі, включають, але не обмежуються ними, ангіостатин (фрагмент плазміногену); антиангіогенний антитромбін І; ангіозим. Бісфосфонат включає, але не обмежується ними, алендронат, клодронат, етидронат, ібандронат, памідронат, ризедронат, тилудронат і золедронат. 00108) Імуномодулюючі речовини і терапії, які придатні для застосування в композиціях і способах, описаних у даному описі, включають, але не обмежуються ними, анти-Т клітинного рецептора антитіла, такі як анти-СОЗ антитіла (наприклад Нувіон (Ргоївіп Оезідп І арх), ОКТЗ (Чоппзоп 4 допп5оп), або анти-СО20 антитіла Ритуксан (ІСЕС)), анти-СО52 антитіла (наприклад
Кампат 1Н (ІПех)), анти-СО11а антитіла (наприклад Ксанелім (Сепепіесі)); анти-цитокін або анти-цитокін рецептора антитіла і антагоністи, такі як анти-ІЇ-2 рецептора антитіла (Зенапакс (Ргоївіп Оеєзідп Гарз)), анти-ІЇ-6 рецептора антитіла (наприклад МКА (Спидаї)), ії анти-І!-12 антитіла (СМТО1275(дапозеп)), анти-ТМЕальфа антитіла (Ремікейд (Чап5зеп)) або антагоніст
ТМЕ рецептора (Енбрел (Іттипех)), анти-ІІ -6 антитіла (ВЕ8 (Оіасіопе) і силтуксимаб (СМТО32
(Сепіосог)), і антитіла, які імуноспецифічно зв'язуються з пухлинноасоційнованими антигенами (наприклад, трастузимаб (Сепепіесі)). 00109) Імуноонкологічні речовини, які придатні для застосування в композиціях і способах, описаних у даному винаході, включають, але не обмежуються ними, іпілімумаб (анти-СТІ А-4), ниволумаб (анти-РО-1), пембролізумаб (анти-РО-1), анти-РО-11 антитіла і анти-І АС-3 антитіла.
Ї0О0110| Композиція переважно виконана у формі одиниці дозування, що містить терапевтично ефективну кількість антитіла або фрагмента. Прикладами одиниць дозування є таблетки і капсули. Для терапевтичних цілей таблетки і капсули можуть містити на додаток до активної речовини звичайні носії, такі як зв'язувальні речовини, наприклад, аравійська камедь, желатин, полівінілпіролідон, сорбіт або трагакант; наповнювачі, наприклад, фосфат кальцію, гліцин, лактоза, кукурудзяний крохмаль, сорбіт або сахароза; змащувальні речовини, наприклад, стеарат магнію, поліетиленгліколь, двоокис кремнію або тальк; розпушувачі, наприклад, картопляний крохмаль, ароматизатор або барвники, або прийнятні змочувальні речовини. Рідкі препарати для перорального введення як правило у формі водних або масляних розчинів, суспензій, емульсій, сиропів або еліксирів можуть містити звичайні добавки, такі як суспендуючі речовини, емульгуючі речовини, безводні речовини, консерванти, барвники і ароматизуючі речовини. Приклади добавок для рідких препаратів містять у собі аравійську камедь, мигдальне масло, етиловий спирт, фракціоноване кокосове масло, желатин, сироп глюкози, гліцерин, гідрогенизовані харчові жири, лецитін, метилцелюлозу, метил або пропіл пара-гідроксибензоат, пропіленгліколь, сорбіт або сорбінова кислота.
Ї0О0111)| Інші загальні подробиці щодо способів одержання і застосування сполук і композицій, описаних у даному винаході, добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, патент
США Мо. 7,820,169, вміст якого включений в повному об'ємі.
І00112| СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ 00113) Будь-який фахівець в даній області техніки, наприклад, клініцист, може визначити підходящу дозу і шлях введення для конкретного антитіла, фрагмента або композиції для введення індивідууму, враховуючи вибрані речовини, лікарську форму і шлях введення, різні особливості пацієнта і інші фактори. Переважно, доза не викликає або приносить мінімальні або не шкідливі побічні дії. При стандартних багаторазових режимах приймання препарату,
Зо фармацевтична речовина може бути введена за схемою застосування, яке призначено для підтримки заздалегідь визначеної або оптимальної концентрації плазми в суб'єкта, що зазнає лікування. Антитіла, фрагменти і композиції можуть бути додані в будь-якому підходящому діапазоні доз або терапевтично ефективній кількості, наприклад, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1,0 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 7,0 мг/кг, 8,0 мг/кг, 9,0 мг/кг, 10,0 мг/кг, 11,0 мг/кг, 12,0 мг/кг, 13,0 мг/кг, 14,0 мг/кг, 15,0 мг/кг, 16,0 мг/кг, 17,0 мг/кг, 18,0 мг/кг, 19,0 мг/кг, 20,0 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг, 70 мг/кг, 80 мг/кг, 90 мг/кг і 100 мг/кг. В одному варіанті здійснення даного винаходу, доза композиції антитіла або фрагмента, що вводиться, складає 0.1-15 мг/кг на кожне введення. 00114) Антитіло або фрагмент може бути введене один раз, щонайменше, один раз, два рази, щонайменше, два рази, три рази, або, щонайменше, три рази на день. Антитіло або фрагмент може бути введене один раз, щонайменше, один раз, два рази, щонайменше, два рази, три рази, щонайменше, три рази, чотири рази, щонайменше, чотири рази, п'ять раз, щонайменше, п'ять раз, шість раз на тиждень або, щонайменше, шість раз на тиждень. Антитіло або фрагмент може бути введене один раз на місяць, щонайменше, один раз на місяць, два рази на місяць, щонайменше, два рази на місяць, три рази на місяць або, щонайменше, три рази на місяць. Антитіло або фрагмент антитіла може бути введене один раз на рік, щонайменше, один раз на рік, два рази на рік, щонайменше, два рази на рік, три рази на рік, щонайменше, три рази на рік, чотири рази на рік, щонайменше, чотири рази на рік, п'ять раз на рік, щонайменше, п'ять раз на рік, шість раз на рік або, щонайменше, шість раз на рік. 00115) Анти-МІЗТА антитіла, фрагменти або композиції можуть, наприклад, бути введені через парентеральний або непарентеральний способи, включаючи, але не обмежуючись ними, внутрішньовенно, підшкірно, перорально, ректально, внутрішньом'язово, внутрішньочеревинно, кріз слизову, внутрішньошкірно, субарахноїдально, назально або зовнішньо. Середньому фахівцеві в даній області техніки буде очевидно, що наступні лікарські форми можуть містити в якості активної речовини або сполуку або відповідну фармацевтично прийнятну сіль сполуки за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, лікарські форми можуть містити в якості активної речовини або сполуку або відповідну фармацевтично прийнятну сіль сполуки.
00116) Анти-МІЗТА антитіла за даним винаходом можуть бути введені як частина комбінованої терапії (наприклад, одна з одною або однією або декількома іншими терапевтичними речовинами). Сполуки за даним винаходом можуть бути введені до, після або одночасно з однією або декількома іншими терапевтичними речовинами. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, сполука за даним винаходом або інша фармацевтична речовина може бути спільно введена одночасно (наприклад, паралельно) або у вигляді окремих препаратів або у вигляді спільних препаратів. В іншому варіанті, речовини можуть бути введені послідовно, у вигляді роздільних композицій, у відповідні періоди часу, як визначено кваліфікованим клініцистом (наприклад, час, достатній для забезпечення збігу фармацевтичних ефектів терапій). Сполука за даним винаходом і одна або декілька терапевтичних речовин можуть бути введені в однократній дозі або в багаторазових дозах, у послідовності і за режимом, що підходять для досягнення бажаного терапевтичного ефекту.
Ї0О0117| Даний винахід також відноситься до способу модуляції або лікування, щонайменше, одного злоякісного захворювання в клітині, тканині, органа, тварини або пацієнта. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, сполуки і композиції за даним винаходом застосовуються для лікування або запобігання раку. Рак може містити в собі будь-яку злоякісну або доброякісну пухлину будь-якого органу або системи організму. Приклади містять в собі, але не обмежуються ними, наступні: рак молочної залози, рак травного тракту/шлунково-кишкового тракту, ендокринний рак, нейроендокринний рак, рак ока, рак сечостатевої системи, рак статевих клітин, гінекологічний рак, рак голови і шиї, рак гематологічний/крові, скелетно- м'язовий рак, неврологічний рак, рак дихальних шляхів/грудного відділу, рак сечового міхура, рак товстої кишки, рак прямої кишки, рак легенів, рак тіла матки, рак нирки, рак підшлункової залози, рак печінки, рак шлунка, рак яєчка, рак стравоходу, рак передміхурової залози, рак мозку, рак шийки матки, рак яєчників і рак щитовидної залози. Інші види раку можуть містити в собі лейкоз, меланому і лімфому, а також будь-який вид раку, описаний в даному винаході. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, щільна пухлина інфільтрована з мієлоїдними іабо Т-клітинами. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою лейкоз, лімфому, мієлодиспластичний синдром і/або мієлому. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак може бути лейкозом будь-якого виду або типу, включаючи в себе лімфоцитарний лейкоз або мієлогенний лейкоз, такий як, наприклад, гострий лімфобластний лейкоз (АГ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ/Ї), гострий мієлоїдний (мієлогенний) лейкоз (АМІ), хронічний гранулоцитний лейкоз (СМІ), лейкоз ворсистих клітин, Т-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, лейкоз із великих зернистих лімфоцитів або Т-клітинний лейкоз дорослих. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, лімфома являє собою гістоцитарну лімфому, фолікулярну лімфому або лімфому Ходжкіна, а в інших варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою множинну мієлому. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, рак являє собою щільну пухлину, наприклад, меланому або рак сечового міхура. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, рак являє собою рак легенів, такий як недрібноклітинна карцинома легенів (МЗС С). 00118) Даний винахід також відноситься до способу модуляції або лікування, щонайменше, одного злоякісного захворювання в клітині, тканині, органі, тварині або пацієнтові, включаючи, але не обмежуючись ними, щонайменше, одне 3: лейкоз, гострий лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз (АГ), В-клітинний, Т-клітинний або ЕАВ АЇЇ, гострий мієлобластний лейкоз (АМІ), хронічний мієлоцитарний лейкоз (СМІ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ І), лейкоз ворсистих клітин, мієлодиспластичний синдром (МО5), лімфома, ходжкінська лімфома, злоякісна лімфома, неходжкінська лімфома, лімфосаркома Беркитта, множинна мієлома, саркома Капоши, карцинома товстої і прямої кишки, карцинома підшлункової залози, носоглоткова карцинома, злоякісний гістіоцитоз, паранеопластичний синдром/злоякісна гіперкальціємія, щільні пухлини, аденокарциноми, саркоми, злоякісна меланома, гемангіома, метастазуюча пухлина, рак, пов'язаний з резорбцією кістки, рак, пов'язаний з болем у кістках і таке інше. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, щільна пухлина інфільтрована з мієлоїдними і/або Т-клітинами. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, щільна пухлина являє собою рак легенів, такий як недрібноклітинна карцинома легенів (МЗС С).
ЇО0О119) У деяких варіантах здійснення даного винаходу, сполуки і терапії, описані в даному описі, спільно вводять із вакциною (такою як вакцина на основі вірусного вектора, бактеріальна вакцина, вакцина на основі клітин, ДНК вакцина, РНК вакцина, пептидна вакцина або білкова вакцина). Такі вакцини добре відомі в даній області техніки. Див., наприклад, Чейгтеу 5СпІот, "Тнегарешііс Сапсег Массіпев: Ситепі айв апа Моміпд Еогмага," у Маї! Сапсег Іп5і; 104:599-613 (2012), вміст якої включено в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі.
00120) У деяких варіантах здійснення даного винаходу, сполуки і терапії, описані в даному описі, спільно вводять із речовинами для хіміотерапії, гормонотерапії і біологічних терапій, і/або бісфосфонатами. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, речовини для хіміотерапії включають одне або декілька з наступних: арбоплатин (Параплатин), цисплатин (Платинол,
Платинол-АС)), циклофосфамід (Цитоксан, Неосар), доксорубіцин (Адриаміцин), етопозид (Вепезид), флуороурацил (5-ЕІ), гемцитабін (Гемзар), іринотекан (Камптосар), паклітаксел (Таксол), топотекан (Гікамтин), вінкристин (Онковін, Винкасар РЕ), вінбластин (Велбан). 00121) В інших варіантах здійснення даного винаходу, анти-мі5ТА сполуки і терапії, описані в даному описі, спільно вводять із одним або декількома антитілами імунних контрольних точок, таких як, наприклад, ниволумаб, пембролізумаб, тремелімумаб, іпілімумаб, анти-РО-Ї 1 антитіло, анти-РО-І2 антитіло, анти-ТІМ-3 антитіло, анти-І АС-Зм, анти-ОХ40 антитіло і анти-
СІТК антитіло. 00122) В іншому варіанті здійснення даного винаходу, анти-мі5ТА сполуки і терапії, описані в даному описі, спільно вводять із низькомолекулярним інгібітором індоламін 2, З-діоксигеназою (ІРО). 00123) Анти-МІЗТА сполуки і композиції за даним винаходом можуть бути введені суб'єктові, що має таку потребу, для запобігання (включаючи запобігання рецидиву раку) або лікування (наприклад, стримувати розвиток або поліпшення раку або одного або декількох його симптомів) раку. Будь-яка речовина або терапія (наприклад, хіміотерапія, променева терапія, цільові терапії, такі як іматиніб, сорафеніб і вемурабеніб, гормонотерапія і/або біологічна терапія або імунотерапія), які свідомо корисні або які застосовувалися або застосовуються в даний час для запобігання, лікування, стримування розвитку або поліпшення раку або одного або декількох його симптомів можуть застосовуватися в комбінації зі сполукою або композицією за винаходом, описаних у даному описі. Протиракові речовини, але не обмежуючись ними: 5- фторурацил; активіцин; альдеслейкін; алтретамін; аміноглутетімід; амсакрин; анастрозол; антраміцин; аспарагіназа; азацитидин; азетепа; азотоміцин; батимастат; бікалутамід; блеоміцину сульфат; бреквинарат натрію; бропіримін; бусульфан; карбоплатин; кармустин; карубіцину гідрохлорид; карзелесін; цедефінгол; хлорамбуцил; циролеміцин; цисплатин; кладрибін; мезилат криснатолу; циклофосфамід; цитарабін; дакарбазин; дактиноміцин; дауноміцину гідрохлорид; децитабін; дексормаплатин; дезагуанін; мезилат дезагуаніну; діазквон; доцетаксел; доксорубіцин; доксорубіцину гідрохлорид; дролоксифен; цитрат дролоксифену; пропіонат дромостанолону; дуазоміцин; едатрексат; ефлорнітину гідрохлорид; енлоплатин; енпромат; епіпропідин; епірубіцину гідрохлорид; ербулозол; езорубіцину гідрохлорид; естрамустин; фосфат екстрамустину натрію; етанідазол; етопозид; фосфат етопозиду; фазарабін; фенретинід; флоксуридин; фосфат флударабіну; флуороурацил; флуороцитабін; фосквідон; фостріецин натрію; гемцитабін; гідрохлорид гемцитабіну; гідроксисечовина; ідарубіцину гідрохлорид; іфосфамід; ільмофосін; інтерлейкін Ії (включаючи рекомбінантний інтерлейкін ІІ, або пгі/2), інтерферон альфа-2а; інтерферон альфа-2б; інтерферон альфа-т; інтерферон альфа-п3; інтерферон бета-І а; інтерферон гама-! б; іпроплатин; іринотекану гідрохлорид; ацетатланреотиду; летрозол; лейпроліду ацетат; ларозолу гідрохлорид; лометрексолу натрієва сіль; ломустин; лозоксантрону гідрохлорид; масопрокол; меклоретаміну гідрохлорид; мегестрол ацетат; меленгестролацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрію; метоприн; метуредепу; мітоміцин; мітоспер; мітотан; мітоксантрону гідрохлорид; мікофенолова кислота; нокодазол; ормаплатин; паклітаксел; пегаспаргаза; порфроміцин; преднімустин; прокарбазину гідрохлорид; пуроміцин; роглетімід; сафингола гідрохлорид; семустин; симтразен; спарфосат натрію; спарзоміцин; спіромустин; спіроплатин; стрептонігрин; стрептозоцин; сулофенур; талізоміцин; тегафур; телоксантрону гідрохлорид; темопорфін; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тіаміприн; тіогуанін; тіотепа; тіазофурин; тирапазамін; топотекан; триметрексат; триметрексату глюкуронат; трипторелін; урамустин; уредепа; вапреотид; вертепорфін; вінбластину сульфат; вінкристину сульфат; віндесин; віндесину сульфат; вінепідину сульфат; вінгліцинату сульфат; вінлеурозину сульфат; винорелбіну тартрат; винрозидіну сульфат; винзолідину сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубіцину гідрохлорид. Цільові терапії включають, але не обмежуються ними, інгібітори тирозинкінази (наприклад, іматиніб, сорафеніб і вемурафеніб).
Даний винахід також включає введення анти-МмІЗТА сполуки за винаходом в комбінації із променевою терапією, що включає застосування рентгенівського випромінювання, гама- випромінювання і інші джерела випромінювання для руйнування ракових клітин. Лікування раку відомі в даній області техніки і описані в такій літературі, як Рпузісіап'є Ое5К Кетегепсе (571П еай., 2003).
00124) Анти-МІ5ТА антитіла, описані в даному винаході, також корисні, наприклад, при лікуванні хронічних інфекційних захворювань, таких як ВІЛ, ВНВ, ВГС, і ВПГ, серед інших. 00125) Різні властивості і інформація про послідовність для вибраних анти-МІЗТА антитіл за даним винаходом представлені в Таблицях 14А, 18 і 2 даного опису. 00126) Таблиця 1А: Послідовності СОК вибраних повністю людських або гуманізованих анти-людських МІ5ТА антитіл
УН Важкий Важкий в - Легкий Легкий Легкий пд ажкий ланцюг ланцюг тАбБІО | сімей- | ланцюг ланцюг ланцюг ланцюг сагз (тої) саг2 ство |сан (тою | сагг (Ітдю) сан (Ітодю Ітої сагз (Ітодю
СМТЕТММУ ПМРУТОЕ ЕБМОТМАМ5 ВА ОСООТМЕОРА
УувтТВ5О (Є) Р АВЕСМОММІЕРУ |. (ЗЕ01О т (ЗЕОІЮ | (5ЕОІО |(5ЕО ІЮ МОЗ) (ЗЕО Ір МОБ) (ЗЕО Ір
МО МО 2 МО 4 І МО:6 сутетНу ПРО5СУ5 | АВСАУООУУОУУ су унвМмам КМ5 00 ЇЕОАБНУРМ
У5ТВ5З3 (ЗО О (ЗЕОІЮ |АМОУ (ЗЕОО (ЗЕОІЮ | (ЗЕ І
МО-7 МО:8) (ЗЕО ІЮ МОС9) МО-10 МО: 11) МО 12)
СМТЕТМУ ІМТУТСЕВ ЕБМОММАМО ВА ОСООБНЕОРУ увтвво б (бЕО1о | ЛАОУУСІУУВАХ ГЕ (ЗЕО1О |. (ЗЕО Ір МО-14) (ЗЕОІО МО5) |(ЗЕО Ір МО 17) (ЗЕО Ір
МО: 13 І МО:16 І МО:18 агтеНМу пвссвут |АВІХОНОСОУТА (СОУНМОМІКув 0 ТОСВЗНУРМ
УеТеВ (ЗБО пого) (во юю мо:г21) | (ЗБОТО пов) (ЗБО о
МО:19 І " МО 22 " МО: 24 мвтВ ДОТЕВБу ПРІЄЄТА І(АВ55УСМ/5УЕРО ОІОТВ 05А5 0 ОО5АУМРІТ 2 (ЗЕОО (ЗЕСО!ІЮ |х (ЗЕО Ір (ЗЕО ІЮ | (ЗЕО Ір
МО 25 МО 26) (ЗЕОІЮ МОС27) |МО:28) МО:29) |МО:30) увтвиї МОЯТЕВБУ ПРІЄЄТА( АВОБ5УСМУЗУЕРО ОВІМТМ ААВО 0 ООАВОТРІТ їх (ЗЕОО ЗЕО І У (ЗЕО Ір (ЗЕО ІЮ | (ЗЕО Ір
МОЗ МО:З2) (ЗЕОІО МОС33) |МО:34) МО:35) |МО:З36)
І00127| Таблиця 18: Послідовності важкого і легкого ланцюга вибраних повністю людських або гуманізованих анти-людських МІ5ТА антитіл
Важкий-ланцюг АА СО5 Легкий-ланцюг АА СО5
ОМОЇ МОБО5ЕЇ ККРОАБУКУЗСКАБОМТЕТММУСІ М
МУВОАРООСЇ ЕМ МОУ МР УТаЕРТМАОСЕКИАВЕ
МЕВІ ОТ5УЗТАХІ ОІС5І КАЕОТАМУУСАВЕСУОМУ С УМТОТРІЗІСВМ ТРООРАВІВ
СВАБЕБМОТМАМ5І МНУУМІ ОК
ІЕРУМУСОСТІ МТГМ55АВБТКОаРБЗМЕРІ АРОБКОТ5И
РООРРОГІИ ІМААБМІ ЕБСМРОВ
СТААІ аСІ МКОМЕРЕРУТУБМУМЗОАЇ Т5аМНТЕРА
ЕБаБаватОЕТІКкІЗВМЕАЕОМ
МІГ О5БОЇ МІ 55УМ ТУРБО СТО МІСМММНКРБОМ
СУУУСООТМЕОРАТЕСОСТКІ.
ТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕГІЇ СОИРОМЕЇ ЕЕ
У5ТВ5О ЕІКАТМААРБМРІЕРРБОЕОЇІ К5
РРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ У
СТАБУМСІ І ММЕМРАЕАКМОМУ
МрРаТмЕМНМАКТКРАЕЄєОСУМОТУВУММІ ТМ НОЮ
КМОМАГОБамМмеОєВМТЕОО5К
МІ МаКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСООРНАЕРО
О5ТУБІ 55ТІ ТІ БКАОМЕКНКМ
МУТГ РРЗІНОЕЇТКМОМ5І ТС УКаЕМРБООІЇІАМЕМЕ5 ХУАСЕМУТНОСІ РУТКУЕМВС
МОаОРЕММУКТТРРМІ ОБООБЕРІ МК ТМОКВАМ ЕС (5ЕО ІЮ МО48)
ОООСММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ 5І 5РОК (5ЕО І
ІО МО:47
ОМОГ МОБОАЕУККРИОИАБУКУЗСКАБСИМУТЕТНУТІН | ОІММТО5РІ 5І РМТРОЕРАБІВ
МУВОАРИОССЇ ЕМ МОМИПРОБОМЗЕММОКЕКОВМТ | САББОТІМНОМОаМТ М ЕММІ О
УувтТВ5З МТАОТ5ТОТУУМЕЇ 551 АБЕОТАУМУСАВСОАМООМІ КРИОБРОЇ ПИКМ5МАЕБаМРО
УВУМАМОММУСОСТІ МТМ55АЗБТКОаРБМЕРІ АРБ5 | ВЕЗИа5БИа5ОаИтТОвЕтТІ КІЗАМЕАЕО
Ко5ТЗаатТААГасСІ МКЩОМЕРЕРУТУБУМУМ5ОАТВИаИм| МОМУУСЕОАЗ5НУРМТЕСОСТ
НТЕРАМІ О55(21І 51 55ММ ГМРБББІ ОТО ГМІСММУМ | КГ ЕІКАТМААРЗМЕІЕРРБОБОЇ.
НКРУМТКУОККУЕРКЗСОКТНТОРРОРАРЕГ ССРТКЗСТАЗМУСТ ММЕУРВЕАКУ
ЗМР ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОМУЗНЕОРЕМК. ОМ/КУОМА! О5СМЗОЄБУТЕО
ЕММ/УУОСУЕУНМАКТКРАЕЕОУМУТУВУУ МІ ТМ О5КОТУВІ 5УТІ ТІ ЗКАОУЕК
НООМ/ІМСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРВ | НКУУАСЕМТНОСІ 55РУТКОЕ
ЕРОМУТІ РРУВОЕІ ТКМОУЗІ ТСІ УКСОЕУРОЗОІАМЕ | МВОЕС (5ЕО 10 МО:5О)
М/ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О50С5ЕРІ УЗКІ ТУОК5
ВУУООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМНУТОКОІ ЗІ РОК
ЗЕО 10 МО49
ОМОГМОЗСЗЕЇ ККРОАБЗУКУЗСКАЗСХУТЕТМУСМ
ТМУВОАРСОСІ ЕМ/МСМІМТУТОЕВТУАООЕКОВ | ТОРІ бі ЗУТРООРАВІВ
РУЕВІОТВУБТАМІ ОІСВІКАЕОТАУУУСАВОУУСІ ООН МН
УУ5АУМ/СОСТІ УТМ55АЗТКОРОМЕРІ АРЗЗКОТВ
КРООЗРОУВАБМІ ЕЗСУРО
ССТААІ ССІ УКОУЕРЕРУТУУМ/МУСАЇ ТЗСУНТЕР
ВЕЗС5С5СТОЕТІКІЗВМЕАЕО
АМІ О55С1 У5І 55УУТУРУЗЗБІ СТОТМІСМУМНКРУ
УСУХУУСООЗНЕОРУТЕСОСТК
МТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕЇ І СОРБМНІ. утво І ЕІКВТУААРЗУЕІЕРРЗОЕОЇ К
ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕМКЕММУ
ЗСТАЗУУСИ ММЕУРВЕАКМО
УМОСУЕУНМАКТКРВЕЕОУМТУВУУ МІ ТМІ НОЮ
М/КУОМАЇ ОБСМ5ЗОЕУТЕОЮ
У/Л/МСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРО
ЗКОЄТУЗІ З5ТІ ТІ ЗКАОУЕКН
УУТІРРЕВОЕІ-ТКМОУВІ ТСІГУКОЕУРБОІАМЕМЕВІ ВКМ ВВ ТВО ЕМ
МООРЕММУКТТРРМІ ОЗРОВЕРІУВКІ ТУОКВАМ ер (БЕСИО МО)
ООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМІНУТОКВІ ЗІ. ЗРОК (ЗЕО
ІЮ МОБ
ЕМОГУЕЗСОСІ УОРОСЗІ ВІ ЗСААЗСЕТЕВМУСМ
ФМ/УВОАРОКСІ ЕМ/МАВІІЗСОБУТУУРОБУКСАЕТІ о/р І РУТРОЕРАЄІЄ
ІЗВОМАКМВІ У ОММ8І ВАЕОТАУУУСАВІУОНОС
СА55О5ІУНОМОМТХУ ЕМО
ОУУАМОУМ/СОСТТУТУЗ9АЗТКОРОМЕРІ АРЗЗК
КРООЗРОПУКУЗМВЕ5СУРО
ЗТ5ССТААІ СС УКОУЕРЕРУТУЄМ/МУСА! ТСУН
ВЕЗС5С5СТОЕТІКІЗВМЕАЕО
ТЕРАМІ О55СІ У5І 55УУ ТРУБІ СТОТМІСМУМН
УСУХУУСЕОСЗНУРМ/ТЕСОСТ
КРОМТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕГІ ССР утво КІ ЕІКВТУААРЗУРІЕРРУОЕОІ.
МЕГЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕМКЕ
КЗСТАЗУУСИ ММЕУРВЕАКУ
ММ/УУОСУЕУНМАКТКРАЕЄЄОУМОТУВУУ МІ ТМ.
ОМУКУОМА! О5СМ5ОЄБУТЕО
НООМ/ІМСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРА
О5КО5ТУІ 85ТІ ТІ ЗКАОУЕК
ЕРОМУТІ РРЕВОЕІ-ТКМОУВІ ТСІУКОРУРБОІАУЕ НОКИВ ОКО еОРМТКеК
МЕВМСОРЕММУКТТРРМІ. О80ОБЕРІУВКІТУОКВ, ЕС БО МОБ)
ВУУООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМЯНУТОКОІ ЗІРОК :
ЗЕО 10 МО5З
ОМОГМОЗСАЕМУККРОЗ5ЗУКУЗСКАЗССТЕВ5УА
УУУВОАРСОСІ ЕМ/МОСТІРІЕЄСТАМУАОКЕОСВУТІ
ТАОЕЗТУТАУМЕЇ 551 ВЗЕОТАМУУСАВУЗУСМУ ВУ | Р'ОМТОРЗБІ ЗАЗМООНМУТІТ
СВАЗОВІОТВІ ММУУООКРОКА
ЕЕОУМ/СОСТІ УТУЗ5А5ТКОРОУМЕРІ АРЗЗКОТеС
РКИПУЗА5І О5СУРЗВЕ5О5
СТАЛІ ССІГ УКОУЕРЕРУТУЗМ/МУСАЇ Т5СУНТЕРА
СЗСТОЕТІ ТІЗ8ІОРЕОЕАТУУ
МО5501 81 55УУТУРУЗЗБІ СТОТУІСМУМНКРОМ
СООЗАУМРІТЕСОСТКУЕІКВТ
ТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕН ССРЗУЕІ Е увтв112 МААРЗУРІЕРРЗОЕОЇ КЗСТАВ
РРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕМУКЕММІ У
УУСИ ММЕУРВЕАКУСМУКУОМ
МОСУЕУНМАКТКРАЕЄОУМУТУВУММІ ТМІ НОЮ
АІ О5СМЗОЕВЗУТЕООЗКОВТУ
ММСКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАЕРО |ЕГСБЕ ТЕ КАОУЕКНКУМАСЕ
УУТІРРЕВОЕІТКМОУБІ ТСІГУКОЕУРЗОТАМЕМЕВІ СТВО ОА ек
МООРЕММУКТТРРМІ ОЗРОВЕРІУВКІ ТУОКВАМ ЕС МОВ)
ООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМІНУТОКВІ ЗІ. ЗРОК (ЗЕО
ІЮ МО: 55
ОМОГМОЗСАЕМУККРОЗ5УКУЗСКАЗССТЕЗ5УАІВ І РІОМТОРУБІ ЗАЗУСОВУТІТ
УУУВОАРСОСІ ЕМ/МОСТІРІЕЄСТАМУАОКЕОСВУТІ | СВАЗОЗІМТМІ ММУУООКРОКА
ТАОЕЗТУТАУМЕЇ 551 ВЗЕОТАУУУСАВУЗУСМ/ЗУ| РКИУААЗУЇ О5СУРОЗВЕ5О5
ЕЕОУМ/СОСТІ УТУЗ5АЗТКОРОУМЕРІ АРЗЗКУТеСІ С5СТОЕТІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУ уєтвіз6 | ЗТААГОСІУКОУЕРЕРУТУЗМ МСА! ТЗСУНТЕРА | СООАВОТРІТЕСОСТКУЕІКАТ
МІО55С1 У8І 55УУТМУРУУВІ СТОТУІСМУМНКРОМ МААРЗУБІЕРРЗОЄОЇ КЗСТАВ
ТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЦ СОРОМ Е | УУСИ ММЕУРВЕАКУСМКУОМ
РРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕМКЕММУУ | А О5СМ5ОЕЗУТЕОО5КОВТУ
МОСУЕУНМАКТКРАЕЄОУМеТУВУМУЗМІ ТМІ НОЮ | ЗІ 55ТІ ТІ ЗКАОУЕКНКУХУАСЕ
У//ЧОКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРО | УТНОСІ 55РУТКЗЕМАСЕС
МУТГ РРЗАВОЕБЕЇ ТКМОМ5І ТОЇ УКаЕМРЗОІАМЕМ/Е5І (ЗЕО ІЮ МО:58)
МаоРЕММУКТТРРМІ ОБООБЗЕРІ МОКІ ТМОКАМУ
ОООСММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ 5І 5РОК (5ЕО
ІО МО:57
ОМОЇ МОБСОАЕУККРИаЗЗУКУВСКАБИаСаТЕ55МАЇ
М УВОАРООСІ ЕМ МаспРІБЕИТАММАОКЕОСАМТІ
ТАРЕБТОТАУМЕЇ 551 ВЗ5ЕОТАУУУСАВОЗУСМ ЗУ РОМ ТОБРЗВІЗАЗУСОНУ ТТ
СВАБОБІЮОТВІ МУМООКРОаКкКА
ЕРВУМ ОСТІ УТУ55АВТКОаРЗМУЕРІ АРСЗА5ОТЗЕ пи В І РК ПМБАББОІ ОБОУМРОНВЕБОа5
ЗТААІ ас МКкОМЕРЕРУТУБУМУМЗИаАЇТ5аМНтТЕРА тав лдоваоттуди тА Вт За: Ба ТОБТТІЗ5 ОРЕОБАТУУ м ОоББЗаім5і мм УРБЗОЗМЕатоУТсММоОнкКРБ дян доп АвоАолов лаву во У | СООБАММРІТРЕЧОСТКМУЄІКАТ ж МТКМОКТМЕВКССМЕСРРСОРАРРААДАБОМНЕІ ЕРРК
УБТВ140 плит ди тА АНА ВЙ І Ю АЮ А ВА А|МААРОЗМЕЇЕРРБЗОЕОЇ КБатА
РКОТІ МІЗАТРЕУТСУММОУМЗАЕОРЕМОЕММУ ММС А кл и щтдщи стик тя тА МЗАтВМ МВВ А| ММС ЕСММЕМРАЕАКМОМУ КМ ОМ
МЕМНМАКТКРАЕЄОЕЄМЗТЕНМММІ ТМ НОВУ МИ А еклнвноваАУ
АГОБаМ5ОЕЗМТЕООЗКОЗТУ
КЕУКСКУЗМКа! РОБІЕКТІЗКТКаОРВЕРОМУТІ Р ЗГ9З5ТІ ТІ ЗКАОУЕКНКУУАСЕ
РОНКНЕЕМТКМОМ5І ТС МКОЕМРЗОІАМЕЖМЕЗМИа ОР МІНОСІЗеРУТКУЕМВСЕС СС
ЕММУКТТРРМІО5БООЗЕР хЗКСТУоОКЗАМмОоССИМ (ВЕОІО МОБ) 00000000
МЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ ЗРК (5ЕО 10 І
МО:59
ОМОЇ МОБаАЕУККРИаЗЗУКУВСКАБИаСаТЕ55МАЇ
М УВОАРООСІ ЕМ МаспРІБЕИТАММАОКЕОСАМТІ
ТАРЕБТОТАУМЕЇ 551 ВЗ5ЕОТАУУУСАВОЗУСМ ЗУ РОМ ТОБРЗВІЗАЗУСОНУ ТТ
СВАБОБІЮОТВІ МУМООКРОаКкКА
ЕРВУМ ОСТІ УТУ55АВТКОаРЗМУЕРІ АРЗЗКЗТоа пики ди І РК ПМЗАББОІ ОБОУМРОНВЕБОа5
СТААГ аСІ МКОМЕРЕРУТУЗМУМЗИалйІ Т5аМУНтТЕРА сидимо ват дась тт Ак тва пато ТІЗ5 ОРЕОБАТУУ мГОоБзЗаі м5І 55ММТУРЗБІаИтОТМСсМУМнКРБОМ тд тт тт Зав ЗУ В | СООБАММРІТРЕЧОСТКМУЄІКАТ ж ТКУЮОККУЕРКЗСОКТНТСОСРРСОРАРРУДСОРОМЕЇ ЕР
УБТВ149А | тити АТ А НМВБ-ИВАИНВЗ У | МААРОМЕЕРРЗОЕОЇ КЗИатА
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОМЗНЕОРЕМКЕММУММ АНУ ки и щи тд
Ат ти В З ВАШ | ММС ЕСММЕМРАЕАКМОМ КМ ОМ
РаМЕМНМАКТКРАЕЕОХУМОТМАММОМІ МІ НОЮУМ І -В- «А Ж 5 : й АХ фОМ-5Ж 5-5 Ж А ША дод ди А А З ЗУ А ОБОаМЗОЕЗМТЕООБКОВТУ
ГМОКЕУКСКУЗМААЇ РАРІАКТІЗКАКІОРАЕРОМУ ЗІЗ5ТІ ТІ КАОУЕКНКУХУАСЕ
ТЕРРЗВЕЕМТКМОМУБЗІ ТС УКаЕУРБОІАУЕМЕЗМ МТНОСІЗеРУТКУЕМВСЕС
СОРЕММУКТТРРМ ОЗООЗЕРІ УЗКСТУОКЗАУУО (ЗЕОІО МО) 000000 МО:56)
ОСММЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ 5І РОК (5ЕО І
ІО МО:6О
ОМОЇ МОБСОАЕУККРИаЗЗУКУВСКАБИаСаТЕ55МАЇ
М УВОАРООСІ ЕМ МаспРІБЕИТАММАОКЕОИНВМТІ
ТАРЕБТОТАУМЕЇ 551 ВЗ5ЕОТАУУУСАВОЗУСМ ЗУ РОМ ТОБРЗВІЗАЗУСОНМУ ТТ
СВАБОБІЮОТВІ МУМООКРОаКкКА
ЕРВУМ ОСТІ УТУ55АВТКОаРЗМУЕРІ АРЗЗКЗТоа п ди І РК ПМБАББОІ ОБОУМРОНВЕБОа5
СТААГ аСІ МКОМЕРЕРУТУЗМУМЗИалйІ Т5аМУНтТЕРА сидимо ват дась тт Ак тва пато ТІЗ5 ОРЕОБАТУУ мГОоБзЗаі м5І 55ММТУРЗБІаИтОТМСсМУМнКРБОМ тд тт тт Зав Ав | СООБАММРІТРЕЧОСТКМУЄІКАТ ж ТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ І ааРОМЕЇ ЕЕ
УБТВ174 те НМА З 5 НБ-ВИВ-- | МААРОЕМЕІЕРРБОЕОЇ КОТА
РРКРКОТІМІЗАТРЕМТОМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУМ | кт и ди
АТ кидав В ЗБШЗВБАШ- | ММС ЕММЕМРАЕАКМОМУ КМ ОМ
МООМЕУМНМАКТКРВЕЕОУМеТУВМУВМІ МІ НОЮ 8ШЕЖ- З «5-5 5 А -5БА Б -ИМБ ААУ
Жили дод НУ А А ОБОаМЗОЕЗМТЕООБКОВТУ
УП МОСКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКЕОРВЕРО ЗІЗ5ТІ ТІ КАОУЕКНКУХУАСЕ
УХМТРРЗЬНЕЕМТКМОМБЗІ-ТСЇ УКОЕУРБОІАМЕМ/Е МТНОСІЗеРУТКУЕМВСЕС
ЗМЕаДаОРЕММУКТТРРМ ОБООЗЕРІ УЗКІСТУрКЗАМ (ЗЕОІО МО) 000000 ІЮ МО 56)
ОООСММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ 5І 5РИОК (5ЕО І
ІО МО:61 "Послідовності константної ділянки в М5ТВ140, М518149 і М5ТВ174 підкреслені.
ААмінокислотні залишки, що надають стійкість до протеази у важкому ланцюзі М5ТВ149 виділені жирним шрифтом.
00128) Таблиця 2: Константа дисоціації (Ко) для вибраних анти-МІЗТА антитіл вж звяманя 00000000 зво 0 озввюв ваівої. 526 зв'язування 3.53Е-09 2.38Е--05 8.А41Е-04 - (Ше | Же 1 530 зв'язування зв'язування іш 00310101 31 зв'язок зв'язок -е ія 32 зв'язок зв'язок
Продовження таблиці 2
ПРИКЛАДИ
ІО0О129| ПРИКЛАД 1: АНАЛІЗ ЕКСПРЕСІЇ МІЗТА НА ЛЮДСЬКИХ ГЕМОПОЕТИЧНИХ
КЛІТИНАХ
001301 Способи: 00131) Підготовка і забарвлення свіжих людських РВМС5 для експресії МІЗТА 00132) Експресія МІЗТА була вивчена на свіжовиділених людських РВМСО5 (мононуклеарах периферичної крові) від різних донорів. Анти-людські Мієта-біотин (ЗА-1) застосовували для забарвлення (5 мкг/мл). Мишачі Ідс1, К-біотин (Клон МОРС-21 при 5 мкг/мл) застосовували в якості контролю ізотипу.
І00133| Донорський матеріал 001341 Зразки крові були отримані від Віоіодіса! 5ресіану Согр. (СоїІтаг, РА) і були зібрані і проаналізовані в той же день. 10 мл цільної крові, що містить гепарину сульфат, були доставлені для аналізу. 00135) Приготування зразка
ІЇ00136| Кров розводили 1:11 в стерильному РВ5. 22 мл розведеної пуповинної крові нашаровували на 20 мл стерильні Рісоїї-Нурадие (ЖЕ Неаййсаге Саї й 17-144003) в 50 мл конічних пробірках. Пробірки центрифугували при 1800 об/хв протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Мононуклеари на границі поділу після центрифугування збирали з застосуванням 1 мл піпет-дозатора і поєднували у дві 50 мл конічні пробірки. Стерильний РВ5 додавали в кожну пробірку до досягнення об'єму 50 мл і клітини центрифугували при 3009 протягом 10 хвилин при 4 "С. Супернатант скидали. Клітини ресуспендували в 50 мл стерильного РВЗ:5 і пробірки центрифугували при 3009 протягом 10 хвилин при 4 "С. Супернатант скидали. Клітини поєднували і ресуспендували в 50 мл стерильного РВ5 до підрахунку.
Ї00137| Протокол забарвлення: Заморожену пробірку, що містить 5х107 РВМС»З5, застосовували для врівноваження контролів і в якості контролю для забарвлення.
ЇО0138) Були використані наступні реагенти і/або видаткові матеріали:
Ї00139| РАСЗ буфер для забарвлення (ВЗА) від ВО Віозсіепсе5 (Саї Ж 554657) був
Зо доповнений 0,2 95 ЕОТА; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5) (сібсо саї Ж 14190); 96- лунковий поліпропіленовий круглодонний планшет (ВО 23077); 1.2 мл поліпропіленові касетні пробірки (Согпіпд Ж 4451); біотинильований анти-МІЗТА клон (СЗА-1 від ІттипоМехі ої я 0806128 (застосовували в 5 мкг/мл); біотинильовані тідс1, контроль К ізотипу (Клон МОРС-21);
Віоїєдепа саї 2 400104, І ої Ж р116649 (застосовували в 5 мкг/мл); анти-людські антитіла (Див.,
З5 таблицю забарвлення нижче); барвник живих/мертвих у близькій інфрачервоній області (Іпийгодеп, саї Ж 110119); і реагенти стрептавідину, включаючи ЗТР-АРС (ВО Віозсіепсе5 саїж554067, І ої Ж 04251) (застосовували в 1:200 розведенні в РЕАС5 буфері), ЗТР-РЕ (Віоієдепа са 405203, І ої Ж 5139688) (застосовували при 1:200 розведенні в РЕАС5 буфері), ЗТР-РЕ Су7 (показав неспецифічне зв'язування в зразках контролю ізотипу), ЗТР-О605 (Іпийгодеп саї й
О1ТО101 МР, ої й 53449А) (застосовували при 1:200 розведенні в РАС5 буфері). 00140) Протокол забарвлення клітинної поверхні
Ї00141| Перед забарвленням, 1х105 клітин переносили в 96-ямкові круглодонні планшети і промивали з 150 мкл РВ5. Планшети потім центрифугували при 1300 об./хв. при 4 "С протягом
З хвилин. 00142) Далі клітини промивали знову в РВ5 і центрифугували, як описано вище. 00143) Забарвлення живих/мертвих потім здійснювали в 50 мкл РВ5, що містить 0,25 мкл барвника живих/мертвих у близькій інфрачервоній області. Через 10 хвилин при кімнатній температурі лунки промивали з 150 мкл буфера для забарвлення РАС»: і центрифугували при 1300 об./хв. при 4 "С протягом З хвилин. Супернатант скидали. 00144) Клітини блокували з людською сироваткою при 1:100 в 50 мкл буфера для забарвлення РАС5. Планшети інкубували при 4 "С протягом 15 хвилин. Лунки потім промивали 3 150 мкл буфера для забарвлення ЕАСз і центрифугували при 1300 об./хв. при 1 4 "С протягом
З хвилин. Супернатант скидали. 00145) Суміш, що містить наступні антитіла, потім додавали в кожну лунку для забарвлення поверхні: Суміші описані в Таблицях 3-6 нижче. Кожна суміш застосовувалася роздільно від інших залежно від досліджуваної популяції. 00146) Таблиця 3: Забарвлення клітинної лінії
Флюорохр Па- Поста- титр
Антиген | Миша Людина! Ізотип | Клон Са Мо. | І ої Мо. |(мкл/105 ом Ок чальник : клітин)
МІВ
АРС Су7 | Пме/Ова Х (в)
АРС/АЕб | МІБТА- Х 47 Віо тіда, .
РєРВ/У450 |СОЗ Хх Кк ОСНТІІВО Віо. |558117 | 90926 0.5 00147) Таблиця 4: Забарвлення Т клітин
Титр
Поста-
Флюс | днтиген Ми Паб| Лю ізотип о) Клон | чаль- |Саї Мо. | Гої Мо. (мкл орохром ша | цюк | дина НИК 10
Клітин)
М5ТА-ВО | Її 17хї 71171111
РЕ Су; /СОБ5Б ШІ КОТ, ві5о ББ7747 | 47968
АРССуЛлІМІЯ.Ї ЇЇ 1хї 11771711
АЕ700 |Сс0458О0 ШІ тідсіга, СНІ 1 | Віоієдепа | 304218 | 8143062
ДЕСІАтВ тсвВос ШІ тіда, Кк Віоїєдепа | 331212 | 8126473
РВ/У450 | СО45ВА ШІ К'9с2в, Гн 560363 90928 об55 |сС0о3 | | | Х |птіобга|541 пмігодеп (010012 | 982352 00148) Таблиця 5: ОС забарвлення
Титр
Флюорох- | дитиген | Миша | ПА: Ізотип | Клон | Поста- ісагмо.| ої Мо. (мкл/106 ром Ок чальник клітин) гітс/АРЯвВ іп! | 1771 хо міх міх воВіо. /|340546і2152758
АРССу7 Мія Її ЇЇ Їх ЇЇ ГГ г 1 17
АРС/АЕ6в47| СОВЗ ШИ тю, Нвтве| ВО Во. | 551073 57688 вуд21 со123 ШИ тю, Віоієдепа| 306017 в'явтея 05
МІБТА- оо во | 1 1х1 11111 00149) Таблиця 6: Мієлоїдне забарвлення
Флюорох- Па- Поста- титр
Антиген | Миша Людина) Ізотип | Клон Са Мо. | І ої Мо. | (мкл/105 ром Ок чальник клітин)
Рітс/АРа88ІСо33 | 171111 Х тост нм3-4 303304|8100963|. З
АРССу7 МА Її Їх ЇЇ її 11717 «они 11021211
Віо тіда, ! 0605 бор45 Хх Кк НІЗО |Іпмйгодеп | О10051| 880470 1 00150) Після забарвлення поверхні, клітини промивали двічі, як описано вище, з буфером для забарвлення ЕАС5 і центрифугували при 1300 об./хв. при 4 "С протягом 5 хвилин. Зразки ресуспендували в 50 мкл буфера для забарвлення БАС5, що містить відповідний флюоресцентно-мічений стрептавідин. Зразки інкубували при 4 "С протягом 30 хвилин. Клітини промивали з 150 мкл буфера для забарвлення ГАСЗ і центрифугували при 1300 об./хв. при 47 протягом 5 хвилин. Цю стадію промивання повторювали, до того зразки ресуспендували в 250 мкл буфера для забарвлення БАС5. Зразки аналізували на ВО І 5ЕРопевза"м клітинному аналізаторі (ВО Віозсіепсев) у той же день. 00151) Дані аналізу 00152) Дані проточної цитометрії повторно аналізували з застосуванням програмного забезпечення Ріомл)о Мегзіоп 9 для одержання конкретних фенотипових популяцій. Підрахунок середнього геометричного застосовували для порівняння експресії МІЗТА у різних клітинних субпопуляціях. Кожна популяція була нормалізована для тла за допомогою вирахування значень контролю ізотипу зі значень зразків, оброблюваних анти-мІЗТА. Графіки одержували в
Ргієт і статистичні дані одержували з застосуванням будь-якого значення Стьюдента, якщо порівнювались тільки два зразки, або однофакторного дисперсійного аналізу з повторною перевіркою Бонфероні. 00153) Результати: 00154) Експресія МІЗТА на людських мієлоїдних і лімфоїдних субпопуляціях:
Ї0О0155) Як показано на Фігурах 2А-2Е, ЗА-3С, 4, 5А-58 і бА-6С, експресія МІЗТА на СО14- моноцитах значно відрізнялася від усіх інших популяцій (р « 0.001). Ніяких істотних відмінностей між іншими популяціями не було. Моноцити експресували найвищі рівні МІЗТА у периферичній крові, з СО14-С016: субпопуляцією, що має значно високий рівень експресії, ніж СО149С0167
Зо клітини. Тоді як АРС5 показали помірну експресію МІЗТА, лімфоїдні субпопуляції показали низькі рівні експресії. 00156) Експресія МІЗТА на Т і МК субпопуляціях людини:
ЇО0157| Як показано на Фігурах 7А-7Е, 8А-80 і 9, з МК субпопуляціями, СО56о клітини показували суттєво більш високі рівні експресії МІЗТА, ніж СО56НІ МК клітини. Субпопуляції Т клітин, СО8» клітини пам'яті експресували більш високі рівні експресії, хоча вони не є значно вище, ніж в СЮО8" або СО4- інтактних Т клітинах. 00158) Експресія МІЗТА на субпопуляціях людських дендритних клітинах: 00159) Як показано на Фігурі Т0А-100, 11 А-116с і 12, немає істотних відмінностей в експресії
МІ5ТА; ОСз і базофіли показали низький рівень експресії МІЗТА, у плазмоцитоїдних дендритних клітинах (рос) як правило, вище, але не в значній мірі. 00160) Висновок: Дані результати показували експресію МІЗТА на різних субпопуляціях імунних клітин, і що МІЗТА експресується на моноцитах у більш високих рівнях, з деякою експресією на різних субпопуляціях Т клітин і МК клітин, і практично відсутня експресія на В клітинах. (00161| ПРИКЛАД 2: ЕКСПРЕСІЯ МІ5ТА НА КЛІТИНАХ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ
ІО0О162| Способи: 00163) Забарвлення цільної крові: Свіжовиділену цільну кров (100 мкл) забарвлювали сумішшю антитіл, як зазначено нижче, при інкубації протягом 30 хвилин при 4 "С. Еритроцити (КВС5) лізували з лізуючим буфером КВС, а клітини, що залишилися, промивали їх буфером для забарвлення. Клітини ресуспендували в 200 мкл буфера для забарвлення. Дані збирали з застосуванням проточного цитометра МАСБО мапі і аналізували з застосуванням програми аналізу Ріомлуо.
Ї00164| Забарвлення мононуклеарів периферичної крові (РВМС5)Й Мононуклеари периферичної крові виділяли із цільної крові з застосуванням градієнта Фіколла. Свіжовиділені 1х106 РВМСОС5 забарвлювали сумішшю антитіл в 100 мкл буфера для забарвлення. Зразки інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С, потім промивали один раз буфером для забарвлення.
Клітини ресуспендували в 100 мкл буфера для забарвлення. Дані збирали з застосуванням проточного цитометра МАСБОЧапкю (Мікепуї Віоїес) і аналізували із застосування програми аналізу Біомюо. 00165) Антитіла були використані СО11р6, СО33, СО177, 016, 2015, 2014, С020, НГ АОК,
СОо3, 004, С08, С0127, СОб69, і ЕОХРЗ антитіла (Віоієдепа, Зап Оівдо, СА). АРС-кон'юговані
Зо мишачі анти-людські МІЗТА (клон 08) були зроблені ІттиМехі (І ебапоп, МН). 00166) Висновки:
І00167| Експресія МІ5ТА на клітинах периферичної крові здорової людини 00168) Цільна кров і мононуклеари периферичної крові аналізували на експресію МІ5ТА з застосуванням багатокольорової проточної цитометрії. Як показано на Фігурах 15А і 158, найбільш високі рівні експресії МІЗТА були виявлені на моноцитах, потім на нейтрофілах. Як бра такі і СО8-- Т клітини експресували низький рівень МІ5ТА, як показано на Фігурах 13С і 130. 00169) Експресія МІ5ТА на клітинах периферичної крові пацієнтів, хворих раком
Ї00170| Як показано на Фігурах 14А-С, були проаналізовані мононуклеари периферичної крові (РВМС5) від пацієнтів з раком легенів. На Фігурі 14А представлений показовий пліт, що показує аналіз СЮО14» моноцитів і СО157 супресуючих клітин мієлоїдного походження (МОЗС5).
Результати показали, що фенотипово СО15" клітини являють собою МО5С5 нейтрофільного походження. Крім того, дані клітини відсутні в зразках крові здорової людини. На Фігурі 148 представлена показова гістограма експресії МІЗТА на похідних моноцитів здорових людини і пацієнтів, хворих раком, що вказує на більш високі рівні експресії МІЗТА на клітинах пацієнта, хворого раком, у порівнянні зі здоровими людьми. Аналогічно високі рівні МІЗТА були виявлені на МО5Сз пацієнтів, хворих раком, як показано на Фігурі 1460.
Ї00171| На Фігурі 15А представлений показовий пліт РЕАС5, що показує присутність МО5С5 нейтрофільного походження в крові пацієнтів, що хворіють раком товстої кишки. На Фігурах 158 і 15С представлені показові гістограми, що показують найбільш високі рівні експресії МІЗТА на моноцитах пацієнтів, хворих раком, у порівнянні зі зразками донорської крові здорових людей. 00172) Експресія МІ5ТА на клітинах периферичної крові яванської макаки 00173) Як показано на Фігурах 16А і 168, аналіз проточної цитометрії цільної крові макак показав профіль експресії гена МІЗТА схожий з людськими клітинами. Як моноцити, так і нейтрофіли експресували найбільш високі рівні МІЗТА у порівнянні з СО4- (Фігура 16С) і СО8- (Фігура 160) Т клітинами. (00174| ПРИКЛАД 3: ЕКСПРЕСІЯ МІБ5ТА В пете ЗЛОЯКІСНИХ КЛІТИННИХ ЛІНІЙ НА РІВНІ
РНКІ НА РІВНІ БІЛКА
00175) Оскільки МІЗТА експресується в пете злоякісних утворень, анти-мМІЗТА антитіла потенційно можуть націлюватися на злоякісні кліті для руйнування, а також блокування МІ5ТА і викликання протипухлинних імунних відповідей. 00176) Дані включають аналіз секвенування РНК (КМАзеа) «140 пете злоякісних клітинних ліній (деякі клітинні лінії повторюються в аналізі). Дані показані на Фігурі 17.
Ї00177| Значення КМАзед значаться як значення ЕРКМ (фрагментів на тисячу основ екзону на мільйон картованих Фрагментів). 00178) По суті, це означає, що, всі прочитання, що зустрічаються в екзонних ділянках гена, підраховувалися і нормалізувалися як по довжині гена, так і по загальній кількості прочитань на зразок (враховуючи відмінності між зразками). Граничне значення складає 1; вище 1 є позитивним для експресії МІ5ТА (на рівні РНК), нижче 1 є негативним для експресії МІЗТА.
Ї00179| Результати показали, що багато клітинних ліній є позитивними на рівні РНК, насамперед гострого мієлоїдного лейкозу і хронічного мієлогенного лейкозу. Це можна було очікувати, оскільки МІЗТА експресувався в найбільш високих рівнях у нормальних мієлоїдних клітинах, і оскільки його функцією є можливе ослаблення імунної відповіді, включаючи протипухлинні імунні відповіді.
І00180| ПРИКЛАД 4: ВИРОБЛЕННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ ПРОТИ МІ5ТА 00181) Пенінг фага
І00182| Двадцять чотири експерименти пенінга фага здійснювали для збагачення фага, реактивного до Мізіа-Ніх5 яванської макаки. Білок МІЗТА яванської макаки застосовували для даних експериментів, оскільки він показав кращу кон'югацію з біотином, ніж людські білки МІЗТА.
Для визначення успішності фагових експериментів, пул фагів від окремих етапів пенінга додавали в планшети з нейтравідином, покриті біотинильованими Міхїа-Ніх5 яванської макаки і визначали з НЕР-кон'югованим анти-М13 антитілом. Окремі колонії відбирали з етапів фагової селекції і білюи Габ5 одержували в 96-ямкових планшетах. Супернатанти експресованих ЕБаб аналізували на зв'язування з біотинильованими Міхїа-Ніх яванської макаки. Це призвело до більше ніж 200 влучень. 00183) МН ії Мі. ділянки від Бар пластин ампліфіковували, надані для секвенування ДНК і експортували як БАБТА файли. При виборі клонів, які повинні бути перетворені і досліджуватися як МАВ», клони відбирали на основі різноманітності послідовності, а також на основі посттрансляційних модифікацій, що мають обмежені ризики, і якнайменше гідрофобних залишків, як це можливо. 00184) МН і Мі від фагових клонів були субклоновані в експресійні вектори Ідс1/каппа ссавців і трансфіковані в клітини НЕК293. Антитіла очищували на афінній смолі на основі білка
А Зерпагозе Разі Ріо. Концентрацію МАВ» фага визначали шляхом кількісного твердофазного
ІФА з застосуванням вимірювань Мапоагор. Панель антитіл експресувалась на високих рівнях.
Аналіз ХО5-РАСЕ показав збереження кожного експресованого варіанта антитіла. 00185) Співпадаюче дозрівання антитіл фага було зроблено шляхом ампліфікації МН доменів із суміші поліклональних антитіл з останнього етапу пенінга для клонування у фагові вектори, які мали різноманітність в МІ. Це призвело до збагачення пулу, який був відібраним з додатковою різноманітністю в МІ... Фаги відбирали через 1-2 етапи строгого пенінга з імовірністю визначення дуже високої афінності зв'язування з МІЗТА ЕСО Ні білка. Твердофазний ІФА моноклональних Бар проводили для визначення досягнення дозрівання. Дані твердофазного
ІФА і експресії були нормалізовані до референсного клону прирівняного до 100 95 від первинного експерименту пенінга і афінність дозрілих клонів з найбільш високим сигналом зв'язування з антигеном МІ5ТА яванської макаки, ніж референсний клон була визначена. Даний процес виробляє декілька клонів, які показали до 200 95 зв'язування, коли скринінг при низькій концентрації антигену (1 НМ), клони з найбільшою афінністю секвенували і одержували як
МАВ». 00186) Одержання гібридоми
ІЇ00187| Одна група мишей ВАСВ/сАпМСгі одержала одне внутрішньочеревинне (ІР) введення 50 мкг Ни МІ5ТА-Ід рекомбінантного білка (5іпо), емульгованого в повному ад'юванті
Фрейнда наступні два тижні після одного ІР введення 50 мкг Ни МІЗТА-Ід рекомбінантного білка, емульгованого в неповному ад'юванті Фрейнда. Через два тижні миші одержували одне ІР введення 50 мкг МІЗТА-Ес рекомбінантного білка яванської макаки, емульгованого в неповному ад'юванті Фрейнда. Всі миші одержували останнє введення 25 мкг людського і 25 мкг яванської макаки МІ5ТА в РВЗ5 в основу хвоста, за п'ять днів до одержання селезінки для злиття. 00188) Інша група мишей ВАГ В/сАпМсті одержувала одне ІР введення 50 мкг людських (Ни)
МІ5БТА-НІ5 рекомбінантного білка, емульгованого в повному ад'юванті Фрейнда. Через два тижні 60 миші одержували одне ІР введення 50 мкг Ни МІЗТА-Нів рекомбінантного білка, емульгованого в неповному ад'юванті Фрейнда. Через два тижні миші одержували одне ІР введення 50 мкг
МІЗТА-Ніх рекомбінантного білка яванської макаки, емульгованого в неповному ад'юванті
Фрейнда. Через два тижні всі миші одержували останнє введення 25 мкг Ни МІ5ТА-НІів і 25 мкг
МІ5ТА-НІ: яванської макаки в РВЕ, за три дні до одержання селезінки для злиття.
Ї0О0189)| У день злиття мишей вбивали за допомогою асфіксії СО», селезінки видаляли і поміщали в 10 мл холодного фосфатно-сольового буферного розчину. Готували суспензію окремих клітин спленоцитів шляхом подрібнення селезінок через дрібне сито невеликою товкачкою і промивали РВ5 при кімнатній температурі. Клітини промивали один раз в РВ:5 і піддавали лізису РВС. Стисло, клітини ресуспендували в З мл лізуючого буфера ЕВС (бідта Ж
К7757) на кожну селезінку і поміщали на лід протягом 5 хвилин. Клітини знову промивали один раз в РВ5З при кімнатній температурі і мітили для магнітного сортування. Відповідно до інструкцій, клітини мітили з анти-мишачими Тпу1.2, анти-мишачими СО11Б і анти-мишачими ІМ магнітними мікроносіями (Мікепуії Віоїес Ж 130-049-101, 130-049-601 ї 130-047-301 відповідно), потім сортували з застосуванням Мо колонки з Міді МАС5. Фракції негативних клітин (фракції позитивних клітин скидали) були злиті з БО клітинами. Злиття здійснювали в співвідношенні 1:1 мієломні клітини миші до життєздатних клітин селезінки. Стисло, клітини селезінки і мієломні клітини змішували, осаджували і промивали один раз в 50 мл РВ5. Осад ресуспендували з 1 мл розчину пропіленгліколя (РЕС) (2 г РЕС молекулярною масою 4000, 2 мл ОМЕМ, 0.4 мл ОМ5О) на 10е8 спленоцитів при 37 "С протягом 30 секунд. Клітину/суміш для злиття потім занурювали в 37 "С водяну баню протягом приблизно 60 секунд із легким перемішуванням. Реакцію злиття зупиняли додаванням 37 "С ОМЕМ протягом 1 хвилини. Клітинам, що злилися, давали спокій протягом 5 хвилин при кімнатній температурі і потім центрифугували при 150 х д протягом 5 хвилин. Клітини потім ресуспендували в середовищі Е-НАТ (МеадійтЕ (еїетсеї! Тесппоїодієв саї й 03805), що містить НАТ (Зідта саї Ж пО262), і засіювали в 9б-лунковий плоскодонний полістирольний планшет для тканинних культур (Согпіпу Ж 3997). 00190) ІФА із захоплюванням застосовувався для скринінга гібридомних супернатантів на специфічні антитіла для МІЗТА яванської макаки. Стисло, планшети (Мипс-Махізогр 74 46612) покривали при 4 мкг/мл протягом, щонайменше, 60 хвилин з козячими анти-мишачими Ід (Ес) антитілами (даскзоп Ж 115-006-071) у буфері для сорбції (ТПегто 28382). Планшети блокували з
Зо 200 мкл/лунка 0,4 95 (м/у) бичачим сироватковим альбуміном (ВЗА) в РВЗ протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшети промивали один раз і додавали 50 мкл/лунку гібридомного супернатанта і інкубували при кімнатній температурі протягом, щонайменше, 30 хвилин.
Планшети промивали один раз і додавали 50 мкл/лунку 0.1 мкг/мл Мізіа-пиЇд яванської макаки і інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Планшети промивали один раз і додавали в планшети 1:40,000 стрептавідин НКР (ЧасКзоп 016-030-084) в 0.495 В5А/РВЗ5 і інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшети промивали З рази і потім проявляли з застосуванням 100 мкл/лунку ТМВ Тигро субстрату (ТПегто Зсіепійіс 34022) інкубуванням приблизно протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли з застосуванням 25 мкл/лунку 4М сірчаної кислоти і вимірювали оптичну щільність при 450 нм з застосуванням автоматизованої пластини спектрофотометра. П'ятнадцять первинних влучень відбирали для субклонування за допомогою граничного розведення і скринували в тому ж самому первинному форматі скринінга.
ЇО0191| Усі реактивні гібридомні клітинні лінії МІЗТА яванської макаки перехресно скринували з застосуванням людських МІЗТА-Ід для визначення перехресної специфічності.
Стисло, планшети (Мипо-Махізогр 2 446612) покривали при 4 мкг/мл з козячими анти-мишачими
Ес (ЧасКвоп й 115-006-071) в 0.1М натрієво-карбонатно-бікарбонатному буфері, рН 9.4 (Ріегсе 28382 ВирН'"М) О/М при 4 "С. Не промиваючи, лунки блокували з 200 мкл блокувального (0,4 95
В5А (5ідта) (м/м) в РВ5 (Іпмігодеп)) протягом усієї ночі при 4 "С. Після видаляли блокувальний розчин, нерозведені гібридомні супернатанти інкубували на покритих планшетах протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшети промивали один раз із РВ5Т (0,02 96 Тмеєп 20 (Зідта) (мл) в РВ5), і потім інкубували протягом 30 хвилин з Ни МІ5ТА-Ід, розведеними до 100 нг/мл у блоці. Планшети промивали один раз і зондували з козячими антилюдськими-Ес-НАР (Часквоп й 109-036-098), розведеними 1:10,000 у блоці протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшети знову промивали і потім проявляли з застосуванням 100 мкл/лунку ТМВ
Тигбо субстрату (Тепто 5сіепійіс 34022) інкубуванням приблизно 10 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли з застосуванням 25 мкл/лунку 4М сірчаної кислоти і вимірювали оптичну щільністю при 450 нм з застосуванням автоматизованої пластини спектрофотометра. 00192) Гібридоми, які показували реакцію як на людські МІЗТА, так і на МІЗТА яванської макаки, мали три клоновані послідовності М ділянки антитіла. Гібридомні клітини готували до бо реакцій зворотної транскриптази (КТ) з набором Іпмігодеп'є Зирегесгірі ПІ сеї Оігесїі СсОМА
Зузіет. Стисло, культуральне середовище скидали і планшет поміщали на лід і ресуспендували в 200 мкл холодного РВ5. Сорок мікролітрів переносили в МісгоАтр Тавзі 96- лунковий реакційний ПЦР планшет і планшет поміщали на холодну металеву пластинку-основу, запечатували полімерною плівкою і центрифугували при 700 об./хв. протягом З хвилин. РВ5 скидали і до кожної лунки додавали 10 мкл ресуспендуючого буфера і 1 мкл підсилювача лізису.
Планшети запечатували і інкубували при 75 "С протягом 10 хвилин і зберігали при -80 "С. 00193) Для реакції КТ кожна лунка містила 5 мкл води, 1.6 мкл 10Х ЮОМазе буфера, 1,2 мкл 50 мМ ЕОТА, 2 мкл Оїїдо(атТ)20 (50 мМ) і 1 мкл 10 мм суміші аОМТР. Планшет інкубували при 70 "б протягом 5 хвилин, з наступною інкубацією на льоді протягом 2 хвилин, потім додавали наступні реагенти в кожну лунку; б мкл 5Х КТ буфер, 1 мкл КМазеоЦШт м (40 од/мкл), 1 мкл зирегзогірі тм ЦІ КТ (200 од/мкл) і 1 мкл 0,1М ОТТ. Планшет запечатували і поміщали на попередньо нагрітий до 50 "С термоблок для реакцій і інкубували при 50 "С протягом 50 хвилин, з наступною інактивацією (5 хвилин інкубували при 85 "С). Реакцію охолоджували на льоді і одноланцюгову КкДНК зберігали при -80 "С до подальшого застосування. 00194) Для ампліфікації М ділянки, приготували 20 мкл реакційної суміші ПЦР. Кожна лунка містила 16.2 мкл води, 2,0 мкл Т10Х реакційного буфера ПЦР, 0,8 мкл Моа5Ох5 (50 мм), 0,4 мкл 10 мм амтТР, суміш 0,15 мкл 100 мкм прямих праймерів 0,05 мкл 100 мкм зворотних праймерів, 0,2 мкл Нієгї Тад фермент. кКДНК, отримана, як описано вище, переносили (2 мкл/лунку) до компонентів суміші ПЦР, планшет запечатували і проводили реакцію ампліфікації; для. УНН програма була (ії) 94 "С протягом 1 хвилини (ії) 94 "С протягом 15 секунд (іїї) 55 "С протягом 30 секунд (ім) 68 "С протягом 1 хвилини. Стадії (ії - ім) повторювали в цілому 35 циклів з наступною кінцевою елонгацією при 68 "С протягом З хвилин. Для МІ. програма була (ї) 94 "С протягом 1 хвилини (ії) 94 "С протягом 15 секунд (її) 55 "С протягом 30 секунд (ім) 65 "С протягом 30 секунд, (м) 68 "С протягом 1 хвилин. Стадії (ії - м) повторювали в цілому 35 циклів з наступною кінцевою елонгацією при 68 "С протягом З хвилин.
Ї00195| Прямі праймери були попередньо змішані і таку суміш застосовували в співвідношенні 3:11 до зворотних праймерів. Продукти ПЦР перевіряли на агарозному гелі.
Реакції підготовлювали для клонування інфузєїю шляхом додавання підсилювача (набір Іп-
Еизіоп НС Сіопіпуд Кії, сах Ж 639650, Сіопіесп). П'ять мікролітрів реакції ПЦР переносили на
Зо планшет ПЦР із наступним переносом 2 мкл підсилювача/лунка. Планшет запечатували і інкубували в термоблоці для реакцій (15 хвилин при 37 "С і 15 хвилин при 80 "С). Вектор доставки (мОК243 або мОкКЗ301) готували шляхом розщеплення Е5р3іІ; (1.5 мкг вектора був розщеплений в З мкл Тапдо буфера, 2 л Е5рЗі і води в 30 мкл реакції при 37 "С протягом 2 годин).
ЇО0196| Для клонування інфузією, 2 мкл продуктів ПЦР, оброблених підсилювачем, змішували з 100 нг розщепленого вектора Е5рЗі ії 2 мкл 5Х ферменту для інфузії (Сіопіесп).
Реакцію проводили у форматі 9б6-лункового ПЦР планшета. Планшет інкубували протягом 15 хвилин при 50 "С на приладі ПЦР і 5іеМйа компетентні клітини були трансформовані за допомогою теплового шоку протягом 40 секунд при 42 "С без струшування і наносили на планшети з агаром ЇВ з підібраним антибіотиком і інкубували протягом ночі при 37 "С.
Наступного дня колонії збирали в 9б-лунковий планшет із глибокими лунками, що містять середовище І В/карбеніцилін і вирощували протягом ночі при 37 "С. Заморожені продукти виготовляли з нічної культури, змішаної в рівних об'ємах з 30 95 маса/об'єм гліцерином. М ділянки секвенували з застосуванням праймера секвенування 5РЕ0052. Послідовності були проаналізовані, була вибрана одна позитивна лунка на мн і мі гібридоми, знову розташовували в нові планшети і вирощували протягом ночі в середовищі, збагаченому ампіциліном.
Клонування потім було мініпрепаратом ДНК (тіпіргер ОМА) для переносу в невеликій кількості в 9б-лунковий планшет.
Ї00197| Вибрані сорок вісім гібридомних послідовностей миші для обох важкого і легкого ланцюга були адаптовані людським каркасом з застосуванням внутрішнього програмного забезпечення. Один людський каркас відбирали для кожного мишачого мН або м. М ділянку
ОМА послідовностей одержували за допомогою зворотного переводу. Синтетичні ділянки ДНК, відповідні до амінокислотних послідовностей НЕА замовляли в ІпіедгаФей ОМА Тесппоїодіе5 (Согаміне, ІА). Клонування здійснювали в попередньо вирізані мОкК 149 і мОК157, людські ІДС і людські каппа, відповідно. Застосовували набори Оіадеп Епадо-їтєє Махі-ргер Кб для приготування ДНК. Культуру Ехрі293 (100 мл) застосовували для експресії такої панелі антитіл. (00198 ПРИКЛАД 5: ПРОТОКОЛ ДЛЯ АНАЛІЗУ ІМ МІТВО т КЛІТИННОЇ СУПРЕСІЇ
ЛЮДСЬКИХ МІ5ЗТА-ІС Т 00199) Мишачі клітини А20 були стабільно трансфіковані з або СЕР або людськими МІЗТА. бо Їх інкубували з пептидом овальбуміна і з 0О11.10 Т клітинами. Експресію СО25 Т клітинами вимірювали через 24 години після початку інкубації. А20-пиМІ5ТА клітини пригнічують експресію
Сра25 за допомогою Т клітин, але ці дані значно відновлювали за допомогою інкубації з М2ТВО5 (Фігура 18).
І00200| ПРИКЛАД 6: АДАПТАЦІЯ ЛЮДСЬКИХ КАРКАСНИХ ДІЛЯНОК АНТИ-МІ5ЗТА АНТИТІЛ 00201) Послідовності мишачої гібридоми для обох важкого і легсого ланцюга людського каркаса адаптували за допомогою СОК-пересадження (опев, єї аїЇ. Майшиге, 321: 522-525 (1986) з застосуванням внутрішнього програмного забезпечення. Програма окреслювала послідовності
М ділянки гіперваріабельних ділянок (СОКз5) відповідно до визначень Кабаї (Ми, Т. Т. є Кабаї, Е.
А. (1970). У Ехр Мед, 132, 211-50) і порівнювала каркасні ділянки з генами людської зародкової лінії з застосуванням Віабї. Людську зародкову лінію з найбільш високою ідентичністю послідовності до мишачих каркасів відбирали в якості гена-акцептора для адаптації людського каркаса (НЕА). У деяких випадках, близькоспоріднені гени людської зародкової лінії відбирали замість, виходячи з попереднього досвіду, з добре експресованими людськими каркасами. ДНК послідовності для людських каркасів відбирали для кожних з М ділянок мишачих мН або мі. одержували за допомогою зворотного переводу. Синтетичні ділянки ДНК, відповідні до амінокислотних послідовностей НЕА одержали від Іпіедгатед ОМА Тесппоїодіез (Согаїміне, ІА).
Клонування виконували в людські ІдДС1 і людські каппа, відповідно. (00202) ПРИКЛАД 7: КОНСТРУКЦІЇ АНТИ-МІ5ТА АНТИТІЛ (00203) Плазміда і інформаційна послідовність для молекул для розвитку клітинної лінії: плазмідні конструкції були створені для анти-МмІЗТА антитіл, що мають варіабельні ділянки
У5ТВІ112 їі константні ділянки ІЇдДс1к (М5ТВ174, новий номер у зв'язку з алотиповою зміною в константній ділянці), константна ділянка ІдС2сигма (М5Т8В140) або протеаза-резистентна константна ділянка Ідсе1 (М5ТВ149). 00204) Гопла вектори
І0020О5| Система експресійного вектора рЕЕб.4 і рЕЕ12.4 яєчника китайського хом'ячка (СНО) (Гопла Віоіодіс5, РІС) була створена в Віоіодіс5 Кезеагсп (ВК) і РПаптасеціїса
ОемеІюртепі 5 Мапиїасіигіпд Зсіепсе5 (РОМ5) в якості первинної експресійної системи для одержання терапевтичних тАбБ5 в експресійній клітинній лінії ссавців. Кожний вектор включає промотор людського цитомегаловіруса (пиСмММ-МІЕ) для керування експресією важкого ланцюга
Зо (НС) або легкого ланцюга (ІС) і включає ген, стійкий до ампіциліну. Вектор рРЕЕ12.4 також включає ген, що кодує фермент глутамінсинтетазу (55). Умови росту, які вимагають активність глутамінсинтетази, встановлюють селективний тиск на клітини для збереження експресійного вектора (55 СбСепе Ехргеззіоп зузхіет Мапиаї Мегвіоп 4.0). РЕЕб.4 застосовували для клонування гена НС, а рЕЕ12.4 для клонування гена С в якості сигнальних векторів гена. Подвійний плазмідний ген І оп7а створювали із цих двох окремих векторів генів І оп7а. (00206) Амінокислотна послідовність варіабельних ділянок важкого ланцюга вибраних МІЗТА тАбр5 (00207) » М5ТВ112 важкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:37) 00208) ОМОЇ МОБСІАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОСИТЕЗЗУАІЗУМУУВОАРОССІ ЕМ МаспРІБИТАМ
МАОКРОС,ВАМТІТАРЕЗТЗТАУМЕЇ 551 ВБЕОТАУУУСАВЗЗУСМУЗУЕЕОУМ ОСТІ МТУ55 002091 » М5ТВ50 важкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:38) 00210 ОМОЇ МОБОаЗЕЇ ККРОАЗУКУЗСКАБОМТЕТММИ МУУВОАРООСІ ЕУМСУММРУТИає
РТГМАВОЕКОаВЕМЕБІ ОТЗУЗТАМІ ОІС5І КАЕОТАУУУСАВЕСТаММІЕРУИМ ОСТІ МТУ (002111) » М5ТВ53 важкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:39)
І00212| ОМОЇ МОБСІАЕУККРОАБУКУЗСКАБОИМТЕТНУТІНУМАОАРСОСІ ЕУУ/МОаМПРОБОМО
ЕММОКЕКОАУТМТАОТЗТЗТУММЕЇ 551 В5ЕОТАУУ САВА ОВУ ОУМАМО УМ СОСТІ МТУ (002131) » М5ТВ95 важкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:40) (00214 ЕМОЇ МЕЗСОСИЇ МОРОаСІБІ ВІ БСААЗИаєТЕАМамМ5УМУАОАРОаКагі ЕМУМАВІЗИЦаЗУТ
УУРєРОБУКОаВЕТІЗВОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАУУМСАВІМОНОСОУУАМОУ МУ СС ТТУТУ5 (00215) Амінокислотна послідовність варіабельних ділянок легкого ланцюга вибраних МІЗТА тАбр5 (00216) "У5ТВ50 легкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:41) (00217| ОПІММТОТРІ БІ ЗМТРИОРАБІЗСВАБЗЕЗМОТМАМ5І МНУУМ ОКРООРРОГІМААЗМІ Е5
СуРєРОвВЕЗОаЗаЗатТОЕТІ КІЗВАМЕАЕОМаУМ У СООТМЕОРАТЕРС,ОСТКІ БІК (00218) "У5ТВ53 легкий ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:42) (00219| ОІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСАЗЗОТІМНЗМОаМТ МІ ЕМ М ОКРИООБРОЦП МКУЗМАЕ зауУРєРОовЕЗОаЗаБЗатоОвТІКІЗВМЕАЕОМаУУУСЕОАЗНУРМТРС,аОСТКІ БІК (00220) "У5ТВО5 легкий ланцюг (ЗЕО ІЮО МО':43) (00221| ОІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСНЗБЗОБІМНОМОМ ТМ ЕМ М ОКРООБРОЇ ПУКУЗМАЕ (510) зауУРєРовЕЗОаЗаБЗатоОвТтІКІЗВМЕАЕОМаУУУСЕОСЗНУРМТЕРСОСТКІ БІК
(00222) "У5ТВ112 легкий ланцюг (5ЕО ІЮ МО:44) (00223| ОІОМТОЗРБОБІ БАБМаОЮ ВМТ СВАБЗОБВІОТВІ МУМООКРОКАРКІ ІМБАЗБІ ОБаМРБ вЕЗОаЗИаБзаИаТОЕТІ ТІ ОРЕОБРАТУУСООЗАММРІТРСОСТКМЕІК (00224) "У5ТВ116 легкий ланцюг (5ЕО ІЮ МО:45) (00225| ОПВІОМТОЗРБОБІ БАБМаЮВМТІТ СВАБЗОБІМТМІМУМООКРИОКАРКІ ІМААЗБІ ОБаМРБ вЕЗОаЗИаБзаИаТОЕТІ ТІ ОРЕОБРАТУУСООАВОТРІТЕЧОСТКМЕК
І(00226| ПРИКЛАД 8: ТВЕРДОФАЗНИЙ ІФА і ЕАС5 СКРИНІНГ АНТИ-МІБ5ТА АНТИТІЛ
І00227| Дані експерименти проводили для визначення здатності отриманих антитіл зв'язуватися з людським білком МІ5ТА або білком МІЗ5ТА яванської макаки у твердофазному
ІФА, а також для визначення, з застосуванням ЕАС5 скринінга, здатності антитіл зв'язуватися з білком МІЗТА на поверхні К5б2 клітин (людська мієлогенна лейкозна клітинна лінія), експресуючих людські білки МІЗТА або білки МІ5ТА яванської макаки. (002281 Способи: (002291 Короткий опис способу твердофазного ІФА: планшети покривали протягом ночі при 4 "С з 1 мкг/мл 580361 (людськими) або 5ВО361 (супо (яванської макаки)) білками, які являють собою позаклітинні домени МІЗТА від відповідних видів. Антитіла розводили до концентрації 1 мкг/мл в якості вихідної концентрації з 1:14 поетапними розведеннями в цілому 4 концентрацій і інкубували при кімнатній температурі (КТ) протягом 2 годин. Мишачі анти-людські ІдО1-НАР (пероксидаза хріну) застосовували для виявлення і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Всі промивання здійснювали з застосуванням РВ5- Гл/ееп (0.0595). 002301 Короткий опис способу ГАС5: 2 х 105 К562-58 (людських) або К562-С7 (яванської макаки) клітин забарвлювали з 5 мкг/мл кожним досліджуваним антитілом і інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С. Козяче анти-людське ІдД51-РЕ (фікоеритрин) антитіло застосовували в якості другого ідентифікуючого антитіла при концентрації 5 мкг/мл. Клітини запускали на ВО
Еопезбза і аналізували з застосуванням програмного забезпечення БіІоу/дУо (Тгее аг, Іпс.,
АзПпІапод, ОК) на МРЇ (середня інтенсивність флюоресценції) для живої популяції.
ІОО231| Дані аналізу/результати: Для кожного антитіла, була дана суб'єктивна оцінка (Так/ні) щодо будь-якого антитіла, сильно зв'язаного чи ні для обох аналізів твердофазного ІФА (ЕГІЗА) і ЕАС5 для кожного з 4 досліджень. Якщо антитіло давало результат "Ні" для зв'язування в будь-якому дослідженні, його повторювали для підтвердження того, що він був негативним.
Результати показані в Таблиці 7 нижче і Фігурах 19А-19Е і 20А-20ОЕ. (002321 Таблиця 7 6 Гм нини жинн ши пиши ни зи ши сини по о п Я ПО о ПО оо
Продовження таблиці 7 (00233| ПРИКЛАД 9: РЕЗУЛЬТАТИ СКРИНІНГУ АНТИ-ЛЮДСЬКИХ МІЗТА АНТИТІЛ З
ЗАСТОСУВАННЯМ РЕАКЦІЇ ЗМІШАНОЇ КУЛЬТУРИ ЛІМФОЦИТІВ (МІК) І АНАЛІЗУ АКТИВАЦІЇ
ЕНТЕРОТОКСИНУ В ЗТАРНМІ ОСОССИЗ5 (ЗЕВ)
І00234| Метою даного дослідження було надати дані, що підтверджують ідентифікацію множинних функціональних с-МІЗТА антитіл, які підсилюють клітинні імунні відповіді в аналізі реакції змішаної культури лімфоцитів (МІК), а також дослідженні активації ентеротоксина В еіарпуіососсиз (ЗЕВ). 00235) Реакція змішаної культури лімфоцитів (МІК) являє собою стандартний імунологічний аналіз, який залежить від МНС класу І і Ії, невідповідного для керування алогенною Т клітинною відповіддю. Мононуклеари периферичної крові виділяли із двох невідповідних індивідуумів, інкубували разом і, як результат таких розбіжностей, відбувалася проліферація і вироблення цитокінів. (00236) Матеріали і способи:
І00237| 10 96 АВ середовище одержували змішуванням 500 мл КРМІ з 50 мл людської сироватки АВ, 5 мл Пеніциліну/Стрептоміцину (10,000 од/мл), 5 мл І-глутаміну (100х) і 10 мл
НЕРЕ5 (1М). Середовище зберігали не більше, ніж 14 днів. 1 мКи мічений тритієм тимідин одержували розведенням 0.2 мл вихідного тимідину (1 мКи/мл) в 9.8 мл КЕРМІ. 00238) Розчинні МІЗТА антитіла розбавляли до 20 мкг/мл в 10 95 АВ сироватковому середовищі. 100 мкл відповідних розчинів антитіл додавали у відповідні лунки 9б-лункового планшета з О-подібним дном (продукт Раісоп Ж 353077 або аналог). Після були додані різні клітинні популяції, кінцева концентрація склала 10 мкг/мл.
І00239| Виділення лейкоцитів: Донорам було, щонайменше, 18 років, як правило здорові люди і вибрані випадковим чином з місцевого населення. Переносили донорську кров з ізольованих пробірок в 50 мл конічні. Наносили нижче 15 мл Фіколла 1077 на 25 мл крові обережно, щоб не перемішати із кров'ю. Клітини центрифугували при 12509 протягом 25 хвилин при кімнатній температурі без гальмування. Лейкоцити виділяли на границі поділу фаз Фіколла і сироватки і клітини розводили в 40 мл збалансованому сольовому розчині Хенкса (НВББ).
Зо
Клітини центрифугували при 45349 (1500 об./хв.) протягом 10 хвилин при 4 "С. Клітини ресуспендували в 50 мл НВ55 і підраховували шляхом переносу 500 мкл в окрему пробірку. (00240) Постановка реакції змішаної культури лімфоцитів (МІК) в 96-лунковому планшеті:
Визначали відповідну кількість "стимулюючих клітин" і "Іімунокомпетентних клітин" необхідних для дослідження, виходячи з кількості аналізованих зразків. Стимулюючу популяцію висіювали при 0,5 х 10» клітин/лунку і імунокомпетентну популяцію висіювали при 1,0 х 109 клітин/лунку в 9б-лунковому планшеті з О-подібним дном. Всі умови повинні були здійснювати в трьох екземплярах. Відповідну кількість "стимулюючих клітин" піпетували в нову конічну пробірку і центрифугували, як описували раніше. Клітини ресуспендували в 10 мл і опромінювали 4000 рад. Клітини центрифугували, як описували раніше, і ресуспендували при концентрації 1 х 106/мл в 1095 АВ сироватковому середовищі і додавали 50 мкл у відповідні лунки. Виділяли необхідну кількість імунокомпетентних клітин і центрифугували, як описували раніше, і ресуспендували при концентрації 2 х 106/мл в 1095 АВ сироватковому середовищі і додавали 50 мкл у відповідні лунки. Клітини інкубували протягом 5 днів при 37 "С і 5 95 СО». На п'ятий день видаляли 30 мкл супернатанта для дослідження на вироблення інтерферону-гама (ІЕМ-у). На п'ятий день додавали 25 мкл 40 мКи/мл розчину міченого тритієм тимідину в кожну лунку і інкубували протягом 8 годин при 37 "С їі 5 95 СО». Клітини переносили в 96б-лунковий мікро- стинциляційний планшет відповідно до інструкцій виробника. Підраховували з застосуванням мікро-стинциляційного детектора відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію ІЕМ-у визначали за допомогою ЕГІЗА (еВіозсіепсе саї й 88-7316-88) з застосуванням протоколу виробника. (00241) Дані аналізу: Підраховували середнє число імпульсів на хвилину (СРМ) або концентрацію ІЕМ-у для необроблених лунок. Підраховували середню величину СРМ або ІЕМ- у для кожної досліджуваної групи. Логарифмічне перетворення і0д:іо набору даних. З застосуванням 12 МІК кратних-балів для кожної сполуки, обчислювали середню величину для набору з 12 досліджуваних груп кожної сполуки середній бал для 12 експериментів - У; К(одто (середня величина СРМ у трьох екземплярів для досліджуваної сполуки)) - (до (середня величина СРМ у трьох екземплярів без лікування)))/12 (00242) Припустимі норми: Всі реагенти дослідження і відповідні контролі були досліджені на наявність ендотоксину до проведення дослідження і мали рівні « 0.1 ЕО/мг. Імунокомпетентні клітини самі по собі мали в середньому рівень СРМ нижче 700 СРМ, що вказує, що клітини були в стані спокою, коли інкубували поодинці. СРМ для групи МІК склав щонайменше в 2 рази вище, ніж СРМ для імунокомпетентних клітин, інкубованих поодинці, вказуючи, що реакція відбулася і що донори були невідповідними. Всі дослідження МІК містили в собі негативний контроль людського ЇД1 білка. Результати негативного контролю людського ІдсОс1 не значно відрізнялися від необроблених зразків, засновані на застосуванні критерію Стьюдента. (00243) Скринінг анти-МІЗТА антитіл в МІК: Попередньо проводили скринінг усіх сполук.
Перед виконанням МІК з анти-мІЗТА антитіл, за допомогою аналізу ЕАСЗ підтверджували зв'язування антитіла також із клітинами, зв'язаними з МІ5ТА, і, за допомогою твердофазного
ІФА, білком МІЗТА. Антитіла 526 (М5Т877), 530 (У5ТВ86), 531 (У5ТВ88), 532 (М5Т890) і 539 (М5ТВ74) не задовольнили такий попередній скринінг, але залишилися досліджуватися в аналізі. З метою первинного скринінга, всі антитіла досліджували при 10 мкг/мл в МІК із проліферацією і вимірювали параметри ІЕМ-у (Фігури 21А-210 і 22А-228В). (00244) Вибір шести лідируючих антитіл. Для первинного скринінга шість кандидатів були відібрані для подальшого аналізу: УЗТВ112 (52), М5ТВ116 (55), М5ТВО5 (516), М5ТВ50 (541),
У5ТВ53 (543) і У5ТВб60 (547). (00245) Дослідження розведення шести кандидатів в МІК: Поправки протоколу. Протокол ідентичний, як описано вище, з поправками, що антитіла були розведені до наступних концентрацій: ЗО, 10, З, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 і О мкг/мл. (00246) Визначення значень ІСво: Грубі показники СРМ і концентрації ІЕМ-у застосовували для визначення ІСхо для кожного з антитіл. Обчислення ІС5о визначали за допомогою застосування програми "Е2-К 51аїв5". Шість окремих імунокомпетентних клітин застосовували для визначення значень ІСво. Окремі значення СРМ і концентрації ІЕМ-у в МІ Е з добором дози лідируючих кандидатів.
(00247) Таблиця 8: Значення ІСво для обох СРМ і ІРМ-у в МІК
Ящик з2 5 516 ЗА 543 547
Гама | 042 | ол | 022 | 006 | 027 | 04 (00248) "" Значення представлені в Іод:іо концентрацій антитіл.
І00249| Висновок: Первинний скринінг показав, що множинні специфічні МІЗ5ТА антитіла здатні підсилювати клітинну імунну відповідь МІК. Антитіла потім були ранжовані виходячи з ефективності і мінливості і, на основі цих результатів, М5ТВ112, М5ТВ116, М57895, У5ТВ50,
У5ТВ5З ії М5ТВб6О були вибрані для оцінки в експериментах підбору дози. М5ТВбО індукували більш слабку відповідь, ніж інші п'ять антитіл в експериментах підбору дози. (00250) Аналіз активації ентеротоксина В 5іарпуіососсиз (ЗЕВ) ЗЕВ являє собою бактеріальний супер-антиген, який викликає активацію специфічних Мря- Т клітин. Виділяли мононуклеари периферичної крові і інкубували з антигеном ЗЕВ у культурі, яка індукувала стійке вироблення цитокіну. Такий аналіз проводили на п'ятьох лідируючих кандидатах.
І00251| Одержання 10 95 АВ середовища, приготування 1 мКи міченого тритієм тимідину, приготування розчину МІЗТА антитіл, і виділення лейкоцитів здійснювали, як попередньо описано вище, в МІ К.
І00252| Підготовка ЕВ 9б-лункового планшета: Визначали відповідну кількість імунокомпетентних клітин, необхідних для аналізу, виходячи з кількості аналізованих зразків.
Популяцію імунокомпетентних клітин висіювали при 2,0 х 107 клітин/лунку в 96б-лунковий планшет з О-подібним дном. Всі умови повинні були здійснювати в трьох екземплярах. Клітини центрифугували, як попередньо описували вище, і ресуспендували при концентрації 4 х 105/мл в 10 95 АВ сироваткового середовища і додавали 50 мкл у відповідні лунки. Додавали 50 мкл 10 до АВ сироваткового середовища, що містить 5ЕВ антиген при концентрації 40 нг/мл. В описаних експериментах, ЕВ одержували від 5ідта Аїагісй (саї Ж 50812). Кінцева концентрація в лунці складала 10 нг/мл. Клітини інкубували протягом З днів при 37 "С і 5 95 СО». На третій день видаляли 30 мкл супернатанта для аналізу на вироблення ІЄМ-у. Додавали 25 мкл 1 мКи/мл розчину міченого тритієм тимідину в кожну лунку і інкубували протягом 8 годин при 37 "б'ї 5 95 СО». Клітини переносили в 96-лунковий мікро-стинциляційний планшет відповідно до інструкцій виробника. Підраховували з застосуванням мікро-стинциляційного детектора
Зо відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію ІРМ-у визначали за допомогою твердофазного ІФА (еВіозсіепсе саї 2 88-7316-88) з застосуванням протоколу виробника. (00253) Протокол: аналіз даних. Підраховували середню кількість імпульсів за хвилину (СРМ) або концентрацію ІЕМ-у для кожного антитіла у всіх концентраціях. Критерії прийнятності здійснювали, як попередньо описували. Визначення значень ІС5о здійснювали, як описано.
Окремі значення СРМ і концентрацій ІЕМ-у в ЗЕВ аналізі підбору дози лідируючих кандидатів. (00254) Таблиця 9: значення ІСво для обох СРМ і ІРМ-у в ЕВ. 7 ДетввеЦетвнока етно БІ
У5ТВ112 (52) | М5ТВ116 (55) | М5ТВО5 (516) | М5ТВ50 (541 543 547
Не
Не (00255) "Значення представлені в Іод:іо концентрацій антитіл.
І00256| Висновки: специфічні МІЗТА антитіла підсилювали вироблення цитокінів і проліферацію залежно від дози в 5ЕВ аналізі. Значення ІСво від ЕВ дослідження в цілому були схожі на результати досліджень розведення МІ К. (00257| ПРИКЛАД 10: АНАЛІЗ ЕПІТОП-СПЕЦИФІЧНОЇ СОРТИРОВКИ 00258) Способи: РгоїєОп ХРЕКЗ6б систему (ВіоКкайд) застосовували для здійснення епітоп- зв'язувального сортування. РгоїеОп сі С чипи (ВіоКай, Саї Ж 176-5011) покривали двома наборами з б моноклональних антитіл (тАбБе5), використовуючи інструкції виробника для хімічного аналізу амін-сполуки (ВіоКаа, саї Ж 176-2410).
(00259) Конкуруючі тАБб5 попередньо інкубували в надлишку (кінцева концентрація 250 нМ) з людськими МІ5ТА (кінцева концентрація 25 нМ) протягом 4 годин при кімнатній температурі і 6 у той же час виконували відносно чипа, покритого з панелями покритими тАбБ5 часовою асоціацією 4 хвилини з наступною дисоціацією протягом 5 хвилин. Після кожного виконання, чипи відновлювали з 100 мМ фосфорної кислоти. (00260) Аналіз отриманих даних залучав угруповання всіх сенсограм за допомогою ліганду і використання майстра вирівнювання, який автоматично виконує вирівнювання Х і Ух вісі, і артефакту видалення. Потім застосовували до даних корекцію Іпіеге рої. (00261) Неконкурентні тАБ визначали як такі, що мають сигнал зв'язування той самий або »
А1 сигнал (зв'язування тільки з людським МІ5ТА). (00262) Конкурентні тАБ визначали як такі, що мають сигнал зв'язування «« Аї сигнал (тобто, зв'язування тільки з людським МІЗТА).
І00263| Результати: В прикладі сенсограми, що показані на Фігурі 23, М5ТВ85 антитіло покривали на чипі Ргоїеоп 5РЕ. і виконували попередню інкубацію МІЗТА білка із зазначеними конкурентами відносно чипа. МУЗТВ5О являє собою приклад неконкурентного антитіла, в якості позитивної відповіді спостерігали, коли виконували комплекс МІЗТАЛ/ЗТВ50. 508, У5ТВ49 і
МЗТВ51 утворювали комплекси з МІ5ТА без зв'язування з М5ТВ85, покритими на чипі, і були, із цієї причини, кваліфіковані як конкуруючі за ту саму ділянку зв'язування на МІ5ТА, як У5ТВ85. (00264) Таблиця 10 датчиком
Продовження таблиці 10 м5тІВ85.001 | З ЇМ М М ЇМ м ЇМ Ім ЇМ Ім ЇМ ою
ПЕВ 1 5 ЇМ п ЇМ ЇМ м ЇМ Ім ЇМ Їм М дю
ТАБ, імобілізовані на датчику
У Е Є конкуренція (сигнал «« ніж А1- людські МІ5ТА тільки)
М - Немає конкуренції (сигнал » ніж А1- людські МІЗТА тільки)
Не визначений (сигнал схожий на А1- людські МІЗТА тільки)
І00265| ПРИКЛАД 11: ВИЗНАЧЕННЯ АФІННОСТІ ПРОТЕОНУ (00266) Антитіла були захоплені на чипах РгоїеОп з застосуванням покритих анти-Ідс Ес 5 поверхонь. Антитіла досліджували на зв'язування з людськими і яванської макаки (супо) позаклітинними доменами (ЕСО5) МІ5ТА при концентрації білків МІ5ТА у діапазоні від 0,39 нм до 100 нМ. Антигени дозволяли зв'язуватися/з'єднуватися із чипами, покритими антитілами протягом 4 хвилин, після чого спостерігали дисоціацію протягом 30 хвилин. Чипи відновлювали, обробляючи двічі з 100 мМ фосфорної кислоти протягом 18 секунд. Всі експерименти проводили при 25 "С і дані були придатними для 1:1 моделі зв'язування Ленгмюра. (00267| ПРИКЛАД 12: ВПЛИВ ЛІКУВАННЯ АНТИ-МІЗТА У МИШАЧІЙ МОДЕЛІ РАКУ
СЕЧОВОГО МІХУРА МВ49 00268) Способи:
І00269| С57ВІб мишам вводили МВ49 пухлинні клітини. Після того як пухлини розвилися, починали лікування анти-мІ5ТА. Ріст пухлини потім контролювали З рази на тиждень. Мишей вбивали відповідно до правил ІАСИС, після того, як пухлини досягали 15 мм у будь-якому вимірюванні.
І00270| Для кожного експерименту заморожений флакон МВ49 клітин розморожували і вирощували в КРМІ 1640 (-- І-Ш) з 10 95 сироваткою і антибіотиками пеніцилін/стрептоміцин.
Після трьох днів у культурі, клітини збирали з застосуванням 5(етРго Ассшіазе і ресуспендували в КРМІ при концентрації 5х105 клітин/мл і вводили 50 мкл на мишу.
І00271| Мишей С57В1/6 жіночої статі віком 6-8 тижнів отримували в Маїййопа! Сапсег Іпзійше.
Після прибуття їм давали акліматизуватися протягом одного дня до того, як їм виголювали правий бік і проколювали їхні хвости. Через три-п'ять днів їм вводили. (00272) Введення пухлини (внутрішньошкірно)х Мишам вводили внутрішньошкірно (і.а.) у їхній виголений бік 50 мкл МВ49 клітинну суспензію (250,000 клітин).
І00273| Контроль росту пухлини: Ріст пухлини вимірювали із застосуванням, по-перше електронних вимірювачів по самому широкому об'єму (І) і по-друге під кутом 907 до першого вимірювання (ММ). Об'єм пухлини визначали в такий спосіб:
Коо) (00274 Об'єм - (12МуУ2гуг2 (00275) Пухлину вважали створеною, коли вона досягає «5 мм в діаметрі (760 мм3 об'єму).
Після того, як створили, починали лікування. Ріст пухлини вимірювали три рази на тиждень у процесі лікування і до припинення експерименту. (00276) Лікування анти-мІЗТА: Химерні 13Е3-тідб2а моноклональні антитіла вводили внутрішньочеревинно в 10 мг/кг. Протокол імунізації був три рази на тиждень протягом чотирьох тижнів.
І00277| Вбивання мишей: Відповідно до правил ІАСИС, тварин вбивали при досягненні їх пухлин 15 мм у самому довгому вимірюванні. (00278) Аналіз ефективності: Об'єми пухлин мишей аналізували з застосуванням Ехсеї! для обробки даних, і сгарпРай Ргізт для побудови графіків. Статистичний аналіз проводили з застосуванням макросу для К статистичних розрахунків програмного забезпечення.
І00279| Експериментальна конструкція показана на Фігурі 24.
00280) Результати: (00281| Сп1ЗЕЗ3-тіІдб2а обробка мишей жіночої статі призводить до повного відторгнення пухлини (СК) в 70 95 тварин і часткової ремісії (РК) в 30 95 (п-7) (Таблиця 13 і Фігура 258). На відміну від цього, всі контрольні миші, що одержували лікування тідсга, показали прогресивний розвиток пухлин (6/6) (Фігура 25А). Дані показали, що лікування анти-МІЗТА могло мати сильний вплив на ріст пухлини. (00282) Таблиця 11: Повна ремісія (СЕК) у порівнянні із частковою ремісією (РЕК) 133 дбга(п-7) жіночої статі
РА | ---/// даждо32//-/-:-/--Зу:
І00283)| Послідовність людських МІЗТА показана на Фігурах 26 і 27, на основі матеріалів
Умапд еї аї.,, 2011, вище, вміст яких включений за допомогою посилання в даному описі у повному об'ємі.
І00284)| ПРИКЛАД 13: КАРТУВАННЯ ЕПІТОПІВ АНТИ-МІЗТА АНТИТІЛ З ЗАСТОСУВАННЯМ
ДОСЛІДЖЕННЯ ВОДЕНЬ/ДЕЙТЕРІЄВОГО (Н/0О) ОБМІНУ
І00285| Для ідентифікації епітопів для М5ТВ50, 60, 95 і 112 на людських МІ5ТА, мабс- спектрометрію розчину на основі водень/дейтерієвому обміну (НОХ-М5) здійснювали з застосуванням відповідних Гарб5. Процедури для Н/О обміну, застосовувані для аналізу Бар відхилення, аналогічні описаним раніше (Натиго еї аї.,.. Віотої!. Тесппідце5 14:171-182, 2003;
Нотт еї аї., Віоспетівігу 45:8488-8498, 2006) з деякими модифікаціями. Рарз готували з Ідо5 з розщепленим папаїном і захват білком А з застосуванням набору Ріегсе Бар Ргерагайоп Кії (Тпегто 5сіепійіс, Саї Ж 44985). Послідовність людського білка МІЗТА містила шість М-зв'язаних ділянок глікозилювання. Для поліпшення захвату послідовності, білок делікозилювали з РМСавзе
Е. Дегликозильований білок МІЗТА інкубували в дейтерованому водяному розчині протягом заданого часу, що призводить до включення дейтерію у взаємозамінних атомів водню.
Дейтерований МІЗТА білок був у комплексі або з Раб МУ5ТВ50, У5ТВ6О, У5Т895 або М5ТВ112 в 46 мкл окису дейтерію (020) при 4 "С протягом 30 секунд, 2 хвилин, 10 хвилин і 60 хвилин.
Обмінну реакцію гасили низьким рН і білки руйнували пепсином. Рівні дейтерію при певних пептидах контролювали зі зрушення маси на ЇС-М5. В якості референсного контролю, білок
МІЗТА обробляли подібним чином, за винятком того, що він був не в комплексі з молекулами
Еаб. Ділянки, пов'язані з Раб, вводили в ті ділянки, що відносно захищені від обміну, і, таким чином дейтерій, що містить більші фракції ніж референсний білок МІ5ТА. Приблизно 9495 білка може бути зіставлено з конкретними пептидами.
І00286| Відхилення зіставлення розчину НОХ-М5 МІЗТА з М5Т1850//5ТВбО, і
У5ТВ95//5ТВ8112 показані на Фігурі 28 зверху і знизу, відповідно. Були ідентифіковані дві групи епітопів. Анти-МІЗТА М5ТВ5О розпізнає той самий епітоп, як робить М5Т8В60; М5ТВ95 зв'язується з іншим епітопом ділянки, як робить М5ТВ112 на МІ5ТА. Анти-МІЗТА У5ТВ50 і 60 ділять той самий епітоп, який включає сегменти, чозМі ТІ О5СІ 1 (5БО ІЮ МО:62) і 1і16МОТакрАРБЗМС 46 (ЗЕО ІЮ МО:63) (Фігура 28 сверху). Анти-МІЗТА У5ТВЗ5 і 112, ймовірно, націлені на схожі епітопи, які включають в себе сегменти 27? МОКаНОМТЕзв (ЗЕО ІЮО МО:75) і
БАВАРІВО ТРОЇ вх (ЗЕО ІЮ МО:65) (Фігура 28 знизу). Є два інших сегмента, що показують слабкі відхилення по М5ТВО5 і 112, що включають залишки 39-52 і 118-134. Крім того, рівні зниження не такі сильні, як у попередніх ділянках (27-36 і 54-65) у диференціальній карті.
Незважаючи на те, що один пептид 100 ГМА:ог2, що показує сильні відхилення по У5ТВО5 і 112, розташований на іншій стороні поверхні МІ5ТА, він є віддаленим від ділянок епітопа, 27-36 і 54- 65. Такі відхилення можуть бути викликані алостеричним ефектом. Дані результати НОХ-М5 визначають рівень епітопів пептиду для анти-мі5ТА антитіл. Там не було ділянок епітопа, що перекриваються, для таких двох груп епітопа. Дані результати узгодилися з попередніми даними конкурентного сортування, у яких вони не конкурували один з одним.
І00287| ПРИКЛАД 14: ВИЗНАЧЕННЯ СТРУКТУРИ КОМПЛЕКСУ ЛЮДСЬКИХ УМІ5ТА
ЕСО:М5ТВ112 ЕАВ ЗА ДОПОМОГОЮ БІЛКОВОЇ КРИСТАЛОГРАФІЇ
І00288| З метою визначення структури МІЗТА і для позначення епітопа і паратопа, що визначає взаємодію між позаклітинним доменом МІЗТА (ЕСО) ії Гар фрагментом лідируючого антитіла М5ТВ112, комплекс кристалізували і визначали структуру при 1.85 А роздільній здатності. Структуру ЕСО людських МІЗТА у комплексі з баб фрагментом антитіла М5ТВ112 визначали в спробі визначення як структури ЕСО самого МІЗТА, так і для визначення епітопа/паратопа для їхньої взаємодії. Структура виявила МІЗТА для прийняття петлі ІДМ з топологією ланцюга, аналогічного Ма ланцюгу ТОК. На додаток до конічного дисульфідного зв'язку, що утворює місток В і Е нитками в задній і передній поверхнях р-сендвіча, структура показала ЕСО має два додаткові дисульфідні зв'язки, один прив'язує СС" петлю до переднього шару, а другий між А їі с" нитками. Незважаючи на те, що кристалічні контакти між молекулами
МІЗТА відбувалися, вони були незначними і не є доказом для димера МІ5ТА ЕСО» на основі цієї структури. Епітоп М5ТВ112 показаний для включення частин МІ5ТА ВС, СС", ії БО петлі разом із залишками переднього бета шару (С"СЕСс) найближчих тих петлею. Паратоп зміщений більшою мірою вбік взаємодій важкого ланцюга з СОК ІЗ, роблячи мінімальний контакт. 00289) Епітоп/паратоп, що визначає взаємодію МІЗТА:У5ТВ112 (00290) МеТВ112 Еаб закриває площу поверхні 1024.3 А2 при зв'язуванні МІЗТА ЕСО, із закриттям поверхні важкого ланцюга, що складає 715.3 А2 від загальної суми. Сім водневих зв'язків і 4 сольових містка взаємодій утворювалися між МІ5ТА і легеим ланцюгом У5ТВ112, а 10 атомів водню і 2 сольових містка взаємодій між МІЗТА і важким ланцюгом МЗТВ112. М5ТВ112 розпізнавало залишки в передньому шарі ниток С", С, Е, ї с на кінцях, близьких до Ес петлі, а також залишки в ВС, ЕС, і СС" петлях (Фігури 29 ії 30). Взаємодії з СС" петлею припадали на більшу частину контактів з легсим ланцюгом Раб з тільки залишками Е125 і К127 в ГО петлі робили додаткові взаємодії легкого ланцюга. Залишки 119 до 127, що відповідають ЕС петлі
МІЗТА припадали на 38 95 від загальної 1034.8 А? площі поверхні, що закриваються після зв'язування М5ТВ112. Зокрема, така петля є високополярною, містила в собі наступну послідовність-І(ІВНННЗЕНА- (ЗЕО ІЮ МО:76). Крім того, М/1О3 в УМ5Т8112 СОК НЗ добре накладені проти залишків НІ122 ії НІ1І23 каркасу МІ5ТА, а Н121 МІ5ТА здійснювали бічні взаємодії з ароматичним кільцем Е55 в СОК Н2.
І00291| Порівняння ділянок епітопів по кристалографії і НОХ показані на Фігурі 31.
І00292| ПРИКЛАД 15: АКТИВАЦІЯ Т КЛІТИН І МОНОЦИТІВ ЗА ДОПОМОГОЮ АНТИ-МІ5ЗТА
АНТИТІЛ
І00293| Ефект функціонального характеру анти-МмІЗТА антитіл оцінювали у двох дослідженнях іп міїго аззаух, реакції змішаної культури лімфоцитів (МІК) і ЗЕВ (ентеротоксин В еарпуіїососси5). Обидва дослідження вимірювали Т клітинну проліферацію і вироблення цитокінів, в якості їх основних показників, але такі ефекти були обумовлені різними механізмами. В МІК, мононуклеарах периферичної крові (РВМСО5) від двох різних людських
Зо донорів інкубували разом, а головний комплекс гістосумісності (МНС) не відповідав між Т клітинами одного донора і дендритними клітинами іншого донора, що призводить до Т клітинної проліферації і виробленню інтерферону (ІЕМу). У дослідженні ЗЕВ, РВМС» від одного донора інкубували з бактеріальним суперантигеном, який безпосередньо зв'язував білок МНС Сіазз5 ЇЇ на поверхні антиген-презентуючих клітин (АРС) з Т-клітинним рецептором (ТСК) на Т клітинах, викликаючи активацію Т клітин, проліферацію і вироблення цитокінів. В обох дослідженнях,
УМ5ТВ112, який являє собою первинну молекулу М5ТВ174, показала дозозалежну індукцію Т клітинної проліферації і вироблення цитокінів, і була найактивнішою серед кандидатів (Фігури 21А-210, Таблиця 12). (00294) Таблиця 12. Значення ЕСво для досліджень зчитування МІК. М5ТВ112 (первинна
У5ТВІ174) була самою активною молекулою.
МАТЕЯ От Ж ООН НО Ж. ПО (00295) Дослідження активації моноцитів 00296) Дані дослідження, показані в Таблиці 12, були отримані з М5ТВ112, первинною молекулою У5ТВ174. Для найкращого розуміння активності М5ТВ174 виконували дослідження активності моноцитів. Результати показали, що інкубація МУ5ТВ174 із цілими РВМС5, викликала підвищену експресію активаційних маркерів (СО80 ії НІГ А-ОК) на СО14- моноцитах, що вказувало на ефект зв'язування антитіла із субпопуляцією імунних клітин, відомими експресуючими високі рівні МІ5ТА (Фігура 32). Додатковим питанням є чи можна сприяти впливу на активацію моноцитів у цілих РВМС будь-яким антитілом, яке зв'язується з МІЗТА і має Ідс1
Ес. Антитіла М5ТВ103 і М5ТВ63 зв'язувалися з МІЗТА з високою афінністю (КО 6.36Е-10 і 8.ЗОЕ- 10 відповідно) і клітинами, що експресують білок МІ5ТА, аналогічно М5ТВ112 ї М5ТВ111.
М5ТВ103 перебував у тій самій парі основ епітопа, як М5ТВ112, тоді як М5ТВ63 перебував в іншій парі основ епітопа; жодне антитіло не сприяло активації моноцитів. В цілому, дані результати показали, що один механізм, за допомогою якого М5ТВ174 могли виявити свій вплив на активацію/проліферацію Т клітин, відбувався за допомогою активації моноцитів, якій сприяли
МК клітини.
І00297| Приготування середовища (00298) 500 мл КРМІ 1640 (Согпіпуд, 10-040-СМ) змішували з 50 мл людською сироватки АВ (мМаПеу Віотеаісаї, Іпс, бої Ж 300405), 5 мл пеніциліну/стрептоміцину (Гопга, 17-602Е) 10,000 од/мл, 5 мл І -глутаміну (100х) (сібсо, 25030-081) і 10 мл НЕРЕЗ (1М) (Різпег ВР299-100, І ої Я - 1). Середовище зберігали протягом не більше ніж 14 днів при 4 "С.
І00299| Приготування розчину МІ5ТА і контрольних антитіл
І0ООЗО0І Антитіла розводили до 2Х необхідної концентрації в 1095 сироватковому середовищі
АВ: М5ТВ174: Іої У5ТВ174.003
Ї00301| Додавали 100 мкл відповідних розчинів антитіл до відповідних лунок 96-лункового планшета з О-подібним дном (РаЇсоп, 353077). Потім додавали різні клітинні популяції в кількості 100 мкл, кінцева концентрація кожного антитіла складала 1, 0,1 або 0,01 г/мл. СМТО 3930 контрольне антитіло Ідс1 (І 0ї 6405, ЕМОО «0,1 ЕО/то) додавали в кінцевій концентрації 1 мкг/мл.
І0ОЗ02| Виділення РВМСО5 00303) Донорам було, щонайменше, 18 років, як правило, здорові і вибиралися випадковим чином з місцевого населення. 003041 Донорську кров переносили з ізольованої пробірки в 50 мл конічну.
Ї0ООЗО5) 15 мл Фіколл 1077 (ЗІСМА, 10771) поміщали обережно під кров, щоб не змішати. Це було на 25 мл крові. 00306) Клітини центрифугували при 12509 протягом 25 хвилин при кімнатній температурі без гальмування.
Ї00307| Лейкоцити виділяли при інтерфазі Фіколла і сироватки і клітини розводили в 40 мл збалансованого сольового розчину Хенкса (НВБ55).
Ї0ООЗО8) Клітини центрифугували при 4539 (1500 об./хв.) протягом 10 хвилин при 4 "С.
І00ОЗО9| Клітини ресуспендували в 50 мл НВ5з5 і підраховували шляхом переносу 500 мкл в
Зо окрему пробірку Еппендорфа.
Ї0ООЗ10| Крім того, набір Рап Мопосуїе ізоїайоп КИ від Мійепуі застосовували згідно з інструкціями виробника (саї Ж 130-096-537) для виділення СО14-- клітин шляхом негативної селекції в декількох оброблюваних групах. 00311) Підготовка до культивування Іп міто
І00312| Визначали відповідну необхідну кількість клітин для дослідження, виходячи з кількості аналізованих зразків. Популяцію імунокомпетентних клітин висіювали в концентрації 2,0х105 клітин/лунку в 96-лунковий планшет з О-подібним дном. Для СО14 популяції, відібраної негативно, засіювали 0,5х10» клітин. Всі умови здійснювали в трьох екземплярах.
ІЇ00З13| Клітини центрифугували, як описано вище і ресуспендували при концентрації 2х106/мл для популяції цілих РВМС і 0,5х106/мл для популяції СО14, відібраної негативно, в 10 до сироватковому середовищі АВ і додавали 100 мкл досліджуваного антитіла до відповідної до лунки, доводячи загальний об'єм у кожній лунці до 200 мкл. 003141 Клітини інкубували протягом 1, 2, або З днів при 37 "С і 5 95 СО». 00315) Забарвлення антитіл і проточна цитометрія 00316) 9б-лунковий планшет з О-подібним дном центрифугували протягом 5 хвилин при 4539 і видаляли супернатант.
Ї00З317| Клітини промивали з 200 мкл РВ5 і центрифугували як на етапі 5.5.1. 00318) Супернатант скидали і ресуспендували в 50 мкл РВ5, що включає в себе наступні антитіла: ее СО14-АРС (клон НСО1Т4) 1:250 (Віоіедепа саї 2 325608) ее НГА-ОВ-РЕ Су? (клон І 243) 1:250 (Віоієдепа саї 2 307616) ее СОВ80-РЕ (клон 2010) 1:250 (Віоіедепа саї 2 305208) е Ни ЕсВ інгібітор зв'язування (еВіозсієпсе саї 2 14-9161-73) 003191 Інкубували протягом 20 хвилин на льоді в темряві.
І00320)| Додавали 150 мкл РВ5 і центрифугували, як на етапі 5.5.1.
І00З321| Додавали 150 мкл буфер РВЗ і аналізували за допомогою ЕАС5. 00322 Зразки перевіряли на проточному цитометрі Мікепуїі МАСЗО цапі з 10-параметрами і аналізували з застосуванням Ріом/до 9.7.5 на експресію НГА-ОК і СО80 на СО14- популяції.
Середнє геометричне значення інтенсивності флюоресценції (МЕ), статистична величина, яка визначає середнє значення множини чисел, застосовували в якості визначальної статистики для порівняння лікувань.
І0ОЗ23)| Статистичний аналіз (00324) Вся статистика проводилася в Ргізт ОСгарпРай, версія 6. Попарне порівняння між групами робили в кожній часовій точці з застосуванням Опе-МЖМау АМОМА з поправкою на множинність Тьюки. Р-значення менше, ніж 0,05 для всіх досліджень і порівнянь, вважали значними. Для всіх графіків і таблиць, " р«е0,05, и ра0,01, и ра0,001, и "р-0,0001.
І00325| ПРИКЛАД 16: АКТИВНОСТІ АОСС І АОСР АНТИ-МІ5ЗТА АНТИТІЛ (0о0326| М5ТВ174 мали Ес Ідс1, які могли забезпечувати активність антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (АОСС) і антитілозалежного клітинноопосредованного фагоцитозу (АОСР). Були проведені обидва типи досліджень і показали, що М5ТВ174 може лізувати або фагоцитувати К562-МІ5ТА клітини (Фігури 33-34), але не мієломну клітинну лінію
К562 первинних клітин (дані не показані). Додатковим механізмом активації М5ТВ174 для модулювання інгібуючої дії МІЗТА може бути лізис або поглинання клітин, експресуючих високі рівні МІЗ5ТА, таким чином, видаляючи їх з локального мікросередовища. (00327| ПРИКЛАД 17: АКТИВАЦІЯ АОСР ДОДАТКОВИМИ АНТИ-МІ5ТА АНТИТІЛ (00328) Аналіз фагоцитозу іп мійго застосовували для вивчення підсилення макрофаг- опосередкованого фагоцитозу клітин, ектопічно експресуючих МІЗТА анти-людськими МІЗТА тАбр5 (М5ТВ173 ії М5ТВ174). Такі тАб5 клонували в різні Ес каркаси (Ідс1 УЛ (дикий тип), Ід451
РК (стійкі до дії протеази), і Ід020) і постулювалися для можливості мати різні активності щодо посиленого фагоцитозу. РК каркаси Ідс1 і їдс1 здатні зв'язуватися з Ес рецепторами і мали потенціал, щоб викликати АЮСР, у той час як Ідс20 не зв'язувалися з Ес рецепторами і не опосередковували АОСР. 00329) Анти-МІЗТА антитіла досліджували в аналізі АОСР з К562 первинними і К562-МІЗТА клітинами-мішенями. Як показано на Фігурах 35-36, М5ТВ174, М5Т8149, М5ТВ173 і М5Т8145 підсилювали пМас фагоцитоз К562-МІЗТА клітин. МІЗТА антитіла М5ТВ140 або УМ5ТВ132, і
ІЧЦе2о Ес, які не зв'язували з Ес рецепторами, не підсилювали фагоцитоз, як очікувалося. МІЗТА тАр5 У5ТВ174 і М5ТВ173 з ІдД01 Ес показували найбільш сильний фагоцитоз, ніж У5ТВ149 і
У5ТВІ145 з ІДС1РЕ Ес (див., Таблицю 13 і 14 для значень ЕСво).
Зо Ї0ОЗЗ0| Таблиця 13. Значення ЕСво анти-людських МІЗТА тА.
І00331| Таблиця 14. Значення ЕСво анти-людських МІЗТА тА.
І00332| М5ТВ174 і М5ТВ173 показували слабке підсилення фагоцитозу К562 первинних клітин при найвищій концентрації (Фігури 35-36), яке могло бути через низьку експресію МІЗТА
К562 клітинами. Інші анти-МІЗТА антитіла не підсилювали фагоцитоз К5б62 клітин. 00333) Негативні контрольні антитіла були досліджені, кожне у двох різних концентраціях в аналізі фагоцитозу К562-МІЗТА, але не викликали ніякого фагоцитозу. Дані результати вказували, що фагоцитоз, опосередкований анти-МмІ5ТА антитілами, специфічний і пов'язаний з експресією антигену МІЗТА К5Ь62-МІ5ТА клітинами. (00334| ПРИКЛАД 18: АКТИВАЦІЯ АОСС ДОДАТКОВИМИ АНТИ-МІЗТА АНТИТІЛАМИ 00335) З метою вивчення їх здатності індукувати АОСС, досліджували наступні три людські анти-МІЗТА антитіла:
У5ТВІ174 (ЗИ1)
У5ТВІ149 (4421 РЕ)
У5ТВ174.ГЕ (1921 ГЕ (низький рівень фукози)).
І00336| Кожне антитіло досліджували в шести різних концентраціях у межах одного планшета, в трьох повторах протягом двох окремих експериментів для загальної кількості шести точок даних.
І00337| М5ТВ174, 578149, ї М5ТВ8174. Є кожне демонструє вимірювану АОСС активність при 10, 1, 0,1 ї 0,01 мкг/мл, у той час як тільки ГЕ антитіло показувало вимірювану АЮСС активність при 0,001 мкг/мл; жодне з антитіл не показало АОСС при 0,0001 мкг/мл. Оскільки кожне з таких антитіл мали варіант Ес Ідс1 або Ідс1, дані результати були, як і очікувалося. І Е антитіла показували збільшену активність АЮОСС про що свідчило менше значення ЕС5о для кривої І Е антитіла (0,002293 мкг/мл) у порівнянні зі звичайної кривою ІдДС1 антитіла (0,02381 мкг/мл). Крива РК ІдС1 антитіла мала значення ЕСбо, аналогічне до звичайної кривої Ідс1 (0,01846 мкг/мл).
ЇООЗЗ38| Таблиця 15. Значення ЕСво (мкг/мл) трьох досліджень анти-МІЗТА антитіл, як визначено за допомогою аналізу АОСОС. 00339) Всі людські ЇДО1, людські 901 РК і людські 901 ГЕ показали вимірювану АОСС, опосередковану цитолізом при концентрації антитіл 10, 1, 0,1 ї 0,01 мкг/мл, у той час, як тільки
Е антитіла показали цитоліз при концентрації антитіл 0,001 мкг/мл. Жодне анти-МІ5ТА антитіло не показало цитоліз при концентрації антитіл 0,0001 мкг/мл. 00340) І Е антитіло показало приблизно в 10 раз більшу активність, яка послаблює АЮОСС, ніж будь-яке з регуляторних антитіл Їде1 або РЕ Ідс1 антитіл, як показано в значеннях ЕСбо. (00341) ПРИКЛАД 19: АФІННІСТЬ М5ТВ174 ДЛЯ МІЗТА ЛЮДИНИ І ЯВАНСЬКОЇ МАКАКИ (00342) Афінність М5ТВ174 для позаклітинного домену (ЕСО) МІЗТА людини і яванської макаки визначали за допомогою способу поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) на приладі РгоїеОп. М5ТВ174 відображали дуже схожі значення КО для кожного білка, 1.56Е-10 М для людських ЕСО МІ5ТА і 8.66Е-11 М для МІ5ТА яванської макаки.
І00343| ПРИКЛАД 20: МІЗТА АНТИТІЛА, ЩО ПОКАЗУЮТЬ ЕФЕКТИВНІСТЬ У МИШАЧИХ
МОДЕЛЯХ ПУХЛИНИ
00344) Мишачі штами, реагенти і моделі пухлини
Ї00345| Для досліджень іп мімо, застосовували людські МІЗТА нокін (МІЗТА-КІ) миші зворотно-схрещеної у фононовий С57ВІ/6. 00346) Анти-людські МІЗТА антитіла одержували для того, щоб дослідження в МІЗТА-КІ мишах, використовуючи варіабельну ділянку М5ТВ8174, пересаджену в Ес ІдС2а миші (М5ТВ123).
І00347| МВ49 рак сечового міхура оцінювали в МІ5ТА КІ мишах. 00348) В доповнення до опублікованих досліджень, які показують, що терапія анти-МІЗТА
Зо антитілами інгібувала ріст пухлини у мишей дикого типу (І е Мегсіег еї а!., 2014), протипухлинний ефект був показаний в антитілі-імітаторі хом'ячка у мишей дикого типу з застосуванням різних режимів дозування і в МІЗТА-КІ мишей, що одержували У5ТВ123. 00349) Ефективність досліджень іп Мімо у моделі пухлини в МВ49 МІЗТА-КІ мишей
І00З350| Дослідження ефективності МВ49 проводили на МІЗТА-КІ мишах жіночої статі, досліджували М5ТВ123 у декількох дозах, у межах від 1-10 мг/кг. Мишам вводили внутрішньошкірно 250,000 клітини пухлини МВ49 у день 0. На 6 день, починали дозування, як показано на Фігурі 37 (або 10 мг/кг ізотипового контролю тідсга, або зазначені дози М5ТВ123; 10 мишей/група).
Ї00351| М5ТВ123 був більш ефективний при високих дозах у порівнянні з низькими дозами, як показано на Фігурі 37. Дози 10 мг/кг і 7,5 мг/кг були еквівалентними, тоді як пухлини збільшувалися швидше в мишей, яким вводили 5 або 1 мг/кг. (00352) ПРИКЛАД 21: ВИЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ МІЗТА В ЛЮОДСЬКИХ ПУХЛИНАХ З АНТИ-
МІЗТА АНТИТІЛАМИ
На Фігурі 1 показана експресія МІЗТА за допомогою АМІ. пухлинної клітинної лінії-це і дані експресії КМАзеа у Фігурі 17 підтримували ідею про те, що МІ5ТА експресувався АМІ. клітинами і що лікарський засіб анти-МІЗ5ТА був ефективний за допомогою прямої спрямованого взаємодії цих клітин для імунної модуляції або антитілоопосредованного цитолізу. 00353) Дані для оцінки експресії МІ5ТА у раку легенів були отримані від зразків раку легенів хірургічно вилучених. Клітини дисоціювали і характеризували для експресії МІЗТА і багатьох інших маркерів. Результати показали, що 13/13 пухлин легенів (пласкі або аденокарциноми) містили в собі СО14-- МІЗТАх мієлоїдні клітини (Фігура 38).
ІО0354| ПРИКЛАД 22: ВИЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ МІЗТА В ПУХЛИНАХ ЛЕГЕНІВ З
ЗАСТОСУВАННЯМ АНТИ-МІЗТА АНТИТІЛ
00355) Аналіз імуногістохімії був розроблений з застосуванням клону 508, анти-людських
МІ5ТА ІдС1 миші. Такі тАБб застосовували для вивчення забарвлення МІ5ТА у недрібноклітинній карциномі легені (МЗС С) ЕЕРЕ ділянок пухлини. 00356) ЕЕРЕ ділянки пухлини обробляли стандартними способами витягування антигену до забарвлення. (508 мишачі анти-людські МІЗТА антитіла застосовували в 1:500 розведенні. 508 зв'язування визначали з застосуванням кролячих анти-мишачих поліклональних антитіл, а потім
НЕР анти-кролячим полімером. Наступне забарвлення, що контрастує з гематоксиліном, потім оцінювали ділянки пухлини.
Ї00357| Експресія МІЗТА у раку легенів була головним чином обмежена імунним інфільтратом (приклад показано на Фігурі 39) і високі рівні МІЗТА позитивних клітин були присутні в багатьох образах раку легенів.
Ї00358| ПРИКЛАД 23: СТРУКТУРА ПОЗАКЛІТИННОГО ДОМЕНУ (ЕС) ЛЮДСЬКИХ МІЗТА У
КОМПЛЕКСІ З ЕАВ ФРАГМЕНТОМ УЗТВ174
Ї00359| Варіанти антигену МІЗТА одержували і оочищували для кристалографії.
Рекомбінантний піз-мічений У5ТВ174 Раб був експресований усередину і очищений. Кристали одержували і застосовували для збору високороздільних даних для комплексу МІЗТА
ЕСО:УМ5ТВ174 Раб з застосуванням магнітногальмівного випромінювання, а структурний аналіз був дозволений з застосуванням комбінацій гомологічного моделювання і аналізу щільності електронів (Фігура 29(зверху)).
І00З6О| Структуру комплексу МІ5ЗТА ЕСО:М5ТВ174 Рар визначали за допомогою рентгенівської кристалографії для роздільної здатності 1.85А, що забезпечує первинну структуру МІЗТА ЕСО і, що окреслює епітоп і паратоп М5ТВ174. ЕСО МІЗТА приймав ІдМ петлю з топологією, аналогічною СТІ А-4 ЕСО, але, що зберігає унікальну С" нитку, яка простягалася до переднього шару В-сендвіча. А" і б" додатково прив'язані хімічно за допомогою дисульфідного містка, утвореного між залишками С12 в А" нитці і С146б в с" нитці. Шість цистеїнів виявлені зайнятими трьома внутрішньомолекулярними дисульфідними зв'язками, і, на основі кристалічних контактів, немає ніяких доказів для димерного МІ5ТА.
І00361| М5ТВ174 розпізнавав залишки в передньому шарі ниток С", С, Е, і б на кінцях, найближчих до Ес петлі, а також залишки в ВС, ЕС, і СС" петлях.
Зо 00362) Навчання у всіх патентах, опублікованих заявках і рефератах, наведених у даному винаході, включені за допомогою посилання в їх повному об'ємі.
Ї00О363| Незважаючи на те, що даний винахід був докладно показаний і описаний з посиланнями на приклад здійснення даного винаходу, це буде зрозуміло фахівцям у даній області техніки, що різні зміни у формі і описі можуть бути зроблені в межах об'єму даного винаходу, включаючи прикладені пункти патентної формули.

Claims (55)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або фрагмент вказаного антитіла, що включає антигензв'язувальну ділянку, яка зв'язується з М-доменом /д супресора Т-клітинної активації (МІЗТА), яке відрізняється тим, що зв'язування антитіла або його фрагмента з МІЗТА модулює або підсилює імунну відповідь, причому антитіло включає МН-домен антитіла, що містить СОК1 МН, що має амінокислотну послідовність ЗЕБО 10 МО:25, СОК2 МН, що має амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:26, і СОКЗ МН, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО 27, і яке додатково включає Мі-домен антитіла, що містить СОКІ Мі, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:28, СОК2 Мі, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:29, і СОКЗ М, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:30.
2. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 1, яке відрізняється тим, що фрагмент антитіла являє собою Раб, ЕК(ар)2 або 5сЕм фрагмент антитіла.
3. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що антитіло являє собою моноклональне антитіло.
4. Антитіло або фрагмент антитіла за пп. 1, 2 або 3, яке відрізняється тим, що антитіло являє собою гуманізоване антитіло.
5. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-4, яке відрізняється тим, що антитіло включає людську константну ділянку.
6. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-5, яке відрізняється тим, що антитіло включає людську константну ділянку ІдДО1.
7. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-6, що включає одну або декілька гуманізованих або людських каркасних ділянок.
8. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-7, яке відрізняється тим, що МН-домен антитіла включає ЗЕО ІЮ МО:37.
9. Антитіло за будь-яким із пп. 1-8, яке відрізняється тим, що Мі -домен антитіла включає 5ЕО ІО МО:44.
10. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-7, яке відрізняється тим, що МН- домен антитіла включає 5ЕО ІЮО МО:37 і МІ -домен антитіла включає 5ЕО ІЮ МО:44.
11. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-10, яке відрізняється тим, що антитіло включає константну ділянку важкого ланцюга.
12. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 11, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга являє собою константну ділянку важкого ланцюга людини.
13. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 11 або 12, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга являє собою константну ділянку важкого ланцюга Ідс1.
14. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 13, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга ІдСї включає амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга Ідс1, що представлена в 5ЕО ІЮ МО:61.
15. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 13, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 була модифікована для підсилення протеазної резистентності антитіла.
16. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 13, яке відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга ІдсС1і, який був модифікований для підсилення протеазної резистентності антитіла, включає амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга Ідс1, що представлена в 5ЕО ІЮ МО:60.
17. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-16, яке відрізняється тим, що антитіло включає константну ділянку легкого ланцюга.
18. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 17, яке відрізняється тим, що константна ділянка легкого ланцюга являє собою константну ділянку легкого ланцюга людини.
19. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 18, яке відрізняється тим, що константна ділянка легкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність константної ділянки легкого ланцюга, що представлена в ЗЕО ІЮ МО:56.
20. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-19, яке відрізняється тим, що Зо антитіло включає важкий ланцюг, що містить 5ЕО ІЮО МО:60, і легкий ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО:56.
21. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-19, яке відрізняється тим, що антитіло включає важкий ланцюг, що містить 5ЕО ІЮО МО:61, і легкий ланцюг, що містить 5ЕО ІЮ МО:56.
22. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-19, яке відрізняється тим, що антитіло складається з важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО:61, і легкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО:56.
23. Антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-22, яке відрізняється тим, що антитіло або фрагмент антитіла експресується в клітині, в якій дефіцит фукозилювання ферментів.
24. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 23, яке відрізняється тим, що клітина являє собою клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО).
25. Фармацевтична композиція, що включає антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким із пп. 1-24 і фармацевтично прийнятний носій, розчинник або наповнювач.
26. Композиція за п. 25, що додатково включає вакцину.
27. фармацевтична композиція за п. 25 або 26 для модуляції або посилення імунної відповіді.
28. Спосіб лікування раку у індивідуума, який має в цьому потребу, що включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла або фрагмента антитіла за будь-яким з пп. 1-24, або композиції за будь-яким з пп. 25-27.
29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що індивідуум являє собою ссавця.
30. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що індивідуум являє собою людину.
31. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що рак являє собою лейкоз, лімфому, мієлодиспластичний синдром або мієлому, рак легені або їх комбінацію.
32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що лейкоз являє собою лімфоцитарний лейкоз або мієлогенний лейкоз.
33. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що лейкоз являє гострий лімфобластний лейкоз (АГ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ), гострий мієлоїдний (мієлогенний) лейкоз (АМІ), хронічний мієлоїдний лейкоз (СМІ); лейкоз ворсистих клітин, Т-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, лейкоз з великих зернистих лімфоцитів або Т-клітинний лейкоз дорослих.
34. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що рак являє собою гострий мієлоїдний (мієлогенний) лейкоз (АМІ).
35. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що рак являє собою хронічний мієлоїдний лейкоз (СМ).
36. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що рак являє собою солідну пухлину.
37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що солідна пухлина оточена стромою пухлини, що містить мієлоїдні клітини, Т-клітинами або поєднанням мієлоїдних клітин і Т-клітин.
38. Спосіб за п. 35 або 36, який відрізняється тим, що солідна пухлина інфільтрована мієлоїдними клітинами, Т-клітинами або поєднанням мієлоїдних клітин і Т-клітин.
39. Спосіб за будь-яким із пп. 28-38, який додатково включає введення вакцини.
40. Спосіб за будь-яким із пп. 28-39, який пригнічує ріст пухлини у індивідуума, якого лікують.
41. Спосіб за будь-яким із пп. 28-40, який відрізняється тим, що композицію, антитіло або фрагмент вводять парентерально або непарентерально.
42. Спосіб за будь-яким із пп. 28-40, який відрізняється тим, що композицію, антитіло або фрагмент вводять внутрішньовенно, підшкірно або перорально.
43. Спосіб за будь-яким із пп. 28-42, який відрізняється тим, що доза композиції, що вводиться, антитіла або його фрагмента становить 0,1-15 мг/кг на одне введення.
44. Спосіб за будь-яким із пп. 28-43, який відрізняється тим, що композицію, антитіло або його фрагмент вводять щотижня, один раз на два тижні, один раз на три тижні, один раз на місяць, один раз на 2 місяці або один раз на З місяці.
45. Спосіб за будь-яким із пп. 28-44, який додатково включає проведення другої протипухлинної терапії.
46. Спосіб за п. 45, який відрізняється тим, що друга протипухлинна терапія являє собою оперативне втручання, хіміотерапію, променеву терапію, біологічну терапію, цільову терапію або імуномодулюючу терапію або їх комбінацію.
47. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що вакцина являє собою вакцину на основі вірусного вектора, бактеріальну вакцину, ДНК-вакцину, РНК-вакцину, пептидну вакцину або білкову вакцину.
48. Спосіб за будь-яким із пп. 28-47, який відрізняється тим, що рак являє собою рак легені. Зо
49. Спосіб за п. 48, який відрізняється тим, що рак легень являє собою недрібноклітинну карциному легені (МЗС С).
50. Спосіб за будь-яким із пп. 28-49, який додатково викликає біологічну відповідь у індивідуума, якого лікують, причому біологічна відповідь вибрана з групи, що складається з: а) активації моноцитів; р) індукції проліферації Т-клітин і секреції цитокінів; с) збільшення виживаності моноцитів; Я) індукції антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (А0ОСС) в клітинах, експресуючих МІЗ5ТА; і е) індукції антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АОСР) в клітинах, експресуючих МІЗТА.
51. Виділена нуклеїнова кислота, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло за будь-яким із пп. 1-24.
52. Експресійний вектор, що включає нуклеїнову кислоту за п. 51, функціонально зв'язану з промотором.
53. Клітина-хазяїн, що трансформована експресійним вектором за п. 52.
54. Спосіб одержання антитіла або його фрагмента за будь-яким із пп. 1-24, де спосіб включає культивування клітин-хазяїнів за п. 53 при умовах для одержання зазначеного антитіла або фрагмента.
55. Спосіб за п. 54, що додатково включає виділення зазначеного антитіла.
печатки нан Ї чи жккжкеннняня ї рак Есе ВЖЕ АР фен цобе й лику зн уч НРКУ чт оіцннкАХ З ТЗІ це Ві «кю ДЖ -ЗМКОХ ї де одер тр іт Н СТЕ МІ ве хамиреления : Й і 39 во зак тати і а їх я. ЛИНОМНННМИИ Що х 1 к сем х Її с оо. Е ЩЕ і ше : ! о і Я і І ї.їх і Х Ж і хі й іш | Ба і й НЕ Е 3 Її важ І: Х 5 Н ТА Я Н ї ї Н Н ЕЕ Н гі 1 ї ї 5 ї 3 1 5 ща їх її ї ї ї ї ї 1 ї хо 5 СУ 1 В: і і і 3 5 ї хі її 5 і ек Я : Н і ЕНН ТУ и НИ ік ож і РЕ 5 Н Кетуда ті їх х а 1 : їх і о У Х фосечнтиноя ня Е я ЕВ: ЕН Н ї КОМИ хи І гЗ ТЕ Умидумиї т 1: Її х ІЗ ї МОВУ І: і «УКВ ХО, Т й із ЕН ї Н 3 як МНН 1 ї я АК я : І г : і кю, Де М - ін МКК КИ 5 5, і і Я Ії ОО. і Я ОК дя ї їх ї Ї її 1 1 : ОК 3 і ООН. й 3 ї А і і Її ї ЗХ о ИЙ З і АоООМ, з ї у з ії І ш зак : БОМ СО ї Ох ОО м. : ІЗ Її Н і 12 ск ОМ АК МКК В І : У ТАК КК о ОО ї І Її ху їх Га ТОРТ ії ВЖК я ОКО а 1 ї І Не ї Н З і Н ВОЗ МО І ЩЕ ШИ Ш х і і8х Н І ї Крит і А її у З В ЗКдор ккодтт сетюрист вх ї. ї ї 1 хх че Н хо хорт ую ГК : З її Й х їх і з з х -Е - аву ех с хі ї Іа семан мин З Зх ЕЕ з Е му смажать ваасю сут х хх их з са х ре х т В й тя дерти В с о І су хм «ах ож 5 Ме я Б хо ї5 зок що з зу пе ац Ед . За КЕ ия ФУ В и шк -жу о сурехчх х х ЗтжвН Є У ек «в чук с; КИ у В де А с зікчсує ВЕ і Форуви ЗВ ЧигуУВВ АК що згура ЗВ ува Кк Жакиеюх за сих кам м й мітку М о У КМУ КАЛЬ мок пек ї ТМ й й ОХ ОМА у і В и а ск ССС КЕТІ --А-- 5 шкі «ОО КИ ї ОК роде пон ж а Ох В лек НИ СО СУМ МК : пк ЗК ОО о би ЕВ: А ИЙ : мі о та (зх дам х КК Фо ВОК я в в М й 5 саі ММК Ода Ве ех Й о фе ї і БОНН: Ми І ОО кож: Ії ВВ ї іже ММК її ав: іх ї Я Фодя - Її Ме Ку ї ОВО КИ. З їх тп сту ре ЖІ Б Її ке осн У. ща ес: ВЕ м ВЕК КБ осий і вс и Мне ха дм тя тин Ко ЗНО ДВК ж. КОТ БО З хх мх ох хо» хх ж ДУМ - АХ Її ШИ КА ще ННЯ с: Не З п ся г З ЗИ І ФО хз Фо й ж х МА ІКТ Е пріо ШННХ ден МКК кине А Зх їх зх ду як що х З ЯК ха план 5 рве ЖК хх : х Се: Хме зМи ХМ ва 8 : Ж су ЕК - З ине їх - ет шо ХВ з 1 Вк ннии: кі їх ОК: ща А Ко с ПУТ КТИХ І У 15 У дно о ах як т 1: кА и МОМ вес ЕІ ЖК КЛЕНВЯ т і і Н ке М Кв ЗИ о УНН ох КРУ Ж «ММ ІУ дитей СЕМ І й ї хх со МО Ха Ж нки пидежнтенннх ЕХ Е оц нс фон са ВООЗ З гу СН ЕЙ: скеЇ дж жтх. М ЗЕМ ке фігу ри ж зі уУра В и: Боня иа ЗА сна В Фвирчхіа УТ : хра бита МА знгуюра мих нена що дегегееесеютє УТУХ ТИ ТАТ КА -- ще й 7 Ач ВН тачка КтІкЖ КУ : ! й ХАТОЮ Ммако ОАЕ Воно СОУ МК ким ини Н хканинВ МК звів нини пнів зл жнива с НИЖ яру дфеннннннннно0деттрнтнннннннн ден ВНКВ Е і й Ві Н І й Н ТП Я 1 ОЙ ЛЕТ К яння іч кі Я й ї які щі ї - Ві і Що ї : ; 1 І - В: Е ; : З ІВ: В і « й Ї НЄ і Кк й ї ; і ІК ії і : КБ : кі КА і Її щі Н ї -щ в 1: і хі НЕ : НО х Н Шо Й Ї 1 з 1 х Я ї їх У. ї 5 і і Мі : 91 ! БИ : «ій Е ! 5 3 Н і й ! «Ей С Н А . і І Би у с З уічафен и Хесллстосст їй З Н жа КЗ хі і осстеететно хх й се У Жук й т Н І ом ох Тс х тн на Ко КИ НК ІЗ ото м Зоо ЖЕК Кканиє шосфеди не і СОУ ткянкно В хамам МК кання даті 1111... ЛУ. хх зи і І ї хе і вд АДМ Н ЕВ Н у і Ех Е Н НН Н 3 : «і М ; і Се і х і хаті Н Ж контрольний і - 5 5 ї М і і г Н Н Королеви В ЕН иВ 5: ;: І х 1 хх У і . КУ Н Бо Я «А : : з Ма ше | : чі Е хокею МД, Н З сою ! з х і ух ї МТА Щоки Х Я Хе Н хх ї й і Ям іс ие оо вкочнн Її Е | ЕОМ ес ее ПУ Ва ЗЕ номза ЗЕ а ех Уа хх МКУ ах ян ян : гі її Ф їх ї ек зд сх ну ве ха Ж ох : . ооо 0 НН Б ї Ж то М ГЕ ро щкОж ох їх - Е її «3 Е інн вня зорю я ЩО ІЗ СУ З о Кос см яд ІЗ х їх Зх ї є се МАХ : Кз х х в х лаків в у- и де ИЙ па знан ою ЗВ, Вс Й ех он: - як Хе ок ПИ ой СХ. Її дк -Е ук ж щ ої щ їкй А ї шо М ке ся де с - вс жк к їз з ке ше ме ря с во хх КУ м осі і хх хх Ко зе сх -- ж яке че х хх хх Сх і: р й й іа Ж ке ред хх ХХ їх З» Ук ко вх ж й ї- рез З х Я ш «З : х де З ї Х Ж -Е до м Ж і х го т уко Ж й х и всі ЩЕ Ж росі їх стзішчеут М Му
Міренмних ОК В ЗУМТАОХ один ват т - ЩЕ ном ннвн ноннанн жк І і «а : рю х ХО юмою ї у ї і о М 3 А ях в тюлю : : Ж Я Ва тео з ї руд ту кд г і - МВВ: мя ! КЛИН оно ня з у С - ї - Я ОК МИ у І. х ї пд х ІВ Н ї і і - х ОД В оче сосоосюю сон Ж 1 ОДА І ХУ Н у ім І: жи "КОХ Й ї кл шен ХМ : же Іон о г ість.
ХОМ Н ФК ди суЙ Ух - : СЕН Мами Уйохк «Же ЛК - хх З КК ІОВ : ВХ КО РОК х Моя БУ То, у ПЕ : Н МЕ З Ж в Н І ни о НН БК ІНВ: т і М о ЧАН ОЦІ ОН.
Я лю м ї ЖУК кнура Ну.
ХХ Ах о хх ОЙ : п Ноя У у : У - І : ДТ : ЕК ВУ Н Н оосолеедоовоюю С ТУ 1 До Мдия паруют ум я со и пармво ос пиасоо зламана і ях я ; х х Ах ЩЗ з в жі омбоож ка к су У А БО СОть Фігура БА Зкгура ХВ пи ке їх : гема ндхх хек ІЗ МКУ Кее КВЕД сю В Й МК КЕН ї ка хе 7 І Я І Я УМ . - пюосякх Й ї один, доня інничнння Дін Пн І ще їх Н ках й ї -- З ї ї х ї . 3 І ГУ З : КЗ ї ї Е ї Н : Ех х І Я З ї ї 1 : У : 3 "ЖЕ : х Її А вх Н Ех Я ї хх ЗЕ ї ї Я х А ї : х Е ї Я : З : й ї їх Її з ї ї Як : - Б ї Кг Кі «кжех хи їлІ Оутхк х ж З й : і к й Н «і В ї ох МИТО КЕ ії» Ще ін ї ї ох ї ї ї 3 х х Б ї палої 7 хх Я ї ї ТИ І 3 3 і -к 11 : : ї ї х ит зо Ку 1 є МНН х : Бо я її ї У як її : які ЯН і рови ї ші 1 ІЗ І: ї І ї мог ж тру 4 ПИТИ т ж ї ПИШИ у сег Же СК : і 3 і ї ї сс: ї ІВ : БУ їх ТА Я І: у СЯ 3 КУ Ії р КІВ І й Що ; Н Ес І 3 Б : Во Ве І ї КОПИПИИе ї ї ах : Зони, ї ІЗ і дом обоєсввюоєї пс оту ую ОКУ люк х : КЗ: ЯМ Я мово І: ії хуя ІЗ ї МАК КККТААЖКАКАТН КК КАР Ж КК юю юю Н ЧА І ї Її їх КО ко о с с и А п ПТ А І в а ще ках пустки КЕ ззикснх ДТ «ФихУра 6 шнура 5 ЧУДА М. мех ухдо ЕЕ ки ЖІН: І Дт Й РК гусак : сек туги щ І тез яВі : се МЕ квіхнни тя Ї ЕОЯДЙ «В МЖ гр т еконо МК.
УКХ ВК ктТнаи « як КО 1, ВКА ЩИДЮ Т ката по и дику и уия -- 5 й Зої МАСІ В те Ї шу -ї момоманх зма ІЕуТржвит Хі хх ЗАВ ї КА юю хиоцках 5 й і ЯКІ ск ї 7 І ЗМ І: ГОЛОС м З Н І косдудних : КН ВО якої 0 ї і 0.0 ! я п: ОТО: се ЕМВ А ЯН і ВО і і ЗК і Ж які УМО Їж ов ж ЕН ТІ де Н Ханчтеу Х х ї лю Кока РІ ж КК: НД Н Ана я їх х ККАВКВКК, 1 КУ «СОМ. сою І і ї Ше ЗНУ -ж 5 ї КК Ко КУ ЕН ох КОН : Мох ВО Можна КЕ З я ї де АЖ : Р оашуд ит сх : МКС : пах МО СК ї 1 АВ: : ЕОМ іурахю ї Н КЕ оо : «ОХ лих і.
ЖЖ КОХ 1 Н ЇХ у т ве В і В КК ай п В У і РО Н І 5 ! УЛ: ку І : Її Фе ВІ і Її ВН : во ТВ Ко ЛОЖІ фо і дофренсюняні Й дндикіуй ДУ ДК НЕ ха КН й Хе ї- ВІ фест ВМ Х т БІ Мк І - жк шх ох хх охо и ІА І У «ох х ря хх Ж Її "Б и Ах пулу - ЕМО Е м поси Ж охе ММ: ВЛА ЮК хни ее й; 5 СК оо ЕН ЕЕ й вже у. їде ТЕ: ПЕС: Р ЗВ зу - шо ее р У ЕК Ен ЇХ хаенине Ееж ПО: й КлАх х Ех: ЗМ з хх. и, піч -и х р й УЖ игруі А ВО кіл Фунт о в КО З У У Я м КІТ ИНИе и Уч З й т сових тура ЇВ Ягода ЛЕ ЗНАТІ гіч В скудно МІХ істину МЕ «фігура ВА «Внува КА уп пишна НК т М В ї ох х ЕТ соки ї ОО Кк ка вО ВК МЕ капнив і 1 ЗК я Я і ; кі і їм | Й ОС усу оухітх кі г ІВ КО й ї К-т Кіуцдтуміте ПИТ ЦцИйх і ЖК клинни ЕК МЕ: НИ і БО Кинуроак гине Е ЗЕ У і їщи і-ї ЗЛ і Манн х 1. з її, М : м 4 ї й Й пихи і хі і |! ік Є й іі | Н Анте КІМ д ї ; і со ОК; | ххх ЖАХ 3 і жі ОО ви Еш ян і . кій г іже 13 М. ДЕ ЗУ : ї їх 3 (У Х ч ї Б у У і ; і Кубок сеснк Ч оіфккх па хнкчннежс бро с «ої Я Ї ооо я Мово ОО ЖояМ 1 СЕК інтаюти ЕК вам у корт 1 кру по З ї ТДМУ нтаютх УЖ пам 'я ТЕ інактні ЕЕ пдашояті Е ї вини а а в я дек ниття Екон у ДТТТЕН Ен уттиииту х А У Н щк ху ї вс .. Н ; З я ім В змі Ж їж та ! і БЕ Ой ШЕ ер В Н Ок уд чугу, їх КЗ : ЕЕ: Я ї ТОЖ Н ОЇ кання я з ГЕ ШК ШЕ а і Я й ОБ БОР. Е ей і ше ще ее Я : т а ни А хг Н Е Н ші? зим щу Н Б : ї щу СОН ї ОощКії ї ок; ї ї Н Жов ЇХ Жодне ОО : В Я ї Коесесвснвнь Ями ек ДМЕ - дмУМ осо селом Я їх о я ск З ВЕН ВЕ ооо ооо МОМ мок сети, г І тус бітум МЕ Кегчіхуксє МЕТІ ТВихвз вий гу ра КЕ Чис БО : і :
с. Я чі " ВО рев ковки : БИЙ ; : же х х знай ках, Ж ково ШКО 400 ОО я Ох ок в ше их до сх" з мох К ї росі . 1 Е жає Ж ЕК збе. п Ж Е щ й р М Е в: й : --е мої КЕ з Коси Й ДИНЯ я з ше ХК З З І а ; зва в Ж КО у ЗХ кб, КВК мк т НИ в і я сх С ; у» в е Ка ух я «ВК З дв т т ш їх г 3 т - Я : ще т Я шо ля М; к м БК хх М шк ях -у Же Як ще г ге Фе ж ж х х Мох хе дих дк ще «-к МУ с ; З х Ех : шк - - Хо - х ; : їх - : б я їк Ж З 5 я х - а ру х ХУ Я Место ВЗ МигУЮа я пе МОУ КУТАХ х зх у з з щ З х а ВГ СОЧІ АНЯ Се НЬА-ЛЯ дення одн ттонннния, рекет фін вно Ду СЕМИ нят ка 3 : ке яку у РБК: Ще і Н х ї : ді і й І: і: Коти хі КУ ї Н ЕН : ХЕ ї ЖДЕ п : Н Не зе ПМ НИ БУ Її щі В : 23 й Диня 23 і і їз х ТУ ще З ї ТЕ Її М : Пк, : «І Я шо Ж 1 ї еВ АК оо ВНС 1 : АВ ННЯ Я ХХ і х: : Ж: рю гово ЕН : т хх: ЖЕ : х Ї НУ : 1 г. і 1 : шої г : ї ВІ : У ня Ві Н І : ВЕН : Х щк 8 1 ї Мам дення І КЗ ї їх Н Ж: її ї ках ЕН ї У х ой ї ія х ох : ї ї 4 ї Ж ї її : є 1. АКОТ че : ДОМІ їі : ЕЗ ії ща ХЕ ї Н Не і с НЕ У НУ Ї КА ле : Ї ії Н Ж ОМ: Її ОО : кКуяу УК : з СІ : М ОК С КУ І: 3: яку НЕ : кл МАУ А ВОК 8 МИМО 73 ЕЕ : 1 жк : ї ні хи 1 «СПЕ ад нс а х Й хі хд, Н ХА к попки КОЮ ням я ЕВ кову титичя дин 9 Мк кн тн й Я 2 М - с З З З ї х ї н лан ЗІ хом мі ЕЕ ок Зо я Мом» цім тег а суха х 7 Кзвіивива ліні СН ЕХ сна 3 Ох сміх - Бе вх и КАК Зх Здесва 134 :. дих Нива Й - й пив ЗХ І Фитра БУ ее ЗО БУчИ ск бита МК е Банжищи пос і ї БК 15 ї Кох : ж їі і З : Є : ше НЕ. ! ї І У ї НЕ: ї : З. У і Кий Кантриль КРЕМНІЮ мі як ї ще З ї Н п ЗБІ 1 Н ї ох ї Ж: їх : нос их Її : у ї КІ ї Її Ж ї Н ех ї І си З УЖ и щі : я 5 і в ЩЕ І зн УЇКТА Ї М Я ї КР я : "КУБ : зкжкжнкм ІЗ ; я Н ме ЩЕ і Ох : ї З я ї еВ і і ва х ї З ї Коня Н я. Н ЗЕ Я ї Н ек. З ї Би Н он х ї др нан ЗХ са підюкнл Во окжккмкнрн з сан Мкрчнеенхнунй Я домо оо ях ОО КВооах ;
х. з С 5 (щ- спро А Миув ії обігу КВУ Чнкува НЕК ГУ Ма БІ У і 20004 х х г 1800 ш - 5 888 ш - кл я ааоюх ма Ж дк А Оп и до ою -- - ХХ о» ге шо ще ЗМ - ще ї КД що 5 Ес; КЗ Ба « мода т З ОО У пох БЕ НО. ї ІЗ Її ї п м ще м - до М се як У іфчктуєт ХВ «Фігжра 12 дев уран нн нка ння Е ! ни ши ! Н Ж їв рожк пк ї , Е РЕЯ г ей ши ї : ше 1 ї Е хо ИН ше щ- зах її ЕЕ Е г 4 і ' шЕ Е і Олі і як ЩЕ КУ (у х Є ї че нен Б шш / | ПЕ : Червосхнвя я УА КМ Я : | г; хі З і х. З Я і ї Аз х сіті і ; Я МО бен. берваєтх з й : х прес ую Кк Уж А Б вбоюо й й с ; щ м о й й УТА зВігуВаА ТЗА Я КЗ Ура ЗА Чирва 15 ще я рт Ї х ! ; поп ТАЖВ оон КАКАн Кі ї і Ж і Ї х і і Зх ї і ї : Беж і ! г ї п і ГЗК ї Но і В І і 3 Мі 3 і х х Н Чі ! ї : п Б : іх Е ; | Я З х 1 ї Ї Мі |: І ХМ 3 Ні Е НУ Ех : ШИ ЇЇ к і ті 1 БЕ і ні й ї і їх ї : Н й : ІН х і й : Р Н лети сек тлячнниХ. ОД НА і м ЗДУ й зоісооогосососососос з свя щі й МТА Финуря С її і ЗнНрУва 133 НЕ: я Ї тт шу дкптеотеотетоех пише В ШЕ ши ша п Її п. Ж і Н ж ї Кз Зіни ГВт с: ЗХ ЯК КН з 13 ї х В Ї 3 роя ЧЕ ЕТ ВЕ ; Он М і УРЕ ЧУ ; І В З 3 ше : 11715 : ї ї З гоп в шини Її ШО ши орввний г ветроль ві і. ММ ЕЕ І : Е ч
І. ши ши шшеше ВШ о Аороної людини : ОО ї ЩЕ 1 Н ї ЗУ Ї ї рочки ами КОП 3 З ! Є і З 1 Кв КУМ Я ЕЗ і З ЩЕ : ї : У | Ве вени ши і Є т ЕЕ і ї жи 1 КВН» ЗВМУНУВК, МО ККОМ ка КестоЗн | : ; й 3 : ї я ц : ВО жор Я ний ІД КК ях У і щаком легені КАХ г г Е Е ; ! и паче усе ме не а та і ІМ Фігтрв А Фігура 155 УК ІК З чІх Чирев; й ; фігура ЯК Фіртура донних, щ ЕЗ І ї5 зх М: ПУ я кюку ум Кк улАААААА ТЯ І гу ЖЕК. ЕЕ ЗІ й щ ТІ АВК о Еш: ШК ШЕ Е З ЖК еко ад тій Ж і Ї т ЗБ Рг Ц ЕЕ в іч ! шк Р ЕЕ КЕ іМерний -ЇКи НН НЕ ЕЕ НИ БО щі рве ЕК НИ о А У І М Ї ОЗ я хан ОБ І ШЕ ши шишЕ З ; А : ШЕ шШШЕ ЕН ши Червоне ксоекроєть вій о ВО ж і 1 ГУ 35 : ї ї х 5 укідогухі ж КрААЄ мех п а ЕН ши ш ЕЗАОБОВОЇЄ людннив ОВ ГЕ ЗЕ ВІ З ї і : нЕеНТ,: М ОО її ЗК: і:13:2 : ЗЕ сві . НК КИ МК мли кни ко и М ЗК ДИ Б : : з рій ді КИ НН як 3 Еоаком ми кмин Є соя бе я з раБшм чи: киВнн СА хх Мауеюх й 7 і х Ії пееннофь нн ЕК НН ОА УТА Здучнух ТК ЧнагуУурва 15А ЧиргУйв 158 ча Ії ігура ЕВ ЖагУва ЄС х Ен и КЕ; п нн х Ж ГУ 1 я І і Зх і 1 у ї 3 У БУ З зх Ко ХУ Н а НН ї: я ї С УК іх рах ї Уч ХУ (е ї ія ди: й хх КЕ Н ЕНН НК Е зе ой ще ше ЕН. Е; х ї НЕ і 1 й Е г іо ервниВ» У КА КАН жк Й з Я Е к ХЕ с їй КУ т зе 1 Я: 3535 і І ШЕ ЯЗ: Ж жені зба ! ки рт Ух її Сн - Мавих х х У У їх ї м і м: АВ ТВ Її додкцим Мідяця 383 А Ї х т З ЕЕ Ех й Її ЕЗШшНИВ я БІАВНИВ У х х а д. х у ех Я ї 3 - я сей ДОК ок. З Ж Ж я х Гівад нині - ін З «З а - й х з ДНІВ ВВ я ГУЗВЯНІЙ 2 сх ; зл о однин Ж 3 ах де й шо Мовний Мізнуца ча їх КІЗ а ї 5 ХНН є РИМ чех ЕС У нн и НН гдрмту ТК ува ЗАВ Чигура ТА біта 15 ке Дт ВВ
Ж. З ; НУ ЯН я АЕН ік
МАЕ. ЕМ 5 НЯ ГЕ шЕшЕ р ЩЕ ї УТ 1 Ж ей З ее У і,
Ж. зЯ їх на х і ще ЗЕ З І Вів ЕШя і СЕУ За ЩЕ ЗА Н -к - і Ж: 1 х Ех ОХ ЕН Е , А сх Шк ет Ши і ЕВ ооо й БЕ х м і ЕТ вонасмй р хи ії. Я ЖК орюодужедюсся ; Зона х; т дкдехюуюср и у ск З ве же КУ ню я З зж я Мав оо зи ФинуУВО БО Янгтра 163 пф нн вв в о в п п п п й їх Ім Денна нення Ж НТК у нення УК НУ КЕТТ КУ с К тт тт Я Я ї б. щих і З нин о БЕН НІ ЩІ, ЗЕ шМмю МЕ : ЕН НВ ЗНИНе ЗБЕ ї ї ЗЕНИК ПЕНЯ: УНН І ДЕННЕ НН ЗЕ АНКНЕ ЧЕН ННВО МК ЗІННІНН ІНН ЧНІ З пу ГЕ п и п п и т п кю ДЕННЕ Не ЕЕЕЕКЕНАОЙ КОН Н НЯ ОБ НН НН ОН ВЕ НК ОН КН НН НЯ ве : ЗІ : к 8Х332І І зУ5зхї25х. . й дв ЕМВ М НН, що НВ "НПВ ую тт ОА в о Во а А ев З В А и А Ве В В ЧАН как Віти ВОВК одах ІОВ РОКІВ стук за я Ек В Ек м вв п км ВЕ СМ В о ВО й ни: Ви НУ г їх Ал НУ х дах ш й х кох ї ОО х 7 піт 1 Читура 7
- МОВО» ї : с : ой З реа З сестру, що МНК укооосіоосоо ЕК ОТ НУ ТЕ Ка ї ШЕ шо чати ще у ї ЗОН й ші в ХЕ х ВВНЗ сесія ЕК і Мо сек -х ВО з щщ КОС де ШЕ: х ЗО ОО ОЕВ кА о Ко
Б. шо вн Ш ЗИ Я І Е МПИЛИПИИИКА : Хннн х З ЗО; ї ОХ оби оно Ор фекнююнннкі сн рт по х ах і ЖЖ бе ВК ; АУОКе АДЬвНУБТА ЧФигУурн і біілуз 11; сх сту Фігура ЗА Знтена 19 І й й ї я «У з КЗ Кі жом Ж і Зх тк За ж за хх х Я ж Ж ях КОХ ке Ж са. -е Ж | ї її яке КВ ще ва З се 0 ЩА де хек З Е: КЕ: 2 КЕ г: ж ак В Ех КЗ А; : Я ще хх : Я Й ка Кк зв Ж ДОД ння В з фф и ВВ ЗДУ Б 5 і У з Ж ІЗ Е З Х З 5. ПК кан : Попа Фігув а Б «фуд кт ТІК бах Є ори хва ЗВ ) -е М х Бе -е дек ВХ З З зако ЗВ ві я т хх й З сяк Зв 5 Бе Ве тео А ле ха БЕ: ще КЗ Май В НЕ. ев з че ЗЕ як ТЕ | зв В. ще ЩЕ ще. же В. ши зе м ; ; ви СЯ ко дж ВВ ОВ ну й є яке жа З З гЗ г 2 ідіом В о совет, " М мя са ек п ПКУ ел мі з Ж х гу Ну що МАУ з і З ря що з | Ж Ку З Фігура ТЕ фитра 1 | з МЕТІ Й «84 З З ще як з Яр най -- Ж Ук. є Ж Ка зе З ох ж я оку КО се ЖЕ В сег тез І х так ВІ х і ек В Енея як ще ща Я ее Зх що ва: як я Як с Й так і КО й ХВ во з «КО а кн ззекн уми кекс ооо ососфоюсоо в Є чадх Ж З 8 5 Х х з Б г Бу Ж х З зх Ж Пимеюхих ПКУ килюй
ЗХ Кн г | т Е г | ще сам З ЕЕ: ш дез З Еш: ху іуловий НЕ Б БЕ і ша ЩЕ ШЕ Фигура ОО с, й п з І Е З 3 де Звава : 3 ме тік уц І З і Х ще ї щу ПТО Ж ІЗ ОН УП КАЛ ше Е і Ї : ЕВ х о З і Ї ха їх з К ї і; х ІТ Я хай ЖЕ ШЕ НЕ кн Е
МОЗ. ЗБ КЕ: т я. їі ї НУ В ЕЕНЕЕ НЕК ШН ї 5. М Ті БЕ | І; Е З ЕЕ ЕЕ . ї і з ї ї ї х Ява с х ЗЕ ЕХ ї Е- КМ НИ А НЕ В ж дов жа ох хх СУ КЗ Бе т і шк Фирурва ЦЕ ту ЗР са с ВВ. І Де уст ТЕ сх ца я КІ я ПЕ З Бо БУ БУ КЕН т ее ї 4 ЕЕ НУ : Я ще з ЖЕ З З : ме ШЕ НЕ ХЕ вка ії хе й : їі ШЕ ши ШЕ. : ще ЕЕ ШЕ х за І ї Х з Е ШЕ шк ВШ ; Б НН. х ПИ т ї о Я Е зад ех и ва ЖИ КАЖЕ ННЯ од о З: В В СЯ с и НВ СЯ З жізвемть вважа ФМ жінькть зитя 2 і яз : й Я ІЗ по с угунуту НЕ й З Н Ки і стару ЗИ пе ж ЕЕ с Шк І | Ффігува 2 4 БЕ : : : х зн ВВ Р. и шниЕ ще - З 31 ; ХХ Б М окт дом ах хх ї У ях Е ЩЕ я ТИ Її Ї Е Б ЕЕ З ях ЖЕ ї по. БІР Е х ПИ жк ї ї ї З ПИ і У : с шк МК ШЕ ЩЕ ше КШКЕНЕ ТЕ Ех З Її ї ЕТ ЕНН ж Ще ск см з ода ж х ЗУБ пе у Худ с в С а З ВИ МЕ ЗНО. т Бек Її кількитьантиле Ті кількість виз ехів сексу з есте; ПК ЖКЕ пів Сід пигупаА СІВ - сві у ща ГЕоехудгм Ф чх ЗекрекуУ НЯ Лов ай» Динюр'є: Дюнер оз» Донор БО КВ 53:33 зе ЕК 5 на хе - з Кк ІЕЕ Зате ЗЕ ЗЕТВЕЕ же Удтвтх УФВ УфТНУ УБІК УТІХ ЗбтБЕ -о в БЕ Я Оу Що ЩЕ в. й: ; зе Б ЗБ 080 хх Щ ши г З Ще ї ЗЕМ 8 . . о ШЕ 5 З щи Ху: ЗЕ я САКЕ: ск: КЕ: З ІІ: ек ха Ж УКХ Ку: Ку: ЗяХХ: ЖК ж ж щщ ж 55 ОК: ІК МВи У: ХК З х З. У ЗБ ЖК: ЗХ ЗЕЖКХ КЕ: КУ: ЗУ з но и: . 5 шо ва «ВМ не ве о ОВ ва У : ск КУ є ч ЗУЕВІЗЮ БТІ ЖТВИХ УУМИВ УЗ СУбТВа зві ЗИМІ УИМЮТЬ ЗБУЖОЕ МІ УТ УР т З ЖЕ х У Ще В. : й тн бе З 5. ІЗ. кн З о щі Їду В з 33: шЖ КУ ЖК ях хи ХХ чї шо ВЕК ХВ ХВ СЕ: ПЕ ї ух З ТЕ КК ХУ. ЗУ З ЗУ У ря БУ З УЗ ЗКУ КЕ: ХХ ЗУ що о ЗІ о че . З: В З "же: 5. З . БЕ. М, З ТЗ КЕ ох о их 3 35, ОЗ А ОСИ Окх Кв: х ЗК Я хо ЗК 8 з аа вв у ТЕЖ ЕЕВЕНИ НВ нів Ва а киш с в ще ще щшктіна ; У ті сує ЕК ияжх уми Хуг ст Фигува ЗІ Фнура еВ
Денов я ЗЗВЩЗ ги з ; і х ч сво мнк я ку вжи вах: "ТУ УБТЖНЯВ УБТВОВ УБТИКВО чУБтиа ; т Коза і ще чию Бу 4 Зх Чигува о зт Те ЮК За. | КІ ях Ка Ек НЕ ща.
Ук ЗЕ МА Ж З к. же ЗК Я. «З З ЯК ЗЕ мя я у я В ваз я І ЗЕ В ВЕ З я шк ие Я щи У ДУ КОКО Я хв МНК о де и З Ки Я МЕ ВЕ З як І Х У ІЕЕ РЕК ЕЕ ЕЕ я КЕ ее Ве уні СЕ ту ТКУ -- ВЕНУ ЕЇ Т що Фитура сов С ЩЕ ех ; ї ! шк НН я 3 б: КК ШЕ КБ ших ЕЕ ші Р В а І шЩЕ яшщщНІ ЕЕ ЗЕ ще ее, ВВЕ КК и Кк а З ки Ви иВиВВ с кжжки екю в ВЕНА 12-9 жЖналюованив- нас Е і - х шу м У Е од ттттнюттннняю ЯК ВКА ен ПЬЮ сяк ОО т : я ЕК: У ща їх ї Ух З Ж г Кох зда» КУ х ї гу ; ; КІ ї І Її ро щої ЩЕ т ЩЕ. жом ще х ї Ху о ЗЕ ще в БА скит Е 12 де ОМ юю ккал как кличу х мих з па в НИ й ї З Ї окт ТК кок жна ТНК. йон 3 Бе т я ї Ж й ання М НО НН В Чер сі жк чит тУра Ка їх з ее у -- ря сух ; мм Теждевв і Тиждень ї Гиждень З Тиждень Я ня Кс о о АННА МЕ М ИН ДЕНЬ г й т ва вн в жі У 95 85 Ф ЗВвеленния вити УТА Фігура 28 яке Коверовми а : же ке ї й т 7 те ее яких «і ДажринцН У тА ід А лов УА . КЗ де Ж : ЕД кн ЗА Сай МН ва сок пк з їх «У дв Жов -к Ким щи З «ло Ви Ше : с Зм зю д 2 ОК ююкрююкккккккккад юка Х и ред Девь в в гу я зе щень зрігжра 25 А «Фігура СОН МОУ РТА ТАС АМ ІА ААВБ ОРУЗАККУАТРУВЦЄЯ ЕБОМУЦЗТСВ ЦОРУКОНОУТЕУКТУУТ ЗЕВСА ВАТРОВІНІЕННООНОДАМТУНІМ АСК УЗАЗОННИМЕТ МАМИ ОБ СОУ ЧЕ КНИНОЕНЕУНСАМЕ СТУ ЄТОКОДРХ МОУ УКРОЗОКЗЕМН ТАКА АСМОЕ НС ВЦЦ ЕУУКО КОДАК КАСЕ УМ ОН ОСТЕМРОБЕДЗРВРАОССІРЕАКУКНЕ БУ УАЙНОРЗЕЧІКНЗЕРУТРІ ЗВЕР ОК КО НУ МОЯ фігура се х 55 ня й дм : шо сни: тику х я КЗ ная кн Беж ше й Ма ООКЗОИК ка Ка З ОК За пиши з ОК ех У ЖК -т ох: Пе с АЕК НЯ Модне 2 повних шо і : п таокУкт Ве ее ВЖК ОК ве з стакана: ще КІ УДК мое МКК ДЕ КЕ 3 ДИ ЗУБИ кизатьа я Я ух КК ММ Кия КУ ЖЕ КУ ех й м РЕК. УКВ КЕжавІк. ВВ ЗВ: ЖЖ ке ее овУнан дока ох Жвиие яса КЕЕаи.. ИБЧкааАК Ва ЖА Ве фани ее я ЕХ ККМУХ пеня знане. зо ВЕЕОКЕЕаКЕ СВ ХХ я КОНКУ Кох лох ка пря ме нотканне ОІНЕАОКоКЕХ Теважее "ВЕ ВЕЖ 5. Кр Сх ке . овен Уа. пуття САВКККУВКК» ДМ Ко ХУ дея вачее. УЖЕ кни ия х пис поет ще декана апр е Кв и маки ВЖОВЕХ: о Ух оооове Ху улякю ах ект Аж жжК кухни ва вие 5 Щ ше мае ХВ фі ЗЕЖХУ і шо рн «а жо че св ока етА КТ, як ї ШИ З - жнннк 5 жд в іх вне оптнннуннню сових ДЕМИКУНМХ хх Ух: ЗУ МОН У шк як по: ХЕ ко КК ок кю ок КК ооо ник ооо юю С ше їх не Ше прик: подо нс Я В. Й ши щи щі за: ваоене. Пн не й сокаовкса тен х пенею паю Ку Жекоя я о МИ ше НИ чех ОК межи х К ЗВККХ пе як шк х. - Зх ЗА я не к нен АВК зх УТ ве СКК КХ Бех ВЕН ОКХ АВІ пеки а ко.
о . п Ех КК ХВЕВЕ ЗІ ххх ви джцхе УКХ УВО и Ж КН Жазстилкєкх ща я Делим» не Еки ще св С Енн ПІП ОН коки тки У КУ ЗО Ж МНК ПАМЧИТЕ ке ам Вих ХЕ МЕС м Ех сп шт гам Кіднчка В ах ТУ КМ СК УВІ Уже ХО хх т жк г іній Й шо б пе З ве Б Гук я ке БО КВ З ААУ СЕМ я У с й ск я Жуків УЗ ЧАН УМХ осо дог Я -е далянах Вико сосок КЗ ни он зо й / ще ЩІ що СЕБЕ дво Ми МВВ й вон КУ менкя З ЗДИНННК КОКО а. КЕ - НЕ Как ОЗХ ЕКО. кл у ВК я М КЕ; ооо Е ен ЖК хх ку ЗК аю, ОЙ ЖОВ ЗУ КЕ КВ я «я ва» Ех ОК осока. Ме хо ех ща : ще хх р. і ПІКИ СЕ оове ока хх Ух ЕК ОК КН ще ще УК ОУ А кох КЗ З жав яка с ех Не ток тае зд витоків ох Бе МТМ ЕМЕЗ о укжвнк. АК КУ З В х Енн, не Ж сх са МЕТАН я ВК ЗЕВНВОК: МКК: ВеВК КО ЕК дедеч КМ МК ЗУ щи ке о МЕМ ЕК тики нак ес і их пи я шо о пнонит НЕКУ
Ко. УБтКАВВ В Є ОКА; Сх сах. Кун: КАРЕ МЯх и ЯКО ЗКУ Ж Ох пе ; ух Щ шо
8. Коло мить Х с ЕК ОНЕ «фа: ПІД ОН кокосом -- ХукУ ОКУ ВК СКК Кок ККУ вес Пон На Но КУКИ к К 5 ше пишна Ма ДНК ткее ну Дощ: МК ренимевсвНи шк нини три с яр ко я Й пня Зеенен ХЕкЕХлаехннно зви зкеаосех і» бенкет шк ЕЕ. ов МОУ ен ШЕ в сссхкво КІВ С ше ОО Ал З. Ома СУЯ м дх : ж ши КА ЕВ КУ ОКУ ХК МОВ м» Я Зак а як : І я с ж с й с п а с: Му м кВ ее аа ВОК Я. вет Сехднна КЗ АКА АВ зви ь кевкх нова ще ку КО Ва Кук ур Бех ак ее ах КО : о т, мо о оон хх ох о. кичне А ; Жук АК АхАх срок 3 Ох п о й КВК вт ЗАКО ХВО Б ВК ши | Й Зо - ЗВ Ме КО що ХК ЖХ й КК КУ щи ге зокре ж» ще дивних о Ме ння «нев пис Я сн: ще 7 - З те зе: щу ХКОКЕКХ їй варив ЕМ ке Зк: й «а ше сен СКУ ще: Зах що ех Ме жк КУ КОЖ ККАВА МОМ й ЗК ов зве не в пек ж 5 : ї оо і. : ; г Ка ОК КВН рос Ех оф пк КОЖ: Зх Зк о ше, сх ОКО Яке В ж: пеохе Хівих Ен ех п ни МО нн І: . Пракне екон Куох ще Он Зх оо І зов с г ще : їв а ХО У ОХ ОК. ЗОН ши що ЕКО КК ХК ОКОУ ЕХО АК ВУ К. У ЖУх. щх ва МК і ВК м 1 С с. о оно в ОК х о Ко СО. ех В ОО зувех о. с о. ПО БОС п КВ КК ОН. З в . КОХ ДОК сх М ве СОВКЖх КЕ и - х КК КУТ в ШЕ й 7 | ру куютя зх Ще; ї Й а
Й утттитетннкнакнх х Б їУ ЕЕУ їх ре м к за в У а фак «ЗК їі жхзке заз УКВЕЕ ВІТ тову» ВЕТИК ЗКУ тати захЕх вих воза» хів ІВ «Ві влсю ВК КЗ дучеу З -їх Ух цп Клен ХІІ: що : « ЗУ ск юю юю Кк КК й Бан З м їх зе з, 45 ж зе Зк ШЕ пе йон» мар м Жжкав: Вінки ав» вІкзВ ухБЕХ ЗоаА ЗКУНО ХІБІТ ВИНЕХ ОКО усе жткіВ М хе ежежюююя дах х КК - м І Я Ба шана КК нен -к и я де у сто ше їх зафо ру крре я огз я їмо Зеуф веж жк яхт заздаа яки м А ВнИ зМБаиВ кіст» хна ик ж Авц ВІ ве ин Зх Х Я їх Ж Х ши. фах еако ви кю хо конк Я ЗА АЖ МКК ОМАЖ ОККО АЖ ОС дою г. й ц І вано оточити 4 те г» й Ху; з яд хх в з: ва їх ЗК сем з укчку ВтЕКт хЕРиВ оту ЗАВ врУМи ваВУТ хужу» тизии шЕЖТОЖ офІНИ В дик дк о» хи Ме - нн: ровррооввов у я ВК жде ш-- х Й Ви: Е ен КЗ Мк КМ В: фея ОВ г Мяннйх х їх Шк Ух Мкееоююткихх 5 Х лидалелнеледюєетчканАнААлннеАкьни дккклнкнтатАКНи З 5 о еок. м. ж же ж але є о: о З . але Нас з за зх а г Ж ей ще пе о ех айс є ВВ з тов Яевео сао» отзно сади покжа БОНУК зтхат вик сьвха Ус ткхв зах зе: ВОШІ сей В В: СЕ нн вн - КА г. винен й сер оС ей за Я їк 1 це Ук т БУ мі 1 паца шах вк х Как х Ахах сі» ЩІ Іі вайпа МЕ зе щ- г о її Е КСЯ в и Чагура В ж Е сш осі: вань ос З й й ЗК Я жоня - Х ЗХ з о сист ав КК КН М х х са Гай о ЗВ Ка Ко ;; Зх с век ИН сток - ее М
;. З шо ЖЖ ТИВ су Ох и и нь ЩІ З чо ве ей 00 Бе же Кох ий Ба ОХ ГУ К-х о с: Я Б осое КЗ х ЕК З в чо дих Б т ОК А І я хх М В М ЖЖ я КЕ,
т.3 МОВУ У ка Я днннни Ід ЗМК УЙ Кодак ЩЕ оси М Ожех НК Ух а ИН аа НН ї ж ж АХ ово ДОД. о ШО КУ: її ху у як ОН Ку - а. Х ІЖ А КЕ І Її Як х Й МО в НА сив и ши ЕЕ Шо ше ПА 5 ШЕ ПІК ЗК УК ї К: ЖЕ З з Ж М с : «ХК Ї Я КК с СК: Ж в щі З С ах Ж З Я Кр Я Б ме ху М КЗ к 7 КК М. р, КІ Ж Ку З ї; с їЕ ї ОВ ЯТЬ Ж ТЕ с Ку а З. ах МЕ Зх жа КУ З с: га З ; КВ ВК КУ: ХХ щи Я З В Я я З дк Я ВО ше Е їх ою с: ва я ОМ Ж - З Ж ї ще М. ЗБЕ й Е : Ток, ж с ав В, о же че Я а Я хх х Б ; Ко ож Ко з ЕУШе ВЕ чИ Я 1 ній у І х х Іо ую й щ я дох «ж г ду го БО Же Б я ща і Е: : » і а Е є і з ; їх ї ГЗ ї ї х х ен о и М и вн АЕБУМІКЕКІИвиК У КК Мао МЕ УЕТУКТКаАККИКУ БК ТОБК рий КО Я х, я як Хеннняня Моллі ШОВ и ЕЗКУ ТЕ Ж ЗО ЩО хх ї су : х З Ж ї с і х Н х ї х х х ї ух т ка Ки ж и КК ох т Ки х Кри дик Кк ках ТВО ЗОМ ОКОМ ОВ КС ВК Я хх хе ОКХ дк, ан нос де ЩЕ ща ММ Хокей мне: ЗМ хання хг че жах ж ЯК КК а Ж З їще Ї і ї ї ї геу КК У Ук АМКУ МКУ МИ КИТИ ОМ В А ВОВК фев в о КК В о В п КК КЕ В В В З ОК ЕЕ ША С и З Хккюютх Жука полон ше дом зр ка ку утх Я. ЕЕ си те У М і гі ж ЕД
; в: Й ях У З, й : Зно соку ЕЕ ть 5 вк КИ 5.
Зв. З и в, здох, хх З М ах ОЙ ж НН нн ще - І АХ ЧК, БОС в ех З З и ОВ У вх ща ПВ збою ШЕ ее За ж З Ж я 5 нь Й 5 я и ЩО КУ . сонну в Ї и ОО, а а остео З Мих Я Хо о ее ХХ я З "нь; я Ом щі кВ В ВН вен, кн в. КК В У й а -- Я МН нн онко, ЧУ а ООН и ЕН В нй Ж УК ох, ВОООООВВввв онВнв У її ж ВЕК в В Ме МКК осо Ка ОО и. УБІК - Он СН я со Ну. - о Кі у Кк НМ З 5 з. ї ж ЩО суднах МОМ а ох і оон В ОК В о жа З ж ни з Кс НЄ Х МЕ в С Ба а ЖЕ сеча с Я зва ех І 15 жа з8 а Же ха в ї х 1 Ж ї к х З Її з і х У ї х х ї УТІМ КК КД у КК УК МІХ ХО Кот ІСУСУ ОА КІ ОВО ЕВ К. о й ж шк жк сво п ук су Чак о В п за ха їх ЗЕ Ж ї я і КЗ ї Н 5 ї г ї Її ї Ї 3 ї х І КУКА УКХ УК М ТУ МИкж КК ми ку ВА пок джу ВЕжЖОХИМИЮГЬТУ МВ ОРКО ВТ ВОВК ІТК КВТ У АВС УЕТЕВо ще СОУ ї й х : : КУ І ж В Ж ї Я Ї Ж ї Ж ї З З ї : ї тити уми а КОВО У куми дмохуме ме дм соках ОКУНЯ ЕМ А УК КВ пон А В ВХ ж кож кв хх к х КЗ Ії х ї ж ї КУ : ж і З х З : : ї УКУС Кт ВІКУ м СУК СКК КК МКК ие м да ФКДКРОКІВУ КК ТАКЕ Ж В КМ РК Я ВИМ ТМ ВК В Кекс кр жи х Зк ку З. ях.
хх. ск чЯигувпа Я У па «Я чюудННВННННННННННННО : х 3 Кк 1 Ж Я х ї х і х х ї ї І ї ї хоемехУм тихе У УТІК их тус УВО КОХ ит Ат х и ДЕКО МУВУККМОККЕ хх НЕВиВКЗКУЄТОВОКе жк» КК ша шу Я гу сх тя шо ллх в Кам Во а ко 15 рр рю р живих Вк и гу МІМІКИ м УМ тр рда ЕК КН УА КВ Х КОМОД ОУНОвАЯ в о и МОВ ЕК х ЗКУ чай І я чат «пт Ей ЕК З дк х ЕКЗ кшМ « ж ши п и п У КОЮ МІТОК КА КИ тупик ПУСК о и пк тк ВЕУ ПОЕМУ юІМНМНиКМВУ МВСУ КиМУ ХВО ЕЗАННЯВЧВ хх х ки жоов ж Й т х ку г Півчнка іти й яка визнасена НИХ МО Аниника спів, яка визначена НОАС МО ооовоюююоюююювововововровоооо г слуг божих теж. яке Е Ок ноде ве т» ь Я Я
МОМ. Ааянка сила ВС 5 а У Н не жук З ; ква ОМІВНО ЗХ НаА У Б пемуня Фігура ЗІ вах 31 СОБІ пад цу ЗрБльні ВМО Я МІдДНиИ 111 53,0 ЗЕ ВА И гухті3уг МмляН ГХБ чу Нілу РВК толени Пш зх їй Ж Се ем Ії пупкового кроосоютогеоедодв ес оюкоюювоєкою 59 Б Я ку МІ ВК чЖОХ дл З яв з ШО ж ; Ф Е Ук її є Піни кюнавий Хом Ж п ше Ша х с ш З Е С м до х Я х х км З 7 А пал. х Ж дів: 5 ХВО : й Е - З х її Я « ще: х К пресі Як К ОМ роя ІЗ Ще З КУ "В сою ІЗ -х ІЗ Е - Ми 0 Хек у Ї - Е ХХ х : З 0 зненх З Ж ке Ж х ЗБ ОН ІЗ с МКК дворових ооо їх СХ нн 0 Зикннннх ІЗ ЇЇ ПК Н хх ПИПИИИКи Хо с, ПИТИ х К ооо зерен У у Я Ж о. и З Е Мовне Х Е: У 7 ПИШИ З их ших З 5 ш Кс Я хх Додано сорго рхоодннов, Х г ї З сок бо нн т но й й ра х Кз сі З КЗ У ро ТУ Кк хі БО хх а ро І с їй ж - -х 3 м вої В КУ К т х с Бк Ко рей вон рий Ж іс їх Я КЕ рей ро - - - тк -ї Я се шо шк НЕ хо т я Го рак -- Х Би 3 ле Ем шо дО 5 х З -55 -тх ле БЯЯ р Еко це най ХО т-т - КЗ МЕ Б х ж жк. т: хх хи хх ск п м паж - м. кову Коб - м к м я їх т - тА ж х БІ - їх по В З х З х -ш Ба ра Я -- х в в ру шо ре шЕ Е о що Е Х ХЕ З и ТУ ЗНрУюв ЯЗ
ЕОО . ОО УуВБТЩЯ ТЯ зв 7 ЕМО 930 ЩО контроль й ! й с МЕ тіннюєтннннсннннн п 3 Й Шен 2 Е : г й АН я с ї жк м я К ! Ж Ще ше Ш : ен Ви й ка -ї 4 з Я тАВімки ма) ЧФигтра ЗО Ж киш
БІ. п отв!
в. ж « УВТВІ74 СН ! ра 5 УувтВляЮю ТК І Ж вах К ве : і зво всій є м аа чичичИ Що г «й -й З В не г : З т я УЗТВІТА я. К. я шо УБТВІя9 хи у Ох сх . к «й ве й шварімкие млі Фігура 35 рес З . -щ ря шо УБ5ТВ174 шк ез УщТВІіЯВ Ах Х «8 з й В тАвВімкгмлі «ФВігура 35 бо
І а прав. 65 ОО УТ О міг
- . ж УВТВМоЗіТА мой З вав 007 УВТВІХ ОХ мкг х ; як МТВ муєкті К 0 т с ї ви дк дж що ЩщНЬ ден о а Ше: Ж 3 шк дну ор зей З кр они МНН и М ен
4 г. ча 365 50 55 95 54 35 5 Девь після імплантації Фетура жу СОЯ ЛОТАМИ» вепо рей фут еюсооюиновка ве
: . 3 З с--ЗИ в ЕК щ УМХ ник ше НИ І Б З Ії Ес: фін нн 4 - панові зникав нн с Пухлина Віхдаленвй б «Чнгуєв ЗВ
«г. хід вк ше до ЖК Мая Ж Я 5 не У В С я МК ов ай - ; З м БА-жИ ше ОХ Ера КО ж У Еш жо ИН хв МК БУ Б я КИ Кс ОА х Ха Я ? за 7 кнкх ме Ше ЗД ке "жа во, я сю, Ми ТВ шу дви КВ ОО. паща и ЧА Чан
«в. 3 а ЗВ о 2-25 нК а то и о а ве деме ке: ШІ "МЖК вх і и Ох КІ и жом кожи о Мои и а ка вв в о ЕК НЯ в з. їз ох УМА ка и Дж В у ТО Мих - ЖК. й Мк Ха ї і Ха Ж ди ДУ в ко цу Ж нта виг Кола у го ї ж с ва хх ОТ и У ЧК ОК Ме ж Я ще ко і КР ОдьсВ Е о ун а В слу о в М Ки в а тк В Ву как о ШИ ки В Кк о В МІ м тя СВ З Вера ОО Шк ся СИЧ В жів пи у хо ик аю КИ ве ль, В св як, ЕК КК на с Мо" а НІ Ви КЕ у ОО Я є ооо піку В ВХ ЖЕ су ЗЕ М вс ох вид лю : 5 я ОК и м В реа Ух А в ки Б ок АН З ДИМ од В, " ки ни і в о на ВО «й
4 5. х а НЕ ЗА У КЗ зх КВУ М В и Я ох ДЯ У сю хе К ОД ВИ ох о о ш ВИИ НА Я сш зни: НК шо я ШИ ЕН НЕ Ина и и в ОО КОН ще УК а МАМ ОМ КВ ку рев жоюн ен С В а и А т ОВ Ху мех, я Ху Я ук ж и г з Ку С НИ як кА и з ее Зм, МУ. а ЗЕ МЕ й тс. в З я, ж Як взшІ М БЕ КК Е ктох ск В У ха МО г бр а Я з хі и Я х З ХО кутом дО ху МА ХК Мох вк «у ЕМВ а парк ХЕ Ех лож ст й А КК в: А ІННИ: Ж Я ож жи пл МК ву вка о БЕХ ЯНИВ тк ВВ и ня у й УВУ М як ООН В УТ Ку у Я ВВ хх МО аз В ат а М ще кое ек НИ о ен о НК Ка ОМ --воЕ ех ких У МН Ше лк ол о КОЖ еВ а ЕІ х шк! М У Ву КУ ав Є рак БО. о ника о м Ас о а а о У оо кож Ши Ох НЄ Я с як вик В Ме яв Ве о в оо аа М Ки дк. Ми ско сон я КО, с ОН й Де и Ох а пр яю ко же Ше Ко о М З усю ту. я ; пи: КЕ ж ння: 00 аж І Я У ЗД а ШЕ и В ВН ВУ о ож ж жу. КО М змиви, М БЕ ок веУУ я КУ мок х БЕ. ЯМА вико й ? нин п в м р З М ра кдд В т ЯмгуУра 35
UAA201607766A 2013-12-24 2014-12-22 Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент UA125490C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920695P 2013-12-24 2013-12-24
US201462085086P 2014-11-26 2014-11-26
PCT/IB2014/002868 WO2015097536A2 (en) 2013-12-24 2014-12-22 Anti-vista antibodies and fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125490C2 true UA125490C2 (uk) 2022-04-13

Family

ID=52444326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201607766A UA125490C2 (uk) 2013-12-24 2014-12-22 Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент

Country Status (32)

Country Link
US (3) US10273301B2 (uk)
EP (3) EP4043493A1 (uk)
JP (4) JP6590810B2 (uk)
KR (2) KR102344991B1 (uk)
CN (2) CN114163529A (uk)
AU (4) AU2014372309C1 (uk)
BR (1) BR112016014966B1 (uk)
CA (2) CA2935378C (uk)
CL (3) CL2016001646A1 (uk)
DK (2) DK3087098T3 (uk)
DO (1) DOP2016000153A (uk)
EA (1) EA201691323A1 (uk)
EC (1) ECSP16062894A (uk)
ES (1) ES2920677T3 (uk)
HR (1) HRP20220748T1 (uk)
IL (3) IL290972B2 (uk)
LT (1) LT3712174T (uk)
MX (2) MX369173B (uk)
MY (1) MY182431A (uk)
NI (1) NI201600090A (uk)
NZ (1) NZ721866A (uk)
PE (1) PE20170254A1 (uk)
PH (1) PH12016501244A1 (uk)
PL (1) PL3712174T3 (uk)
PT (1) PT3712174T (uk)
RS (1) RS63295B1 (uk)
SA (1) SA516371402B1 (uk)
SG (4) SG10201805933TA (uk)
SI (1) SI3712174T1 (uk)
UA (1) UA125490C2 (uk)
UY (1) UY35961A (uk)
WO (1) WO2015097536A2 (uk)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
NZ602634A (en) 2010-03-26 2015-06-26 Dartmouth College Vista regulatory t cell mediator protein, vista binding agents and use thereof
EP2892558B1 (en) 2012-09-07 2019-04-10 The Trustees Of Dartmouth College Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
JP6590810B2 (ja) 2013-12-24 2019-10-16 ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ 抗ｖｉｓｔａ抗体および断片
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
MX2016016310A (es) 2014-06-11 2017-10-20 A Green Kathy Uso de agonistas y antagonistas vista para suprimir o aumentar la inmunidad humoral.
MX2017007136A (es) 2014-12-05 2017-12-04 Immunext Inc Identificacion de vsig8 como el receptor vista putativo y su uso para producir moduladores vista/vsig8.
EP3292152A1 (en) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
JP7026509B2 (ja) 2015-06-24 2022-02-28 ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ 抗ｖｉｓｔａ抗体およびフラグメント
CA2994241A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Hematopoietic stem cells in combinatorial therapy with immune checkpoint inhibitors against cancer
WO2017096179A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
US11505599B2 (en) 2016-01-14 2022-11-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibodies specific for Foxp3-derived peptides
TW202216201A (zh) 2016-02-12 2022-05-01 比利時商楊森製藥公司 抗vista抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
SG10201601719RA (en) 2016-03-04 2017-10-30 Agency Science Tech & Res Anti-LAG-3 Antibodies
WO2017181109A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof
RU2021111187A (ru) * 2016-04-15 2021-04-29 Янссен Фармасьютикалз, Инк. Антитела против человеческого vista и их применение
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
BR112018074463A2 (pt) 2016-05-27 2019-03-06 Agenus Inc. anticorpos anti-tim-3 e métodos de uso dos mesmos.
AU2017281830B2 (en) 2016-06-20 2023-04-06 Kymab Limited Anti-PD-L1 antibodies
KR20210010678A (ko) * 2016-06-30 2021-01-27 난트 홀딩스 아이피, 엘엘씨 난트 암 백신
CA3030841A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
US11649285B2 (en) 2016-08-03 2023-05-16 Bio-Techne Corporation Identification of VSIG3/VISTA as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy
EP3495391A4 (en) 2016-08-05 2020-08-19 Y-Biologics Inc. ANTIBODIES AGAINST PROGRAMMED DEATH LIGAND 1 (PD-L1) AND USE OF IT
CA3042698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
WO2018089628A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
WO2018098352A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Jun Oishi Targeting kras induced immune checkpoint expression
US11306150B2 (en) 2017-01-11 2022-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Method of identifying a P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) antagonist
BR112019019108A2 (pt) 2017-03-14 2020-04-22 Five Prime Therapeutics, Inc. anticorpos, ácido nucleico, composições, célula, métodos para preparar de um anticorpo, para tratar um sujeito com câncer, para tratar uma doença infecciosa, para tratar uma inflamação, para identificar um ab, para melhorar a eficácia antitumoral de um ab, para melhorar a farmacocinética de um anticorpo, para seleção de um anticorpo, para melhorar a eficácia de anticorpos, para isolar anticorpos e para detectar vista em uma amostra
US20200010528A1 (en) 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
WO2018237287A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Apexigen, Inc. ANTI-VISTA ANTIBODIES AND METHODS OF USE
KR102281405B1 (ko) * 2017-10-20 2021-07-26 주식회사 파멥신 항-vista 항체 및 이의 용도
CN111372584A (zh) 2017-11-03 2020-07-03 奥瑞基尼探索技术有限公司 Tim-3和pd-1途径的双重抑制剂
EP3706798A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Aurigene Discovery Technologies Limited Conjoint therapies for immunomodulation
EP3746477A1 (en) 2018-02-02 2020-12-09 Bio-Techne Corporation Compounds that modulate the interaction of vista and vsig3 and methods of making and using
CN111971304A (zh) 2018-03-21 2020-11-20 戊瑞治疗有限公司 在酸性pH结合至VISTA的抗体
US20190300610A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
GB201814562D0 (en) 2018-09-07 2018-10-24 Hummingbird Bioscience Pte Ltd Vista antigen-binding molecules
WO2019185163A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
CN108640972B (zh) * 2018-05-17 2021-07-30 中国药科大学 与vista具有亲和力的短肽及其用途
TW202028235A (zh) 2018-07-11 2020-08-01 美商戊瑞治療有限公司 於酸性ｐｈ結合至含免疫球蛋白ｖ域之t細胞活化抑制子（ｖｉｓｔａ）之抗體
US20230243836A1 (en) 2018-07-20 2023-08-03 Pierre Fabre Medicament Receptor for vista
AU2019324170A1 (en) * 2018-08-23 2021-02-18 Seagen, Inc. Anti-TIGIT antibodies
US10577424B1 (en) * 2019-08-15 2020-03-03 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Antibodies binding VISTA and uses thereof
KR20220065816A (ko) 2019-09-19 2022-05-20 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 산성 pH에서 VISTA에 결합하는 항체
AU2021206202A1 (en) 2020-01-07 2022-06-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Improved human methylthioadenosine/adenosine depleting enzyme variants for cancer therapy
JP7337959B2 (ja) * 2020-06-26 2023-09-04 バイオアークティック アーベー α－シヌクレインプロトフィブリル結合抗体
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
MX2023012672A (es) 2021-04-30 2024-01-18 Pf Medicament Nuevo anticuerpo anti-vista estable.
KR20240058149A (ko) 2021-09-16 2024-05-03 허밍버드 바이오사이언스 피티이. 엘티디. Vista 항원-결합 분자를 사용한 암의 치료 및 예방
WO2023046979A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2023213814A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pierre Fabre Medicament New formulation of anti vista antibody
WO2024062073A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2024121380A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Pierre Fabre Medicament Vaccinal composition and adjuvant

Family Cites Families (299)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0590689B2 (fr) 1985-03-30 2006-08-16 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtention d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombinaison d'ADN
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0349578B2 (en) 1987-03-02 1998-10-28 Enzon Labs Inc. Organism carrying a Single Chain Antibody Domain at its surface.
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
DE3853515T3 (de) 1987-05-21 2005-08-25 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
DE68926882T2 (de) 1988-01-11 1997-02-13 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
US5039660A (en) 1988-03-02 1991-08-13 Endocon, Inc. Partially fused peptide pellet
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
CA2057923A1 (en) 1989-05-16 1990-11-17 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5763266A (en) 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE3923279A1 (de) 1989-07-14 1990-01-18 Will W Prof Dr Minuth Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren
DE69032483T2 (de) 1989-10-05 1998-11-26 Optein, Inc., Seattle, Wash. Zellfreie synthese und isolierung von genen und polypeptiden
WO1991006666A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5580756A (en) 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
TW212184B (uk) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2109945T3 (es) 1990-06-01 1998-02-01 Chiron Corp Composiciones y procedimientos para identificar moleculas biologicamente activas.
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
ATE204902T1 (de) 1990-06-29 2001-09-15 Large Scale Biology Corp Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
AU1435492A (en) 1991-02-21 1992-09-15 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
PT503648E (pt) 1991-03-12 2000-10-31 Biogen Inc Dominio do antigenio 3 associado a funcao linfocitica de ligacao as cd2
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5660827A (en) 1992-03-05 1997-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies that bind to endoglin
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
ATE256738T1 (de) 1992-10-30 2004-01-15 Gen Hospital Corp Ein neues zellzyklus kontrollprotein
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
GB9302660D0 (en) 1993-02-10 1993-03-24 Sihra Kirpal S A building system
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP1553168A3 (en) 1993-06-04 2011-04-06 The United States of America as represented by The Secretary of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
WO1995024220A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
WO1996004925A1 (en) 1994-08-12 1996-02-22 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US6096532A (en) 1995-06-07 2000-08-01 Aastrom Biosciences, Inc. Processor apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5985653A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Aastrom Biosciences, Inc. Incubator apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
CA2264485A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Gata-6 transcription factor: compositions and methods
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US6593372B2 (en) 1996-11-13 2003-07-15 Cold Spring Harbor Laboratory Therapeutic uses for nitric oxide inhibitors
US5977181A (en) 1996-11-13 1999-11-02 Cold Spring Harbor Laboratory Therapeutic uses for nitric oxide inhibitors
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20060084082A1 (en) 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999026657A1 (en) 1997-11-25 1999-06-03 Musc Foundation For Research Development Inhibitors of nitric oxide synthase
US6982323B1 (en) 1997-12-23 2006-01-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins for diagnosis and treatment of diabetes
US6006758A (en) 1998-02-03 1999-12-28 University Of Maryland Method and device for the detection and removal of head lice
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
IL140980A0 (en) 1998-07-28 2002-02-10 Univ California Nucleic acids encoding a g-protein coupled receptor involved in sensory transduction
US7098312B2 (en) 1998-09-01 2006-08-29 Genetech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6924355B2 (en) 1998-09-01 2005-08-02 Genentech, Inc. PRO1343 polypeptides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
JP4892132B2 (ja) 1998-11-24 2012-03-07 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー ７０ｋＤ熱ショック蛋白による化合物の細胞内標的輸送
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US6696686B1 (en) 1999-06-06 2004-02-24 Elgems Ltd. SPECT for breast cancer detection
WO2001000814A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Universität Zürich Hetero-associating coiled-coil peptides and screenign method therefor
AU6058500A (en) 1999-06-30 2001-01-31 Center For Blood Research, The Fusion protein and uses thereof
CA2379388C (en) 1999-07-13 2012-05-29 George N. Cox, Iii Immunoglobulin fusion proteins
PT1210428E (pt) 1999-08-23 2015-07-21 Genetics Inst Llc Pd-1, um recetor para b7-4 e suas utilizações
CA2381770C (en) 1999-08-24 2007-08-07 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
DE60116067T2 (de) 2000-03-24 2006-08-31 Pharmacia Corp., Chicago Amidino-verbindungen als hemmstoffe der stickstoffmonoxid-synthase
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6545170B2 (en) 2000-04-13 2003-04-08 Pharmacia Corporation 2-amino-5, 6 heptenoic acid derivatives useful as nitric oxide synthase inhibitors
US7417130B2 (en) 2000-09-08 2008-08-26 University Of Zurich Collection of repeat proteins comprising repeat modules
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
WO2002029072A2 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Novartis Ag Targetting molecules for adenoviral vectors
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2002064834A1 (en) 2001-01-04 2002-08-22 Myriad Genetics, Inc. Novel two-hybrid system and use thereof
US20050063948A1 (en) 2001-03-08 2005-03-24 Dickerson Erin B. Methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
CA2447183A1 (en) 2001-03-28 2002-10-10 Incyte Genomics, Inc. Molecules for disease detection and treatment
ITTV20010035A1 (it) 2001-03-30 2002-09-30 Bettio Group Srl Zanzariera con dispositivo di aggancio e sgancio rapido della barra maniglia
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
DK1436003T3 (da) 2001-05-24 2010-03-15 Zymogenetics Inc TACI-immunoglobulin-fusionsproteiner
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
TWI334439B (en) 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
EP2277914A3 (en) 2001-08-10 2012-08-08 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
US6797493B2 (en) 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
PT1482973E (pt) 2002-03-15 2009-11-20 Schering Corp Métodos de modulação dos receptores cd200
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003247411A1 (en) 2002-05-23 2003-12-12 Cognis Corporation NON-REVERTIBLE Beta-OXIDATION BLOCKED CANDIDA TROPICALIS
JP4409430B2 (ja) 2002-07-03 2010-02-03 小野薬品工業株式会社 免疫賦活組成物
GB2392158B (en) 2002-08-21 2005-02-16 Proimmune Ltd Chimeric MHC protein and oligomer thereof
WO2004037999A2 (en) 2002-10-23 2004-05-06 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and a33-like 3 dna, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
AU2003295502A1 (en) 2002-11-12 2004-06-03 Yucheng Chang Adenoviral vector vaccine
JP4511943B2 (ja) 2002-12-23 2010-07-28 ワイス エルエルシー Ｐｄ−１に対する抗体およびその使用
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
WO2005056764A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20050256576A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Moskowitz Nathan C Artificial expansile total lumbar and thoracic discs for posterior placement without supplemental instrumentation and its adaptation for anterior placement of artificial cervical, thoracic and lumbar discs
PT1751184E (pt) 2004-05-13 2009-11-10 Lilly Co Eli Proteínas de fusão de fgf-21
ES2405273T3 (es) 2004-06-24 2013-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polipéptido coestimulador B7-H5
HUE026826T2 (en) 2004-10-29 2016-07-28 Ratiopharm Gmbh Modeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
EP1812031B1 (en) 2004-11-01 2015-06-24 The Regents of the University of California Compositions and methods for modification of biomolecules
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
US8231872B2 (en) 2005-04-25 2012-07-31 The Trustees Of Dartmouth College Regulatory T cell mediator proteins and uses thereof
US8236304B2 (en) 2005-04-25 2012-08-07 Trustees Of Dartmouth College Use of PD-L3 proteins and PD-L3 specific antibodies or antibody fragments to regulate CD4+ and CD8+ T cell immunity
KR101514463B1 (ko) 2005-06-08 2015-04-28 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 예정 세포사 1(ｐｄ-1) 경로를 억제함으로써 지속 감염 및 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
US20070009880A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Toledo Luis H Methods And Solutions For Storing Donor Organs
US7531164B2 (en) 2005-10-21 2009-05-12 Duke University Preventing bacterial or viral infectivity and composition containing infection preventing additive
US7655778B2 (en) 2006-02-28 2010-02-02 Curonix Co., Ltd. SISP-1, a novel p53 target gene and use thereof
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2010014629A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific binding proteins targeting b cell disorders
EP2324055A2 (en) 2008-08-25 2011-05-25 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
EP2349291B1 (en) 2008-10-03 2012-12-05 Emory University Agonists of toll-like receptor 5 for the treatment of graft-versus-host disease
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
CA2780692C (en) * 2009-12-10 2018-09-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding preferentially human csf1r extracellular domain 4 and their use
EP2525820B1 (en) * 2010-01-19 2016-05-11 Immunomedics, Inc. Novel class of monospecific and bispecific humanized antibodies that target the insulin-like growth factor type i receptor (igf-1r)
NZ602634A (en) 2010-03-26 2015-06-26 Dartmouth College Vista regulatory t cell mediator protein, vista binding agents and use thereof
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US20180237525A9 (en) 2010-03-26 2018-08-23 Randolph J. Noelle VISTA Agonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20110245469A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Athena Discovery, Inc. Intermediates formed in biosynthesis of relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
KR20150018604A (ko) 2012-06-06 2015-02-23 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 히포 경로를 조절하는 결합제 및 그의 용도
WO2015109340A2 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Noelle Randolph J Vista antagonist and methods of use
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN104619722B (zh) 2012-06-22 2022-10-04 达特茅斯大学理事会 新型vista-ig构建体和vista-ig用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
EP2892558B1 (en) 2012-09-07 2019-04-10 The Trustees Of Dartmouth College Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
JP6682426B2 (ja) 2013-05-24 2020-04-15 メディミューン，エルエルシー 抗ｂ７−ｈ５抗体およびその使用
JP6824735B2 (ja) 2013-06-06 2021-02-03 ピエール、ファーブル、メディカマン 抗Ｃ１０ｏｒｆ５４抗体およびその使用方法
JP6590810B2 (ja) 2013-12-24 2019-10-16 ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ 抗ｖｉｓｔａ抗体および断片
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
CN106659765B (zh) 2014-04-04 2021-08-13 德玛医药 二脱水半乳糖醇及其类似物或衍生物用于治疗非小细胞肺癌和卵巢癌的用途
MX2016016310A (es) 2014-06-11 2017-10-20 A Green Kathy Uso de agonistas y antagonistas vista para suprimir o aumentar la inmunidad humoral.
MX2017007136A (es) 2014-12-05 2017-12-04 Immunext Inc Identificacion de vsig8 como el receptor vista putativo y su uso para producir moduladores vista/vsig8.
JP7026509B2 (ja) 2015-06-24 2022-02-28 ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ 抗ｖｉｓｔａ抗体およびフラグメント
TW202216201A (zh) * 2016-02-12 2022-05-01 比利時商楊森製藥公司 抗vista抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
RU2021111187A (ru) * 2016-04-15 2021-04-29 Янссен Фармасьютикалз, Инк. Антитела против человеческого vista и их применение
WO2017181109A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof
US11649285B2 (en) 2016-08-03 2023-05-16 Bio-Techne Corporation Identification of VSIG3/VISTA as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
SI3712174T1 (sl) 2022-06-30
EP3712174A9 (en) 2021-05-12
BR112016014966B1 (pt) 2024-03-05
EP3087098B1 (en) 2020-04-08
KR20160124086A (ko) 2016-10-26
IL301714A (en) 2023-05-01
RS63295B1 (sr) 2022-06-30
US20170051061A1 (en) 2017-02-23
IL290972A (en) 2022-05-01
CN114163529A (zh) 2022-03-11
CA3190821A1 (en) 2015-07-02
US20220144954A1 (en) 2022-05-12
AU2014372309C1 (en) 2017-12-14
EP4043493A1 (en) 2022-08-17
AU2017228688B2 (en) 2019-08-22
PH12016501244A1 (en) 2016-08-15
NI201600090A (es) 2019-02-26
ECSP16062894A (es) 2017-01-31
MX369173B (es) 2019-10-30
MY182431A (en) 2021-01-25
DK3087098T3 (da) 2020-06-08
SG10201805933TA (en) 2018-08-30
BR112016014966A2 (pt) 2017-09-19
JP6924234B2 (ja) 2021-08-25
LT3712174T (lt) 2022-05-25
WO2015097536A8 (en) 2016-08-04
IL290972B2 (en) 2023-10-01
CN106661107B (zh) 2021-12-24
EA201691323A1 (ru) 2016-11-30
SA516371402B1 (ar) 2022-03-09
HRP20220748T1 (hr) 2022-09-02
PT3712174T (pt) 2022-05-27
SG11201605200XA (en) 2016-07-28
CN106661107A (zh) 2017-05-10
CA2935378C (en) 2023-04-18
CL2019002428A1 (es) 2020-02-07
AU2017228688A1 (en) 2017-10-05
IL246401A0 (en) 2016-08-31
WO2015097536A3 (en) 2015-11-12
PE20170254A1 (es) 2017-04-12
JP2021167359A (ja) 2021-10-21
SG10201912793RA (en) 2020-02-27
NZ721866A (en) 2017-10-27
AU2014372309B2 (en) 2017-07-06
KR20210158435A (ko) 2021-12-30
US11242392B2 (en) 2022-02-08
KR102534681B1 (ko) 2023-05-18
EP3712174B1 (en) 2022-03-16
JP2023073449A (ja) 2023-05-25
EP3712174A1 (en) 2020-09-23
DK3712174T3 (da) 2022-04-25
ES2920677T3 (es) 2022-08-08
IL290972B1 (en) 2023-06-01
CA2935378A1 (en) 2015-07-02
JP2017502667A (ja) 2017-01-26
MX2016008193A (es) 2016-12-16
AU2019213384B2 (en) 2021-08-26
AU2019213384A1 (en) 2019-08-29
AU2014372309A1 (en) 2016-07-21
AU2021215226A1 (en) 2021-09-02
EP3087098A2 (en) 2016-11-02
WO2015097536A2 (en) 2015-07-02
KR102344991B1 (ko) 2021-12-28
JP2019214619A (ja) 2019-12-19
IL246401B (en) 2022-04-01
MX2019012714A (es) 2019-12-05
CL2016001646A1 (es) 2017-06-09
CL2021000353A1 (es) 2021-08-27
SG10201912797XA (en) 2020-02-27
US20200017589A1 (en) 2020-01-16
NZ735662A (en) 2020-11-27
DOP2016000153A (es) 2017-08-15
US10273301B2 (en) 2019-04-30
UY35961A (es) 2016-06-30
PL3712174T3 (pl) 2022-07-04
JP6590810B2 (ja) 2019-10-16
AU2019213384C1 (en) 2021-12-16
JP7256238B2 (ja) 2023-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125490C2 (uk) Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент
TWI756204B (zh) 抗ｖｉｓｔａ抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
UA125898C2 (uk) Антитіла до tigit
UA118013C2 (uk) Комбінована терапія з використанням антитіла до клаудину 18.2 для лікування раку
UA122929C2 (uk) АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄ ЛЮДСЬКИЙ Тim-3
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA128306C2 (uk) ЗЛИТІ ПРОТЕЇНИ, ЯКІ МІСТЯТЬ РЕЦЕПТОР TGF-<font face="Symbol">b</font>, І ЇХ ФАРМАЦЕВТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
UA123111C2 (uk) Антитіло до cd40 та його застосування
CN107530420A (zh) 抗tim‑3抗体
UA125208C2 (uk) Антитіло до cd40
CA2990360A1 (en) Anti-vista antibodies and fragments
UA126897C2 (uk) Антитіла проти dr5 і способи їх застосування
UA92337C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ ПОВНІСТЮ ЛЮДСЬКЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ДО ГАММА-ІНТЕРФЕРОНУ (IFNγ), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ПОЛЕГШЕННЯ ІНТЕНСИВНОСТІ СИМПТОМУ АВТОІМУННОГО ЗАХВОРЮВАННЯ АБО ЗАПАЛЬНОГО РОЗЛАДУ
UA123774C2 (uk) Антитіла проти c5 та способи застосування
US20220064323A1 (en) Therapeutic Anti-CD9 Antibody
UA126115C2 (uk) Антитіло до gitr
UA126389C2 (uk) Антигензв'язувальний білок проти gitr і спосіб його застосування
TWI770455B (zh) 抗vista抗體及片段
US20200024347A1 (en) Or10h1 antigen binding proteins and uses thereof
US20140134730A1 (en) Method for inhibiting cell proliferation by oxidative stress