UA125898C2 - Антитіла до tigit - Google Patents

Антитіла до tigit Download PDF

Info

Publication number
UA125898C2
UA125898C2 UAA201809862A UAA201809862A UA125898C2 UA 125898 C2 UA125898 C2 UA 125898C2 UA A201809862 A UAA201809862 A UA A201809862A UA A201809862 A UAA201809862 A UA A201809862A UA 125898 C2 UA125898 C2 UA 125898C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
cells
human
tisit
amino acid
Prior art date
Application number
UAA201809862A
Other languages
English (en)
Inventor
Дж. Юнь Тсо
Наоя Цурусіта
Наоя Цурусита
Омар Дурамад
Original Assignee
Джн Байосайєнсіз, Ллк
ДжН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ЛЛК
Абмуно Терапьютікс Ллк
Абмуно Терапьютикс Ллк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джн Байосайєнсіз, Ллк, ДжН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ЛЛК, Абмуно Терапьютікс Ллк, Абмуно Терапьютикс Ллк filed Critical Джн Байосайєнсіз, Ллк
Publication of UA125898C2 publication Critical patent/UA125898C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Винахід стосується моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язується з TIGIT, що містить важкий ланцюг CDR1, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 11, важкий ланцюг CDR2, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 12, важкий ланцюг CDR3, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 13, легкий ланцюг CDR1, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 15, легкий ланцюг CDR2, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 16 і легкий ланцюг CDR3, що містить амінокислотну послідовність SEQ ІD NO: 17.

Description

За даною заявкою запитується пріоритет тимчасової патентної заявки США Мо 62/304045, поданої 4 березня 2016 року, і тимчасової патентної заявки США Мо 62/413025, поданої 26 жовтня 2016 року, опис яких включено в дану заявку за допомогою посилання у всій їх повноті.
Галузь техніки, до якої належить винахід
У даній заявці представлені, іпіег аа, моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з молекулами імунних контрольних точок, таким чином призводячи до істотної активації імунних клітин, а також застосування таких антитіл для лікування злоякісного новоутворення та інфекційного захворювання, серед іншого.
Рівень техніки
Антиген-специфічна імунна відповідь являє собою складний біологічний процес, який контролюється декількома рівнями позитивних і негативних регуляторів. Т-клітини спочатку стимулюються через Т-клітинний рецептор (ТСА) шляхом розпізнавання їх когнатного пептидного антигену, презентованого молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС) на антиген-презентуючих клітинах. Для оптимальної Т-клітинної активації потрібен "другий сигнал", забезпечуваний костимуляторними молекулами, такими як СО28. Імунна відповідь потім позитивно регулюється костимуляторними молекулами, такими як ОХ40, СІТА і 4-188, які належать до суперродини рецепторів ТМЕ, і негативно регулюється молекулами контрольних точок, такими як РО-1 ї СТІ А-4. Функція молекул контрольних точок полягає в запобіганні небажаної надмірної реакції імунної системи в організмі; однак, вони також обмежують здатність імунної системи ефективно боротися зі злоякісними новоутвореннями та інфекційним захворюванням. Повідомлялося про те, що блокування функції РО-1 або СТІА-4 антагоністичним моноклональним ІдСсь антитілом ефективне для імунотерапії злоякісних новоутворень у людей (див. огляд РагаоїЇ, Маї. Рем. Сапсег, 12:252-264, 2012; Манопеу еї аї.,
Маї. Веу. Опа бівсом. 14:561-584, 2015; ЗНіп еї аі., Си. Оріп. Іттипої. 33:23-35, 2015; Магдиез-
Воадаз вї аї. Апп. Тгапві. Мей. 3:267, 2015).
Повідомлялося про інші молекули контрольних точок, такі як ТІМ-3, Г АС-3, ТІСІТ, ВПТА і
МІ5ТА (Мегсівг евї аї., Егопі. Іттипої. 6:418, 2015). ТІСІТ (Т-клітинний імунорецептор з Ід і ІГІМ доменуми), член суперродини імуноглобулінів з імунорецепторним інгібіторним мотивом на основі тирозину (ІТІМ) у цитоплазматичному кінцевому сегменті, експресується на підгрупах
Зо активованих Т-клітин і природних кілерних (МК) клітин (Ми еї аї!., УМаї. Іттипої. 10:48-57, 2009).
Відомо, що ТІСІТ взаємодіє з СО155 (також називаним РУК і песі-5), СО112 (також називаним
РМНІ2 і нектин-2) і можливо СО113 (також називаним РМВІ З і нектин-3) (Мегсієг еї аї., вирга;
Мапінпеї єї аї., Маї. Нє. Іттипої. 15:243-254, 2015). Повідомлялось, що зв'язування ТІСІТ з високоафінними лігандами СО155, які експресуються на антиген-презентуючих клітинах, пригнічує функцію Т-клітин і МК клітин (Мегсієг еї аї., 5ирга; щдоїег еї аї., У. Іттипої. 186: 1338- 1342, 2011; еапівїбКу еї аЇ., Ек. У. Іттипої. 43:2138-2150, 2013; Ії еї аї., У. ВіоІ. Спет. 289:17647-17657, 2014; 7Напа еї а)ї. Сапсег Іттипо!. Іттипоїйег. Ериб оп Еер. 3, 2016). Також повідомлялося, що ТІСІТ інгібує Т-клітини опосередковано через модуляцію продукування цитокінів дендритними клітинами (Ми еї а!., зирга).
Пухлини створюють високосупресивне мікрооточення, де інфільтруючі Т-клітини виснажуються і МК клітини пригнічуються молекулами контрольних точок, такими як РО-1 і
ТІСІТ, для відхилення від імунних відповідей (допп5іоп єї аї., Сапсег СеїІ. 26:926-937, 2014;
СНнамміп еї аї., 9. Сііп. Іпмеві. 125:2046-2058, 2015; Іпо7ите еї аї., у. Іпмеві. Оептаїйо!. Ериб оп Осі 12, 2015). Як повідомлялося, високий рівень експресії ТІ! на СО8- Т-клітинах корелює з поганим клінічним результатом у пацієнтів з АМІ. (Копа еї а!., СІіп. Сапсег Ве5. Ериб оп дап. 13, 2016). Функціональні дефекти виснажених ТІСІТ-СОва Т-клітин у пацієнтів з АМІ, як повідомлялося, оборотні при міРНК-опосередкованому нокдауні експресії ТІСІТ (Копа еї аї., зирга).
Також повідомлялося, що ефекторні СОв8-- Т-клітини при інфекції ВІЛ у крові і інфекції ВСГ (вірус свинячого грипу) у лімфоїдній тканині демонструють більш високі рівні ТІСІТ (Спему єї аї.,
РГОБ5 Раїподепв, 12:еі005349, 2016). Крім того, повідомлялося, що ех мімо блокування ТІСІТ антитілом відновлює вірус-специфічні СО8-- Т-клітинні ефекторні відповіді.
Розкриття суті винаходу
Винахід належить до, іпієг аїііа, антитіла, яке конкурує з будь-яким з ТІСІ1, ТІС2 або ТІСЗ за зв'язування з ТІСІЇ людини. Антитіло ТІС1 характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 14 і зрілою варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 10, антитіло ТІС2 характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 22 і зрілою варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО 10 МО: 18, і антитіло ТІСЗ характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 30 і зрілою 60 варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 2 6, для специфічного зв'язування з ТІСІТ.
Деякі антитіла зв'язуються з тим же самим епітопом на ТІСІТ людини, що і ТІС1, ТІС2 або ТІСЗ.
Деякі антитіла інгібують зв'язування ТІСІТ людини з СО155. Деякі антитіла включають три СОВ легкого ланцюга і три СОВ важкого ланцюга, по суті з відповідних трьох СОВ легкого ланцюга і трьох СОВ важкого ланцюга з ТІС1. Деякі антитіла включають три СОВ легкого ланцюга і три
СОВА важкого ланцюга ТІСТ1, ТІ22 або ТІ2З3. Деякі антитіла включають три СОН важкого ланцюга, визначені за номенклатурою Кебота, і три СОВА легкого ланцюга, визначені за номенклатурою Кебота, будь-якого з ТІСТ (5ЕО ІЮ МО: 15-17 легкого ланцюга і 11-13 важкого ланцюга), ТІС2 (5ЕО ІЮ МО: 23-25 легкого ланцюга, 19-21 важкого ланцюга) або ТІСЗ (5ЕО ІЮ
МО: 31-33 легкого ланцюга і 27-29 важкого ланцюга).
Деякі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом ТІСІТ людини, що містять залишки 35 і 37 ЗЕО МО: 1 і/або залишки 49 ії 51 5ЕО ІО МО: 1. Деякі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом ТІСІТ людини, що містять залишки 35, 37, 49 ії 51 5ЕО ІЮО МО: 1. Деякі моноклональні антитіла зв'язуються з пептидом, що складається із залишків 35-51 5ЕО 10 МО: 1 і не більш ніж п'яти фланкуючих амінокислот з 5ЕО ІО МО: 1 з обох сторін. Деякі моноклональні антитіла зв'язуються з пептидом, що складається із залишків 35-51 5БЕО ІО МО: 1. Деякі такі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом, що складається із 3-20 суміжних залишків БЕ
ІО МО: 1.
Деякі антитіла є химерними, гуманізованими, венованими або людськими. Деякі антитіла мають ІДС! каппа ізотип людини. Деякі антитіла мають ІдДС24 каппа ізотип людини. Антитіло може являти собою інтактне антитіло або одноланцюгове антитіло, Раб або Е(ар)2 фрагмент.
Винахід також належить до фармацевтичної композиції, що містить будь-яке із зазначених вище антитіл і фармацевтично прийнятний носій.
Винахід також належить до способів лікування або здійснення профілактики злоякісного новоутворення в пацієнта, що включають введення пацієнтові, що страждає на злоякісне новоутворення або, що має підвищений ризик розвитку злоякісного новоутворення, будь-якого із зазначених вище антитіл в ефективному режимі. У деяких способах пацієнт страждає гострим мієлоїдним лейкозом або Т-клітинним лейкозом дорослих.
В інших варіантах здійснення даний винахід належить до застосування антитіл, описаних у даній заявці, у комбінації з інгібіторами імунних контрольних точок. Було показано, що блокада
Зо імунних контрольних точок, яка призводить до ампліфікації антиген-специфічних Т-клітинних відповідей, є перспективним підходом у лікуванні злоякісного новоутворення в людини.
Приклади імунних контрольних точок (лігандів і рецепторів), деякі з яких селективно активуються при регуляції в різних типах пухлинних клітин, які є кандидатами для блокади, включають РО-1 (білок запрограмованої клітинної загибелі 1); РО-І1 (ліганд запрограмованої клітинної загибелі-1); ВТ А (В і Т лімфоцитарний атенюатор); СТІ А-4 (антиген 4 цитотоксичних
Т-лімфоцитів); ТІМ-3 (Т-клітинний мембранний білок 3); І! АС-3 (ген активації лімфоцитів 3); М- доменний імуноглобуліновий супресор Т-клітинної активації (МІЗТА); С0О96; Агав (аденозиновий
А?а рецептор); А2гЬА (аденозиновий А2грЬ рецептор); СО73 (екто-5'-нуклеотидаза); СО39 (ЕМТРОТЇ, МТРБравзеї); Аргіназу; індоламін-пірол 2,3-діоксигеназу (100); триптофан 2,3- діоксигеназу (ТОО); і інгібуючі рецептори кілерів. Інгібітори імунних контрольних точок і комбінована терапія з використанням таких інгібіторів обговорюються докладно в даній заявці.
Винахід також забезпечує способи лікування індивіда, інфікованого патогеном, що включають введення індивідові будь-якого із зазначених вище антитіл в ефективному режимі. У деяких способах патоген являє собою ВІЛ або ВСГ. В інших способах патоген являє собою вірусний, бактеріальний, грибковий або найпростіший патоген.
У додаткових аспектах у даній заявці представлене анти-ТІСІТ антитіло, яке зв'язується з
Поліпептидом ТІСІТ на одному або декількох амінокислотних залишках, що включають 051, де поліпептид ТІСІТ має амінокислотну послідовність, що відповідає 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення антитіло являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло є химерним, гуманізованим або венованим. У деяких варіантах здійснення антитіло являє собою людське антитіло. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло не зв'язується з одним або декількома амінокислотними залишками, що включають 1 44, 147 або Н55. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло включає зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга 5ЕО 10
МО: 14 і зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 10. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло зв'язується з тим же з епітопом, що їі ТІС1, в амінокислотній послідовності, що відповідає 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, 60 антитіло включає три СОВ легкого ланцюга, що включають 5ЕО 10 МО: 15-17, і три СОВ важкого ланцюга, що включають 5ЕО ІО МО: 11-13. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності 5ЕО ІЮО МО: 35, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності ФБЕО ІЮ
МО: 37. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 35, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 37. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮО МО: 40, за умови, що С- кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕО І МО: 41.
У наступних аспектах у даній заявці представлене моноклональне антитіло, яке конкурує з будь-яким з ТІС1, ТІ2 або ТІС2З за зв'язування з людським ТІСІТ, де антитіло ТІС1 характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 14 і зрілою варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 10, антитіло ТІС2 характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 22 і зрілою варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 18, і антитіло ТІШЗ характеризується зрілою варіабельною ділянкою легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 30 і зрілою варіабельною ділянкою важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 26, для специфічного зв'язування з СО155. У деяких варіантах здійснення антитіло зв'язується з тим же самим з епітопом на людському ТІСІТ, що і будь-яке з ТІС1, ТІС2 або ТІС3. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло інгібує зв'язування СО155 з людським ТІСІТ. У деяких варіантах здійснення антитіло включає три СОВА легкого ланцюга і три СОВ важкого ланцюга, що відповідають трьом СОВА легкого ланцюга і трьом СОВА важкого ланцюга будь-якого з ТІС1, ТІ242 або ТІС3. У деяких варіантах здійснення антитіло включає три СОВ важкого ланцюга і три СОВ легкого ланцюга будь-якого з
ТІСТІ, ТІШ2 або ТІС2З3. У деяких варіантах здійснення антитіло включає три СОМ важкого ланцюга, визначені за номенклатурою Кебота, і три СОВА легкого ланцюга, визначені за номенклатурою Кебота, будь-якого з ТІСТ (5ЕО ІЮ МО: 15-17 легкого ланцюга і 11-13 важкого ланцюга), ТІС2 (5ЕО ІО МОз5. 23-25 легкого ланцюга, 19-21 важкого ланцюга) або ТІСЗ (5ЕО 10
Зо МО: 31-33 легкого ланцюга і 27-29 важкого ланцюга). У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло є химерним, гуманізованим або венованим. У деяких варіантах здійснення антитіло являє собою людське антитіло. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло має людський ІдС1 каппа ізотип. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло являє собою інтактне антитіло. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло являє собою одноланцюгове антитіло, Раб або К(ар)2 фрагмент. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності 5ЕО ІЮО МО: 35, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності БЕО ІЮ
МО: 37. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга щонайменше на 95 або 99 95 ідентична послідовності ЕС ІО МО: 35, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга щонайменше 95 або 99 95 ідентична послідовності ФЕО ІО МО: 37. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ЕС ІЮ
МО: 35, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕО І
МО: 37. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 40, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕСО ІЮО МО: 41. У деяких варіантах здійснення, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІО МО: 60, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІО МО: 64. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІО МО: 61, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕО І МО: 64. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності 5ЕО ІЮО МО: 43, і зрілу бо варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності БЕО ІЮ
МО: 45. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга щонайменше на 95 або 99 95 ідентична послідовності ЕС ІО МО: 43, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга щонайменше на 95 або 99 95 ідентична послідовності 5ЕО ІО МО: 45. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 43, ії зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 45. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮО МО: 48, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕО І
МО: 49. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 62, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕСО ІЮО МО: 65. У деяких варіантах здійснення зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 63, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮО МО: 65. У деяких інших аспектах у даній заявці представлене моноклональне антитіло, яке зв'язується з епітопом, що включає залишки 35 і 37 5ЕО МО: 1 і/або залишки 49 і 51 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення антитіло зв'язується з епітопом, що включає залишки 35, 37, 49 і 51 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення антитіло зв'язується з пептидом, що складається із залишків 35-51 5ЕО І
МО: 1 ї не більш ніж п'яти фланкуючих амінокислот з БЕО ІО МО: 1 з обох сторін. У деяких варіантах здійснення антитіло зв'язується з пептидом, що складається із залишків 35-51 5ЕО І
МО: 1. У деяких варіантах здійснення, епітоп складається з 3-20 суміжних залишків ФЕО ІЮ МО: 1. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антитіло має одну або декілька з наступних властивостей: (а) інгібує зв'язування ТІСІТ з СО155, необов'язково з ІСво 15-100 нг/мл, (б) підвищує природню Т-клітинну активацію в присутності антиген-презентуючих клітин, що експресують СО155, як виміряно за продукуванням ФІ -2, необов'язково 1,5-3-кратно, (с) підвищує антиген-специфічну Т-клітинну активацію, як виміряно
Зо за продукуванням ІІ -12, необов'язково 1,5-3-кратно, (4) підвищує активацію природних кілерних клітин, як виміряно за продукуванням будь-якого з ЇЇ -2, І -6, ТМЕа або ІЄМу, необов'язково 1,5-
З-кратно, (є) підвищує продукування Т-клітинами щонайменше одного прозапального цитокіна, необов'язково 1,5-3-кратно, і () зменшує продукування Т-клітинами щонайменше одного протизапального цитокіна, необов'язково 1,5-3-кратно.
В іншому аспекті в даній заявці представлені фармацевтичні композиції, що включають будь-яке з антитіл, описаних у даній заявці, і фармацевтично прийнятний носій.
В інших аспектах у даній заявці представлені способи для лікування або здійснення профілактики злоякісного новоутворення, що включають введення індивідові, що має рак або підвищений ризик розвитку злоякісного новоутворення, ефективного режиму або терапевтично ефективної кількості будь-якого з антитіл, розкритих у даній заявці У деяких варіантах здійснення рак являє собою гострий мієлоїдний лейкоз або Т-клітинний лейкоз дорослих. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять пухлино-інфільтруючі Т-клітини, які активуються антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять вакцину, що індукує імунну відповідь проти злоякісного новоутворення, який підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення вакцина включає антиген або його фрагмент, що експресується на поверхні ракових клітин. У деяких варіантах здійснення будь- якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять природні кілерні клітини, цитотоксичність яких проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні клітин злоякісного новоутворення, при цьому ефектор-опосередкована цитотоксичність другого антитіла проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні імунної клітини. У деяких варіантах здійснення, імунна клітина являє собою Т-клітину або природну кілерну клітину. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антиген являє собою СТІ А-4, РО-1 або РО-І1. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять одне або декілька лікувань, бо вибраних із групи, що складається з хіміотерапії, опромінення, клітинної терапії і хірургічної операції. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять інгібітор одного або декількох рецепторів або лігандів імунних контрольних точок. У деяких варіантах здійснення інгібітор вибраний із групи, що складається з іпілімумабу, ніволумабу, пембролізумабу (ламбролізумаб) і атезолізумабу.
У додаткових аспектах у даній заявці представлені способи для лікування індивіда, інфікованого патогеном, що включають введення індивідові ефективного режиму або терапевтично ефективної кількості будь-якого з антитіл, розкритих у даній заявці. У деяких варіантах здійснення патоген являє собою вірусний, бактеріальний, грибковий або найпростіший патоген. У деяких варіантах здійснення, патоген являє собою ВІЛ, ВСГ, гепатит, вірус герпесу, аденовірус, вірус грипу, флавівірус, еховірус, риновірус, вірус Коксакі, короновірус, респіраторний синцитіальний вірус, вірус епідемічного паротиту, ротавірус, вірус кору, вірус краснухи, парвовірус, вірус коров'ячої віспи, НТІ М вірус (Т лімфотропний вірус людини), вірус денге, папіломавірус, вірус молюска, поліовірус, вірус сказу, УС вірус, вірус абровірусного енцефаліту, хламідії, рикетсії, мікобактерії, стафілококи, стрептококи, пневмококи, менінгококи, гонококи, клебсієлу, протеус, серацію, псевдомонас, легіонелу, дифтерію, сальмонелу, бацили, холеру, правець, ботулізм, сибірську виразку, чуму, лептоспіроз і бактерії, що викликають хворобу Лайма. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивіда лікують вакциною, що індукує імунну відповідь проти патогену, який підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення вакцина включає білок патогену або його фрагмент. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять друге антитіло проти патогену, де ефектор-опосередкована цитотоксичність другого антитіла проти патогену підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять один або декілька із противірусного засобу, антипаразитарного засобу, антибактеріального засобу або протигрибкового засобу.
В іншому аспекті в даній заявці представлені способи, що сприяють лікуванню злоякісного новоутворення, що включають введення індивідові, що має рак, терапевтично ефективної кількості будь-якого з антитіл, розкритих у даній заявці. У деяких варіантах здійснення, рак являє собою гострий мієлоїдний лейкоз або Т-клітинний лейкоз дорослих. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять пухлино-інфільтруючі Т-клітини, які активуються антитілом. У деяких варіантах здійснення будь- якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять вакцину, що індукує імунну відповідь проти злоякісного новоутворення, що підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення вакцина включає антиген, експресований на поверхні ракових клітин, або його фрагмент. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять природні кілерні клітини, цитотоксичність яких проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні клітин злоякісного новоутворення, при цьому ефектор- опосередкована цитотоксичність другого антитіла проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні імунної клітини. У деяких варіантах здійснення, імунна клітина являє собою Т-клітину або природну кілерну клітину. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, антиген являє собою СТІ А-4, РО-1 або РО-І1. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять одне або декілька лікувань, вибраних із групи, що складається з хіміотерапії, опромінення, клітинної терапії і хірургічної операції. У деяких варіантах здійснення будь-якого з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, індивідові також вводять інгібітор одного або декількох рецепторів або лігандів імунних контрольних точок. У деяких варіантах здійснення один або декілька рецепторів або лігандів імунних контрольних точок вибрані із групи, що складається з СТІ А-4, РО-1 і РО-І 1. У деяких варіантах здійснення інгібітор вибраний із групи, що складається з іпілімумабу, ніволумабу, пембролізумабу (ламбролізумаб) і атезолізумабу.
Кожний з аспектів і варіантів здійснення, описаних у даній заявці, можна використовувати разом, якщо тільки він явно або безперечно не виключений з контексту варіанта здійснення або аспекту.
Короткий опис креслень
Фіг. 1 схематично представляє структуру векторів експресії для рекомбінантних ТІСІП і 60 СО155 білків.
Фіг. 2 представляє інгібування взаємодії ТІСІТ-СО0155 анти-ТІСІТ антитілами.
Фіг. З представляє амінокислотну послідовність ТІС1 МН.
Фіг. 4 представляє амінокислотну послідовність ТІС1 Мі.
Фіг. 5 представляє амінокислотну послідовність ТІС2 МН.
Фіг. б представляє амінокислотну послідовність ТІСа Мі.
Фіг. 7 представляє амінокислотну послідовність ТІСЗ МН.
Фіг. 8 представляє амінокислотну послідовність ТІСЗ МІ.
Фі. 9А представляє нуклеотидну послідовність НиТІСйі МН гена і амінокислотну послідовність, що кодується, тоді як
Фі. 9В представляє нуклеотидну послідовність НиТІСбІі Мі гена і амінокислотну послідовність, що кодується.
Фіг. 10 схематично представляє структуру вектора експресії РНИТІС1.АА.
Фіг. 11 показує результати ЕГІ5А аналізу зв'язування НиТІа1-Ідс1.АА з людським ТІСІТ.
Фіг. 12: ЕАС5 аналіз зв'язування НитІС1-Іда1. АА і НитІс3-ІДа1.АА з людським ТІСІТ.
Фіг. 13 представляє графік, що показує блокування взаємодії між людським ТІСІТ і людським СО155 за допомогою НитІа1-Ід4са1.АА ї НитІс3-Іда1.АА.
Фіг. 14А представляє нуклеотидну послідовність НиТІСЗ3 МН гена і амінокислотну послідовність, що кодується, тоді як
Фіг. 148 представляє нуклеотидну послідовність НиТІсЗ Мі гена і амінокислотну послідовність, що кодується.
Фіг. 15 представляє Е| ІЗА аналіз зв'язування НиТІс3-ІдДа1.АА з людським ТІСІТ.
Фіг. 16 показує підвищене продукування 1-2, викликуване ТІС1, при стимуляції антиген- специфічної імунної відповіді.
Фіг. 17 представляє підвищену СО4-- ії СОв' Т-клітинну проліферацію, викликувану ТІС1, при стимуляції антиген-специфічної імунної відповіді.
Фіг. 18 представляє експресію СО155 на К562 клітинах (вгорі) і ТІДІТ на МК клітинах (внизу).
Фіг. 19 представляє підвищену МК-клітинно-опосередковану цитотоксичність, викликувану
ТІС1 на К562 клітинах-мішенях.
Фіг. 20 показує, що НитІс1-Ід421.АА потенціює ефекторні відповіді цитокінів.
Зо Фіг. 21 представляє експресію людського ТІСІТ клітинною лінією диикаї-ТІСІТ на поверхні клітин.
Фіг. 22 показує, що НитІс1-Іда1.АА їі НитІс3-ІдДа1.АА не викликають активність СОС.
Фіг. 23 показує, що НитІСс1-ІдДа1.АА ії НитІСа3-ІДС21.АА підвищували природню Т-клітинну активацію в іп міто аналізі Т-клітинної антагоністичної активності для анти-людського антитіла до ТІСІТ.
Фіг. 24 представляє СО112, СО155 і РО-11, експресовані ЯМ-С5Е/ЛІ -4 диференційованими дендритними клітинами моноцитарного походження (тоЮсв5).
Фіг. 25 представляє підвищену секрецію ІЕМу при додаванні НитІс1-Іа1.АА, анти-РО-Ї 1 антитіла і НитІс1-Іда1.АА у комбінації з анти-РО-Ї 1 антитілом.
Фіг. 26А представляє експресію ТІСІТ і 2096 на людських лімфоїдних і мієлоїдних клітинах.
Фіг. 268 представляє репрезентативні гістограми анти-ТІСІТ забарвлювання при різних рівнях експресії.
Фіг. 27 представляє картування епітопів НиТІс1-Іса1.АА методом проточної цитометрії.
Фіг. 28 представляє стрічкове представлення позаклітинного (ДМ домену людського ТІСІТ із пронумерованими бічними ланцюгами амінокислотних залишків епітопу у вигляді тривимірної фігури.
Фіг. 29А і Фіг. 298 показують результати аналізу СО4- Т-клітинної субпопуляції для визначення експресії ТІСІТ.
Фіг. ЗОА і Фіг. ЗОВ показують результати аналізу СО8- Т-клітинної субпопуляції для визначення експресії ТІСІТ.
Фіг. 31 представляє підвищену МК клітинно-опосередковану цитотоксичність, викликувану
НитІС1-ІДС1.АА і НитІс3-ІДС1.АА, на К562 клітинах-мішенях.
Фіг. 32А представляє експресію ТІСІї она пухлино-інфільтруючих лімфоцитах з дисоційованих зразків пухлин.
Фіг. 328 представляє репрезентативні гістограми анти-ТІСІТ забарвлювання при різних рівнях експресії.
Докладний опис
Винахід забезпечує, іпієї аїйа, моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з позаклітинним доменом ТІСІТ, який є членом суперродини імуноглобулінів з імунорецепторним бо тирозиновим інгібіторним мотивом (ІТІМ) у цитоплазматичному кінцевому сегменті.
Моноклональні антитіла інгібують зв'язування ТІСІТ з СО155 і, таким чином, можуть активувати
Т-клітини і/або МК клітини. Моноклональні антитіла можна використовувати для лікування злоякісного новоутворення та інфекційного захворювання, серед інших застосувань.
І. Визначення
Моноклональні антитіла або інші біологічні сполуки, такі як фрагмент ТІСІТ, типово забезпечуються у виділеній формі. Це значить, що антитіло або інша біологічна сполука типово є щонайменше на 50 95 мас./мас. очищеним від білків, що заважають, і інших домішок, що виникають при його одержанні або очищенні, але не виключена можливість того, що моноклональне антитіло об'єднане з надлишковою кількістю фармацевтично прийнятного носія(носіїв) або іншого наповнювача, призначеного для полегшення його використання. Іноді моноклональні антитіла щонайменше на 60, 70, 80, 90, 95 або 99 95 мас./мас. очищені від білків, що заважають, і домішок від процесу одержання або очищення. Часто виділене моноклональне антитіло або інша біологічна сполука є переважною макромолекулярною частинкою, що залишилася після очищення.
Специфічне зв'язування моноклонального антитіла з його цільовим антигеном означає афінність (константу асоціації або Ка) щонайменше 106, 107, 108, 1097 або 109 М", визначену, наприклад, в аналізі Приклада 15. Специфічне зв'язування помітно вище за величиною і відмінне від неспецифічного зв'язування, що відбувається із щонайменше однією неспорідненою мішенню. Специфічне зв'язування може бути результатом утворення зв'язків між конкретними функціональними групами або конкретною просторовою відповідною структурою (наприклад, за типом замка і ключа), тоді як неспецифічне зв'язування зазвичай є результатом ван-дер-ваальсових сил. Специфічне зв'язування, однак, необов'язково припускає, що моноклональне антитіло зв'язується з однією і тільки з однією мішенню.
Основною структурною одиницею антитіла є тетрамер субодиниць. Кожний тетрамер включає дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, при цьому кожна пара має один "легкий" (близько 25 кДа) і один "важкий" ланцюг (близько 50-70 кДа). Аміно-кінцева частина кожного ланцюга включає варіабельну ділянку із близько 100-110 або більше амінокислот, переважно відповідальну за розпізнавання антигену. Ця варіабельна ділянка спочатку експресується зв'язаною з сигнальним пептидом, що відщеплюється. Варіабельну ділянку без сигнального пептиду іноді називають зрілою варіабельною ділянкою. Таким чином, наприклад, зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга означає варіабельну ділянку легкого ланцюга без сигнального пептиду легкого ланцюга. Карбокси-кінцева частина кожного ланцюга визначає константну ділянку, переважно відповідальну за ефекторну функцію.
Легкі ланцюги класифікуються як каппа- або лямбда-ланцюги. Важкі ланцюги класифікуються як гамма-, мю-, альфа-, дельта- або епсилон-ланцюги, і визначають ізотип антитіла, такий як ІдСї, ЯМ, ЧА, 90 і Ід9Е, відповідно. У межах легких і важких ланцюгів варіабельні і константні ділянки зв'язані ")"-ділянкою, що складається із близько 12 або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг також включає "0"-ділянку, що складається із близько 10 або більше амінокислот. (Дивися, загальний опис в Еипдатенпіа! Іттипоіоау (Рашці, МУ., єд., 2па ед. Вамеп Ргезз, М.У., 1989, Сп. 7, повний вміст якого включений за допомогою посилання у всій повноті для всіх цілей).
Зрілі варіабельні ділянки кожної пари легкого"єважкого ланцюга утворюють зв'язувальний сайт антитіла. Таким чином, інтактне антитіло має два зв'язувальних сайти. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, ці два сайти зв'язування є однаковими. Усі ланцюги демонструють однакову загальну структуру з відносно консервативних каркасних ділянок (ЕВ), з'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, також називаними визначальними комплементарність ділянками, або СОЯ. СОВ із двох ланцюгів кожної пари з'єднуються за допомогою каркасних ділянок, забезпечуючи зв'язування зі специфічним епітопом. Від М-кінця до С-кінця легкий і важкий ланцюги включають домени ЕРНІ, СОН, ЕНг,
СОоВг, ЕВЗ, СОВЗ і ЕВ4. Присвоєння амінокислот кожному домену здійснюється відповідно до визначення за Кеботом, бедцепсев ої Ргоївїнп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (Маїопа! Іпвійшев ої
Неанй, Веїпезаа, МО, 1987 апа 1991) или Споїпіа 8 І езК, 9. Мої. Віо!. 196:901-917 (1987); Споїйпіа еї а!І., Майте 342:878-883 (1989). Крім того, Кебот забезпечує широко використовувану систему нумерації (нумерація за Кеботом), у якій відповідним залишкам між різними важкими ланцюгами або між різними легкими ланцюгами присвоєні однакові номери.
Термін "антитіло" включає інтактні антитіла і їх зв'язувальні фрагменти. Таким чином, будь- яке посилання на антитіло слід розуміти як посилання на антитіло в інтактній формі або фрагмент, що зв'язується, якщо тільки з контексту не випливає інше. Як правило, фрагменти конкурують із інтактним антитілом, з якого вони походять, за специфічне зв'язування з мішенню, 60 включаючи окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги Раб, Раб", Е(аб)», Е(аб)с, баб», нанотіла і БСЕМ,
діатіла, 5сЕм-Ес, мінітіла, ІЯМАН»:», М-МАВ, НсіІдс, Ббіб-зсЕм, триатіла і тетратіла. Фрагменти можуть бути отримані методами рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних імуноглобулінів. Термін "антитіло" також належить до біспецифічного антитіла. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гіоридне антитіло, що володіє двома різними парами важкого/легкого ланцюга і двома різними сайтами зв'язування (див., наприклад, бопавімііаі апа І аспитапп, Сіїп. Ехр.Іттипої., 79:315-321 (1990); КовівіІпу вї аї., У. Іттипої. 148:1547-53 (1992)).
Термін "епітоп" належить до ділянки антигену, з якою зв'язується антитіло. Епітоп може бути сформований із суміжних або несуміжних амінокислот, які накладаються одна на одну при укладанні в третинну структуру одного або декількох білків. Епітопи, утворені із суміжних амінокислот (також відомі як лінійні епітопи), зазвичай зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, у той час як епітопи, утворені при формуванні третинної структури (також відомі як конформаційні епітопи), зазвичай губляться при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп типово включає щонайменше З або більше, зазвичай щонайменше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Методи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографію та двовимірний ядерний магнітний резонанс. Див., наприклад, Протоколи картування епітопів в Меїпод5 іп МоїІесшаг Віоіоду, Мої. 66, СіІепп Е. Моттів, Еа. (1996).
Антитіла, які розпізнають однакові або епітопи, що перекриваються, можуть бути ідентифіковані за допомогою звичайного імунного аналізу, що виявляє здатність одного антитіла конкурувати за зв'язування з антигеном-мішенню з іншим антитілом. Епітоп антитіла може бути також визначений за допомогою рентгенівської кристалографії антитіла, пов'язаного з його антигеном, для ідентифікації контактних залишків. Альтернативно, два антитіла мають той самий епітоп, якщо всі амінокислотні мутації в антигені, які зменшують або елімінують зв'язування одного антитіла, зменшують або елімінують зв'язування іншого антитіла. Два антитіла мають епітопи, що перекриваються, якщо деякі амінокислотні мутації, які зменшують або елімінують зв'язування одного антитіла, зменшують або елімінують зв'язування іншого антитіла.
Конкуренцію між антитілами визначають за допомогою аналізу, у якому антитіло в умовах
Зо випробування інгібує специфічне зв'язування контрольного антитіла із загальним антигеном (див., наприклад, Уипайапз єї аї!., Сапсег Нев. 50:1495, 1990). Випробовуване антитіло конкурує з контрольним антитілом, якщо надлишок випробовуваного антитіла (наприклад, щонайменше 2х, Зх, 4х, 5х, бх, 7х, вх, Ух, 10х, 15х, 20х, 25х, ЗОх, З5х, 40х, 45х, 50х, бОх, 7Ох, вОх, 90х, 100х або більше, включаючи значення між зазначеними значеннями) інгібує зв'язування контрольного антитіла щонайменше на 50 95, але переважно на 75 95, 9095 або 99 95. В інших варіантах здійснення випробовуване антитіло конкурує з контрольним антитілом, якщо надлишок випробовуваного антитіла інгібує зв'язування контрольного антитіла на будь-яку величину із щонайменше близько 55 95, 60 95, 65 95, 70 96 або переважно щонайменше близько 75 95, 76 95, 77 чув, 78 9, 79 У, 80 9, 81 У, 82 95, 83 У, 84 95, 85 У, 86 У, 87 У, 88 У, 89 У, 90 Ус, 91 У, 92 о, 9396, 94 95, 9595, 96 95, 97 90, 9895, 99 95 або 100 95, як виміряно в аналізі конкурентного зв'язування. Антитіла, ідентифіковані за допомогою методів конкурентного зв'язування (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що і контрольне антитіло, і антитіла, що зв'язуються із суміжним епітопом, розташованим проксимально щодо епітопу, з яким зв'язується контрольне антитіло, для утворення просторового утруднення.
Переважно конкуренцію оцінюють, як описано в Прикладі 14.
Термін "індивід" включає людину та інших індивідів-ссавців. У деяких випадках способи за винаходом можна використовувати для експериментальних тварин, у ветеринарії і у розробці тваринних моделей для захворювання, включаючи, але не обмежуючись цим, гризунів, включаючи мишей, щурів, хом'яків, а також приматів, таких як мавпи. У деяких варіантах здійснення індивіди приймають, або є кандидатами для приймання, або профілактичне, або терапевтичне лікування.
У контексті даної заявки амінокислотний залишок з амінокислотної послідовності, що представляє інтерес, який "відповідає" або є "відповідним", або "відповідно до" амінокислотного залишку еталонної амінокислотної послідовності, показує, що амінокислотний залишок з послідовності, що представляє інтерес, перебуває в положенні гомологічному або еквівалентному зазначеному залишку в еталонній амінокислотній послідовності. Фахівець у даній галузі зможе визначити, чи відповідає положення конкретного амінокислотного залишку в поліпептиді, такому як поліпептид ТІСІТ, положенню такого залишку в гомологічній еталонній послідовності. Наприклад, послідовність поліпептиду ТІСІТ може бути вирівняна з еталонною 60 послідовністю з використанням відомих методів (наприклад, засоби пошуку основного локального вирівнювання (ВІ А5Т), СіиеїаМу2, програми вирівнювання послідовностей на основі структури (5ТВАР) тощо). Крім того, координати кристалічної структури еталонної послідовності можуть бути використані як допомога при визначенні тривимірної структури гомологічного поліпептидного залишку (бієепаєї! еї аїЇ., Ргос. Май). Асай. сі, ОСОБА, 109: 5399-5404, 2012. В іншому аспекті, еквівалентні залишки можуть бути ідентифіковані через визначення гомології на рівні третинної структури. Використовуючи такі способи, амінокислотні залишки поліпептидного варіанта ТІСІТ можуть бути пронумеровані відповідно до нумерації положень амінокислотних залишків еталонної послідовності. Наприклад, амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1 можна використовувати для визначення нумерації положень амінокислотних залишків для кожного амінокислотного залишку ТІСІТ варіанта, що представляє інтерес, або епітопу. У деяких варіантах здійснення одна амінокислотна послідовність відповідає іншій амінокислотній послідовності, якщо вони мають ідентичність послідовностей щонайменше близько 80 95, 81 Об, 82 У, 83 95, 84 Фо, 85 95, 86 о, 87 95, 88 9Уо, 89 9, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 Ус, 96 9, 97 У, 98 оо, 99 95 або 100 95.
Для цілей класифікації амінокислотних замін як консервативних або неконсервативних, амінокислоти згруповані наступним чином: Група І (гідрофобні бічні ланцюги): Меї, Аа, Маї, І еи,
Іе; Група ІІ (нейтральні гідрофільні бічні ланцюги): Суз, Бег, ТА Група Ш (кислотні бічні ланцюги): Авр, Сіи; Група ІМ (основні бічні ланцюги): Авзп, сп, Нів, Гуз, Ага; Група М (залишки, що впливають на орієнтацію ланцюгів): С1у, Рго; і Група МІ (ароматичні бічні ланцюги): Тр, ТУг,
Ріє. Консервативні заміни включають заміни між амінокислотами того ж класу. Неконсервативні заміни включають обмін члена одного із цих класів на член іншого класу.
Відсоток ідентичності послідовностей визначають шляхом максимального вирівнювання послідовностей антитіл з використанням системи нумерації Кебота. Після вирівнювання, якщо ділянку, що представляє інтерес, антитіла (наприклад, уся зріла варіабельна ділянка важкого або легкого ланцюга) порівнюють із такою ж ділянкою еталонного антитіла, то відсоток ідентичності послідовностей між ділянками порівнюваного і еталонного антитіла являє собою кількість положень, зайнятих тією ж амінокислотою як в ділянці порівнюваного, так і еталонного антитіла, ділену на загальну кількість вирівняних положень двох ділянок, причому пропуски не враховуються, помножену на 100 для перетворення у відсотки.
Зо Композиції або способи "що включають" один або декілька перерахованих елементів, можуть включати інші елементи, конкретно не зазначені. Наприклад, композиція, яка включає антитіло, може містити тільки антитіло або антитіло в комбінації з іншими інгредієнтами.
Якщо явно не випливає з контексту, посилання на діапазон включає всі цілі числа в рамках цього діапазону і усі піддіапазони, обумовлені такими цілими числами.
ІЇ. Молекули-мішені
Якщо не зазначене інше, ТІСІї означає людський ТІСІТ. Ілюстративній людській послідовності присвоєний бм/із55-Ргої номер доступу 04 95А1. Повна послідовність людського
ТІСІТ містить 244 амінокислоти, з яких амінокислоти 1-21 являють собою сигнальний пептид, а амінокислоти 22-244 утворюють зрілий білок (ЗЕО І МО: 1). Приблизно залишки 22-141 утворюють позаклітинний домен (ЗЕО ІЮ МО: 3). Приблизно залишки 142-162 утворюють трансмембранний домен і приблизно залишки 163-2 4 4 утворюють цитоплазматичний домен.
Якщо не зазначене інше, СО155 належить до людської форми цього білка. Ілюстративна людська послідовність для людського СО155 позначена як Єм/із5-Ргої Р15151, яка являє собою білок з 417 амінокислот, з яких приблизно залишки 1-20 являють собою сигнальний пептид, 21- 343 являють собою позаклітинний домен (5ЕО 10 МО: 6) 344-367 являють собою трансмембранний домен і 368-417 являють собою цитоплазматичний домен.
Якщо явно не випливає з контексту, посилання на один із зазначених вище білків означає щонайменше позаклітинний домен білка, і зазвичай повний білок за винятком сигнального пептиду, що відщеплюється.
ІП. Антитіла за винаходом
А. Специфічність зв'язування і функціональні властивості
Винахід забезпечує моноклональні антитіла, що зв'язуються з епітопами в позаклітинному домені ТІСІТ білка. Антитіла, позначені як ТІС1, ТІС2 і ТІСЗ, є трьома такими ілюстративними мишачими антитілами. Послідовності зрілих варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів цих антитіл позначені як 5ЕО ІО МО: 10 їі 14, 181 22, і 26 і 30, відповідно. ТІС1, ТІС2 і ТтІСЗ специфічно зв'язуються з позаклітинним доменом людського ТІСІТ.
Деякі антитіла за винаходом зв'язуються з тим же або епітопом, що перекривається, що і антитіло, позначене як ТІС1, ТІС2 або ТІСЗ. Інші антитіла, що володіють такою специфічністю зв'язування, можна одержати імунізацією мишей за допомогою ТІСІЇ або його частини, бо включаючи цільовий епітоп, і скринінгу отриманих антитіл на зв'язування з позаклітинним доменом ТІСІТ, необов'язково в конкуренції з ТІС1, ТІ2 або ТІ2З3. Антитіла також можна скринувати проти мутагенованих форм ТІСІТ антигену для ідентифікації антитіла, що показує такий же або подібний профіль зв'язування з колекцією мутаційних змін, як ТІС1, ТІС2 або ТІСЗ.
Мутації можуть являти собою системну заміну аланіном (або серином, якщо аланін уже є присутнім) одного залишку за раз, або з більш широкими проміжками, по всьому позаклітинному домену ТІСІТ антитіла або його частини, у якій, як відомо, перебуває епітоп.
У Прикладі 16 картовані залишки 35, 37, 49 і 51 5ЕО ІО МО: 1 як такі, що представляють собою залишки, що утворюють епітоп ТІС1 антитіла. Заміна аланіном на будь-якому із цих залишків по суті усуває зв'язування антитіла. Винахід, таким чином, включає інші антитіла, що зв'язуються з епітопом людського ТІСІТ, що включає залишки 35 і 37 5ЕО МО: 1 і/або залишки 4 951 5ЕО ІЮО МО: 1, і переважно епітопом, що включає всі із цих залишків. Епітоп може бути лінійним (наприклад, 3-20, 3-17 або 5-10 суміжних залишків) або конформаційним. Деякі такі антитіла зв'язуються з пептидом, що складається із залишків 35-51 5ЕО 10 МО: 1 і не більш ніж 1,2, 3, 4 або 5 фланкуючих амінокислот з 5ЕО ІЮО МО: 1 з обох сторін. Деякі такі антитіла зв'язуються з пептидом, що складається із залишків 35-51 5ЕО ІЮО МО: 1. Деякі такі антитіла можуть бути генеровані шляхом імунізації такими пептидами. Приклад 19 також показує, що залишок 90 5ЕО ІО МО: 1 є критичним для зв'язування гуманізованого (Ни) ГІС антитіла з ТІСІТ, на додаток до залишків 35, 37,4 9 і 51 5ЕО ІО МО: 1. В інших варіантах здійснення антитіло (таке як НиТІСІ1 антитіло) зв'язується з епітопом, що включає один або декілька із залишків, відповідних до амінокислотних положень 35, 37, 49, 51 і/або 90 5ЕО ІО МО: 1. В інших варіантах здійснення антитіло (таке як НиТІСі антитіло) не зв'язується з одним або декількома залишками, відповідними до амінокислотних положень 34, 39, 44, 47, 52, 55, 86, 88, 92 і/або 96
ЗЕО ІЮО МО: 1.
Антитіла, що володіють специфічністю зв'язування вибраного мишачого антитіла (наприклад, ТІСІ, ТІС2 або ТІСЗ3), також можна одержати з використанням варіанта методу фагового дисплея. Див. УМУіпієї, МО 92/20791. Цей метод є особливо підходящим для одержання людських антитіл. У цьому методі варіабельну ділянку або важкого, або легкого ланцюга вибраного мишачого антитіла використовують як вихідний матеріал. Якщо, наприклад, варіабельна ділянка легкого ланцюга вибрана як вихідний матеріал, конструюють бібліотеку
Зо фагів, у якій члени демонструють однакову варіабельну ділянку легкого ланцюга (тобто мишачого вихідного матеріалу) і різні варіабельні ділянки важкого ланцюга. Варіабельні ділянки важкого ланцюга, наприклад, можна одержати з бібліотеки перегрупованих людських варіабельних ділянок важкого ланцюга. Вибирають фаг, що показує сильне специфічне зв'язування для ТІСІТ (наприклад, щонайменше 109, і переважно щонайменше 109 М").
Варіабельна ділянка важкого ланцюга із цього фага потім служить як вихідний матеріалу для конструювання додаткової бібліотеки фагів. У цій бібліотеці кожний з фагів демонструє однакову варіабельну ділянку важкого ланцюга (тобто ділянку, ідентифіковану з першої бібліотеки фагового дисплея) і різні варіабельні ділянки легкого ланцюга. Варіабельні ділянки легкого ланцюга можна одержати, наприклад, з бібліотеки перегрупованих людських варіабельних ділянок легкого ланцюга. Знову, вибирають фаг, що показує сильне специфічне зв'язування для ТІСІТ. Отримані антитіла зазвичай мають таку ж або подібну специфічність щодо епітопу, як у вихідного матеріалу з миші.
Деякі антитіла мають зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає СОВ НІ, Н2 і
НЗ, і зрілу ділянку легкого ланцюга, що включає СОН 11, 12 їі ІЗ, повністю або по суті з ТС.
Деякі антитіла мають зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає СОВ НІ, Н2 і НЗ, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає СОН І 1, 12 і І 3, повністю або по суті з
ТІС2. Деякі антитіла мають зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає СОВ НІ, Н2 і НЗ, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає СОН ІТ, 12 і ІЗ, повністю або по суті з ТІШЗ3. СОВА можуть бути визначені відповідно до будь-якого прийнятого визначення,
БО включаючи визначення за Кеботом, за Чотіа, за Кеботом і Чотіа, за АЬМ або визначення за контактом, як показано в таблиці нижче:
НЗ1--НЗ5В
НЗ1-нЗ35
Інші антитіла можна одержати шляхом мутагенезу кДНК, що кодує важкий і легкий ланцюги ілюстративного антитіла, такого як ТІСї1, ТІ2 або ТІС2З3. Моноклональні антитіла, які щонайменше на близько 80 то, 81 то, 82 то, 83 то, 84 то, 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 Фо, 92 95, 93 Фо, 94 95, 95 Ус, 96 о, 97 Фо, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичні ТС, ТІС2 або ТІСЗ в амінокислотній послідовності зрілих варіабельних ділянок важкого і/або легкого ланцюга і зберігають їх функціональні властивості, і/або які відрізняються від відповідного антитіла невеликою кількістю функціонально несуттєвих амінокислотних замін (наприклад, консервативних замін), делецій або інсерцій, також включені у винахід. Амінокислоти в каркасах варіабельних ділянок, що можливо є важливими для зв'язування, можна ідентифікувати, як описано в розділах, що належать до гуманізації, нижче. Моноклональні антитіла, що містять щонайменше одну, і переважно всі шість СОВ(5), визначених за номенклатурою Кебота, які на будь-яке з наступних значень близько 80 95, 81 95, 82 95, 83 9, 84 95, 85 95, 86 95, 87 Ус, 88 9, 89 то, 90 то, 91 зо, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичні відповідним СОВ ТІСІ1, ТІС2 або ТІСЗ, також включені.
Антитіла переважно мають одну або декілька з наступних характеристик (ї) інгібування зв'язування людського ТІСІЇ з людським СО155, (ії) інгібування зв'язування ТІСІТ з іншими лігандами, такими як СО112 і СО113, (ії) посилення антиген-специфічних Т-клітинних відповідей, (ім) активація природних кілерних клітин, (м) стимуляція природніх Т-клітинних активацій і (мї) стимуляція продукування одного або декількох імуностимуляторних цитокінів і або зниження продукування одного або декількох імуносупресорних цитокінів Т-клітинами та іншими клітинами імунної системи. Ілюстративні аналізи для вимірювання цих властивостей представлені в прикладах.
Переважні антитіла повністю або частково інгібують зв'язування ТІСІТ з СО155. Деякі антитіла можуть інгібувати таку взаємодію з будь-яким з наступних значень ІСзхо близько 25-300 нг/мл, 25-75 нг/мл, 25-50 нг/мл, 40-75 нг/мл, 50-75 нг/мл, 50-90 нг/мл, 50-100 нг/мл, 75-100 нг/мл, 50-150, 75-175 нг/мл, 100-200 нг/мл, 125-225 нг/мл, 100-250 нг/мл, 150-300 нг/мл, 175-250 нг/мл, 200-300 нг/мл, 25-275 нг/мл, 250-300 нг/мл, 49 ж/-10 95 нг/мл, 65 ж/-10 95 нг/мл або 76 ї/-10 95 нг/мл, вимірюваних, як описано в прикладах. В інших варіантах здійснення, антитіла можуть повністю або частково інгібувати зв'язування ТІСІТ з СО155 з будь-яким з наступних значень
ІСзо близько 25 нг/мл, 50 нг/мл, 75 нг/мл, 100 нг/мл, 125 нг/мл, 150 нг/мл, 175 нг/мл, 200 нг/мл, 225 нг/мл, 250 нг/мл, 275 нг/мл або 300 нг/мл або більше, включаючи концентрації, що перебувають між цими значеннями. Деякі антитіла можуть підсилювати антиген-специфічні Т- клітинні відповіді 1,5-3-кратно, наприклад, з будь-яким з наступних значень посилення відповіді приблизно 1,5,1,6,1,7,1,8,1,952,2,1,2,2,2,3,24,2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 або З-кратно або більше, як виміряно в прикладах. Деякі антитіла можуть підвищувати продукування 1, 2, З або всіх з І! -2,
І/-6, ТМЕРа і ІЕМу МК-клітинами 1,5-3-кратно, наприклад, з будь-яким з наступних значень підвищення продукування приблизно 1,5, 1,6, 1,7, 1,8,1,9,2,2,1,2,2,2,3,24,2,5,2,6, 2,7, 2,8, 2,9 або З-кратно, або більше, як виміряно в прикладах. Деякі антитіла можуть підвищувати природню Т-клітинну активацію 1,5-3-кратно, наприклад, з будь-яким з наступних значень підвищення активації приблизно 1,5, 1,6,1,7,1,8,1,952,2,1,2,2,2,3,2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 або
З-кратно, або більше, як виміряно в прикладах. Деякі антитіла можуть інгібувати рак або інфекційне захворювання, як показано у тваринній моделі або клінічних випробуваннях.
Тваринні моделі злоякісного новоутворення, у яких ракові клітини людини ін'єкують імунодефіцитній лабораторній тварині, такій як миша або щур, є широко доступними.
Гуманізація або химеризація антитіл підвищує період напівжиття іп мімо у порівнянні з вихідними мишачими антитілами. Одержуваний у результаті період напівжиття може становити 10-50 днів, наприклад, у людини. Період напівжиття можна виміряти шляхом фармакокінетичних досліджень, таких, які описані Кіт еї аї, Єиг У ої Іттипої! 24:542 (1994).
В. Нелюдські антитіла
Одержання інших нелюдських моноклональних антитіл, наприклад, мишачих, морських свинок, приматів, кролячих, курячих або щурячих, проти ТІСІЇ можна здійснити, наприклад, шляхом імунізації тварини за допомогою ТІСІТ або його фрагмента, або клітин, що несуть
ТІСІТ. Див. Напом/ 8 Іапе, Апіородіеєв, А Іарогаїогу Мапиа! (С5НР МУ, 1988) (включений за допомогою посилання для всіх цілей). Такий імуноген можна одержати із природного джерела, шляхом пептидного синтезу або рекомбінантної експресії. Необов'язково, імуноген можна вводити злитим або іншим способом, що утворює комплекс із білком-носієм. Необов'язково, імуноген можна вводити з ад'ювантом. Можна використовувати декілька типів ад'ювантів, як описано нижче. Для імунізації лабораторних тварин переважним є повний ад'ювант Фрейнда, потім неповний ад'ювант. Кроликів або морських свинок зазвичай використовують для одержання поліклональних антитіл. Мишей зазвичай використовують для одержання моноклональних антитіл. Антитіла скринують на специфічне зв'язування з ТІСІТ. Необов'язково, антитіла додатково скринують на зв'язування з певною ділянкою ТІСІТ. Такий скринінг можна здійснити шляхом визначення зв'язування антитіла з колекцією делеційних мутантів ТІСІТ і визначення того, які делеційні мутанти зв'язуються з антитілом. Зв'язування можна оцінити, наприклад, методом вестерн-блотингу, ЕАС5 або ЕП ІБА.
С. Гуманізовані антитіла
Зменшення або усунення відповіді НАМА (людського антимишачого (також застосовно до людського антищурячого або людського антикролячого, або людському антихом'якового і т. д.) антитілу) є важливим аспектом клінічної розробки підходящих терапевтичних засобів. Див., наприклад, КНахлавїї єї аї., У. Май. Сапсег Іпві. (1988), 80:937; дайНегв еї аї., Тгапзріапіайоп (1986), 41:572; Зпаулег еї аї., у). Іттипої. (1985), 13511530; Звагв еї аї., У. Віої. Везропзе Моа. (1984), 3:138; МіПег єї аї., Віоса (1983), 62:988; НакКіті еї аї., У. Іттипої. (1991), 147:1352;
Веісптапт вї аї!., Мате (1988), 332:323; дипаНапз евї а!., Сапсег Вев. (1990), 50:1495. Як описано в даній заявці, винахід забезпечує антитіла, які є гуманізованими, щоб відповідь НАМА зменшувалася або усувалася. Варіанти цих антитіл можна потім одержати з використанням рутинних способів, відомих з рівня техніки, деякі з яких описані нижче.
Гуманізоване антитіло являє собою генетично сконструйоване антитіло, у якому СОВ з нелюдського "донорного" антитіла пересаджені в послідовності людського "акцепторного" антитіла (див., наприклад, Сиєєп, 05 5530101 і 5585089; М/іпієї, 5 5225539, Сапег, 05 6407213, Адаїг, 05 5859205, 6881557, Еооїє, 5 6881557). Послідовності акцепторного антитіла можуть являти собою, наприклад, зрілу послідовність людського антитіла, суміш таких послідовностей, консенсусну послідовність із послідовностей людського антитіла або послідовність ділянки зародкової лінії. Таким чином, гуманізоване антитіло являє собою антитіло, що містить деякі або всі СОВ повністю або по суті з донорного антитіла і каркасні послідовності варіабельних ділянок і константні ділянки, якщо присутні, повністю або по суті з послідовностей людського антитіла. Подібним чином гуманізований важкий ланцюг містить щонайменше одну, дві і зазвичай всі три СОВ повністю або по суті з важкого ланцюга донорного антитіла, і каркасну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і константну ділянку важкого ланцюга, якщо присутні, по суті з людських послідовностей каркасної ділянки варіабельної ділянки важкого ланцюга і константної ділянки. Подібним чином гуманізований легкий ланцюг містить щонайменше одну, дві і зазвичай всі три СОВ повністю або по суті з легкого ланцюга донорного антитіла і каркасну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга і константну ділянку легкого ланцюга, якщо присутні, по суті з людських послідовностей каркасної ділянки варіабельної ділянки легкого ланцюга і константної ділянки. На відміну від нанотіл і ЗАБ5, гуманізоване антитіло включає гуманізований важкий ланцюг і гуманізований легкий ланцюг. Тут і далі в даній заявці, СОВ у розглянутому антитілі по суті з відповідної СОВ в еталонному антитілі, коли щонайменше близько 80 95, 81 95, 82 95, 8395, 84 95, 85 95, 86 9, 87 96, 8895, 8995, 9095, 9195, 92 95, 9396, 94 95, 9590, 9695, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 відповідних залишків (визначених за Кеботом) ідентичні між відповідними СОЕ; однак, СОВ На, як визначено за номенклатурою Кебота, у розглянутому антитілі походить по суті з відповідної
СОВ в еталонному антитілі, коли щонайменше близько 65 95, 6б 95, 67 Зо, 68 о, 69 95, 70 95, 7195, 72 ув, 73 до, 7490, 7590, 76 Уо, 77 90, 78 Чо, 79 Фо, 80 Уо, 81 Ус, 82 Фо, 83 90, 84 95, 85 Фо, 86 о, 87 96, 8895, 8995, 9095, 9195, 92 95, 9396, 94 95, 9590, 9695, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 відповідних залишків (визначених за Кеботом) ідентичні між відповідними СОВ. Каркасні послідовності варіабельної ділянки ланцюга антитіла або константна ділянка ланцюга антитіла походять по суті з людської каркасної послідовності варіабельної ділянки або людської константної ділянки, відповідно, коли щонайменше близько 80 95, 81 95, 82 90, 83 9», 84 9», 85 У,
86 Фо, 87 Зо, 88 95, 89 Фо, 90 У, 91 95, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 90, 96 У, 97 95, 98 о, 99 95 або 100 95 відповідних залишків, визначених за Кеботом, є ідентичними.
Хоча гуманізовані антитіла часто включають усі шість СОВА (переважно, визначених за номенклатурою Кебота) з нелюдського (наприклад, мишачого) антитіла, вони також можуть бути отримані з меншим числом СОВА (наприклад, щонайменше 3, 4 або 5) СОВ з нелюдського антитіла (наприклад, Равзсаїїв еї аї., у. Іттипої. 169:3076, 2002; Ма|доз сеї аї., доштаї ої МоїІесшаг
Віоіоду, 320: 415-428, 2002; Іманавні еї аї., Мої. Іттипої. 36:1079-1091, 1999; Татига єї аї, дЧоштаї ої Іттипоіоду, 164:1432-1441, 2000).
У деяких антитілах тільки частина СОВ, а саме, ряд СОМ залишків, необхідних для зв'язування, називаних ЗОВ, потрібні для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі.
СОВА залишки, що не контактують із антигеном і що не перебувають в 5ОВ, можуть бути ідентифіковані на основі попереднього дослідження (наприклад, залишки НбО-Нб5 в СО нг часто не потрібні) з ділянок СОВ за системою Кебота, розташованих поза гіперваріабельними петлями Чотіа (Споїпіа, у). Мої. Вісі. 196:901, 1987), методом молекулярного моделювання і/або емпірично, або як описано в Соплаїез вї аї., Мої. Іттипої. 41: 863, 2004. У таких гуманізованих антитілах у положеннях, у яких один або декілька з донорних СОВ залишків є відсутніми, або в яких є відсутньою уся донорна СОВ, амінокислота, що займає таке положення, може являти собою амінокислоту, що займає відповідне положення (відповідно до нумерації Кебота) у послідовності акцепторного антитіла. Кількість таких замін для включення акцепторних амінокислот замість донорних в СОВ відображує баланс міркувань, що стосуються конкуренції.
Такі заміни потенційно вигідні для зменшення кількості мишачих амінокислот у гуманізованому антитілі і, як наслідок, зменшення потенційної імуногенності. Однак заміни також можуть викликати зміни афінності, і переважно уникати значного зниження афінності. Положення для заміщення усередині СОВ і амінокислоти для заміни також можуть бути вибрані емпірично.
Хоча акцептор може бути ідентичним за послідовністю вибраної людської каркасної послідовності, незалежно від того, чи походить вона з людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної послідовності, даний винахід припускає, що акцепторна послідовність може включати раніше існуючі амінокислотні заміни щодо послідовності людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної послідовності. Ці раніше існуючі заміни переважно мінімальні; зазвичай різниця тільки в чотирьох, трьох, двох або одній амінокислоті щодо людської послідовності імуноглобуліну або консенсусної каркасної послідовності.
Послідовності людського акцепторного антитіла необов'язково можуть бути вибрані з множини відомих послідовностей людських антитіл для забезпечення високого ступеня ідентичності послідовностей (наприклад, 65-85 95 ідентичності) між каркасами варіабельної ділянки людської акцепторної послідовності і відповідними каркасами варіабельної ділянки ланцюга донорного антитіла.
Деякі амінокислоти з каркасних залишків людської варіабельної ділянки можуть бути вибрані для заміни на основі їх можливого впливу на СОАВ конформацію і/або зв'язування з антигеном.
Для дослідження таких можливих впливів використовують моделювання, дослідження характеристик амінокислот у конкретних положеннях або емпіричне спостереження ефектів замін або мутагенезу конкретних амінокислот.
Наприклад, у випадку відмінностей амінокислоти між каркасним залишком нелюдської варіабельної ділянки і вибраним каркасним залишком людської варіабельної ділянки, людська амінокислота каркасної ділянки може бути замінена еквівалентною амінокислотою каркасної ділянки з нелюдського антитіла, коли є підстави очікувати, що амінокислота: (1) нековалентно зв'язується з антигеном безпосередньо, (2) є суміжною з СОВЕ ділянкою, (3) або інакше взаємодіє з СОВ ділянкою (наприклад, перебуває в межах близько 6 А від
СОВ ділянки).
Іншими кандидатами для заміни є амінокислоти акцепторної людської каркасної ділянки, які є незвичайними для імуноглобуліну людини в цьому положенні. Ці амінокислоти можуть бути замінені амінокислотами з еквівалентного положення нелюдського донорного антитіла або з еквівалентних положень більш типових людських імуноглобулінів. Іншими кандидатами для заміни є амінокислоти акцепторної людської каркасної ділянки, які є незвичайними для імуноглобуліну людини в цьому положенні.
Переважне гуманізоване антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга щонайменше на близько 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 95, 87 Ус, 88 У, 89 Ус, 90 Об, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 90, 95 о, 96 Фо, 97 У, 98 95, 99 96 або менше ніж 100 95 ідентичну 5ЕО ІЮ
МО: 35 і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга щонайменше на близько 80 95, 81 95, 82 9бо, 60 83 95, 84 Фо, 85 Фо, 86 95, 87 У, 88 Уо, 89 90, 90 Фо, 91 Фо, 92 Уо, 93 Ус, 94 Фо, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 о,
99 95 або менше ніж 100 95 ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 37. Переважно, будь-яка зміна може мати місце по каркасних залишках варіабельної ділянки, за винятком тих, які визначені як можливо важливі для зв'язування (див. абзац (0073)). Переважно, будь-яка зміна являє собою консервативну амінокислотну заміну. Переважне антитіло включає зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІО МО: 35 їі зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІО МО: 37. Для експресії повнорозмірного антитіла зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга переважно зв'язують із константною ділянкою важкого ланцюга, що складається з або що включає, 5ЕО ІЮ МО: 40, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга переважно зв'язують із константною ділянкою легкого ланцюга, що складається з або що включає, 5ЕО ІЮ
МО: 41.
Інше переважне гуманізоване антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга щонайменше на близько 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 95, 87 Ус, 88 У, 89 Ус, 90 Об, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 90, 95 о, 96 Фо, 97 У, 98 95, 99 96 або менше ніж 100 95 ідентичну 5ЕО ІЮ
МО: 43 і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга щонайменше на близько 80 95, 81 95, 82 9бо, 83 У, 84 95, 85 У, 86 95, 87 У, 88 95, 89 У, 90 9, 91 У, 92 Ус, 93 У, 94 Ус, 95 У, 96 Ус, 97 У, 98 9, 99 95 або менше ніж 100 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 45. Переважно, будь-яка зміна має місце по каркасних залишках варіабельної ділянки, за винятком тих, які визначені як можливо важливі для зв'язування (див. абзац І0073| і приклади). Переважно, будь-яка зміна являє собою консервативну амінокислотну заміну. Переважне антитіло включає зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 43, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має послідовність ФЕО ІЮ МО: 45. Для експресії повно розмірного антитіла зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга переважно зв'язують із константною ділянкою важкого ланцюга, що складається з або що включає 5ЕО ІЮ МО: 48, за умови, що С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга переважно зв'язують із константною ділянкою легкого ланцюга, що складається з або що включає 5ЕО ІЮ
МО: 49. р. Химерні і веновані антитіла
Винахід також забезпечує химерні і веновані форми нелюдських антитіл, зокрема, ТІСТІ,
Ко) ТІС2, і ТІСЗ антитіл прикладів.
Химерне антитіло являє собою антитіло, у якому зрілі варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів нелюдського антитіла (наприклад, мишачого) присутні в комбінації з людськими константними ділянками легкого і важкого ланцюгів. Такі антитіла по суті або повністю зберігають специфічність зв'язування нелюдського антитіла і є приблизно на дві третини людською послідовністю.
Веноване антитіло являє собою тип гуманізованого антитіла, яке зберігає деякі і зазвичай всі з СОВ, і деякі з каркасних залишків нелюдської варіабельної ділянки нелюдського антитіла, але із заміною інших каркасних залишків варіабельної ділянки, які можуть сприяти взаємодії з В- або Т-клітинними епітопами, наприклад, експонованих залишків (Радіап, Мої. Іттипої. 28:489, 1991) залишками з відповідних положень послідовності людського антитіла. Результатом є антитіло, у якому СОВА повністю або по суті з нелюдського антитіла, а каркаси варіабельних ділянок нелюдського антитіла стали більш подібні людським шляхом замін. Веновані форми
ТІСТІ, ТІС2 або ТІСЗ антитіла включені у винахід.
Е. Людські антитіла
Людські антитіла проти ТІСІТ забезпечуються з використанням різних способів, описаних нижче. Деякі людські антитіла вибирають шляхом здійснення експериментів конкурентного зв'язування, методом фагового дисплея М/іпієг, описаного вище, або як такі, що мають таку ж епітоп-специфічність, як у конкретного мишачого антитіла, такого як одне з мишачих моноклональних антитіл, описаних у прикладах. Людські антитіла також можна скринувати на специфічність щодо конкретного епітопу з використанням тільки фрагмента ТІСІТ як антигену- мішені і/або шляхом скринінгу антитіла проти колекції делеційних мутантів ТІСІТ.
Способи одержання людських антитіл включають триомний метод Оевібвего еї а!., Нургідота 2:361-367 (1983); Оєзірега, Патент США Мо 4634664; і Епдієтап єї а)І., Патент США Мо 4634666, використання трансгенних мишей, що включають гени людського імуноглобуліну (див., наприклад, І опрегу єї аі., МО 93/12227 (1993); 05 5877397, 05 5874299, ОБ 5814318, 5 5789650, 005 5770429, 0055661016, 05 5633425, 5 5625126, 05 5569825, 5 5545806, Маїшйге 148, 1547-1553 (1994), Майте Віотесппоіоду 14, 826 (1996), Киспепараїї, УМО 91/10741 (1991) і методи фагового дисплея |див., наприклад, Юоуег єї а). МО 91/17271 і МсСанепу єї аїІ., МО 92/01047, 5 5877218, 05 5871907, 5 5858657, 05 5837242, 05 5733743 ії 5 5565332). 60 Е. Вибір константної ділянки
Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів химерних, гуманізованих (включаючи веновані) або людських антитіл можуть бути пов'язані із щонайменше частиною людської константної ділянки. Вибір константної ділянки залежить, частиною, від того, чи є бажаними антитіло-залежний комплемент і/або клітинно-опосередкована цитотоксичність. Наприклад, людські ізотипи ді і їд053 мають комплемент-опосередковану цитотоксичність, а людські ізотипи (2 і ІдСс4 її не мають. Константні ділянки легкого ланцюга можуть бути лямбда або каппа. Для імунотерапії проти злоякісного новоутворення або патогену, що не експресує ТІСІТ, часто переважні людські ЇдДС2 або Ідс4 або атенуйована форма людського ІдС1 зі зниженою ефекторною функцією. Для людського ІдДс24 часто переважно включення 5228Р (Би нумерація) генно-інженерної мутації на важкому ланцюзі для запобігання обміну Гар-фрагментами. Однак для елімінації ракових клітин, що експресують ТІСІТ (наприклад, з Т-клітинних або МК-клітинних пухлин) або для імуносупресії часто переважні людські ІДС або Ідсаз.
Людські константні ділянки демонструють алотипові варіації і ізоалотипові варіації в різних індивідуумів, тобто константні ділянки можуть відрізнятися в різних індивідуумів за одним або декількома поліморфним положенням. Ізоалотипи відрізняються від алотипів тим, що білки сироватки, які розпізнають ізоалотип, зв'язуються з неполіморфною ділянкою одного або декількох інших ізотипів. Посилання на людську константну ділянку включає константну ділянку із будь-яким природним алотипом або будь-якою пермутацією залишків, що займають поліморфні положення в природних алотипах.
Одна або декілька амінокислот на аміно або карбокси кінці легкого і/або важкого ланцюга, такі як С-кінцевий лізин важкого ланцюга, може бути відсутньою або може бути перетворена в частини або в усі із цих молекул. Заміни можуть бути в константних ділянках для зниження або підвищення ефекторної функції, такої як комплемент-опосередкована цитотоксичність або
АОСС (див., наприклад, УУіпієг єї аі., Патент США Мо 5624821; Т50 єї аЇ., Патент США Мо 5834597; і І агаг єї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 103:4005, 2006), або для продовження періоду напівжиття в організмі людини (див., наприклад, Ніпіоп еї аї.,.). Віої. Спет. 2796213, 2004).
Ілюстративні заміни включають Сіп у положенні 250 і/або І єи у положенні 428 (Ем нумерація) для збільшення періоду напівжиття антитіла.
Деякі антитіла за винаходом конструюють шляхом введення мутації(мутацій) у константній ділянці для одержання знижених ефекторних функцій, таких як СОС і АОСС або АОСР, у порівнянні з таким же антитілом без мутації (мутацій). Переважно, кожна або всі із цих ефекторних функцій знижуються щонайменше на 50 95, 75 95, 90 95 або 95 95 у порівнянні з антитілами без мутації. Представлені приклади показують, як можна виміряти СОС. Інші аналізи описані в опієЇїдв5 еї аіЇ, 2001 9. Віої. Спет., Мої. 276, р 6591-6604; Спарреї! єї аї., 1993 9. Віої.
Спет., Мої 268, р 25124-25131; І агаг єї аі., 2006 РМАБ, 103; 4005-4010.
Заміна будь-якого або всіх положень 234, 235, 236 і/або 237 знижує афінність до Ееу рецепторів, зокрема, до ЕєуВІ рецептора (див., наприклад, 5 6624821). Аланін є переважним залишком для заміни і /234А/235А є переважною подвійною мутацією для зниження ефекторної функції. Інші комбінації мутацій зі зниженими ефекторними функціями включають
І234А/ 235А/ с237А, Е2З3ЗР/ 234М/ 2356/2236, АЗ27с7АЗ3305/РЗЗ315, КЗ22А, 1234А і 1235А,
І/234ЕЛ 235Е/РЗ3315. Необов'язково, положення 234, 236 і/або 237 у людському ІдС2 замінені аланіном, а положення 235 глутаміном (див., наприклад, 05 5624821). Дві амінокислотні заміни в сайті зв'язування комплементу Сід у положеннях 330 і 331 (Еи-індекс) зменшують фіксацію комплементу (див. Тао єї аї., ). Ехр. Мей. 178:661 (1993) ії Сапіїєїд апа Могтізоп, У. Ехр. Меа. 173:1483 (1991)). Заміна в людському Ідс1 або ІдД2б2 залишків у положеннях 233-236 і в Іїдс4 залишків у положеннях 327, 330 і 331 сильно знижує АОСС ії СОС (див., наприклад, Агтоиг КІ. еї а!., 1999 Єиг У Іттипої. 29 (8):2613-24; і ЗПпівЇдв ВІ.. єї а!., 2001. У Віої Снет. 276 (9): 6591- 604). М297А, М297О або М297Са (Би нумерація) мутації знижують глікозилювання і, відповідно, ефекторні функції. а. Експресія рекомбінантних антитіл
Химерні, гуманізовані (включаючи веновані) і людські антитіла, як правило, одержують шляхом рекомбінантної експресії. Рекомбінантні полінуклеотидні конструкції типово включають контролюючу експресію послідовність, функціонально пов'язану з послідовностями, що кодують, ланцюгів антитіла, включаючи природно-асоційовані або гетерологічні промоторні ділянки.
Переважно, послідовності, що контролюють експресію, являють собою еукаріотичні промоторні системи у векторах, здатних трансформувати або трансфікувати еукаріотичні клітини-хазяї.
Після введення вектора підходящому хазяїнові, цього хазяїна підтримують в умовах, що підходять для високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей, і здійснюють збір і очищення рекомбінантних антитіл.
Клітини ссавця є переважним хазяїном для експресії нуклеотидних сегментів, що кодують імуноглобуліни або їх фрагменти. Див. М/іппаскег, ГЕгот С1єпев ю Сіопе5, (МСН РибіїзНетгв, МУ, 1987). Різні підходящі клітинні лінії-хазяї, здатні секретувати інтактні гетерологічні білки, були розроблені в даній галузі, і вони включають СНО клітинні лінії, різні СО5 клітинні лінії, Неї а клітини, НЕК293 клітини, Ї клітини і не продукуючі антитіла мієломи, включаючи 5рг2/0 і М50.
Переважно, клітини є нелюдськими. Вектори експресії для цих клітин можуть включати контролюючі експресію послідовності, такі як точка початку реплікації, промотор, енхансер (Ойцееєп еї аї., Іттипої. Вем. 89:49 (1986)), і необхідні сайти обробки інформації, такі як сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання і послідовності термінаторів транскрипції. Переважними контролюючими експресію послідовностями є промотори, що походять з ендогенних генів, цитомегаловірусу, 5МУ4 0, аденовірусу, бичачого папіломавірусу тощо. Див. Со еї аї!., У. Іттипої!. 148:1149 (1992).
Після того, як антитіла експресовані, вони можуть бути очищені відповідно до стандартних процедур, відомих в даній галузі технікию, включаючи ВЕРХ очищення, колонкову хроматографію, гель-електрофорез тощо. (див. у загальному 5сорев5, Ргоївїп Ритпіїсайоп (5ргіпдег!-Мепад, МУ, 1982)).
ІМ. Терапевтичні застосування
Антитіла можуть використовуватися для посилення імунних реакцій при лікуванні злоякісного новоутворення та інфекційних захворювань. Розлади, що піддаються лікуванню антитілами за винаходом, включають, без обмеження, рак, включаючи гематологічні злоякісні пухлини і солідні пухлини. Такі ракові пухлини можуть експресувати або не експресувати ТІСІТ або СО155. Антитіла до ТІСІТ ефективні проти злоякісного новоутворення, що не експресує
ТІСІТ, оскільки інгібування взаємодії ТІСІТ з СО155 стимулює імунну відповідь проти таких видів злоякісного новоутворення. Приклади гематологічних злоякісних новутворень включають лейкози, лімфоми і мієломи, включаючи гострий мієлоїдний лейкоз, Т-клітинний лейкоз дорослих, Т-клітинний крупногранулярний лімфоцитарний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, хронічний мієлолейкоз, гострий моноцитарний лейкоз, лімфому Ходжкіна і не ходжкінську лімфому, і множинну мієлому. Приклади солідних пухлин включають, без обмеження, рак яєчників, рак ендометрія, рак молочної залози, рак легень
Зо (дрібноклітинний або недрібноклітинний), рак товстої кишки, рак передміхурової залози, рак шийки матки, рак підшлункової залози, рак шлунка, рак стравоходу, гепатоцелюлярну карциному (рак печінки), нирковоклітинну карциному (рак нирки), пухлини голови і шиї, мезотеліому, меланому, саркоми і пухлини головного мозку (наприклад, гліоми, такі як гліобластоми).
Способи за винаходом можна здійснити на практиці в умовах ад'ювантної терапії. "Умови ад'ювантної терапії" належить до клінічної ситуації, коли індивід має історію проліферативного захворювання, особливо злоякісного новоутворення, і зазвичай (але не обов'язково) відповідав на лікування, яке включає, але не обмежується цим, хірургію, променеву терапію і/або хіміотерапію. Однак через історію проліферативного захворювання ці індивіди вважаються підданими ризику розвитку цього захворювання. Лікування або введення в "умовах ад'ювантної терапії" належить до наступного способу лікування. У деяких варіантах здійснення в даній заявці представлений спосіб для лікування або здійснення профілактики злоякісного новоутворення, що включає введення індивідові, що має рак або підвищений ризик розвитку злоякісного новоутворення, терапевтично ефективної кількості будь-якого з антитіл, розкритих у даній заявці в умовах ад'ювантної терапії.
Способи, представлені в даній заявці, також можна здійснювати в "не ад'ювантних умовах", тобто спосіб можна здійснити до первинної/радикальної терапії. У деяких аспектах індивід раніше проходив лікування. В інших аспектах індивід раніше не проходив лікування. У деяких аспектах лікування являє собою терапію першої лінії. У деяких варіантах здійснення в даній заявці представлений спосіб для лікування або здійснення профілактики злоякісного новоутворення, що включає введення індивідові, що має рак або підвищений ризик розвитку злоякісного новоутворення, терапевтично ефективної кількості будь-якого з антитіл, розкритих у даній заявці, в не ад'ювантних умовах.
Інші розлади, які можна лікувати антитілами за винаходом, включають інфекційні захворювання, викликані вірусами, бактеріями, грибами, найпростішими та іншими патогенами (наприклад, гепатит (А, В або С), вірус герпесу (наприклад, МАМ, НБМ-1, НАМ-6, Н5М-Ї, і СМУ, вірус Епштейна-Барра), аденовірус, вірус грипу, флавівіруси, еховірус, риновірус, вірус Коксакі, короновірус, респіраторний синцитіальний вірус, вірус епідемічного паротиту, ротавірус, вірус кору, вірус краснухи, парвовірус, вірус коров'ячої віспи, НТІ М вірус, вірус денге, папіломавірус, бо вірус молюска, поліовірус, вірус сказу, УС вірус, ВІЛ, ВСГ ії вірус абровірусного енцефаліту,
хламідії, рикетсії, мікобактерії, стафілококи, стрептококи, пневмококи, менінгококи і гонококи, клебсієлу, протеус, серацію, псевдомонас, легіонелу, дифтерію, сальмонелу, бацилу, холеру, правець, ботулізм, сибірську виразку, чуму, лептоспіроз і бактерії, що викликають хворобу
Лайма.
А. Введення антитіл
Антитіла, описані в даній заявці, вводять в ефективному режимі, що означає дозування, спосіб введення і частоту введення, які затримують початок розвитку, зменшують тяжкість, інгібують подальше погіршення і/або поліпшують щонайменше одну ознаку або симптом розладу. Якщо індивід уже страждає від розладу, режим можна назвати терапевтично ефективним режимом. Якщо в індивіда підвищений ризик захворювання в порівнянні із загальною популяцією, але він ще не відчуває симптомів, режим можна назвати профілактично ефективним режимом. У деяких випадках терапевтична або профілактична ефективність може спостерігатися в окремого індивіда щодо історичних контролів або досвіду минулого в того ж індивіда В інших випадках терапевтична або профілактична ефективність може бути продемонстрована в доклінічних або клінічних випробуваннях у популяції, що одержують лікування індивідів у порівнянні з контрольною популяцією індивідів, що не одержують лікування.
У деяких аспектах будь-який з описаних у даній заявці способів включає введення терапевтично ефективної кількості одного або декількох антитіл, описаних у даній заявці, індивідам, що потребують цього. Використовуваний у даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" або "тнерапевтично ефективна доза" протиракової терапії (такої як будь-яке з антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці) являє собою кількість, достатню для одержання корисних або бажаних результатів. Для терапевтичного застосування корисні або бажані результати включають клінічні результати, такі як зменшення одного або декількох симптомів, викликаних злоякісним новоутворенням, підвищення якості життя індивідів, що страждають від злоякісного новоутворення, зменшення дози інших лікарських засобів, необхідних для лікування злоякісного новоутворення, підвищення ефекту іншого лікарського засобу, наприклад, шляхом націлювання, затримки прогресування захворювання і/або продовження виживання. Ефективну дозу можна вводити у вигляді одного або декількох введень. Для цілей даного винаходу ефективне дозування протиракової терапії являє собою кількість, достатню для здійснення терапевтичного або профілактичного лікування безпосередньо або опосередковано. Як розуміється в клінічному контексті, терапевтично ефективна доза протиракової терапії може досягатися або не досягатися в комбінації з іншою протираковою терапією.
Ілюстративні дози для будь-якого з антитіл, описаних у даній заявці, становлять близько 0,1- 20 мг/кг або 0,5-5 мг/кг маси тіла (наприклад, близько 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг або 20 мг/кг) або 10-1500 мг (наприклад, будь-яка доза з менше ніж 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1100 мг, 1200 мг, 1300 мг, 1400 мг або 1500 мг, або більше, включаючи значення між цими цифровими значеннями), у вигляді фіксованої дози. Доза залежить від стану індивіда і відповіді на попереднє лікування, якщо воно мало місце, незалежно від того, є лікування профілактичним або терапевтичним, і від того, є розлад гострим або хронічним, крім іншого.
Введення може бути парентеральним, внутрішньовенним, пероральним, підшкірним, інтраартеріальним, інтракраніальним, інтратекальним, інтраперитонеальним, інтратуморальним, місцевим, інтраназальним або внутрішньом'язовим. Переважним є введення в системний кровотік шляхом внутрішньовенного або підшкірного введення. Внутрішньовенне введення можна здійснити, наприклад, шляхом інфузії протягом періоду, такого як 30-90 хв.
Частота введення залежить від періоду напівжиття антитіла в кровотоку, стану індивіда і способу введення, серед іншого. Частота може бути щоденною, щотижневою, щомісячною, щоквартальною або з нерегулярними інтервалами у відповідь на зміни стану індивіда або прогресування розладу, що зазнає лікуванню. Як приклад, частота для внутрішньовенного введення являє собою введення від одного разу на тиждень до одного разу у квартал у ході безперервного періоду лікування, хоча також можливо більш-менш часте введення. Для підшкірного введення, як приклад можна вказати частоту введення від одного разу на день до одного разу на місяць, хоча можливо більш-менш часте введення.
Кількість доз, що вводяться, залежить від того, чи є захворювання гострим або хронічним, а також від відповіді розладу на лікування. Для гострих розладів або гострих загострень хронічних розладів часто буває досить від 1 до 10 доз. Іноді одна болюсна доза, необов'язково у вигляді бо дробових доз, достатня при гострому розладі або гострому загостренні хронічного розладу.
Лікування може повторюватися при рецидиві гострого розладу або гострого загострення. При хронічних захворюваннях антитіло можна вводити через регулярні проміжки часу, наприклад, щотижня, раз на два тижні, раз на місяць, раз у квартал, раз на шість місяців протягом щонайменше 1, 5 або 10 років або протягом життя індивіда.
Лікування, що включає антитіло проти ТІСІТ, може полегшити захворювання, збільшуючи середню виживаність без прогресування або загальний час виживання пацієнтів зі злоякісним новоутворенням щонайменше на близько 30 95, 31 о, 32 Ус, 33 Зо, 34 У, 35 90, 36 Зо, 37 90, 38 о, 39 Уо, 40 95, 41 95, 42 Фо, АЗ У, 44 90, 45 90, 46 Фо, 47 Чо, 48 90, 49 9о, але переважно щонайменше на близько 50 зо, 51 то, 52 то, 53 то, 54 Зо, 55 90, 56 Зо, 57 о, 58 то, 59 то, 6о0 то, 61 то, 62 то, 63 то, 64 95, 65 Фо, 66 Фо, 67 90, 68 У, 69 Уо, 70 90, 71 Фо, 72 Фо, 7/З о, 74 о, 75 ую, 76 90, 77 90, 78 Фо, 79 Уо, 80 Фо, 81 95, 82 У, 83 95, 84 Фо, 85 95, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У, 9695, 97 95, 9895, 9995 або навіть 10095, у порівнянні з контрольними індивідами, або збільшити будь-який час із зазначених на 2 тижні, 1, 2 або З місяця, або переважно на 4 або 6 місяців, або навіть на 9 місяців, або на рік. Крім того або альтернативно, лікування, що включає анти-ТІСІТ антитіло, може підвищити відсоток пацієнтів 3 повною відповіддю, частковою відповіддю або об'єктивною відповіддю (повна т часткова) щонайменше на близько 30 95, 31 Об, 32 У, 33 ую, 34 90, 35 Чо, 36 бю, 37 90, 38 У, 39 Уо, 40 90, 41 90, 42 Фо, 43 У, 44 У, 45 Чо, 46 95, 47 90, 48 95, 49 96, але переважно щонайменше на близько 50 95, 51 95, 52 95, 53 Уо, 54 90, 55 90, 56 Об, 57 У, 58 95, 59 У, 60 95, 61 У, 62 95, 63 У, 64 95, 65 У, 66 У, 67 У, 68 Зо, 69 У, 70 У, 71 У, 72 о, 7З У, 7495, 7590, 769, 77 Чо, 78 90, 79 У, 80 9, 81 в, 82 Ус, 83 У, 84 У, 85 У, 86 Ус, 87 У, 88 У, 89 Фо, 90 95, 91 о, 92 Фо, 93 Зо, 94 Фо, 95 95, 96 о, 97 Фо, 98 о, 99 95 або навіть 100 95, у порівнянні з контрольними індивідами. Контрольні індивіди приймають те ж лікування, що і індивіди, які приймають анти-ТІСІТї антитіло, за винятком анти-ТІСІТ антитіла. Таким чином, контрольні індивіди можуть приймати тільки плацебо або комбінацію плацебо і деякого хіміотерапевтичного засобу відмінного від анти-ТІСІї антитіла, якщо такий засіб також приймають індивіди, що приймають анти-ТІСІТ антитіло.
Анти-ТІСІТ антитіла, розкриті в даній заявці можуть підсилювати МК-клітинно- опосередковану цитотоксичність СО 155-експресуючих клітин (таких як, але не обмежуючись цим, К562 клітини), на будь-яку величину із близько 10 95, 11 95, 12 95, 13 95, 14 90, 15 95, 16 Ор,
Зо 17 У, 18 95,19 95, 20 90, 21 95, 22 95, 23 Ую, 24 ую, 25 У 26 95 27 У, 28 95, 29 90, ЗО Зо, З1 Фо, 32 о, 336, 3495, 3590 або більше в порівнянні з рівнем МК-клітинно-опосередкованої цитотоксичності СО 155-експресуючих клітин під час відсутності одного з анти-ТІСІТ антитіл, розкритих у даній заявці.
Як правило, у клінічних випробуваннях (наприклад, у фазі І, у фазі ПЛ або у фазі ІП) збільшення середньої виживаності без прогресування і/або частоти відповіді індивідів, що одержували антитіло проти ТІСІТ, у порівнянні з контрольною групою індивідів статистично значиме, наприклад, на рівні р-0,05 або 0,01, або навіть 0,001. Відсотки пацієнтів з повною і частковою відповіддю визначаються об'єктивними критеріями, зазвичай використовуваними в клінічних випробуваннях для лікування злоякісного новоутворення, наприклад, перерахованими або прийнятими Національним інститутом раку і/або Управлінням з контролю над продуктами і ліками, і можуть включати, наприклад, визначення об'єму пухлини, кількості пухлин, метастазів, час виживання і якості життя, серед іншого.
Фармацевтичні композиції для парентерального введення переважно є стерильними і, по суті, ізотонічними і виготовляються в умовах (СМР (правила правильного виробництва).
Фармацевтичні композиції можуть бути представлені в стандартній дозованій формі (тобто доза для одного введення). Фармацевтичні композиції можуть бути сформульовані з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, розріджувачів, ексципієнтів або допоміжних речовин. Лікарська форма залежить від вибраного шляху введення. Для ін'єкцій антитіла можуть бути сформульовані у водних розчинах, переважно у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний розчин, або ацетатний буфер (щоб зменшити дискомфорт у місці ін'єкції). Розчин може містити агенти для формулювання, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. Альтернативно, антитіла можуть бути в ліофілізованій формі для відновлення підходящим носієм, наприклад стерильною апірогенною водою, перед використанням. Концентрація антитіла в рідких композиціях може варіюватися приблизно в межах 10-150 мг/мл. У деяких композиціях концентрація становить близько 25-50 мг/мл.
В. Комбіновані терапії
Даний винахід передбачає застосування антитіл проти ТІСІТ у комбінації з одним або декількома активними терапевтичними засобами (наприклад, хіміотерапевтичними засобами), бо або іншими профілактичними або терапевтичними модальностями (наприклад, опроміненням).
У такій комбінованій терапії різні активні засоби часто мають різні взаємодоповнюючі механізми дії. Така комбінована терапія може бути особливо переважною, дозволяючи знизити дозу одного або декількох засобів, зменшуючи або усуваючи, таким чином, побічні ефекти, пов'язані з одним або декількома засобами. Крім того, така комбінована терапія може мати синергічний терапевтичний або профілактичний ефект на основне захворювання, розлад або стан.
Використовуваний у даній заявці термін "комбінація" означає терапевтичні засоби, які можна вводити окремо, наприклад, сформульованими окремо для окремого введення (наприклад, як може бути передбачено в наборі), і терапевтичні засоби, які можна вводити разом в одній композиції (тобто "спільна композиція").
У деяких варіантах здійснення будь-яке з антитіл проти ТІСІТ, розкритих у даній заявці, вводять або застосовують послідовно, наприклад, коли один засіб вводять перед одним або декількома іншими засобами. В інших варіантах здійснення антитіла вводять одночасно, наприклад, коли два або більше засобів вводять приблизно в той самий час; два або більше засобів можуть бути присутніми у двох або більше окремих композиціях або об'єднані в одну композицію (тобто спільну композицію). Незалежно від того, чи вводять два або більше засобів послідовно або одночасно, вони вважаються такими, що вводяться в комбінації для цілей даного винаходу.
Антитіла за даним винаходом можна використовувати в комбінації із щонайменше одним іншим (активним) засобом будь-яким чином відповідно до даних обставин. В одному варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом і щонайменше одним антитілом проти ТІСІТ за даним винаходом підтримують протягом певного періоду часу. В іншому варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом зменшують або припиняють (наприклад, коли індивід стабільний), у той час як лікування антитілом проти ТІСІТ за даним винаходом підтримують при постійному режимі введення. У ще одному варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом зменшують або припиняють (наприклад, коли індивід стабільний), тоді як лікування антитілом проти ТІСІТ за даним винаходом зменшують (наприклад, більш низька доза, менш часте введення або більш короткий режим лікування). У ще одному варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом зменшують або припиняють (наприклад, коли індивід стабільний), і лікування антитілом проти ТІСІТ за даним
Ко) винаходом збільшують (наприклад, більш висока доза, більш часте введення або більш тривалий режим лікування). У ще одному варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом підтримують, а лікування антитілом проти ТІСІЇ за даним винаходом зменшують або припиняють (наприклад, більш низька доза, менш часте введення або більш короткий режим лікування). У ще одному варіанті здійснення лікування щонайменше одним активним засобом і лікування антитілами проти ТІСІї за даним винаходом зменшують або припиняють (наприклад, більш низька доза, менш часте введення або більш короткий режим лікування).
Лікування антитілами за винаходом можна поєднувати з іншими лікуваннями, ефективними проти розглянутого розладу. При використанні в лікуванні проліферативного стану, злоякісного новоутворення, пухлини або передракових захворювань, розладів або станів антитіла за винаходом можна поєднувати з хіміотерапією, опроміненням (наприклад, локалізованою променевою терапією або загальною променевою терапією тіла), лікуванням стовбуровими клітинами, хірургією або лікуванням іншими біологічними препаратами.
У деяких варіантах здійснення даний винахід належить до способів придушення пухлини або росту пухлини, що включають введення антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці, у комбінації з інгібітором сигнальної трансдукції (51) для досягнення адитивного або синергетичного придушення росту пухлини. Використовуваний у даній заявці термін "інгібітор сигнальної трансдукції" належить до засобу, який селективно інгібує одну або декілька стадій у сигнальному шляху. Інгібітори сигнальної трансдукції (5ТІ5) за даним винаходом включають: (Її) інгібітори ВСВ-АВІ -кінази (наприклад, іматиніб мезилат (СІ ЕЕМЕС)); (ії) інгібітори рецепторів епідермального фактора росту (ЕСЕ), у тому числі інгібітори кінази і антитіла; (ії) інгібітори НЕВ- 2/пеи-рецепторів (наприклад, НЕВСЕРТІМ); (ім) інгібітори кіназ родини АКІ або шляху АКІ (наприклад, рапаміцин); (м) інгібітори кінази клітинного циклу (наприклад, флавопіридол); і (мі) інгібітори фосфатидилінозиткінази. Засоби, що беруть участь в імуномодуляції, також можна використовувати в комбінації з антитілами проти ТІСІї, описаними в даній заявці, для придушення росту пухлини в ракових пацієнтів.
Приклади хіміотерапевтичних засобів включають, але не обмежуються цим, алкілуючі засоби, такі як тіотепа і циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імсульфан і піроссульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і бо метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід,
триетилентіофосфаорамід і триметилоломелаламід; азотисті іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид мехлоретамін оксид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациліприт; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеаміцин, карбабіцин, каміноміцин, карцинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-І -норлейцин, доксорубіцин, епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, мікофенолова кислота, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-Е)); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуринові аналоги, такі як флударабін, б-еркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; піримідинові аналоги, такі як анцитабін, азацитидин, б-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флуксуридин, 5-РИ; андрогени, такі як каластоун, дромоностанол пропіонат, епітіотонол, мепітіостан, тестолактон; засоби, що пригнічують функції надниркових залоз, такі як аміноглутетимід, мітотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамідглікозид; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елформітин; еліптиній ацетат; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентінан; лонідамін; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подофілинова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; разоксан; сизофіран; спірогерманій; тенуазонова кислота; триазиквон; 2,227- трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид (Ара-С); циклофосфамід; тіотепа; токсоиди (наприклад, таксани), наприклад паклітаксел, таксол і доксетаксел; хлорамбуцил; гемцитабін; б-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; платина і платинові координаційні комплекси, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; етопозид (МР-16); іфосфамід; мітоміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат;
СРТІ1; інгібітори топоіїзомерази; камптотецини, дифторметилорнітин (ОМЕО); ретиноєва
Зо кислота; еспераміцини; капецитабін; антиметаболіти (наприклад, азатіоприн); антрацикліни; рослинні алкалоїди (включаючи, наприклад, алкалоїди барвінку); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з вищевказаних.
Хіміотерапевтичні засоби також включають анти-гормональні засоби, які діють як регулюючі або інгібуючі гормональний вплив на пухлини, такі як антиестрогени, включаючи, наприклад, тамоксифен, ралоксифен, інгібуючі ароматазу 4(5)-імідазоли, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен і тореміфен; і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалютамід, лейпролід і гозерелін; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з вищевказаних. В деяких варіантах здійснення комбінована терапія включає введення гормону або відповідного гормонального засобу.
Додаткові способи лікування, які можна використовувати в комбінації з антитілами проти
ТІСІТ, описаними в даній заявці, включають променеву терапію, моноклональне антитіло проти пухлинного антигену, комплекс моноклонального антитіла і токсину, Т-клітинний ад'ювант, трансплантацію кісткового мозку або використання антиген-презентуючих клітин (наприклад, терапія дендритними клітинами) або клітинних терапій. Використовуваний у даній заявці термін "клітинна терапія" належить до будь-якої терапії яка включає введення клітин з метою досягнення бажаного терапевтичного ефекту, наприклад, для відновлення ушкоджених або пересичених клітинних популяцій або тканин дорослих, або для посилення імунної відповіді проти патогену або проліферативної клітини (такої як ракова клітина). В інших варіантах здійснення клітинна терапія включає введення недиференційованої клітини (такої як стовбурова клітина або інша мульти- або тотипотентна клітина), здатної диференціюватися в конкретний тип клітин, необхідний для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, наприклад, відновлення ушкоджених або пересичених клітинних популяцій або тканин дорослих, або посилення імунної відповіді проти патогену або проліферативної клітини (такої як ракова клітина). У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом можна також вводити з інфільтруючими пухлину Т-клітинами або природними кілерами, які необов'язково були розмножені або вибрані для хоумінгу до пухлини ех мімо. Антитіло за винаходом сприяє активації цих клітин.
Переважна комбінація являє собою антитіло за винаходом із другим антитілом, спрямованим на поверхневий антиген, переважно що експресується на ракових клітинах у бо порівнянні з контрольною нормальною тканиною. Деякі приклади антитіл, які можна вводити в комбінованій терапії за допомогою антитіл за винаходом для лікування злоякісного новоутворення, включають ГерцептинФ (трастузумаб) проти антигену НЕН2, АвастинФ (бевацизумаб) проти МЕСЕ або антитіла до рецептора ЕСЕ, такі як (ЕгтойихФ, цетуксимаб) і
МесібріхФ (панітумумаб). Інші засоби, які можна вводити, включають антитіла або інші інгібітори будь-яких з РО-1, РО-І 1, СТІ А-4, 4-188, ВТІ А, МІБ5ТА, ТІМ-3 і І Аа-3; або інші інгібітори шляху передачі сигналу, наприклад, інгібітори тТОВ і С5КЗВ; і цитокіни, наприклад, інтерферон-у, ІІ -2 і П--15. Деякі конкретні приклади додаткових засобів включають: іпілімумаб, пазопаніб, сунітиніб, дазатиніб, пембролізумаб, ІМСНО24360, дабрафеніб, траметиніб, атезолізумаб (МРОЇІ З280А), рарцева, кобіметиніб і ніволумаб. Вибір другого антитіла або іншого засобу для комбінованої терапії залежить від лікування злоякісного новоутворення. Необов'язково, рак тестують на експресію або переважну експресію антигену для напрямку вибору підходящого антитіла.
Ізотипом другого антитіла переважно є людський Ідс51 для промотивування ефекторних функцій, таких як АОСС, СОС і фагоцитоз.
Антитіла за винаходом також можна вводити з вакцинами, що викликають імунну відповідь проти злоякісного новоутворення. Така імунна відповідь підсилюється антитілом за винаходом.
Вакцина може включати антиген, що експресується на поверхні злоякісного новоутворення, або його фрагмент, ефективний для індукції імунної відповіді, необов'язково пов'язаний з молекулою-носієм.
У даному винаході розглядається застосування антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці, у комбінації з інгібіторами імунних контрольних точок.
Величезна кількість генетичних і епігенетичних змін, характерних для всіх видів злоякісного новоутворення, забезпечує різноманітний набір антигенів, які імунна система може використовувати для розрізнення пухлинних клітин від їх нормальних аналогів. У випадку Т- клітин, максимальна амплітуда (наприклад, рівні продукування або проліферації цитокінів) і якість (наприклад, тип імунної відповіді, що генерується, такий як картина продукування цитокінів) відповіді, яка ініціюється за допомогою розпізнавання антигену Т-клітинним рецептором (ТОВ), регулюється балансом між костимуляторними і інгібіторними сигналами (імунними контрольними точками). У нормальних фізіологічних умовах імунні контрольні точки мають вирішальне значення для профілактики аутоімунітету (тобто підтримки самостійкості), а
Зо також для захисту тканин від ушкоджень, коли імунна система реагує на патогенну інфекцію.
Експресія білків імунних контрольних точок може бути дисрегульована пухлинами як важливий механізм імунорезистентності.
Приклади імунних контрольних точок (лігандів і рецепторів), деякі з яких селективно підвищуючи, регулюються в різних типах пухлинних клітин, які є кандидатами для блокади, включають РО-1 (білок запрограмованої клітинної загибелі 1); РО-І1 (ліганд запрограмованої клітинної загибелі-1); ВІТА (ВІТ лімфоцитарний атенюатор); СТІ А-4 (цитотоксичний Т- лімфоцит-асоційований антиген 4); ТІМ-3 (Т-клітинний мембранний білок 3); ГАС-3 (ген активації лімфоцитів 3); М-доменний імуноглобуліновий супресор Т-клітинної активації (МІЗТА);
С0роб; АгавВ (аденозиновий Ага рецептор); А2ЬВ (аденозиновий А2Ь рецептор); СО7З (екто-5'- нуклеотидаза); СО39 (ЕМТРОЇ, МТРбавеї); Аргіназу; індоламін-пірол 2,3-діоксигеназу (100); триптофан 2,3-діоксигеназу (ТО); і інгібуючі рецептори кілерів, які можна підрозділити на два класи на основі їх структурних особливостей: і) кілерні імуноглобулін-подібні рецептори (КІВ5), і і) лектинові рецептори С-типу (члени родини трансмембранних рецепторів ІІ типу). Інші імунні контрольні точки, які не були так добре визначені, були описані в літературі, включаючи як рецептори (наприклад, 284 (також відомий як СО244) рецептор), так і ліганди (наприклад, деякі інгібіторні ліганди В7 родини, такі В7-НЗ (також відомий як СО276) і В7-НА (також відомий як В7-
З1, В7х і МСТМ)). Див. Рагаоії, (Аргії 2012) Мате Веу. Сапсег 12:252-64.
Даний винахід передбачає використання будь-якого з антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці, у комбінації з інгібіторами вищевказаних рецепторів і лігандів імунних контрольних точок, а також ще не описаних рецепторів і лігандів імунних контрольних точок. У цей час доступні деякі модулятори імунних контрольних точок, у той час як інші перебувають в останній стадії розробки. Для ілюстрації, коли воно було схвалене для лікування меланоми в 2011 році, повністю гуманізоване моноклональне антитіло СТІ А-4 іпілімумаб (МЕВМОМУ, ВгізіоІ-Муегв5 запіЇбр) стало першим інгібітором імунної контрольної точки, що одержало офіційне схвалення в
СІЛА. Злиті білки, що містять СТІ А-4 і антитіло (СТІ А-4-Ід, абатацепт (ОВЕМСІА, ВгівіоІ-Муєтв запібр)), використовували для лікування ревматоїдного артриту, і було показано, що інші злиті білки ефективні в пацієнтів із трансплантацією нирок, які сенсибілізовані до вірусу Епштейна
Барра. Антитіла проти РО-1 перебувають у стадії розробки (наприклад, ніволумаб (ВгізіоІ-Муег5 зЗапібр) і пембролізумаб (ламбролізумаб) (МегсК)), а також антитіла проти РО-11 (наприклад,
МРОІ 3280А (Восне)). Ніволумаб і пембролізумаб показали потенціал у пацієнтів з меланомою, раком легень і нирок.
Подібну комбіновану терапію можна використовувати для лікування або профілактики інфекційних захворювань, таких як вірусні, бактеріальні, грибкові і паразитарні захворювання, розлади і стани, а також пов'язаних з ними розладів. Наприклад, антитіло за винаходом можна комбінувати з антитілом, спрямованим проти патогену, або з вакциною проти патогену, наприклад, з палівізумабом проти вірусу саркоми Рауса. Вакцина може являти собою білок патогену або його фрагмент, ефективний для індукції імунної відповіді. Антитіло за винаходом підсилює імунну відповідь антитіла або вакцини, спрямованої проти патогену. Антитіло за винаходом також можна вводити з Т-клітинами або природними кілерними клітинами, розмноженими ех мімо.
Така комбінована терапія включає антивірусні засоби, націлені на різні стадії життєвого циклу вірусу і що мають різні механізми дії, включаючи, але не обмежуючись цим, наступні: інгібітори декапсидації вірусу (наприклад, амантадин і римантидин); інгібітори зворотної транскриптази (наприклад, ацикловір, зидовудин і ламівудин); засоби, націлені на інтегразу; засоби, які блокують приєднання факторів транскрипції до вірусної ДНК; засоби (наприклад, антисмислові молекули), які впливають на трансляцію (наприклад, фомівірсен); засоби, які модулюють функцію трансляції/рибозимів; інгібітори протеази; модулятори складання вірусу (наприклад, рифампіцин); антиретровірусні засоби, такі як, наприклад, нуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази (наприклад, азидотимідин (АТ), аа, аас, зтс, а«т); ненуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази (наприклад, ефавіренц, невірапін); нуклеотидні інгібітори зворотної транскриптази; і засоби, які запобігають вивільненню вірусних частинок (наприклад, занамівір і озелтамівір). Для лікування і/або профілактики деяких вірусних інфекцій (наприклад,
ВІЛ) часто необхідна група ("коктейль") противірусних засобів.
Інші противірусні засоби, призначені для використання в комбінації з будь-яким з антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці, включають, але не обмежуються цим, наступні: абакавір, адефовір, амантадин, ампренавір, ампліген, арбідол, атазанавір, атріпла, боцепревірертет, цидофовір, комбривір, дарунавір, делавірдин, диданозин, докозанол, едоксидин, емтрицитабін, енфувіртид, ентекавір, фамцикловір, фосампренавір, фоскарнет, фосфонет, ганцикловір, ібацитабін, іміновір, ідоксуридин, іміквімод, індинавір, інозин, різні інтерферони (наприклад, пегінтерферон альфа-2а), лопінавір, лоризид, маравірок, мороксидин, метизазон, нелфінавір, нексавір, пенцикловір, перимівір, плеконарил, подофілотоксин, ралтегравір, рибавірин, ритонавір, пірамідин, саквінавір, ставудин, телоправір, тенофовір, типранавір, трифлуридин, тризивір, тромантадин, трувада, валацикловір, валганцикловір, вікривірок, відарабін, вірамідин і залцитабін.
Даний винахід розглядає використання будь-якого з антитіл проти ТІСІТ, розкритих у даній заявці, у комбінації із протипаразитарними засобами. Такі засоби включають, але не обмежуються цим, тіабендазол, пірантел памоат, мебендазол, празиквантел, ніклозамід, бітіонол, оксамнікін, метриконат, івермектин, албендазол, ефлорнітин, меларсопрол, пентамідин, бенідазол, ніфуртимокс і нітроіїмідазол. Фахівцям у даній галузі відомі інші засоби, які можуть виявитися корисними для лікування паразитарних розладів.
Варіанти здійснення даного винаходу припускають використання будь-якого з антитіл проти
ТІСІТ, розкритих у даній заявці, у комбінації із засобами, корисними для лікування або профілактики бактеріальних розладів. Антибактеріальні засоби можна класифікувати різним чином, у тому числі на основі механізму дії, на основі хімічної структури і на основі спектра активності. Приклади антибактеріальних засобів включають засоби, які націлені на клітинну стінку бактерій (наприклад, цефалоспорини і пеніциліни) або клітинну мембрану (наприклад, поліміксини), або втручаються в дію основних бактеріальних ферментів (наприклад, сульфонаміди, рифаміцини і хіноліни). Більшість антибактеріальних засобів, які направлено діють на синтез білка (наприклад, тетрацикліни і макроліди), є бактеріостатичними, тоді як засоби, такі як аміноглікозид, є бактерицидними. Інший спосіб класифікації антибактеріальних засобів оснований на їх цільовій специфічності; засоби "вузького спектра" націлені на конкретні типи бактерій (наприклад, грампозитивні бактерії, такі як стрептокок), тоді як засоби "широкого спектра" мають активність щодо більш широкого кола бактерій. Фахівцям у даній галузі відомі типи антибактеріальних засобів, що підходять для застосування при конкретних бактеріальних інфекціях.
Варіанти здійснення даного винаходу передбачають використання будь-якого з антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці, у комбінації із засобами, корисними для лікування або профілактики грибкових розладів. Протигрибкові засоби включають полієни (наприклад, бо амфотерицин, ністатин і пімарицин); азоли (наприклад, флуконазол, ітраконазол і кетоконазол);
аліламіни (наприклад, нафтифін і тербінафін) і морфоліни (наприклад, аморолфін); і антиметаболіти (наприклад, 5-фторцитозин).
Даний винахід охоплює фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні засобів (їі представників класів засобів), перерахованих вище.
Антитіла проти ТІСІТ можна використовувати в комбінації з будь-яким із других антитіл або засобів, описаних для використання в спільному лікуванні як компоненти фармацевтичної композиції. У фармацевтичній композиції засоби можуть бути об'єднані з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, як описано.
МУ. Інші варіанти застосування
Антитіла проти ТІЩСІЇ можна використовувати для детекції ТІСІТ у контексті клінічної діагностики або лікування, або в дослідженнях. Наприклад, антитіла можна використовувати для детекції присутності ТІСІТ на Т-клітинах, природних кілерних клітинах і ракових клітинах як ознаки того, що індивід страждає від злоякісного новоутворення або інфекційного захворювання, що піддається лікуванню. Експресія ТІСІТ на Т-клітинах, природних кілерних клітинах і/або ракових клітинах індивіда, що страждає на злоякісне новоутворення або інфекційне захворювання, також свідчить про те, що рак або інфекційне захворювання піддаються лікуванню антитілами за даним винаходом. Антитіла також можуть продаватися як дослідницькі реагенти для лабораторних досліджень для детекції Т-клітин, природних кілерних клітин і злоякісних клітин і їх реакції на різні стимули. У таких застосуваннях моноклональні антитіла можуть бути мічені флуоресцентними молекулами, спін-міченими молекулами, ферментами або радіоїзотопами і можуть бути представлені у вигляді набору з усіма необхідними реагентами для здійснення аналізу на ТІСІї. Антитіла також можна використовувати для очищення ТІСІТ, наприклад, за допомогою афінної хроматографії.
МІ. Набори
Антитіла проти ТІСІТ можна об'єднати з будь-яким із других антитіл або засобів, описаних для використання в спільному лікуванні як компоненти набору. Винахід, розкритий в даній заявці, передбачає один або декілька наборів, що містять одне або декілька з описаних у даній заявці антитіл, а також один або декілька фармацевтично прийнятних ексципієнтів або носіїв (таких як, без обмеження, фосфатно-сольові буферні розчини, вода, стерильна вода, поліетиленгліколь, полівінілпіролідон, лецитин, арахісова олія, кунжутна олія, емульсії, такі як емульсії олія/вода або емульсії вода/олія, мікроемульсії, наноносії і різні типи змочувальних речовин). Добавки, такі як спирти, олії, гліколі, консерванти, ароматизатори, барвники, суспендувальні агенти тощо, також можуть бути включені в набори за даним винаходом разом з носієм, розріджувачем або ексципієнтом. В одному варіанті здійснення фармацевтично прийнятний носій, що підходить для використання в композиціях антитіл, описаних у даній заявці, є стерильним, вільним від патогенів і/або іншим способом безпечним для введення індивідові без ризику відповідної інфекції та інших небажаних побічних ефектів. У наборі відповідні речовини можуть бути представлені в окремих флаконах з інструкціями для комбінування і наступного введення або з інструкціями для окремого введення. Набір може також включати письмові інструкції для правильної маніпуляції і зберігання будь-яких антитіл проти ТІСІТ, описаних у даній заявці.
Передбачається, що кожне максимальне числове обмеження, наведене в даному описі, включає кожне більш низьке числове обмеження, як якби такі більш низькі числові обмеження були явно зазначені в даній заявці. Кожне мінімальне числове обмеження, наведене в даному описі, буде включати всі більш високі числові обмеження, як якби такі більш високі числові обмеження були явно зазначені в даній заявці. Кожний чисельний діапазон, зазначений у даному описі, буде включати в себе всі більш вузькі числові діапазони, які попадають у такий більш широкий чисельний діапазон, як якби такі більш вузькі числові діапазони були явно зазначені в даній заявці.
Усі патентні заявки, веб-сайти, інші публікації, номери доступу тощо, на які посилаються вище або нижче, включені як посилання у всій їх повноті для всіх цілей тією самою мірою, як якби кожна окрема публікація була спеціально та індивідуально зазначена для її включення за допомогою посилання. Якщо різні версії послідовності зв'язують із номером доступу в різний час, мається на увазі версія, зв'язана з номером доступу на діючу дату подачі даної заявки.
Діюча дата подачі означає більш ранню, ніж фактична дата подачі, або дату подачі пріоритетної заявки, що посилається на номер доступу, якщо це застосовно. Подібним чином, якщо різні версії публікації, веб-сайту або т. п. опубліковані в різний час, мається на увазі версія, яка була нещодавно опублікована на діючу дату подачі заявки, якщо не зазначене інше. Будь-яка ознака, стадія, елемент, варіант здійснення або аспект винаходу можна використовувати в комбінації з бо будь-яким іншим, якщо спеціально не зазначене інше.
Хоча даний винахід був описаний досить докладно за допомогою ілюстрації і прикладу для ясності і розуміння, буде очевидно, що певні зміни і модифікації можуть бути реалізовані в рамках прикладеної формули винаходу.
ПРИКЛАДИ
У наступних прикладах обговорюється одержання, опис і гуманізуваня моноклональних антитіл проти людського ТІСІТ, а також представлені ілюстративні способи, за допомогою яких можна визначити характеристики зв'язування антитіл, описаних у даній заявці.
Приклад 1: Експресія рекомбінантних людських білків ТІСІТ
Клонування генів, мутагенез і конструювання плазміди в цій роботі здійснювали з використанням стандартних методів молекулярної біології, таких, які описані в Затбгоок апа
Вивзе! (Моїесшаг Сіопіпуд, А ІГарогаїгу Мапиаї, За єд., 2001, Соїй 5ргіпу Нагбог І арогаюгу
Ргезв5, Соїд 5ргіпд Нагрог, МУ), Ковієїпу єї аї. (Ійї. у). Сапсег 93:556-565, 2001) і Соїе еї аї. (9.
Іттипої. 159:3613-3621, 1997).
Вектор експресії ссавця рЕСтва04 (Фіг. 1) для продукування позаклітинної ділянки людського
ТІСІТ, злитої з Ес ділянкою у! ланцюга людського імуноглобуліну (НТІСІТ-Ре; З5ЕО ІЮ МО: 59), містить наступні генетичні компоненти. За напрямком годинникової стрілки від баї сайту рЕСт404 на фіг. 1, плазміда містить транскрипційну одиницю для НТІСІТ-Ес, починаючи з головного передраннього промотору і енхансеру (СМУ-Р на фіг. 1) із цитомегаловірусу людини (СМУ). Після СММ промотору йдуть кодуючі ділянки сигнального пептиду (5р; 5ЕО ІЮО МО: г), позаклітинна ділянка людського ТІСІТ (НТІСІТ; 5ЕО ІЮ МО: 3), поліпептидний лінкер (ЗЕО ІЮ
МО: 4) і людська у! Ес ділянка (ЗЕО ІО МО: 5), а потім йде сайт поліаденілювання гена у важкого ланцюга людини. Після НТІСІТ-ЕРс гена йдуть 5М4 0 ранній промотор (5М40-Р), ген пуроміцин М-ацетил-трансферази (риго) для резистентності до пуроміцину і сегмент, що містить
ЗУ40 сайт поліаденілювання (5У40-А). І нарешті, РЕСт404 містить частину плазміди РОС19, що включає бактеріальну точку початку реплікації (рос оті) і ген ВД лактамази (В лактамаза). Стрілки на Фіг. показують орієнтацію транскрипції. Відповідні сайти для рестрикційних ферментів показані на кресленнях.
Кодуючу ділянку позаклітинної ділянки людського ТІСІї в рЕСт4 04 заміняли ДНК фрагментом, що кодуює позаклітинну ділянку людського СО155 (НСО155; 5ЕО ІО МО: 6), що
Зо призводило до утворення нового вектора експресії рЕСт406б (Фіг. 1). Позаклітинну ділянку людського СО155, злиту з людською у! Ес ділянкою (НСО155-Рс; 5ЕО ІО МО: 7), експресували з рЕСта06.
Кодуючу ділянку у! Ес ділянки між Аде! і Еаді сайтами в рЕСт4 04 заміняли ДНК фрагментом, що кодуює РІ Асі пептид (БІГ Асі; ЗЕО Ір: 8), з наступним сигналом зв'язування глікозилфосфатидилінозиту людського СОБ55 (СРІ; ЗЕО І: 9), що призводило до утворення нового вектора експресії РЕСт407 (Фіг. 1). Позаклітинну ділянку людського ТІСІТ, злиту з РІ АС і аРІ (птІСІТ-СРІ)-кодованим рЕСт406 експресували на клітинній поверхні.
Для одержання клітинних ліній, стабільно продукуючих ПТІСІТ-ЕБс ії йСО155-Рс у культуральних супернатантах, вектори експресії рРЕСт404 і рЕСт406, відповідно, вводили в хромосому мишачої мієломної клітинної лінії МБО (Еишгореап СоїІесійоп ої Апіта! Сеї! СиПигев, заїївригу, УМійеНпі, ОК) М5О клітини вирощували в ОМЕ середовищі, що містить 10 95 фетальну бичачу сироватку (ЕВ5), при 37 "С в 7,5 95 СО» інкубаторі. Стабільну трансфекцію в
М5О здійснювали шляхом електропорації, як описано в Вербіпдюп еї а!. (Віо/Тесппоіоду 10: 169- 175, 1992). Перед трансфекцією вектори експресії лінеалізували з використанням Еебрі.
Приблизно 107 клітин трансфікували за допомогою 10 мкг лінеалізованої плазміди, суспендували в ЮОМЕ середовищі, що містить 1095 ЕВ5, і висівали в декілька 96-ямкових планшетів. Через 24 години наносили селективне середовище (ОМЕ середовище, що містить 10 95 ЕВ5 і З мкг/мл пуроміцину). Приблизно через 10 днів після початку селекції культуральні супернатанти аналізували на продукування Ес злитих білків методом ЕГІЗА з використанням цапиного антитіла проти людського гамма ланцюга для покриття і НАР-кон'югованого цапиного антитіла проти людського гамма ланцюга для детекції Ес злитих білків.
М50 стабільні трансфектанти, що продукують високі рівні Ес злитих білків, адаптували до
Гібридома-5ЕМ середовища і розмножували в ньому (ТНепто Рібзпег 5сіепійіс, Майнат, МА) і вирощували до виснаження в ролерних флаконах. Після центрифугування і фільтрації культуральний супернатант завантажували на колонку з білком-А-сефарозою (СЕ Неайнсагеє,
Різсаїаулау, МУ). Колонку промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5), потім Ес злиті білюи елюювали з використанням 0,1 М гліцину-НСІ (рН 3,0). Після нейтралізації за допомогою 1 М Ттібз-НСЇ (рН 8) буфер Ес злитих білків, що елююються, обмінювали на РВ5 шляхом діалізу.
Для одержання клітинних ліній, що експресують НТІСІТ-СРІ на поверхні, вектор експресії рЕСта407 стабільно трансфікували в М5О клітини. Експресію ПТІСІТ-СРІ на клітинній поверхні контролювали методом проточної цитометрії з використанням щурячого анти-РІ АС моноклонального антитіла і РЕ-міченого цапиного антищурячого ІДС, Ес-специфічного антитіла.
М50 клітинні лінії, що експресують високі рівні НТІСІТ-СРІ на клітинній поверхні (М5О-НТІСІТ), використовували для скринінгу анти- ТІСІТ антитіл.
Приклад 2: Генерування і характеризація анти-ТІДІТ моноклональних антитіл
Мишачі гібридоми, що продукують антилюдські ТІСІТ моноклональні антитіла, одержували на УМ Віозсієпсев (Мошпіаїп Міему, СА) з використанням стандартної гібридомної технології, такої як СбепотОМЕ СЕ ЕХ СеїЇ Ривіоп КНеадепі (Соб5то Віо, Сагізрай, СА). Як імуногени використовували людські ТІСІТ-Ес злиті білки і М5О-НТІСІТ клітини.
Мишачі антитіла, секретовані в культуральних супернатантах гібридомних клітин, піддавали серії скринінгів для ідентифікації антитіл з наступними властивостями: (1) зв'язування з очищеним НТІСІТ-Ес злитим білком, (2) зв'язування з МБО-НТІСІТ клітинами, (3) не зв'язування з
М5О клітинами, (4) зв'язування з СОЗ3- Т-клітинами, що походять з фітогемаглютинін- оброблених мононуклеарних клітин периферичної крові людини, і (5) блокування зв'язування ПСО155-Рс злитого білка з М5О-НТІСІТ клітинами. Першу властивість зв'язування з НТІСІТ-Ес випробовували методом ЕГІБА з використанням НАР- кон'югованих цапиних антитіл проти мишачих каппа і лямбда легких ланцюгів (5оцїпегпВіоїтеси,
Віппіпанат, А!) для ідентифікації мишачих анти-ТІСії антитіл. Другу, третю і четверту властивості досліджували методом проточної цитометрії з використанням РЕ-міченого цапиного анти-мишачий гамма ланцюг антитіла (5оційпегпВіоіїес!и) для детекції зв'язаних із клітинами мишачих антитіл. П'яту властивість аналізували методом проточної цитометрії, як описано нижче. Було виявлено, що три мишачі моноклональних антитіла (ТІС1, ТІС2 і ТІС3) мають усі із цих п'яти властивостей. ТІС1, ТІд2 і ТІС2З3 моноклональні антитіла очищали з культурального супернатанта гібрідомних клітин колонковою хроматографією з білком А, як описано вище.
Ізотипи ТІСТІ, ТІ22 і ТІ2З являють собою мишачі ІдДс2гр/Каппа, ІдсСга/каппа і ІдСг2а/каппа, відповідно.
Активність ТІС1І, ТІС2 ї ТЗ для блокування взаємодії між ТІСІТ Її СО155 аналізували
Зо методом проточної цитометрії. М5О-НТІСІТ клітини інкубували із суб-насичувальною концентрацією НСО155-Ес у присутності (або під час відсутності) різних концентрацій анти- ТІДІТ моноклонального антитіла як конкурента. Детекцію НПСО155-Рс, зв'язаних з М5О-НТІСІТ клітинами, здійснювали з використанням бу іднпі488-міченого цапиного антилюдського Ідсї, Ес- специфічного антитіла (даскбзоп ІттипоВезеагси, У/евзі Стоме, РА). Як показано на Фіг. 2, ТІСТІ,
ТІС2 ї ТІСЗ інгібували зв'язування НСО155-Рс з М50-НТІСІТ клітинами дозозалежним чином.
Напівмаксимальна інгібуюча концентрація (ІСзо) для блокування взаємодії між НСО155-Ес і М50-
НТІСІТ клітинами становила 49 нг/мл для ТІС1, 197 нг/мл для ТІС2 і 460 нг/мл для ТІСЗ.
Концентрація антитіл, необхідна для блокування більш ніж 95 95 зв'язування СО155 з ТІСІТ, становила 0,63 мкг/мл для ТІС1, 1,25 мкг/мл для ТІС2 і 2,5 мкг/мл для ТІСЗ.
Приклад 3: М генне секвенування анти-ТІСІТ моноклональних антитіл
Визначення послідовностей варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів (МН і Мі, відповідно) мишачих анти-ТІСІї антитіл здійснювали, дотримуючись процедур, описаних в
Твигивпйа сеї а). (МеїШод» 36:69-83, 2005). Тотальну РНК екстрагували із приблизно 107 клітин з використанням ТАІ2оЇ реагенту (Іпийгодеп, Сапврад, СА) відповідно до протоколу постачальника. Оліго аТ-примовану КДНК для 5-ВАСЕ синтезували з використанням набору для КДНК ампліфікації Ф«МАВТег ВАСЕ (Сіопієсн, Мошпіаїп Міем,, СА), дотримуючись протоколу постачальника. КДНК МУН і Мі ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), використовуючи Рпизіоп ДНК полімеразу (ТПпепто Різпег Зсіепіййс, Майшат, МА), з використанням 3 праймерів, які специфічно гібридизуються 3 мишачими константними ділянками важкого або легкого ланцюга (Твигивпйа єї аї., вирга), відповідно, і 5' праймера, забезпечуваного в наборі ФМАВТег ВАСЕ для кДНК ампліфікації. Ампліфіковані УН і МІ гени клонували з використанням набору для клонування Сіопедеї РОСА (Тнепто Рівпег Зсієпійіс) і піддавали секвенуванню із праймерами, представленими в наборі для клонування Сіопееєї
РСВ. Декілька УН і МІ. клонів секвенували та ідентифікували унікальні послідовності, гомологічні типовим мишачим варіабельним ділянкам важкого і легкого ланцюга.
Амінокислотна послідовність зрілого МН ТІСШТ (5ЕО ІЮ МО: 10) показана на Фіг. 3.
Амінокислотні послідовності СОН, 2 ії З ділянок ТІСТ МН являють собою МЕСМН (5ЕО ІО МО: 11), РІБОЗЗБІУМАОТУКа (5ЕО ІЮ МО: 12) і МАГОУМАМОМ (ЗЕО ІО МО: 13), відповідно.
Амінокислотна послідовність зрілого МІ ТІШі (5ЕО ІО МО: 14) показана на фіг. 4.
Амінокислотні послідовності СОН, 2 і З ділянок ТІС1 МІ являють собою ВАЗК5ОІЗКМІ А (ЗЕО 10
МО: 15), Ба ТІ О5 (ЗЕО ІЮ МО: 16) і ООНМЕМ РМУТ (ЗЕО ІЮО МО: 17), відповідно.
Амінокислотна послідовність зрілого МН ТІШФ (5ЕО ІО МО: 18) показана на Фіг. 5.
Амінокислотні послідовності СОВА, 2 ї З ділянок ТІС2 МН являють собою ЕМТМН (ЗЕО ІЮ МО: 19), СІМРЯМИС ТТ ЗУМОКЕКа (ЗЕО І МО: 20) і РОМУУММАМОМ (5ЕО ІЮ МО: 21), відповідно.
Амінокислотна послідовність зрілого МІ ТІЩО (ЗЕО ІО МО: 22) показана на фіг. 6.
Амінокислотні послідовності СОВТ, 2 і З ділянок ТІС2 МІ являють собою КАБОСМ5ТАМА (5ЕО
ІО МО: 23), БАБУВМТ (5ЕО ІО МО: 24) і ООНМІТРУ/Т (5ЕО ІО МО: 25), відповідно.
Амінокислотна послідовність зрілого МН ТІШЗ (5ЕО ІО МО: 26) показана на Фіг. 7.
Амінокислотні послідовності СОН, 2 і З ділянок ТІ2З МН являють собою ЮОМОМ5 (5ЕО ІЮО МО: 27), мЗраауУмМТУУРєОотУКка (5ЕО ІО МО: 28) і ОП АММЕОМ (5ЕО ІО МО: 29), відповідно.
Амінокислотна послідовність зрілого МІ ТІШЗ (5ЕБЕО ІЮ МО:30) показана на Фіг. 8.
Амінокислотні послідовності СОВ1!, 2 і З ділянок ТІб0З МІ являють собою
К5БОБІИЇ МЗЗМОКММІ А (5ЕО І МО: 31), МАБТАЕ5 (5ЕО ІЮ МО: 32) і ООУНЗМУРМТ (5ЕО І
МО: 33), відповідно.
Присвоєння СОВ послідовностей і нумерація положень амінокислот на Фіг. 3-8 представлені відповідно до Кебат еї аї!. (1991). Послідовності СОВІ, СОВ2 і СОВЗ підкреслені на кресленнях.
Приклад 4: Конструювання і експресія гуманізованого ТІС1 антитіла
Гуманізацію УН і МІ ТІС1 здійснювали, як описано в Ойееп еї аї. (Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА. 86:10029-10033, 1989), дотримуючись процедур Твигиб5Нйа еї а). (МеїШоса5 36:69-83, 2005).
Коротко, тривимірну молекулярну модель варіабельних ділянок ТІС1 спочатку конструювали з використанням алгоритму, розробленого ОМ Віозсієпсе5. Потім ідентифікували каркасні амінокислотні залишки, важливі для утворення структури визначальних комплементарність ділянок (СОЯ) ТІШТї з використанням молекулярної моделі. Паралельно цьому, вибирали амінокислотні послідовності, що походять з КДНК, людських УН і МІ з високою гомологією з
ТІСТІ МН ї МІ, відповідно. | нарешті, здійснювали щеплення послідовностей СОМ разом з каркасними амінокислотними залишками, важливими для підтримки СОВА структури, з ТІС1 УНі
МІ. у відповідні вибрані людські каркасні послідовності.
Зо Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІС1 МН (НитІСТ УН) являє собою
МОВАМ МЕМ КаИмМоОСЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОаСБІ ВІ БСААБЗаєТтТеЕЗМеЕОМНУУВОАРИаКаї
ЕММУАРІЗЗОББЗОІУМАОТУКОаВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5ЗІ ВАЕОТАМУМСАВМАІ ОУМАМО УМ
СсОатТММтТМ55 (5ЕО ІЮ МО: 34). Амінокислотна послідовність зрілого НиТІС! УН
ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИаБІІ ВІ БСААЗБСЕТЕЗМеЕОМНУУВОАРОаКаї ЕМУМАРІЗБОЗЗОЇУ
УАОТУКОаВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВМАІ ОУМАМОМУ С2МОСТММУТМУ55 (ЗЕО І
МО: 35) починається в положенні 20 в 5ЕО ІО МО: 34.
Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІСТ МІ (НитТІСТ МІ) являє собою
МАРОМОоМмі а УМІЗалОоСрІОМТО5РББІ БАБМаОВМТІТ СВАБЗКБІЗКМІ АМУООКРИаКАР кі ПУТ ОБаМУРЗАЕЗазавзатовТтІтІІОРЕОБАТУМСООНМЕМРУТРаСИТКМЕІК (5ЕО
ІО МО: 36). Амінокислотна послідовність зрілого Нитіс1 М.
РІОМТО5РБОБІ БАМИ ВМТ СВАЗКБІЗКМІ АМ/МООКРОКАРКІ ПИТ О5БаУРЗАЕЗОа завзатовт ТЗІ оРЕОБЕАТУМСООНМЕМРУМУТРОаСаИТткКМЕїІКк (5ЕО ІЮ МО: 37), починається в положенні 21 в ЗЕО ІЮ МО: 36.
Ген, що кодує НиТІСі МН, синтезували у вигляді екзону, що включає сигнал донора сплайсингу на 3' кінці кодуючої ділянки 5реї! сайт на 5' кінці фрагмента і Ніпаї сайт на 3' кінці фрагмента. Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІС1 МН гена, фланкована 5реї і Ніпан! сайтами (5ЕО ІО МО: 38), показана разом з передбаченою амінокислотною послідовністю (ЕС
ІО МО: 34) на Фіг. 9А.
Ген, що кодує НиТІСії Мі, синтезували у вигляді екзону, що включає сигнал донора сплайсингу на 3' кінці кодуючої ділянки Мне! сайт на 5' кінці фрагмента і ЕЄсойВі сайт на 3' кінці фрагмента. Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІСТ МІ. гена, фланкована Мнеї і ЕсоВі сайтами (5ЕО ІО МО: 39), показана разом з передбаченою амінокислотною послідовністю (5ЕО
ІО МО: 36) на Фіг. 98.
Вектор експресії ссавця рНитІСТ.АА (Фіг. 10) для продукування гуманізованої ІдДСс1/каппа форми мишачого моноклонального антилюдського антитіла до ТІСІТ, ТІС1 (НитІс1-Іа1.АА), був сконструйований як такий, що містить наступні генетичні компоненти. За напрямком годинникової стрілки від ЗаїЇ сайту на Фіг. 10, вектор містить транскрипційну одиницю важкого 60 ланцюга, починаючи з головного передраннього промотору і енхансеру із цитомегаловірусу людини (СМУ) (СМУ-Р на фіг.) для ініціації транскрипції гена важкого ланцюга антитіла. Після
СММУ промотору йде екзон, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга гуманізованої форми
ТІЇ, фланкований 5реї! і Ніпа сайтами (НиТІСті МН), геномна послідовність, що містить людські константні ділянки уї важкого ланцюга, включаючи екзони СНІ, шарнірної ділянки, СН2 і
СНЗ із проміжними інтронами, і сайт поліаденілювання людського гена важкого у! ланцюга. СН2 ділянка, що кодується в рНитТІСтТ.АА, містить заміни амінокислот на аланінові залишки в положеннях 234 і 235 (Єи нумерація) (І 234А/ 235А) для елімінації ефекторних функцій (Негагейп еї аї., у. Мігої. 75:12161-12168, 2001). Після послідовності гена важкого ланцюга транскрипційна одиниця легкого ланцюга починається з СММ промотору і енхансеру (СМУ-Р), з наступним екзоном, що кодуює варіабельну ділянку легкого ланцюга гуманізованої форми ТІСТІ, фланкованим МнНеї! і ЕсОоВІ сайтами (НиТІСІ1 МІ), геномного послідовністю, що містить людський екзон константної ділянки каппа ланцюга (Ск) з попередньою йому частиною інтрону, і сайтом поліаденілювання людського гена каппа ланцюга після Ск екзону. Потім після гена легкого ланцюга слідує ранній промотор 5М4 0 (5М4 0-Р), ген пуроміцин М-ацетил-трансферази (риго) для резистентності до пуроміцину, і сегмент, що містить сайт полі«аденілювання 540 (5М40-А).
І нарешті, рНитІС1.АА містить частину плазміди РОС19, що включає бактеріальну точку початку реплікації (рОС оті) і ген В лактамази (В лактамаза). Стрілки на Фіг. показують орієнтацію транскрипції.
Амінокислотна послідовність зрілого важкого гамма ланцюга НитІа1-Ід4с21.АА, що кодується в рНитІат.АА, являє собою
ЕМОЇ МЕЗОаСИЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗИЕТЕЗМЕаМНУУУВОАРИаКа! ЕМУМАРІЗБЗОЗББІММАОТУ
КавеЕтТІЗВОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВМАІ ОММАМОУМУ С4ССТМУТУЗБЗАЗТКаРЗМУЕ
РГАРБ5ЗКЗТЗаИасТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О551І 51 55УМ ТУР
ЗОЗ ЕТО МІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕААСИРБЗУГНІ ЕРРКРКОТІ МІЗ
ВТРЕМТСУММОУЗНЕОРЕМКЕММУ Ура МЕУНМАКТКРАЕЄОУМОТУВМУМУЗМІ ТМ НОСУМІ МаКЕ
УКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИОРАЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМБІ ТС УКОЕМРЗОІАМЕМЕ
ЗМИаОРЕММУКТТРРМІ О5БОСОЗЕБІ ЗК ТУОКЗАУМОСаММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОІ БІ БРА. Кк (ЗЕО ІО МО: 40).
С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім.
Зо Амінокислотна послідовність зрілого легкого каппа ланцюга НитІс1-Ід4с1.АА, що кодується в рРНитІС1.АА, являє собою
РІОМТО5РБОБІ БАМИ ВМТ СВАЗКБІЗКМІ АМ/МООКРОКАРКІ ПИТ О5БаУРЗАЕЗОа завзатовЕтІ ТЗІ оРЕОЕАТУУСООНМЕМРУТРаСаИткМУєІКкАТУМААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇІ Ка
ТАБМУСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАЇ ОБОаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКМУУ АСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМАСИЕС (ЗЕО ІО МО: 41).
Вектор експресії рНиТтІй-т-.АА вводили в хромосоми в клітинній лінії СНО-К1 яєчників китайського хом'ячка (АТСС, Мапаззаз5, МА) для одержання клітинних ліній, стабільно продукуючих НитІС1-Ід4с1.АА. СНО-КІ! клітини вирощували в 5ЕМАСНО середовищі (СЕ
Неайнсаге І їе 5сіепсев, І одап, ОТ) при 37 "С в 7,5 95 СО» інкубаторі. Стабільну трансфекцію в
СНО-КІ1 здійснювали шляхом електропорації. Перед трансфекцією рНитІСТ1.АА лінеалізували з використанням Еврі. У типовому експерименті приблизно 107 клітин трансфікували за допомогою 20 мкг лінеалізованої плазміди, суспендували в 5БЕМАСНО середовищі і висівали при 100 мкл/ямка в декілька 96-ямкових планшетів після відповідних розведень клітин. Через 48 годин додавали БЕМАСНО середовище, що містить 20 мкг/мл пуроміцину, при 100 мкл/ямка для виділення стабільних трансфектантів. Приблизно через десять днів після початку селекції культуральні супернатанти трансфектантів аналізували на продукування антитіл.
Експресію НитІСс1-ІдДа21.АА вимірювали сендвіч-методом ЕГІЗА. У типовому експерименті
ЕБИІЗА планшет покривали цапиним антилюдським дСо Ес-специфічним поліклональним антитілом, промивали промивним буфером (РВ5, що містить 0,05 95 Гуеєп 20) і блокували
ЕПЗА Буфером (РВ5, що містить 2 95 знятого молока і 0,05 95 Тмеєп 20). Після промивання промивним буфером випробовувані зразки, відповідним чином розведені в ЕГІБА Буфері, наносили на ЕГІЗА планшет. Відповідне гуманізоване ІдСі/к антитіло використовували як стандарт. Після інкубації ЕГІБА планшета протягом 1 години при кімнатній температурі і промивання промивним буфером, зв'язані антитіла визначали з використанням НАР- кон'югованого цапиного поліклонального антитіла до каппа ланцюга людини. Після інкубації планшета протягом 0,5 години при кімнатній температурі і промивання промивним буфером, ініціювали прояв кольору через додавання 100 мкл/ямка АВТО субстрату (бЗідта-А|їагісн) і зупиняли за допомогою 100 мкл/ямка 2 95 щавлевої кислоти. Поглинання зчитували при 405 нм.
СНО-КІ1 стабільні трансфектанти, що продукують високі рівні НитІс1-Ідс1.АА, збільшували 60 в об'ємі в 5ХЕМАСНО доти, поки клітинна життєздатність не ставала менше ніж 50 95. Після центрифугування і фільтрації культуральні супернатанти завантажували на колонку з Білком А (Ніттар МАВЗеїесі Зи,иНе, СЕ Неайнсаге, Різсаїамжау, МУ). Колонку промивали за допомогою РВ5, потім антитіло елюювали з використанням 0,1 М гліцин-НСІ (рН 3,0). Буфер антитіл, що елююються, нейтралізували за допомогою 1 М Тті5з-НОЇ (рН 8) і потім обмінювали з РВ5 шляхом діалізу. Концентрацію антитіл визначали шляхом вимірювання поглинання при 280 нм (1 мг/мл--1,4 00).
Приклад 5: Характеристика НитІСс1-ІДС1.АА
Зв'язування НиТтіІСс1-ІДС1.АА з людським ТІСІТ досліджували методом ЕЇІ5БА. ЕГПІБА планшет покривали 5 мкг/мл НТІСІТ-Ес в РВ5 (100 мкл/ямка) при 4 "С протягом ночі, промивали промивним буфером (РВ5, що містить 0,05 95 Гуеєп 20) і блокували за допомогою 200 мкл/ямка зирегВіоскК блокувального буфера (Пепто Рівнег бсіепійіс). Після промивання ямок промивним буфером додавали НитіІа1-Ід4с21.АА, починаючи з 2,5 мкг/мл і серійних 2-кратних розведень в зирегВіоскК блокувальному буфері, для зв'язування зі зв'язаним на планшеті людським ТІСІТ.
Після інкубації ЕГІЗА планшета протягом 1 години при кімнатній температурі і промивання промивним буфером, зв'язані антитіла визначали з використанням 100 мкл/ямка НАР- кон'югованого цапиного поліклонального антитіла проти людського каппа ланцюга (бошцНетгтп
Віоїесін), 1/2000-розведеного в ЕГІЗА Буфері. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і промивання промивним буфером, ініціювали прояв кольору з використанням 100 мкл/ямка АВТО субстрату і зупиняли за допомогою 100 мкл/ямка 2 95 щавлевої кислоти.
Поглинання зчитували при 405 нм. Як показано на Фіг. 11, НитІс1-ІдС21.АА зв'язувалися з людським ТІСІТ дозозалежним чином. Напівмаксимальна ефективна концентрація (ЕСво)
НитІс1-ІДда1.АА для зв'язування з ТІСІТ склала 65 нг/мл. Це показує, що НиТІС1-ІДС1.АА являє собою гарне зв'язувальне для людського ТІСІТ.
Зв'язування. НитіІСс1-ІДС1.АА з людським ТІШІЇ також досліджували методом проточної цитометрії. М5О-НТІСІТ клітини (8х105 клітин) інкубували в 160 мкл ЕАС5 Буфера (РВ5, що містить 0,5 95 бичачого сироваткового альбуміну і 0,05 95 азиду натрію) у присутності (або під час відсутності) різних концентрацій НитТІСс1-ІдДС21.АА, починаючи з 10 мкг/мл і серійних 2- кратних розведень, протягом 20 хвилин при 4 "С. Після промивання ЕАС5 Буфером зв'язування
НитІс1-ІДС1.АА на М5О-НТІСІТ клітинах визначали з використанням РЕ-міченого цапиного
Зо анти-людського ІдСї антитіла в ЕАС5 буфері. Після інкубації протягом 20 хвилин і промивання
ЕАС5 Буфером, клітини піддавали проточній цитометрії з використанням ЕАС5бсап проточного цитометра (ВО Віозсієпсез5, Зап дозє, СА) для одержання середньоканальної флуоресценції (МСЕ) при кожній концентрації антитіл. Фіг. 12 показує графік МСЕ (вертикальна вісь) при кожній концентрації антитіл (горизонтальна вісь). ЕСво значення становило 60 нг/мл. Це показує, що
НитІс1-ІдСс1.АА являє собою гарне зв'язувальне для людського ТІСІТ, що експресується на клітинній поверхні.
Активність НиТІСс1-ІДС1.АА для блокування взаємодії між людським ТІСІТ і людським СО155 аналізували методом проточної цитометрії з використанням М5О-НТІСІТ клітин. М5О-НТІІТ клітини (105 клітин) інкубували із суб-насичуючою концентрацією (125 нг/мл) РІТО-мічених пСО155-Ес злитих білків (НСО155-Ес-РІТС) в 200 мкл ЕАС5 Буфера в присутності (або під час відсутності) різних концентрацій НитІС1-ІдДС1.АА, починаючи з 10 мкг/мл і серійних 2-кратних розведень, протягом 20 хвилин при 4 "С. Після промивання ЕАС5 Буфером М5О-НТІСІТ клітини піддавали проточній цитометрії з використанням ЕБАСбсап проточного цитометра (ВО
Віозсієпсе5, бап щобзє, СА). Для дослідження зв'язування ПСО155-Бо-БІТОС вна клітинах одержували МСЕ при кожній концентрації антитіл. Як показано на Фіг. 13, НитІСс1-І4с21. АА блокували взаємодію між пИСО155-Ес-РІТС і ТІСІТ на клітинній поверхні дозозалежним чином.
Напівмаксимальна інгібуюча концентрація (ІСво) НиТІс1-ІДС21.АА для блокування ТІСІТ-С0155 взаємодії становила 67 нг/мл. Це показує, що НитІСс1-ІС1.АА є ефективним блокатором взаємодії між СО155 і ТІСІТ.
Приклад 6: Конструювання і експресія гуманізованого ТІСЗ антитіла
Гуманізацію МН і МІ ТІСЗ здійснювали, слідуючи загальній процедурі, описаній в Прикладі 4.
Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого МН ТІСЗ (НиТІШЗ МН) являє собою
ММРасвиеСМСТІ КамМмсСЕМОЇ МЕЗО ССИаг МОРОЗІ ВІ БСААБИагБАГЗОМОМЗУМАОА Рака.
ЕММАМІЗРИаСУМТУУРОТУКОаВЕТІЗАОМАКМБІ МІ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВОШІ ВУМЕОУМУ
СсОатТтТУТМ55 (5ЕО 0 МО: 42). Амінокислотна послідовність зрілого МН НИТІСЗ
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБИаБАЕЗОМОМБУМУВОАРИаКаИТї ЕМУМАМІЗОСИУМГУМРОТ
М КавеЕтТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВОШ ВУ спо, (5ЕО ІЮ МО: 43) починається в положенні 20 в 5ЕО ІЮ МО: 42.
Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого МІ ТІСЗ (НиТІСЗ МІ) являє собою
МОБОАОМІ МЛ МУ УЗатСаріОМТОРББІ БАБМООВМТІТСКБОБИ УЗЗМОКММІ АММОС
КРОКАРКІ ПИУМАЗТВЕЗИаУРЗАЕЗаБазатовТтІ ТІ ОРЕОЕАУУУСООМНОЗУРМУТЕРССОССТ
КМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 44). Амінокислотна послідовність зрілого М НитІСЗ
РІОМТО5РБОБІ БАБМаО ВМТ СКЗБОБИ УЗЗМОКММІ АММООКРОКАРКИ ІМ АЗТВЕЗИаМ
РЗАЕЗаБаБаТОгЕТІ ТІ ОРЕОБАМУМСООМНОУРМУТРОССОТКУМЕБІК (5ЕБЕО 10 МО: 45), починається в положенні 21 в ЗЕО ІЮ МО: 44.
Ген, що кодує НиТІСйЗ МН, синтезували у вигляді екзону, що включає донора сигнал сплайсингу на 3' кінці кодуючої ділянки 5реї! сайт на 5' кінці фрагмента і Ніпаї сайт на 3' кінці фрагмента. Нуклеотидна послідовність синтетичного гена НитІСаЗ МН (ЗЕО ІЮ МО: 46) показана разом з передбаченою амінокислотною послідовністю (5ЕО ІЮ МО: 42) на ФІГ.14А.
Ген, що кодує гуманізований МІ ТІШЗ (НиТІшЗ МІ), синтезували у вигляді екзону, що включає сигнал донора сплайсингу на 3' кінці кодуючої ділянки МНеї сайт на 5' кінці фрагмента і
Есогі сайт на 3' кінці фрагмента. Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІСЗ МІ. гена (5ЕО
ІО МО: 47) показана разом з передбаченою амінокислотною послідовністю (5ЕО ІЮО МО: 44) на
Фіг. 148.
Вектор експресії ссавця рРНиТІСЗ.АА для продукування гуманізованої Ідс1/каппа форми моноклонального антитіла ТІСЗ проти людського ТІСІТ (НитІС3-ІДа1.АА) конструювали шляхом модифікації РНиТІСТ.АА наступним чином: (1) НитТІС1 МН ген заміняли НиТІсЗ МН геном між зреї і Ніпаї|Ї сайтами, і (2) НитІСІ1 Мі. ген заміняли НиТІСЗ МІ. геном між МнНеї і ЕсоВіІ сайтами.
СНІ ділянка, що кодується в рНиТІСЗ.АА, містить заміни амінокислот на аланінові залишки в положеннях 234 і 235 (Єи нумерація) (І 234А/І 235А) для елімінування ефекторних функцій.
Амінокислотна послідовність зрілого важкого гамма ланцюга НитІс3-Ід4с21.АА, що кодується в рРНитІСЗ.АА, являє собою
ЕМОЇ МЕЗО МОРО,аБІ ВІ БСААБИаБАЕЗОМОМЗУМУВОАРИаКаИТї ЕУМАМІЗОСИУМГУУРОТМ
КавеЕтТІЗВОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВОШ ВУ МмМУусОатТТУТУ5ЗАЗТКаТРЗМЕ
РГАРБ5ЗКЗТЗаИасТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О551І 51 55УМ ТУР
ЗОЗ ЕТОТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕАДАСОИРБЗУНБІ ЕРРКРКОТІ МІ5
ВТРЕМТСУММОУЗНЕОРЕУКЕММУ УМО МЕУМНМАКТКРАЕЄОУМОТУВМУМУЗМІ ТМ НОСУМІ МОКЕ
УКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИОРАЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМБІ ТС УКОЕМРЗОІАМЕМЕ
ЗМИаОРЕММУКТТРРМІ О5БОСОЗЕБІ ЗК ТУОКЗАУМОСаММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОІ БІ БРА. Кк (ЗЕО ІО МО: 48)
С-кінцевий лізин може бути присутнім або не бути присутнім.
Амінокислотна послідовність зрілого легкого каппа ланцюга НитІс3-Ід4с1.АА, що кодується в рНИиТтІЄЗ.АА, являє собою
РІОМТО5РБОБІ БАБМаО ВМТ СКЗБОБИ УЗЗМОКММІ АМУООКРОКАРКИ ІМ АЗТВЕЗИаМ
РЗАЕЗаБаБатТОгТІ ТІ ОРЕОЕАУУУСООУНЗУРМТРаСаИТткМУЕІКАТМААРЗМРІЕРРЗО
ЕОЇ КБатАБУМСТ І ММЕМРАЕАКМОУМУКМОМАЇ О5аМЗОЕЗМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ КАВУ
ЕКНКУМАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМАСЕС (5ЕО ІО МО: 49).
Транзієнтну трансфекцію рНитТІСЗ.АА в 100 мл експоненціально зростаючих Ехрі293 клітин (Тнепто РізНег 5сієпійіс) здійснювали відповідно до протоколу постачальника. СНО-КІ стабільні трансфектанти, що продукують високі рівні НитТІС3-ІДС1.АА, також одержували шляхом електропорації РНиТІС3З.АА, як описано вище, і збільшували в об'ємі в ФЗЕМАСНО доти, поки клітинна життєздатність не ставала менше ніж 50 95. НиТІС3-ІДа1.АА очищали з культуральних супернатантів кожних транзієнтно трансфікованих Ехрі293 клітин і стабільно трансфікованих
СНО-КІ клітин на афінній колонці з білком А, як описано вище.
Приклад 7: Характеристика НиТІс3-ІДС1.АА
Зв'язування НиПІс3-ІДС1.АА з людським ТІСІТ досліджували методом ЕЇГІ5А, як описано в
БО Прикладі 5. Як показано на Фіг. 15, НиТІс3-Іда1.АА зв'язується з людським ТІСІТ дозозалежним чином. Напівмаксимальна ефективна концентрація (ЕСво) НиТІс3-ІДС1.АА для зв'язування з
ТІСІТ склала 85 нг/мл. Це показує, що НитІС3-ІДС21.АА являє собою гарне зв'язувальне для людського ТІСІТ.
Зв'язування НиТІСЗ-ІДС1.АА з людським ТІСІЇ також досліджували методом проточної цитометрії, як описано в Прикладі 5. Як показано на Фіг. 12, НитІС3-ІДС1.АА зв'язується з людським ТІСІТ дозозалежним чином. Напівмаксимальна ефективна концентрація (ЕСво)
НитІ3-ІДС1.АА для зв'язування з ТІСІЇ склала 370 нг/мл. Це показує, що НитІс3-І4с21.АА являє собою гарне зв'язувальне для людського ТІСІТ.
Активність НиТІСс3-ІДС1.АА для блокування взаємодії ТІСІТ з СО155 аналізували методом 60 проточної цитометрії з використанням М5О-НТІСІТ клітин і ЕІТО-міченого НСО155-Ес, як описано в Прикладі 5. Як показано на Фіг. 13, НиТтІС3-Ід4с1.АА блокує взаємодію між ТІСІ ї СО155 дозозалежним чином. Напівмаксимальна інгібуюча концентрація (ІСво) НиТІс3-ІДС1.АА для блокування ТІСІТ-СО0155 взаємодії становила 279 нг/мл. Це показує, що НитІс3-ІдДС1.АА є ефективним блокатором взаємодії між СО155 і ТІСІТ.
Приклад 8: Відповідь ІЇ-2 цитокінів на правцевий анатоксин у людських Т-клітинах підсилюється за допомогою блокади ТІСІТ
Здатність мишачих анти-ТІСІТ антитіл підсилювати антиген-специфічні Т-клітинні відповіді досліджували з використанням іп міго аналізу антиген специфічної відповіді на правцевий анатоксин (див., наприклад, Ріего та еї а!., Массіпе. 2006 Арг 12; 24 (16):3076-83; 7айпае!в еї аї.,
У Іттипої. 2009 АцаЯа 15;183 (4):2827-36). Достатній вакцинний захист для правцевого анатоксину досягається за допомогою бустер-ін'єкцій, які дозволяють імунній системі індукувати відповіді СО4- і СОв- Т-клітин пам'яті. Як сурогатний показник ефективності (див., наприклад,
Ріожкіп єї аї., Сіїп Массіпе Іттипої. 2010 9и!; 17 (7): 1055-1065; Сюоціоп еї аіІ. Мом. 1972 Ргеззе
Меа. 1:3049-3050.), рівні в сироватці 0,1 МО/мл анатоксину проти правця вказують на підтримку імунної відповіді.
Мононуклеарні клітини периферичної крові (Ротсв) від людей- добровольців, вакцинованих правцевим анатоксином, одержували (ід Віозсіепсе5) з підтвердженням титру правця в крові добровольців вище ніж 1,0 МО/мл методом ЕГІЗА (Сепулау). 800000 РВМС» культивували в
ВРМІ 1640 середовищі (Іпийтодеп), що містить 10 95 фетальну бичачу сироватку (ЕВ5), в 96- ямкових круглодонних планшетах (Мипс). 2 мкг/мл правцевого анатоксину (і івї Віоіодіса!
І арогайтгіез) додавали в ямки, що містять РВМС», у присутності мишачого анти-РО-1 антитіла (Віоїєдепа, клон ЕНІ12.2Н7) або анти-ТІСІТ антитіла (ТІС1) при 3,3 мкг/мл або 10 мкг/мл протягом 4 днів при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі. Як контроль, 2 мкг/мл правцевого анатоксину додавали до РВМС без яких-небудь антитіл. Супернатанти з культивованих ямок збирали і вимірювали вміст цитокінів, що вказують на Т-клітинну активацію, ІЇ-2, шляхом мультиплексного аналізу на мікросферах (ВО РНаптіпдеп, СВА ТпИТн2 СуюКіпе Кі) методом проточної цитометрії (ВО ЕАСзЗСаїїриг). Як показано на фіг. 16, продукування ІІ-2 при стимуляції тільки правцевим анатоксином склала 31 пг/мл. Продукування 1-2 ще більше підвищувалася до 70 пг/мл і 86 пг/мл у присутності мишачого анти-ТІСІТ антитіла ТІС1Т при 3,3 мкг/мл і 10 мкг/мл,
Зо відповідно. Продукування 1-2 при стимуляції правцевим анатоксином також підвищувалася до 39 пг/мл Її 57 пг/мл у присутності мишачого анти-РО-1 антитіла ЕНІ12.2Н7 при 3,3 мкг/мл і 10 мкг/мл, відповідно. Ці дані показують, що ТІС1 має функціональну здатність підсилювати антиген-специфічні відповіді Т-клітинних цитокінів.
Приклад 9: Проліферативна відповідь Т-клітин людини на оправцевий анатоксин підсилюється за допомогою блокади ТІСІТ
Здатність мишачих анти-ТІСІТ антитіл підсилювати антиген-специфічні Т-клітинні відповіді досліджували з використанням іп міо аналізу антиген-специфічної відповіді на правцевий анатоксин (див., наприклад, Ріегота еї аї!., Массіпе. 2006 Арг 12:24 (16):3076-83; 7/айпаегв еї аї.,
У Іттипої. 2009 Аца 157183 (4)2827-36). РВМС від людей-добровольців, вакцинованих правцевим анатоксином, одержували (10 Віозсіепсе5) як описано в Прикладі 8. РВМС мітили карбоксифлуоресцеїнсукцинімідиловим ефіром (СЕБЕ) (ТнептоРїізНег), що представляє собою реагент, використовуваний для іп міо і іп мімо мічення клітин для відстеження декількох поколінь із використанням розведення барвника методом проточної цитометрії. 250000 СЕ5Е- мічені РВМО5 культивували в АЇМ-М середовищі (Іпийгтодеп) в 9б-ямкових круглодонних планшетах (Мипс). 2 мкг/мл правцевого анатоксину (Авіапе Віоіодієз, ІІ С) додавали в кожну ямку в присутності мишачого анти-РО-1 антитіла (Віоїєдепа клон ЕНІ12.2Н7) або ТІС1 при 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл або 10 мкг/мл у кожній ямці. Клітини інкубували протягом 4 днів при 37 "С в 5 95
СО» інкубаторі. У День 4 1-2 |50 одиниць/млі| (Рергоїєсі) додавали до культур, а в День 6
РВМС» збирали для вимірювань проліферації методом проточної цитометрії (ВО ГАСзЗСаїїриг)
БО для визначення розведення СЕБЕ на СО4-- Т-клітинах або СОв8'- Т-клітинах.
Як показано на Фіг. 17 (верхні панелі), правцевий анатоксин індукував проліферацію 4,5 95 і 6,5 96 людських СО4ж Т-клітин, отриманих від донорів 1 і 2, відповідно. Додавання ТС! ще більше підвищувало СО4- Т-клітинну проліферацію при всіх випробовуваних концентраціях антитіл (2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл і 10 мкг/мл), при цьому подібні проліферативні ефекти спостерігали з анти-РО-1 антитілом при цих діапазонах доз.
Як показано на Фіг. 17 (нижні панелі), правцевий анатоксин індукував проліферацію 15 95 і 15,5 95 людських СО8- Т-клітин, отриманих від донорів 1 і 2 відповідно. Додавання ТІС1 ще більше підвищувало СО8- Т-клітинну проліферацію при всіх випробовуваних концентраціях антитіл (2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл і 10 мкг/мл), при цьому подібні проліферативні ефекти спостерігали
Зо з анти-РО-1 антитілом ЕНІ12.2Н7 при цих діапазонах доз. Ці результати показують, що ТІС1 має здатність підсилювати антиген-специфічні Т-клітинні проліферативні відповіді.
Приклад 10: Підвищення МК-клітинно-опосередкованої цитотоксичності з використанням людських первинних ефекторних клітин і К5 62 клітин-мішеней за допомогою блокади ТІСІТ
Людські МК-клітини здатні індукувати природну цитотоксичність для клітин-мішеней, які не містять МНС І, таких як К562, клітинна лінія хронічного мієлогенного лейкозу (СМІ) (див., наприклад, Мадеї! еї аї., Сапсег Нез 1981; 41:2284-2288; Апаегззоп вї аї!., Іпї У Сапсег. 1979 Рер; 23 (2):143-7.; 1 027іо єї а!., Ї еик Вев. 1979;3(6):363-70). Експресію СО155 (РУБ) на К562 клітинах (АТСС) підтверджували з використанням комерційного антитіла (Віоїеєдепа анти-СО155 клон
ЗКІІ.4). Як показано на Фіг. 18 (верхня панель), 9895 К5Ьб2 клітин, як було виявлено, експресують високі рівні СО155 (чорна гістограма). Експресію ТІСІї на людських СО 56- позитивних МК-клітинах в РВМС (10 Віозсієпсе5) з використанням комерційного антитіла (еВіозсієпсез5 анти-ТІСІЇ клон МВ5А43 і Віоієдепа анти-СО5б клон НСОБ5б) також підтверджували на З репрезентативних людських донорах (Фіг. 18, нижні панелі).
Лізис К562 клітин, опосередкований МК-клітинами, вимірювали з і без ТІСТ. РВМС культивували протягом ночі в АІМ-М середовищі (Іпмігодеп) у присутності інтерлейкіна-2 (ІІ--2) (200 одиниць/млі| (Рергоїесій) при 37 "С в 595 СО» інкубаторі. Наступного дня К562 клітини мітили СЕ5Е і спільно культивували 1:100 з РВМСО:» (Мішень: РВМСО5; одна К562 клітина на сто
РВМС, які містили приблизно 5 95 МК-клітин) протягом 4 годин при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі в присутності 10 мкг/мл ТІС1. Після інкубації клітини збирали і забарвлювали за допомогою 5 нм зЗуюх Вей (ПепторРізНег) для розрізнення мертвих клітин-мішеней за допомогою (СЕЗЕ -5уюх
Веаж). Відсотки К562 клітин-мішеней, лізованих МК-клітинами, визначали методом проточної цитометрії (ГЕАС5ЗСаїїриг; Ріомлуо Аналіз). Як показано на фіг. 19, 2 95 К562 клітин було лізовано без ТІС1. Коли додавали ТІСІ1, було лізовано 4,4 95 К562 клітин. Додавання ТІС1 підвищувало
МК-клітинно-опосередковану природну цитотоксичність К562 клітин дворазово, демонструючи, що ТІС!Т має здатність підвищувати рівень кілінгу клітин-мішеней субпопуляцією людських ефекторних клітин.
Приклад 11: ЗЕВ-індуковане продукування цитокінів людськими Т-клітинами підсилюється за допомогою блокади ТІСІТ
Зо Суперантигени, такі як 5ЕВ (еїарпуіососсив Епіегоїюхіп В), активують Т-клітини шляхом зв'язування молекул МНС класу ІЇ на антиген-презентуючих клітинах з мв елементом ТОВ, призводячи до продукування цитокінів, включаючи інтерлейкін-2 (ІІ-2), інтерлейкін-б (ІІ -6), фактор некрозу пухлини альфа (Та) і інтерферон гамма (ІЄМу) (див., наприклад, Ктакацег єї а!І., Тохіп5 (Вазеї). 2010 Ацо; 2 (8): 1963-1983). У порівнянні з типовою антиген-індукованою Т- клітинною відповіддю, де 0,1-001 95 Т-клітин можуть активуватися, 5ЕВ здатний активувати до 10-20 95 Т-клітин у людській крові залежно від фракції Т-клітин, що містять мВ3, м812, мВ14 і
МВ17, виявленої в крові кожного конкретного донора. Тому ЕВ можна використовувати для Т- клітинного аналізу секреції цитокінів для визначення рівня модуляції мішені за допомогою блокади ТІСІТ з використанням клітин цільної крові людини (М/ВС).
Свіжовиділені зразки МУВС (-їапіога Віоод Сепіє) одержували з використанням натрій гепарину не пізніше ніж через 4 години після взяття крові з відсутністю візуальних ознак гемолізису. 250 мкл розподіляли аліквотами по ямках в 96-ямкові круглодонні планшети (Мипс) і стимулювали за допомогою 5ЕВ (Тохіп Тесппоіоду) при 1 мкг/мл кінцевої концентрації в присутності 10 мкг/мл гуманізованого анти-РО-1- моноклонального антитіла або 10 мкг/мл
НитІс1-Іда1.АА протягом 24 годин при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі. Через 24 години 96-ямкові планшети швидко центрифугували для відділення шару плазми для збору. Після збору зразків плазми рівні експресії ІІ -2, І/-6, ТМЕс; і ІЕМу вимірювали шляхом мультиплексного аналізу на мікросферах для визначення вмісту цитокінів (Віоїєдепа, ГЕСЕМОрієх"М Панель людських
СО8/МК) методом проточної цитометрії (ВО РАСбсСаїїриг) і аналізували з використанням
Віоїєдепа програми для кількісного визначення.
Для визначення зміни рівня експресії кожного з Ії -2, І/-6, ТМЕо і ІЄМу, рівень цитокінів у присутності випробовуваного антитіла (плюс 5ЕВ) ділили на рівень цитокінів під час відсутності антитіла для кожного донора. 2-кратна зміна "наприклад, визначена в присутності анти-ГІСІТ), таким чином, означає, що абсолютна концентрація цитокінів, вимірювана в експерименті, у два рази більше виявленої в ХЕВ-стимульованих контрольних умовах. Як показано на Фіг. 20, 5ЕВ- стимульоване продукування 1ІЇ-2, І/-6, ТМЕо або ІРМу клітинами крові здорового донора підвищувалася в присутності 10 мкг/мл гуманізованого анти-РО-1 або 10 мкг/мл НитІС1-
Ідс1.АА. У цих умовах, 5ЕВ-індуковане продукування цитокінів клітинами УВС і її модуляція за допомогою НитІс1-ІдДа1.АА є показником потенціювання ефекторних відповідей цитокінів, що реєструється. НитІСс1-ІДС1.АА здатний потенціювати імунні відповіді, як продемонстровано стимуляцією продукування ІІ -2, І. -6, ТМРо; і ІЕМу у показаному аналізі.
Приклад 12: Характеристика НитТІС1-І(ДС1.АА ої /Нитіа3-ІдДа1.АА-опосередкованої комплемент-залежної цитотоксичності
Комплемент-залежна цитотоксичність (СОС) належить до лізису клітини, яка експресує молекули-мішені в присутності комплементу (див., наприклад, Са77апо-запіого еї аї., у. ІттипоЇї.
Меїпоавз, 202:163). Активація класичного шляху комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (Сід) з антитілами (підходящого підкласу), які пов'язані з їх розпізнаним антигеном на клітинній поверхні. Для оцінки активації комплементу, людську Т- клітинну подвійну репортерну батьківську клітинну лінію УшциЖаї (Юца! диткаї; Іпмімодеп) сконструювали для стабільної експресії людського ТІСІТ (Читкаї-ТІСІТ) на поверхні. Як показано на Фіг. 21, експресію ТІСІТ на поверхні диикаї-ТІДІТ клітин підтверджували методом проточної цитометрії з використанням комерційного РЕ-міченого анти-ТІСІТ антитіла (еВіозсієпсе5 клон
М5ВА43).дитка-тісіІї тому використовували як клітини-мішені, які конститутивно експресують мембрана-зв'язаний ТІСІТ і, таким чином, можуть зазнати активності антитіло-зв'язаного СОС у присутності комплементу.
Аналіз СОС здійснювали з використанням УигКкаї-ТІСІТ клітин і людського комплементу в присутності НитІс1-Ід4с1.АА, НитІсЗ3-ІдДС21.АА або кролячого антитимоцитарного глобуліну (АТО) (Егезепіиє Віоїесй СтрЬН) з концентраціями, що збільшуються, до 50 мкг/мл. АТО використовували як позитивний контроль через його реактивність із УшцшКаї клітинами і документально підтвердженої комплемент-залежної цитотоксичної активності з УиїКаї клітинами (див., наприклад, Еієттапп еї а!., У Нетаюйег 5іет Сеї! НКез. 2001 дип;10 (3):385-90.; Ауик еї аї.,
АпіїСапсег Везвєагсі 29: 1355-1360 (2009). 50000 диткаї-ТІСІТ клітин в ВРМІ 1640 середовищі (Іпмйгтодеп), що містить 1095 фетальну бичачу сироватку (ЕВ5), висівали в 96-ямкові круглодонні планшети (Мипс). Використовувані для обробки антитіла додавали, починаючи з найвищої концентрації 50 мкг/мл, з наступним трикратним серійним розведенням, і залишали для інкубації із клітинами протягом 1 години при 37 "С в 595 СО» інкубаторі. Після цієї 1- годинної інкубації додавали людський комплемент і залишали для інкубації ще протягом З годин при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі. Після завершення цієї З-годинної інкубації додавали 5 мкг/мл
Зо пропідій йодиду (ТпептоРізПпег) і зразки аналізували методом проточної цитометрії (ВО
ЕАСо5сСаїїриг) для визначення відсотків пропідій йодид-позитивних як показника клітинної загибелі.
Для визначення нормалізованих змін відсотки життєздатних клітин вимірювали методом проточної цитометрії і відсоток пропідій йодид-позитивних клітин оцінювали як мертві клітини.
Значення для необроблених зразків нормалізували до 100 95. Відсотки життєздатності зразків у присутності антитіла ділили на нормалізовані необроблені з одержанням кратної зміни життєздатності. Як показано на Фіг. 22, ні НитІс1-Іа1.АА, ні НитІс3-ІДС1.АА аж до 50 мкг/мл не індукували СОС активність. Ці дані показують, що зв'язування як НиТ/Іс1-ІС1.АА, так і
НитІа3-Іда1.АА з ТІСІТ не призводить до комплемент-опосередкованої клітинної загибелі Т- клітин.
Приклад 13: Характеристика НитІСс1-ІДС1.АА ї НитІаЗ3-Ід4с1.АА з використанням УишЖКаї подвійної репортерної клітинної лінії
Функціональний наслідок блокування людського ТІСІї рецептора аналізували з використанням УшКаї-ТІСії репортерної клітинної лінії яка несе в хромосомі секретований люциферазний репортерний ген, який управляється ІЕМР мінімальним промотором, злитим з п'ятьма копіями МЕ-кКкВ консенсусного елемента транскрипційної відповіді і трьома копіями с-Не сайту зв'язування. УиКаї-ТІСіІї клітини також експресують секретований ембріональний репортерний ген лужної фосфатази (5ЕАР) під контролем ІЗа54 мінімального промотору разом з п'ятьма елементами ІЕМ-стимульованої відповіді.
Аналізи включають дві клітинні лінії, що представляють Т-ефекторні клітини (диикаї-ТІСІТ) і антиген-презентуючі клітини. Т-ефекторні клітини стабільно експресують люциферазний репортер, який активується нижче від Т-клітинного рецептора (ТОВ). Антиген-презентуючі клітини (штучні антиген-презентуючі клітини або "аАРС") стабільно експресують активаторний білок Т-клітин, який зв'язується і активує Т-ефекторну клітину, таку як дигКкаї-ТІСІТ, антиген- незалежним чином (Рготеда). аАРС клітини також сконструйовані для експресії СО155. Коли Т- ефекторну клітину спільно культивують із її відповідної аАРС клітиною, взаємодія ТІСІТ з СО155 інгібує активацію Т-ефекторних клітин і зменшує експресію люциферази. Додавання анти-ТІСІТ блокувального антитіла вивільняє інгібіторний сигнал, що робить можливою експресію люциферазної активності.
У цьому аналізі 16000 аАРС, які експресують людський СО155 і активаторний білок Т-клітин (ТСА Активатор СО155 СНО-КІ) (Рготеда) висівали на 9б-ямковий планшет з половинним об'ємом ямок і інкубували при 37 "С в 595 СО» інкубаторі протягом 24 годин. Наступного дня 50000 людських Уижкаї-ТІСІТ клітин спільно культивували з ТОВ Активатор СО155 СНО-КІ1 під час відсутності або в присутності НитТІС1-ІДС21.АА або НитІСЗ3-І4С1.АА, починаючи при 10 мкг/мл із дворазовим серійним розведенням, ще протягом 24 годин. Супернатанти збирали і секретовану люциферазу вимірювали з використанням ОШАМТІ-Їис (Іплімодеп) і багаторежимного планшет-рідера (РеїкКкіп ЕІтег Епорігє) у вигляді відносних світлових одиниць.
Для визначення кратної зміни відносних світлових одиниць відносні світлові одиниці УиКаї-
ТІСІТ, спільно культивованих з ТСА Активатор СО155 СНО-КІ у присутності різних концентрацій анти-ТІСІТ антитіл, ділили на відносні світлові одиниці під час відсутності антитіл.
Тому як приклад, 2-кратне збільшення (наприклад, визначене в присутності анти- ТІСІТ), таким чином, означає, що відносні світлові одиниці, вимірювані в експерименті, у два рази більші, ніж кількість, визначена в контрольних умовах, стимульованих тільки ТСВ-активатором.
Як показано на Фіг. 23, і НитІа1-Ід421.АА ї НитІСа3-ІдДа1.АА могли підвищувати природню Т- клітинну сигналізацію, що активує, як визначено зі збільшення відносних світлових одиниць, індукованих у присутності кожного блокувального ТІСІТ антитіла, від 0,6 мкг/мл до 10 мкг/мл, приблизно з 1,5-2, 5-кратним збільшенням. Ці дані показують, що анти-ТІСІТ антитіла мають антагоністичну активність, блокуючи функцію ТІСІТї, і підвищують природню Т-клітинну активність.
Приклад 14: Конкурентне зв'язування з ТІСІТ
Проточну цитометрію використовують для ідентифікації антитіла, яке конкурує з ТІС1 за зв'язування з людським ТІСІТ. ТІС1 мітять флуоресцентним барвником РІТС з використанням набору для РІТОС-мічення антитіл Рівтсе (Тепто Рівпег Зсієпійіс) відповідно до протоколу виробника. Зв'язування отриманого РІТС-міченого ТІС1 з людським ТІСІТ досліджують методом проточної цитометрії з використанням М50-НТІСІТ клітин. Сто тисяч М5О-НТІСІТ клітин інкубують з різними концентраціями ЕРІТС-міченого ТІС1, починаючи з 10 мкг/мл і дворазових серійних розведень, в 200 мкл ЕАС5 Буфера (РВ5, що містить 0,5 95 бичачого сироваткового альбуміну і 0,05 95 азиду натрію) при 4 "С протягом 30 хвилин. Після промивання за допомогою
Зо 2 мл ЕАС5 Буфера М5О-НТІСІТ клітини суспендують 0,2 мл ЕАС5 Буфера і піддають аналізу методом проточної цитометрії з використанням проточного цитометра ЕАСбсап (ВО
Віозсієпсе5, Зап дозє, СА) і одержують середньоканальну флуоресценцію (МСЕ) при кожній концентрації антитіл. Суб-насичуючу концентрацію, де досягається 90 95 від максимального рівня флуоресценції, визначають для РІТОС-міченого ТІСТІ.
Суб-насичуючу концентрацію ЕРІТС-міченого ТІС1 інкубують зі ста тисячами М5О-НТІСІТ клітин у присутності (або під час відсутності) 200-кратно більш високої концентрації випробовуваного антитіла в 200 мкл ЕАС5 Буфера при 4 "С протягом 30 хвилин. Наприклад, коли 0,1 мкг/мл РІТО-міченого ТІС1 використовують для зв'язування з М5О-ПТІСІТ клітинами, 20 мкг/мл випробовуваного антитіла додають до клітинної суспензії. Як фоновий контроль сто тисяч М5О-НТІСІТ клітин інкубують без яких-небудь антитіл. Після промивання за допомогою 2 мл РАС5 Буфера М5О-НТІСІТ клітини суспендують в 0,2 мл ЕАС5 Буфера і піддають аналізу методом проточної цитометрії.
МСЕ значення для клітин М5О-НТІСІТ, інкубованих з РІТО-міченим ТІСт (МСЕ АЇ, нормалізують до 100 95, і МСЕ значення для клітин М5О-ПТІаІТ, інкубованих без яких-небудь антитіл (МСЕ ВІ, нормалізують до 0 95. МСЕ значення для клітин М5О-НТІСІТ, інкубованих з
ЕІТО-міченим ТІШТї і випробовуваним антитілом | МСЕ СІ), нормалізують із використанням наступної формули: 100 х (МСЕ СІ - ІМСЕ ВІ)ЛІМСЕ АЇ - (МСЕ ВІ). Коли нормалізоване значення
МСЕ для М5О-НТІІТ, інкубованих з РІТС-міченим ТІСТІ ї випробовуваним антитілом, менше ніж 20 95, випробовуване антитіло визначається як конкуруюче з ТІС1 за зв'язування з людським
ТІСІТ.
Такий же аналіз можна використовувати для ідентифікації антитіл, які конкурують із ТІСе або ТІСЗ.
Приклад 15: Вимірювання афінності
Антиген-зв'язуючу афінність моноклональних антитіл можна виміряти за допомогою безмаркерних оптичних біосенсорів на ефекті поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ), таких як Віасоге Т100 (СЕ Неайнсаге І Ше бЗсієпсез5, Мапброгоцдни, МА), РгоїєОп ХРАЗ6 (ВіоРНаа,
Негсшіевз, СА), Осієї ВЕОЗ84 (РопевВіо, Мепіо Рак, СА) і ІВІ5 МХ96 (У/азаїсй Місгої Іцідісв, Заї
І аКе Су, ОТ) (Мапа єї а!., Апаї. Віоспет. 508:78-96, 2016). Афінність зв'язування антигену для кожного з ТІС1, ТІС2 і ТІ2З вимірювали з використанням Віасоге Т100, як описано Мапа еї аї. (510) (зирга). Білок А/Я (Тйепто Різпег Зсієпійіс) іммобілізували на проточних комірках в СМ5 сенсорному чипі (БЕ Неайнсаге ІПе Зсієпсев5) з використанням стандартного протоколу зв'язування. Випробовуване антитіло (ТІС1, ТІС2 або ТІСЗ3) захоплювалося білком А/С на СМ5 сенсорному чипі. Різні концентрації рекомбінантних людських ТІСЧІТ білків, таких як
Рекомбінантний Людський ТІСІТ, Нібв-мічений (Стеайме ВіоМапй, Зпіпеу, МУ), використовували в потоці для зв'язування з випробовуваним антитілом на сенсорному чипі. Значення швидкості асоціації (ка) і швидкості дисоціації (Ка) взаємодії між випробовуваним антитілом і людським
ТІСІТ одержували з використанням програми ВіАємаЇнайоп (СЕ Неайнсаге І Пе Зсіепсев).
Константу асоціації (Ка) розраховували шляхом розподілу швидкості асоціації (ка) на швидкість дисоціації (Ка) для кожного з ТС, ТІС2 і ТІС3. Константу дисоціації (Ка) розраховували шляхом розподілу швидкості дисоціації (Ка) на швидкість асоціації (ка).
Дослідження з використанням біосенсорів для НитІс1-Ід401.АА здійснювали на ВіоНай
РгоївєОп ХРАЗ6 системі в 10 мМ НЕРЕ5, 150 мМ Масі, рН 7,4, 0,005 95 Гиееп-20 і 0,2 мг/мл ВБА при 25 "С. НитІСс1-Іда1.АА розбавляли до 3,7, 1,2 і 0,4 нМ і захоплювали протягом 5 хвилин на
СІМ сенсорному чипі, покритому - 10000 ВО антилюдського ІдС антитіла від СЕ. Ніз-мічений розчинний рекомбінантний людський ТІСІТ (Саї Ж ТІТ-Н52НЗ; Аего Віозувіет5, Межа, ОЕ) випробовували при 100 нМ у вигляді найвищої концентрації в З-кратних серійних розведеннях до 1,2 НМ. Дані від трьох різних поверхневих густин антитіл глобально підганяли до 1:1 моделі взаємодії з використанням локально встановленого АНтах. Отримані швидкість асоціації (ка) і швидкість дисоціації (Ка) являли собою (4,42250,02)х105 М'сек.! і (4,09-0,02)х107 сек, відповідно. Розрахована константа дисоціації (Ка) мала значення 92557 пМ.
Приклад 16: Картування епітопів
Для локалізації епітопу, розпізнаваного кожним з ТІС1, ТІС2 і ТІСЗ в ТІСІТ молекулі, мутанти з однією амінокислотною заміною були утворені в позаклітинній ділянці ТІСІТ (5ЕО ІЮ МО: 3) методом сайт-спрямованого мутагенезу з використанням ПЛР із розширеннями, що перекриваються, (Нідиснпі, А., 1989, в "РСА ТесПппоіоду: Ргіпсіріеєє апа Арріїсайоп5 їогї ОМА
Атрійісайоп", Епісн, Н. А., ей. 5юсКіоп Ргез5, Мем Мої, МУ, рр 61-70). Для аналізу використовували наступні шість мутантів у позаклітинній ділянки ТІСІТ: ОЗБА (5ЕО І МО: 50),
МЗ37А (З5ЕО І МО: 51), ОЗ9А (5ЕО ІО МО: 52), МА9А (5ЕО ІО МО: 53), ОБО1ТА (5ЕО ІО МО: 54) і
ЕВбБА (5ЕО І МО: 55). Буква ліворуч, цифра в середині і буква праворуч у назві кожного
Зо мутанта означають амінокислотний залишок в ТІСІТ дикого типу, розташування рахуючи від М- кінцевого метіонінового залишку в позаклітинній ділянці ТІСІТ (5ЕО ІЮО МО: 3), і амінокислоту в мутанті, відповідно. Амінокислотні залишки позначені однобуквеним кодом. Кожний із цих шести мутантів містить амінокислотну заміну поблизу ділянки контакту ТІШІТ-СО155 комплексу (іеподеї, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 109:5399-5404, 2012).
Вектор експресії ссавця рЕСті79 мав таку ж структуру, як рЕСт404 (Фіг. 1), за винятком того, що (ї) ген пуроміцин М-ацетил-трансферази замінений геном ксантингуанінфосфорибозилтрансферази Е. сої, і (ії) позаклітинна ділянка людського ТІСІТ замінена людським 1І/-15. ДНК фрагменти, що кодують шість мутантів, що включають заміну аланіном, позаклітинної ділянки людського ТІСІТ, індивідуально вбудовували в рЕСт17 9 для заміни І1-15-кодуючої ділянки. Отримані вектори експресії, рЕСт!179-О35А, рЕСт!79-М37А, рЕСті179-О39А, рЕСт!179-М49А, рЕСт179-051А ії рЕСт179-Е86А, містили ОЗ5БА, МЗ37А, ОЗ9А,
М4А9А, 051А і Е8бА мутанти в ТІСІТ-кодуючій ділянці, відповідно, і експресували таку ж послідовність ТІСІТ-ЕРс злитих білків, як ту, що кодується в рЕСт404, за винятком однієї амінокислотної заміни, специфічної для кожного мутанта.
Дикого типу і мутантні ТІСІТ-Ес злиті білки транзієнтно експресували в клітинній лінії ембріональних нирок людини НЕК293. НЕК293 клітини вирощували в ОМЕМ, що містить 10 95
ЕС5, при 37 С в 7,595 СО» інкубаторі. Вектори експресії дикого типу і мутантних ТІСІТ-Ес злитих білків (рЕСт404, рЕСт179-О35А, рЕСт179-М37А, рЕСт179-О39А, рЕСті!79-М49А, рЕСті179-051А ії рЕСт179-Е86А) індивідуально трансфікували в НЕК293 клітини способом з використанням полієтиленіміну (ЮОитоснег еї аї. Мисі. Асіа5 Нев. 30: е9, 2002). Рівні продукування
ТІСІТ-Рс злитих білків у культуральних супернатантах вимірювали методом ЕГІБЗА. Коротко,
ЕПІЗА планшет покривали 100 мкл/'ямка цапиним антилюдським /дс Ес-специфічним поліклональним антитілом (бідта-Аїагісн), 1/ 2000-розведеним в РВ5, при 4 "С протягом ночі, промивали промивним буфером і блокували ЕГІЗА Буфером 200 мкл/ямка протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Після промивання промивним буфером, культуральні супернатанти транзієнтно трансфікованих НЕК293 клітин, відповідним чином розведені в ЕГІЗА Буфері (100 мкл/ямка), наносили на ЕГІЗА планшет. Очищений НТІСІТ-ЕРс використовували як стандарт.
Після інкубації ЕГІЗА планшета протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і промивання промивним буфером визначали зв'язані Ес злиті білки з використанням 100 мкл/ямка НАР-
Ге) кон'югованого цапиного антилюдського ІДС поліклонального антитіла (5ошетвВіоїесі), 12000-
розведеного в ЕГІЗА Буфері. Після інкубації планшета протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і промивання промивним буфером ініціювали прояв кольору шляхом додавання 100 мкл/ямка АВТО субстрату (бідта-АїЇдгсн) і зупиняли за допомогою 100 мкл/ямка 2 95 щавлевої кислоти. Поглинання зчитували при 405 нм.
Зв'язування кожного з мишачих ТІСІ1, ТІС2 і ТІСЗ антитіл з ТІСІТ мутантами досліджували методом ЕГІ5А. ЕГІЗА планшет покривали за допомогою 100 мкл/ямка цапиним антилюдським
Ід Ес-специфічним поліклональним антитілом (бідта-Аїагісн), 172000 розведеним в РВ5, при 4 "С протягом ночі, промивали промивним буфером і блокували 200 мкл/ямка ЕГІЗА Буфером протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Після промивання промивним буфером, 0,5 мкг/мл транзієнтно експресованих ТІСІТ-Ес злитих білків, що містять або ТІСІТ дикого типу, або один із шести ТІСІТ мутантів, в ЕГІЗА Буфері (100 мкл/ямка) наносили на ЕГІЗА планшет у двох паралельних експериментах для інкубації при кімнатній температурі 30 хвилин. Як негативний контроль використовували культуральні супернатанти нетрансфікованих НЕК2 93 клітин. Після промивання промивним буфером наносили 100 мкл/ямка 200 нг/мл випробовуваного антитіла (ТІС1, ТІС2 або ТІСЗ) в ЕГ ІЗА Буфері (100 мкл/ямка). Після інкубації ЕГІЗА планшета протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і промивання промивним буфером, визначали зв'язані антитіла з використанням 100 мкл/ямка НАР-кон'югованого цапиного поліклонального антитіла до мишачого каппа ланцюга (ВеїнНуї І арогаюгіев, Мопідотегу, ТХ), 1/2000 розведеного в ЕГІЗА
Буфері. Після інкубації планшета протягом 0,5 години при кімнатній температурі і промивання промивним буфером ініціювали прояв кольору шляхом додавання 100 мкл/ямка АВТ5 субстрату (5ідта-АїЇйгіст) і зупиняли за допомогою 100 мкл/ямка 295 щавлевої кислоти.
Поглинання зчитували при 4 05 нм.
Таблиця 1
Зв'язування ТІСТІ, ТІС2 ії ТІСЗ з ТІСІТ мутантами 11111111 Відноснезв'язуванняз ТІСІТ(9).д
МЗ37АСЗЕОІ0МО:51). 77777771 17111171081 17111175 1111835. ЮщЩ (
Для кожного з ТІС71, ТІФб2 і ТІСЗ відносне зв'язування з кожним ТІСІЇ мутантом розраховували за наступною формулою. Середнє поглинання з дикого типу ТІСІТ-Рс злитими білками (Абе А| нормалізували до 10095, і середнє поглинання з культуральними супернатантами нетрансфікованих НЕК2 93 клітин (Аб5 ВІ нормалізували до 0 905. Середнє поглинання з мутантним ТІСІТ-Рс злитим білком (Абе Сі)| нормалізували з використанням
Зо наступної формули: 100 х (АБ СІ - І(Аб5 ВІЛІАБ5 АЇ - ІАБб5 ВІ). Результат представлено в
Таблиці 1. Відносне зв'язування ТІС1 було менше ніж 5 95, коли амінокислотний залишок був замінений аланіном у положенні 35, 37, 49 або 51, вказуючи на те, що амінокислотні залишки в цих чотирьох положеннях є критичними для зв'язування ТІС1 з ТІДІТ. Жоден з ТІСІТ мутантів, використовуваних у цьому аналізі, не усував зв'язування ТІС2 і ТІСЗ з ТІСІТ.
Приклад 17: Підвищена секреція ІРМу при додаванні НитТІс1-Іда1.АА, анти-РО-1 1 антитіла і
НитІс1-ІДда1.АА у комбінації з анти-РО-І1 антитілом
Людські РВМО5 спочатку виділяли з лейкоцитарної плівки шляхом нашаровування крові на градієнтне середовище (І утрпоргер; ЗТЕМСЕГ І; 07801) і збору РВМСОз після центрифугування з інтерфази. На наступній стадії людські моноцити виділяли з РВМО5 шляхом СО14 позитивної селекції (набір Еазубер для позитивної селекції людських СО14; ЗТЕМСЕЇ І; Саї й 18058) відповідно до протоколу виробника і культивували протягом шести днів в ВРМІ середовищі, доповненому 5 95 ЕВ5 і 0,1 мкг/мл ЕМ-С5Е (НО; Саї й 215-24М-050/СБЕ) і 0,1 мкг/мл ІІ -4 (НО;
Саї я ІІ -050/СЕ). Диференційовані моноцитарні дендритні клітини (тоЮсСв5) збирали і перевіряли на експресію СО155, 20112 і РО-І1 методом проточної цитометрії (Фіг. 24).
Людські СО4- клітини від 4 різних донорів виділяли з лейкоцитарних плівок шляхом негативного виснаження (Нозейебер коктейль, збагачений людськими СО4 Т-клітинами;
ЗТЕМСЕЇ І; й 15062) і визначали чистоту методом проточної цитометрії.
тоОсз і 004 клітини об'єднували у співвідношенні 1:4 (25000 тоЮСв5; 100000 СО4-- клітин) і культивували протягом чотирьох днів у безсироватковому середовищі (Х-Мімо-2 0; 1 ОМ72А; Саї я 04-44803) у присутності НитІСс1-ІДС1.АА (5 мкг/мл або 15 мкг/мл) або анти-РО-1 1 антитіла (10 мкг/мл; клон 243,55.51; 5ЕО ІО МО: 56 8. 57), або обох НитІС1-І421.АА (15 мкг/мл) і анти-РО-І 1 антитіла (10 мкг/мл) протягом 4 днів перед кількісним аналізом ІЄМу з використанням
Цитометричного Аналізу на Мікросферах (СВА; Нитап ІЄМу Рієх Зеї; ВО; Саї Ж 560111).
Людський Ідс1 Ес (25 мкг/мл; ВіоХсеї!; Саї 2 ВЕ0096) використовували як контроль.
Як показано на Фіг. 25, блокада НитІС1-Ідс1.АА і анти-РО-Ї1 антитілом незалежно підвищувала продукування ІЕЄМу у порівнянні з відповідним ізотиповим контрольним антитілом.
Комбінація НитІС1-Ідс1.АА з анти-РО-/1 антитілом суттєво і синергічно підвищувала продукування ІЕМу у порівнянні з будь-якою монотерапією, використовуваної окремо.
Приклад 18: НитІс1-Ід4с21.АА ї НитІСЗ3-ІДС1.АА розпізнають ТІСІТ, що експресується на людських лімфоїдних і мієлоїдних клітинах
Сумарні людські РВМС5, виділені в десяти донорів, спільно забарвлювали безпосередньо кон'юЮгованими антитілами, розмежовуючи Т-клітини, В-клітини, МК-клітини і субпопуляції мієлоїдної лінії. Мертві клітини виключали з використанням набору для забарвлювання
Пмуе/деай Ріїхабіеє Ада Оеєаа Сеї еаїп Кії. Експресію ТІСІТ визначали з використанням НитІс1-
ІДСа1.АА і НитІаЗ-ІДС1.АА антитіл, кон'югованих з Аїехаб47 барвником. Експресію С0О96 визначали з використанням комерційно доступного анти-СО096 антитіла (клон МКЗ2,39). На Фіг. 26А, знак плюс (ж) означає експресію вище фонової, а (їж--) означає найвищу спостережувану експресію. Знак плюс/мінус (-/-) показує, що тільки субпопуляція клітин у позначеній популяції експресує ТІСІТ або СО0Уб вище фонового значення, а знак мінус (-) вказує на відсутність експресії вище фонової. У всіх випадках фонове значення визначали з використанням модифікованого способу РіІнпогезсепсе Міпив Опе (ЕМО), у якому були додані всі флуорохроми, використовувані в забарвлювальній панелі, за винятком цільового антитіла (тобто НитІС1-
Ідс1.АА, НитІсЗ3-Ідса1.АА, анти-СОО9б антитіло). Навпаки, цільове антитіло заміняли Ідс специфічним ізотиповим контрольним антитілом такої ж конфігурації. Фіг. 268 показує репрезентативні гістограми забарвлювання анти-ТІСІТ антитілами в РВМСО» при різних рівнях експресії, які використовували для визначення рівнів експресії СООб на Фіг. 26А. Світлі
Зо гістограми представляють модифікований ЕМО. Темні гістограми представляють НитІС1-
ІДа1.АА або НитІс3-Іда1.АА забарвлювання.
Дисоційовані пухлинні клітини з меланоми, колоректального злоякісного новоутворення, недрібноклітинної карциноми легені і світлоклітинної нирково-клітинної карциноми одержували з комерційного джерела і забарвлювали безпосередньо кон'югованими антитілами, розмежовуючи Т-клітини і антиген-презентуючі клітинні субпопуляції. Лейкоцити ідентифікували з використанням пан-ізоформи анти-СО45 антитіла (клон НІЗО). Мертві клітини виключали з використанням набору для забарвлювання І іме/адєай Ріхаріе Ада Оеаай Сеї! іаїп Кії. Експресію
ТІСІЇ визначали з використанням НитІС1-ІДС1.АА антитіла, кон'югованого з Аїехаб47 барвником. У всіх випадках фонове значення визначали з використанням модифікованого способу Ріпогезсепсе Міпи5 Опе (ЕМО), у якому були додані всі флуорохроми, використовувані в забарвлювальній панелі, за винятком цільового антитіла (тобто НитТІСс1-І4а1.АА). Навпаки, цільове антитіло заміняли ІдСб: специфічним ізотиповим контрольним антитілом такої ж конфігурації. Фіг.32В8 показує репрезентативні гістограми анти-ТІСІТ забарвлювання на пухлино- інфільтруючих лімфоцитах (Ті) при різних рівнях експресії, показаних на Фіг. 32А. Світлі гістограми представляють модифікований ЕМО. Темні гістограми представляють НитІС1-
ІДа1.АА забарвлювання.
Приклад 19: Картування епітопів антилюдського ТІСІТ антитіла НитІа1-Ід4са1.
Людську кКДНК ТІСІТ клонували в рерМА 3.1 (ж) з гемагглютиніновою (НА) пептидною міткою, що включає 9 залишків, з наступним пептидним лінкером, що складається з 10 залишків, вбудованим після природного сигнального пептиду, що складається з 21 залишку, і перед М- кінцем зрілого ТІСІТ білка (ЗЕО ІЮ МО: 58). Амінокислотні залишки, що представляють інтерес (134, 035, М37, Е39, І 44, 147, М49, 051, 152, Н55, Е86, 188, НОО, У92 і Т96), у позаклітинній ділянці людського ТІСІТ були мутовані в аланін, по одній амінокислоті за один раз. Плазміди очищали і транзієнтно трансфікували в СНО-КІ1 клітини з використанням реагенту Гидепе 6 (Рготеда) для трансфекції відповідно до рекомендацій виробника. Експресію НА-міченого людського ТІСІТ мутанта підтверджували шляхом детекції за допомогою анти-НА антитіла.
Для аналізу проточної цитометрії зв'язування анти-пТІСІТ антитіла з епітопом, НА-мічені людські ТІСІТ білки з або без одиночної амінокислотної мутації транзієнтно трансфікували в
СНО-КІ клітини. Через 24 години трансфіковані клітини суспендували в НВЗ5 буфері (Тпегто 60 Еівпег Зсіепійіс, Саї Ж 14175095) і інкубували з НитІС1-ІДС1.АА антитілом при концентраціях, що
Зб змінюються, в об'ємі 50 мкл. Після інкубації протягом 1 години при 4 "С клітини промивали і здійснювали другу інкубацію з 50 мкл АїЇПеха488-кон'югованого антилюдського ІдС(«Н-ї) вторинного антитіла (Тйепто РівПпег бсієпійіс, Саїша-11013) для детекції клітин, зв'язаних антитілом. Клітини інкубували з анти-НА антитілом (Зідта, Саїж Н7411) як позитивний контроль, а нетрансфіковані СНО-КІ клітини використовували як негативний контроль. Клітини аналізували на Айипе МХТ цитометрі (ТНегто РізНег Зсіепійіс) і дані обробляли з використанням програми РіоуЛ)о. Для кожного мутанта МЕРІ! (середня інтенсивність флуоресценції) при зв'язуванні антитіла, що насичує, нормалізували до 100 95 РОС (відсоток від контролю), і МЕЇ для контролю з відсутністю зв'язування первинного антитіла нормалізували до 0 95 РОС. Дані потім використовували для одержання нелінійної сигмоїдальної кривої з 4 параметрами за допомогою програми для добірки кривої СстарпРаай Р'гїзт 7 з використанням наступної формули:
Уу-Нижня точкає(Верхня точка-нижня точка) /(1--10 (со ЕС) "кутовий коефіцієнт Хілла)),
У цьому аналізі НитІС1-ІДС1.АА зв'язувався з людським ТІСІТ дикого типу з ЕСво-1,28 нМ.
П'ять із п'ятнадцяти одноточкових аланінових ТІСІТ мутантів зв'язувалися з НитТІа1-Ідс1.АА з більш ніж 10-кратним зниженням афінності зв'язування. Людський ТІСІТ (5ЕО ІЮО МО: 3) з мутаціями МА9ЗА, 051А, НООА, М37А або ОЗ5А зв'язувався з НиТІас1-Ідс1.АА з активністю, що зменшується в наступному діапазоні ЕС5о-17,7 до 176 нМ, відповідно (Фіг. 27). Усе із цих залишків ко-локалізуються до однієї дискретної ділянки на передній р-листовій структурі ІМ позаклітинного домену ТІСІТ (Фіг. 28).
Приклад 20: Ех мімо Імунофенотипування Т-клітинних субпопуляцій із цільної крові відмінних від людини приматів, яким вводили НитТІСс1-І9Д21.АА
Фармакокінетичне дослідження здійснювали в Спагез Вімег І арогаюгієез (Вепо, ММ). Метою цього дослідження було дослідження ех мімо зразків цільної крові від мавп супотоїЇди5, яким вводили одну дозу 10 мг/кг анти- ПІСТ (НитІс1-Іда1.АА) антитіла для опосередкованої оцінки зайнятості рецепторів для ТІСІТ.
Трьом раніше не підданим експериментам самкам мавп супотоЇдиєх (267, 268 5 869) вводили разову внутрішньовенну дозу 10 мг/кг НитІс1-ІДС1.АА антитіла. Зразки цільної крові в натрій гепарині одержували протягом 24 годин після останнього збору зразків у точках часу, які відповідали наступним: переддозова, Дні 1, 2, 7, 14, 21 і 28 після введення дози. Для
Зо дослідження цільної крові методом проточної цитометрії флуоресцентно мічене антилюдське
ТІСІТ від ВіоїЇ еєдепа (клон МВ5А43) використовували для визначення рівнів експресії ТІДІТ на клітинних субпопуляціях лімфоцитів крові мавп супотоїідив, оскільки, як було показано, вони перехресно реагують із нелюдськими приматами (РіГо5 Раїпод. 2016 дап; 12 (1); ВіоЇ едепа).
Живі клітини одержували за допомогою ГАС5Саїйриг і аналізували з використанням програми
Ніомо.
Анти-ТІСІТ (МВ5А43) було здатне зв'язуватися як з СО4, так і з СОв- Т-клітинними субпопуляціями при забарвлюванні переддозових зразків цільної крові. Після введення дози анти-ТІСІТ (МВ5А43) було незручно виявляти експресію ТІСІТ на цих Т-клітинних субпопуляціях аж до Дня 14 або 21, залежно від різних досліджуваних мавп, при цьому рівні верталися до переддозових рівнів виявлення до Дня 21 або 28, залежно від різних досліджуваних тварин (Фіг. 298 8. 308). Причиною цієї нездатності виявляти експресію ТІСІТ не були істотні зміни частоти бра або СО8-- Т-клітин (Фіг. 29А 8. ЗОА, відповідно), із чого можна зробити висновок, що це було через зайнятість поверхні ТІСІТ оброблюваним антитілом (НитІС1-ІДС1.АА), а не через виснаження Т-клітинної субпопуляції.
Ці дані підтверджують, що анти-ТІСІТ антитіло НитІс1-ІДС1.АА є перехресно-реактивним у мавп супотої/див, і використання антилюдського ТІСІТ від ВіоЇ єдепа (клон МВ5А43) забезпечує оцінку зайнятості ТІСІТ рецептора.
Приклад 21: Підвищена МК-клітинно-опосередкована цитотоксичність, викликана НитІс1-
Іа1.АА і НитІс3-Іда1.АА на К562 клітинах-мішенях
Аналіз МК-клітинно-опосередкованої цитотоксичності, описаний у Прикладі 10, повторювали з використанням очищених МК клітин замість РВМСО5. Для одержання достатніх і підходящих очищених МК клітин для цих експериментів важливо здійснити скринінг на донорні РВМО5 з високою МК-клітинною частотою, достатньою експресією ТІСІї на поверхні і достатньою експресією СО226. Одержували І ейкоРак периферичної крові (що складаються із 10 мільярдів клітин або більше) і здійснювали виділення МК клітин з використанням Мійепуї аптомАсС5 Рго зЗерагайог відповідно до інструкцій виробника (Мінепуї Віоїес, саїаІюд й 130-092-657). Очищені МК клітини ресуспендували в середовищі, що містить інтерлейкін-2 (1-2) (200 одиниць/млі, в б- ямкових планшетах. б-ямкові планшети поміщали в 5 95 СО» інкубатор при 37 "С на 24 години перед здійсненням досліджень природньої цитотоксичності із клітинами, зібраними з ямок.
Лізис К562 клітин, опосередкований очищеними МК клітинами, вимірювали з і без анти-ТІСІТ антитіла (ТІС1Т). МК клітини культивували в ВРМІ 1640 середовищі (Іпийгтодеп) у присутності інтерлейкіна-2 (ІІ -2) (200 одиниць/мл) (Рергоїесі) протягом ночі при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі.
Наступного дня К562 клітини мітили СЕБЕ і спільно культивували 1:20 з МК клітинами (Мішень:МК; одна К562 клітина на двадцять МК клітин) протягом 4 годин при 37 "С в 5 95 СО» інкубаторі в присутності 10 мкг/мл Ритуксану або гуманізованих анти-ТІСІТ антитіл (НитІа1-
Ізс1.АА або НитІСЗ-Ід4с21.АА). Ритуксан використовували як негативний контроль, оскільки
К562 клітини не експресують СО20. Після інкубації клітини збирали і забарвлювали за допомогою 5 нМ бух Червоного (ТНептоРізНег) для розрізнення мертвих клітин-мішеней за допомогою (СЕБЕ-5уїох Червонийж). Відсотки К562 клітин-мішеней, лізованих МК-клітинами, визначали методом проточної цитометрії (ГРАСЗСаїїриг; Аналіз Ріом/уо).
Як показано на Фіг. 31, при використанні очищених МК клітин додавання анти-ТІСІТ антитіл підвищувало МК-клітинно-опосередковану природну цитотоксичність /КБ5б62 клітин, демонструючи, що анти-ТІСІТ антитіла (НитІС1-ІДС1.АА або НитІс3-Іа1.АА) мають здатність підвищувати рівень кілінгу клітин-мішеней (на 2895 або 1995, відповідно, у порівнянні з нормалізованими відсотками "Без Антитіла" або з Ритуксаном) субпопуляцією людських ефекторних клітин.
ПОСЛІДОВНОСТІ
ЗЕО ІО МО: 1: Амінокислотна послідовність зрілого людського ТІСІТ:
ММТатТЕТТОаМІЗАЕКСОСИаЗП ОСНІ БТ ТАОМТОММУЕОСОБВО АІСМАОІ СМУНІЗРО
ЕКОВМАРОРОаЇ СІ ТІ О51 ТММОТаЕМЕСІМНТУРОСТУТа ВІР ЕМ ЕЗ5МАЕНОСАВЕОІРИ С
АМААТІ УМІСТАМІМУМАЇ ТАКККАЇ ВІНБМЕСОЇ ВАКЗАСОЕЕМЗРЗАРБРРИЗСМОАЕААРА
СІ ССЕОВСЕОСАЕБЇ НОМЕММІ БУВ СМОЗЕЕТЕТОа
ЗЕО ІО МО: 2: Амінокислотна послідовність сигнального пептиду вище позаклітинної ділянки людського ТІСІТ: МЕОУМУЗУМІЕЕРІ І ЗатАБМІ 5
ЗЕО І МО: 3: Амінокислотна послідовність позаклітинної ділянки людського ТІСІТ (НТІСЦІТ):
ММТаТЕТТОаМІЗБАЕКСОСОаЗП ОСНІ БТ ТАОМТОММУЕОСОБОМ АІСМАОІ СУУНІЗРОЕКО ВУ
АРОРИЇ СІ ТІ О5І ТММОТОЕМЕСІМНТМРОраИтУТаВІР ЕМ ЕББМАЕНСОСАВЕОІРТОа
ЗЕО ІЮ МО: 4: Амінокислотна послідовність поліпептидного лінкера безпосередньо нижче
Ко) від НТІСІТ: ТО
ЗЕО ІО МО: 5: Амінокислотна послідовність людської у! Ес ділянки:
ЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І СОаРБЗМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕМТСУУМОМЗНЕОРЕУК
ЕМУУУрамЕУНМАКТКРАЕЄОММЗТУВУМЗМІ ТМ НОБУУЛІ МСКЕМКОСКМУ5ЗМКАЇ РАРІЕКТІЗК
АКОСОРВЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМУБІ ТС УКЕЕМРЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОС
ЗЕ УЗКІ ТМОКЗАУМООСМУЕЗСЗММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І РОК
ЗЕО ІЮ МО: 6: Амінокислотна послідовність позаклітинної ділянки людського СО155:
ОМУММОАРТОМУРОНБІ аОБМТІ РОМ ОМРММЕМТНУЗОЇ ТУАВНОЕЗаЗМАМЕНОТОСРБУ
ЗЕЗКАЇ ЕЕМААВІ САЕЇ АМАБІ АМЕСІ ВМЕСЕСЯММ ТС ЕМТЕРОСЗАЗМОМ/І ВМ АКРОМТАЕ
МОКМОЇ ТаЕРУРМАНСУВЗТОаСсСАРРАОСІТМУНЗОЇ аМРМТЗОМРОаРІ ЗИ ТУТ МІ МРЗБОМ рРаТкММТскМЕНЕЗЕЕКРОЇ СТУМІТУММРРЕМБІЗЕИМОММУУМІ ЧОМЕАТІ ТССАВЗМРЕРТИа УМ
МЗГТМОаРІ РРЕАМАОСАОП ТА РМОКРІМТ ПТ ІСММТМАЇ САВОАЕЇ ТМОМКЕВРРЗЕНЗОМ5А МА
ЗЕО ІО МО: 7: Амінокислотна послідовність позаклітинної ділянки людського СО155, злитої з
Ес ділянкою людського у! ланцюга (НСО155-Ес):
ОМУММОАРТОМУРОНБІ аОБМТІ РОМ ОМРММЕМТНУЗОЇ ТУАВНОЕЗаЗМАМЕНОТОСРБУ
ЗЕЗКАЇ ЕЕМААВІ САЕЇ АМАБІ АМЕСІ ВМЕСЕСЯММ ТС ЕМТЕРОСЗАЗМОМ/І ВМ АКРОМТАЕ
МОКМОЇ ТаЕРУРМАВСУЗТОаСАРРАОІГУНЗОЇ аамМРМТЗОМРОБІ БИ ТУТ МИ МРББОМ рРаТкММТскМЕНЕЗЕЕКРОЇ СТУМІТУММРРЕМБІЗЕИМОММУУМІ ЧОМЕАТІ ТССАВЗМРЕРТИа УМ
МЗГТМОаРІ РРЕАМАОСАОП ТА РМОКРІМТ ТП ІСМУМТМАЇ САВОАЕЇ ТМОМКЕВРРЗЕНЗОаМ5 А
МАТаССЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇГЇ СО РЗМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУМУМОУЗНЕОРЕМ
КЕМУМУрамЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУВАУУЗМІ ТМ НОУУІ МСКЕМКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІВ
КАКСОРАЕЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМ5І ТОЇ УКИЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О50 азЕР ЗКУ ОКЗАМОСС,ММУЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК
ЗЕО І МО: 8: Амінокислотна послідовність РІ АС пептиду (РАС): ОМКОСООК
ЗЕО ІЮ МО: 9: Амінокислотна послідовність сигналу зв'язування глікозилфосфатидилінозиту людського СО55 (РІ): РІКМКОЗОТтТЗОТТВИ ЗОанНТСЕТ Та ат УтмМма! т
ЗЕО ІО МО: 10: Амінокислотна послідовність ТІСІ УН: рмМмОоЇМЕЗССИЇ МОРОСЗАКІ ЗСААЗИаЕЄЕТЕЗМеИМНУУВОАРЕКИаИїЇ ЕМ/МАРІЗЗОББЗБІУМАОТМУ
КавеЕтІЗВОМРКМТІ ГГ ОМТ5І АЗЕОТАМУМСАВМА ОММАМО УМ СОИТ5УТУЗо
ЗЕО ІЮ МО: 11: Амінокислотна послідовність ТІШТ МН СОВІ1: МЕСМН бо ЗЕО ІЮ МО: 12: Амінокислотна послідовність ТІС1 МН СОР: РІББОБОБІУМАОТУКОИ
ЗЕО ІЮ МО: 13: Амінокислотна послідовність ТІСТ МН СОВЗ: МВ ОУМАМОУ
ЗЕО ІО МО: 14: Амінокислотна послідовність ТІСІ У:
РМОІТО5РБОУУЇ ААБРОЕТІТІМСВАБКОІВКУЇ АМ/МОЕКРОКТМКІ ІИБаЗТІ ОБаІРЗНЕЗа
БабБатТОг ТІ ТІЗ5І ЕРЕОБЕАМУУСООНМЕХМ РМ ТРОСИТКІ БІК
ЗЕО ІЮ МО: 15: Амінокислотна послідовність ТІС1 МІ СОВ1: ВАБК5ОІ5БКМІ А
ЗЕО ІЮ МО: 16: Амінокислотна послідовність ТІС1 МІ СОВ2: 5авті 05
ЗЕО ІЮ МО: 17: Амінокислотна послідовність ТІСІ МІ СОВ8З3: ООНМЕМРМ/Т
ЗЕО ІО МО: 18: Амінокислотна послідовність тІС2 УН:
ЕМО! ООБОРЕЇ МКРОАБУКІЗСКТЗахуТтЕтТЕУТМНУ УКОВНаТакм єУМмИТсімМме части МоКкеЕ
КОаВАТІ ТМОКО5ЗОТАУМЕЇ БІ Т50О5АМУУСАВРОМ УММАМО УМ СОПОСТТ ЗУ
ЗЕО ІЮ МО: 19: Амінокислотна послідовність ТІС2 МН СОН: ЕМТМН
ЗЕО ІЮ МО: 20: Амінокислотна послідовність ТІС2 МН СОН2г: СІМРММАааТ5УМОКЕКаИ
ЗЕО ІЮ МО:С21: Амінокислотна послідовність ТІС2 МН СОВЗ: РОМУММАМОУ
ЗЕО ІО МО: 22: Амінокислотна послідовність тІС2 У:
РІММТОЗНКЕМЗТОМарАММІТСКАБОСУЗТАМАМ УООКРООЗРКІ ІП ІМ5АБУВУТаМРОВЕТа
БабБатОЕТЕТІЗ5МОАЕОІЇ АМУНСООНМУІТРУТЕРССИТКІ БІК
ЗЕО ІЮ МО: 23: Амінокислотна послідовність ТІС2 МІ СОВІ1: КАБОСУ5БТАМА
ЗЕО ІЮ МО: 24: Амінокислотна послідовність ТІС2 МІ СОВ2: БАБУВУТ
ЗЕО ІЮ МО: 25: Амінокислотна послідовність ТІС2 МІ СОВЗ3: ОЮНМІТРМУТ
ЗЕО ІО МО: 26: Амінокислотна послідовність ТЗ УН:
ЕМОЇ МЕЗОСИОЇ МКРОСБІ КІ БСААБОГАЕБОМ ОМУЗУМВКОТРЕКА ЕМ МАМІ СУМ УМ РОТУ
КОаВЕТІЗБАОМАКМТІ МІ ОМ55І КЗЕОТАІУМСАВОПІ ВУМЕЮОМУСОС,СТ ТУ
ЗЕО ІЮ МО: 27: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МН СОВІ1: ОМОМ5
ЗЕО ІЮ МО: 28: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МН СОВ2: МІОСсСУМТУМРОТУКО
ЗЕО ІЮ МО: 29: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МН СОВЗ: ОП АММЕОУ
ЗЕО ІО МО: 30: Амінокислотна послідовність ТЗ У:
РІММ5БО5РБУБІ АУЄМОЕКУТМТСКО5ОБІИЇ У5ЗМОКМУ АМУМООКРООБРКІ УМ АВТВЕБОМ
РОВЕТОа5ОаБатоТІ ТІБЗБМКАЕОЇ АМУУСООУНОЗУРМТРИ,И,ИТКІ БІК
ЗЕО ІЮ МО: 31: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МІ СОВ1: КО5ОБ5І ЇЇ М55МОКММІ А
Зо ЗЕО ІЮ МО: 32: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МІ СОВ2: МАБТВЕ5
ЗЕО ІЮО МО: 33: Амінокислотна послідовність ТІСЗ МІ СОВЗ: ООСМНОМРМТ
ЗЕО ІЮО МО: 34: Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІС1 УН (Нитіс1 МН):
МО5ВІМІ МЕ МП КаМОСЕМОЇ МЕБОСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБСОЕТЕЗМЕОМНУУВОАРОКОЇ.
ЕММАРІЗБОа5ББІУУМАЮТУКОаВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСАВМНІ ОУМАМО ММ вОостТМУТУ55
ЗЕО ІО МО: 35: Амінокислотна послідовність зрілого НиТІС1 МН:
ЕМОЇ МЕЗО СИ! МОРОСБІ ВІ БХСААБаЄТЕЗМЕОМНУУВОАРИаКИЇ ЕММАРІВЗБИа5ОУ
МАОТУКОаВАЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСАВМАІ ОСММАМОМММ СХЮСТМУТУ55
ЗЕО І МО: 36: Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІС1Т МІ (НитІСт М):
МАРОМОМ СЛ УМО АОСОІЮОМТО5РБІБІ БАБМООВМТІТ СВАБК5БІБКМУІ АМУООКРОКАР
КГ иБавтОобБамРЗВЕЗававатовтІ ТІВ ОРЕОЕАТУУСООНМЕМРМУТРаСаИткмЕїКк
ЗЕО ІО МО: 37: Амінокислотна послідовність зрілого НиТІС1 МІ:
РІОМТО5РБОУБІ БАБМООЮОВМТІТ СНА5БКОІЗКМ АММООКРОКАРКІ ПУБОаБТІ ОБаМР
ЗНЕБабБаватовтІ ТІЗБІ ОРЕОЕАТУУСООНМЕМРМТРСааТтТкКМЕїК
ЗЕО ІЮ МО: 38: Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІС1 МН гена в РНиТтІСт.АА:
АСТАСТАССАССАТОаСАСТОСАСОаСТСААТСТОСТ ТТ ОСТТатосСТТАТТСТОаААдАСа сатоСсАаастТТаАдАдатасадастаатахаттассавасасстатасАа,асставАаваатосстТт (Є!
АВАСТоТоСТаТатаСАасСсСТСстТаСАТТСАСТТТСАИТААСТТ ТОСААТаСАСТОСИТТСОаАСАСцаИ
СстТоСсАСаСААд,асаастаАХатватсОаСАТТСАТТАаТАСТаССАСТАСТТССАТСТАСТАТОС
АПАСАСАИТОАдАапаССаАТТСАССАТСТССАПАСАСААТаССААСААСАасССтТатАССТаСАА
АТОААСАСТСТаАдапастаАаСАСАСТаССОаТаТАТТАСТИОТОаСААСААТОАСАСТОСАТТАСТ АТаСТтТАТОСАСТАСТОВЙСОСТСААССААССАТОСТСАССИаТСТоСТСАВатТААСТАТИСССТОСТА а7астт
ЗЕО ІО МО: 39: Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІСІ МІ. гена в рРНитІСс1.АА:
ВСстТАаСАССАССАТОАДОСТТССАСатТТсАсатставаастоСстсТастстТаСАТСТО
ОАдаСССАаТатТаАТАТССАСАТОАСССАСТСТОСАТСТТСТСТТТСТаСАТСТаТттТасСАСАТ 60 АПАаТСАСТАТТАСТТСАСОСОСААСТААСАаСАТТАИСАААТАТСТОВССТОСТАТСААСАСА
ААССтТапйсАААдасСТоСтТАдасСтТастТТАТСТАСТСОТаСааТтСсСАСТТТаСААТСтТаСАсСТТССАТС
ААСАТТСсАСсТасоАаатТасАТСТастАСАСаАТТТСАСТСТСАССАТСАС,аСтТАассСстТасАасСсСтТадА
САТТТТаСААССТАТТАСТаТтТсСААСАасСАТААТОААТАССССТОаСАССТТСЯСаВСаспАааСАССА
ААСТСО,САААТСААДАСаТтААаТАпААТССАААСААТТО
ЗЕО І МО: 40: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НитіІа1-
І4С1.АА, що кодується в рНитіс1.АА:
ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОСБІ ВІ БСААБаЄТЕЗМЕЯМНУУВОАРОКОИЇ ЕМ/МАРІЗБЗИИБЗІУМАОТМ
КОаВЕТІЗБАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВТАЕОТАМУУСАВМАІ ОУМАМО УМ СОСТМУТУ5БАЗБТКОаРУМЕ
РГАРББКОТЗОаСТАА асії МКОМЕРЕРУТУБМУ Мала Т5аМНТЕРАМІ О550І М5І 55 ТУР
ЗІ СТО МІСМУМНКРЗОМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕАДАСОРБОМГІЇ ЕРРКРКОТІ МІ5
ВТРЕМТСМУМОУ5НЕОРЕМКЕМУ УМВИМЕУМНМАКТКРАЕЄОММОТМАММБМІ ТМІ НОБУМІ МОКЕ
УКСКУ5БМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОМУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМ5І ТС УКОЕУРБОІАМЕМЕ
ЗМаОРЕММУКТТРРМІ ОБрОа5БЕРІ ЗК МОКВАУМОСОаММЕЗСОММНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І 5РОК
ЗЕО ІЮ МО: 41: Амінокислотна послідовність зрілого каппа легкого ланцюга НитІс1-І4а1.АА, що кодується в рНитІСтІАА:
РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТ СВАБКОІЗКМІ АММООКРОКАРКИ ІМ5ОаЗТІ ОБаМРУОВЕба
БаБатоОв ТІ тТІЗБІ ОРЕОБЕАТУУСООНМЕМРМ ТЕО ТКМЕІКАТМААРЗМУРІЕРРБОЕОЇІ Ка
ТАБМУМСІ І ММЕМРВЕАКМОМКМОМАЇ О5ОМЗОЕЗМТЕООБКОБТМУБІ 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКМУ
АСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМАСЕС
ЗЕО ІЮО МО: 42: Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІСЗ УН (НитісЗ МН):
ММРИї АГІРІ МІ ТІ КОММСЕМОЇ МЕЗО СИ МОРОСБІ ВІ БСААБИОБАЕ5ОМОМО5УУВОАРОКИІ.
ЕММАМІЗОИаСУМТУУРОТУКОаВЕТІЗВОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАУМУСАНКОШІ ВУМЕБУМ соатТтУТУ55
ЗЕО ІО МО: 43: Амінокислотна послідовність зрілого НИТІСЗ МН:
ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОСБІ ВІ БСААБСОБГАЕ5ОМОМ5УУВОА РОКИ ЕМУМАМІЗВВССММТУ
УРОТУКОаВЕТІЗВОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСАВОП І ВММЕЮМУУСсОоОСТТУТУ55
ЗЕО ІЮ МО: 44: Амінокислотна послідовність сконструйованого гуманізованого ТІСЗ МІ. (НитісЗ Му:
МОБОАдОМІ МО М УБатсарІОМТО5РБОБІ БАБМабАВмМТІТСКОБОБИ МО МОКММІ АМУМОС
КРОКАРК МУ АЗТВЕБИаМРОНЕЗабБаваТтОгЕТІ ТІЗ5І ОРЕОРЕАУУУСООМУНОЗУРУТЕРОСССИТ
КУЕІК
ЗЕО ІО МО: 45: Амінокислотна послідовність зрілого НиТІСЗ МІ:
РІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСК5ОБОБІ І М55МОКММІ АММООКРОКАРКІ ГПУ А5Т
ВЕБОМРОАЕЗИаБаБато ТІ ТІ ОРЕОБАМУУСООМНОУРМТЕСИааТКМЕЇїК
ЗЕО ІО МО: 46: Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІСЗ МН гена в РНиТІСЗ.АА:
АСТАСТАССАССАТаААСТТ ТаАСОСТСАСАТТОАТ ТТОСТТатосСТТАСТСТОаААдДОсС
СсатаААСсТатаАдла,атосАа,астсатаадатстасасавАасасєсєтатасаасставАд,ааатосст (Є)
АдсАСсСТоТоСсСТатТасСсаасстотааАттсастТтсАаТтОАСТАТОАСАТИаТСТЯДЙОССТтсасССАса стостааСААдсасастасаатаваТСасСАТАСАТТАСТаАТааССааТтТАТААСАССТАСТАТОС
АпАСАСТатаАддапйасСсСаАТТСАССАТСТОСАСАСАСААТаССААСаААСТОССТатТАССТасАА
АтТаААдсАХатстада,авастаАдааАСАСАасССаТтСстТАТТАСТаТаСААСАСАААТтсотТа,астасаст
АСТАСТТТОАСтТАСТОаСОаасССААДаССАССАСТаТтСАСАаТСТОСТСАСпаТаТтаАаТсСТТААААСА а7аст
ЗЕО ІО МО: 47: Нуклеотидна послідовність синтетичного НиТІСЗ МІ. гена в рРНиТтІСЗ.АА: асСстТАаСАССАССАТаСаАТТСАСАсСасССсСАсаТатстАтТастастастастотавиатто таОбААсстТатасааАСАТТСАСАТаАСАСАаТТсТоСАТтоСсТОССТатотТасстоАатТтасАСАС
АевасаТТАСТАТСАССТаСАДаИатоСАатТСАпАаТСТТСТатАТАаТАаСААТСААДААДСААСТАСТ
БО таасстТатТАСсСАаСАпйАААССАпаспААаасСТоСТАААСТастТаАТТТАСТапаСАТССАСТАС саААтотассатсостАдатсастстсАавасАаатавАТсТаваАСАСАТТТСАСТСТСАССАТС дасдатсТасСсАаСсСсТаААаАСТСасСАСТТТАТТАСТатСсАаСААТАТСАТАаСТАТСССТОаИА сстосасСсапАСасСАССААДасТаспАААТСАААСИаТААаТАСаААТССААДОСААТТо
ЗЕО І МО: 48: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НитІСс3-
І4С1.АА, що кодується в рНитІаЗ.АА:
ЕМОЇ МЕЗОСИОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБОБГАЕ5ОМОМЗУУВОА РОКИ ЕМУМАМІЗВОССММТУМРОТМ
КавВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСАВОШ ВУМЕОМУ ОСТ МТ У5БАЗТКаРОМЕ
РГАРББКОТЗОаСТАА асії МКОМЕРЕРУТУБМУ Мала Т5аМНТЕРАМІ О550І М5І 55 ТУР
ЗІ СТО МІСМУМНКРЗОМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕАДАСОРБОМГІЇ ЕРРКРКОТІ МІ5 60 ВТРЕМТСМУМОУ5НЕОРЕМКЕМУ УМВИМЕМНМАКТКРАЕЄОММОТМАММБМІ ТМІ НОБУМІ МОКЕ
УКСКУ5БМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКОИОРАЕРОМУТІ РРОНОЕБ! ТКМОМ5І ТСІ МКОЕМРБЗОІЇІАМЕМЕ
ЗМИаоРЕММУКТТРРМІО5БООа5БЕРІ ЗК ТКА ОСаММЕ5СОУМНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І ЗРО К
ЗЕО ІЮ МО: 49: Амінокислотна послідовність зрілого каппа легкого ланцюга НиТІс3-Іа1.АА, що кодується в рНитІаЗ.АА:
РІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСКОБОБІ І М5ЗМОКММ АММООКРОКАРКІ ПИМАВТНЕБИМ
РОВНЕБОаЗаБатТО ТІ ТІЗ5І ОРЕОБЕАУУУСООУНОЗУРМТРаСОИТКУєІКАТМААРБЗМЕІЕРРБО
ЕОЇ КИ ТАБУМСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАГ ОБаМБОЕЗУТЕООБКОБТУБІ 55ТІ ТІ КАПУ
ЕКНКУМАСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМВОЕС
ЗЕО ІО МО: 50: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з ОЗБА мутацією:
ММТИаИтІЕТТОаМІБАЕКИаСЗІ ОСНІ БТ ТАОМТАММУЕОСОБОЇ ГГ АІСМАОІ СУУНІЗБРБ
ЕКОВМАРОРОаГ СІ ТІ О5І ТММОТаєЕМЕСІМНТМРОСТУТаВІРІ ЕМ ЕЗБМАЕНОСАВЕОЇІРТО
ЗЕО ІО МО: 51: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з МЗ7А мутацією:
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСИЗІП ОСНІ БТ ТАОМТОМАМ/ЕОСОБОЇ І АІСМАОІ СМУНІЗРО
ЕКОВМАРОРОаГ СІ ТІ О5І ТММОТаєЕМЕСІМНТМРОСТУТаВІРІ ЕМ ЕЗБМАЕНОСАВЕОЇІРТО
ЗЕО ІО МО: 52: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з ОЗ9А мутацією:
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСИЗШ ОСНІ БЕЄТ ТАОМТОУМУАСОБОЇ І АІСМАОІ СМУНІЗРО
ЕКОВМАРОРОаГ СІ ТІ О5І ТММОТаєЕМЕСІМНТМРОСТУТаВІРІ ЕМ ЕЗБМАЕНОСАВЕОЇІРТО
ЗЕО ІО МО: 53: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з МА9А мутацією:
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСЗІ ОСНІ БЕЄТТАОМТОУМУМЕСОБОГ І АІСААОІ СМУНІБРО
ЕКОВМАРОРОаГ СІ ТІ О5І ТММОТаєЕМЕСІМНТМРОСТУТаВІРІ ЕМ ЕЗБМАЕНОСАВЕОЇІРТО
ЗЕО ІО МО: 54: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з ОБТА мутацією:
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСИЗІП ОСНІ БЕЄТТАОМТОУМУМЕСОБОГ І АІСМААІ СМУНІЗРО
ЕКОВМАРОРОЇ СІ ТІ О5І ТММОТаєЕМЕСІМНТУРОСТУТаИВІРІ ЕМ ЕЄББМАЕНОСАНЕОЇРТа
ЗЕО ІО МО: 55: Амінокислотні послідовності позаклітинної ділянки людського ТІСІТ з ЕВбА
Зо мутацією:
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСЗІ ОСНІ БЕЄТТАОМТОУММЕСОВБОГ І АІСМАОІ СУУНІБРО
ЕКОВМАРОРОаГ І ТІ О5І ТММОТаЕМАСІМНТМРОСТУТавВІРІ ЕМ ЕЗББМАЕНОСАВЕОІРТО
ЗЕО ІО МО: 56: Амінокислотна послідовність зрілого важкого ланцюга антилюдського РО-Ї 1 антитіла
ЕМОЇ МЕССІ МОРОСБІ ВІ БСААБИЕТЕБОБУМІНМУУВОАРОаКаИагЕММАМІВРУС,СИТУ
УАрБУКОВЕТІБАОЮТОКМТАМІ ОММ5І ВТАЕОТАМУУСАВАНМ РОСБЕОММ ОСТІ МТГМ5ААЗТКа
РОМЕРІГАРЗ5ЗКОТ5ОаСТААІ аСІ МКОМЕРЕРМТУБУ Мала Т5аМНТЕРАМІ О5511І М5І 55УМ
ТУМРБББЗІ атТОТМмІСМММНКРОМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ І СОРБОУМЕЇ ЕРРКРКОТ
ІГМІЗАТРЕМТСММУМОМЗ5НЕОРЕМКЕМУ У РОМЕМНМАКТКРАЕЄЕОХАБТУВММ5МІ ТМІ НОВУ.
МОКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМ5І ТС МКОЕМРБОЇІА
МЕЖЕБМСИООРЕММУКТТРРМІ О5БОРОаЗЕРБІ КІ ТКА ОСОСММЕЗСОУМНЕАЇІ НМНУТОКОБІ 5
ІРО
ЗЕО ІЮ МО: 57: Амінокислотна послідовність зрілого легкого ланцюга анти-людського РО-Ї 1 антитіла
РІОМТО5РБОУБІ БАБМОЮВМТІТ СКАБООМЗ5ТАМАМ УХООКРОКАРКИ ІМ5АБРЕЇ УБаМР
ЗАЕБабБаватТо вті ТІ ОРЕОБАТУМСООМІ ЕТРРТЕБОСТКМУМЕІКАТМААРБЗУРІЕР РООЕ
ОЇ Ка ТАБМУМСІ І ММЕМРВЕАКМОУУКМОМАГ О5ИМ5ОЕВМТЕОО5КОБТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАОМЕ
КНКУМУАСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМНИаЕС
ЗЕО ІЮ МО: 58: Амінокислотна послідовність сигнального, НА іад і лінкерного пептидів, злитих із зрілим людським ТІСІТ:
МАУС ГУМА ВОАРІ АБСМРУВУРОУМАСсССОЯСваОСОСаЗММТСОТІЕТТОМІЗАЕКОО5
ПГОСНІ БЕТТАОМТОММУЕОСОВОІ АІСМАОЇ ЯМУ НІБРОЕКОВМАРО РИ СІ ТТ О5І ТУМОТаИ
ЕМЕСІМНТУРОИатТУТОаВІР ЕМ ЕЗ5МАЕНОСАВЕОІРІ І ФСАМААТІ ММІСТАМІМММАЇ ТАККК
АЇ ВІНВБМЕСОЇ ВАКЗАСОЕЕМ БРОАРБРРИАБСМОАЕААРАСІ СОБОВСОЕОСАБЇІ НОМЕММІ МА
З'ЯМСОСЗЕЕТЕТОа
ЗЕО ІО МО: 59: Амінокислотна послідовність позаклітинної ділянки людського ТІСІТ, злитої з
Ес ділянкою у! ланцюга людського імуноглобуліну (ПТІСІТ-Ес):
ММТИаИтІЕТТОМІБАЕКИаСЗІ ОСНІ БЕЄТТАОМТОУММЕСОВБОГ І АІСМАОІ СУУНІБРО
ЕКОВМАРОРОаГ а ТІ О5І ТУМОТаєМЕСІМНТМРОСТУТО ВІРІ ЕМ ЕЗББМАЕНСОСАНЕОІРТОТ 60 СОСЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ССО РБОУМУЕГ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕМ
МУУрамЕУНМАКТКРАЕЄОУМОЗТУАМУМ5МІ ТМ НОБУМІ МОКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАК
СОРВЕРОММУТІ РРОВОЕЇТКМОМ5І ТС УКОЕМРБОІАМЕМ ЕБМЕОРЕММУКТТРРМІ ОБООБЕ
ЕГУ5КІ ТМОКЗ ВМ ОССО ММ Е5С5УМНЕАЇІ НМНУТОКОБІ 5І РОК
ЗЕО ІЮ МО: 60: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НитІс1-Ідса1.0:
ЕМО МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСААБОЄТЕЗМЕЯМНУУУВОАРОКИЇ ЕМУМАРІЗБОБЗОБІУ
УАОТУКОаВЕТІБАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСАВМНАІ ОМУАМОУМ СХКОСТМУТУ5БА5ТК
СРБМЕРІ АРОЗ5КОТ5ОаСТААІ СІ МКОМЕРЕРУТУБМУМ5ИалІ ТЗОМНТЕРАМІ О5501І 51 55
МТУРБББІ СССТОТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІЇ СОРБОМРІ ЕРРКРКО
ТІ МІБАТРЕМТСМУУМОУМЗ5НЕОРЕУКЕМУ УМВОМЕМНМАКТКРАЕЄОМОЗТУВАМУММІ ТМ НОСОМ
ГчаКЕУКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУТІ РРОВОЕТКМОМ5І ТС МУКОЕМРББІ
АМЕМЕЗМИООРЕММУКТТРРМІ О5БОСОЗЕРІ У5КІ ТМОК5АМОССММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКБІ.
І РОК
ЗЕО І МО: 61: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НитІс1-Ідса4. Р:
ЕМО МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСААБОЄТЕЗМЕЯМНУУУВОАРОКИЇ ЕМУМАРІЗБОБЗОБІУ
УАОТУКОВЕТІБАОМАКМБІ МІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСАВМАІ ОХМАМОУМ УЮСТММУТУ5
ЗАБТКОРОМЕРІ АРСБА5ЗТ5ЗЕБЗТААЇ СІ МУКОМЕРЕРУТУ5БМУМ5ОАІ ТЗаМНТЕРАМІ О55Ц1 МУ 5І 55 УРБББІ ОТКТУТОММОНКРОЬМТКМОКАМЕБКУСРРОРРОРАРЕРІ аОРБМГРІ ЕРРКР
КОТ МІЗАТРЕУТСУУМОУ5ОБЕОРЕМОЄМУ УМ СИМЕМНМАКТКРАЕЄОєМОТУВУММІ ТМ НО
РУ МаКЕМКСКМУМКИї РОБІЕКТІЗКАКИОРВЕРОММУТІ РРЗОБЕМТКМОМ5І ТСІ УКОЕУРБ
БІАМЕМЕБМООРЕММУКТТРРМІ ОБОО5ЕРІ ВІ ТМОКЗВУОБЯММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОК з'егввак
ЗЕО ІО МО: 62: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НиТІс3-Іда1.0:
ЕМО! МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСААБОБАГБОМОМОУУАОАРОКИЇ ЕУУМАМІБОВС СУМУ
УРОТУКОВЕТІБАОМАКМБІ МІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСАВОШІ ВМ ММУ ОСТ УББАБТК аРБМЕРІ АРОБКОТ5ЗОаСТААГ аСІ МКОМЕРЕРУТУБМ/М5ОАГТ5ОаМНТЕРАМІ 0551 51 55
МТУРБББІ СССТОТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІЇ СОРБОМРІ ЕРРКРКО
ТІ МІБАТРЕМТСМУУМОУМЗ5НЕОРЕУКЕМУ УМВОМЕМНМАКТКРАЕЄОМОЗТУВАМУММІ ТМ НОСОМ
ГМОаКЕУКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАВЕРОММУТІ РРОВОБ!І ТКМОМ5І ТСІ МКаЕМРБОЇ
АМЕМЕЗБМООРЕММУКТТРРМІ О5БОСОЗЕРІ У5КІ ТМОК5АМОССММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКБІ. зо 5І5БРОК
ЗЕО ІЮ МО: 63: Амінокислотна послідовність зрілого гамма важкого ланцюга НиТІс3-Ід(4. Р:
ЕМО! МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСААБОБАГБОМОМОУУАОАРОКИЇ ЕУУМАМІБОВС СУМУ
УРОТУКОВЕТІБАОМАКМБІ МІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСАВОЇ І ВУУгОМУМУСОСТТУТУ5БАЗТК
СРБМЕРІ АРСЗАЗТ5ЗЕБТААІ аСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗОАІ ТЗОУНТЕРАМІ 0551 51 55М 0 МТуРБЗББІ аТКТУТОММОНКРОЬМТКМОКАМЕБКУОСРРОРРОРАРЕРІ СОаРБМУРІ ЕРРКРКОТІ М
ІЗАТРЕУТСМУМОМ5БОБОРЕМОЄМУ УМОСМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМОТУВМУММІ ТМІ НОВУМІ МО
КЕУКСКУ5МКИаї РОБІЕКТІЗКАКООРАЕРОМУТІ РРЗОБЕМТКМОМБІ ТОЇ МКОЕМРБЗОІАМЕ
МЕБМСООРЕММУКТТРРМІ О5ОО5ЕРІ УВІ ТМОКЗВУМОБОММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКВБІ 51 5 ак
ЗЕО Ір МО: 64: Амінокислотна послідовність зрілого каппа легкого ланцюга НитІа1-І4с1.О і
НитІа1-Ідаа4,Р:
РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБКБІЗКУ АМУООКРОКАРКІ ППИБОаБТІ ОБОМР
АЕБаБавзатовТтІ ТІ ОРЕОЕАТУУСООНМЕУРМУТРОСИаТКУБІКАТМААРБМУРІЕРРЗОЄ
ОЇ Ка ТАБУМСІ І ММЕМРААЕАКМОМ/КМОМАГОБаМЗОЕЗМТЕООЗКОБТУБІ ТІ ТІ ЗКАОМЕ КНКУМАСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМАСЕС
ЗЕО Ір МО: 65: Амінокислотна послідовність зрілого каппа легкого ланцюга НиТІс3-І4с1.О і
НитІаЗ3-Ідаа4.Р:
РІОМТО5РББІ БАБМООЮВМТІТ СКОБ У5ЗМОКММІ АММООКРОКАРКІ ПММ АЗТАЕБИМ
РОВЕЗаБавБОТОВЕТІТІЗБІ ОРЕОБЕАМУУСООУНЗУРМТЕРСИИатТкКУєІКАТУМААРБЗМРІЕРРБО
ЕОЇ КБатАБММУСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАГОБамМЗОЕВМТЕООБКОБТУВІ 55ТІ ТІ КАСУ
ЕКНКУМУАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМАСЕС
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ДЖН БАЙОСАЙЄНСІЗ, ЛЛК
АБМУНО ТЕРАПЬЮТІКС ЛЛК
ТСО Дж. Юнь
ЦУРУСІТА Нася
ДУРАМАД Омар бо «120» АНТИТІЛА ДО ТІСІТ
-130» 50658-5040010 «140» Не призначено -1415 2017-03-03 -1505 62/304,045 -1515 2016-03-04 -1505 62/413,025 -1515 2016-10-26 -160» 65 «170» Раїепіп мегзіоп 3.5 «2105 1 «2115 223 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 1 меб Мет Тахо бі ТБ офіе зів ТВх о тТБІ бфу Аяв бів дес віч сім Був ї а 19 15 щіуУу ім беж їі. її Беца оЗзій Ку Нів ГБеб бек о йед ЖВХУ ТЕ ЛІД Оп зп Зк за чаї тних пів баз Аа Тжросіч бів бів дво обіп цем Без да ї1є бух двподіа йо іно ЗУ ТЕЮ Ні ті Зек Бо бех ББє Був Вр Ат Уві
Бо 55 Ко ув о гко пі ВЕЗ КУ бец о б1іу гео ТВр цем Сів бек Бев їх Уаї вва 5 ме іа во
Влв Те осіуУу біз ТУЮ Біб дує Їфіє ТУЮ Мія ТОК о ТУх БЕо Двройпуу ТВЕ 5 Зо ЗЕ
Теж ТнНж бі Аку бі бе їі; біб бУеі ей бій бек бах УЩІА Аля піц мо ІВ То
Ві 01Уу Віз ко Ве піз їі ко бер їли у йіа Меї діа дів тТвЕ зУешя чих ЗЕ
МА М еп Хо тТищії Хі зга ро тк и Кіш ну тк ху щі и Ку охує ТИ: ДК рон х І : І Ге Н її 7 ї ій ННЯ ги НКУ І си дке ких що З ї еДу 1 с ей Уві мах іш СУБ ТИЖ А УА Ав ові Ва де мія ше АЛ Ов поту щоку в я
НН ау НИ шо ож ки кад
Очна и нь в и о и чно А а о ЧИНИ зу Мамух томи М меж М их
МУ о МБУш ву МА вВац вит А паз шк УВУ АЙ У АЮ М пе АК ле пошті пи то
ДУ Але «хх А поля ско М юю ж си Ку ен мул сх кох Храм дж учи зу, їляпо бек і Ії 25 тя ля ню Те ба Ж ох Жккої бак ту Лурух розмов пе п м Кк М с а я бек ОККО ж Кс ЕХО АХ ВОК сх ру САМА
Бех яд усу
МТУ У Ко
Ек чу тт З Фо ка ютов я МО Вта жи З ух, Журі ху КМ у ВЛ
Кк нах нн с я КК М НАВ м в ка п НУ и В НН і п М А а М п В А КК дов - УК дум
ТЕХ МЕ НЯ
Уа лк А
Є. в жу КЛ хх Сак ик См му Н ЖД жу ж ж З пос «й ї т и и а 1 міт ія й ІТ голі дя сік бчж ху Щлуую Де хи роде шАТ ОКО бу Ше ЛІ УЮ йде заАш шшМ пІЗ а ААУ ІМЖ ММ Ум о шЕХ ог стеку пруж т
ДИ хом «ТМ пк ін уче щи та Тк оба тю дю СЮ Бач спимо їй 43 Кі ст
Ел УЮ КМ мах о мМ ху Ма ж ж ЕтТри БІ КК МО ХІТ Х хз Ку г пу ї тут
МИ «подо ши
Мідюм ста Ух пев ЩШифуУ З и лю Тнау Гм Мт сок Я у пт КІ ТОК Ж А сук
Матс сйпаУу ШЕ Бех ж ва Са КЕ Кп сем Бей сек бу жИиЖ діа пех ї ї ІЗ І: у х зх ях ї к хх їх х ща: я; м
Єва ода ие
А ММК ІК ув нм о НИ і Зенон Нв На ОВ НЕ Оле бик Ал УТО я Повх мет меш гам балу ЕП ла СІЮ зи Сп Бі вай Ор МЕЖ Аа сталі шЕ
З кЕ тт я ї м КО ЕЯи ба ат ї КУН ех м ЬШНИ вчи ах нич «М х 3 ме я г, Ук ча т. л ох і хотуїхм ще с і-ї щім б ней о тахі ще Ми СВК ж педа щі
ЗрУ щу ак тів Бі їі БІБ су Вів ім Бех ес оТнЕж ТБ Аа ців св тт ре
КУ т хг
Ву ко в шкал ре ж її ат ую ля р м Кох ща, Ха Га Ма Ж бю тих ча вх бів шві БепоОТух МОСКАЛЬ АЗАТЬ АК зва ММ НМ ОВО в ух ух ях я ц ж Б 5 х н полон ІМ же Уся й же ту ЗЕД Ж НА о Аж Ти соду ве Нар дал одіІЩ ВВО Мамо су ЖЖ ОНУа тів бе ос Щек се пух АВо Аа ді
ЗИ Кн Гн ен и нн но и Ан НН о НН НО а НН На а НВ В НН Хуг з ща кКжОо хау ЕК ХА Ку мим БІК КН СО дЬ см ким АТЬЮ У ЯМА «а то т во сс и шо ж руч Мф ШУ пики Не суд ТЕЖ 3 сих. СЮ ПЗ я Му щу ПЛ ПІТ Ж:
ДН Є бі пе скель сша дів обоє МьБОожВвО бук БЕ АЛ ТКУ ТИХ пох КТ Беж ее щі п
НУ у: ху шию у Жак щі: і Хр сті Ся хе тжуюо ХЕ тлю й,
ТУуж Тех іш хр дія пе реб ошіц я їі сій Зак Бак Ущі АКВОожАМ
МИ МАМ ОА т нам п чн ще лі од их Ус Мк ж Ск ж
Віт о дів ДЕ Ви пій Ті Бе ЖЕК оса
ТКУ его «2105 4 «21154 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 4 пунк ШО я» ду М ху
ТМ У у ку «2105 5 «2115 232 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 5 мох нен а и т и и в НН НН ОН Но ьо Же Шини ре Тр ХО
За БЕ Муй бек щу ВЗ» цу ТвЗх нів спе СУух схо о вЕО шу БЕ Ада
Х 5 1 15 пжіа ма мвмщ ше су бі Бк ше УЗ МоББВЇ Тв Бпео ВЕ БК ОМ у жде
ВН ТУ Ух ме Уч шк
Ходжаю Межі 1 Моя. МА ТИ Фах А ких ІМ, хх С чих ет дже УУЖруче лем 1-3 хх
МАМУ СКХКМО п МвЕе фі Мет Ам лі Ес ій Сб-і ТвЕ Су Уді Увй ї
А С в їі плющ ЗЕ: Ж 2 0 бе мих МА и Ж ЇВ Ві ма бал ГУ
МЕ ЗУ ж шіВЖ кВ ОМ ЯМ Кл б УВІ ме ап Же ї я У.
ЧНУ БУ щи куш ле, ГУЧНІ пек ую іга; се на на и НК Но НН ЕН НН ків Я г яю: - їду М о Мод дв пт ще ру МЕ Я І ІТ
ТОМ КК хна у ЖІ ММ Ма МОМ ЛУЮМІЮ АЛІ. ДЖ лі: УЖ МК КК УВА довд ОО хх ше Б ем" сутх т КО Не БЯНН тако дер Шах Маю стае дви тал За Шев У ба ту щ среді Ніщо УМ
КА. МЖК ФА г АЖ А АОС ЖКА МК КАТЯ МЖК. АМЛл ОО МАММ Олю. СЯДУХТІЮ ХА СУКА ої Фр їз и Б М х й « с кл г ших К - пк є ті ак Є ї ке
Ха беж су М у Іа тяг ух Ми жук гу Тебе ЗД дуї сл щу тех ж
ЯМІ: лом АУІАІ сЯла І Му пух А УК м ЖЖ МОЖ АХ ому жлвМ ста ФМ мус т
З; пог тлвпа
Али Ам ОМю оо У. прот тм о С; х уки МУКУ вжи тросу мере т, ке Лу Ук
Уго ют. І ли МУ; то ЛІТ ТСТИ ТГК Тіз Щоки Ж о НА нн За
БЕ Кл я иК ЯКУ Б УК я КІМ дещо хи ме міц ЛхЖІМ БОЮ КАТОД
КЕ поту т ц
Ех ВІ М пошу хви Туле Же хжА Ох зу ши СК их тк пуд Хшк м М дю яр Ж дні Ви ру жах обме М хжКА Її ппдкує СВБ ти их ку їм бот Ще 3 тд с
Кк ек и м аа м ОК М З ЗК Я п она КО СО шк их шо ММ МАЛА МКМ АТАК хх ня под
НИ Ах НИ хх МУК АХ поз :х Що ля КЕ -ї ра я Я М зуе ся ях ооиж І Кози М з кі чн А тих Шу лящ Її ж Тло З ху На ї У їх ке ная т.к РОН хх Аг Шу жи ту ЕАДЕЖЬ ХАТІ Ж. ок АХ ТО С я ОКА що ЛА Ла СУ Б 4 У ЖЕ ол, той ТОК ве пк я ЖК о: М пу Ух з хи вт уми хм их х ЧУ Си їх с зх по уеек кл кв о нин ИН до лоді рії сї5ідр ЗУ ДАМ СХ ла им гір де АМТ Не
ТЕО АДЖЕ лю оЖшло лаХІ ОБОМф лм ХК УЮ СУК у МК СУ хи УВА ЖУІМ дм Ку дея утрй як
НЕ НКУ НН рр лим сумую дати флмую (ІА тую бе Му шт пак б ЛА ШУМ дО фом Птах мух АХА Ки и а з М З и а з м м о В п ЕК с УЖЕ ОКА МА У ву
М В ц Зобугю де МЕТІ АО пк т хіт У туї и ЛЬ вн - оте ту ау м ке Коен тт ТА ща Без л Таз біжу ям С докух як лику Дю Кт щі: щів іс дав о шШдл їв веж мУуд пе опх Ул МАТ СБК ех КУ Хо ЗЕ сп осо ДЗ о ящА КТЕ яв ххх стук, п НН УК
А кг «КК реко тут Фа дл ло жа ХА г У че кі А Мощі МУ р я. чу
Фкрко дику ах шило мм 5 гр щі а ТУ удо м Ми ще гонок Баш тот
ЛЕК КОЖ су т КИМ МІЖ ХО МОХ БУК Ми КОЮ ХУ ДМ ОЕМ Ку Х КК ЯН ле НЯ ші дО шу ям «х во у ГУ т вч
Меаеує Тації фу Тл): Ух зате ГО хв Тс зак о Кем оЗзакК мем ЗЕ Кшш жах мух тісуц пухких хі ЕХ КО Км х Ж : Уж ч хх. Беж о У ет тм. их шк гечщНи ан оо хо ями. Мода
Му щі щі Ка піт дід г БУ щі сУущ и Ж хх Зако Тихим Їх бющк пав очі У УпЕ сАБО ВАВ БО УДК бе жу КО їв У ск м су МЕ х - пожх «їх ї п ТО ху х 12 но КУ нн с АНЯ ож ск яко Ж оцо У «ті статую у лишок Фо дк ее Ж п знане паю що бик Хе ла що Же х бути Ме о 23: гу З т ші Мп бер бро ем жк зву Кт уж ЖЖ ти ЕК їх ОМ СЮ ГО их ок У жи «и ще
4 м 1: Я и м ч виш етан чши Ту МОм ок ТЛ хх ше ж Б ще Я Йо, чо м по
Модок Б. МБщк алі тем Ло Ук МІ АК Мч ІК ПІІ хо Прі Ж Ех
ЇМО УА сш Ха Ж МАМО ОМ КЛ ТК КГ Ж ж щшаАМм М маш ше В
ТК й ОБ,
ТП БА Ех
БАЧ ен ази не на Но І НА З не ни НН и А ШК руш хі: Ти Льиж Кг тлі ПЕ То р Ма фбриниие беж ХЕ Ля Міху Пиво Ам
ФАО УшА ЕТ мл ій ЗМ цем ЩА Ж БЕК с СХ УК ЖЕ гм сш ШЕ щи ми Ех
ЦЕ ТАТІ ше х м ех ж що са хол т Ж их ожини СУ ЬХ гас КУ В Ач р че Ми паші 13 що де КАТ що Мо ЩОКИ томі цріли Доім лі тихі: ке ж І хх о НЕК ква КЕ а А а Я а М Я М У о у З В ПИ о КЕ В М У З ТА С А ЕМ лак ЕК ще зулх ох тт
Тк ли ме; ГУ т жо дя Му. лою Ж ек ень на Ше и хе ки сум сум их
ПЕ не нн аа КУ іш тм ФА що: ОО 15 тах Вл АК т ТЕ
Кл КЕ ВІ Юта САУ шин КІ УА Ся ММ МІ а У ЛЗ ОС ВК Оу у ххх реж мо М А
ЕМ гуни мают м чн пах ЖТрях лак у е їі щує т по тод пу ЮК щі про ви лим Іл ТАРА дує Дом тм Ми хі у У ТД х б Сету цу
Аж КІ ОХ їх шах с КМ У КО СЮ МЕДУ ОККО АЛЬ Карен МАК АБИ
ЕНН т тай
АММА я ОО ще чи НЯ що ло нн НН піци Ку кі шущсрох х ки ше поля Ал т Дідо т зу щу Мою м дог ре ко не ку НН НК НВ
ЖЖ ЖЕ маш М ЖАВ МІ ЖК А ЖУІХ Оу пока БМ У СА М очах САТ мо ох чок
ЕК Мт РУК 4 МИ нг пет НУ тот -, ке оз ай ду ож 2ошй. т дя
БаМуг мах гугл їжи к Зі пер Вау що йо их СЕН з нн ник ан КН НИ вна и з м а с в м а и В кп ж з о в п и і з м С п м м м п п НЕ М п о В А КУ чочк сук чом
ОА них 1
БО І а ода щ дя док ж чо АЙ А сухохі її кі - ох ки и и чн ди ау мами Мі КК в Ко А о Жди похуу тії Бу АХ ТЛ рхМ МЕМ О ти ух
ЖУп АКИ ККУ ЖАКА ТАХ -ОЖоМ ЖИВОЮ Ж ОА я МКМОКО КМУ ХОМ тиц пт ци зЗщи
МОХ КП чем МІН. уро М за а ЕХ у КІ уки 1 ШМК од: фо шко и НЕ с я Не ВН
Ту т Ток ТУ тт с КН У У С ШІ ТА Ах На Же піну хи деї Наче яЛеЛА МАМО ФАЧІЛ. УпЦОРІ мяМА. ЖИ Уплоле су лАМИДО Даті САМ здо у МА ж АС АСМІЛ. ОМЯКО АЛ ху НН 1
МУ ОК КОМІ
Мал біввіч ит Я А у Ше Ми Мем хі кт оту тіл ти дю ли вн ее о и З З А С ск з с хи п М а м о о ВИ в В ПИ Кв г Кк у М МО жи Ж ЖИМ ми ши КІ мил М ОК -ї их - досжж ман 1їх4 то ме ч Уход Укл жоут ше. СК т код УУаих
То ОО пихи у Я Ми її ОО МІ іх 17 и і ти. ей ТК ля хи мМ дм А.О М М ТЛОМ ААУ ой шт А МА ТА АРМ КООК М АХ АЮ ЖІ МИМО Ю
ІЕЕ пит г пр шт ММ ТИЙ
СЕ духу Ж дух. миня др от зх хе Ху туша ка ОшАЛОЗ СТЖАВ ФАО дя їх У В й їв тиша сви Ле йхтає суб тиж уми а А Женя У шк ДК ри хм Ж ВМІА КДКА МіІхА и М Кк МИ Я ХА У МЖК АХ ХК А А КОЖ У. В ЯКО Ж т ЖК пк Ех лах т ух кА «шли. дн тя Жим Мб птн Су а КІЛ у ді СИХ ЩО зу жде тошутх ТМ мо ту Дод
ФУДЛІК МІМІКИ шум Мп М шу ме ЖИ ВА: ОМЖ М Є пок ЖК ВК сум ЯМІ кут стю у тю жд ий «М сь я ку о, чно пушок Трах т нь нн и в НН НН я
Зі Аксеа Ши Ха от СТРУ дк тк по р ши С юу Жди СМ 7 М яМАХА БЖ ВК ВО жо А м пл КМ ЖЕО: КІ де бло Ме 7 ПК ГЕ ух
ЖУТЕС ее; рана а Мих, вач Ху Ж лития, їхня р КАЛ в на АННИ КО НО НН НН тод ТТ ою
На 5 Це Бо тону Це шк Мо ше х і м Кі мих тю ННЯ ЕІ ПЕ з Не р кл а я а м а В В я ДЦ В п ЖК п ПК М м и ВН СК Ж В З ЗИ Ко НМ В А У сект ся д ут
ОН МАО ще хо Фея пд Фоми жест уко ух од УМяА ще лм т ших ож у : нь нь поро бек ЛЕ Жаююро Жозе Фуени Ж обх Жюи Мр сюу т оія ТБ їЗхуєт СХ дн 12 гом дя
ЕК Б Є МН ВМ ІЗ АУБ МОДА МАК НЯ Й МЕГА. МКК жлГбОшММІА жа МК прю уж з рт я БЕЗ шк т пох тою КД УК хо будемо З Мі м. пох прі, ор и ми 1 Ж одя Аж о НА З НН ДНК ект а НН А і не з ие а вн кр НН Нв НН КН АННИ ет ех м і А м по и ВК ОО ВА Ко а В КМ В кВ В ОК В М А ВХ М А ОВО р ЗНА
МКК ЗІ гу ей ко и КК они кА Я ж зо Но НК АК НК З НА я тк о божт фу У їх ес м ши о км а нм во п Ж В а и в с М по м М М в о п о я о ще стю ЧИ р дл ря
СЕМ Ах А
У нов нн а нн НН НН и нн НА и на ев НК в и НН НН НА их їх хр ЕІ жу Я МІВ Кри гуру щі ше Тур Мі т п Фу оре ен не нн я З НН о КН М НН НН С КО НК В М НЕ А В НЕ ОК В З НАС В М ВЧ СИ ЕС
Її З о М их 2одяціх хання хі Е их щ му мо ре Ук зо Уха Ки УЖ СИЧ вл.
Мекку що нки Аж ша жк Ух тіше уч СБАЧНЬІ Шик Мою Вл лає щі Мк ре я ап САМА АКТАХ ХОМА пе ЖИВОМУ МО АЖ АВМ УА. АК ЛОМУ ХААЛЬМІ МАМИ ОО СУК ІК ОО ж пЖ тату т оч
ЕН хі Ах їли у хм о НИ Бош Три Яку щи Можу дош ТОК 1. ож но нн НК
ТОМА ЯК мритЬ БІК СК ях Хр мех Хе У КК КО хв ХХ МЕ лох с Ба
МИ хх У а ен по не о АН Ша Как НН НН АН о А А НО НА НАУ
ЩІ щі Кпе мов Ст їМпх вай са У КО маК мух важ ощ шК УЖ КІ пт п шоу щої ге КІ
З ПІВ У ше ЛІ з. Ех с 15-89 ран В. жи Ж. че ані , ях я то : тою. о они учи щ - типі буть Біне щі ді щі що тр бом: ЩІ М рі Та окт Аж Ор Жах
МИХ ХМ ДЖ МиБЕ тло тА МК КИМ СА У Кк М да КМдД ЛьКІх ХДУ ЗМ їх ск чу й. в от ІК Гая НМ
Х пе КІ во
НЯ пксмодю дк зе меж кине На нь КУ жошух Ла хи тра Моно баки годі дя КО мч: Я ТОК: Ху тд бо ЖуклУ І охо ре тих 1 лк мя ОМ БК ЕН ХА ОМ ХВ МАМО хи: МАХ АЖМИ шк А М ВВР БК КК Оу тра Сет тек куЯщ щра Ін тоявії Дім. ЗЕД фе трюки ар: ЕМВ пори фриз у сдржкню. Ж му но тосхтх ема ТМ УщЕ Сл оп СК бл: ху ЗЕ КЕ ФеВЖ УВО ФМ Б ЩЕ вО тая з ла
АК Ки КН жом и тота: М Ст км им ММ т тр: щої хі да жу сто хи
До; хек теп: що КУ мкг пл щи и іш гл СА АА ї її ТИ хи що ПАНИ
ЯКЕ шар А СКМ «КА ву КК сег Ва Ол К щі с УА БХУТ шуй щі с тя зх ;х лк ушу Кк км ШК: ХР тран ди ЮТх Фокса їх Ж бі ую Ти ую шеф дю жу
МАЛА ЮТЬ САУ мим шЖхИ А МК МНК О Аа У КІ и Ма. сю ІМ с му гу ї Х Ку - уж доти там
КА НИ І
Фокус жи Ж шк вн ку Мі сс лю. Хобчу Ж ку КАЛ хо Жааххє Хрних ру кКал мМ АОІ А ЛАХ ВА у БЕХ ОК БК ІЙ КОНЯ Ж ху м АЙ ти кг піц лях
М ле МОЛ МОМ
- Ул - п АН А НН АН ши м яки о МКАС тн шунт посух Прах Мам ДО т ТК Мати ЕЛ хе ХУмЕ: 7 уд блю Я пью хід пе хх ПЕх ж
ВЗЛОп ех АЛЬ МВА ЖК АХ Мода лаштУМ ААУ КМ Ко май аг УВІ ГЛ уки чех -чк те їх Ж - с кх Ок ЧО рощя ЗНИК Ше п оче НН АН У: з ст ха Тоші) Пт гі боюм Жди: ж. ба Хв Р М зашил ЩІ о Ток ду щі мк полу Он ІН а КМ а си В а я З и о В З М ЕВ В о М З В о ЗЕ Я » КЗ з К Сн ї
ЯН за ли
Али МО АСЕМ пі. їх т п Ну -к ех Ку повин - їх сеї ст ож МО
Чркрюв ос бучико Ж ха що Я у дю 133 Ек БУ Оз ст ен уУ ТР бок щу Ок гне м у о мух Ук А АЮ салом ЖК КА СМ ки ЖЖ ЖИ АСК де дж КЛІ М яогує сх ту,
КОТ, ВЧ ТК
КОМ У «я сови ни и нн НН ЕНН и я Нв и нь и НА о НН о ь Нен НН ННЕ чаш І и Ко І 0 УК КЕ ККУ Кк ЕМ В Лв У УК лав НЯ ЯН як БУ ме бах Можу Же бе Ск тт 0201 ЕХ м ре ТМ КО о ри Ток ве бр боту
Буш ДАЙ СПХАВАХЮ А КОЖ БА ЗМ М ЗАСТ МУДАКИ ЛИМАН А ДІДУ МАМА АЛІ криє ях ект Б яті ХМ БАН ияк ло су пух й до Уч КАЖ, Уха. СИМ ж кю пу ек пу о сво уд Ма ржіх тпрожже з жу ие Уч Ех з о сияр Мод с ж буд ою ее Му х . КО мриох Мову шт Кф. жит ТИХ НД, АХ Тк пжх М г труси Мкхї вин ни ек и з а хо и З а о М а м п а з п М В М В м В М Ж п о М В З ИН Й ЗК сх яра ги ху ДЕ ОКУ як й ше шуй ж Фо х ни НИ т я, щ- во х яко и я НН ж ж КУ Й мк бр кт бла ХК М ж се Дід я щі що У І МО Ку Кт Ти: Там То; шк ш ЕК ЦЕ ЄКОо Ко ще яма УЖ БУВ м У ла АТ МО Б ДАЄ пев ТАКУ МКИУ
А ХАЙ «ко
Момоиж дно ХЕ мимо З дз чі Му ам ТИВ щує тп Тл сіру пд еще рях
Ка І Кк СИХ г Є пов НУ Яни Б.І Ех хіх ЩІ що спе
Як Жах Уж хат АЖ ОКО СаШККЕ ЯМІ ЗМО ЛЕК Хм КОАЛЕ СЮ ЛЬ ЛМЗІМ ЖК АТАК ж НХ зх се
УЖНУ хе рми пок ЗО т л ж рУшя т ск! Сол аку п В ох тку м. ЕК ль дж х - Уоя ет ів іш іо Аа ду т з ошщіз їж Тв ді строма Баш
МЕМ ОогувВ ям У не ке и м В М КЕ М МИ М о п п В п і В КЗ М КЕ НК сі "сх, ТУ ла ШЕ ТЕЗ Ух лют Жоднои. Тех Фк Ту їй 1-х кое що ої Мис кох ТУ щ с ОО ж су пОМНШеЯ я г
Фсрілх о фе усу Мшк 251 р Живу «іх МЕ рих тщпйб7 ой хід Крім І щи І ща ЕЕ Ей НІК с Б севкК сх Ше Се Агов ва ЗЛ САУ су зт тут ту улутч
ШІ КА ІБ; А ще -- у -к з ше ож « ще удо ж не Кк кода чн АН пода Лаз фам, бар о ще бо шк їз м мод пеню бле що ер Мих тк ве: че на ЗУ а А и в в МО М о АХА ЖЕК УЮ І У ЮК КЕ ох ЖЖ. ЖК ст прик «сх
Вед ЛО «ТО ьше ух --е ч ж нь ни НН ке кою жах Ж ту ги тами Х с
То ух 1 3 М дур ТІ ВІТ дУ сут М де ХР ул ХХ ТА ж Шеюу Шу ою ко З ВН З и у М Я КН М Ки ЗІ ННЯ МА калу Х и НВ М С МО З М В М ВУ их АХ ЩО сг КІ КІ
Усе т я Поогя о ха ще в тати в Ху их ФМ ук рен х. НО мас с ен У це мае ох
Му ох, дез рр То и тріо Жак усе СИРУ Ле ух юю У іх ях гії
МАЙ му ЯМУ МКК дин ж долі с МК СХ К КК С ж ЮТЬ КОМ У ие шт ча
ТР. ІНК Кжинй
Би: Я У дж кої : УАЗ се Іо ехо що ги чи РЕ ук й не . у - й ее м гро шк Я що їі; дошк Ялуу тІ3 45 355 їх З що дощ см срлву
ЖАЄ ххйІн ЯМ О ж А ОК ЇХЛ Олю ло ЛХ АД АЛОКІЮ МК МУ МІ ЯМІ МмоОотУх прттух пек уки ши ОКУ АТ нео нн нн і Ше НН А НК С ЕНН «воля пол « ши Не гаку не М а п,
У. оду та ту с ті ен ку ях їх ща опт Мю кв а о а АН из оз залі и На Я У З З Ва о З ВО М я З В З В ке ХЕ АОКХ ВК АЮ ле ц БАЧ АНЯ Ж «ЖУТХ КМ «МО ОМ ан и и нн вн нн На о НН КО Я мм уж хау п 1 ух ТОМ
АТО КМ ж МЕЖ ХК М У ші ВШ І І мк У КК ах й ОО
ЧУ Ам А полю ошух Мтнку Фощаї МЖоутжу Шут жу Со УТ ал бухти Жотачує сук Ж МК чує моху: Ток мин: МИМО ЖЕК мимо жі ша у Буд А УЮ ДУ ОКУ ду хви ХМК ЗМ Ух
КА МО ож
ПЕ и ря ни УМ УХ
Ото Жах У Ох ті ль ие Хо ТІ хо слачни о и НО а Жодні Ж ду их м от Тлщла факту ДІ: Шкту бліх тт ТТ хжщу ту їй Ечци ко 1 АБ дотхкйо г и ТІ В ен ЕС о М а а ж з м в нн км з п в м В м п і п п о в и ЕК и в В ас п ШО
З ш ЛЕ чл
У Мох ек пул о НЕ ен У чле код їхня тку (х м. чия их Ж Код
Убанся Люжи КБ5ї Ме їх хи тк о Моркії іет. ру Мр фею долю. ШЛОМЯз о Кості пк кп и За п п а ко С ж М З Б ВЕ В А С С зм Ки а В м В В т в с п ЕК М НМ НА ВВ и как
СОЮ ща пожот
ІМ Алла ом
Ума тки т хжую р щ ом нн и Но ок АН че ХУ Пози Ж ка. КА Мчюичи 0 ТУ
У хи ки УНК Оу КІ хе. Киї ПМ птлеж и Є ХТД ки ЕВ хи ЛИХ Ти ем, ха му ОТ АБ А мМ ши ХК ШОВ М мах мж у ший ую Ко
ОО Бе ва МО
Бе що; їх Я ско йо і. щі лящ ля се ІТ ик ди Лк к т о Ше Ух докт ДАМ сІВЖ вки Моя ВОЗ УА Я А МОКЕ АК АЛА СЛАМТО ФАО ба Мо ХА ЖК АТАЛІ АК БУВ ах аз й ой хх бан леми М бує и ких тих ую Тоємляо соя лу Люк КОТ аю ІРНХ шт мя
АХ і МАХ ОО ЕО тр ші ся АВ Я ВІЛЕКІ хшАО У ХЕ А паж ЖК ОТ що Б БЕ
Те х ще Жогер, дис роги п Тор кт. Поля Що У Код ЖЖ рити сь ТЕ ж нан То шо хз я Же ких іти КІ а. ТМ т яму Ту МАСІ лю Кч зе Ка Ух щі Я
МК З Ж дово ЖК мВ Ж КЕ лом сш ДМЕ уза хз АВЮ СА МО МК ше М шолт пот г
ПОГОЦх Ер У бзухахо бл їМекого Здіюко Зі Мі Ма м сл: М. жені Мо ж вк Мі мо іву ру с(птУє кІМж ЕК мВ УК Ж УншА лАшЖ ЗАМОК МУ БА АТ УКАМ БУК КПК АВ мон й йпохл «од лю ТУ І:
Те пек Бай Мо сто щшШЕує дику яю БК
ХУ жи Ід ХА 0 ДУМА МК АХ дих БУХ
ЗА зи; под у тк Чех Ко дхах Моди Модем Локк
МИ КУ ДМ ЛУ ОБУ я ТУ АЖ ЗУ ОМ
М Бо х СУ я гу хх Ся
Я Ем
Фут Кв Жолутю й уд ФМ дек й ру іш пу Жежю А жк Мем МУюрш о и Ж оду Ток пт яви СУ бі йей о шіУ ЖЕ ОТ» вх бі жфнжх тп Аа фі бі ше ї З ЯН як
М т. Кая ох т М що м їх ПИ Мої суху; ППУ ІТ хо Мод: Ба й хх Муз хх но чому т АМС Ух в: ТАКА Х ДОКТ 14 Х жи МО ЗАЛИ ЗА 0 КУ Кл ААУ А ЗАЕХ си й Б
У и фИВМ Бехм Ух щук
Бк: «2105» 10 «2115119 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 10
М А ех ке Жошни хи, АН Уж их х роя Ух т той хе гоже па АХ ж; шт дя йди ма ць КИ щі ша НК У ше Ж бли у ЕХ жк. їй ХО Ж м Як
З 5 та т
НК ме яко ми. ла аею ХЕ Тс р ни НИ Ми и щук КЛ ях БУ ТИЖ ТУ Сейму. Ух ек а ЗУ Ам ОУЖК УуВ МАЕ ДЕА ОХЕЖК ба ЦЕ ТІК Кб УКХ ВМТ Юм
В ВЕ З
У троюю хи» ФМ М ух їй Ту С т Фу. шани Хякж Лю ох у даже Сич
У Маг па ТЕ із оухр МЕРЕ АТ дів пБЕО ФА Буш ХДУ їду Те Мді зх 1 З 1 т Ук т. а пл я. « Ск ие нм « Ся во ж ую сту ххх гео КУШ реве нькя я іже ие Вів дес Бех бі бек ЗБЕ бек бе Тек тТУК дів АвротвЕ Уві й 5 щИ
Кк ех З Кин осв о шо дви у пу м их ТУ я нн СПК дж СЛ, їхали філ ВЕ БО Те оїде дек Ах АвробаЄб Бхе бум і Тв лає БИ 5 Зп я щи 23 1 15 щи ин ав но ни КН и и НН о НН НИК хо нн и ше З и На НА мала мі ще ххх ши Мем УК ЖК см т Я пЕ Аа Ва УК гуК УМ ще вот пе 5 й пу ух о т
Мід Ха Мет Аха їжи Даю Тех ТУЮ діа Мей дж БУЄ ЖкО пе Фі олу
МО 105 То тТвх дес УВО Тис бвщі Зех бее т ц
НК
«-2105 11 «2115 5 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 11
Мод ЧУ ТІЛІ: ЖИ ку ЖЖ о
АВК ОТО с У ЖЕО ЖК і Зх «-2105 12
«212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 12
Ве тів обаю Док пбфу Зоек бю йек ТіК БУК Тую Алв дар тТпх УВА Бук «210513 «2115 10 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 13 меї Джо їні дз Тек Ту дія Меб дар о Тух
Ї Е Ще «210» 14 «2115107 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 14 аа Уві Бі Тіє ТвуУу Щів пек жо беж Тую бен діа Віз аж ВЕБ обу піч Жак фіж ТВ бів ав оСую Аку Лів ек буж Бех бів Бех був Тую
Й ЕК БИ тип діщо спа кме аКЕ АН впоФуа Туж Шк бро тод тре ши БТещо Таз туп Тіз
С 10 45
Тух ек спіуУ Шеж Тих Її) Зі о йеє зі їі ко беж Ам рве Бек опію зо ВЕ а йшжЖ ту пек Сі Тл дво Бір тв Тем отак їі дек бею ївбобіб Бк
ПР ов бие вів Ме тег бок пу 1 Бі Ні дДазвоЗро ТУЮ Вк тер де й Зб
Ку щ 5 х На Ка Ошанк 4 щі У АХ Іх М х й АХ, ЗД. У пІ «210515 «211511 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«020» «223» Синтетична конструкція «4005» 15 «210516 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «4005» 16 «-2105 17 «-21159 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична конструкція «400» 17 ї 5 «210518 «2115119 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 18 пів Уві бі без одій сій Щек обі жо піц Бем УЮ у вх БІУ САТ А
Чех Чі бує іє 5вЕоСуй пух Тв дер ошіЄє ТеЕ ТтВх о БнХ ТтТвж а Тк ж Ех 3 теж ме Ні Тхв о Уаі Буш піп Беж Мів піУ Буз дагоБев біз Тер оїїв пі щу 115 дв Бго Вай вай БУ піу ЖБх беж тує Аа ОЗ був ВЕ му Біт Ма Ав лмЖ бер» їй ві йзрофГує Вес Зек беву ТВ Абе оюх
Сл ти 5 ци
Май біл їжа бота Ше іні ТИХ Бех дя дяю Зах лів Чаї ТУЮ ТУХ СУВ
Мія вка хо сіУу ТЕБ ТУЮ Хай тег під Меб дев ТУЮ ТЕ Об ХВ ОоЄуу
І ій І І їх 13
А АХ и ча» ма ро М СИЧ ЕН Ск ООН Фр с щику
РК Оу МАК. Ех Х Ка ТЕМНА НК ВМ КУНКИ «2105» 19 «2115 5 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 19
Ока тую ТЕ Мої нів «210» 20 «211517 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 20 пі їі Аді бо дав о дни Біт бі Тих Беш бує дай осів був РМе Був
Н КЕ 1 ЕК «2105» 21 «2115 10 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція
4005» 21 хо бу ТЕО ТУуЄ Ав ТК ліфа Мех АвроїтУю «2105» 22 «2115107 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 22
Мох Кі дю ХМ Мішеко б Бюу (і М Мо пох ЖЕ МАЄ Щек СТВ Є Ж ххх ему и на з и ЗХ В а В п а п М я п і м М з В М В ВИ ВУ Ек ож Ху то 25 зо
ЗА ши ах
Тек хек дія Бек ої Ах бе Тв сі ві ККо АВ Акт вМе твх бі зак осіу Зк ЗУ ТБ оАзю Рие Тл Бе ТВЕ тів Зек Зеб Увь Біб Ага біз вд бан діз баї Жук Нів Св са Ів Ні тТУК бів ТБ бЕЗз ТІВ
ЇНЕ Впе ЦІ1Уу бі Шу ТАК був їжа СБ тів оьув по М «210» 23 «211511 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 23 пт пі бах біз пі Уві ве ТВк йіа Уві) Вів «210» 24 «21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 24 дек Ат дек теж ДЕ о ТУК ТЕБЕ «2105 25 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 25 ів бів НЕз о ТУє лі ТБЕ БвО тео тТБЕ «-2105» 26 «2115 119 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 26
Сів чаї бів Бе шві байодек пре сОіУу ст цем Уа бух Вко біє шіу сеж лей вуж дев ЗеКосСУЗ Мія Аів Бек обу пе бів Бе о баж Аве бек в вже по двроМеє йек о Тїю Уві Вже бів ТНЕ Бр сіб Пух Ака о Бемз біб Тсю Уду ді теж ші ех дже У пі ЖУК дяк ТБХ СЕ Тух Бко вжю ТВ Уві в В Б пу о плу Аа Бе ТЬк о фїічб Бех ЛюбФ Лео; о йжо дів БУ ав обах Бе Тух
Ба в То Ви їммх бал ме йеЕ Жвж Бо бух ББЖ сім йероїне Віз Яйе Ту Тук суВ її Зо зх ка во ам Вів їв Ба оАва Тух ТУЮ Вб бер тую ТОВ Бу С бі 10 МГУ 115
ТтТвВЕ тн без о тТнЕ УЗі Бек оїекх «2105 27 «-21155 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 27 в гУух Во Ме пев «2105» 28 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 28 тТук Кі пек Аж сСьу Бут Тук ДВО ТБЕ ТУЮ ТУє Бо АВрвОсю УЖЕ бух «2105» 29 «2115 10 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 29 пік тТіє Беб Бебз йо ТК ТеЕ Бе даЗ жех ї й 16 -2105» 30 «2115113 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 30 пшю їзе Уві Меб Бек бів бер вхо Бах беж рве Аа ча пек Уві зу по оцЕв о Увайї Тожх Мет ВЕ бю ра деїх дак сів Шех ел Беб тек ше хх Ав осів бм5 дес тує ББи Ліз Тов ТУЮ БІБ Обі буд схо ЗКУ ПІ
Звт реє Був їв ївр Ті Тек Трр» дія дек о ТнЕ дека фін; бек пі Уа ко дае вха БНО ТВЕОслу бек со Бек об ЖВЕ АвворБе Тв обжм тТву
Сх та В що їїз дек йек Чаї Бу Та піз вар ово вів Уві Бех Тек Су пів БІВ
Туш Нів Зех Тук Бгро їх ТЕ БЕ бі щіу піу СБ БУ бе біб тів -2105 31 «211517 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 31 «2105 32 «21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005 32 -2105» 33 «21159 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 33 піп осбів Тк ів щеюв їУю Б Тк отае - З «2105» 34 «2115 138 «212» Білок «213» Ното зарієп5
Коо) «400» 34 аа ЧАК чи Ан моди СК кн ИН ШИЯ пи чн чл кож з вшу
Та. раз мою уч тим шу ба ЗЕ шт ою: 3725 ТТ ТЕЗ ко Ех
МІ МІшКМ О КО ЖУМО АМАХ фАТХУ: А УК КЛІЩ АЛ А МЕККА ДЛЯ ОМСУ КО Ул лу з ї я че ї Не І НУ
РІД Я іі ча Мен м Яку, ня НИ НИ до МАТ ні
Яцпье пі м ев прим од по їм би прра сх ко їі мо бурфіхк бла юю їм ц Не: жи Ук ШВАМИ кА АВМ аю ОО шу КМ юю мМ ОУН ою сюду Ух зи
М ФІ яки дит юю и до ди : осо кою - ти ик й я мимо дя рус фену у ме Лак фл Томмі ож ж Коші Має лях жю Тр Тл лід МТ хх ни кан лику
КОАМН МАСОЮ МИМО ОХЖМТА. ОЛВШТА БЗЛОМЮ Мих ОХКШУК хе Ж ХМ Аля. ЛМАЖА КуХІ и у чи КО КО
ЕЕ ЩЕ о о ни я нн о нан Не ж о НА ОН На НН НН НААН
Ми о АМмЕМ г хе МА їлку т ї я ТУ х Фо тки БЕХ те т хк Ж вух си ХХ АОС Ул ю М ш МО УЮ АМС дА Ж їв МАВ ЖАН ше шо як Мем ух АКТ ко р шо ше -«х хк- ох Ух я анит с яки т ки сх У сти -х Кох ання тиху ти у Ме хх яжу кшщемо М ліску км іх з ю лихах и Му мим ож сек МКУ ОпІДХх ОДУМе МІ я МІД Ск х МІХОВ МО БК ХО ЯМАКВ. шк ТЕ З ср ту КгУ 1 щі хо І БІ Гео; фл прю кА Та щі его кам ву їла Маму ЖЩату бек щи Кі то шт ую дал УА АЖ У у ЯКО МАМ АРАХ АЗК МІЖ АІМІ ЖМИКМ ОЖЖЕМРХ судо мок хо ЖЖх А че с Пре
ТУ М т он нн и нн НН Но НН Ноя прю ок Ту ДО т Хаус іиє В оси слІЖ шо бр їі Зік щЕ: ДЕ пре лупи дуут Іі щ гЗіз1; дак ТУ МІД бої ск див и БВ Боком А Бек їн Аа Ав спи дв ЩІ Ммід щу зн хор, зах
ЕС ой М греч ух ит юн, ОК я, Тл М - руш ше - То ги м. Гея ОО Мити. МУ ж, рик Ка
Уу бо їі М, Тс Мих и Я тв ха у ху ОЛІЮ дн: Том жу блкж гу
УЖ о хУХ уд ву АЖ В АЖ ше вОр ЕК БУЄ РА ВКМ ХЕ УК О М - З - 2 З 1 Х КУ Е З їх ях те док лок и НЕКОя
КК ке ка:
Кухта хи Ию щидою ХК ли чл слух мк У В У НН НД ть РУ тля ень ші ам Сід У
МК лм: МАУ ЕМО Мч Іа МІК Услщоо яжМХ ЛУ
Зо ктх ять
БО АНЯ
Ка ол ня ті ля їв там ЛАБ лізу Же ст дк ря ФІ ту З и у Шемд оБуфаюж фл ек нн и не п м нн вк м в п п п по ж м п п п пп п а в, м з нн п в в в Ж п М М
І ді чі ТОК
КУ го Ку ож яд, ще ВШ Можу Ж С пи шу я ки м, ех тв ТЗ з Тк У Ле. - РУ т ху тд ОДИК; Тип КІВ тр Кг що шк Ялі БЕФЛУМ МЕ жи Кри
ЗЕ Ми ЯК ХишщО стОизж Су між душ лик ьо ібн тре мік шко АЖ МТ
НИ ТЕЖ ії «М ШО ЗА
АЛ ти Вир О ра Кох п Аме ОТ у ЛЮ ких 15 очну І 55 Тахії Зір ву. ЗЕ шАОЖ МТ ОК МО ЖІ сйМисмМ МАЮ ОЛкАЛИ ОАОЛОМУ їм шумом мм ша ЮК ЖАХ ту хг до
Ах пі Ох лою ох жу Мох Мід І тю Мих дю оту хх бл Мк к о стю МО др До. В-
МАЄ МІТМИ ЛА ФМ КК СМ Ж. ЖАХ АК ЖУМ ХО АТО ОЖ КК ТИХ ТУЮ ХІХА хх
ВІ у ГО
У гуд оч жі мя ду тож оч и ША вче зодоюмю кр чн чи чн т. гіфи т в еки (Вч МУ лютих х ша ЩІ Мід Ку Ж сла х ЗІ хх пив су щЕЩ Еш їблХ АЖ ех мус БЮ ВПО Мід ОБУ АЗИ СЕ мо У пул при п я -ої : з - жо х з ж - -кк хо ХК ж Пр ет
Томії 2 ач о ЗмЕУМО бум Лющю. Лов бує ДО що тя Доу ик КОХ КДННН вуж Пише тт
МИША ЗО АТЬ МЖК ОВОЖТК са св ва Я ша АЕС ЗК А НА КК КТК М цк за в
ПО хх Мови Маші Пожежу дощ Ск лики жо ДЮ лм щу хи пу Ех ТІ жи г хх шк ЕК МОМ АСТМІ КУ АХ І КАК МОЖА ЖУК КІ бух ху Кошик Ау МК Ку док пог я
ННЯ» пу 11
УМ ке Ам покою даю У жи паю ух пт М ГОЛА рать Жди я Ж
Мак ех ще ах а. ме Зах
Мах Кн ря КН Во НВ їх хх с ни АН НЕ о НН ки НИ КБ о нак о ОН ОН пи а а в с м а В В В М ЕЛ о В В ок Кз КВ С В М В о В и п В В В М о ЕЕ ВХ ч х яогу Ек 4 п ня АХ яхт ук мо дет му хм Кк як Маші тк ох їх т п їх т Ко глек ХУ у дж До КЕ в. тд Пк їі тю Юіх и ШІ шк Мі шу Мох кож МН зе че у кн Ко м жов СТ М НО З М Й п о А п М о В ДЕ Ко А м ЗЕ С М п М о А М о не «т ш пуд мії хо 3; тт КУ Ен я тля Моя УМА ко Ух сеї х я ух - мч пе : ко. кл пк У що їх т що щКатих ог хх току и Не щу НЯ шви мли жах ща ААУ МБ ОАЄ Жщ хх ЮК АТАК юю ВАК ВІЙ ОКО Ук кт -к кох яке ії І жа ою пю нач То А я ре ке НА Не НН ЗАВ ЧИН Ток їх же
Чан ЗЕ МЛ УЖЕ Ж дАД А ОСІ жо чМКХК ЛЕТ СО ХУ КАМ АКУЛ ККААЯА ОК БО ціх ши Ох
М Ей У
Ж сов то Ж що пишу ду МІ у да ду Мом Мода Ух див ШАХ КЯЩОВ і дю ки дев ши Аж Еш ше шо ВЕ МО мемйа спо осв Се ж МЕ ах рецая МН ту щу Оу ой м Мох меж
Хе Ма Мих Ж хек хи аа ІМ паю ун КВ КО мар СИМВОЛ о дя пе а и м вк в о В М ж В п З, в М ІМ М п п в М М о КЕ М В В а в
МД пі са,
Мо ТА Х пути Ж КЛ ж ми льш т ач - Хк В М. . Ук ии тт я. Шк ких т. пок їде ода могут и чу ШШкух 1 в Зіа Мід Є Мо их пев о бтеш гі жу жщо їду Му оо ен Ки и КО НА я М о В З но ПЕ МВ Я ЗМ С В С Во ПК у З А ОН КК МО ШК а "гу пк ла що АЛ а еч яке. г У ел чт ванн кН НН зн я жі ТУ м С имя
ТЛ, тт Їж М ж рух пизжх т Б ШО Ов їх щі Тех і-ї їли ки на и НІМ З ОМ ЖК шАМР ОЗ КАМ ОО ЖАКА АЖ ХМ ММА. ЩА лю док ги ріжки
ОК сш ІМ М
НЕ НБН Ше:
«212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «4005» 37 дю Кі бій Мес Так січ Бек Бо бек йех опвм о 5ех Хі 5еЕ УЗі бі
З НЯ от пох х Й вк Я
КК Ложки жу хг - ех ву реа Ач Що ж м ер ЧУ рек; я СЛ Ки З озих Тіт
Хв ох УМ ТБ в жнЕ су АКО дів щек БУ ЗК ОБ ЕК Був тех свіх У ц лих
ГУ ГУ ЩА і Аля бю бек Б бів бує Боб пе Пух Драже Вуз ба їв Бл її ЩО Б:
Сас Можу. ЯМ ша ом ж МК у Хоча У. Фени КВ я ОН Тк тн У не Фк т хх
Х Ек ше оса Ох ІЛ Пам діб бас Бі Зв бЕкоО Зех АЖЯ сб бек озіх
З а ве пе бі пак одіж ТИЖ дев о БВЕ ОТвЕ пев тих їі Зах бак ін оФфув Ка
В та 5 во пл Ке и и ее Туя Лу Чл пу мАШНКХ пак 1 поши Ж зЯ пю дм ух кум,
Зі йаю о бве Дія ЇВ оОгтеУк ТеЕЖ пуд шій піз нів ба о пін о тУХ БІО ТКВ пп. пк пе 5 БЕ М ху ЕТ ЯН ен о яхти Ж ок нн Аня НН НВ ЕМ ж вИа ія АКА МО ШК АТХ А д ее УА АТ АВ МОЮ пух тЕц хи МАТ -2105» 38 «2115 448 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 38 жи адченІв сни поннУЄТ пев пиЧек ие о спла посла зицеає ОЙ про у чі Я в иа уж км Я па рих иа же и фо их жи жи учи хол цпрспацдцітке вадеопиаоєк допризовної сг мрмиви пеачедцеацес МиМНКитох 15о піпаззовек спіпеллаасє осока лвЕсо ВІ боса виспигтавзаї пери 15. «часа соаФфіппаа етичні чоло пи чем ши МІК сх и і НН НН ікон ож у им дити ит еф т дожив сук о па авопржтитасх папасасвих чада штсахоВиУ сСовшсасей Коса я адап асс посваатзай заспелошав: звисвозоасв село повтор ЗО пиши снацас ІЧ Єлени Своспчшочє зазнала пиши с
ІалІсзЗзоаслив свакалмснои сел зав 2105» 39 «2115 416 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«ди Му іди пи кут фі из жу и шк рми жи В живими Сир их нет ик уми им ие шу
Ол люеколи т ТАЖ ТУТта Ку М СИХ ІІ Хлор ДИ ЕКО пЛКІКОКВ С КНИХ Хна Мт Кия т муж сири ии тт, нн с и а я мезо нео не и о не НКИ Ялта
Фени пса шаленлв рабів бант ахим спе Епос и
Є Е пом вив ка и А а пе п и ен п и п и нн кефіру У и МО те УК щі КЗ
ФАК НИМІМИ СЛМЛЮСТМ ТІ рин А ЗІКА КТ СЕ АЛ ХУ Костюм А ет твезлі ІІ и тки МІВ ІВ Мои ж ІЗ доли ТУ им що М ків їм ж ж жириж Фу да КМ ит децюТокХ, "7 ух смасеваи вно ооо Іони шосту шасуерекилеу ска лю хо песто уж с жир потр щи биті дви тити фуд ут дог цї
МАТКИ о шІ КТІ МОЛЕКО І МТА шия ЩО ММК УМ САТ ЕКО ам жах дужими ті ив м ЖЖ Юним ти у Мещріч и вугри піхов Миті су тут Здії
ФЛ Мав ШшУулІФЛ Ву ШИ ди ХО МІ ШИ М ЕМАагАтТИ щИдолІВ МВС Уожю СОУ І ШИ ПОКИ КІ вжи в в и ню пу дату сою ЦЕ м сет Юди пу в т бФувю м их яз. «ІНлиу аура прорив шь са лев дме лолифмещиа у понти ША ЗШ ту Ху тех тем ди ож нн но я о а НАШ НИ хх АТ ую кое но с ЖК тА АД А іа МО НО М ст АСУ Ж МІК МА АТ ХО ЗАМ САМ з хх і не ї Ш Ми М
Шкожеюо о Ходожі А усу Сроухія Джил М'уту СОЯ у Ж о жиє АТ я Жувду ЛИ ух ЖЖ пеежує Зфахуу с Кри
ЕОМ Ю Кроки с СВ іще Б. бу. ЖЕ САТЬМ ОКР а КОТА ОКУ
ШежН щу г ве хашич хи ПН А Ь почи мі САЛО Іхчи Бей я й Жонте оче гію Мт іх Хшево Мало Ло Зщ дк ФІ т то Шжмтг іх ої скдо пі Та ЇХ: жу щі
ВА ЖІ АВ ХУ сами ЖОщМ ЖК ЛЯ Вк довля балу яд МАУ ОА Мо ше АЮ У роя до Нео
В У а що У пи хо оч пеих У но М р ВЕ чННЯ ОН кошики М у ло,
Хі шкІУх бю ие ШІ Ще бак Штюу С С до м Дод бю СУК пі р НЕ НА АК М З В В М В М З В В з м М п я о п с В М НВ ше ки За в ПюЦ КУ таж ДУ ТУ хх та ДУ сф Стоп ік Дон йду ум до гля До ув Тоні ях
ЖІ ЗОАТУ ВедІр о кце фРК сю ЗХ КБ ЯМІ МУ УМХ шу ке М а ВЕ КА о, м 2 І ЗХ:
КУ г ме; Ж пн ее о. в злом, их з з г ня Ол т Пон ту - ро щ яю їх їч - тя ку им. лок Ми шо ду Глас Ду Ті ха же ТКУ Щі щі пу сек ух
ПА Се СВ М ВИН СОННИК ее она ее у За М С ПК их З СЕ Ж п ЧК В З В В а ж зи в
ОО ро де в. їх ко Ж кох "ох Ач Тіт м Ох щи Кошти РИХ уче ож СХ ж пл тк пі о йего Мао да т Із хико Сх Ук іа Мало доні бук бу. гріх т ах а и КЗ що мВ ча а УЖ УАЗ ВБИВ Р ХУ ЖЖ ож аку м сзау ях -км я пи Щи ще
ГКУ М Бу не че нич ск 2 сх млі ехо. зах У одежа с ке ких т и КО ато в На и о в НН НІ У нич я Не У а що пвх пом ща КИ Тож ме оз Е аа Кох пк КМ Уа Я МИ ТА ходою ЛОБА хх КН та
Ел Кк Мі
Жюля ех: лож три бу б тлі жк тую уюу ТУРА іх лу в. І п ллаКІх
Кс Бе ев Кок се Є См УК КЕ СУМ о Ку БЕ У ВІК лУДТУ ТК М хо хик проек, яд ке Моб нау нин ном Ан ж мою т яд и я «жо хх «хи те
Фріз, ху Ломері ЗАМ ОО ри; В хи бЛіМих фУуюкту Тут лроШкАа ді бек а ЕМ ЛИ жу що ж СУДУ ШІ щу меш т й ІУЖО ШО ЖК шк М МТ
Ах я шт ху ККУ
Ах НБК ЕК щі
Мч У Кох ре кими мн нн и АН І НН А ни нн Ан НО НОЙ с «хво
Мк Мод ТІ я ЛоОтоцу тищат Ку пе 2тіх; КУ ДНК НН УЗ й ЩО що ил і ЕІ
ВшиИи 5 У ка А дп КК сш М За МО ЮК ХК гм мою МА пд яУргу чсжк аж: КАМ ІЗ пан Хе щи о я фт : й т сен ФУ шо -; Фе усли ск пр 2-3 ху т -. киш 1 Сн ча
Тут смапю хім ж бі: пак и томі о Мі ЗЕ щі б тк ві такту ВЕ ше Бу лю КО ВК ла АТ БИВСЯ ти її КО Ж ж МО ЛК МІ еВ Ош лопух я од реа
КЕ Да РОМА
АТ МТКОЙ КУ
Фея У шо их ою ТМ пон ТИ как -ох жу ск дО 151 т с ту
Хо КМ Тв ТУ хг пе щі пк КЕ іже ДК що ее НИ ЧВЯКОч тиха у
САМ МАУ А ОБАМИ КО чн а нн м м в М и а и М М в З МЕ о пох тур чут
Не САН т
Ал шарм АЛІ ра - оди ср ч Ки в х ї Я ін оч чх мая Жак. С Ти, Ж т ж шах Даштр Км. Зоххех ЛУК ет буси тА ТЕ ГУТІ том Туш Бу ко їбн их ца ик
За га ОКХ МУ ЗІ мо ошш МмУБ УЩа ЗАМ ОЖЕО цу шшК Су ВЕ пу ї Х Не - ТУ З х мм в, пу й туту «А Саня оку пд и хв ач т тю их. , Я хч МУШУ у па У ж як, Яхти жд.
Кук о МВоаспюолик:ю жу Фк Шк жу тку дідо Шет іп щі Міщук: іш ми ожипр ом КЕ КЕ СУМ Ко ма Ж БА ба віщо жу кА КО кет хуль суд Ве п Упр пи пі йіхтхЇ «ХМ хе «ТЬ - дили зх я ті г зу У їх ох - ; ях -щ зиск чолом дух
Пе ббррі ЮК ах о їди Бери бу лд9лет Тусщо о йжтю В А щуУю ЛИ сим МЕН ор: Ж
ОХ ЖЕ То до ЕКО МЕТ ЄМО КБУ Є УЗ ЗЕи М Зиму МЕ А АК ОХ сих ті бепої
МК ау ямою сх сок тку п о Ь ШК: пуд ж 0 жк ух - шо п хо ще ях х
Хоми вк о дачу (15 щі піч баки КЕ Ху ії сх ХЕ Фк 3 хо ТІ 43 хх се МИША РОЮ ШО МА ЛК У Ух Уа м НИ Уа ЕХ ТВ У АЖ спи ту вче суки
НЯ у, ТЕ яеХИ У ек г
Ж ск ми БІ юю вич гУї х в роов ем в жи рУшАЄ к ому пл ГК з. БТ: М що шк Різ Ода бо БР щу бок бихе щі т АХ до І бар Комо маш ТІ зима ще Ж ГМИи Ам ОП А ми. М І ем жа ХК УМ ВАДА ДАТУ ту Б іх дя ЛЕ дек то ЖІ тт оси т ща ше з. -. шу г АН ее зи ч пз їх сх ке, хм -х Ся
Тл ох зом г ей де Жруєю Лужиту ЖАР д КМ Ж ку хи слух Ск ю Пен чт мах хр
Кл АСУ КОРІ: Й ШО КИ В хни пІ-юК 4 АС ММЮМІХ. ТК ААУ А ЖАКА ОКЯ в і ЗК ху м ке с У . Б; ху буті плюк потік
КА во ТМ «ТК клея в дж тт ши у КУ зму ХА я їх Беж Я ее Ним х ті Ж ку Ух їлрі у пе ла. Кри ЗИ ОЇ ТМ; Фіат яші кв Аж ут паз ша я тд м мВ ІК МІ ШІ ЛК м СТ ТОДІ КАТЮ ЛИ КМ ТМ АК УМ ХК ва сек мож те Ж чек шрх шиА КЗ РІ
ЗАКО А Кох «КИ
МАННЯ 2 - пох чу - вух шо шо жо гу ах. хи ч іш тихе Кбда те к ЛІ тоди Лу уї йди 20122 тла уу. СК лю мух іш пу г
МЛМ гум МАМ ХУ лІ МА ЕМО АЮ АК МУМ хай СлЯА ДАО СУ ОК дО КА ДО куту че пурезаї ту ц ІС ау хі ХАХМ ХВ яко тощо Фк ток хіт вени и НЯ чн тя я ве ху - й т іде Кам у бло У що 7 ди г ту ШКтЗ Люк як Ех ЧЕН УК О кух ох мо як ЗК НЕ ВИ о З НМ и м на п в Ян ЗМ М м Я м со п З М БИК ОТ Я МІСЬКЕ АХ сит лику ЧЕ ва лежу КМ чи ще - коти ж - « ТАННЯ з пе ЧЕ НК - п
Тим й же Тажує Ще Мокоет о бошу ії; о Хр вм тохк 2 шу С Ав Ж там НК мим хюш КшОо зе МЕС КАМ ЗАМ ОМшЮ ПЖХ о сЗУуш в сеї Улье шжЖ БЦ скл в З тд
ЙОД Ж и Мя ку яко п Кк реч Кк пл РУДИ п жо чех чо ек ке 2 тел ї їх тіл м тишу ххх ТМ ІХ хе сити ЕІ сУтІ ТЕХ ик СО НН пази З хи Ж ІМ ЗА лу хтА у ум А мА нн а кп о М МЕ в ах МО АХ МмоА ту пут сютю р. е іх що КО КК: пог ОКО М
Ями Жодне Тл я лк нях оту Мак ск ох Мох же Ждних Кен ЖК осві во Минл МАУ САТ Кок ле ща аж А Ух да ЕЕ АПК о жде кис а Бех зи ц аа р Я гїх
ОХ ВЕН хх ТВ:
ЗМ ЗМУ ЗНО лам шк ує бом их кед мо Тих Ме Ж ну Ми є Жду Томат у 4 Машу тих ошжку ЩІ долар ща и МК То бю Ем Ту Тим Пр Ящик стих
Ен а м п о о пк м п о в нн ік м М КК М п в Ко п В В КЕ В М М іх ух
Дт АЕН ВН тич ве вн пою ХМ чия п хо яку як я Фа ХК тух п Ухик о КУ чт Хассе До аку оду Мом Пух ух й Ме ким Хр ті МуУх бум бик зу ЗУ Мох лою 71 ху ше АКТ СО сват НАУ АК ОМ КУ КЕ суще о мм ВмеК РІ пох «т дою ях Б дозІх ках Б лю
Ж. ладі МО шо ща Щі шо б кю ту бю ХЕ ща Ма тазі Йде ки ТУ хо лів ви пі ВМО НК Ж СЮХКК сах кшую Ж шк о ж юс хау поз дод Аа рих ї БУ БУ я тик он и саке М ще и у. але Фен я у Фо м: ве о Хо КУ кт що По. г Кн ЯН х 2 х Тож ТЛО ЖуУ пл ЕХ У Нажкя реа Ка туту Боже Ку ул МОХ Тк КУ нни тлу ра;
АЖ КЕ І мМ тла б КОН МІ ШНМ Ве ши ж ЖАН ЗХ мода СУШУ ї К, ях Я
НЯ ш М М х їх жи їх ух І их пт Щі. жк ток ТУ - тки, -ї - к - хух у пав ДЯ тре та СМ их АК ОК КО Ту ТЕ тіше ехо гро раху чом жил гл ХВ ли ж а век о МУшовжЕ ща Км мух кКуУх п А БЖ
У «ІЙ М
Би мож УТ стих. Гая АЖ, х СИ Лк бік кожи х ше п ме. Ж ках т Н Жах ЗК їди Міш бр ау Щщітр і ж Тиси Мт іх бух Аіщо бух во фемі Не ех ім КК ГЕ ДУ СМТ др ор ЩО юю УЮ М ДНЕМ ОК мн дог з с Ж Бу поч ГО іх п ом М Я - ке Уухм їх (г . -М К Ул КУ Я ау Ж І АЙ ЕК прє тащут Тл КД ік ща гоже ко ча Шкиє ім Ту
ЖЖ я у Ж ТК зе Ол ше здо УЮ МО Ж ЛК КІМ ме УА У пох кл шк
Пп У по - дит х яку -е - т т з ту прех ся : « кет с:
Зако оіш йеж іо Тк дю Ба Ту Там бак тів беж бе їдму 2іфТУ Ки нн и нм зо вам о м а и м м В п В м В т о и А КЕ З МИ З ЕС, му яаоех КЕ йо
ЩЕ ЩО ЕІ хи її у ДЩоадя ИЮЛЯ о пифмо брзум о бббдує бик ГІ ж ую Я шо ші ші ау бюд сміх тих
УВА ТІ шж КМ АГ ХА дО Ух АЖ ЩО КМ уж МИ. ЛЬ МИЗАМО ххх КУ КИ Е МО А ло вх що цк мл, жук кож: М логя Ухх шк Не Коль чо я я не А и ВН ЯК мою вт они ж нн я ІН Да ІНН СНИ аи КУА Ат 1 ОО 14 заг щи и ії ЩО
МІХА у М АХ УМ У ХА му х ж КА АС А шоу АХ Ме Шо ЧЕ Меч я ит зга 1лй
Ам кни ян ен Ша не Не Не в и НН НН На НН НН я НА НН З Не КН
У ж два лот лм (муу Її тод оту Ба Оу тахі Тит щу Я хе
АХ ОМА ж дам АСВ ХАТА ОБОХ МАСТІ МО ль да Ма ла АХ МОЖЕМО Лад т
Мк проку чок 1 КН У хх пола шосе мує М «де ди ЕН ух В уюті. ЖОодх не на НН тм ст пот
ТЕЖ ух піп мале не 53 ї Ст хіх ТО Тюху п КІ КУ ЧИ Щі ї
МАКОМ АКА ми шКя аку шо сом АН ВМ КАХ КУ В Я ПООТУХ щ оч Ах золу те я дах ви У чи ши жк ку вшити свт зи жи В от -е --: кс ОД НН сечу
ЕН Му ту те у и Ки нен ки НН ВН НН НН НН НН З Не ху т коре КН ек З НК р НК МЕ СТ М ОС СЕ МК ЯН З ЗК НЕ БО А М ЕЕ В ЦП СЯ М КУН ВК «дк пох з Кк дух й з Я З
ОТ КУ М жк вн їх ОМА «ті й У у. щу ско пт й су п и г - т окт тах ем да аа б жиє Мі іодж душу Си Ку саке бю ою, Кк у
ЗЕ Ки зи зи В НН ЕЕ ОЗ С З З Іа СН р ва ЗК ВК я ЯН ВЕСТИ о и а ЗКУ З ях чоеч яку
НАУ КК ОТ ших У не не и НН НН жу мк не нн На А НК Жоухих ТЕО бах
Фаек кота тю ге щих хе ЖК. фліх Зк флірт леж Я -що ло Ху тю
СА АЛЮМО АУАЛАЮ АРК ДАЛА БОКОМ ЖК ФУКК ЕЙ Я ЖЖ шАЛА му ТАМ зум А КУ лот так тугу
АЛЕ «ХО КУМ
ЧЛ дю тях ТЯ ХВ. Твен 3 шу Тл: тат ух Ме уки ху ж тк вла СВ БМ жа ГИ КОМпАБ лі му ММ ошЕ ЗшЖ КК Ма Юхим ех
Кк зр лохй
Ту ВИН у
Та бор бос їв тю тт
Зх о п о А С ЗХ У -
ОМ
МА АНЯ БУ С х жо Сррошю. тод шля оте вч ха. ож Се дя, шк Жосдтю ка ак С сит У КЕ -к х. Зіч ГІ» т ІЗ та НРК а Кт хх гот РН я їі Н 2 ях пови вена кон о НМ З НМ о КИ НН ах в СТИ УКУПІ ЗА У НН ЗК УНН ЗНА ТВ НН 1 ізо лог ОК ії х Шк Не чан ен НН а о Не в НН НО ВН и НН нан НН НН НО НО
Кизим з мч и М В М з я в ВИМ у и и В М з М М В С и ВК М В С А З В ЗО п САНЯ пи
Ка Ех А ех їх км Сен У як ї ж У ще ТК Є М М воже ше ж и. соле Я хх ек Ач
ЖШвию ТЛ о Ж ши деко 7 мії Юм у тод. іш б М ТУ УЖ 2 КНУ КОЮ во ня ень НЯ зші Мр дю ЖБК ХА я АД А ж КЖЛО їз У КІМ А Кп и, Хо се
ЗУ У їй
КО жОЧНИ САНИ ку п х я ян я . жи. х Же пе шош ж тя . Ж ші гель с що хх льлНИ БИ сах М лиж ож Вт Шу б уч он а У: А Но НВ НН в НН НН шко ММ Му їх шо оМа ЗК сх Мох ХА ОК ІМ ббенм ЖОМУ КО му дев у ом пор Кг от
ЯН сля ГНЕ ан КЕ ан Еш м з У Ж ще ль у ик ж ба нин ода ---х я Му ух стю юья пл т»тяя Ж у Щжщ ло 0Єт ох їмо Ж щу ому ою ЇЇ хх а ен он фу Трубу Ту маш КЕ ЗАВ УшЖК дае Кк ВЖЕ А СЕУ УК Ма ЗЕ КК АУЕ ЕхХУ
Кн хіх сур Бе
Бен; г Кк 5 з я. т м ис ов. пек ле. м ди, ванн І то в а тю Мокх руш т т я ду
Жов мі. СЮ у г ху Таж ж хо жук Шан С КОУ Ті КУ Алі йо Мей Мі оа АХ
ВІН ККК мі Се ші щу ЕК ОСКИХ дод Ох ме ма АБО сера ув КО
М рН Бен
ЩО у Хо сеафе То ахїї фа З сумі луг Кук о дім бика юки дур ВАЛ о іх ик Ця к о щу ше ве ТК ме оди Мак зв шк реп ще ЗБК КМ ОАКУЮ БЕК уд жа тугу рН За хїх
МУбУ ее, АкУ бно шу мо тя хух ЩО: Тюсжнам 3 ях жк їх т Мона ТМ Ук Ха дю мі Мак Пік
АХ То У щем ох щу му дО. даті Ам» МИ КМ А МЕ ЖЕН ЯМИ КУ Х АЮ т зпй ЖЕ
МА ЯхАЛИ Ах ух ит 2 : ще вуж Де - и нан но но а НО На и НН о
МАУ АТ КУ ЗЛЕ С КИПЖ жа У цу Зх ше ус прод, ке А ви пе и аа а Бо ох шу ит ку МК ошуєч ЖЕО СК у Ж а НН пір зді іт тазі ЗИшО іа: Хдую її у 21 ТІ Ті щік такту (ту пуї хх нн мм а на а в м і п м в а а п В ЕК КИ а В ВК З В М В НЯ ОККО А жом
ЩІ щ, ЗЕ ОК
М г АЛІ «ХЕ
ФУ Ж: Хрзум. СТ ошхія полку їх Кто Мішки Му ХМ щт Сущо Мао Щодо ех
ТУЮ А ЯАХМИ сЖМА жЯК Аль Яд ЯМА ВО ЖК ВАСУ БАЗ Я БІД ЄЮ ЮА т ех сюм Божа
Я БО хи хи ах М х хі хх хх хи х а ко Ук с а й ен У пкт м пт
Мт Мо Мк буку ЦИ Жим у М дю фену І хх у хх Та 143 ил 175
ЯМ РМ с КО ЖК А ФК МАТ ге Кит са У де ШК ев АЮ КО У ток А я
ТО ЗУ вен ре оч ше хи РА чл н Око. Жде Мо с ТИ о юю Уві ож оду брих кал по ня Тех ХУ хм Ул мо Ії хх Ти Мотя ПУ се На почи шу Три? тож лоша ВАШ МИ ОМ Мо шву щу ох ОжЖ А лУлІХ АЛЬ АЖ МУК ЛК АК АХ ХА рН ке шої ші «ТУ ТУ тож КВ лих Іі ПУ ж ве А а НЕ о Не Хо т Ж ух Макух. дю ке коли ІМК Ту З Кб ду ит ложу Щи ту му. Ми ЕМ: СП) п ОКУ кв ения їм ЕКЛЯ КУ юИ МЕА, Ух У М Моя У ЖУК ха дм ж УТ КА М Х СУ м ц лег три щи
РУ НЕЗУ г мне не НИ НЯ шо ; ши о ТИ А меш вої якщо нд ЗК ке
Таж: 223 Мешко дк о їодох ее що Ех пу Му Ж до ХК ск Каф ТУ меш алу КТ КАЛІЮ МЖК ЖІ ФАО ЖАВ ВАМ ОМ АТКЮ ОК УЗА КУЄ УК МА пі Ка гро. т я Ух жотоя тих ЕК кт тку ТМ А му рух сук ту брмлмо спрею бю Я ро ет хлоп тату бал ШО ХНН МІ КУуЖ о УЮ БВ Ж СЮ шк ах ЩЕ СУ
НКИ п 11
НЕЗЯУ КТ ММ о Есе пос нн чи НИ ВН щі щих жа 47: тив ж МК вач ок ен а нан ВН ан Ши ва Но НН я НА я НН на Но ШО ЕН
МитЕ мли сив ХК мо г УК зп ДНА ХО ДУХ ші МЕ НМУ СТЕ ок САТ я е ях як
Н І ху х - ох М и я ММ стю ЕК -М Я иУя Миші «ля яхт У жи -х де уми у БА трів бохкщо ЖІ де дж 3 шк в ян в Ши Моз МУ Тех бу
АСУ СМАКБО Ж АК ХА СУ ТАКІЙ ДОМ УА ШКО АЛЛА АЖ АТЮ МЖмК ОО КА ХКЖК НК Ма МО СХ туїх хх ск ух У її ду як Й -КУ іш о оба зд тую Уа М оту За уі ивн т дк нд тяУци То Шмує ему Й бе від освЖ Уа шу АСМиИХ жо У слу Ішли Во зт сю ЗБЕ за ми
Б ай хх
КУ Б жа ток винна я ин НН НН НН В НИ и ЗНА Нв о НЕ р У І и Но ве о НЕ НО НК ОА мим ВМ З УК шшЕ ше Ум о муУую ММ КУ ши МАВ дКЮ УЖЕ АТ БАХ де пи я щл ЩА Б
Фокуть о Жкрєді ТЕЗ А нн НК чШЬ жо сті що му юю суку М хи но Ву току що Же ТЕ хх тлу ВИД ж Жоуу Ждилі стат 1 я, б ва о бик ую ух пУушщ Еш ау де Бош Б ДУЖЕ КяпЛл Бама Бе АЯКС Кщ АЮ ХІЮХ ВК ще ж кт тех
Що гу КТ: ци ще 1 ТА Я кан нн НЕ НН НЯ Федина ТЕ Фі МК ук прю у СК я щи Ж ТУЮ
НВ Се ха ЖАБ НЕ СЕЗ УМ и о У Ма и А М М З З ЗВ Я І С В В З ВИ Я В М о Я СІМ сон тх СА, го и сл тло УЧ ше т вії Зк з до лица Я ож Мт же Шу БУЛ я дух ШУМ о Бу ЦЕ яку кла супе шееМ АДе дж ЯК стю Бе ях ЖЕ ЗАМ о мшЮ бле в ме У УуХ пог тт г пс У КН су туя ож жа Му ЕІ Я о ш Хиуш Мт ЖЕ Жим. МУ ую Ху Еш Ух дя Му
АМКУ ШОК за КУ Нв ше Ку КЕ ло СІЮ Ж КУ МК пе АЖ чаш я їх пк,
ННЯ НИК 155
Ал ря дж
Поки заїхав тя
МДУ жи АТ ів ОВ рогу
НВК че ХЛ дя дю меди шу ж Шк 2 дое т одутио в АЛ кл ух 1, пе дв олав о МеБ о ТВЕ сало КхО Зед ВЖЕ вві зе лк зву да шу і В 16 15 ве ни НЕ Не в НН НН НН ЕН солет сжн к Ух Си Ж дя вх ку МУ ям жкХ І Уа Блюх МА Оле СВ МУЗ Я ме АЙ ях вам оз дує ех ст я зла я й М пра ЧИ ятрем, жо БК в не СОН пдкжх плен нень Їх, жк тд Мф У «кт зЗек дапоежи Буш АВпО ТУЮ би ліва дек ту ФІ ЗАМ СУ КК сау БУВ ж кг У я УЮ З 1 Кк т. г. т Кк Та п шня ТИ фен З ху. г; но й ях ТЕ их я ЩЕ.
Аі око пуж їні Мей жа Тек о Ткр Йов о бех бли для бід ойех ПКУ БУ оїх М ДЕ у оон и нь А НН ан Но в НН ур МУ ті МО
Би хе де Проти ЕК їй У ЖЖ су ВК КМУ Аз вок Там| ТЕЖ
Ви тут Є тогу
Її А же Пе ле чно сб Жив ЖК Дитя бра лу ІМ рве ха бтя Міюачя бак ВУ. г
Баш ВК ВХ дн АТО КК о жМ я ЕП Мід УА ЖК МЖК АТ МИ в Ми ТМ
Теж Був беж отею Бк ТЕ Тек бре піу пі бує тТве бух мя я Б.В
Мо ї1п5 мо
Му «2105» 46 «2115 448 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 46 зе штрих схиавиттМ ож ттсва ладити: плижшсмствс Хледавечо ща шпон знач шоштзчиаеок зон вичок се юуцюцо ве сіра шими сист пекит Ялта дсолфомнийа ше пек во г н ч и и А пон м НН тд сзвмасжОі с: стосвоб чив ке вусик Бозосвіву ср танах тай ше ши и мн шк щи ну ЩО лю уми ий пи кожно ПО чи питати, соти цу лох звишпеслситвнти ази патини СИС МІЛА ХАН БА блсостатакну пшсваєтлаа слечпжсиоао пелет см тиха БЕВоКТХох ака власна їх Татари сних АТО кни ваш шк ВИ КИ ТЕО ших у в ужлігтмі джин і МІВ о ритми Кен
ЕМ Норд СКК МАО МЕЛА В КХОУ Ся «2105» 47 «2115 434 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична конструкція «400» 47 ук М овужгв дих мо йтжм поВоужо ОВ їх сфе рими ІТ ОБОХ щетоитих Же туз ім ки ВЛ Іри МОМ КИ, Ко мА МАК КО МЛМ Ти кума х м Со роман о нс в и но п а о и и в п и вн я М соків ер ту стрес: Ки догори У уст рутв стртр тв гук поет у Кох А педа тНлпЕрОть ше шНАМОЮІВ ТРЕКІВ С МТА ТИ ПМ ЛИ БОДІ Кт вимо моти п ит, и Ж иж три, ежотвот; р у лу й ет тра в иж о Киж у щі смик кю ди жо с лулЬВОМОКІ У щи еп сота пихи момор сет холилюьИх сл ху пе Оштучв салат їп5по зе сушею див НА ужити пфитик ода пн РІ ДЕ МОЮ пра дж уд М прин дж Зиг
ФІУМСІУЄ ТИ СЕС КЛ І АТАКА ТОД ФАКТІ ТУЮ СМ ЕНИ ИДЮУ КО ОМКЯ КМ сок пе ї у. -. пря Фен чия лок я сю хи тд вч пити К ник. пере чно люту мери асмтуМ о смути сизим ще сзирет ух ди сумі в посуттгі вх ди па
ЖИ оре Іа ХУ М ЗМК АТ ОА КОСАМИ СУПІ КАТА же чн на п а а а п у п и п а у и а п и и В НИ ШК пе
МНН АХ ль ХУ БАЛІ ТТ КМ та пта плац ли п НН НН НІ о в На Не ДИН
ЗвКсдинути сатіМмнукЦчВ супом ма грчсвосшвасу болазахосаа вича по пи Слух 55
ЗАКІЛВІВ В Се шк Ухщл о х жк її т тк и ж У я птах ди Утх ях ух мання Ім бан гу Мхат гдАХ ГУТ АХ ЛІЯ З З дрі Біт шт ю и ОМА ТИ
ВАЛ ЗЖЕАЮ ЖАТЬ ДИКА УВО А Ж ХА АВ УХ АЛЛУ А МО ММ маю ЖЕ ЖЮ ко КЕ У ЮА з е чогу в - її 1 4. си ШИ ьо їх У х У їх У мі А тиж ях о хо не др ев зола терржх сих Тих ен Ул КХомиМо лю ЩА с ее и а нь о ЛК пло ж шт Мох Ся
АУЕМХ. Мито Уч Вип хи СУ мя МК сих яКА Ж.О ЖЖ КУАХА Ж іди ши А ЖюЛЕКУ А й хутх Зк ау «ЕІ В. -2 з шк на но и в нано Шви в А НН САН У НН ВАН хну сь ШИЯ Хто п НЕ КА Щокл бд ЩО Ка о НАЧННЬ те Ку хг талі Із их Мої
АЮ ти ий ДМ МАО МІДІ КЕ ВУ АХВ АДМ ААУ АЖ ТА захи. УВА дов ММ
Мн ОКА КО
САТ їм МКУ
Вл стю Жде Маю юшку 031 єх ти кує Ка Яра сбТакух Пак їз; До ве а
АУБ Аж ле ЕМ АЮ АЮ КУ Ам АВ КЕ БУК КЕКС Б ІТ У щх що що пк
НО НЕ: що нан о на и с НН и Но НН НН НО меш и ни шо и НИ А то жу дю ту ж ще 1 Кут кл вк Ди Мі їла ж ко і паху
Ку Мою ВО ЕХО ях КОМІ си БЕК ХАТА БАЛІВ яХАЧИ МІУ Хе АХМІА ді МУК у ре Не ТЕ БЕЖ
У у НК КУ ж ош шен А и и Но НН НН пе
Тр 1 ек у ТЕМ Та Ле І У луки у у ЯН ЕН Тк ди тт ів Би уп у с їх и АЮ МОХ Ба жі ма УКОСУ рак КОКОН їде ща о вк
Аа ен р А ма БаУт щоки ол лпЯкв о Шфодо фур тя Пруту БУТКО іх
Ак ХЕ МОЖ доли УА я Б Ах Ки Мішше ТУКА Аж ХМ ВЕЖ МОУ АЮ МКУ чл наче от ке ВМ Я ек еВ НВ и НЕ В В о НН НН нн и НН НН НН и НК ІНАЯЄ пох ее дю пику др Сея Сол Ді ду На Нея Тл уч я ре ска хх
МАО КАМ ж. КАК хи ех Є ШАХ Ж МИ кро му АЖ МАМО КО щА шІ дор окт я «ОК ям ОКХ шен. Ж Ж шкі бує демо Я би б Мк Фе Тл зи тік рум ДР о тил
Ех ша дав сш ЖЕ леж ву дес уп лю АМС СЕК Од вкА о юу чт сх дол
ВО ДІВ М
ХУ шко йхке жо хе Жди Жар Міхно та Дн МУЛ Зам ДА твою схо в КИ
ВДЕ а ИН АН УНН Ма пах ле ти (ах фі ЛІ їщі хи окт шип Ж шу дим ЖЕК А ДЕ УВІ ВЖК ЯМ ЖЖ МЕ Ус яв АВЖО Ж А МА СКМ з ци че Ти зах по ДІЮ о) ож КК Кан Фо оливою ди лу жк щСЬ ау ри туя Дух о у яю т овен кН То тивів Мди АЮ ХЕ Ма тв ши ую М о Хлх п зем в ко м и ик а м с з км м В М Во А В В ОБ В В Ж У с С В шок окре «жк : 3 ї хг
НУ її ЗУ
Аз якоОТАх іх
Але ши ле - пк так Уч Кох, я ЛК ил Кути, кан хто Тл ж ла Ж жм УЖ тт
Тім; ие фрі Тахру бю пеню Такі; шко ів ЗдКії ВН б ж кг их иа а а пр ну м я М В НЕ Ем ех С КО НВ М В В ЗНАК ПАМ З ВІКУ ложе потр ш «Ук ум ЗІАЙ КЕ АЙ кл. сх. їх КшкеО или т. ен ше мл, Пи ич п ся Ми Ук Кох Ж даткю хх Ло ш ож лав бах бщах ТЛ я ЛИ Мох пок пк Убххж її ду зе Хм Ба Ха Мох тяжким ек лк Ом ою КМ бага Ух з СУ ЩЕ чшІ мпАш Ота Пе сю лот путі ето
ВТ КК КОН
Ох КУ о лю Ко нн чн ан НН НН НН НН не НН На На НА НН
Щи що толь рі дам тини То щі пр Мт с д о Є хо их з
ШУ ЖІ ТС ФК УМ УХА ді УЖ М Ми МАКО КОКО А ХМ ХК ОО УМ ХО ДУ ХХ я к; - х -Х -Х Не 5; т ДНЯ РМК ком аку ше суху «ті - ее я ц пк. Муза ЗА Ди, п о Та ТА ох ПА с а Ху може щі мух їз: душу Жерит Обт в Пи що б 113 0 І іх І у ла хо ФА ДЮ. ПЬЮ пото нн и ІОВ КО мя Дом КАМ КА КМ яЛАДНМІ ЯКУ зла тА КУ ех пит шовк пд хи Ме Лю «ек ЖК
Ач оч ку тод Тюеих тм Жуки т тучя товща жи Мк аа Ван жо Піих м
То х що Н ретуш ТІ МТК: ТЕЖ Мі НУ ет їх ощм НЕ: 1 М ої ПЕ З ші ши югм СБ АКЖНИ ККУ ка У оп ОК КВК Мам БИ АЖ КК ня сві оку
Не «І КОВШ о А сел пед м А НН ЧК Де Я ях т-е-х зум:
Теж лу лу пет тх мук зла ху їх Можу ІХ йишу Мом фах Лю
ПпЕЩщОЛЕ КО зам о Ух І СУ щи ша м А ЖІ лек ВІ ба ОАЕ «дих ств пуежух «ку ОАЕ ШЕ
Їх мух хол т. їх І Фрожк З у г Уж чи ж Зугуж у ше кі т очи г Тут
Шо Й 1 гщі пн НН во У НН паж ух ді ще пух ті Се Ма во щу ший ша жах муш Ки мате оУгІМ ую еще ВЕ см МВ СА У МАВ: УВІ
ТК АЖ ту ечКЛЬ КРУ ей
ГК шин хх пр т с. Ж мсто Туру жи ититу Я сен Усю ки Уже шт М хе ух я КУ жк
Щіщ їм СТУ їТчшо шу: ожам БІЛО жу: лу хх Уві лід Ту ЗЧЖ Ук Хі
ТАЛЯ ЖІ АТХ леж БЖ ВЕК ХУХЛХ слі УА ДУХ БО сл АК КК КО У
ТЮТАТУ ту пд и Й яю ох те юю ЯМ з Б м ик. М ешьУ Ж іх г У м Тк. п в щх у пт т п йде і Жіщая и іди Мо ІТ дож юах щяя Дв їду гллє КУТ жи У У ЖЖ Ку оя А лАМ ж. ОРДА САТ А УЮ ЛА КІ САЗХКРЯ Я С Кеш БУХ хлАзуУ сла Оя М пакт кож -- чик
ІК ІА 1 леї
ЗАКМЕ я А ям их, пух тс Ух ке у похід т. СХ Можу їдять То, ложі. Ам. ТУ Жлюя дю ЖД КОЖ доку ко ршх ОАЕ ДЕН щі ТКУ ох Тс - тові ЩА жи. Лю до та кух и не НН и ох ММ ВА г яАЙІ Од ВО ЖІ ЖК Ома Клер а ААУ хіт стю хХутж і шу о ЗА
ЕН Ева ха: мому Кк пе Фа т : нина НО туди й у, ЖІ ж ян УК и рання пе Крах Ми Жди М тр 211 4х 2 хро ких Жах д ЛІР лам Ті щі пов
АТАК БУ иа ж ЛО ех КОЮ АСВ КОМУ А ЖАЛА У КО А УВА ЖАЛА тих тр пи
У Ж Зх
КУ т Ск, я Тк ІМ. пою т с ее т є ЕН т ки ох. АН Ух ТЕ Фняоух Ж. псих
Тов: Тзатих. ЖИ, дж о Му паж 1 ю товуме ЛИрах о Тит Ми пк ТЕ о бро Тоді ую
МЕ ОКА ОККО КК АК ми св МЕМ ОК му зм й УВК шЕ мМ клю яви чиї схе г века МИ ла хи. АК
Ко 4 нн -х икді гот К- сх ем и не и А АННИ бу йтжуж сТехіт ЗИ 0 рози ФІ МН При ю фе Хр дат ті щи ли тутзв гуту 1 у
У М ев МО БОКАХ душ УК Еш се ВІ лов ХВ см КК 3 Ї В ї х сотку пк, худу
ОХ Ех сем са Док о АН НИ АНЯ Ту оо глжкще тож М тою ий юри Таж І ахїх зх АВ БА У КІ КИ си вт АВ УЮ МУЗ ЩІ ООКОюЖо КО У мем гу ЯН ах і по
Тогхе Фк ке Кр жк ут Ми а Ж Мн М тяж Ж му 2 мч ЯЖодках щі МК АУтМ їі 720 УК Хто ШшарЕмЇ зп осракю лулее ІМ Емі: щі да шою оту В ОНИ СК им хи ах кн о нан НН НА НН и Ши ИН а на НН НН НК НА Ша
ТІЛУ их ТАКУ ХУ а А ОМ ОА МАЮ ІІ СЄИК Ме ЕІХ ІН МАМО ЗОМ КМ РАХ дум СУ ях
Бен мул ча ми - І че 32. що мери ко тома мя ч омела : ою Іди г я
Ффотоде Топл Мам даху М ок СМх кю СЕ ФУ 1 лих. ХЕ З ік іГчУї: Мікро пе ТІ реж ники за у ло а с у я п о М В А В З М В З ОА о о и В и а З М З МА ЗЕ ЯЗКУ
Сх ЕД й й
Слям пом чл мух
То я їх ТЕ з хх їх ГхУ че мн ли рати «ХК хю то. ще Золя ху не Ж є Кк зн Р док о ТЕх Кур ді ри тт жю ткту бик ауує Тдмзі баку іо Мр їли щі
КОЛО ЛО АТ ЩО МО НО ШК Мп КЕТІ МОБ ох хі о їдасу ї їх 1 У
Мои, що Мал сю ХМ ЛИ ом їляюти т ка лу Муфта ТО жо МЕМ Са бохо Личух ие зак с з М КК п М А М м м м а М з п в м в З п ЕК М КК ВВ Оле
Ме Ух ТАТ ач в на и р на и НН а НН на Но НН ОН НН НН Не НА МНН НЯ
Зш МВ с ж ом СУК О ЮК ХМ У Х То км а А лижах КМ ОКУ мих ск «о ще
В Мі й
Бе мот Мо вно нин НН НН НН З СН СМ ОН НН С С Я М а сь В М анна у А КЕ Я ЕВ з КИ М З КУ ПИ ла юку МАК вер ла МВА УРА ХКА мот мо Гога
Пл! ТУ ГК хів Миша окт Мих ду ЇХ бі іх у т кю рю дух Ж» СТЬю Та Ме мА ИМИО ЖАММ ЖЖ МАМУ М ос Ах У У ОО ЄЖАЮ Ах, АЖ ОДУ АОМІШОО А ІА МО СКЛІ Х я ЗЕ ох. ТО
Бач Ел На сх ло сбдує Жде Ж оехтї Їх Тюижух ОЙЛО Ух люкем ТІК ко Теж бан дж ЖК А У маш ШЕ мк меш им Ж ММ ММ де мам я УК СК КУ шт АНА
КИ СО п я «о ах муху 1250 но СМ ку Живи ю Мих СУМ но дуючу ТИ г ую йУлога пи юо Ток ХХст шт бля Ввщо Миь таж Доки У Чеєтуу СК дю, Фі хх гріх я Ск т НН 1 1 кн и п м ж м пи ж и з п м Кк В М А о м у пак іо ко В а п М п М в а ех СИ з чаЕ СН
ММ Кн У х т хх аж мк я т Кук о дах Ж алюих воші УА ЕТ жтЕ яв: го Хо ия те їх ту Кг ГТК хилуї кох З де ему Жах "Ії Мк ї І ПІДЕМ тру пт ні що ау що жММоД ІА мм жк А КАХ МЕ шк про КК шо кА САУ 1 тк за те по яю М. пока як; Толі т шию ЛК ТК. др пу я ЯКА дих Лоджіж Тоащуї З Ко видне А Кк зн у вх В Ва М І М п м а з п ІН М І В М ЛП В МЕ З ВО ВАЗ
А ПК чай
НН НЕ в
Хв х пк ФУ хх, Фо ЛІ Тк тоітту ол со - ую Жуки туї Фо жу оса Ох т шк
А АК нн а кине с о с у о С п М КЕ М М КЕ В В В І НН М ЕВ ко У Ка В о ВН АН подо Тег Ех і ши ко лює к сте ЧЕ Не но спе а МСА УНІ хуя спину Ух лжо отуму біих у оку М шу а о о Ффмю 5 та кі Урі ЖЕВА Хі іч оквосжпоа м Їм. Му лу 1, шжх нем ни з м о в на ик пк п п в і а а Км м п а з м в п а ЕК у М І
РЕ ла ту
Іл 47 АТХ лю, мне Ши Кк х У з ФМ сли Сам Піч Жок регелнним т. Гм -к х г У РУ Ж. м.
Флюух ім Срлеу щем Тамах ше Меко ПоКрю Тв ЛИ ко т еуІ ЩеЕкжу Те Жіщд шу У бак «схуд ла М о мк иа но е м Ео ква Зея ММ ам мМ АлшАХ ЯХИ А КМ МО А Во тож лам А У
НН 185 190 ек - ел и ня яких ни и и у А НН вки шу ек ж г рах ти мок тдих їла йхмко то ших тоди йВок о Біч ож ку їх 14, їн ою нан і ни з мк нс и у и В Зк М с ов САМ ОУША Ап жа АД Он У МФ КЕ злтуч с пам,
М КОХ Мол ху сх гжіх мк их з тх тру зо х т шт их
Хар усу ді бкрко рик аж прі АДЖЕ ДИужЧи тріАг І М доо в хи КВ х ВКРЖО Мід. УМО ОАЗХТ ОпЬААК АНЯ ХХ АЛУ СМ ТА СУХУ житнє дат сим стр ха ух ги я ее ан ТІ дж фея т шу ютуб уєх
МАМУ. ЗІ. ОМ: хау 0 КЖЕк ЛлОДх лам АлХУ МАКОМ НК А ЖЖ т па МУ
ІЙ Кк г че
АХ - ох ой шт Б го. льш ж. - 2-х я -ї п -- т Бе --ї що Б ша хода КОЗА, То: Га: ил. т сх: ко НИНІ Крочи Се кине Кк ах ПЧННяІ
Ана вна Кк им чн нина п о как м в о а п п Ві п ох о З В М В ОЗ КК І КМ Я ЕЕ НАУ мч по Б ще по ен га 1 ості жі Фк п 2 м неї р їх - що ел м «ві лине ЩІ пи Мові пижма ЕТ я УА НН ННІ Не НК НИ ЕН а НН Ноя
У. СКК ад Моця БЖ СКОИЖЬ хе кКХІ у УЮ АКТ ОМ ІМ АД ДВОХ мя ре Ка по ся п
ЛЕО ще її
Фея ло цо до лора й юю А тт ж ож р С т х БУ БУ Хв
Там МІ до дух Ліма у ЕЕ Моз ї8з лих Бухж ЖЖ бБІМ би ДЖ ис до
ТІМ ях Б АК ххх а З МК АК Е її ме Кл! леж М ла ах пох мо дет. ци що па п пої м мл їх» У іухе тиж, т ож Жора ТИЛ лин жи Кіш мих т : я хх може плодом лат ту ур шо ще ЗТ ЕВ ти ПІК шт лави ГМК Ов МОЖЕ
Кон ие о а в СИ ПЛ З НК о о Ме ЗВ Мк М ДЕ ВЧ З Я ОМ ВО М о В ВН ЗИ У Я З У ЗА а у хе Ех пот
ХУ ке їх Бач ро тн кю: Ко КУиШНИ гух Я чо Я еп аМО стця піжі т х У я ог тра І.Ю І я їх їду їла ї хз ранні Мох Тк хр и АК у У
БЗЗЮОАМЕ сж Ав ОЖшЖХ ув бу да ух щмеЖ п Ух жо стю сну ОКАЮ -к вч -Е роль І сука
КЕ З Ат
ШК. А тик сп кі пл ти Ж хм У що я ж С шоку гео Мед тя с зу ка піку Ек гіди юю То Ше 7 щит Філ др т. та БІЛО ОуЩОМ СУЩО хгщ могла
МЖК АВМ ААУ. ЛЕМ ААУ ОМ М ААУ ти ХМ мА МА ММА дом М у чат Ягує ях
НИ Ох МН
Го КЕ КК зло жи ен пд нн ШЕ НН АНЯ я жі тя гу мі ТУМИ їт тку 3 - Щмух бу Ід ен Ва п о о я В ПК ОК ОН Б КН М Я Я и з ОВ ВЕН ше ЗТ и я НН он я о НК А Но на нн и НН НН а я НН І НК и НМА у ся НН п о о о НМ В ОО о ка я КЕ ЛИ Я п ж АХ ФМ А Ж МК ААУ ї щ 1 А
У И М Ж паче м Но НН жди фон Хо жх тлу МЛ ох СК одуиїя що сушу мо іч во ІЛ ж мам А У НН КО фа дм чі М Су ла Пе ду ХХ ХРО КЛ я о «іх -Е кре
КІ С Ту
АХ ЛЬХЕ М яку зу щу кт хх ї -оз ме его КИ з их У Ж х чл тм
СУ пі т ХЕ НЕ я 1 ут «пл БУТ щу І фея оця М у Ко Ух, тд СМР Ж Вр Ома ук КЕ сш АТ ща МОЛ ФА Т вяа БМ АКА Ту х их холу до я ях ск я кт шодо Ух ї» ки ЕнаНННИ КИ же жі меш гу Кк о г холу шик сум Що тиж З ст г хе Мбмих Я Того щу пет Ми люк ТА туту ту У
ЗІ гло ЛЮДУ ФАТА ЗИ Блю ТА лож М дл. Кем ММ дель ТУЮ їх шо
Кк Б сих ве ЛЕ то
Мо шо тах єю. Ху ЖИ я Гоа ТТ кої емі3 Ту ЛЕ я ТАС ж ли То дух чую Ли ау Ток У. пом гаю АХ Х ШОК нав зи ее М з и У т с З а і В М С МЕ КА ФК ня затих и їх: шк о В да яю оси чини ННЯ зу КИМ и семи и У сг СМТ оче ся Ж шуму КУ, Кия
То туї як іл гак р ке: НН НВ НН Но Пот Му йомхух 11 вк ж МЛ їщу се ен і и а М А с В З С КУ В М А ЗК ОКХ ОМ КК ЕТ па БОМ тру пуделя КАЖ хх. М Уся ххх т п НЕ НК щої с як В ях дж ЧОою ПУ хи ут 07 ЛЕ поті ФУ іх жд сблмф; йЩ143 Ми Меую ЗщЩ АЛ лю ІЛ 4 на АКА ху А МОАІ Ом К: о нь Км а А ку ор о и СОЯ шкех я що ЯМА СУМАХ прокутх ЗЕ ях
А МАТ Я,
ІТ. ях ять юю ВІ яти Оу зх ОА гу
Щіш щі АТ дО щи ЗЕ ур ТО г и ЛИ К
Вій сАУ бум жи о клЕ СІК АЖ Ого УМ ААУ
ЧЕ, лоти ин КоХу СХ
Мих Жила рожеве я ж, тя юн у Тк хх жі реч Мо З ранчо м Не ЕЛ сш МІК Же ШМК ЛО су дах ам с хан кА Ул : - 57 ке : т пз 15 не о Не М оон си ни КН НН т НН по спини шим Ж я ЗИ и ПМ, ЧНУ их птая іх ЩЕ ТД їх мі Тіт «км Я ож Тел зу Ми т гвжко від ів
ААУ КУ ЕМО КА ДЖ ДК АТ КИ МАЗ мжЖМ о вшМ Зв шлпЖ ЗХ ще щ ЗАВ 2 25 за що «й в жу те жк Ко ж т т М. що мання ьо х пж СА т й БУ чл чо чи сш ен а я о НН НА НА НН ЗНА НИ ен НС а
Кн о м кн п М Ко М В М Ан З п В В М М В с р ЕН Щи А МВ А ММ
ЗЕ Ах й
МУ жк ЕН
Ха. ЛУ йуш Я щіх Кн Меню Я що С щі ту Шах ке на Не и МН Ше аапомви мжю ме об БЖу МАЯ У шх юЕб БМ ЕТ Буш єни вАХЩ ЗВ п пл пох
КО ПЛ Ко
СУ дани: МАЮ шити СЕМ ЄЮ Ха ЖАЛЮ Ж дід Му Ж дії КМ у Тік слу СПЕКУ ЯК щі Алюм ща ЖК ЗАМ КЕ лу вшИ ААУ ВШИМ АПУ Сей Се шим ВМО БИК о а АВ ту ТК че т рАЖОУ НАУ м «У схов М ху ю БУК лим. фе ббгуту СЯ ко Мік Мі є у Чинки їх Мав гул у
ЖМІІК ЯК УК чл ОО УК Ен ж А КМ Ми КИ ДУХ ОКХ СОЮ ОА Ж СКК п, щл ТК сю Ку г юю джу С ко ХЕ тоащшх УЖ 5 Ж това Тк бю из у ХК ОТ су ху
УЖ лах з ж ЦЮ за Юпя мем Са УФО БЕ КМ о жех шк У. ЯКА УМ ил КН їли кН ВУ ОА ТУ, ут: я ої - ши нК - ОН АНУ
Щі тя Мі що доня Шо УТ ую дю Кен Сум ХЛ ху
ТІ ще ДЕК ОЖУщІВ ж аж дО КК СлюМО їА У тк ох
МК А ен о нн нав а Нв нан ва в а в АННИ НН НН НК КО НН АН НЯ
КІДТА. МЕ ЖЕ 5 НИ ЕН ВН Енн М З а м а і В п З М ЕК М АК СЯ ї к їх х В ку МУ е А ит. меч тео ч-ї жо т - Ул Ху Ач ов Фшню Фо ке кул ла са т хх см ну Ж шу ти КУ у Кляхо МА мо бопі дико бом бу ул Те ІД Ко шу УА МЕЖ и Ам МшМ УТ МУ я мс сжеК ж Є ММК лю КЕА Ех ре т зе а ко ва пен З ек п тх.т « я ик я -Я пу -. с - пря я щої МУ тут 3 у птн І мо сл м Дам С жо току Тож кіх УЛ ц То гла мо ЗК МАЛЮК ХА ФР Я ЖЕ КЛІ за ії ОМшщ ат а сей дав це Ух
ЕК Ай Ах,
Же ва -як
Оз рУше шк Пежо сх ЖЛєу Мізому ХХ ше Я х ГК СЯ ро сх. ил нт. г. С Мо пк
Ві с Мод дат пух ТО су тлу ту НК я о НО ен НИК НК щ
ТТЛ МК Хушуюі МТА АСУ ЖК ме зл с-г ж п г У М Се У ра С Бе Й ня: не А зни сфішуяу Ку тУу хе У ях щу тд ту шу Ба т А ск яп сх
ПАЮ то ів ок їі Том 0 бе є Тв що у ХМ ТИ Мах лящ « кА КА С МУ ЕХ полі х АММ шЮМО ПК АТХ О М ВІ зи ж 13 Тло бі Аа ке и Ех ни п БЮ їх и
Фо Й Кк ши РА а У АчННаИ У тата 17 ше М: па й Ху мл за
Дошку ЛИфру 3 и Я а буки ЖУмиг сяк Ко ду сек 13 шу (Ин пак ж мах тля рю
ЕК ОКХ жу мА ОЖУХ ЖпЕ ук АВ Дух Ж паж о БЖ КО АБО У Тах т тртх ек ха що ЗМ дане з си ух у ме ти, МО п ХУ ї ЖЕ 1 Жах т у хх о т ке. Ки 1 пох УЛ
Как лики ля юки т ЖИМ 7 3 х хкащ ше Ж ШЕУди Фі ЗК, доб: узЕ ОКМК жу КЕ ге Би о Себ пог Уві ій бла 5 щшЕх Уа АВ БИ чим тв тА
Да ЛУ НЯ и нан пот шило Кк ен А шКМ- ХА У ХА АХ ЕН ХХ мМ ОК у т15 їх
А їм ож но НН АН і в З Мн в ни Не В НАХ АН МН НЕ он на в Ан ШК НЯ мех ЖМеб тик ошо ЖВЕ гі ба жвх тик піу йяп о фзіе пе Ві Ай пух я х Зх «ах 1 ве ла Аа
Ек Кен т ї то кс хо г о, кчк. жаток То п. че о пек - ТТ "КОХ У піз щу ЖЖ Ті Бі Бе ФбівосСов міш їі двт йакоткУ тк дії ід меш ни з ме и зн щатаее мав жи Еш ше Зм пев АВ тв зд з дем ки БУ жи ливо ТАЛУ долюте Зиатву Ал оу ТМ що Оу М КІ Тех ямі ОК СГ их
ЖК СЖТУКК зало У аяи ФА Кг МО ХК хх АЖДО ХАТІ дж МІХ ОАСКЛЮЬ ЮА ЙО КУТ О
У А я ц
ОВО но чо
Же Аля що рожа т Мах Хі фу СКЗ 3х. я Же фрукти до Жана лу
Ав ойла іш бен би букв Ка зів се ко Бек вм му АвродхчЯ Уві
Км пк т ца по ШЕ пен сла що хх. ту маю гу ее ч тн смачно НН НН ЛЬ т не НИ
Хі що лиже ВХ Му тт хм 4; 251 Ем роко Туюма іх; ЩІ їй ТК лк щі па шко бу хо зіу Мем обу Бе а мем сао мш БК Усю МЛМ -У пах їч Срех
КО т Я щИ ох ЩЕ На: в зо ех чаш ення очи соя, чу йти Фен Я у т - ач пог тд ХО зу в БУ Жуля А Кех ху КЛ ехо Зах ие пяхує жу лек прі СКУ
ЕК Оп бу вю І1 мЖ ва Сх аж о юук АВ АЛЛО КУК ОБЖ БЕ ру. АТЕХ щи Фо
Ту Жено ри у ре дофик дар Толя АТ т в там ЖІ бує дру та М я 4
На ще БІЛ лю Деу Тих вх шт ті т їв тами: її 131 Сехує Щі ве Мі ух жлж бум АЖ Бр кп р па о УЯю мем о жоді ЗБЕ соВЖ ВА оо ва чо хх «Кк о и АК її мило хо Фе у ях -ох 3 що Є гу
Віл БТ ях ТК з окт ж гл тів зи брюк ді х чи шу ЕЕ АК БД шоп сКте СИ с зв ях «КУ ож
Жир Ме СЕ Момо сл» тю Я о Уа ен ну: с ху ду тв блю ДІ гу тах
ХІШЬХ. БУЛИ М млн Ук Ау БІ ААНХО МАК АХ МАУ дес ЖУЖУТА дай М ХЕ 0ОТМиЖ ам Ж ч ря чт ЗЕ
А БК ЗХ АЙ г я шт фест шо Бей -х 23 я Ко кН А нн НИШНК тіл СІ пе Кок т раму їі ях і дух: дев ує ЖМ ПКую й м ду Ів
А ФР Жуює ро ті їм; міт сощх МІ це бек шик тво мів КЕ й Х і: кт тр тю и К Не шия серия ту яжоО м «и сан КАН ННАЧА тіж Такт бод Ле о лока ди та ло сть і ж ХУ щу пеж пр Як Др з ж бЛлм їн А ті ХЕ
У ТЕ са шах ВО БТ о За оіїа В ми За Се жнМ ЗА ТКУ У т, лі а моди Жов Жодюя З у лм 1:41 г жа й мо Км вику Хо Жожию М одну Тс Хо
Я ва АК СКМ б УТ МВ ож о Кит ЗК Кл БЕ ш ОАЕ АК УЗ в ВУ їх : х : ох -к вже
Зо па щі мин НН В Не На и ни о А НЕ На в НН я нан и НН НН ОН НН Тк мух ни но манки в з м м о и КВ п у м м в а з а М о В В А ЕК С -х туї -Зщ І ох хг р кп хо мМ гео чи
Доу лиж й юю й жуки Вл юю фаху у труну Ж У тв ує Мк Ту дим МУ луку
МІ СКМ А сх м КІ В Іри ОК І КК АЮ сх Ме И х В: З В: 4 Ве Зх А: ср до ЕЕ плу КЕ БЖ яри ВИ ку кош жи у п ЗА п НН НААН ях но чу же
Также ЛЬОЗ дк Вел С бух ЯЗ Тим фі 3 ві Тащре ЩІ. ЖНВуУх бирку ді ко ин З и и о м Ве КО Не УНН Я НК ОЗ С Я УК А Я Я З В З я З ВЕ Я М З ВА У о З Я логегу гуд яру шк КИ Ки моущ отхуіях пло уки ку вх ТЯ У Кв их Кути САМ ЕТ ку
Ме слі гі ОК Ме пт БТІ Бко гаях Ок У тах тому
Бу вм. оч Є жк пасе Коко пт тиж є хе с ит, мА х ач ох я ван гани Тех алея й х КЕ Вт : т я ЕМ НА КН тні: їд їж км. (ТИ Ох и МО Жарі сот БМ ов їз КК У МО ВАТ КЛ с У ї КУ ВУ Х Є і Не КІ п х ще Я дО У ан Аня рт пд туш КЛ Зоні й лу кох ія жу демо зу Фі я ж ба я му евро го ДО У що аж ах Ши Сб вом Мч Мік Дам Є по за М М а т М М КО М о С о к М В В мо я я п ВН М ко и КТ І ЗЕ пи ск де пла У Б
Федя я М шо лях шк ин А НН НААН ня т ик т шо
ЖЖ ТЕМ Мі шо лу ч 1 Му М ід же 1 5 тя ли ти ГТ бе жу ХЕ
КЕ ни ж м а п В ДИ о в Я М В ЗК с В В КЗ В КВ ВК В В В Я ВМ ЖК ЕММА В В З НЯ схо ах и п щи м ох - яті. мя лк тА. дю у ми кет г Мас рю мої хе І ен авіа с чів Ж дух ей: Саду. ТУ хм смак ть СЮауху біююи МОЛ мах Мах ах ху в ех Не с он СВ ЗИ ЛВ З В ко ож а п оо С хх ВИ ЧИ ВИ Я іч кА В ДОВ ВА. поту Мк, У тм ев ще
Тодкши ШСЗ Вуи: пПкюе Ж ОЇ ше сяду М з душе пря м он шу ах Вр ою спяя тд дуг бочку. ідо ПБюю ва НВ Нв НН НН и ННЯ з а НЕ паку мим ша МЕ ОТ БИ ДУ хи А ММ ХК ше мМ ДМ І АХ а ГУК
Баня ек р не хо ме кан м 4 у ше чия - « тощо ж ях я ше ке які оо як : кт
Тожмі 30 т МАК пока ни с пра ян но и п НИ в не аа ие Низ НВ У ВН АК в и АБ НН Вая
М жа Ки Теж А сжИ мІ КО Ек А АЛЕ КПХ БА ВМ МК у УА жо дк то ск ке що МО
КАЄ Усаиу Аа ям ТВ го Ук па АННИ Тон ке пух Муженко й ум МК т
Мідр од МУ Міо ке Фет; сі и ШБи Де лою кт щі іт Ух ню ки жк чо о з и М у п В М М Кі М о Во поь я и фо нь ВМ НЕ ВИ В М кВА МК
У У х милим х М х Б Х А іє КУ Я я гугх я я хм Й ОК зок ЖК не на Не че кл ух Фжишоми ОМИ ях Ж к им у Ту их Же вжи Дня Тлюх тюки
БРЕТТ КН хОух БОМ хи ОН А НН Кр ТАМ а ВАЖКЕ Су АК МТ Ом
ЯМІ м Ми. САМ не ж ера о о п на и п и С ЗИ В в в Го У шою В КК Ю рек я о кох пок які
КОХ ЯН ЯЗ
МАЯ Ам Мали пог руш ж ги ФУ ня, т є У Н ІК, т Кияк Її Га ГУ МО. Ол Тож т
АВІА що Шк пуд Ми Ти ршо Ек рух Миби ТУРУ 3 юЮТЕ щі Мо ві ЛІ мА жу БО КО си до ОМ МАВКА хау УМА У СЯ ек ре о в У Ка о У НН лот ву поїв дз поки во А ше Жошх хо у Же т ве ЕХ и и дек хв ср МКУ Же ТК же о подо 1,3 ОН т.ч МО их ОК ВМ ок ЩІ п їі ХЕ У ТАТІ ше М зи ЖЕМИ. дом ЛИ СУ мтТМй Ж МО ЕКО ж МІК шо жи БИ ОМА ик щі не чо
ІКНІ НА ще Кі
Ол КУ мя ХОМ - ще. тм БУ Я Не мах я Ко т Б 1 Ії ТТІДе їх С КН мч «х. 1 їй з МН
Ма КА АВ щу Там ЛК шко їі щі 1 ЛАК Шк Мугу мод Удрі ам ЕН «ЧИХ ек а я оре М ОК А М І З Мо я МАЯ хи АВ НЕ З о ав ДЕ ФЛ о ЕНН о ОН КЕ ЗИ М Я я кор «ок жк
ОКХ: ой 125
Моб кУХ Сн Моя
Фе шу и фу Ху ие лу Хо Фа ам ла АТ ую М Ше броня пора м ЕН З ОН о У Нана Бе ді Ту ЯН лет Ж ЕК и м ве о ж и пи В С м ЗК В о а М а КК я з В С в п Ко ж В п и о в В п и М а Осо зо уран Ззвит
А МЕЖ АЖ
: : «дя ше : ких шо Я КУ х СУМ Ш хе: - з с о НК Нонна в НИ АННКЄ тир Пт ли а4хеУу оку. ПН Мік Мік Толусх кине роде ки Кен А МЕНЕ АН А я З АН нн м КО З За М о З я В ВЕ п В и Ко Я ЕЗУИНІ
ТІ ВИК М: нн ХА хо
Змі. СМіфмо сто ЖІ щи Тож ху кт Ху Фан Лак яю Ка шко ча Дж Тл ТВ
ЯТІ М КІ аж на Ок в о с в а п І М а В М В З М и о З ВН ВИЗ ллє кю МК жо ва хіт тм МИ пл Шен Ж тзумео тіж ЩО шко Жуучих й у деку Тс Я плоти пюнуяо Мову
Що тою г Ше уж туш 3 юету 0 Та му БУР Бахту Тоді ха їх Фея ву у
ТА ке а нм и ла и п с и В я п м и и й о А п о п і С Кежоч шли Ок пк гюх я т шодо я АТ мк Я «и «я в ех дл й - пн Ан т шоу ТА о з пис 4 хх ох гх з - су ЗЕ Таку. Ше Іл ут умо умо Ма у тих Щи ЛІК км; М Торжх фар (А Кт
ІВ шал иа мл Уа Юм шю В Б МО ММ ЩО МмЕцА БОМ Б'є пе ск «45 ех УК
ВЕ ІМ Дани
ХАІ хх й ХО пря ху чне а в НН и о НН в Но и НО НА АН НН ан не нн аа КН С НН и В НН ЕНН щі АБ що Мем хі УА
ЖЕО ам КВН МЕ М ЗО АД. СЕ МИ ЖК ДЕД: жк 6 зп лу ОА ду Ук кул
ККУ ку ев хм 1 У т Б пах пу жд яхтрю вв хух жа СА -к фрі 5 тиху Ва ддУ сиві пек а Ха і ша гі А Мі хх дар з ож с у я дО БІ ВУХУІ БЮ Я У МЕМ У МУ щі МА РО РАМИ мав
Ех та их тут В
СЕ; ЖЖ шен
Жофжю СИ к о Мат Тех ум 1053 (145 Ша ср доби Ж ну уко ха хр
Ку У еЗ в сну ОЕМ ЖУК АХ СВ ци їз ї із на я НК во А ЯНА М З У Ум о ж як Уют ке
МН Ух, ТУГУ осв; КОШІ ФК
КЗ ка ке її мм, ж їх пт. Е м У СЯ пк тя К Я ш що ЗД тд жиє У щі їжі Вт КЕ у Халл й мжу Лацзі бу; хх Х чи ТТ пюТу о С я МЕ п ДК ЕМВ М ка ма с ПДМ ЗА В ЕНН ЕК ВЖК А У УК і У ї
Ту, ен ЖЖ Уклх г
Ту, 1 жо ях
НВ Ам АЙ М жк с : Ки Кох - з Кк - тах Я Оу, РА чо хи жо су т кущики Ток ЛК фах Деми Бех Ж ни т шут лину ВО нити у Ох Ж п
ВКМ ОО Му шосе М А М МОМ Ж с хешІА КАХ Ка З в и З А ЕН Си ЗНА ВНИЗ, тюль хх жа г З ЗЕ, дя ее «ОК -х че Н сосюх чо пюжод їх - мн и і В А М НН У ще пік бак тк А У. услв 1-х фі ет оких м дику тт Ко па ож щі ле слави У АЮ МУЗ У Ба КУТ ОА ЗАМОК АЖ УКОСЯ по Їж сг вх ц Кона г ВНУ ІТ ами пи реж ж Шик Мито домтж ХХ ту хі мо тв я Р Хмара й ше Ко ЗБ г аж ім мВи ож цу ф ВО ст о хУщЗві зе а п ух
КечиН кит «оц ов З Б
Жодні лІлу т ххк ЕТЯ тю Муха Дня щує шо Ж лов | хау М тля до їі: да ти Щі ЯМ их ВУ Марк Ж тод ек па ех Са пам му щу ЕпЕ тує БК ДБК ЛЮ Аж ВАВ ще шим Кт с ЗЕ ак ех зусуй
М дО ек
Що ль рел ТУ хат Ж КА Уже Кк дк ся. ее кожи я и К ко - жк Ж ЗУ ек йо СІ те ту Ше ГІ Ів Де Лошк Бах токц кре вує ЖИ Ше іх шах Мих ее і сь КІ Мо а п о І М п З Я с а Ста м ВЕ ВИКЯ поки МЕж ді ін пк зх Ач таті дог
КЕ А4пО ВШ КОНЯ с ея отит ик Феихоух век тк ож Ук у ха Хи - вач пк р; б Я плн оди ми т аж Ко. щ- пу бу жі: Ло Фе М ОКУ пу бюд пе зх Ти: Пе що шк Тих Му сш АНУ шу ск ОКР у г ве Сх Ж ЕК му МЕМ м мА ОАЕ Мох У шк дого чо доп, ча пл дог а зала АХ су її пеуєкж й жу Ук АН чн НН НН ревно НН НН подо не 1 Ме БР: по їх пк ТЛ ох
КУХ Ши ж о и я Поу ки нн М нн в коза м о м а и п а и п М в и ЕК а о
Ве п ОУН пух ЗК ОА боєм Рі юю и и нн он НН и На Ко На ЕН НН НН
Бо О АЛ мл УК ої козі после Бер пежЖ цецпо ве ке хау так дод ки
ТІК я ца
Мо ух ях де жу М пятожо хо Й кеш г - ук р я сх ху ач а Тл ж іх жд: сти. ул ліку Ше Жде Ех у ше им З Саме гул
МЛК МАХОМ КК БЕ МОСК ЛА КМ Е КОМ жЖмох. ел КД ХштФ яті хх сх жа Ух ху т с дл я о
Я С ІНН мл ї т Кк ТТ
Жде Мне с жу на ж Ь Кок кун ВІ. ен ше ее КН а НВ ХНН кар А У ХП ЮК ОО ж яю ЛУ ЖК ла іп ода шо мах Зк т ге хх г Бе: ле а я т хо - Фо ри че т 3 : Жіету ТУТ сю Гостро буку Мт Тихі от ую бай Від ге Тек щік ів БУВ Мет іє ГУ Міф бий ших АЖ мА КАЛ мах. ма МЕЖ УК сід Ав уд МОХУ ж т ЖК МУ шу ха. тлі МАЮ А у МО Улас УККАЮ мух яд і; К: у хх як ї5 ж се і я Які ск и и на НН НАННЯ 1 п : " пк дух Кі хи НЕ у Ма Дюк Пе Не ТЗ
БЕ Сет Віа ак йве би) пчжв о бмую із За йо Ма жа пос СУ пет МЕУ БІД щі Миша ЗНЕНа а а А сх У В В м в о Я ЗБ В: у
ЖК зв па ва пе ММ МА хЖ НАУ х. т ще шк г и ПО и І й х сЗ сег їх Фах жи Тотугу тру них
Кк їх -кої тр х Ше ку бу 07 их Муху: Фби Тоїх; піхов ка ж о щі ше п БУ Тк ода вка Тих Бей о лбве о Ті бах бек Пво щі ВКе мя АЖ МАК ОХ Скорик ам Я Х . ! щи ЕКЗ ах Аж
МЛ о
Ві пл ях г мимо и пику товії ФО плюевО УтА, СЕк их
Ух. В джу Таж МОЛ КО ТИЛом пджя хек гу пох По п ква тре по еая сеї тиж по фу АК УК шк ех ек зем У, й
З док п яц рев М ща - сю ж пери туш т ша ян НН: В АН ч х - га са Чер Ту жар 0: Тл Тло док СИ гаї Від хід тк вка о щі« шлт муч ств їдкща уд пі тіше ж АЖ Кук У ЗНИК ЗК ЯСЕН А гивЕОовмце бує БІВ ТК ев щі І Тік КУ У 7 Щі ик ери поикю рт та
АЦІ ПАТ ках
МХ ке т ех «о т шою ОБ юю . й щ-к -у я ух Федів Жорж ЯЛЛЬт ж жо Ср ууро 2 до ту 2 пу туту о Зі ос? кт. Буль Зак ні тросі Тан) Тож од ю. СКх пли жа БІ дО КИпа ло Ж ми ЯМ Її ли ла І у з і: ки шк УА ІМ Їде шен ОКО з г ї код мч хх 115 їх 15
МАХ
- рад -к ях вир УТ хлоа кл ге хи хи бжхк СВК тим Моляко СЕМ них Ли м ЕЕ І Аїд тм оміе Ме У ЕІ Оу ге ОО ЛЬШшРАК ЖЛІЇ МЕ А ух КЕ Ка Ко І о У
КВК дхаля ОЖЕВИО МЕИ. мМ МАУ МО ми ЩО ФА ЛІВ АХ УХ ме
КОН ХЕ ІЗ її ОА А чати жахи р уч Б тет Ба Не зо юю шдасю КТ ях " пд х хг: Ж ше ж ам ЕХ сЕйУх Ух: Дохі тк у
У уки дж Пп Таж Ма у ат З том піч шех іс йхв пе (іл мм ЖАНА БЖД ми ОА ЛМР АК ОЕМ лет мк у У мух м ВАТ ОСКЖЛЕК МИХ Ії в т ОЙ «и
ТА за ТУ іще й Ь; хі жених хх З КУ Х
АК
: я г є: даю же ТИЖ ю о пи их Там Шіхме піц о ВекоУі їв щі обі вав обек оце Аж ПЕЖО ТЕ Туш чек інв ШЕ нн а а м я пе п п М СТ в В х у ме пр ок жи ВИНИ НВ ко в АТ я 4 зо ес, их гоххуам ЗІЖ о бу ХРО тех ж
Н - : ен нн А тич МУ до би Ху! ях
Зах ТВЖ їм ТВ демо Шеї Був діа бо УЮ 10 пу Ні бу УВІ тех
МІЖ ВЕЖ АРІ АЖАХ ДУЕТУ Хо ух ААУ Хо З В с ЗЕ, чл 1 Зх 1о 4 : К кни нн З НН АН х хх сх СЬшИ тт ху фах пор но НН НАНУ КЕ КАН
Мі ооо ші буді КУ Вів пів то її щи Мат ще МБО УВІ тп о ке 5
КАК Ж МКМ ЖК ТЮЛЮ А ММ : 7 мч хх. вч як
ЗА р АЗОТ кА - 7 хх -х рок чн г шШтепу боту бю, у хк Б шт: шТМпОлУДІВ ХХХ хх пд ЮА
БЛІН
- - « лхх щі су х Ух кю Жені В мук Й ри М лу
Я я. Її їжа фі Баш тбжую Мій шт іс Тена ук бій мів
Ха Дух бук се о тиві Та ВМО БА ФУ І ТІ с АВТ ЖУК З З
Мн АхЯ БК СУ днищ Ще Би Ба ЮЮ ОКО Х
Я що 1 НИ т: : «в ще 5 - - хе 5 хро х мхх хо у етоду кт
Хіти їй ДО дід шт хю біг ку Пак ої щі дк Я шк Си Му С
ХІІ ТАТА. ЖАХ А ММО ХЖ АХ Му А АХ шУКІЄ я А Ж КУ г уста у Уж 2 шо в діжу ши, - мя ке Ух вн нн НН М сю СК КенНИ сет гу ух мак я ІК ую СУ ду Ми о Мих БтрЕ ОО б В Так сх КЕ му са ху АХ х щу мк у САМ дамо. мМ. АМКУ О дя. у АТАК Кок зп АКА
Хо а Й - не - що Кя т еру БЖ тк п гостру тону Ол пизди паж лк г вн о І НАННЯ со їм щі ха Бі шо мі (ОО Сх
Кон нн З в В Я ЧИЯ рем я ЗА З Уне І ШЕ З Я о За в и м п м о а п и и и п в а КЕ В М хх пог пох ще по ЗИ ше
А ня т ях. Ко о наше я МУКУ у. ДЯ мн жен кеВ паче Ха ох Тож, ТИ; У ож
Що гло ав о ЩШевлахм Мр гу Хі ТУ ві вк ім ді В; ух ЛІ щіІМ кн ЗЕ с На М В ВИ ЗЕ В У З о З Ма о МЕ ОМ НН М В У М о НК о в В КО КМ оо ОН ОЗ оп МН п ціа
БЕЖ: їм їжи м вх чех . - ох ет і е ско хо т а це ср ях я сети І я Боді бою ЩІ ро Ж ду їла км Довж М цю Таз: лу мух І у НК плов із фі пюий Мімвм 5 СУБ Ал міщ в ВМ Бім КО Кущ гріє
КЕ, ТЕ ра
ПОЛЕ У шо й ж їх ре т стек отит поки «г рек ту і к Уч от тора пи Ж с
Хан а и ШЛЕ Х ЛІ Лю зош щі мА Я х ви КО ща хи фі 0 ІІ
Ма Еш сте й о У в ще Ей діа в Юлі КЛІ иа У а А М АН ут УЧНЯ З І: и тлу ВН
Ек жу КК пт . ех я « пт рута - ші пе ще ху т 2 ях спот у Ху ниж СТУ ую хи у о Нв пу аг тт юю ТУ; МІ Мує Ши бе гу лах жо о зм ЯМ дл ж аг А Моска МА ше УК ЖБК Ух мк чн пи ях
НИ НЕК 1
МУ ям дОхА тика зх пт ЧУ кож Тк кою ан нн на і а НО НН В На ОО НН тях пев 3144 0 тео дих Тих Дюк ФТІ дк ЛАБ аю піка ЯТІ ко Мк уми іш: Мих їз: (11
ЖК АТХ МН а о у ЗЕ ЕІ Уж ЖК хну ЖЕ МАВ ДОЮ СІМ МИНА п. М поожих а ЗЕ з дет
Нива 5 іди
НЕ Н У щи
ЯК; вже ДОЛЬ
ЧА ШІ как о я нев ен на М АН НН НЯ и Нас АН я
КИ ОУЕН ї Троє щЩлує бе їх щоб лок Ех Бойл МІУ кози и и ке мн о В А КОМ и и СК п У В ВО о ВИ СОЯ пе осаді дао шк яких дод док
ВАТУ ЕКО інет по
Кб ПО Кеш о; ля - . ї мя а ун кн ен не АН НН БАНЯ рон пк и лю ди
Ти фамаї 051 б Мао що Дол до тує че Уд УНН БЕК: ЛУК пк ОА до щі
Нор ех мив ЧК ОПО о У НК З ОВО ЯН У КИ Я МО мк, оч нь М МАК ги У до по ач 1 ВН 1
АЖ Ку о 2 и А А НН ЧУ 2. чі м - и АН п чан и НИ тах жк до а АЛ я тим СКМ Моютр тім ти хо лі що їн ку Її шк Мід
МАЕ мл УЮ жара же МЕМ УМХ МЕ МУ зУШ У іно НВО люк ЖК ТЯ порту сич хх
НЯ НЯ ЕН о яти жк кт, ще коляд «ху м У Н пооуе х т хи еп. пк ру Ул НИ ее дЕМ ЖУеЮ (Л у: ау ма Бем ДУ Мету Туш Меху дос Ту уст 1 сих
ФЕОУЕ БІ Е ХА РУШ Мий ЗИ лУМЯУ УЖ ХР ККУ НВ ХО КА СУ ХК К УКАЗ СМАК БК пох туту ту хж начня УК гук
ЇІ М Ії их у сх «1 У их о м У о ам сь ек ех А т, - щі тим Туя Тих Щі йо Мн юде Жмух Мет Ж дм їз ЯМУ ну ДБ т т х
НА ев З пе я и М З Ах ПИ М у ЕК я В во М З І В ЗК СВ и и х що ЖЕК Ту А АВБАІ ЖАНУХ тут зак пуд кА жи до вн бору ту кози яти жо, ххх вило нн нн ВН ЬН мож га зятем с ен НН аа и На нн а и в в НН З ан НН НИ З Ве КВ НЯМ во мн ж но мо о не ки в я з м на м п и Ел М но з я в ЕМ а нь и В я ша хо ДІ КОЖ тд Мія шк баки КЕ Тюсте ЗрЕ Том; біз бихуую Воржк Ми Жвма їТ1і4; бом їх ша Тел ех УВО жа жк са меш УЗ А ЖА АКБ хе АЗКМА КУ Ж АЮ МИ М ех єв тих
За Ка ЗК де ку ждокн гу тя, дя ноу хх Ку сть. г щік БЕ те ПМК 13 КК тя
ТЯ ОК БАМТІ. гамМт о БАК КАЄ ДІ: НАШУ екол
Кая
ОМ од ; : « з ех н хх дп Я щ с х се кох хе щ міш е А е КЕ О УКЖ ШТ ДІ ною Тл Та ен Мр Ту. ЛУ шнуї 0 ж щу ЗМ м ЛУ Ж кул
ХІМ ЧЕМ Її б КІМ СА ІЛІ КЛ МАТ буки ж. МАО да АК М іх - е пог жк : У НЯ 15 и ду и тп киш в на й ЖІ яко ЖЖ шк б Мк ян у мі ях,
Р вк лох де ЕМО их Тов: м 2 М чок ТЗІ Мине Маю кою тво долу оч я нн ва т и а у и в п м о п п ж і п п м м в ск хі ЯК КАМ АХА пе я Б
М шо ня
Ул нн и АН ре нн нн НА ИН Маха й аю Жук тут А СК шк тку ду щі їж пух бу ту Вт ЯЗ ТІ хі ЩІ 51 ІН не Н з її
Кен ЕК ВА їЮ УХА ША КАН КАХ МУКУ ЗМО ЕІ. КК. Кмип дО аАМА В ОМ ЗОМ
Я дії у ях ко жа -к чн - - оовхх т. ши ж ох У ух ох т х ші ух
У Що ло тм БОБИ ЛЕ М Тем ок ти о БІ из Ак щу лід
Міг маш А ВО що ою Ще мА МАХ о ЗМ І ОМ ТУМІ хх се ке шов. з Но ен х т шо дк сан я Ша АН кою ДУ у. Ток туя ум дя ою ХУ Аа
Мо жи 1 Му СМІХУ тиху ІЛ Та ТУ и бу У Ту У жи Оу х Ні дов їхала дО пу а о ня СМ Са С ОК М В М М БСК ЗХ З М ЗК В М МИ ща Оу я т їх ши
Мем ги Ток КЕ х пуф м дути м ху ее хх паї тА п ше ке Ж Може ЕХ пух
Му ку І Ку і ТАМ ЕХ дл тора Пд Мі Не Маю Хувух Туш їх КУЄ хи. МАМО їх СМ Ж ХО МКК хх уи ОА СЮ МО ЛОВ А АХ ев нн а Вк ше с ОН МАУ
ТК щі БЕХ
ХЕ Ко пох іду бро лу Жду Ж що Му Ж шу ЇЙ 2 КА шу ТІ А нн м НН ВН НН
Пк у ТР о ФщІ ек йо 1-0 БК зожя ХРО й ллілі Миєт ех ЗА Кі що ІЛ на 171 їх ж щу ши мер см. ашК сю хи Х ЗК: ж час хпдла дог т зок пох
ГНН НЕО ТУ коми сша а ско КУ ел х У т зо їх пт у г Ух Мр ух ль кю хи ж прес Ку ху ВО що от люду Оу тан му ПР м хх ух 0 3» (ях ж хх Іа а
КН Оу ло ММА АОДУЖТ ЗИ МАМО АОЛОЩО ЗКОКМ МІК зд и у МКК оку ла ж шу УХА КК 1, ід Пов ох но ект х вх е сх - М вт п ке г - пт Ух чо вх ху. пожи пршжужо бах Ту и но нн и НН ик рожа Хати Ти Жак ТИ їх не АН В Іжа КК юки КІ ШК шкК ал БМ мо 17 Зк СН
МКМ Ал Ми ка я п - Жуля КА якщо Жим т - чук худа Сюди ої ту хор Хрому
ТОЖ Тиша ік Ку КУ ух Ми щі тт фадтї їлК Ладу хати ох ее а не Дт КУ а і о ЕЕ В Ме с В а КО ет ьо ми мк Ко м ча і В п В М В і п о и п и о КИ лойщц що п З
НЕ еЧНоч НН ТЛІ ЕЕ
Во х виро Інв а НН и НО сф не кни и НЕ нь иа ОН
ТР о тарі Ми Та бік ОК ух ОМ БЕ мі НУ пе щі ді палат
ТЕ без Ме її пе Моз ТБ обо бій Уві ТВ оСує в Уві Уві жо м Аа ХОБІ тк шШкове мая ММК Мухи ж ТА 12, Тозже о ЖукМіхУ ойоуму Лоу б скю Хйї Мтюту. су
МЕВАО КУА ТхАж ЖАВ ЯМ КК МАМ ох МУ Ки Оолое Км АХ ож и Ох че З і еН
ПАК ясень Я хи чн 1 ха ТІ Ту Мо Ж ох чу Жодтх тд Тесує а. м їх з кВ ГЕРяч ле ща
НЕ Тр Хі пл до бю фут ТІМ Тк Уся Я ту уж ІА Ер Ір пак ТКщу
УА см що В аш КАМ ов п ДВ шЕшщ А Ма ІА АТ СУМ АЖ хи ик «ук
ПЛИТ НН ІМ нн чна Аа чин ни и и НН и В и НН А А НН ОК Нч си у «яко ки М я ех т тк т пі у ха Мох жа МІУ гу КАТА УЖ А «ха щи МІ ІДИ щу БА МОВІ Я. ДЕ ООММЛІ
ЕН Ах ЕВ
МАО АК хи товутуо Коші КМ ко б Й шу бохо бек богу АЮ мк Міо Тлахо Щі до із у уч
Си о аАЯЙ зу ПУ ша Сук шу еВ ОО о мщі ее мА МУ в о мМшМ о ж стек трі ух студ ск, а лу зай дек я Кн ОХ пол ше а ВИН НН нн ве НН У НО Ул аю тля ЩО юн ПИ 7 у Фу: А де Ту іа Ка жа ше ВО ЛК ко шко ПиМмОоА Ма БУД АК М ООлЛЬ ка лук ЮК лох сек их «ши ФУ «КО я, ОР Меч ТК м. те ок дух ож. их, че їх ах. т ик т 4. ТЕ У см вт жд пк сяє т свіх ее и буму бЗде мо фея ат Щі Там ву Тими Мк
Еш ть мща ЯК ЛЮ М КОЖ КУ ее О Ки Е ЛУК си. БК ОБЄМ СКХУКО лю ХЬ ХОМ т ЕХ, г ям щих! КОЖ ОО; тю ж ви шо МУ фата б ик ЕК тік МИХ юю о МУ Жаюю ех Хі па МД Чи о зим ТтрЕ аю Там лк Ти с рих Лю зе; ЕК ФАХ Ті шим: ММА НМ МІЯ СВК У ЛиБТА СУМОМ Ж задля КІМ СКУД ХК с ст АЛ хУХрК суду ух у «С КОДЕАНи
Ач в ня нн с Но НН НН АВ НН НН ШК НН Не
ЯМА Кк іа МО СМ зала ЕМ АВ а МО Ха ОК со АВ впору ПУ СТИХ
НИ ване БАЧ
МВ. фуд СТУ че НЕ А А ЧО що луки М хх зртркчи й :
Пік. фл ді ктх ЗЕД бог Фк Мих умів: Алое ве Ше ЖМИх Та СБкж. сідшок бах
ШКО Кал ЮА Уж. одІК ЖК сш АК сам а БА я ММ АК аж щи ю
БУ дл ше па
ЯКЕ ПАЛ ЗАЗ пл тот пу якщо отак х р чк ук в Я ши чен КА НН НИ ЧАН
Кам Мою его Бисх Шик доку спе шт вх, гУїдУ см ді Укр: суду го
МЕМ СБІВКО жа БЮ Сухе аЖеХ Крок Кт Ла ХР зимою ям ВА КМщо ОЕМ уЗ паж зуху "ук па ЕК Я шШсук їм ма Уа де ії МІ сім Мі що ват Мі щ пжуми б й ж зр ЩШеву Тім шик МАЛ п. КЕ АВ ож мем ВОК ОМВО У ХК ЖхКК АЛЕ вух ошшк Ммш лю чих зе я ХА я тео Тані: ер о Ше Би бод зеещ ша а што шим т
АК ла хм ух томі 171 Мр и ФЕ ж» лложю Тл яю Стошхія Ха й ро лання тю и ух ший що ша Мж У зем ше Ам ААУ У БО жах СА ОКО мМ шу
ІН М З Ех ок
М ЛЕ Іл 17 г ож нн АНЯ фам Кл щої їх мех пд тк, іх У х ня мк Жду жи ші Мн. ФК дек хх ШИ Пк ЮБає шко Мету Лімо кн а но ке км мк нм вх а кл кі и Ва и з о в В в і п І В В і з Ве я За а я гу тек сет
НЯ яУ пи ля пе НОчН КЕуюжя, 2-1 Мис КМТ ПО Дт ан Чо и ач ЛЬ УЖ, я, ОДУ
Має мещ сту Мі ух гріх бок по бли фіз Там сліїв Ср ХуУщі
УК У МОВ п М М и о п ВН екз КВ М о В о м Ва с м НЕ З ВИ З ла. мок У
УП ях М ро Еко кс Ху ш г а не Ко. Фах По х. вин тут л. жити Ве пе - и м. ж
Мій Би Тра б Мі 451 05 МІУ Жоснї пу Ті хни тк Ід щі НИ г
Уа ДІ доп а КАТ в І В МНК з КЗ МА МАВ В МЕ ПО АН В иа ВЕ ЯКІ Не н ОАЯ що Ок, ФІ
Тор же с днуж ТМ ую Я о луку ух Мам му Мо ж одусю Моно Пе Тому. ТИд ж дит ЕІ о щу у Мін ГК Тож ЩЕї дж сх йому о тощо ому ЩЕ У ие: ТД Хх мух о шваш мЕтш же их ад шк ж лев а тогда -зУШ БІ: ЗЕМ М Кук -кї сх зх тм
МЛ НЕ Ка: о - ях ч У то Ус х . -о ит ся Н ня ж «с жи
Хоші Лну АддУк о ддек ши Тідаит о доти ТМ що ля духи тю до ха дя Ск їжак
КВ се Я І о М З А А на З З З ЗИ М КО о Я С МИ НМ а и НИ ЗК У А ЕЛ ЖЕ АХ ще ще, с Зк вом о НН Б В Се р не но не в Не а в НА о на
Тло три лух ок Кама Мох М и НД "лі ЯН хх Пн ПК ЕХ лою МІ; яМИЮЩе ОКтТАМ КІ ККУ Ми ОдО Як НВ ТК ОХ ко лм ме ми МАША Мох їду МА ЇА ЧК
ТАТА ТЕ тро
ЕЯч ДУМІ у п ен ЧИННА сиг. мк Шен Й ке їх тихим СУ щ ха Муха, Ге сода тА
Мк Сх хо чт щі БО я І щ шу Пе Тоши ШЕ УМ пу Ав щі ШИК
БМ КОЛ Є ож АТАК Я А. ІМЯ ХХІ ла ХЕ ЛО Я КОХ ше м КІ УК. МОМ АЛ пох г їх ту ток хо пт кол киця Усффо и ЖрЛю ато кдд т пд мл мом жу йжегу бот Ві шви ба Масу Тк смжуу а ах с Махже бл дк г пк М Кох
ЖЖ мжМмоА жЖЖО сю ее дмш ОК КОХ щем АЛ СУК А ЯМА ОО ОКА чо ль хи дом АЙ Корея ану не за Ше НН Нр на иа А КН Во в нак Ше кн с и и М і В м с м п с с п В зн м а я и З не В з В НВ З ИН ЕХ ЖК И А, МА де За х пи то
Ти НИХ МК Жу АЛЕ дл ше сту Бе тар о ак ія дл Мф тру йвуа ФК Длодю йду и аапо лес му Ак Ж ТС МК слу З ЩЕ ЯКО Кл шк Ук у так «тА дек хи -к Бкшя
ШО бому щу я лк тож ТЕтЯ ку хи Зоодиних оо ФО ус ху їх хукї (- чн ми ти па. док бла ж 5 їн бек Бек о їшир ех пе Уві УщА СИХ і Бут ат сх «її пото
І КОМУ ГО
Ка МО їмо пе ще т шир тих вт сх т -ол - х чи Не тс т шум трек о НМ о ХК юр Оу ик кКо Ім бок ак ті Ск жу щі Ап Бик ому
ЕКО МАХ хи МА У ЛУКИ ХеАЇЮ КБ КК лов кешх МА АТОМ ул ко тк тт жи
МІХ ші єму ки ші кА гі: пн ІН АНЯ м ок нн де « х- як. хошж фл
Ск бух Маю о Бест б Аг ун о ення на а НА а НС НН
МЖиИМІХМИКО ФМ мух ж. ЖММУМ мим лу Ж ЗА МАМО ЗЕ КМ УК АЛЕ ау
Ех хх РИН аУ «А КНУ хх тиж. мо 0 що сно яю Ж мито ка й их Му учих Ж жари Камта. булу В кю їм йти мло Ср Км год Мол ром тк кт ро МУ РІ Тдиху Гані 1515 ТАК Мк 11 лЛ: АЧХ Ен а и Ом о и ОК У МЕ Ко В ЕК А В НН в В В В КМ чити пуд тик, а пом Ту ОЛІЇ М ООМу Ба
Ко ше я У з г тк: сх по Кия т. їч ТІ т ще Ж х вки КУ сухі Ж хх. с Мен т і оо що и ячКЯ лєМі мете МИ тих Кохих. Ка льш Хо мож шу АЖ ох чок
ХА о УшеВ ЩЕ шт ЩІ г го мущо же шу ти з шшА ше аю шу тих, ох їх як
КОН о Ух чу
АТ «о ай х отих г як хх ту ях Ся чи фтн ве ту Ух ож ех х
Здачо пПамо ЗНА 1-7 Мом стляюцю Ж РН ким ших ЗА слух дж у стуку хм Не МАХ Мт могу хХ мису жим. ММ жа КАХ м хи. ЖІ Мк ЖД АК соки ож ху ух
Б по кг бус Й я Ж о У мо Чмут 17 СК жу Ж т Ю.Ф шо в пу 113: ща тіл ЛІ Доу пе леж лк боту їі щі 21311: щі хо Дату
ККАЛ А БУ клжш ММ ж Ооук жа Ва КУ УЗ САМ ОоУА пАіФ АТО
ЗЕ КУН: п
Бен ОДУ хуй рН отже Зі, п Жожхи дих, боки Тк 1 х КТС ж ВИ х пан Фа вия Ста хо, Тома 17-51 х ких Вк о а НО У Т.к кі У чек жує бурю о СТЬ у пуд ложі Аз кумом дл АТХ І коп а и в А ЧК Мо С КО Я п і С М ЗК М КК ЗНЕ ВА ож сихх її ж
Ж ах за ту
ТУ КОВІХ «КУ кА ЖЕ юн ХК і но У НЕ їхемі т ж 3 о дж уєш. Ка ДашУю хх бах І шк хихІЧ. с ІМТ. ХА Улаок о дзктію БААЮМО СХ ДОМИ Кл. Метод ЗАТАЮ УДО У дух Ал тки КН пап ве
С УНК з СНУ
Клич У обу : ши и АН я іще СК х жи хх яд ке УА бджоли бтяуєу ох її ую Щжуту Тем ЩО що т хх хаті А зх зх ож лі цк
УЖ МУ Св КУ п ЗЕ АН овмУМ МІЙ ОБ ЮІО лав ЕТ МА Ам мух сіє сдмрт ел
Ук М ТО
МіМІмт Жо ід дз Же ХМ жодуні уру ихХ пу Сйомохя ЕТ я Живу ку и их
Ук Тл Щек о тя ЗУ ано бордо Є ху з Ше, докт гм Луруу о, лих пі
ФК ЗК Од ат до ух яма о аКухМ ВАСУ ММК КЛ БУК УВА ОХ ША ОХ АЛЮ У СХ Кк х ВИ три жи УЮ
МАР ВН у
Тихі; ФУкКуу кі» Кізж ДкгпрощитУ Тіз б ЄьУ їжу вт щі Мало ЄЮ їду БЕ
МЕМ ОБЖ Кто ОХ ВЕ І У цоолд СжО ЛК Кт А за тьЬ ка Ж о уп
КЕ са с кої КМ мя вне Би ях їх Н дит ч гм пи Ен ник не о Моди г хо ши йеЖж хі жи й а а и ня НН НО Кн НА о о в НН о Зо З НК НАВ ВН ЗНАВ
ВН І НН С у Ен М М ЖЕ и п А ПМ п м ЕН В ЕД А аж СА СУХЕ Мох
СЕ Бк зт
І Не: ТО бло Во ха 1 у Зі у іх Мих буку болем ьимо ЛУмоує їни Шууиу сачЗюЬ Ж я
ЧЛ УТ сем МІ ех та жМОТЮ ФО С цу гриж Кл КК ро Фев хни
Ах п зах СДН
Мои, НеУ іх еле ШУ М т Км То сот Хли о т ких т пух. - й сть У ожан шкі ик дат Ж Б Ма раму Пехю щу: Тиси тех КФбко Мл йлт Гблхв вихо ЗК ЗІ аю ж ЗЮТЬНи м Бий ЖЕ Ки Му шШешжХ АК ла Зав мух ягВ БІБ СиБя
СУЯ ЧК МКК реко а НАННЯ НН НВ В и НІ тих бе тях ОКУ хи Зо МА шо т: а а мк не оц м В м В п о З В І и В хв В В а С В М ДК и В В ЕЕ В ЗІ поту тю а стжц дстх и я ВК
МО хащах ЩЕ Ху ме ВА кі Убзііяк ТИ ую МТ ух Тоуєювкі шах СТЕ Зою божі. и З ха йошме АВМ БО вл тТ ПАВУК ДИКЕ АЛ О АРУЛЬ ЗМО ММА КО ЗА еВ КІ Ду ух СВ ак ек ху о тоб
Аж я чн нн АН НИ мене НН ІНН ук -- ех ух пд и я ЗАЦІЯ Мих пре прі Мі тім Ти Мф сля ало прю Її ме лі яку Ти щі М Мем І ЦО Лі ху
Ум мя М ХЮ ММ тА м М ХА мА у мова ни п п о в м в В по УМА 4 Ф я г ж х що во Кн ха Кал дня Той: дім стеж. уз хо де ФІ ду ЛІМИМ ЧО ою ІМ хни щем іх рон нн я за о м но М В и В а м м а п м а в і м в по В НМ о а кн п т В В МЕ я уд туУщ пи «У ше я ул ози КМдек і що бут рих ую щі Ви і Ж діє їі СХ сим, ХК кА ХХ МАЄ іа 1 Ан ЗО ЕК о р ІН В Не НА НН КК КО У мМ КАДА АКА
Би Би най нки че Ме тощо их тла щу. би 22 Так о соккю дя дав КО чи пмум іх посух леї ух тя Кл ДАО юшку МК ШМК МЖК м фу ОМ А А МИМО ІТ МАХ мо міт кох лу І т «Я хх шу
Ук ее нн ок ня ШНЕК «т ж тА В Ялом ща ле : о ток ІЛ 5: омлет лм вою ро ак ух пух дл ві тах жу пив а лак
Му юку А КМмж Ох аж КК АК Мммю БО АКА АУХЮ ЯММІА БАК мМ ОРЕ ех -х ик -к я т У п, їх
ТУ М КИ реч тощо їн Ми шо Му Там ому лов ти т3: Дах Жвоє 014 гл Чі аку дк
Вип ХМ ХР ЖИМ о ек: ОХ МК ЗАДОКК ЯМА слліМ ЛЬ АІС. ших А Я - ИЙ -ятг тт я їх У хх -х Я шо У х ме: -- - з. - ня де ж ее ре п о дих Мазок жопу бу Ліка пах А ЖЯшУ ко біт лає тку ТЛ Ум ГІ Пп хг їх г БІ Мо ЖК Да ЖМА Еш КК ти ИН АЮ УЮ їх ца мі ск юМ ЗПОМоу пот Трою чі о ен не
Му у. лі ЗЕ Му ху Тим бує ТК Фо ру Томи дк учи де хі ХУ: хо це Ма бак зла їМмикК ех Мій ек бу Беж рі ЖЕО Мао: Ва ччк «нг «и іх М док
Я Я тп А Ж я. шо, їх и г их Ми. пе я ля с Фу Я УЧ Ку ТО
ЕХ ПКУ ЯН Тло да ВХ, ІА ча о кечнНе Не ри ГУК У стер у жк КО очи хх и к.мКТі ен НК М От М о У р ни М С УНК МОСТУ ТАЛА ЛИ ЛУ щем жим ЛУК сМІМУ МА зсЕт зл тягу
КК УКХ НЕ лО, я и ш. Ки нт. пи в о Топ ях я ЛИ кн мо а м чи пу ЯМ веж п ре дов штхА ЕК щі Тис Ех хи ЖУКІШЕ уче тла БАКУ КД НУ щі ЩО ок пу ОКУ ЖЕК Ю махло Аухь ЯМ Я Ух жи БОМ ЖК спа кий ді БУО мМ «ПНІ БК пп ЗОЗ грош щи
АХ ОХ ЕК кя чок їх томі чу Форт ГК. я пло с т - и Я жіїх тд пох Ха жо
Фр ау щі ді що тет ЧІТ ложу їх щі тіл: тах Лак ю їжи Ко до Хі У ди
ЖЕТАВ УЖ ХУОМ м о и о м КЕ З В У ФМ о АЗУЮАЮ АЗІЮ АТАК КТ Фа ки СКМ МАХ «шк доки чсжх
ОТ ЧУ м
КВ ж ю БІЙ маш он прик її У Ж ся, - М. - с. щи ота рожа» ния х-. 1 ж СЕРЕ, 5 ВЕЖ Гени я ї пет Же ших ТАК ти гху Ма їмплі ЗАКО рих т. У МЕ КІ ЕК Ма ІК
А му МВ (фу Нам ОК ТАЖ сни СУК сиву У ВА ТЛО ОУА МК КНИЖ ок чощ хх стю б В ш ож нн на і но НН в Нв о КН ее В НИ НА ся буде шт Їх Ти тд Три пАМУ Сх Уж АТ У АКОТ чу Км сл пає яка да у БІК ЛУ АЛАХ СС мих бУуш ваї Уві вже ОЗ Му КИ пащу с МТК
Я Мои Же
ШЕ ох ТЕТ ж коемх Тан Ту ки, оси, у Б ті роко я У г М гри ж о ї л.
Щш кт ддг ПИ БЕ щі й КЕ хо Дю АД щи УЗ туго лу щи АК ШК МК
Ж О ЯМІ СКЛО У У що МЕ ую и мя бе З У уко ше КУ тах тю ли и ОО «У су п т т - нн нн НН АНЯ кн ее кА но нн йшла лек бли дм Те Б их 1; шКЕМ ТахУт 11 ху лем сх п
ШТ ЖІ жк ШМК хау Б із МО БІММ КИМ скА У ОО КО ШКО ОО пе
ОБУ НЯ тут БА ту «хи хи мики о ху ул : 5 ж т дрож дн : х жд У : тр г тод г блю її то де Ом з : тут: ОЦ юУ ач. анало їжу м их оче ср фе боже б тах о ббній бю у Ме пд ХОБІ ПЕ ААЛЯ І1хУ ШК ан У ІКя, щих ем КК нн РО Мах пл ях Мах ЕД
У КОХ чекай
Ж жу «С меті Ух ЩІ х ен я ни На ЖАХ ут ної ке - в яки прі Мдоі бврми так З Од мир шт Мод им (125 213: Доц хм Тр щі у ки о и В и п о С: МА ЗЕ З НВК М З В І Пи М Я НЕ, ЕМ Ж лам У цу ха «МКМ шо тут хІЖх мог т ких хм тт х их ж дж Аж Фен до жк - що оку сла. лову Лан Мо пвх бли КРУ шкі пох А Я ЖАН хни Вій мак хУклІМ Ху щОо яхУМма с АЖ жд Кол МЕЖ Мт. УКЛ жд.М о ДТ ХВ С БААТЛІ ЯУАА Даю КА. піку піжучхх му шт 3 ах ше Й ях «о то ху Жуусту Що алу я у фс жу. ТА о чи ние не у В я МУЛ
Тих й жю Ще тр отр щі: 1лі1х Тер хіт МВ СВ ха ги щі Химі ща лід а нн и на у а мн м в о и М т з м п в а У меш ни а нн о п в
Бе т УНН т тіні ох ще АН АНН хо буянуу Х ку Ходеу КУ шо спи шо іще ев на и нн Со НЕ ие о пи НИ а о в а НН З ев ЧЕ ИН НЕ НН и о НН
АТМ АМІАК ХК м Худ АХ ж Км мем о ям мому мух мкхш а УМ мух ую пив що ще т ких
АНІ К М Кк КУ ве Бе шНКе Не ЖЖ
Тебе Доу тод Б ях Ткі ЇЇ юту Шев; пПеку ї бо Куті; бхув Жак кедр и КК У о Я НО В З З У З МИ МО В В о НЬЮ З А ЗНЗ Е МЕ СЯ о ВИ ЧИ ЗМО НА Я туту у, пот таті
БУ Ж ЗІ хуй У У ж Ол сроже рю ту т п но я я аж ее --ї тих Жди кт тиж Аіщо о фойУущ гію опік пуиту. М Рі шкі лі ді пхеюм ЛК толку їж
АЖ ОМ Му У а ж кс С С м п с м Кн М А М а М КО АЖ МО ШОКОМ ДОМ
А тр к, чо
ТА Кока рОж є -х не хх щи --е - ее есе и ча НИ - ех ун и А
Ще М ПД і БК, юю ту що шт ГЛ ді оон пере Му Ти де оо аа о п нн ом КЗЗ у МК в МИ М пок о п а я я В М а п А и В ОМ ВК ук Бя «уд
ЗІ ЛІ «КТ
Фо ОЗ оую Хр яю ую Фо ки ва Не а Уч НОСИ сади й г. их трі Р то 33 Мк пли ж Кту и же Ех Мои хз тк Іі Вик дош ТІ пн я з М КВ А КО п М В В ЕК жено аа НН КН ву З 4 з у ве туге тк «у дктх
УЗ г Уегх
ШЕ дО Ж ли ви я, пог. Мооутж У и ж Я ення їм пухких, жиш. вік їв хх т ж ож Ст -. по с
БІ ко ЗМУ Прі Дах До гл Хм ВМО лив шШлету ую ХЕщО тод юшку іо іх оо ОВ ве но КУ КН о М Ж Х ха ЖІ У КАХ МАО шАКК меш. дю ЕЛ МК ФМ та у жене сх пи
ЗО а ЗУ АНО
Грраж жи ко ЕН Шіз: Битут ж пору А ЧИ тозур Бр хи Доу Кос ЕН До
АЖ МЕ о киш КИ МОУ К АК Ж ца СКК УК ЖК СУ ШЕ АК ЮК хх дО ас дІх, С де я ЯВНУ СУ
Ток. тло 2 С и чия очи В фея ТУ жояпт. сю ЯсЕу Х БУ їх ХЕ хе. Ж Том Зоо іа І тло ЗІ Я Кн ЛІТЕ. ЖМх те и Мо щи. МЕМ Вщо лі Мм о Жі ле мі НІВ пи: мА МЕ КОЮО «ЛИЙ МІ и. АЖ ІШТ УЛ ХА ЖУК ЗЛІ ПІН О БАХТ Хо ЛОЮ ХУ Уцо ЖхА«А ах лА ОО СКРОХУ дух логи яса ти п ща му УТ бю СБУ лі мо Браке шику ум б дія Шк Толя дм ххх
МК: Не ЗЕ ші ТАКЕ 23 НЕУНН з ТМ ЗІ ТИМ ВОНИ
ЖУТЬ юю АХ ОО АХЬ Муш ЗшХх мшМм А ШІ ЯК ЯМА Ху мух
А СИНИ чий
ПО Б ап ви їм КЗ ню жк вч гену с вх шо с г до я у як
НА Жар ЖІ м Лог Га НАННЯ о нн А у т кв Кн и НК ЕНН АН їжи лк КУА ше м НЕ БЕ жа А ЕК ОМ су Му ОА Х МаЮ ОК КВ о хек хни у
Е ня тт ТЕ «демо фр юю боєм М бе а В Мем іх МЕ й р В ех оп) СТ кіт: ОФАЖЖІА ЛА А ХУМ ЄжА ОО КМ ЖКА В Є АМ ЛУ М Мох шишок шт же АЛЛО ке ту в а: якос МЕ у мУцпх жо де ях тер ую ох щожУт У УНН Ач хх МУК Обох с ую НУО ки м з кт ТУ тою БУ А та. ЛЗ пу дещо вп ОпаНМО ІРО Кп жд ЕК УТ Мід Ж МУ АЮ УМ АК КЗ А М МО ХІМ МКМ тпоЕ дол А
ЛЗ їм Ме
Кот, НН жо. очи Мох канеНИ ож ничнЯ Ку дж Кожну ник АБ ХУ ки же Уж; т. ня Лю м, хх
ЖІ щ стику лою бик Му ШІ чі 1 де не да Лю п хе Тег ци ми щі вен мн в м мн на м в м ох Ок З з пл п З М о п М З п В і, п п о п и В В І ВЕ ВО ви ши лу ща я от х, т с лк - х хх х мл - х БУ У ту
Ток ІТ ко жу Фк ТОМ т зим ді ех ож бами ЛУ 1 що щу 0; уко Толі ЯК
МЕ АЖ ЮЛФО ЮЛ ДІ КО ЖЕ гУЖМОУ ЯМ ло Ж ЖИВ а М ух
НЯ ША ЕК, ща с ге гл с 4 мк ож - Я - ки -х му Кк вит су т та тек СУДеКі будети смак рам Дос ЛЮ Ж 27215: бо Ем ОК хи км и поч гу мя А АЖ УМО ОБУЖ р КМ. МОЖ ФАО Ж лм ям АЗК ЯМА ЖК ОХ НК А НК
ЕЕ сх У ес. щи пу п А ИН т. - х те т пд - те не їх пк жк зх нак но НЯ болю томат Тож м, Тіт Мем Му кдд ли мух Ба Іру І аю ж шАТ КМ О ММ мжи дих Же Духи мл Ух ХЕ А ЗАМ сла
МЕ ЗАКО а бури ФМ Хв св ж ом ЖУдюию О сх ир ТИУю Сою МА и них Іду жи тилу Пи. я СКК А КЕ ЗА КБ св мар сна ЛК шу шу КЕФОоеК ем кг хи котрих ж лок НВК ЕЕ
КА А Й
Ж доку Мо Же Тихе Що МО хх З она ен в НА я НА а НО НО РЕ НН
БІ фанюо жкАФ Ж см Юм ду ау КЛ ее КО Су КМ ЮІТУЮ КАК ж НУ я хх я до
М Коня Ко
АНІ з Я хо й 32-Х т пси Тс сс алое ХЕ КО ННКНЯ я хлсж і Лю я пил, "З є. режх ни ех тах щої іх хІ а тд ШК о а ч ве г Тр алеї ЖК ух нн С м вк м КВ рн а у вам М М з В и и А М ЖЕ Мох ха ОХ їх М чт ще оо пово
Гей щі жу ТЕ
ЛК чес Кеш ХК жу ик, У пе ж умі БУ яю тин ШК лю пеих А ту ха хх : т я
МІК хо іх: ща ом ТбіхалоЖщом І о СХ щодо лих па хіт Ві НЕ тоаж
Ен кн ва и ж В М з м З М в М п ж В п ПЕ КН В В В а М М ТЯ
Яоит ча ши бик ОТ Тк «.Щ У КУ: лож, Тел ух «У м. ях НИ Н Тр ку. шин, Жодхи Є шин ОК. . 53: ой КУ ен і ТІ Же го бе щако М фу глив лях Жили о бді: н шоб Зіщі Ід Че їі ом син
АТО о шва и МК мен У сен М Ех МАЯ. ЖЖ шк си, пи Ех НБН
Кн я мМ п 2 т пери ТК их мА їх ва нн нн ЯН м А с ак ол У КЕ бує КІ СЕУ Піх ГЕ бчхгш гу що ас Ма що бо Шк мух ск жна КО УБОЗу Лоли КВК Я ж ОМА ку ВЕЖА ЯУВІ М му Ко ри сплю сУуУх
ВЛ БУ КІ
Плстути од УтЕ о ве то. 2 -е Мо - х я Тов Ка Є, ми т т То - ях оду: жо лис Аж Тих Тихо щі Даю тич из до щі: Мк ГТ тик пущу То
На НМ З МЕ І НМ М МЕ І ЗК В ВАС КІ пом ток мує хи ху ги лях ілі 1 ії сін 21 оо нь нь х тку. Жахи іже ех яння пу нь ен оньНя лю у Вік СКУ чи ТЕ мих ЛК усе хх: Ла Ху Тют 1 Тнх топУт Ії ху сто ких
Ом ие: Са В о ЗИ З п о в ОМ п о НН ВН В о М о пл КК М о м Ви сх зу сук туп й ши хІЬЗ «АН мет З Ів стави Тед АЮ ДАК Зак ий учую пишу Ин То: В КО ло дух
АК «ше м АК ОО п КК АТО о в а не о км и В КЕ Я Аж Ку тю хх темп «ВО як «ПИЛ
Б ж точи Бач И чт АХ Тих хі піт тА вх пою Сон ся и 154 о АННИ де тьом Тег Іі: та тв же пущі ді ві дн бі бек Міг ір щеОУ вином нн и и ак м а м а п В нн п З и М п М п в и и с пк п о и з НК ВИ при тре м туту и я НЕ
Ж МАЛ хе шо г жит вич дю -х ме сту чи ЧИЯ кермі ШК НН
Мах тлі в Йде МІУ дотх у пхви М щі у іх ою «ЛІ: Мдіи Ма ж шт що см мМ ши АІС й КК Ом ЖУК м УА си ж ІА г
ТЕ, ЩІ У ой ММ ери
Що туш ТИМ О їде щоку їла 131 11 пит пу ж ЕХ ТИКИ ри Ку щі
АВ о мушок БУ Ко в лм бом зай ук шуй ЗК опх ій ЩО ХК Мою пуд кою сук 2 Оу І кю кер: Ас о сети г точ я т- шт то щу СІ шо тлу В пгт ож т до у то іх
Іза Ж що ба и А тим МІ Щі гу Нд тивів рі туш Лі «Ві шеюшЮ Ма ди Гл о що сим мл ол тЬ ФУВ НУ г І УВІ пу 5 ІІ зад Бак тах ср
ШО У -ВАЛ ВАЗУ пан АН о А и К - нич А А о чи АЕС дл зок
Бак и ітчуху їде бу шк дДмм іо Щі що тамгро дюрум щоб ТТ гі тус жо мух мм ду ХА КУ ОА М Сн н.е п МК В А Кп І ЕК Я буткх зах се и и Ся КАК зу м то 45 - ау хо ни 2: хх г ПАТ дя, Ач Кох ти плин сь КОНЯ п - УУх в и. тку Дн Ин зо М о Не я т. Тл хх дар. Ще Док їла ет їі хх па Туя ке нн ка с и СТЬ о о пк де а в м п и и В пз а и С п в м а У пох МКК пт под Й Заг ал З МАЯК
Чом ек, УК дю Мне ю ушу КІ ж год ЛИ М а тях Аа тра у дю дя ж
Ка віт г сЖК ту МОЖУ ші Тут ОАЕ ЗІ 5 В ТІ Щи Н вен В нен о зам У С В а м в а и З НМ З В з я о а п Нм и п М І ка МИ ЕВ поко Пп цу
ХУ Не ЮТ ях. м пи и т гу - че сх А Ух и и НАУ п с тіж тати М гр ки Ка бане шву Ма дух ти і ща їх кро пютю хі мем МЕМ ЖК мМутТт сайся Ж АУЖО МКК ши в А ФО У ЗАМ УК ЗАМ тт чт треї
СН Ек пл
АК КЕ ЗА
Фо ії її тех уже їх х Ура Мк З шо нщео зубу Мун ту сх м
Яцик. Йлім шт сх 0 Ме Ії33з ою шу ПИ х тож Чтв сб 0 У ту бю жк тов м ж а а м о з в М а п С и и в м я и М і и В З ЕК М М В З а п п ер ту сту СОНЯ
Му АННИ іч ДІ шу и веж М п
МК -, жо. т. АЖ Гм я. МАЛ Ах их й к ЛІ. фе я У 5 їх аж УК тю ож, пою ди жі; ЕК й у ЛІ Кк дух Мішки фдах: ЗАКО СУХУ У ШЕ ВМО ші ли
МІОМИ ЖИМ ОА су Ел КВ ди УК цех ее з тп о Заа А штК МУ ле зх як
СНАУ а пік я гянах я
Пе Мк Єчлтут С тю ТТ у ОВ хо ОТю кік ху во в о на 5 НК В ее виш ОА пк Мих ї ї ті ла 1 Два Зблрі их Ох хи паж о ми ; ОС: рем с ев ИМЯ В ЗЕ ЕМ СО а ЗМ З ПИ В А З МЕ ЗК ВЗ с З НЕ с Я М я ЗВ их РА Кг рот п УВУ
Тк НУ НЕРЖ я : шо 1 т їх тк яке ту Ом Ху Фах ти ие т свя дж Ж учи 1 до
МО Її 3 13 хо М я ж ке ик ТІК Тв іде то М ТЕМІ Худ МЕ У жів Мена ЕЕ МИХ КА МхкКО КАК МІУ ДТ «яю Ма ЖИ ДУМ сип КАМ лок дк яд й
Я Де Ех
УЗ
ЕН з З ях с ех У ен нн ен нн НН НК пері ли Уроку їх ХК ТЯ ою ЩІ АХ дух І та Мо ЕК Кт 21 ху пр
КН СВО ве НН В А С В З М В Я и КМ ЕС МВ С ВЕ В М НО
ІЧ хх 1 л НЯ ї й о АХ ця г -ї її і: т Тло Мода пух
Фішеюко Таміх Хомко То Тагг й'чихо Щі до 04 павук У ВО і Жвю писк й пу па. МЕ и в оо КУ В я я У НАННЯ я ЖІ ялаощ ТАМ ЗА уХО ЛЕМ» НИ ди Ку 33
ЕН ще
З Мадшв о хх пн НИ ВІН я ев НН ак нанні и З НН КН а НЕ ЕНН КВН а І сю СБ що ж ЕК ай ям СКМ Хек мух шою ма МО ЖАКА Ж ж й Й их чай "75 АТ Б
СВІЙ СУ ха - я з чі тех Ук ут ек Музи жк Хо ге М х Ж ек не с ни Чек дк г ях т Лк Дод 7ИТрю блю кю ек ес ть: в
ПАШшОАУХ кУуш шк ЗВ ОКУ ху Їж УМ Ж ОКУ К ЕтУЖХ КК Вер дІ ку
ЮА ААУ М І: З З В; ії В; пох т ще
Шо ША се : я х -х . т х її Фах Му. ї п еко Же Мія 0 юю симулятор Миємо сті ху
ТІлиху шу Мр ОВ плЬМО дл ІК ух ся АЮ УЮ гу мл феум ОХ ЕКО ДМІХО Ім я тт ее Б т з тої шхл туукки тю ДЛ їх ж жщої суд бюро ект бі ФУ, Мишко йофжу дек Саші ож 0 що ШІ у у рю хо кі пек м Со
Заец оса ши авг. бас ву Ех кА М ВЕ КлЕ ваш ж сш К У У ра де ще п да зх мл С зи го до НУ сек
ОЇ У й Си ву тон ун рах хх ШУМ о С пд пк лавку І ФО 2 ху
Мала Ав іт лиж меч сямх Бщ УЖ ТУЮ Бі оба Тдую КжЕ СУ БЕ осіу
Й ярі о ко ух пли ТИ, МНК
ММ Ми ее - . їх ке я к ЗУ чШНКУ хо му жу їдяих ел Хйчю ОО
Му і шк ТЕ оо А У ді СМ Ек у ЩЕ ую ти Ку бує Щи МІ: ши жХжх жо УшА Пп УА век ОВК Мід Бек ОО ХЛХ муде МУ КК су За ОРГ х полатя тує 115 НК «БЖ ї ве осі я Дю ичах ме нн Не не НЕ ЧАН Се жов САЛО
Вуз бе вів Бтє Се Щаву воз пек о їТвУ Бех бі. девЕ ЖвКоВів дів Без плоцух ле я.
ЩЕНЯ і ія ТЕ
ВМ ДО їх
ІЗ ач Ки ях Ко но ги ух ХК іму Ху си жк
Ті ха глек боки ЗА ти йо би Мах Може 4 лаки Ку КОМІ ДНК АК ше щУш БЦ да зе ее З мч чи ко м М З І М КЗ Фо МИХ х: тА СТУ ТУ У ев коя рек тя ложу; пет. 17х З що ких ек би и Уго шкі У Те Ткутию СВ уче
Моне щік Щі» ДТ СМЖу сяде Щі що Ж ОК ЛАмЕх Мт. ща що ХА тлі яті АЮ хЖАСЖ ОМА ОМ КАМ ЗОМ А КЗ ри кн нс М о ми и о а о и КЕ п і В НЕ а г ак рт
ОК ху ПИ
АЛ Аг ОР по г ча альо У я ВУЖ. ух ек -т- - Фан жу ч дого ку Ух ті Ух с чо й тла бару дане стіл Мат сбарує Мао Товії дук й т зт а ач ник а ук СА ХР ХА А МК мА КО МО ТЕ ДО іх ЛЖВ «МО ЖАХ. ЖІ АЛІХ як СК ДАМ КАТА
ЕН и ЗА п Ще М сепія бик Ти пт хі му мо У аа фея Міднмо брудно їдою ХМ суху ПЗ проза ко
ККУ жу тиці) шу сук тн УКХ На ИЗ пгрЕ г ЖК Лід ЗА ОМОрчо ти ек
МЛ ШМК АМИМО ААУ ОКЖВКО БибЖЬ АЛЮМО ЯСУ ФО МИМО ХУДІ ММК симКА ХО ТММ О ДЖ КАТ лІК НИ Хуг
Я У шу М
Феує сю ж борщ З й дгу То ут МА Мр ек ух ту не Ти Авт жу
ШЕ МО МІ АлАхо АМУЮ ЕМ МІ. ЛЕМ мух ЯМАЛА С Не Я НЕ НЯ КАК КОДУ МАХ МАО КИ 21 В в бік лю Хек пе жу м ТМ лих рани туз Зижя її Є ж ХЕу Се ХА Хакіих ток Км и Ух лока не Укл гл лат не те ме он І НН ан вх НО МЕРЕ
МАО ЖІЛЮКИ ОЙ АОЮМ ск ут. ША КАЛ АБУ ло ШО АК вд су ААУ ОКА ЮМ ХУУВА ОМА ОКОМ беж зу тех тюд т
ЗЕ Ух оду м дг
Ка аЛАМ АЯУ «Ж п ще Тени гу - Кл ї т Ж ух вч З - У С мн М ї- м 4. - Тео. се що в о нн в НА НН На хі Люкух. ТИ ух Ті Ме Пен о А ус теку
Тв Шлсю ле БІ фур ша уж о СБУ Би НАЖІ Бе Ва Е мщ п БО пох СУДИ лах
Км Кен ох ко еко тт сх ри не ни НН шж от тушок ге шухл ж УА поло ліц подо їз р ки хи и оджуюю ХК ум 27 Уже КК « зу прі Ле ЛИ м щі я що дах Ку М тає А ицх ше і щі
А Ух А МУ ж жа що ВМ ва ж Ав о зам МО г Ам ОМ и
ВН ту лу яті дО ші ух хз -к їх НА Ь х пт дж ті ххх тх 3 і шень: У - су пі шві ще сту рух що Ка дя МОВ ХВ міт йду ДОЮ Кох у ме шіІМВ лижах ДК АЖ ямі я М.Х ай. хх ЮК ТІМ ЖММІА ХО АК АЛЛА ше ек. ТЕХІ А шо «А дУКІЇ : зол СХ ки ше у АНЯ - їх тих, с х од жк АЦЯ ою цх
Тозяк Хм тю ют 2ШЯя ЖО Ті С же ШюмУу Сбюшую;р Ме ТК; б Мом г Так ех ді
МО КУ ХА КО СМ о с БАВЕ ЛАЩТ ЕКО ЛИКУ Кш Ж УА ка ВХ Ж
ТУТ ШК КН: и я АК
Ж м о т У и тя х я Бо У сне У У і ал Ім есу. Ух з ож. ї тонша бр Кто пт лад яю Ов бука прожчу Ток. пою Ух їх т ср ж іше бік
ШЛЕ КК УЖ КиИВМ ЖК ек ши МІ Вир Яд СУКА му ст ЕК У АСУ : -Х ї З - - х
Ек чіп Ке та
МЕ ЛУ ДЕК ДК Джо торхщшю ма итогу тА с ка аеьнк Кі жу Ух т ж ян ую Ло ях М ню ОМ ї2 шх ан І пару са точ рі и ох пів УЗ ЦцЦЩУ І 3:34 пф КОТОМ і ЖІ КО А МЛ Х ую МА КІМ СКМ мМ ди лад МО МАХ КАТ ОЮНХ
Ул, лик, п
ШКО їх ж меди ТА Уся Му сю ху ок ум оч вени ху п пах х я Ух кс
Ток бли і Іі КУ уж ЕІ у Мара гл ж ща ої юсж беху меж й УВО ІЗ КМ АЮ бал Ох Ав КУ Х БК ев КО г
ЕД пк пов
ТЕ НИТЕКНя жо ух
Фе оо шешия и ї Зьшин чи У їх ві т в пи СЕ ьо тя ск Н ложу. І их ш ЕК хі ак ї3і р Ббріфф І гтЬ ЕХ Блек тик Ах пі Зх пану зд КК воїна удо
ЧО ЇВ їм І ЕКО р КО ЗКУ ЛЯ АТО ЕКО А ТК Ух ЗИМ м, ри м чня У ваау МОЗ; и
ІД ау Ко ди р ги Жибудчи о т и 200 ж щуци ен Му ук ху пу, пельшЯ ень ан КолечНИЯ тет г Лв ха лету ща дет от Я до Хр ТІ Те Фа Мак Км ТУ хх
М їВАСМ КО КК Ж пт КО ВЕБ ХО А У ЕКАОЇ МКК СК мА Ж ОЖММ ВАСУ и ОК жа
Тк ячхож ил. 3 м Ту сли кі при он, ТУ ж ет т. го Я ето жа ша РУК Фа м Ваши щік Тх КІх ілі Вл див тух я тлу бек Шок би ді їлм" Аїд пу даю
Ел Не о в А и з З М о з В В ЗМ Я п а В М І а З С В Я КИ ВЕ зак БУНчА -зщУх дик
М А Кия ЯН
ЗО УМ ІВ ж и ех тич ти ТК боку; Міо Жду ян ваш ПТЕ у: Жак Тк» жу Шу Мом тм ж.
Тр умо Жак ЩЕ Ме Тим с бхек Мдзю Дю Та пвх Зв шт бр Чу коту
Аж шк Ущ'У ша ОМ їу оо шжк дк МмшМ ВИХ ЗХ АЮ мух шк г Не МАМ ду СІЯ ях
Тр Бен А іх чне доку щі ТКрЕМ тин ха се. Тр. 0МідиЇ о гпу ль б1ї що биМм з палої шоу ВИМ А БІМБ мя СЕ ХУ що ВИМ МІХ МО КО Ве МК а до ЛК, ка тах УМ ря жу - УЖ окисли ВРХ... ешня У р ун х Гл шо - ТЕ и т - гак з х їх їж; Ж и Кри 1 Тло ув шко Жему оТивзір Мав ко Тай р ху гл: МК АХ км от и а не ни нн я я ЗК о ЗНМ І М о а З В А В А СТЬ ях че ЯКУ
З: дай ах и б имя подо т оба ТТ м дю спро т бю ум и яко Тлмт: дек Зб о сткух ХА ті
ВІТ ж АТ ОМВО її Кк ощів Бей ОЗ его зе ге ойек дів пек охала са 1 ї. зх Кк к - пох БО тот нан ль нн НН НН НН щ ж чо чн чн ту щу бут ХЕщо міх У СО Іо їххак; жи ЛУ Ж Слух и на На НС ЗНА Мхку
БА ЯК ми КІМ АЮ Мк А у ЖК жа им Лю КИТИ ЯК ди би ю ж А зп ад з в ях мл « й що шо ук. Аж я в У я кт У хол Ук шо то кош ечя ше пах дю тМахух МУ ТТ ух ШК у мує УЛ ТО ЛО ХУ їх Тік Ї ЩЕ ке и о о З с ЗЕ ВУНА З ЖА ОО Ж ЛІК су Му щока КА ДУ КИМ МАЮ АК ту я а в; Ж ЕХ
Меню Жюує МІ срею ме Мф у хро ом я зу уж жену дини ом УК Є барюм о Ех хх
Ту Хм хі ЩЦиву Те У Кк. ат ую КМТ ЗА мим АТ докт Бех Щіазу ціх:
Ус бла мМ ро да ХА МІ ху жи Ж КАК МА Ж ВА МКК САУ щи що КОМ по І КА
ФЕдую СКЛЛ жи соку Ж жо де Можу ЛЯ у се Тошьия Же ТЗ шує ше им тож УЗ кю 0 Шухе шк МА я Я Ку ІЕМ Жди ті МОСК Б ЖК ДЕ еВ ХК ет За КК шо пр ше З щх в ЩЕ пу миши можу С Ж ох, них нн з НН их Ал Ех що С я лу. У Фі ДТ ужия
Іі Моку трж ОК мо Пувеє сих хю шо їмху У сті м ЖІ шо до, 211 зве б; ТУ ую,
СУКА АВК ЛЕ Ор СУ ТКХ і Оу Уест об ТИХ вуж ЗУмО ЯМ Ка БЮ и я ши
Трюмо рф А аю у пі Мн ує Хоча СІЯ кл токгшйо кер: МУ ом кл щ Жде ру тіше І ли Ж хх Да МУ ує Там ит т: ЖЕ т охе мк хащі Мхло Мі
ЕТРКО ЕЖЛпт ох МАУ ХА Ж РКО шум ОО УА МО КХ МО домЬ ЖАХУ СИТХ ВМ АКА БК В ложа я Золоту у ОМА Ох не дб МКАС ЖЖЮр Ж у Ля; Фуко Му ши оон А г перу ж Жах дум Й
Шеету Щек ад Би: Тобі Мч шь бу Фк) ДУ Моллі ті Мо ЇМ пух МВ Спи
ЕЕ ж ді КІМ бю ож БЕ БЕ сх МОМ сим о ск хек мущ ЗБЕ ць у ж, Ух ТЕ,
Моя ок Тих пі З и ХА Я йно Хуг ткач до Хшо Мф. СИякх (Ук Лю и: Ух
Тіт Щі о хх дме г о Тов З ахії Ддшт шу: МВ. СбПявУу бе; Дж іч від и нн НМ В и п а р В ИН я ВО В а п ЦО З З В М З В о и В ВУ ЯН
Ул лк Е подат
КК о клен тазу а гі жов 12 су пі Що Мем ЕТ лу БУ Би Жан, кує І
АКшЖЕМ ЖАТЬ ЗОМ му о ав ВІЮ их МО БІ СЬКІ КО у АЖ ХК пи
Не Не лох АЖ гхз - ФЕМ вд сна з ке пі - пен КУН: х х т
Тл баню АБ но п 1 йди их дк оку ую СМРм М Ша їм: шу
МО МК КОХ м ни нн и м нн А і МЕ п з п М КК І, п и М М о и В ва подік Яку я Ех
ЕІ 1 Отю
ОБОХ А коти ж нм НН Кн НН Ка НА НН ИН Но ни и ов КН А НН ЗНА Фк
ЖІ ЯКО А КЛ БАтТІХ 0 дух ДАЛИ ЛІ КОЖ Ко хпцод дж ХУ ДАМ САБАЙКМООМІУАИу з пу ге З - м о АД ен І ену шо ня у: що якою СЕ ст « -
Іі щ го лі сх гу щі шо ік У Та: щу іх Щтр ке и
Мищ Се І УДК Кп мА У су МІ ОК ОВК КО ВА лю УЮ а жк ую «ти іх зп ХУ пе не нн АН НАННЯ
Мп ОМ ї ке ІННА зи и г из и ки о а м В М У Я шою хи ббтжіу СЕР У ех Мф ту. У им ую Мох їмо буфет 2 ТУ ях
Які я айл ОА КМИ В. ІЛ ММА Їю УА кльош п Зв у м сх ж ж ААУ
Н : їй ре
КЯ л Ве ПхЕ кіт жк шк жо; т -к фФогута с жде фло В що фін жом. г А НАНУ ка ня КИ пін тод вну за То Фк Мат (ТТ Жахяє файлу бок бЧіж мо Шудхя дзвовхч ба БИих Іде ТвЕ Су бевБ ох Мед Бій У ба б СТУК УВІ чи тек ке
БЕН и 7 ко що М
Зм йо гі дин шу брак осілма 3 5осг кт тен ЩІ п Зла м Тих у прі Ту д
ЗОМ АО ЮТЬ МО АХ КК ХЕ І я Мі мі І ОЖМ. хі хто лу КА му іх их НЯ хЕ о; п Бен пох гою Ж щ те я т м ох ху ще Тож т Є усю, тих м. т. з ие шо. ще помеш вч щодо ит еко бо тат бік са жу щі Маю тру кт 213 п ліхк уд
ЯМАХ ЕЕ ТО АНУ МА лит КА А У БЖ хан са А ОБЛ КО ХК ММ ух чу МІВ зу щи ІВ км З реж
Хуенао лиж у ТК пи слух Фан дж аю ит дя шою ФТІ 4 М фрукт ХУ Чек фо СИ
Етсопех дмищКаВвоше Буш ЗЕ мою Ов сад К век о Клео ж Ме ГлЕ ще тт -х - щі зу НЯ м щ З б ще
КУШНиКО ра я То т. ще ос жу тих КУ с нКЯх . лу х КУ жк т. т ух. я и. СТох т бла Маю ри їі; Рі кт пі ймрво ба Діод ОО Ов хе змо Ст тр іч жошжЕ Мах де МУ ді БЖ а ав оЕпе зво а ЗВ СКУ УК Ж ах лю Ук Ук
МІЛЬ щи БсНАН
Тік хо Ку ТЯ Ім. ПТ юо бери ЖіМахМ ха. 8 дж ЖАТЬ Тим ту г З прологу
ТУ Оп лю рук ж ТК пу Ел Си У бу зу БляЕ Буш Ущ Мод же потр кох ох
ТУ Ех ГИНЕ
ТІ хи долі
У е НА не а и РАН АН ВН Фен. Мешу мо ЕІ жук лості Кк пряну шк Молю
Туя плити пн и НИ НН краху ді ТІК іш МБ бут (хе бах щу ши ЯКЕ мл о зва ж ЯМА ке с К ж Р да ХО Юлі МІХ
175 їй пд
Фі о шай сей обу пек Оїу ТЕ йЛіж зах Уві ЗА Су емо їжа АвавоО АЕН
Бе ЖУК Кк ВЕУ с дів душ Уві сіб їкКб БУ Уві Ва» бен бів Без за ща ІБ ї5И са ожнх У дж: о зеж дів Фіз ЗБЕ УВІ ТБЕ Сім бів Ахю ВЕ Був Ар
ТЕХ ІТ Її йшие Тк оТух беж бо су де Тра Бей Тв їжа ех БЖ АТа Аа тух
Зіб їв Біш бУужх Уві Жух Ві Сев іл Уді Те Мів пів б3)У Лех ит її шу АС зчзежх ро Уві ТВ бу дес Сн дав дк Чі сів ОсСух 1 Кей 2

Claims (24)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Моноклональне антитіло, яке містить важкий ланцюг СОК'1, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 11, важкий ланцюг СОК2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12, важкий ланцюг СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 13, легкий ланцюг СОКТ, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮО МО: 15, легкий ланцюг СОК2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 16 і легкий ланцюг СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮО МО: 17.
2. Моноклональне антитіло за п. 1, яке є химерним, гуманізованим, венованим або людським антитілом; і/або яке (ї) має людський Ідс1 каппа-ізотип; (ії) являє собою інтактне антитіло; або (ії) являє собою одноланцюгове антитіло, Рар- або Е(ар)»-фрагмент.
3. Моноклональне антитіло за п. 1 або 2, де антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮО МО: 35, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності зЕО ІЮ МО: 37.
4. Моноклональне антитіло за п. 3, де антитіло містить зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 35, і зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 37.
5. Моноклональне антитіло за п. З або 4, де зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 40, за умови, що С- кінцевий лізин може бути присутнім або відсутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 41.
6. Моноклональне антитіло за п. З або 4, де зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 60, за умови, що С- кінцевий лізин може бути присутнім або відсутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 64.
7. Моноклональне антитіло за п. З або 4, де зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 61, за умови, що С- кінцевий лізин може бути присутнім або відсутнім, і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга зв'язана з константною ділянкою легкого ланцюга, що містить БЗЕО ІЮ МО: 64.
8. Моноклональне антитіло за п. 1 або 2, де антитіло містить зрілу варіабельну ділянку легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 14 і зрілу варіабельну ділянка важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 10.
9. Моноклональне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке має одну або декілька з наступних властивостей: (а) інгібує зв'язування ТІСІТ з СО155, необов'язково з ІСво 15-100 нг/мл, (Б) підвищує природну Т-клітинну активацію в присутності антигенпрезентуючих клітин, що експресують СО155, як виміряно за продукуванням 1-2, необов'язково 1,5-3-кратно, (с) підвищує антигенспецифічну Т-клітинну активацію, як виміряно за продукуванням 1-12, необов'язково 1,5-3-кратно, (4) підвищує активацію природних кілерних клітин, як виміряно за продукуванням будь-якого з 1-2, І -6, ТМЕс або ІЄМу, необов'язково 1,5-3-кратно, (є) підвищує продукування Т-клітинами щонайменше одного прозапального цитокіну, необов'язково 1,5-3- кратно, і () зменшує продукування Т-клітинами щонайменше одного антизапального цитокіну, необов'язково 1,5-3-кратно.
10. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за будь-яким з попередніх пунктів і фармацевтично прийнятний носій.
11. Спосіб лікування або здійснення профілактики злоякісного новоутворення, що включає введення індивіду, що страждає на злоякісне новоутворення або в якого підвищений ризик розвитку злоякісного новоутворення, антитіла за будь-яким з попередніх пунктів в ефективному режимі або в терапевтично ефективній кількості.
12. Спосіб за п. 11, де злоякісне новоутворення являє собою гострий мієлоїдний лейкоз або Т- клітинний лейкоз дорослих.
13. Спосіб за п. 11 або 12, де індивіду вводять пухлиноінфільтруючі Т-клітини, які активуються антитілом.
14. Спосіб за будь-яким із пп. 11-13, де індивіду вводять вакцину, що індукує імунну відповідь проти злоякісного новоутворення, яка підсилюється антитілом.
15. Спосіб за п. 14, де вакцина містить антиген або його фрагмент, що експресується на поверхні злоякісних клітин.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 11-15, де індивіду вводять природні кілерні клітини, цитотоксичність яких проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом.
17. Спосіб за будь-яким із пп. 11-16, де індивіду додатково вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні клітин злоякісного новоутворення, при цьому ефектор- опосередкована цитотоксичність другого антитіла проти злоякісного новоутворення підсилюється антитілом.
18. Спосіб за будь-яким із пп. 11-16, де індивіду додатково вводять друге антитіло проти антигену, експресованого на поверхні імунної клітини.
19. Спосіб за п. 18, де імунна клітина являє собою Т-клітину або природну кілерну клітину.
20. Спосіб за п. 18 або 19, де антиген являє собою СТІ А-4, РО-1 або РО-І 1.
21. Спосіб за будь-яким із пп. 11-20, де індивіду додатково проводять один або декілька видів терапії, вибраних із групи, що складається з хіміотерапії, опромінення, клітинної терапії і хірургічної операції.
22. Спосіб за будь-яким із пп. 11-21, де індивіду додатково вводять інгібітор одного або декількох рецепторів або лігандів імунних контрольних точок.
23. Спосіб за п. 22, де один або декілька рецепторів або лігандів імунних контрольних точок вибрані із групи, що складається з СТІ А-4, РО-1, РО-І 1, ТІМ-3, ГАСа-3, ВТІ А, МІБТА, С096, Агак, АЬК, аргінази, СО39, СО73, ІРО і ТО.
24. Спосіб за п. 23, де інгібітор вибраний із групи, що складається з іпілімумабу, ніволумабу, пембролізумабу (ламбролізумаб) і атезолізумабу.
їй Мовиий Кому ок ХЕ ЖК С: Ах т - х Баня Е й ї | Й Й й Що Що ШЕ Е сла ще ТЕ ХК дих СЕ Я дляю дитненесенсветньоої Ж ТМ КАЄ ОБО - ж й шк. їх т Е Я г. щі сх х Не МУ й Н Е Е Е І КЯ кКтуайх Е І КМУВУо Е В й ї ї: Я секуеі м Е ї пактамаха зак Ї Коко Ом ж з. КК КЕ . ПММ вода ДУЖЕ ї Х с ха ди ее а шини Я ь се -о ч МКУ гу Я шия сс зи ЩЕ нин а поио е ми ден | БИ ї г У Ж ї КУ У ІЗ КУ ГУ з ї г . ї З п. ОХ КУ «томі дай ЗК ОЇ жов кад! «М й ї - т
У. Кі і НІ В Е і НІ : ї "З У х г В с Сея ку ся ря ея М Ст рек СУХУ УМ о з. їх. КУ Я и фей ок тки Ж АНЯ гі ї УЗ ЗІ сп ГУ ї питне джюоюх ЖИ ВЕ ВІАШІ КО Ні 5 СЕ ЩО га М ІЗ Е. КЯ її -Я : ії ї ФА ВЕ. ен ! і Е і : ІЗ ЖЖ слескеня еще соку Е: ІЗ І ЕТ Е Ге ІК ІК тата УК х й ко. ЗЕ У х МЕ ях КАК алі дан ї с х КМАхАх скл ккккннлАня ; а з винен: НИЙ пох й ; ; ки й й Це ж ще
Фіг.
Зв'язування ЛОША НК з МЕСНВ НОР клітинами у присутност анти ПОМ детитле -Е Н Ше зену Е тей : щі д А с І : Му па ее ще У у й й и шк во пок г чі я х 3 ТЕЗ ще че дово Ку ї х а і с Енез антитійа - СЕН. ї х А У ТИ КУ АГ, й ї т Я З ся пи Ме: «ко ШО: МИ Беж: т Е З , М: КТК і УРЕ не: Концентрація конкурента пиктлял - Гл
Фіг. 2
Зірка м: НОТУ ! в й 1ОЗАБЕТВО пезааБотве пІоЗИБВТНОо плов МеЗАБЕТВб петззабвтва Ота поза ТВ ПАЧУКВОО срлжееесое ОоГБААВОЄТЕ ЗМЕомудАава Ук ія СОН К ебать ОКО АУКО каре х гр х хе Пе ! у ККУ с сяг пава пра мн пеллашотох ря п Кі 7 і ї кан нн А сп ни С у хосСеуч Ана сідомоовмУу длатуюавєт крОюМОоХМт ЕЕ а. іже у їз СОЯ КЗ Я ! 1 че г -к ; В З й Її ой оу ту - ту тра т З чок гу У їх од ЖК іч - ту їх й і З ку В Е дк се 55 їх їх х ер г З Ка й во . В ЕЙ) ти 5 ПЕ М Камю З ІЗ 1 Мч 3 шу вектор ге тут я УуУСАНМНУ УМО АюСОоСстВУ туба ПОМ ВоЕптаМм ТтсАКМКОМ УКОСУ Ту не ща Св
Фіг. З й Е зак с і її М У Ме ? 2 ; алі кат казати паза мавки таза УВО Ото УВо Тем УВО Ото зебтасре У дАсрВОст ТВерАснс: КУ ВЕУСЕК ПУСТО У ААБРОЄТ ПЕС ККУ ча ше ! Х ї; 5 Й 4 З й пеілзаяЕ ГАК Ко пря КК поза О Го ча ! 789 Оіоою піз еВтво ооо Гео РОКТМКИ У соте ББрБощеВТ ПеЕТОТВВЕ РОКУ БОБ БЕЗ КТ я . - й і т й ях Ж днк й тв р вх Ки вх їх Ж у й 7 Піза О позив ОТО; рен ях важли гріти ант В, ЗК Е їй РЕОБАМУТСО НМР оотКЦеК у каш «я
Фіг. 4
3 т р Ж ра хв добу орех ху зязУ з ра ви я пхаззекетва еЗА5Б7В5 01234789 ото БЕВО ОТТО ІМ пУтуичия КЗ ех а Я ВУ Прати нано щ че КУТ ї КУ М яз й ака РУССО С УКРОАБУК БОКОМ ТЕИИМАКО ті ОВ Я х 3 -х я ве в Її злзззака?ао апзззазасазов пасив паіззаказав вити НК В Нв І КЕ НИ ві віками ке зи а К ку і їх БЕ, дет я х км: дру га Х кан й й че» да так у БНоКмМеМме скеукоствУ Моска ПЛЯЖ ТА І Ї « ї- д й З З о А паззазаазаКезаа вячзасииае запа заасетава паза шини птоз Тва ОО ТАБ ТА НЯ як З І ж ПВ зи уки я ж ЖІ а че я МЕКХО ТБООБАУ УУСАКРОДУМ ХАУС ВУ ТУВ5 МКК дк и АХ Її ау Тука еечммув Ока
Фіг. 5 ій "." а пеуектрх й І КУ «й а жита: г а БЖ кв Пазюк ЯЗ Кк а еБотаЗ піозакетва ОВО УЗА деку ха Ом од дк доку ик Ех В Ек Став Ви Купе ЕКУх пи у КІ МА Ж КЕ 2 КЗ ку Я піммтовню емМетяуВОвВУЇ ДА ДЦ МК СО Кх; и Я і дізаакозав поза ввзаа лезо пізлакозво пісна о ае о1еоцва му ве Мои К их ре б крику ку Керевечмовува сики ферхоумр ооя, Мех МОБ АБУ УЮ Окис ОК КПеСКУЗ лова ША 4 : У їх в й пох виокови со ух кв тк тк фе кт кутя шк кум й кож ку у ТУЯ КИ ск ДК ЗО СКК КВК и не и о ЗЕ вже и ЕІ ТТ ІнАУ СБ Ат САТ ант як фіг. б ш" Кесву ек В ПЛ УМ Ві т с і; ї йх їззабвтва піззаб5во піозаБозВОо пі2345575о виска й: НИНІ; ем ОН плату ие Бевз І ва ее Ко шгрутунсчав я УС УБО АКРОЮВ СОСААВОВАК БОМ БАН сг В ї - ск КІ я й а З ! траса жи: фія сту ки гу паз ЕЕ А ту р ек зи ШК и ши НЕ ЕК Я ЗНМ КМ КАК ЕН То муть ша ТРЕК ЕАтА ТОМУ ВУХО БЕОМАКУТ У 1 З х їх пл 4 й У у Е пеоосозакатВо птоз З валіза казав пап рик и шнЕик ей НН КИ НН Вю о ПОМ КаЕПТа УСАЮВІВ уУУСМаАЮИОСТИ пбб ОМС САН ОМА Б ке уих сок
Фіг. 7 й ч йо ша. гу. У й У х В: З ї ї ж я свлижсвчки Мілана Іза КаТІІз ТІ взазавиВва теааББТВУ ОНКО те затв РОТ кічийнк зосдві мч ож хі оошож о тажио ой зок ар рмиитьии Ки як и рен вари ачк Ме кі ТУТ Ке КТ В КН ТЗ ДІРУ пУМоОоЗеВ ВАУЗУЄЕКУ МОЛЬ КАТА КТОСК пе ЕЕ еЯ В меча тив ваза впала касове папа еко паж кк и КЕ у и Кк шва сах КИ ШЕ що з вза а ту Ех о ЦЕ ї о жі ОО Да Оу ВЕ соб ОПТ ОБук терту ї СЯ го х хи Вк ха туху я мом вх ой ак я СХ І КМм кул, а нс ан ВЕ паж ЕЕ АБО ОМА БТ Кк як Ще ;
Фіг. 8
НИ УН тен АСТАСТАССАССА ТОСТІВ ТТ ОСТ ОТОСТТ АТ ОА шин ни ши ши в и з и м пн п ОСА ТО ОВАСТОСАОСТОВТЗОАС СТ ОВОВОАВОССТОВ ОСВОЮЄ ВОАС СОВОАЄТС ОСТ СТОКАСЮЄТСТОВА ПОАСТ ТОМ ААСТТ ТОСААТОСАЄТОВСТТ СОСОК СОКОМ ОСС ТОАТТ АТ АС ТС ТОЮ ж ж От УК ВВЕ ВО АК АКТ ОТАСЮТ ВСАА ТОВАСАСНИ САС ОАОЮАСВО ПОС А ТАС ПИЛОМ АПКАИСТАВОЮТТ І ЗЕО КО МОЗ по БО НОМ
Фіг. ЗА аа МЕТИ УМ ТВ кЖ коки, и и КК тт КИ КЕ Ку в ди Кр ук ве и Ку Ж КВК В 3 їх ВОК В ї СЕЖО МТ 15 КА ТАК м ККУ РИХ МАХ ІМТ я шк хм ко. і ; : ; чої Їж Во є вн НИ о ЗЕ У Я т І: і ІЗ СОННИКУ В: с ЗЕ Є ЗМ В З ПИ ВИ ЗЕ и З З З З чо с о о мим ик Ко Ки жири им пу ЕЕ у и У К ух он о ТИ Не В ОК и КО МК М ВВ и З ее ВО М ВО НН В В КВ НЯ В В В ЕВ М ІБМХ : : пев шок яко ж окол вк ж 2 вх їж т : пров т 15 р ку 5 1 х х у Ох А КОЮ В: що 3 ОХ ХОМ ВАХ М 5 Сак Кк КК ЖЕК КК Ки вк ЕК КК я КК рам в ЕН о ВО В в В В З Ве а І ОРАТІВ ІА ТУКА АНА ТМ ПОМ Я маг В НІК їм г СчУ хх х зі т їх х. « ї пк ї їх їх У їх А хх - ж: вк ж М М и кн М З в о п З В З В З С хо я сот екж у пасма ти мока тика ее рату ти в кв В ОВК ОАЕ ВО ПТ С ВТ ОВК г Кг Я її я ш 5 ЩЕ ц : 1 ї - п хх я я ї Од ши и и в з з З с по п з п м п п пуху чую куту АлАТ х КК В Ка В ої у БУ ху ОК ОА ПВ А ОП ОНА ГТ ОКО СОН ке: нн нн нн нн и НН НН НА 4 товод ВИ и Ех НИ и І З Ек п п КЗ М ВЗ В В СМ З Я ЗА М В и ВОК в в КІ НН Кк хх ЕЕ АСПЕК ВАТ ПОМ АС ОН ОА ОСА ПА ВАННОЮ 5 - : х- : г У : н х кож хек жо ху ра Е ку к Е т Х х ТЕ ху щи г я г КУ о шк ща ж п м зл з З М З ЗИ З З З З ЕЕ Я З З У ЗОМ Я С тат сут со кя сш ту х КН в КО Учояю жижуи з КК Ки о кТиху кю дроту чуми и дим и АК ЕМ Же "ач вах т ох тку ух КЕ СВО ВСАА ЗУ М СКАН ДА Ка СОААВОВА НО СБЕННОЕВК Уж ос воде гер ; що УТУМЕЄ М МЕЧ У ни ни нс п п м о пн КК БО х: «Я Фіг, 98 «Ск хі. КщІ Хахті той ЗІ МеВ: ка ЗА : : 5 оедедеднчн'нінінннттттжжжжя СОКАХ в лох х песен? І ОК З Ау пущу КЕ ж У фсднй МОВ вав ВИННІ ВНС ее ВУ ЕЕ заан: ВИ з ЕН ЧО УТ) фев г де ї х з гак ! ШЯЖ КТ Н : - Е і ва Е я Н тоже і ЯМ ЕЕ ауди ІЗ Гепактмава вне да ! Фо х й са Фят Ех гу пло Ме А БУЩЬЕ вЕсІе і ; МО ссккккккккннкки й Що х пуд х. ск з. З димеваююннинннннн З о. й ї З ; сок. т я сш МЕЛЕ: : я ен | вне В ши А ши ВЕ КІ ЧИ ; М г й Ї й х х Кл М хкей УЖ Ма Фі І 0
ІГ.
Зв'язування МОТО ЛА з людським ТЕМ З-з іо - я ї 4 чЗ «А МУ : 514 / це 3 У Зо я дн Концентрація внтитиа гм
Фіг. 11
КАСО вила зв'язування з МЕСЄМУЙПЕТ клітинами їх її а ой ий т МКК Я в «АН Ка Я Де Не ЧК гей | щі нет да ЖК БА ! а МИТ ХеК А - МА З с : ве я сх ВН я МОВ Концентрація зни імхлялі
Фіг. 12 Зв'язування РИ С мічного СОМОВЕЄ з МЕСЬН ТЯ кпітинами ЯК шо й | Щ Конеюуюче знтитио с-ще СО непонотАК Ж м, А й. НИК МоО АВ ши ча М сх я 5 х й - їх р 5 -к " КЯ х ї ЩО й Е ро Концентвація конюдуючео анти (акме
Фіг. 13 шо ши ши и в СООСАСКТЄ ООСАА ВТО ОТ ОК ОВОК ТАЛА ТАТА МОСС ТАТА
Фіг. 14А
НИПОО М тен ЕТтТітІ:5іО0вБЕО:г:АвУУТСВО ААТОСЯДАСААТТО 5БО 0 МО я7) .
Фіг. 148
Зв'язування НПС ЗА АХА з людським ПОТ ях Ж чу 4 ще НК: що -к : хх Е: Кх щ Х БЕ дО є ЕЧО нн ТЕН її ї х пз : МІ ХБАЖІ М. Її Концентозця антятевх мкм
Фіг. 15
ЖЕ ера хі5у52 семеро ВУ горісі с КИ ге рокли Підвинене продукування К-Є у присутност МОМ у результат стимклювання вити гпевеспецночної відповід! чи ни : і ! ск, З ї ї ї : ІІ Н дення і Ї ї з ІЗ ї коша «акккданнх ї У 3 ня в ЕЕ їі В Га ЩІ ЕНН: ; т, їх ї ї ІЗ КИ них ! щі : ах рення Е ї ; Е | Н і Гн | З ж: Ка Н І гу ї їх ІЗ ї щк ї ШЕ і 1 ї Е «В і | і | їі ії Е Шо ї : г: Ї А ї З їі Е А . і : і . ! Е ї 5 3 ЕД: Я ї ШЕ ! ще . : ї З Н ї З ї Е мойви і іш і шк ї Е як деку ж хх м вк Ко ща ех ее Же Як - «В І щі М щі Ж - Й : ей ще Бей п й Ж ї 2 ве Ф се кА о і мі не х - я М с? «5 шк дк х Як Є; вк Зх ух Е х я 2-й Же сх ях ше
Фіг. 16
: ки КУЗЬ з Тйх ху ХО це ча СО ВОДА Т-клітин проперерація у присртя м овищена МЛН, ВАВ, ГКУ антиген опецічної відНовві ТИ у узечуль сті те АКВ В НТ МЕ Соц ХОХОЖ БОЖЕ КО м пен тине я ех ВО НЕдеЗАНК Пронкнера тину їх ка ТКУ МЕККА її і: й жд в ТНМК Кене ххх ЕК У т енімих З ис ПЕКИ ИН М - дев ось СЕ Тек ЗЕ АЕКНО пекан ЗЕДЕУВКИЬ ВІДОМ Ме ; дин "ЖНИВ у: СВЕНК іще НО хни відпенцев полем СМ В на сені ЗЕОК ЕІ щ кит» сен КК пуфи ЧЕ ма З ік пеню Повз не 7 мих Кох АК з ЕОЯ Лад; хе г роб ять ак щи я сс З ве з еко ж 7 ! що Пп. с Пт с ДЕ Я я ших, Б ЕрІї |. ! тен я-- В КК | НЕ 5 ! КЕ ЕЕ Е в НН НІШІ МО - 1 ЩЕ НН ЕМ НЕ НЕ «НЕШШЕЕ ЖЕН Я МЕ ЖЕ ШИ НЕ І Ещ нини ин нне шш ЕЕ п ше Я І ЯМУ У ах З 3: ТЕ ЧЕ КУ ї ІЗ ЩО БЕРЕ БЕРЕ БЕ І 115 КЕ 11 КІ КЕ КЕ В КУ ІЕЕ: Ер НЕМАЕ УНН НЕ МІНИ ЧИ ЗЕ К никнення ПИВІ ШННЕ ОЇ ж, НЕ ШЕ І 15 ПБИШИНаНиШИних КЕОТЕ кВ ї 8 ЗУ ї що ЯН і г с Ї НИ ЕНЕЙ МАЯ: Се за М шк; с БОР і Хоевйккюво уні ЩО ПО ее ще
5. Деві кнічніііе х ся Є о, ке ОО ж» 8» 5 М де и Ж що с доку В, ХК шо Шок в М и В ЗУ є хм М М м КОЗИ око ще ОВО и й Ше сек ке З А ОК о и яю оту МИ КО ВИ О Зо МК де о с ще си Ин Же пе ща Ки УМ я о ко АЖ а и сю ЖИ я і Кк ж ко Ко ж - ки КИ, їх г т КЗ с ще Ба сне: и щі шк й оре де и и ЩЕ жо Кк ОМ ОВ ЯМ, М І Сш Е К З МК с: Б У а Я КК х КО фервтвих НОР педюнемає проміферетнану 5 КЕН о и В СМТ Ен НО пюохиюх кооперативну Ведіть пнідрьких МОН Тк в ОО Шо ЩО на овканевічееех антен и ки нм на х мн ЩЕ Е ЯК КВК Ак еК ЯКВК 5 Довов? Ж хна М Ж М ж б ож. Я шк Якщо Й ї й - 1 ГК ЕК р ва я «З І 515 хв ЕК! КЕ її ї 1 т ВО ие ІН і ШЕ я Пити н ше и В ЖЕ Б БЕРЕ; ЗНО НЕ Н АНЕ НІ ШЕ ЖЕН НИ ЗВ ЩЕ НЕ ШЕ ШЕ НЕ ще ДЕННІ ШЕ МЕНЕ НЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ 551311 Бе І ши Бр Б ШИ ЯКО нЕ ТРЕТІ ще ЩЕ БТ ї й ; А ї ; | : ; Е Ь | ! ВУ Ка 141 се МА Же ИКИЧАКЙ «Кейнсвий ж МК з К Е мк Ж ва М, що кн СНИ ШК ак а НИЄ ЕК. я : й шт У ам о ОЙ п Я КК КК, и А г НН Ше до у НА КОКО Ку У Кох СЗШ ХО ня як ух КМ са М ай сек ши ач Ха У ОО шк У Ба Бе ва Ов сок що кох ее КК и а я Ме ак ШИ ОН СО ж с Ока ь о С я ех Я г ще що МОЖ пе ЗШ ою Сея Ж М Еш в а : ШК ж ШКО М, ЕЕ Ох ОК Е Бе 5 МОЖ ОО щОК я ї хх г о с ше в ак до ж ЖК отче Ох дк, т -ї Б ше 7 іг. 17
Фіг.
ТК чек за | ЗОМ а сК БУ ! щ ї Ка й Ж м З вій К з ВЕ ку ї шо 4 ЕЙ З ех ; З : й Ко, ЩО Е ш- ВК Ж Ме . З с. З х М де т З Ма Ї і . ! РО ІЗ З КЕ с ї КИ : оо КО пої й ХХХ КО ; БО А З Я ОО т5 Е Ж. КО КК -к 5 т. В ВЕ і р ОКО еВ Е ХОМ ; і ск ОО фену Ем ЕК МК. ЗНА ще Ве КЕ ЕВ К т жо гак хр БНО НВ АВ дою ванн ду «е ХА ІКІЖ ХХ КУ КНИ ее Не й ПОД ; Хі за Ще і ТАЄ МЕ КІКТКНИ х ї ТЯ. ВК копка Е Он Інв «ке ща Б ша ШЕ К | кеуоше Ще га НК КЕ пе КК ТЕМ В Е ОЗ же ПЕ й Я: і; Бе Ок Вр. Ї ще ТКУ ій кі ОКУ НОМ А о ї 8 ши ОВУ и МОН: М о БК Ох : о КІ тА У НИ Бе . : й З па жит ВИ р а
Ж и. я ж В. З ВО ЗІ, ОЗ Е- ях КОВО ї Н 3 и ї ее МО Ой у НЕ Ва дюни сеї КЕ Ме - . ЩІ МО Не зо ІК Ох Оси ІДЕ БЕ яв ХЖ. МК Бо Кок в ЗНА Те ВЕ краше КО ах - ЩАНОТКУ- ВЕ КЕНІЯ ВЕ ВЕ Ни ТЕ - ВЕ
Фіг. 15 і « 1
Ж зухсжктьккіїоя; ВНУ Фіхте і кивок ів как ТЯ я Підвевдене МКоклотннна цитетокенчніть, вниликвна ПС, на ВХ дузтручаїую, В мраети КОВО клітинах міицених "В: хват КІ сучків смузідттькоу 1 Ук Ів хх Укр тики Підвищена МК єлЛІТиннНа понродня цитотокоичнсть у пОокеутнаст рр БЕЖ губи ТК до КОВО клітини БО т х Кая хЕ І
Я . КД К в я ща З Зх Ка де Х - Ка і о ї ! КН ї Дт ет тест с Ї : і я ЖЕ з їх К. : З : : сх : ! тА ; шк : ля ; ї : ї ІЗ ІЗ Я ха Е й ХХ З а о вії ее ее - Я СлВ ей Е щи .".
Фіг. 19
МЕТЕЬЩО КА потенціює ефекторну відповуть уитокіна Тплловоь людських Бе ма МеВ рідвовіль зоаських од на ЕВ ах ех ТЯ У т СЕ СУП НтТеТеН сени ФІ «Я гопини зв Зі године Кі що - ЖЕ КН ві: г З що гу ЗИМУ В ЕВ 1 В в в В ПН: ях чу ях БВ В НЕ: ТЕ ух що дя Фо В т Ї ЖЕ ж В В ЕВ іх І 5 У гг КУ Кх що ї аг ї ї по т. м я ще З Ма у : гм ЗЕ і й де Е ВЯ ВЕ бе. КО ве: с. К с. 5 КУ х хх іо а . т -х Ох й Як ще СЕ «М еВ що в а с п р ІВ І ЕВ У КЕ КО ЕН КНУ ЗК о 5 г. ! В о о шо НО во НК НО КК КЗ НИ. реж А КС ЕЕ: ХВ ІЗ Щ ЩКЖІІ м ця Х ТЕсЯ З КЕКС МИ ВК А У ШИ З Я МО Ел СВАТИ ве чи ою че Каши с о Шо М М я М В ши ши шу й ши В а сек ЕК че колон я ї КЗ БСК меми: А Я екв: БООАНЬРОМ меми; З З вев о в ККЗ рнвані І Віднкни ді пюдовких ЗМК жна ЗЕ Відеевниє людних Ме на СЕ - ще суперантнти щік пуперантон ЩО ве ЗА вчи ТЕХ не й зем в | В Я Піди й ! «Я ТОДиННЕ УМ В шо 1 В ФО Ген ЇМ т. СЕ і в и ШИН з с ще Е: х Ж ГУ п 5 Е ЗУ хо зе у їх ІЗ З З Щ М ва МЕ КК ! я | я ЖІ: МЕ щи ш ши ж й й КЗ ІІ З НК Я а 5 ІВ КР НЕ о БК ко ЕЕ УЗ РВК Я ВХ зх Ву КВ ІБК ЗБ ГК У з ше й ВЧ са З З ІН Б БВ Я Ме й ВК Же: 5 КЕ ЕН ТІК РЕ Ме й іму ях КО БИНН с ку. ж НЕ се Я КЕ ЗВЕНЕКЕ ЕВ В М. а М ще М Ох з ше Ше АК Ж нь а НО
Фіг. 20 хи січ: КО ку яких КІ с чхає «Вогеде ПОЗІ жуєтимна лінія вкспівеує МИ не повені клин ер кни ЗИ інте. гучний Експрес: людського Пе БК оепертерної КВТ: МЕНЕ ж - Е ой ї ивай ВІЧЕ Е: 1-- ЖИМ М ІЗ З рух ІЗ фу «МІК Ух і; В Е Ї й : Ї що М Її їх і ї -й А я Гоя ; о Ве ї й / : й Ж : Я З ї ї хо зе. Н ї що ОБ З о. ї вк
5 . ний Із Е ка щ Н ко рочків Кк КУЩ о оселова й сю м р я я Х в, нні кій шен ка аж кож как Аж кни о пи дя ді : ХРАМАХ ІЙ У ї ЗК Анти
Фіг. 21
НОЯ АВ за Ми ОЗ ВА на вияклинає аитУвнеть СС З В г СОС аналіз з МИТО МЕТ АА та НОТ ОВ КА - хе «У І хх СОЯ лм В й Е ;
ОВ. Дрейк їх що Ї сх скін АЛ 53 іч | і як КрОлче Ага ще ї Е: КОХ І Кк е кл Ж ія ОБОХ -- г 3 Ше ме ік ши хх зви зи жи зах ух зви пив вс вана ВКМ АНТ
Фіг. 22
Аналіз Т-кливннк антвлністичної активності й мо Для анти людеьимх антів до ТОНІ пед кьи ье Я ко чаум 53, рю о медик НИВУ С АА підсниює НЕ ПОВ ітАА підомлОє Зичу Жовта 5 о ВЕ У пркродню Т-КитТинму привоадню г кп ннНу ВХТЯВЦЮ З ВИКО НН ЗЕТИВаЦНО З Використано Взичх ТЕ умру сю мертві ЗНЕВ НСНТ гелповтерної дкен- ТЕ репертевняя хлрітинни лін КЛІТИННОЇ ПЕН в - щі 1 КУ що і 5 похлнно : щ- щі 3 Кодж ї СК Ж з Ко чл сиву Е : с і в нщ ді їх Е: І 33 З КОКО ЗХ ї Н Н ОШЕ ши ш Од ; ! Во 1 шо ВО й : т З х. Е котик мо Ім щем. І КЕ і ек Е ХО КВ ШЕ Н КО М : ; ще ШИНИ БЕ он ши У І Ши | їх НІ ! ! ГНЕ НН Ку ; ши щ ше в МИ С ОЕЖ ооо ДЕ т щ Б ББ ББО ж- Б Ж 5 Б ж дж ЩЕ 0 000 в І А СПИ КОСУ КА АХ. У АХ, АХ р АК А - жу АХ, в Га Зх ХЕ ж ех г с Б жк хе а хе кеш ще ши ши ШЕ. ше ше ше ШИ ШЕ: жи нан НН НЕ аа и З В МТ Ж ок ож МУ ОВ є Мох МУ що Йо з м вав НК т ех йо з ях пах йо й пев нн а я м С: т ож Кк й як КА У я Х : Х Га ит Хо Же о Же КО шо ОБУ, ббш Б СО ща ен и сво и З и в п о хх кох че дукхх хе щу Ук ге ж дек и її Же і ща Ехо ом ше що я 8 зе Зб ку й 55 ОО в я ее дсах ВЕУ ск роох дю ек «М КЕ шо ОО ЩО же о я Я о ОЙ р ви зи в ЗИ ре ие пи я я пе НН 7 реж и У м с КІ ре - І Є, н
Фіг. 25
Яни ГК тиеНОЇ ДУ НКТ ВКЕТЯ НИК У для стек Кіль ца мовчав й Ге жи днтя-яюдевКих ЗЕТИТИ де ПО КО ілра кі КЕ ІА УВИИ КОНТ. А ян НИВИ ВНТ ТЕКА Не а сх ри нк су днк нн нд кн кн платня й снкнкняк, ; ї : і Н і й ; ї і ІЗ х 1, 3 ї Її : : З Ж 3 Е З А Ії й Е х ТХ : ГУ ПУ і ї ІЗ 5 Я З Кі В 8: ї ї ї : КО Я Н Н і їй І ОК З Н Кк Б 5 хх що Х І ІЗ Ж то МОЮ с ІЗ ї В г З КОД Ж. Н ї т Мт ї ЗК Зк ; ія З Ох ї Б ТеКЯ 3 Й І: Е СЯ п Н Ге: Кан її ї Е їх. й ІЗ КО іти ЖІ »; ІЗ Кк з ог ІЗ З: КОН хи В І ї ТЕ ння І: ЗХ ПДВ КО |З : ЗЕ З ЗХ НН яу З Е хх МИХ І ІКТ 11 ВІТИ ІМ ї Я ел | с ВНеНЕ рот ї ї ОКХ ї МІЖ ОХ ння : ї г: УКХ НН ЕХ НН Н ї С За дя НН пфртивиціиній І ї КО Я суч МБ днновюттьсьі З ; КО ЗНИАН ; КУ КВ са х ее у КК У У "учедяй но МОМ Ще ООН ОЛК сш ши ЕН що щво ку
Фіг. 24
НГ. еклинех. З КЕ дес ше чи Е; ЯЕМ Я ; : і ! : схил х МЕ В : : ї : ї м Я ІЗ ЖЕ Е ї ї с зт: АЙ ІН Я НО Е що ї Мооодаля 5 3 КУ | : А І : наче СК ІЗ ІЗ ще НЕК зле Е І Шо пи ї І І г ІЗ сет Ж І У ОХ сосок Я Ж Я х і : х п лляних ри -у Е. І сннндчкя Е і сонник Е У; ШИ : ! я ! а : Ж з рек е ЩО себбоккннюююв ення і, А В: и Й Т : З МЕС ит МД ОБ ПЕВ х КАК Б Кк закгіх Зпрадутвів моих КОНТ НЬ ОБАМИ хх МЕ ЕК НОВ БУ ЕМ КОМІ х
Фіг. 25
ІГ.
МАХНО АЖ ААААААК ЖК КАК АКА КК А КК КК КК Кк нн, в: ОА ЛЕЖЯ 1 Її о БК Н нн пи п и СХ и мини Ж сонемаьицкосне 3 Кесноюк ка вики Твоя М ко КЕ у СУБТЮКВИЧНКВ З Ккереківовкв в яанкен ТЕВЕ КОТЕННЕ ОХ КМ. Е ГУ Ж педа у М ИК. 5 КЗ і 0 х ЩО В ЕР о. о но ІЗ М МУР КЕ ХЕ сх х з МЕ : МІ ОХ а ЗАМКУ З їх Зх І кон на НН НН о ВХ 3 ЖОВ сужудими я ЖЖ УК КиК, М М Ж ООН мети ВО и Б Х ежхуна ем Ж КЕеХ ЖХ МОХ З ккннкнккнн ВВ Іон Кк хх ЗОВ -х ОО що Ж КОЗАК ТКА М КО МК КМЖЕ ПАХКОСОМАТХ п. МОЖ - Фінна фо кн КК ОО ОО ВО кала Її ве мм З ев і і ЕЙ МУ щМшЮ МУ ЕООНН в я ОХ 1 Верн финннкнння Е ВН ВЕ ВІН ВУ ОО ВИ КОКЮ реж тиж ОХ і де ТУ Е КН ЕКО З ОО З они МН нн ни ох КК 1 ра: пе в А В ОКО КОХ З Я ї г: МКК ЕХ МОСК ! Е їо-ано СОКОМ о : Ф с го У за сх З Е нах дв ПВ ВВ Ко З че ев ПН Кн в о Ех хх І ! ТО вфен КОС М о . З З ЯКя ен ЗО М о Моя ус В фо є НО и В : | ОКА : ВАК ик чек те к ок ДИ КИ НИВКИ І ОК І КОКО КН ИН : І МЕРТВЕ АКя ОВ І: : го Ух НИМ о Я І Е ШК НЕ І М і ООБМУЄ НЕО КАЖУ КН МО Я І Я ою скін ткож Х х І сх, ху аку В и о МЕ СОКУ о с І З у Кооююєююююююююююкой МО днк ДО ОХ ї у І фея Кн ВК що з: фе ВОНО ИН ОО ; «рено сс ІЧ ше В З УМО КУ 1 ЗНИННЕ и ї вишу аж ре и а и І І КА Я КАЖУЧИ БЕ ОН ЗО Мод Н ПИ ОН Пливе ОВНС ІЧ ще хе сені пох КК КК І У ЕК САМЕ КК ПЕК І І пі ЕН ЕК М В МКК ІЗ І НЯ ЕК ЗА КК сх Ж ІЗ Х вуддццих Вон фон кн ко МОЖ: З ІЗ 5 ; КУ ХКОК Я ГТ НянАва пон н ва ІЗ ще хх, ХЕ КИ КІ КК МКК КО их М ве она т нин И У ШИ ка І шШШНННи с лих: ТЕКА КК Х КК у кла і ХУ БАХ ОО ІЗ ІЗ Х т х хо ще ї ІЗ В схучео мої т р ВОК КК ХЕ «и а КЕ ка ви Кеемвані ГК МК ВеиВ КК ТОМУ КОХ ШНЕКМННИЧ осуд уки махи КАХ КУ КОМАХ Фк т Ви ЕВ В КК ОК СОТ ДММКХ КОМ ЕНКАК Е о МОЗКОМ о КО замааннькь с Оаи ОО ЗК ВХ моно Ух Мих ета та і ут МВ ОЗ М о аг КИ ЗУ ПК Ин : Е Кук якЯ пе КИ МКУ о. ВО До : ТКУ умі мим, ж т МНК а УВУ Я гів хи МКК ЕК Я он о нн ОК ВК К х КО У КК І ке х ї вв и и МКК ее ко МКК І БОМ ВИШ КВК ша НЕ ТИ СМ Смс поз ВИЗ ОК КН о В ня КО З ТК КК ВОЗ ще МЕ ПОД они ї в и Не о й СОКАХ о ІПН СКМ Ву мих ки му ВН КВК, Ми КС . я
Фіг. 25А ї 5 ї і ї ЕВ ї і. КІ
Фіг. 266
НО» шк й й и Б ДУ щі КУ сь З ПИ, ЯЗ Ж ско Я З, - МОМ Ки й УНН з я ко і сек ення А, вся На Ж. ЯК зе ще пу З ФМ а ее ДЬ. рія і й ах КА У о їхх й о см М вк жо Що і зк Вес ку а « Е пий НН я же Я й Ж. ща ЯН ша Кум руч пече Ковцентраців антихиачнМ! БО ппенкнов нан жи зак Я яку склу ши З . 135 о: ЖЕКу Є с «х знякююооі фею ! МА пови Кун вх ; дае ТК НА роз ! учи Й цк нан Енн з й Дннкнннкнекннмнвжнмевнкнофмеоввемеветннскмовогой ШК и ШИ одно МТА нення КВса Мав Ве ня нен фен ГЕН за с З В ЕК" щих х ; горе К ЕХ Кей Е КК Уж У ТКУ ї Ви ї зно В оон ЩА Кк Та ї Я й й иа НВ ее ! сен , Й ГА ЕВ ! фі М Х х ЕХ Ве ЗЕРЕН АН ен и РОКУ зоетоеня КА повововв вовк З оскнннннно нн кунннняннкн Дннникн с м днинкнкнннянЯ ще й ; і пу тини З МЕа ХУ і Х : МАК ї ; є пре У ої ее НЯ завіннннм фонів
Фіг. 27 ай п ов а усу є щі Що,
Фіг. 28
Ме к сон оч 0 бо ду її ще КН ВН КК х Кк й Ж ї НІ сту ВЕ в- й ї І р. Ся МІВ її Мтуогом, М КН | а Сееню ра е ож Ж Во. Ї,дпяляянннвввесссссссююсо
3. Ве Я Й фу с ді зе зв я «ух ЖЕ як й НЯ х й Ку . ї І. Іза Зі: званих аль аа зни ик ки Мак кн уия ао а о ща що ХК ре шо ЕЙ в гюОх «ік хі» Кз х т ій Ж це А еВ ше а в КВ ев ЦЕ кі м й ОМ НН в в о НВ В ах ЕК а о ч ВК МК С Ки В А ОО БО ек х с ОК У « ще
Фіг. 29А . ; в ща М Ко Ба -- З в щі т З як З сю Її З В ЕЕ КЕНЕ що ДУ Есе й е вік Пп Е е йк СКВЕКОУ до З є. я ї Й (ІК АЛЛА о кесккжкклн ково е є Я од. що ва ема ше жен з я - й з ПЕВ з ме Я їй пом оман ши мно Са дід и к Кі ве АТ КО М с и М и мікс ЯК НК і ОО В о КЕН Мода КОЖ КО Й КМ КК А Кн
Фіг. 2985 й " кму ІМК і КІ щи що 7 г се пох ЕК Оса ХЕ ще у их ре КО Слона ях годе В мя Вк а МИХ З З як В в як «пінеток осееюєсєтно ша ї с. ж Вб ов в І ки коки В НЕ щі айв в ж вай ок Х пт тренера р тре» ди а о КИ НА Б У я ДИ ИН Є - хи тю Ву а Ту ім о дл в в М НН хо о «Ж ех он Те ВМ а МЕ о ОН о НО ЕК о В, М В В сю а КЗ У «У с Х СЕОК м З ку Кс чу що Ей з ск п - й
Фіг. А я щ ОН сб ї КУ їх ї о ва ромоентенннтннннннну ПО " о Сеев ру : - ; да ЩО ЩО суха Б шк ва букв ко М он фе А : ТЕ вом е ща РИ Ф М - їх: - Ех ЧИ Ж. Я ко пи и Шекиноченисие чия чну Ка зи нн ар МА в В ши В о хм В кп зй Ф я ше: і Б Й -
Фіг. 30В .". і т
: х Н к І Ж Я х Е В с вк. М я
З. ХК, ме ОО ко ІК ЗО ЕК ен б, жо х є ж кХ яо оо й с Я з ее, БУ конк ТИ я їй до МО преефна КЗ ок ЕН ЦЕ 31 ення ТЕН; Вк МК ху Ії її гу до згз Син Її 1 С; ; СЕК НЕ вки ЕНН: Е; Я ОВ Ка 1 се ПОН ТЕН В АЖ сему фен РІ: 15 о. т КВ НН КАК хх : я МЕЖ 135 Е г і ж НО
; о. зв акакяк ня НН ШИ: о У СЯ Н ий НН: БЕ Ох З ВЖИ. Ма ННЯ ВУ нк жу Я За я ЖЕ ; ї Б КУ ее ТО ТЕБЕ ЕЯ КО МК З іекрнда Ох ТЕЧЕ ї ЕЯ РУХ ОХ НЕМЕИК и ЕРТЕЕХ ї о. ей ай СО НАЕИЧН: ! Б а онесня ЕНН: : ОХ ХХ КН ТОК 2351: у інн Ми НБН о ж о Я КО х кун їз ОО ТфЕТЕВ КО З дкожах ННІ КАХ ще У щу не ех жо я їх ЕВ о жен Ми НЕ Е ЗК А ГЕшке ВЕ Он ЕНН 15 ОО вик кв НЕЖЕ се 3. ІЗ но о дев Ж б кодеки 113 НЕ рів АХ КУКА Я ке ПЕНІ З «с о. ЖеКРЕК. МН НЕНЧНЧЕ: КОВО: то с КУ, М КН х З ке ух и ХЕ 1:53 й ше мя К 1 Я Е ж ення екв НА З ке й гокннн ОО ЗННІЇ ве 8 Б НН ще ї ко і Ер 0 Аж 2 " ША З ОК ЕК Й й й З Є й с. І ри «ее кам дв че К А ка « оду че я фі іс.
пн нин ПЕК и уннин ДИШИИ МУКА КУКИ ни пишне нини кккккккікнкнн СЯ В спи тест дн ЗЕ На ТЕЖ Тк Елаю. ФО : ! нки ПЕ В В тен ши ЗМ Е пемеда ек йти Зою Кк дк 1 туда р ух фрі ДЕАЗНИМа ЗУ ТННЕ рок Би АВК. оно фееоентнкювтнюннкннн ке Е З те зако ЖЕ ок де МО у нен ї що . Е тн ве и Кв Кк і ж ле ЩЕ фелевенюре СОВИ ЯМА ІЗ щк й ВИНИ ЗМК сек - ООН р КЕ : й ши о 7 Керн ВВ. кВ доп ще ХК пек КЕН М АТ З У кіна ЛВ АК Е пн нин пон нн о зурае ет ит КОМ КК т ЗВО ТТ олітхві Тег вті ЕЕ. КУКИ елжНЕ ТОВ КМ ЦК ІТК ЖЕК Же НЕОН ЕЕ с Кожен ср и ЗЛО ІІ о КК ХО ще во . ІАЕ ентова сум па дя не о р АКНЕ КК УК ВАК У І МУК пи о сх З ПЕВ сні я Ж» ВЕ ЗУ В ЖЕНЕ зе М мМ УКХ КАШ ї щи лежу шк ія ТО
Е. 5 ЗеК Та т ие З ТС С Ко и о ! | Шк " а ВОК Я і ера гуд мук СЯ М: Мод К ТЕН Ед Ху» Ку их пе К: зими Коти о сфкр ле ЗОВ Модвкнаюу ТТН шани іх зе МИХ ОК ХНЕ сижчзуки Ки МИМОМИМ У НяННа ! | ТЕ СО с Клин 00 ВЕК З КОМА ню попе ою кю п. х КЗ ХУ КЕ ПОН В гук кд: к У 7 ойененювае ронесвеннонмо путч уран кА ння ОО Ух тек ПЕВ ЕН І АЖОЮо БОЯХ ЗТ МТК А Му КЗ КУН ТНЕ, ПВ Й --. І І ее де че У дХ Ше снеки хх най ОВК Пн Кесівьких КН ЕСЕ | Зак ТОВ ОВ ах о НН умань мує ве ІЗ ї пк страх и я ї уки юки Хткки ПИШНИМ ї ТІ деко МОМ, ТЕ мХ ОВ. оОТНеКЕ фея с х : З ект В оове пеіу маком ід» ну МО кар бититенпрече СНИ ЛЯ Не М М х їх й ХОМ : х селі звававв БО х МеКИЧ Іржі я ев ОЗ ї М НИК КУ МІК КО Хе ІЗ кніхнне РОМІВ КК УКХ у З Скноокю нічні, А ХК іг. 32А
Фіг. .
Ріваме вкопреєі й В Ко ї І МХ ! : ща Ж Бі : ! ій А
Фіг. 328
UAA201809862A 2016-03-04 2017-03-03 Антитіла до tigit UA125898C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662304045P 2016-03-04 2016-03-04
US201662413025P 2016-10-26 2016-10-26
PCT/US2017/020719 WO2017152088A1 (en) 2016-03-04 2017-03-03 Antibodies to tigit

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125898C2 true UA125898C2 (uk) 2022-07-06

Family

ID=59744453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201809862A UA125898C2 (uk) 2016-03-04 2017-03-03 Антитіла до tigit

Country Status (18)

Country Link
US (3) US10537633B2 (uk)
EP (1) EP3423089A4 (uk)
JP (2) JP7109382B2 (uk)
KR (2) KR102588359B1 (uk)
CN (2) CN116514976A (uk)
AU (2) AU2017228474C1 (uk)
BR (1) BR112018067458A2 (uk)
CA (1) CA3014934A1 (uk)
IL (1) IL261188B (uk)
MX (1) MX2018010485A (uk)
MY (1) MY191649A (uk)
PH (1) PH12018501778A1 (uk)
SA (1) SA518392332B1 (uk)
SG (1) SG11201806992VA (uk)
TW (2) TWI752012B (uk)
UA (1) UA125898C2 (uk)
UY (1) UY37141A (uk)
WO (1) WO2017152088A1 (uk)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3049445A4 (en) 2013-09-24 2017-10-25 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
CA2946398A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
MX2018010485A (es) 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).
CN117586403A (zh) 2016-10-11 2024-02-23 艾吉纳斯公司 抗lag-3抗体及其使用方法
MX2019006072A (es) 2016-11-30 2019-08-14 Oncomed Pharm Inc Metodos para tratamiento de cancer que comprenden agentes de enlace al inmunoreceptor de celulas t con dominios ige itim (tigit).
WO2018187191A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Jounce Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of cancer
EP3618863B1 (en) 2017-05-01 2023-07-26 Agenus Inc. Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
WO2018220446A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Compugen Ltd. Triple combination antibody therapies
WO2018229163A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 King's College London Methods of activating v delta 2 negative gamma delta t cells
US11542312B2 (en) 2017-06-19 2023-01-03 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-2 superagonists in combination with anti-PD-1 antibodies
EP3484925B1 (en) 2017-07-27 2020-05-27 iTeos Therapeutics SA Anti-tigit antibodies
WO2019023504A1 (en) 2017-07-27 2019-01-31 Iteos Therapeutics Sa ANTI-TIGIT ANTIBODIES
EP3689909A4 (en) * 2017-09-29 2021-12-29 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
US20200399376A1 (en) * 2018-02-26 2020-12-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2019173692A2 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Agenus Inc. Anti-cd73 antibodies and methods of use thereof
AU2019239850A1 (en) * 2018-03-19 2020-10-29 Lanier Biotherapeutics, Inc. High affinity neutralizing monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (PD-L1) and uses thereof
AU2019276578A1 (en) 2018-06-01 2021-01-14 Compugen Ltd Anti-PVRIG/anti-TIGIT bispecific antibodies and methods of use
JP2021532058A (ja) * 2018-07-25 2021-11-25 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及びその使用
CA3107596A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Seagen Inc. Anti-tigit antibodies
JP2022514702A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 二機能性抗ｐｄ－１／ｉｌ－７分子
KR20210113282A (ko) 2019-01-07 2021-09-15 아이테오스 벨지움 에스에이 항-tigit 항체
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2020185739A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Jounce Therapeutics, Inc. Anti-icos antibodies for the treatment of cancer
CN109734806B (zh) * 2019-03-15 2022-07-01 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用
KR102332847B1 (ko) * 2019-06-13 2021-12-01 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도
CN114269782B (zh) * 2019-07-15 2023-12-29 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗tigit抗体及其应用
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
CN114423793A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 分子模板公司 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
US20220378909A1 (en) 2019-11-05 2022-12-01 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of Treating Cancer with Anti-PD-1 Antibodies
TW202124452A (zh) * 2019-11-14 2021-07-01 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 抗tigit的新型抗體
US20230057899A1 (en) 2019-12-05 2023-02-23 Compugen Ltd. Anti-pvrig and anti-tigit antibodies for enhanced nk-cell based tumor killing
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
CA3176497A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Fatima MECHTA-GRIGORIOU Antxr1 as a biomarker of immunosuppressive fibroblast populations and its use for predicting response to immunotherapy
WO2021247591A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Arcus Biosciences, Inc. Antibodies to tigit
WO2021257124A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Genentech, Inc. Treatment with anti-tigit antibodies and pd-1 axis binding antagonists
CN111718415B (zh) * 2020-07-03 2021-02-23 上海洛启生物医药技术有限公司 一种抗tigit纳米抗体及其应用
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
KR20230098221A (ko) * 2020-10-26 2023-07-03 아케소 바이오파마, 인크. 항-tigit 항체, 약학 조성물 및 이의 용도
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022117572A2 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2022124864A1 (ko) * 2020-12-10 2022-06-16 주식회사 유틸렉스 항-tigit 항체 및 이의 용도
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
IL307419A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Ose Immunotherapeutics A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties
TW202304965A (zh) 2021-05-04 2023-02-01 美商艾吉納斯公司 抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ９６抗體及其使用方法
EP4339208A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 MediMabbio Inc. Anti-tigit antibodies and use thereof
WO2023010094A2 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
KR20240046905A (ko) * 2021-08-20 2024-04-11 아케소 바이오파마, 인크. 항-TIGIT 항체 및 TGF-βR을 포함하는 융합 단백질, 이의 약학 조성물, 및 용도
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
CN114480298B (zh) * 2022-04-14 2022-06-24 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一株分泌抗tigit单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
WO2023215719A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Arcus Biosciences, Inc. Anti-tigit antibodies and uses of the same
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023239228A1 (ko) * 2022-06-10 2023-12-14 메디맵바이오 주식회사 항-tigit 항체, 인터류킨-15, 및 인터류킨-15 수용체 알파 스시 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024015251A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Arcus Biosciences, Inc. Inhibitors of hpk1 and methods of use thereof
WO2024020034A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 Arcus Biosciences, Inc. Cbl-b inhibitors and methods of use thereof
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024041639A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies targeting tigit and uses thereof
WO2024059142A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Arcus Biosciences, Inc. Dispersions of etrumadenant
WO2024081385A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Arcus Biosciences, Inc. Hpk1 inhibitors and methods of use thereof
WO2024086718A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Arcus Biosciences, Inc. Lyophilized formulations of cd73 compounds

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69426527T2 (de) 1993-06-09 2001-08-30 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen, die scfv fragmente enthalten, in transformierten schimmelpilzen
US7473423B2 (en) 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
CA2253942A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Biogen, Inc. Common gamma chain blocking agents
JP4619651B2 (ja) * 2001-06-01 2011-01-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用
WO2003072035A2 (en) 2002-02-22 2003-09-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
EP2277532A1 (en) 2002-09-11 2011-01-26 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
KR20120035234A (ko) * 2003-04-11 2012-04-13 메디뮨 엘엘씨 재조합 ｉｌ?９ 항체 및 그의 용도
JP5004154B2 (ja) 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
ES2772674T3 (es) 2005-05-12 2020-07-08 Zymogenetics Inc Composiciones y métodos para modular respuestas inmunitarias
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
JP2009538120A (ja) 2006-04-13 2009-11-05 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 四量体化ポリペプチドおよび使用方法
FI20075059A0 (fi) 2007-01-29 2007-01-29 Valtion Teknillinen Allergeeniä sitovat monoklonaaliset IgE-vasta-aineet ja hypoallergeenit:tyypin l lgE:n ja allergeenin immunokompleksivuorovaikutus
JP2010516747A (ja) 2007-01-29 2010-05-20 バルティオン テクニリーネン トゥトキムスケスクス ＩｇＥを主成分とする新規試薬の製造方法
WO2008127735A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
WO2009064944A2 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
WO2009073163A1 (en) 2007-12-03 2009-06-11 American Type Culture Collection (Atcc) Avian influenza antibodies, compositions, and methods thereof
MX364200B (es) 2008-04-09 2019-04-16 Genentech Inc Composiciones y metodos novedosos para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la inmunidad.
WO2009154026A1 (ja) 2008-06-20 2009-12-23 国立大学法人岡山大学 石灰化小球に対する抗体及びその用途
FR2933702A1 (fr) * 2008-07-08 2010-01-15 Sanofi Aventis Antagonistes specifiques du recepteur fgf-r4
US8183346B2 (en) 2008-12-05 2012-05-22 Eli Lilly And Company Anti-ferroportin 1 monoclonal antibodies and uses thereof
EP2419447B1 (en) 2009-04-17 2017-08-23 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
DK2462161T3 (en) 2009-08-06 2017-06-06 Immunas Pharma Inc Antibodies specifically binding to A-beta oligomers and their use
WO2011047146A2 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods of affinity maturing antibodies
CN106397588B (zh) 2010-02-26 2020-09-08 生命北极神经科学公司 原细纤维结合抗体及其治疗和诊断帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的应用
FR2959416B1 (fr) 2010-05-03 2012-06-22 Monoclonal Antibodies Therapeutics Mat Biopharma Utilisation d'anticorps anti-cd71 pour la preparation d'un medicament
CA2802017A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
JP2012021943A (ja) 2010-07-16 2012-02-02 National Cancer Center 子宮体がんの検査方法、子宮体がんの検査薬、並びに子宮体がん抗原に対する抗体
WO2012021834A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Baylor Research Institute Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
EA201390472A1 (ru) 2010-10-29 2014-02-28 Иммьюноджен, Инк. Новые молекулы, связывающиеся с egfr, и их иммуноконъюгаты
WO2012078793A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to tazarotene-induced gene 1 (tig1)
MX356400B (es) 2010-12-08 2018-05-28 Abbvie Stemcentrx Llc Moduladores novedosos y metodos de uso.
US20120231023A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 Baylor Research Institute Novel Vaccine Adjuvants Based on Targeting Adjuvants to Antibodies Directly to Antigen-Presenting Cells
WO2012129227A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Baylor Research Institute Dendritic cells (dcs) targeting for tuberculosis (tb) vaccine
WO2012135132A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Baylor Research Institute Compositions and methods to immunize against hepatitis c virus
JPWO2012176765A1 (ja) 2011-06-24 2015-02-23 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ヒトｐ−カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体
IN2014KN01715A (uk) 2012-02-21 2015-10-23 Toray Industries
RU2632645C2 (ru) 2012-02-21 2017-10-06 Торэй Индастриз, Инк. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака
AU2013203506B2 (en) 2012-02-24 2016-06-09 Abbvie Stemcentrx Llc Novel modulators and methods of use
US9416193B2 (en) 2012-03-30 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of liver cancer
DK2832366T3 (en) 2012-03-30 2018-01-22 Toray Industries PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND / OR PREVENTION OF Gallbladder cancer
CA2869473C (en) 2012-04-03 2020-06-09 Novelmed Therapeutics, Inc. Humanized and chimeric anti-factor bb antibodies and uses thereof
CA2869704A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Perseus Proteomics Inc. Drug conjugate comprising anti-cdh3 (pcadherin) antibody
RU2014145633A (ru) 2012-05-14 2016-07-10 Дженентек, Инк. Композиции и способы для диагностики и лечения опухолей
US20140056890A1 (en) 2012-06-06 2014-02-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Binding Agents That Modulate the Hippo Pathway and Uses Thereof
EP3508215A3 (en) 2012-12-03 2019-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
MX2015006973A (es) 2012-12-04 2015-09-28 Oncomed Pharm Inc Inmunoterapia con agentes de enlace.
WO2014189973A2 (en) 2013-05-20 2014-11-27 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
US10364288B2 (en) 2013-05-24 2019-07-30 Biogen Ma Inc. Anti-GPIIB/IIIA antibodies or uses thereof
TW201536811A (zh) 2013-05-31 2015-10-01 Biogen Idec Inc 嵌合ｆｖｉｉ－ｘｔｅｎ分子及其用途
PL3021869T3 (pl) 2013-07-16 2020-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworu z użyciem antagonistów wiązania osi PD-1 i inhibitorów TIGIT
JP2015066079A (ja) 2013-09-27 2015-04-13 オリンパス株式会社 超音波処置具、及び手術システム
PL3192812T3 (pl) 2013-12-17 2020-10-19 Genentech, Inc. Przeciwciała anty-CD3 i sposoby ich zastosowania
JP2017502023A (ja) 2013-12-24 2017-01-19 ノーベルメッド セラピューティクス インコーポレイテッド． 眼疾患を治療する組成物および方法
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
WO2015133882A1 (ko) 2014-03-07 2015-09-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 ScFv 항체 라이브러리, 이의 제조방법 및 이를 이용한 ScFv 항체 스크리닝 방법
ME03558B (me) 2014-03-14 2020-07-20 Novartis Ag Molekuli anti-lag-3 antiтela i njihove upotrebe
CN106132439A (zh) 2014-03-31 2016-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法
MX2016017288A (es) * 2014-07-16 2017-06-27 Genentech Inc Metodos para tratar el cancer con inhibidores de tigit y agentes contra el cancer.
JP6670297B2 (ja) 2014-08-07 2020-03-18 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 抗セラミド抗体
JO3664B1 (ar) * 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة لـ tigit
RU2017119428A (ru) 2014-11-06 2018-12-06 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая применение агонистов, связывающихся с ох40, и ингибиторов tigit
JP6779876B2 (ja) 2014-11-19 2020-11-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体抗体及びその使用方法
JP6993228B2 (ja) 2014-11-19 2022-03-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体／抗ｂａｃｅ１多重特異性抗体および使用方法
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
MX2018010485A (es) * 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).

Also Published As

Publication number Publication date
JP7109382B2 (ja) 2022-07-29
JP2019513817A (ja) 2019-05-30
TW201734043A (zh) 2017-10-01
AU2017228474C1 (en) 2024-03-28
TWI805127B (zh) 2023-06-11
PH12018501778A1 (en) 2019-05-15
KR102588359B1 (ko) 2023-10-13
IL261188B (en) 2022-08-01
US11723971B2 (en) 2023-08-15
TW202237646A (zh) 2022-10-01
AU2024200018A1 (en) 2024-01-25
CN108883164A (zh) 2018-11-23
UY37141A (es) 2017-09-29
AU2017228474B2 (en) 2023-10-05
CN116514976A (zh) 2023-08-01
EP3423089A1 (en) 2019-01-09
US20170281764A1 (en) 2017-10-05
CA3014934A1 (en) 2017-09-08
TWI752012B (zh) 2022-01-11
SA518392332B1 (ar) 2023-01-22
EP3423089A4 (en) 2019-10-23
MY191649A (en) 2022-07-05
KR102355950B9 (ko) 2023-10-26
WO2017152088A1 (en) 2017-09-08
US10537633B2 (en) 2020-01-21
IL261188A (en) 2018-10-31
CN108883164B (zh) 2023-04-07
KR20180119653A (ko) 2018-11-02
KR102355950B1 (ko) 2022-01-26
US20240115696A1 (en) 2024-04-11
AU2017228474A1 (en) 2018-08-30
KR20220024837A (ko) 2022-03-03
BR112018067458A2 (pt) 2019-01-02
JP2022126847A (ja) 2022-08-30
SG11201806992VA (en) 2018-09-27
MX2018010485A (es) 2019-01-10
US20200297844A1 (en) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125898C2 (uk) Антитіла до tigit
US20200376052A1 (en) Combination of oncolytic virus with immune checkpoint modulators
ES2900233T3 (es) Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas
CN109824778B (zh) 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
SA517390370B1 (ar) عوامل ربط للمستقبلات المناعية من نوعية واستخداماتها (tigit)
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
SA517381676B1 (ar) Pd-1 أجسام مضادة ضد وطرق استخدامها
UA125718C2 (uk) Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
JP7352473B2 (ja) がん細胞を標的化するキメラ抗原受容体のための方法および組成物
UA126802C2 (uk) Композиція, що містить антигензв’язуючий домен, який зв'язується з tigit людини
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
UA126269C2 (uk) АНТИТІЛОПОДІБНИЙ ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИЙ БІЛОК, ЯКИЙ СПЕЦИФІЧНО ЗВ’ЯЗУЄТЬСЯ З ПОЗАКЛІТИННИМ ДОМЕНОМ CD3<font face="Symbol">e</font> ЛЮДИНИ І З CD123<font face="Symbol">e</font>
UA111612C2 (uk) Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
UA125490C2 (uk) Анти-vista антитіло і його антигензв'язувальний фрагмент
UA126964C2 (uk) Конструкція біспецифічного антитіла, що зв'язується з дпб3 (dll3) і кд3 (cd3)
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
CN107106670A (zh) 用于修饰的t细胞的方法和组合物
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
UA112062C2 (uk) Cd33-зв'язувальний агент
UA105445C2 (en) Normal;heading 1;heading 2;heading 3;ANTI CD37 ANTIBODY
UA119226C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку
UA118013C2 (uk) Комбінована терапія з використанням антитіла до клаудину 18.2 для лікування раку