MX2014013806A - Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores. - Google Patents

Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.

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Jo-Anne S Hong
Jagath R Junutula
Isidro Hotzel
Yonglei Shang
Shang-Fan Yu
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Abstract

La presente invención se dirige a composiciones de materia útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumores en mamíferos y a métodos para utilizar esas composiciones de materia para los mismos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisionales de E.U.A Nos. de Serie 61/646,803, presentada el 14 de Mayo de 2012 y 61/776,603 presentada el 11 de Marzo, de 2013, tales solicitudes se incorporan por la presente para referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias presentado en formato ASCII a través de EFS-Web e incorporado por la presente para referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 11 de Marzo de 2013, se nombra P5043R1 O_PCT SequenceListing.txt y es de 62,928 bytes de tamaño .
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones de materia útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumores en mamíferos y a métodos para utilizar esas composiciones de materia para los mismos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades cardiacas (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que eventualmente se difunden a través de la sangre o sistema linfático hacia los nodos linfáticos regionales y hacia sitios distantes a través de un proceso llamado metástasis. En un estado canceroso, una célula se prolifera bajo condiciones en las cuales las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasión y agresión.
En intentos por descubrir los objetivos celulares efectivos para diagnóstico de cáncer y terapia, los investigadores han buscado identificar polipéptidos de transmembrana o de otra manera asociados a membrana que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de célula cancerosa, en comparación con, en una o más células no cancerosas, normales. Con frecuencia, tales polipéptidos asociados a membrana se expresan de manera más abundante en la superficie de las células cancerosas, en comparación con, en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales polipéptidos de antígeno de superficie celular asociados a tumor ha dado origen a la capacidad para tener como objetivo específicamente células cancerosas para destrucción a través de terapias con base a anticuerpo. En este aspecto, se observa que la terapia con base a anticuerpo ha probado ser muy efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXA ® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado exitosamente para tratar cáncer de mama y linfoma no de Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del proto-oncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) . La sobreexpresión de la proteína HER2 se observa en 25-30% de cánceres de mama primarios. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal de murino/humano quimérico genéticamente diseñado dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B normales y malignos . Ambos de estos anticuerpos se producen recombinantemente en células CHO.
A pesar de los avances arriba identificados en terapia de cáncer de mamífero, existe una gran necesidad de agentes adicionales de diagnóstico y terapéuticos capaces de detectar la presencia de tumor en un mamífero y para inhibir de manera efectiva el crecimiento de célula neoplásica, respectivamente. De acuerdo con lo anterior, es un objetivo de la presente invención identificar polipéptidos asociados a membrana celular que se expresan de manera más abundante en uno o más tipo(s) de célula(s) cancerosa (s) , en comparación con, en células normales o en otras células cancerosas diferentes y utilizar aquellos polipéptidos, y sus ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y detección por diagnóstico de cáncer en mamíferos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente especificación, los Solicitantes describen por primera vez la identificación de polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos de codificación o fragmentos de los mismos) que se expresan a un mayor grado en la superficie de uno o más tipos de célula(s) cancerosa (s) , en comparación con, en la superficie de uno o más tipos de células no cancerosas, normales. En la presente se hace referencia a estos polipéptidos como polipéptidos Objetivo Antigénicos Asociados a Tumor (polipéptidos WTAT") y se espera que sirvan como objetivos efectivos para diagnóstico y terapia de cáncer en mamíferos.
De acuerdo con lo anterior, en una modalidad de la presente invención, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido objetivo antigénico asociado a tumor o fragmento del mismo (un polipéptido "TAT") .
En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido TAT de longitud completa que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de codificación de un ADNc de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente, la secuencia de codificación de un polipéptido TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, la secuencia de codificación de un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT el cual es, ya sea eliminado del dominio de transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana, o es complementario a tal secuencia de nucleótidos de codificación, en donde el (los) dominio (s) de transmembrana de tal (es) polipéptido (s) se describen en la presente. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipéptidos TAT descritos en la presente.
En otros aspectos, la presente invención se dirige a moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan con (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente, o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En este aspecto, una modalidad de la presente invención se dirige a fragmentos de una secuencia de codificación de polipéptido TAT de longitud completa, o el complemento de los mismos, como se describe en la presente, que pueden encontrar uso como, por ejemplo, sondas de hibridación útiles como, por ejemplo, sondas de diagnóstico, cebadores PCR, sondas de oligonucleótido antisentido, o para fragmentos de codificación de un polipéptido TAT de longitud completa que pueden codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-polipéptido TAT. Tales fragmentos de ácido nucleico son usualmente de al menos aproximadamente 5 nucleótidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, O 1000 nucleótidos en longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia más o menos 10% de esa longitud a la que se hace referencia. Además, tales fragmentos de ácido nucleico usualmente se comprenden de nucleótidos consecutivos derivados de la secuencia de codificación de longitud completa de un polipéptido TAT o el complemento de los mismos. Se observa que nuevos fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido TAT, o el complemento de los mismos, pueden determinarse en una manera rutinaria al alinear la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido TAT con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un número de programas de alineación de secuencia bien conocidos y determinando que fragmento (s) de secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido TAT, o el complemento del (los) mismo(s), son nuevos. Todos de tales nuevos fragmentos de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido TAT, o el complemento de los mismos, se contemplan en la presente.
También se contemplan los fragmentos de polipéptido TAT codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, preferentemente aquellos fragmentos de polipéptido TAT que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-TAT.
En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas identificadas arriba en la presente.
En un cierto aspecto, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos, con un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de una proteína de polipéptido TAT de transmembrana, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente .
En todavía un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleótidos que se híbrida con el complemento de una molécula de ADN que codifica (a) un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, (b) una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, (c) un dominio extracelular de una proteína de polipéptido TAT de transmembrana, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente, (d) una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente o (e) cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente.
En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido TAT aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o sin la metionina inicial y se codifica por una secuencia de nucleótidos que codifica tal una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente anteriormente. Los procesos para producir los mismos también se describen en la presente, en donde aquellos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular.
Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido TAT aislado el cual es, ya sea eliminado del dominio de transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana. Los procesos para producir el mismo también se describen en la presente, en donde aquellos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente . También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquier tal vector. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
En otras modalidades, la invención proporciona polipéptxdos quiméricos aislados que comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT descritos en la presente fusionados a un polipéptido (no TAT) heterólogo. Ejemplos de tales moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT descritos en la presente fusionado a un polipéptido heterólogo tal como, por ejemplo, una secuencia de etiqueta de epítopo o una región Fe de una inmunoglobulina.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se une, preferentemente de manera específica, a cualquiera de los polipéptidos descritos arriba o abajo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de cadena sencilla o anticuerpo que inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo anti-polipéptido TAT a su epítopo antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o calicheamicina o auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas y preferentemente inhibir el crecimiento o proliferación de o inducir la muerte de una célula a la cual se unen. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse de manera detectable, unirse a un soporte sólido, o lo similar.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquier tal vector. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular.
En una modalidad aún adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipéptido TAT quimérico como se describe en la presente, o un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, en combinación con un vehículo. Opcionalmente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En todavía otra modalidad, la invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición de materia contenida dentro del recipiente, en donde la composición de materia puede comprender un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipeptido TAT quimérico como se describe en la presente, o un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente. El artículo puede comprender además opcionalmente una etiqueta fija al recipiente, o un folleto incluido con el recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un tumor.
Otra modalidad de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipéptido TAT quimérico como se describe en la presente, o un anticuerpo anti-polipéptido TAT como se describe en la presente, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido TAT, polipéptido TAT quimérico, o anticuerpo anti-polipéptido TAT.
Otras modalidades de la presente invención se dirigen a cualquier anticuerpo aislado que comprende una o más de las secuencias CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 , o CDR-H3 o VH o VL descritas en la presente, o cualquier anticuerpo que se une al mismo epítopo como cualquier tal anticuerpo.
Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo que se une al polipéptido TAT, y en donde la unión del anticuerpo al polipéptido TAT causa la inhibición del crecimiento de la célula que expresa el polipéptido TAT. En modalidades preferidas, la célula es una célula cancerosa, tal como, por ejemplo, una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer de pulmón y la unión del anticuerpo al polipéptido TAT causa la muerte de dicha célula cancerosa que expresa el polipéptido TAT. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo biespecífico o anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide o calicheamicina o auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas .
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso, tal como, por ejemplo, un tumor de cáncer de mama o un tumor de cáncer de pulmón que comprende células que expresan un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une al polipéptido TAT, resultando así en el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo biespecífico, o anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide o calicheamicina o auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas .
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para determinar la presencia de un polipéptido TAT en una muestra sospechosa de contener el polipéptido TAT, en donde el método comprende exponer la muestra a (o poner en contacto la muestra con) un anticuerpo que se une al polipéptido TAT y determinar o detectar la unión del anticuerpo al polipéptido TAT en la muestra, en donde la presencia de tal unión es indicativa de la presencia del polipéptido TAT en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener células (que pueden ser células cancerosas) sospechosas de expresar el polipéptido TAT. El anticuerpo empleado en el método puede marcarse opcionalmente de manera detectable, unido a un soporte sólido, o lo similar.
Una modalidad adicional de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido TAT (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero, y (b) en una muestra de control de células no cancerosas normales conocidas del mismo origen de tejido o tipo, en donde un nivel mayor de expresión del polipéptido TAT en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de prueba.
Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células de tej ido obtenidas del mamífero con un anticuerpo que se une a un polipéptido TAT y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido TAT en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente, el anticuerpo empleado se etiqueta de manera detectable, unido a un soporte sólido, o lo similar, y/o la muestra de prueba de células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso.
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con expresión o actividad alterada, preferentemente incrementada, de un polipéptido TAT, el método comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de un polipéptido TAT. Preferentemente, el trastorno proliferativo celular es cáncer y el antagonista del polipéptido TAT es un anticuerpo anti-polipéptido TAT u oligonucleótido antisentido. El tratamiento efectivo o prevención del trastorno proliferativo celular puede ser un resultado de muerte directa o inhibición de crecimiento de células que expresan un polipéptido TAT o al antagonizar la actividad que potencia el crecimiento celular de un polipéptido TAT.
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para unir un anticuerpo a una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende poner en contacto una célula que expresa un polipéptido TAT con dicho anticuerpo bajo condiciones que son adecuadas para unir el anticuerpo a dicho polipéptido TAT y permitir la unión entre ellos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se marca con una molécula o compuesto que es útil para determinar cualitativa y/o cuantitativamente la ubicación y/o cantidad de unión del anticuerpo a la célula.
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para suministrar un agente citotóxico o de diagnóstico a una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende proporcionar un agente citotóxico o agente de diagnóstico conjugado con un anticuerpo que se une a dicho polipéptido TAT para formar un conjugado anticuerpo-agente, y exponer la célula al conjugado anticuerpo-agente. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo de cadena sencilla.
Otras modalidades de la presente invención se dirigen al uso de un polipéptido TAT, un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT o un vector o célula huésped que comprende ese ácido nucleico, o un anticuerpo anti-polipéptido TAT en la preparación de un medicamento útil para (i) el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer o tumor, o (ii) el tratamiento terapéutico o prevención de un trastorno proliferativo celular.
Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa, en donde el crecimiento de dicha célula cancerosa es al menos, en parte, dependiente del (los) efecto (s) que potencia (n) el crecimiento de un polipéptido TAT (en donde el polipéptido TAT puede expresarse ya sea por la célula cancerosa por sí misma o una célula que produce polipéptido (s) que tienen un efecto que potencia el crecimiento en células cancerosas) , en donde el método comprende poner en contacto el polipéptido TAT con un anticuerpo que se une al polipéptido TAT, antagonizando así la actividad que potencia el crecimiento del polipéptido TAT y, a su vez, inhibir el crecimiento de la célula cancerosa. Preferentemente el crecimiento de la célula cancerosa se inhibe completamente. Aún más preferentemente, la unión del anticuerpo al polipéptido TAT induce la muerte de la célula cancerosa. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo biespecífico o anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide o calicheamicina o auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas .
Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es al menos, en parte, dependiente del (los) efecto (s) que potencia (n) el crecimiento de un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une al polipéptido TAT, antagonizando así la actividad que potencia el crecimiento de dicho polipéptido TAT y resultando en el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo biespecífico o anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide o calicheamicina o auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. Los anticuerpos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas.
En todavía modalidades adicionales, la invención se dirige al siguiente conjunto de reivindicaciones potenciales para esta o futuras solicitudes: 1. Ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, (f) la secuencia de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (g) el complemento de (a), (b) , (c) , (d) , (e) o (f) . 2. Ácido nucleico aislado que tiene (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, (f) la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (g) el complemento de (a), (b) , (c) , (d) , (e) o (f) . 3. Ácido nucleico aislado que se híbrida con (a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, (f) la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (g) el complemento de (a), (b) , (c) , (d) , (e) o (f) . 4. El ácido nucleico de la reivindicación 3 , en donde la hibridación ocurre bajo condiciones severas. 5. El ácido nucleico de la reivindicación 3 que es de al menos aproximadamente 5 nucleótidos en longitud. 6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3. 7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en donde dicho ácido nucleico se enlaza operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7. 9. La célula huésped de la reivindicación 8 que es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura . 10. Un proceso para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido del cultivo celular. 11. Un polipéptido aislado que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO:2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l. 12. Un polipéptido aislado que tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 13. Un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido de la reivindicación 11 o 12 fusionado a un polipéptido heterólogo. 1 . El polipéptido quimérico de la reivindicación 13, en donde dicho polipéptido heterólogo es una secuencia de etiqueta de epítopo o una región Fe de una inmunoglobulina. 15. Un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 16. Un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido que tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 17. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que es un anticuerpo monoclonal. 18. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que es un fragmento de anticuerpo. 19. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que es un anticuerpo quimérico o humanizado. 20. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 21. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que se conjuga con un agente citotóxico. 22. El anticuerpo de la reivindicación 21, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 23. El anticuerpo de la reivindicación 21, en donde el agente citotóxico es una toxina. 24. El anticuerpo de la reivindicación 23, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 25. El anticuerpo de la reivindicación 23, en donde la toxina es una auristatina. 26. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que se produce en bacterias . 27. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que se produce en células CHO. 28. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que induce la muerte de una célula a la cual se une. 29. El anticuerpo de la reivindicación 15 o 16 que se etiqueta de manera detectable. 30. Un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 15 o 16. 31. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 30 enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 32. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 31. 33. La célula huésped de la reivindicación 32 que es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura . 34. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 32 bajo condiciones adecuadas para expresión de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo del cultivo celular. 35. Una composición de materia que comprende (a) el polipéptido de la reivindicación 11, (b) el polipéptido de la reivindicación 12, (c) el polipéptido quimérico de la reivindicación 13, (d) el anticuerpo de la reivindicación 15, o (e) el anticuerpo de la reivindicación 16, en combinación con un vehículo. 36. La composición de materia de la reivindicación 35, en donde dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable . 37. Un artículo de fabricación que comprende (a) un recipiente; y (b) la composición de materia de la reivindicación 35 contenida dentro de dicho recipiente. 38. El articulo de fabricación de la reivindicación 37 que comprende además una etiqueta fija a dicho recipiente, o un folleto incluido con dicho recipiente, refiriéndose al uso de dicha composición de materia para el tratamiento terapéutico de o la detección de diagnóstico de un cáncer. 39. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo que se une a dicha proteína, la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína causando así una inhibición de crecimiento de dicha célula. 40. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 41. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 42. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 43. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 44. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico. 45. El método de la reivindicación 44, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 46. El método de la reivindicación 44, en donde el agente citotóxico es una toxina. 47. El método de la reivindicación 46, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 48. El método de la reivindicación 46, en donde la toxina es una auristatina. 49. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 50. El método de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 51. El método de la reivindicación 39, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 52. El método de la reivindicación 51, en donde dicha célula cancerosa se expone además a tratamiento con radiación o un agente quimioterapéutico . 53. El método de la reivindicación 51, en donde dicha célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula cancerosa colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula cancerosa de ovario, una célula cancerosa de sistema nervioso central, una célula cancerosa de hígado, una célula cancerosa de vejiga, una célula cancerosa pancreática, una célula cancerosa cervical, una célula de melanoma y una célula de leucemia . 54. El método de la reivindicación 51, en donde dicha proteína se expresa de manera más abundante por dicha célula cancerosa en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 55. El método de la reivindicación 39 que causa la muerte de dicha célula. 56. El método de la reivindicación 39, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l. 57. Un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a dicha proteína, tratando así de manera efectiva a dicho mamífero. 58. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 59. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 60. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 61. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento . 62. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico. 63. El método de la reivindicación 62, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 64. El método de la reivindicación 62 , en donde el agente citotóxico es una toxina. 65. El método de la reivindicación 64, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 66. El método de la reivindicación 64, en donde la toxina es una auristatina. 67. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 68. El método de la reivindicación 57, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 69. El método de la reivindicación 57, en donde dicho tumor se expone además a tratamiento con radiación o un agente quimioterapéutico. 70. El método de la reivindicación 57, en donde dicho tumor es un tumor de mama, un tumor colorectal, un tumor de pulmón, un tumor ovárico, un tumor del sistema nervioso central, un tumor de hígado, un tumor de vejiga, un tumor pancreático, o un tumor cervical. 71. El método de la reivindicación 57, en donde dicha proteína se expresa de manera más abundante por las células cancerosas de dicho tumor en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 72. El método de la reivindicación 57, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 73. Un método para determinar la presencia de una proteína en una muestra sospechosa de contener dicha proteina, en donde dicha proteína tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO:2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método exponer dicha muestra a un anticuerpo que se une a dicha proteína y determinar la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína en dicha muestra, en donde la unión del anticuerpo a dicha proteína es indicativa de la presencia de dicha proteína en dicha muestra. 74. El método de la reivindicación 73 , en donde dicha muestra comprende una célula sospechosa de expresar dicha proteína. 75. El método de la reivindicación 74, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 76. El método de la reivindicación 73, en donde dicho anticuerpo se etiqueta de manera detectable. 77. El método de la reivindicación 73, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l. 78. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de un gen que codifica una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero y en una muestra de control de células normales conocidas del mismo origen de tejido, en donde un nivel mayor de expresión de dicha proteína en la muestra dé* prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de prueba. 79. El método de la reivindicación 78, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicha proteína comprende emplear un oligonucleótido en una hibridación in situ o análisis RT-PCR. 80. El método de la reivindicación 78, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicha proteína comprende emplear un anticuerpo en un análisis inmunohistoquímico o Western blot . 81. El método de la reivindicación 78, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO : 2 , con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 82. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero con un anticuerpo que se une a una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, y detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y dicha proteína en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en dicho mamífero. 83. El método de la reivindicación 82, en donde dicho anticuerpo se etiqueta de manera detectable. 84. El método de la reivindicación 82, en donde dicha muestra de prueba de células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso. 85. El método de la reivindicación 82, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l. 86. Un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con actividad o expresión incrementada de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de dicha proteína, tratando así de manera efectiva o previniendo dicho trastorno proliferativo celular. 87. El método de la reivindicación 86, en donde dicho trastorno proliferativo celular es cáncer. 88. El método de la reivindicación 86, en donde dicho antagonista es un anticuerpo anti-polipéptido TAT u oligonucleótido antisentido. 89. Un método para unir un anticuerpo a una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo que se une a dicha proteína y permitir que ocurra la unión del anticuerpo a dicha proteína, uniendo así dicho anticuerpo a dicha célula. 90. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 91. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 92. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 93. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento . 94. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico. 95. El método de la reivindicación 94, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 96. El método de la reivindicación 94, en donde el agente citotóxico es una toxina. 97. El método de la reivindicación 96, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 98. El método de la reivindicación 96, en donde la toxina es una auristatina. 99. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 100. El método de la reivindicación 89, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 101. El método de la reivindicación 89, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 102. El método de la reivindicación 101, en donde dicha célula cancerosa se expone además a tratamiento con radiación o un agente quimioterapéutico . 103. El método de la reivindicación 101, en donde dicha célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula cancerosa colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula cancerosa de ovario, una célula cancerosa de sistema nervioso central, una célula cancerosa de hígado, una célula cancerosa de vejiga, una célula cancerosa pancreática, una célula cancerosa cervical, una célula de melanoma y una célula de leucemia. 104. El método de la reivindicación 103, en donde dicha proteína se expresa de manera más abundante por dicha célula cancerosa en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 105. El método de la reivindicación 89 que causa la muerte de dicha célula. 106. Uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 107. Uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 108. Uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 109. Uso de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 110. Uso de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de medicamento para tratar un tumor. 111. Uso de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 112. Uso de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32, o 33 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 113. Uso de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 114. Uso de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 115. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 116. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 117. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 118. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 119. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 120. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular . 121. Uso de una composición de materia según cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 122. Uso de una composición de materia según cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 123. Uso de una composición de materia según cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 124. Uso de un artículo de fabricación según cualquiera de las reivindicaciones 37 o 38 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección por diagnóstico de un cáncer. 125. Uso de un artículo de fabricación según cualquiera de las reivindicaciones 37 o 38 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 126. Uso de un artículo de fabricación según cualquiera de las reivindicaciones 37 o 38 en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 127. Un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de dicha célula es al menos, en parte, dependiente de un efecto que potencia el crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO.-l, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha proteína con un anticuerpo que se une a dicha proteína, inhibiendo así el crecimiento de dicha célula. 128. El método de la reivindicación 127, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 129. El método de la reivindicación 127, en donde dicha proteína se expresa por dicha célula. 130. El método de la reivindicación 127, en donde la unión de dicho anticuerpo a dicha proteina antagoniza una actividad que potencia el crecimiento celular de dicha proteína. 131. El método de la reivindicación 127, en donde la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína induce la muerte de dicha célula. 132. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 133. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 134. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 135. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 136. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente citotoxico. 137. El método de la reivindicación 136, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 138. El método de la reivindicación 136, en donde el agente citotóxico es una toxina. 139. El método de la reivindicación 138, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 140. El método de la reivindicación 138, en donde la toxina es una auristatina. 141. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 142. El método de la reivindicación 127, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 143. El método de la reivindicación 127, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1. 144. Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es al menos, en parte, dependiente de un efecto que potencia el crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) el polipéptido mostrado in como SEC ID NO: 2, (b) el polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha proteína con un anticuerpo que se une a dicha proteína, tratando así de manera efectiva dicho tumor. 145. El método de la reivindicación 144, en donde dicha proteína se expresa por células de dicho tumor. 146. El método de la reivindicación 144, en donde la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína antagoniza una actividad que potencia el crecimiento celular de dicha proteína. 147. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 148. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 149. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 150. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 151. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico. 152. El método de la reivindicación 151, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 153. El método de la reivindicación 151, en donde el agente citotóxico es una toxina. 154. El método de la reivindicación 153, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 155. El método de la reivindicación 153, en donde la toxina es una auristatina. 156. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 157. El método de la reivindicación 144, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 158. El método de la reivindicación 144, en donde dicha proteína tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, con su secuencia de péptido de señal asociado, (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado como SEC ID NO: 2, sin tener su secuencia de péptido de señal asociado, (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N0:1, o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO:l. 159. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epítopo unido por un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29. 160. El anticuerpo de la reivindicación 159 que es un anticuerpo monoclonal. 161. El anticuerpo de la reivindicación 159 que es un fragmento de anticuerpo. 162. El anticuerpo de la reivindicación 159 que es un anticuerpo quimérico o humanizado. 163. El anticuerpo de la reivindicación 159 que se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 164. El anticuerpo de la reivindicación 159 que se conjuga con un agente citotóxico. 165. El anticuerpo de la reivindicación 164, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 166. El anticuerpo de la reivindicación 164, en donde el agente citotóxico es una toxina. 167. El anticuerpo de la reivindicación 166, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 168. El anticuerpo de la reivindicación 166, en donde la toxina es una auristatina. 169. El anticuerpo de la reivindicación 159 que se produce en bacterias . 170. El anticuerpo de la reivindicación 159 que se produce en células CHO. 171. El anticuerpo de la reivindicación 159 que induce la muerte de una célula a la cual se une. 172. El anticuerpo de la reivindicación 159 que se etiqueta de manera detectable. 173. El anticuerpo de la reivindicación 159 que comprende al menos una de las regiones que determinan la capacidad de complementación de cualquier anticuerpo de las reivindicaciones 15-29. 174. Una célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido TAT. 175. Un método para identificar un anticuerpo que se une a un epitopo unido por cualquier anticuerpo de las reivindicaciones 15 a 29, comprendiendo dicho método determinar la capacidad de un anticuerpo de prueba para bloquear la unión de cualquier anticuerpo de las reivindicaciones 15 a 29, en donde la capacidad de dicho anticuerpo de prueba para bloquear la unión de dicho cualquier anticuerpo de las reivindicaciones 15 a 29 a un polipéptido TAT por al menos 40% y a concentraciones iguales de anticuerpo es indicativa de dicho anticuerpo de prueba siendo capaz de unirse a un epítopo unido por dicho cualquier anticuerpo de las reivindicaciones 15 a 29. 176. Un anticuerpo aislado que comprende al menos una secuencia CDR seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia CDR-L1 de cualquiera de SEC ID NOS:4-10; (b) una secuencia CDR-L2 de cualquiera de SEC ID NOS: 11-16; (c) una secuencia CDR-L3 de cualquiera de SEC ID NOS: 17-24; (d) una secuencia CDR-H1 de cualquiera de SEC ID NOS: 25-32 O 67; (e) una secuencia CDR-H2 de cualquiera de SEC ID NOS: 33-40 o 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de cualquiera de SEC ID NOS:41-48 o 69-73. 177. El anticuerpo de la reivindicación 176 que es un fragmento de anticuerpo. 178. El anticuerpo de la reivindicación 176 que es un anticuerpo quimérico o humanizado. 179. El anticuerpo de la reivindicación 176 que se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento. 180. El anticuerpo de la reivindicación 176 que se conjuga con un agente citotóxico. 181. El anticuerpo de la reivindicación 180, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 182. El anticuerpo de la reivindicación 181, en donde el agente citotóxico es una toxina. 183. El anticuerpo de la reivindicación 182, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina. 184. El anticuerpo de la reivindicación 183, en donde la toxina es una auristatina. 185. El anticuerpo de la reivindicación 176 que se produce en bacterias . 186. El anticuerpo de la reivindicación 176 que se produce en células CHO. 187. El anticuerpo de la reivindicación 176 que induce la muerte de una célula a la cual se une . 188. El anticuerpo de la reivindicación 187, en donde dicha célula es una célula de cáncer de mama. 189. El anticuerpo de la reivindicación 187, en donde dicha célula es una célula de cáncer de pulmón. 190. El anticuerpo de la reivindicación 176 que se etiqueta de manera detectable . 191. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia VH y una secuencia VL, en donde dicha secuencia VL es de cualquiera mostrada en SEC ID NOS: 49-57 o 74. 192. El anticuerpo aislado de la reivindicación 191, en donde la secuencia VH es de cualquiera mostrada en SEC ID NOS:58-66 o 75-79. 193. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO:49 y la secuencia VH es SEC ID NO: 58. 194. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 50 y la secuencia VH es SEC ID NO: 59. 195. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 51 y la secuencia VH es SEC ID NO: 60. 196. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 52 y la secuencia VH es SEC ID NO: 61. 197. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 53 y la secuencia VH es SEC ID NO: 62. 198. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 54 y la secuencia VH es SEC ID NO: 63. 199. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 55 y la secuencia VH es SEC ID NO: 64. 200. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 56 y la secuencia VH es SEC ID NO: 65. 201. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 57 y la secuencia VH es SEC ID NO: 66. 202. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 75. 203. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 76. 204. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 77. 205. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 78. 206. El anticuerpo aislado de la reivindicación 192, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 79. 207. El anticuerpo aislado de la reivindicación 176, que comprende: (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO : 6 ; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO:13; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO:19; (d) una secuencia CDR-H1 de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 69. 208. El anticuerpo aislado de la reivindicac 176, que comprende: (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO: 6; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO: 13; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO: 19; (d) una secuencia CDR-Hl de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 70. 209. El anticuerpo aislado de la reivindicación 76, que comprende: (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO : 6 ; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO:13; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO:19; (d) una secuencia CDR-H1 de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 71. 210. El anticuerpo aislado de la reivindicac 176, que comprende (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO : 6 ; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO : 13 ; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO:19; (d) una secuencia CDR-H1 de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 72. 211. El anticuerpo aislado de la reivindicac 176, que comprende : (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO : 6 ; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO:13; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO:19; (d) una secuencia CDR-H1 de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO:73. 212. Una célula que produce un anticuerpo de la reivindicación 176. 213. Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la reivindicación 176.
Aún modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para el experto en la materia en la lectura de la presente especificación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y IB muestran una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO:l) de un ADNc TAT194, en donde SEC ID NO:l es un clon designado en la presente como "DNA225706" .
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de un polipéptido de isoforma 1 TAT194 derivado de la secuencia de codificación de SEC ID NO:l mostrada en la Figura 1. Esta isoforma se ha descrito previamente como WRET51" (ver Le Hir et al., Oncology 58:311-318 (2000).
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 3) de un polipéptido de isoforma 2 TAT194 derivado de la secuencia de codificación de SEC ID N0:1 mostrada en la Figura 1. Esta isoforma se ha descrito previamente como "RE 9" (ver Le Hir et al., Oncology 58:311-318 (2000).
La Figura 4 muestra las secuencias CDR-L1 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:4), R4204 (SEC ID NO:5), R4205, R4206 y R4207 (SEC ID NO:6), R4208 (SEC ID NO: 7), R4209 (SEC ID NO: 8), R4210 (SEC ID NO:9), y R4212 (SEC ID NO:10).
La Figura 5 muestra las secuencias CDR-L2 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO: 11), R4204 (SEC ID NO:12), R4205, R4206 y R4207 (SEC ID NO:13), R4208 (SEC ID NO:14), R4209 (SEC ID NO:15), y R4210 y R4212 (SEC ID NO: 16) .
La Figura 6 muestra las secuencias CDR-L3 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO: 17), R4204 (SEC ID NO:18), R4205 (SEC ID NO:19), R4206 y R4207 (SEC ID NO:20), R4208 (SEC ID NO: 21), R4209 (SEC ID NO:22), R4210 (SEC ID NO:23), y R4212 (SEC ID NO:24).
La Figura 7 muestra las secuencias CDR-H1 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:25), R4204 (SEC ID NO:26), R4205 (SEC ID NO:27), R4206 y R4207 (SEC ID NO:28), R4208 (SEC ID NO:29), R4209 (SEC ID NO:30), R4210 (SEC ID NO:31), y R4212 (SEC ID NO:32).
La Figura 8 muestra las secuencias CDR-H2 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:33), R4204 (SEC ID NO:34), R4205 (SEC ID NO:35), R4206 y R4207 (SEC ID NO:36), R4208 (SEC ID NO:37), R4209 (SEC ID NO:38), R4210 (SEC ID NO:39), y R4212 (SEC ID NO:40).
La Figura 9 muestra las secuencias CDR-H3 de los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:41) , R4204 (SEC ID NO:42), R4205 (SEC ID NO:43), R4206 y R4207 (SEC ID NO:44), R4208 (SEC ID NO:45), R4209 (SEC ID NO:46), R4210 (SEC ID N0:47), y R4212 (SEC ID NO:48).
La Figura 10 muestra las secuencias de aminoácidos VL kappa completas para los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:49), R4204 (SEC ID NO:50), R4205 (SEC ID NO:51), R4206 (SEC ID NO:52), R4207 (SEC ID NO:53), R4208 (SEC ID NO:54), R4209 (SEC ID NO:55), R4210 (SEC ID NO:56), y R4212 (SEC ID NO: 57) .
La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos VH completas para los anticuerpos anti-polipéptido TAT194 R4203 (SEC ID NO:58), R4204 (SEC ID NO:59), R4205 (SEC ID NO:60), R4206 (SEC ID NO:61), R4207 (SEC ID NO:62), R4208 (SEC ID NO: 63), R4209 (SEC ID NO: 64), R4210 (SEC ID NO: 65), y R4212 (SEC ID NO: 66) .
La Figura 12 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-vc-MMAE conjugado con anticuerpo P4204.
La Figura 13 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-vc-MMAE conjugado con anticuerpo P4205.
La Figura 14 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-vc-MMAE conjugado con anticuerpo P4206.
La Figura 15 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-vc-MMAE conjugado con anticuerpo P4209.
La Figura 16 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-DM1 conjugado con anticuerpo P4204.
La Figura 17 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-DM1 conjugado con anticuerpo P4205.
La Figura 18 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-DM1 conjugado con anticuerpo P4206.
La Figura 19 muestra la muerte in vitro de 293/RET (o; que se han diseñado para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular) y 293 células (¦; que no expresan polipéptido TAT194) por tratamiento con ADC MC-DM1 conjugado con anticuerpo P4209.
La Figura 20 muestra modelo de murino de xenoinjerto in vivo que demuestra la inhibición de crecimiento del tumor de la línea celular CF7neoHER2 derivada de tumores de célula de mama por tratamiento con ADC C-vc-PAB-MMAE conjugado con anticuerpos anti-RET murino 4202, 4205 y 4209 en comparación con un anti-GP120 ADC irrelevante y un ADC potente conocido, inmunoconjugado anti-HER2 trastuzumab-MCC-DMl a una dosis IV única de 5 mg/kg.
La Figura 21 muestra modelo de murino de xenoinjerto KPL1 in vivo que demuestra la inhibición de crecimiento del tumor por tratamiento con ADC MC-vc-PAB-MMAE conjugado con anticuerpo anti-RET murino 4205, en comparación con un anti-GP120 ADC irrelevante, a una dosis IV única de ya sea 1 mg/kg o 3 mg/kg.
La Figura 22 muestra modelo de murino de xenoinjerto de carcinoma de mama de humano BT474 MI in vivo que demuestra la inhibición de crecimiento del tumor por tratamiento con 5 mg/kg de dosis IV única de anti-RET-MC-vc-PAB-MMAE conjugado con clones de anticuerpo anti-RET murino 4205, 4206 y 4209 en comparación con un control vehículo y un MC-vc-PAB-MMAE anti-GP120 irrelevante, y un ADC potente conocido, inmunoconjugado anti-HER2 trastuzumab-MCC-D l a una dosis IV única de 5 mg/kg.
La Figura 23 muestra modelo de murino de xenoinjerto de tumor de mama DA-MB-175 in vivo que demuestra la inhibición de crecimiento del tumor por tratamiento con 5 mg/kg de dosis IV única de an i-RET-MC-vc-PAB-MMAE conjugado con el clon de anticuerpo anti-RET murino 4205 en comparación con un control vehículo y un anti-GP120 irrelevante MC-vc-PAB-MMAE, y un ADC potente conocido, anti-HER2 pertuzumab-MC-vc-PAB-M AE a una dosis IV única de 5 mg/kg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN I . Definiciones Los términos "polipéptido TAT" y "TAT" como se utilizan en la presente y cuando se siguen inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polipéptidos , en donde la designación completa (es decir, TAT/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas como se describe en la presente. Los términos "polipéptido TAT/número" y "TAT/número" en donde el término "número" se proporciona como una designación numérica real, como se utilizan en la presente, comprenden polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptido y fragmentos de polipéptidos de secuencia nativa y variantes de polipéptido (que se definen además en la presente) . Los polipéptidos TAT descritos en la presente pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse por métodos sintéticos o recombinantes . El término "polipéptido TAT" se refiere a cada polipéptido TAT/número individual descrito en la presente . Todas las descripciones en esta especificación que se refieren al "polipéptido TAT" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente así como conjuntamente. Por ejemplo, las descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos a o contra, formación de oligopéptidos de unión TAT a o contra, formación de moléculas orgánicas de unión TAT a o contra, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen a cada polipéptido de la invención individualmente. El término "polipéptido TAT" también incluye variantes de los polipéptidos TAT/número descritos en la presente. En una modalidad, una secuencia de polipéptido TAT194 se muestra como SEC ID NO: 2. En otra modalidad, una secuencia de polipéptido TAT194 se muestra como SEC ID NO : 3.
Un "polipéptido TAT de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido TAT correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos TAT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios sintéticos o recombinantes. El término "polipéptido TAT de secuencia nativa" de manera específica comprende formas secretadas o truncadas que ocurren de manera natural del polipéptido TAT específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes que ocurren de manera natural (por ejemplo, formas alternativamente divididas) y variantes alélicas que ocurren de manera natural del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos TAT de secuencia nativa descritos en la presente son polipéptidos de secuencia nativa de longitud completa o madura que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa mostradas en las Figuras acompañantes . Los codones de inicio y terminación (si se indican) se muestran en negritas y subrayados en las Figuras. Los residuos de ácido nucleico indicados como WN" o "X" en las Figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, aunque se muestra que los polipéptidos TAT descritos en las Figuras acompañantes comienzan con residuos de metionina designados en la presente como posiciónl de aminoácido en las Figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina ubicados ya sea corriente arriba o corriente debajo de la posición 1 de aminoácido en las Figuras puedan emplearse como el residuo de aminoácido inicial para los polipéptidos TAT.
El "dominio extracelular" o "ECD" de polipéptido TAT se refiere a una forma del polipéptido TAT que está esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmicos . Ordinariamente, un ECD de polipéptido TAT tendrá menos de 1% de tales dominios de transmembrana y/o citoplásmicos y preferentemente, tendrá menos de 0.5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos TAT de la presente invención se identifica conforme a los criterios empleados de manera rutinaria en la materia para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio de transmembrana pueden variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se identifica inicialmente en la presente. Opcionalmente, por lo tanto, un dominio extracelular de un polipéptido TAT puede contener de aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier lado del límite de dominio de transmembrana/dominio extracelular como se identifica en los Ejemplos o especificación y tales polipéptidos, con o sin péptido de señal asociado, y ácido nucleico que los codifica, se contemplan por la presente invención.
La ubicación aproximada de los "péptidos de señal" de los varios polipéptidos TAT descritos en la presente puede mostrarse en la presente especificación y/o las Figuras acompañantes. Se observa, sin embargo, que el límite C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal de péptido de señal como se identifica inicialmente en la presente, en donde el límite C-terminal del péptido de señal puede identificarse conforme a los criterios empleados de manera rutinaria en la materia para identificar ese tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot . Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucí. Acids . Res. 14:4683-4690 (1986) ) . Además, también se reconoce que, en algunos casos, la división de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, donde el péptido de señal se penetra dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal del péptido de señal como se identifica en la presente, y los polinucleótidos que los codifican, se contemplan por la presente invención.
La "Variante de polipéptido TAT" significa un polipéptido TAT, preferentemente un polipéptido TAT activo, como se define en la presente teniendo al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAT de longitud completa como se describe en la presente (tales como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa solamente una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAT de longitud completa) . Tales variantes de polipéptido TAT incluyen, por ejemplo, polipéptidos TAT en donde, se agregan o eliminan, uno o más residuos de aminoácido en los términos N o C de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Ordinariamente, un variante de polipéptido TAT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos TAT sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de polipéptidos TAT de longitud completa como se describe en la presente. Ordinariamente, polipéptidos variantes TAT son al menos de aproximadamente 10 aminoácidos en longitud, alternativamente al menos de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos en longitud, o más. Opcionalmente, polipéptidos variantes TAT tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con la secuencia de polipéptidos TAT nativa, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácido conservador en comparación con la secuencia de polipéptidos TAT nativa.
El "Porciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptidos TAT identificadas en la presente, se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptidos TAT especifica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia de por ciento máxima, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando software computacional públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para propósitos en la presente, sin embargo, valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa computacional de comparación de secuencia ALIGN-2 , en donde el código de fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Patente de E.U. No. 7,160,985, que se incorpora en la presente para referencia. El Programa computacional de comparación de secuencia ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente del mismo se ha presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Reproducción de E.U.A., Washington D.C., 20559, donde se registra bajo el No. de Registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible por Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4. OD digital . Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencia de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede enunciarse como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido marcados como partidas idénticas por el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B . Se apreciará que donde la longitud de secuencia A de aminoácidos no es igual a la longitud de secuencia B de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con A.
El "Polinucleótido variante TAT" o "secuencia de ácido nucleico variante TAT" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, preferentemente un polipéptido TAT activo, como se define en la presente y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácido nucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAT de longitud completa como se describe en la presente (tales como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa solamente una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAT de longitud completa) . Ordinariamente, un polinucleótido variante TAT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa sin tener el péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin la secuencia de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAT de longitud completa como se describe en la presente. Las variantes no comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.
Ordinariamente, polinucleótidos variantes TAT son de al menos aproximadamente 5 nucleótidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos en longitud, en donde en este contexto el término waproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia más o menos 10% de esa longitud a la que se hace referencia.
El "Porciento (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a secuencias de ácido nucleico que codifican TAT identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico TAT de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede lograrse en varias maneras que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando software computacional públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para propósitos en la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se generan utilizando el programa computacional de comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código de fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Patente de E.U. No. 7,160,985, que se incorpora en la presente para referencia. El programa computacional de comparación de secuencia ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente del mismo se ha presentado con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Reproducción de E.U.A., Washington D.C., 20559, donde se registra bajo el No. de Registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible por Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de ácidos nucleicos, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia C de ácidos nucleicos dada a, con, o contra una secuencia D de ácidos nucleicos dada (que puede enunciarse alternativamente como una secuencia C de ácidos nucleicos dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia D de ácidos nucleicos dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z donde W es el número de nucleótidos marcados como partidas idénticas por el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en esa alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que donde la longitud de secuencia C de ácidos nucleicos no es igual a la longitud de secuencia D de ácidos nucleicos, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D con C.
En otras modalidades, polinucleótidos variantes TAT son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido TAT y que son capaces de ibridarse, preferentemente bajo hibridación severa y condiciones de lavado, con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido TAT de longitud completa como se describe en la presente. Polipéptidos variantes TAT pueden ser aquellos que se codifican por un polinucleótido variante TAT.
El término "región de codificación de longitud completa" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT de longitud completa de la invención (que con frecuencia se muestra entre codones de inicio y detección, incluyendo los mismos, en las Figuras acompañantes) . El término "región de codificación de longitud completa" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucléico depositado ATCC se refiere a la porción que codifica el polipéptido TAT del ADNc que se inserta en el vector depositado con ATCC (que con frecuencia se muestra entre codones de inicio y detección, incluyendo los mismos, en las Figuras acompañantes) .
"Aislado," cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos TAT descritos en la presente, significa polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían típicamente con usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos . En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N- terminal o secuencia de aminoácidos interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinte plata. Polipéptido aislado incluye polipéptido in si tu dentro de células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural de polipéptido TAT. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico que codifica el polipéptido TAT "aislado" u otro ácido nucleico que codifica el polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado, es otra que en la forma o escenario en el que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido aislado por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido específica ya que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado incluye moléculas de ácido nucleico que codifica el polipéptido contenidas en células que expresan ordinariamente el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de células naturales .
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosoma. Las células eucarióticas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación, y aumentadores .
El ácido nucleico se "enlaza operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o guía secretora se enlaza operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se posiciona para facilitar su traducción. Generalmente, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas, y, en el caso de una guía secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos. El enlace se realiza por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los enlazadores o adaptadores de oligonucleótido sintético se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
"Severidad" de reacciones de hibridación se determina fácilmente por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de enjuague, y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para templado apropiado, mientras las sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores . La hibridación generalmente depende de la capacidad de ADN desnaturalizado para volverse a templar cuando están presentes los filamentos complementarios en un ambiente debajo de su temperatura de fusión. Mientras más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta será la temperatura relativa que puede utilizarse. Como un resultado, sigue que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer a las condiciones de reacción más severas, mientras las temperaturas inferiores las harían menos severas . Para detalles adicionales y explicación de la severidad de reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, iley Interscience Publishers, (1995) .
"Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se define en la presente, pueden identificarse por aquellos que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para enjuague, por ejemplo 0.015 M cloruro de sodio/0.0015 M citrato de sodio/0.1% sulfato de dodecil de sodio a 50°C; (2) emplean durante hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0.1% albúmina de suero bovino/0.1% Ficoll/0.1% polivinilpirrolidona/50mM tampón de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM cloruro de sodio, 75 mM citrato de sodio a 42 °C; o (3) hibridación durante la noche en una solución que emplea 50% formamida, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml) , 0.1% SDS, y 10% sulfato de dextran a 42 °C, con un enjuague de 10 minutos a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un enjuague con alta severidad de 10 minutos que consiste de 0.1 x SSC conteniendo EDTA a 55 °C.
"Condiciones moderadamente severas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de enjuague y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica y %SDS) menos severas que aquellas descritas arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM tricitrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextran, y 20 mg/ml ADN de esperma de salmón compartido, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, resistencia iónica, etc. según sea necesario para acomodar los factores tales como longitud de sonda y lo similar.
El término "epítopo etiquetado" cuando se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT fusionado a un "polipéptido de etiqueta" . El polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede hacerse un anticuerpo, siendo aún lo suficientemente corto de manera que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido de etiqueta preferentemente también es bastante único de manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente con otros epítopos . Los polipéptidos de etiqueta adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácido (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácido) .
"Activo" o "actividad" para los propósitos en la presente se refiere a forma (s) de un polipéptido TAT que retiene (n) una actividad biológica y/o inmunológica de TAT que ocurre de manera natural o nativo, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) causada por TAT que ocurre de manera natural o nativo diferente a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por TAT que ocurre de manera natural o nativo y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por TAT que ocurre de manera natural o nativo.
El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe, o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido TAT nativo descrito en la presente . En una manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido TAT nativo descrito en la presente. Las moléculas, agonista o antagonista, adecuadas incluyen de manera específica fragmentos de anticuerpo o anticuerpos, agonista o antagonista, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos TAT nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido TAT pueden comprender poner en contacto un polipéptido TAT con una molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido TAT.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere a tanto tratamiento terapéutico y medidas preventivas o profilácticas, en donde el objeto es prevenir o disminuir (aminorar) el trastorno o condición patológica dirigida. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno asi como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes el trastorno está por prevenirse. Un sujeto o mamífero se "trata" exitosamente para un cáncer que expresa polipéptido TAT si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT de acuerdo a los métodos de la presente invención, el paciente muestra reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de los siguientes : reducción en el número de células cancerosas o ausencia de las células cancerosas; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir, disminuir a algún grado y preferentemente detener) la infiltración de la célula cancerosa en los órganos periféricos incluyendo la difusión de cáncer hacia tejido suave y hueso; inhibición (es decir, disminuir a algún grado y preferentemente detener) la metástasis de tumor; inhibición, a algún grado, de crecimiento de tumor; y/o alivio a algún grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; mortalidad y morbidez reducida, y mejora en calidad de los aspectos de la vida. Al grado que el anticuerpo anti-TAT u oligopéptido de unión TAT puede prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, puede ser citoestático y/o citotóxico. La reducción de estas señales o síntomas también pueden sentirse por el paciente.
Los parámetros anteriores para valorar el tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad, son fácilmente medibles por procedimientos de rutina familiares para un médico. Para terapia de cáncer, puede medirse la eficacia, por ejemplo, al valorar el tiempo para progreso de la enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR) . La metástasis puede determinarse al clasificar las pruebas y por exploración ósea y pruebas para nivel de calcio y otras enzimas para determinar la difusión al hueso. Las exploraciones CT también pueden hacerse para esperar la difusión a la pelvis y nodos linfáticos en el área. Los rayos X del pecho y medición de niveles de enzima en el hígado por métodos conocidos se utilizan para esperar la metástasis a los pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos de rutina para monitorear la enfermedad incluyen ultrasonografía transrectal (TRUS) y biopsia con aguja transrectal (TR B) .
Administración "crónica" se refiere a administración del (los) agente (s) en un modo continuo como opuesto a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) para un periodo de tiempo extendido. Administración "intermitente" es tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, pero en su lugar es cíclico en la naturaleza.
"Mamífero" para propósitos del tratamiento de, aliviar los síntomas de o diagnóstico de un cáncer se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y zoológico, para deportes, o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, oveja, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.
Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
"Vehículos" como se utiliza en la presente incluyen vehículos, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se expone a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución de tampón de pH acuosa. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS®.
Por "fase sólida" o "soporte sólido" se entiende una matriz no acuosa al cual puede adherirse o unirse un anticuerpo, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas comprendidos en la presente incluyen aquellos formados parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado) , polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinilico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinúa de partículas discretas, tales como aquellas descritas en Patente de E.U.A. No. 4,275,149.
Una "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agente tensoactivo que es útil para suministro de un fármaco (tal como un polipéptido TAT, un anticuerpo para el mismo o un oligopéptido de unión TAT) a un mamífero. Los componentes de la liposoma se ordenan comúnmente en una formación de bicapa, similar al orden de lipido de las membranas biológicas.
Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" se define en la presente por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltones.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido, anticuerpo, oligopéptido de unión TAT, molécula orgánica de unión TAT o un agonista o antagonista de los mismos como se describe en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y en una manera rutinaria, en relación al propósito establecido.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, oligopéptido de unión TAT, molécula orgánica de unión TAT u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir, disminuir a algún grado y preferentemente detener) la infiltración de la célula cancerosa en los órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuir a algún grado y preferentemente detener) metástasis de tumor; inhibir, a algún grado, crecimiento del tumor; y/o aliviar a algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Ver la definición en la presente de "tratar". Al grado que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, puede ser citoestático y/o citotóxico .
Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión- TAT o molécula orgánica de unión TAT para propósitos de inhibir el crecimiento celular neoplásico puede determinarse empíricamente y en una manera rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT para propósitos de inhibir crecimiento celular neoplásico puede determinarse empíricamente y en una manera rutinaria.
El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y de manera específica cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TAT únicos (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes) , composiciones de anticuerpo anti-TAT con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos anti-TAT de cadena sencilla, y fragmentos de anticuerpos anti-TAT (ver abajo) siempre que muestren la actividad inmunológica o biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza intercambiable con anticuerpo en la presente.
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o secuencia de aminoácidos interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reducción utilizando azul Coomassie o, preferentemente, tinte plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo ín situ dentro de células recombinantes ya que al menos no estará presente un componente del ambiente natural del anticuerpo. Ordinariamente, sin embargo, anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
La unidad de anticuerpo de 4 cadenas básica es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste de 5 de la unidad de heterotetramero básica junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y por lo tanto contiene 10 sitios de unión de antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensambles polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con cadena J) . En el caso de IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150,000 daltones. Cada cadena L se enlaza a una cadena H por un enlace de disulfuro covalente, mientras las dos cadenas H se enlazan entre sí por uno o más enlaces de disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes de disulfuro de intracadena regularmente separados . Cada cadena H tiene en el término N, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas y y y cuatro dominios CH para isotipos µ y e . Cada cadena L tiene en el término N, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Se cree que los residuos de aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El juntar un VH y VL, forma un sitio de unión de antígeno sencillo. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8va edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y Capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie vertebrada puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, teniendo cadenas pesadas designadas , d, e, ?, y µ, respectivamente. Las clases ? y se dividen además en subclases en la base de diferencias relativamente menores en secuencia CH y función, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos . El dominio V media la unión de antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través del alcance de aminoácido 110 de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten de estiramientos relativamente invariantes llamados regiones de estructura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando grandemente una configuración de hoja ß, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos formando parte de, la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . Los dominios constantes no se incluyen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .
El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de manera natural, que pueden estar presentes en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe construirse como requiriendo producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse por la metodología de hibridoma descrita primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse utilizando métodos de ADN recombinante en células bacterianas vegetales o animales eucarióticas (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (ver Patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "cebados" que comprenden secuencias de unión de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo Cercopitécido, Simio etc) , y secuencias de región constante de humano.
Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión de antígeno así como una CL y al menos dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa de humano) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras .
Los "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región variable o unión de antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver Patente de E.U.A. No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizarse fácilmente. El fragmento Fab consiste de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) . Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión de antígeno, es decir, tiene un sitio de unión de antígeno sencillo. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un fragmento F(ab')2 largo sencillo que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab enlazados por disulfuro que tienen actividad de unión de antígeno divalenteí y aún es capaz de reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab al tener pocos residuos adicionales en el término carboxi del dominio CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fa 1, en la cual el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento Fe comprende las porciones de terminal carboxi de ambas cadenas H conservadas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, tal región también es la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) encontrados en ciertos tipos de células .
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena ligera y uno de pesada en asociación no covalente, hermética. Al doblar estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada una de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácido para unión de antígeno y confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo. wFv de cadena sencilla" también abreviado como wsFv" o wscFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una cadena de polipéptido sencilla. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que sFv forme la estructura deseada para unión de antígeno. Para una reseña de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados al construir fragmentos sFv (ver párrafo precedente) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de manera que se logra la formación de pares inter-cadena pero no intra-cadena de los dominios V, resultando en un fragmento bivalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos biespecífieos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "híbridos", en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas de polipéptido. Los diacuerpos se describen de modo más completo en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al.r Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) .
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad del anticuerpo deseado. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulinas de humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) .
Un "anticuerpo dependiente de especie," por ejemplo, un anticuerpo IgE anti-humano de mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte para un antígeno de una primer especie de mamífero que tiene para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie "se une de manera específica" a un antígeno de humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 y más preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser de cualquiera de los varios tipos de anticuerpos como se define arriba, pero preferentemente es un anticuerpo humano o humanizado.
El término "numeración del residuo de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de aminoácido como en Kabat", y variaciones de las mismas, se refiere al sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal actual puede contener pocos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción única de aminoácido (residuo 52a de acuerdo a Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc de acuerdo a Kabat) después del residuo 82 FR de cadena pesada.
La numeración Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia enumerada Kabat "estándar" .
La frase "sustancialmente similar, " o "sustancialmente la misma", como se utilizan en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/de comparación) de manera que un experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores para ser de poco o nada de significado biológico y/o estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es preferentemente menor a aproximadamente 50%, preferentemente menor a aproximadamente 40%, preferentemente menor a aproximadamente 30%, preferentemente menor a aproximadamente 20%, preferentemente menor a aproximadamente 10% como una función del valor para el anticuerpo de referencia/de comparación.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno) . Al menos que se indique de otra manera, como se utiliza en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su compañero Y generalmente puede representarse 1 por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. Los anticuerpos con baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras los anticuerpos con alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conoce en la materia, cualquiera de los cuales puede utilizarse para propósitos de la presente invención. Se describen a continuación las modalidades ilustrativas específicas.
En una modalidad, "Kd" o "valor Kd" de acuerdo a esta invención se mide por un ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión de la solución de Fabs para antígeno al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (1251) en la presencia de una serie de concentración de antígeno no marcado, capturando entonces el antígeno unido con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881) . Para establecer condiciones para el ensayo, las placas de microconcentracion (Dynex) se revisten durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM carbonato de sodio (pH 9.6), y bloquearse subsiguientemente con 2% (p/v) albúmina de suero bovino en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no absorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM
[1251] -antígeno con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la valoración de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un periodo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . Se remueve entonces la solución y la placa se enjuaga ocho veces con 0.1% Tween-20 en PBS. Cuando se han secado las placas, se agregan 150 ul/cavidad de centelleante (MicroScint-20; Packard) , y se cuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) por diez minutos . Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de unión máxima, se eligen para usarse en ensayos de unión competitivos. De acuerdo a otra modalidad Kd o valor Kd se mide al utilizar ensayos de resonancia de plasmón de superficie utilizando un BIAcoreT -2000 o BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips C 5 de antígeno inmovilizado en -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con lOmM acetato de sodio, pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2uM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1M etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25ul/min. Las velocidades de asociación (kactiva) y velocidades de disociación (kno activa) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción knoactiva/activa. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad activa excede 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad activa puede determinarse al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25°C de 20nM anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de incrementar concentraciones de antígeno según se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de terminación (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco series 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitadora.
Una "velocidad activa" o "velocidad de asociación" o "kactiva" de acuerdo a esta invención también puede determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie descrita arriba utilizando un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (Rü) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Antígeno se diluye con lOmM acetato de sodio, pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2uM) antes de la inyección a una velocidad de flujo 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de 1M etanolamina para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25ul/min. Las velocidades de asociación (kactiva) y velocidades de disociación (knoactiva) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la proporción knoactiva/activa. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad activa excede 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad activa se determina preferentemente al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25°C de 20nM anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de incrementar concentraciones de antígeno según se midió en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de terminación (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco series 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. "Kd" o "valor Kd" de acuerdo a esta invención se mide, en una modalidad, por un ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab del anticuerpo y molécula de antígeno como se describe por él siguiente ensayo que mide afinidad de unión de la solución de Fabs para antígeno al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (1251) en la presencia de una serie de concentración de antígeno no marcado, capturando entonces el antígeno unido con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer condiciones para el ensayo, las placas de microconcetración (Dynex) se revisten durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM carbonato de sodio (pH 9.6), y bloquearse subsiguientemente con 2% (p/v) albúmina de suero bovino en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no absorbente (Nunc #269620) , se mezclan 100 pM o 26 pM
[1251] -antígeno con diluciones seriales de Fab de interés (consistente con valoración de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un periodo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente por una hora. Se remueve entonces la solución y la placa se enjuaga ocho veces con 0.1% Tween-20 en PBS. Cuando se han secado las placas, se agregan 150 ul/cavidad de centelleante (MicroScint-20 ; Packard) , y se cuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) por diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de unión máxima se eligen para usarse en ensayos de unión competitivos. De acuerdo a otra modalidad, Kd o valor Kd se mide al utilizar ensayos de resonancia de plasmón de superficie utilizando BIAcoreTM-2000 o BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Antígeno se diluye con lOmM acetato de sodio, pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2uM) antes de la inyección a una velocidad de flujo 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1M etanolamina para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25ul/min. Las velocidades de asociación (kactiva) y velocidades de disociación (knoactiva) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción knoactiva/activa. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad activa excede 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad activa puede determinarse al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25 °C de 20nM anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de incrementar las concentraciones de antígeno según se miden en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de terminación (Aviv Instruments) o espectrofotómetro SLM-Aminco series 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitadora .
En una modalidad, una "velocidad activa" o "velocidad de asociación" o "kactiva" de acuerdo a esta invención se determina con la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie descrita arriba utilizando un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Antígeno se diluye con lOmM acetato de sodio, pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2u ) antes de la inyección a una velocidad de flujo 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de 1M etanolamina para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25ul/min. Las velocidades de asociación (kactiva) y velocidades de disociación (knoactiva) se calculan utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la proporción knoactiva/activa. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad activa excede 106 M-l S-l por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad activa se determina preferentemente al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25°C de 20n anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de incrementar concentraciones de antígeno según se midió en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco series 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
La frase "sustancialmente reducida," o "sustancialmente diferente", como se utiliza en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/de comparación) de manera que un experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores para ser de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd, respuesta HAMA) . La diferencia entre dichos dos valores es preferentemente mayor a aproximadamente 10%, preferentemente mayor a aproximadamente 20%, preferentemente mayor a aproximadamente 30%, preferentemente mayor a aproximadamente 40%, preferentemente mayor a aproximadamente 50% como una función del valor para el anticuerpo de referencia/de comparación.
Un "antígeno" es un antígeno predeterminado al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo. El antígeno objetivo puede ser polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto sintético o que ocurre de manera natural. Preferentemente, el antígeno objetivo es un polipéptido. Una "estructura de humano de aceptación" para los propósitos en la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulina de humano, o de una estructura consenso de humano. Una estructura de humano de aceptación "derivada de" una estructura de inmunoglobulina de humano o estructura consenso de humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos existentes. Donde están presentes los cambios de aminoácido pre-existentes, preferentemente están presentes no más de 5 y preferentemente 4 o menos, o 3 o menos, cambios de aminoácido pre-existentes . Donde están presentes cambios de aminoácido pre-existentes en un VH, preferentemente aquellos cambios están solamente en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácido en esas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una modalidad, la estructura de humano de aceptación VL es idéntica en secuencia a la Secuencia de estructura de inmunoglobulina de humano VL o secuencia de estructuras consenso de humano.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de competir por la unión al mismo epítopo ya que se une por un segundo anticuerpo. Se considera que los anticuerpos monoclonales comparten el "mismo epítopo" si cada uno bloquea la unión del otro por 40% o más a la misma concentración de anticuerpo en un análisis de unión de competencia de anticuerpo in vitro estándar.
Una "estructura consenso de humano" es una estructura que representa el residuo de aminoácido que ocurre más comúnmente en una selección de secuencias de estructura VH o VL de inmunoglobulina de humano. Generalmente, la selección de secuencias VH o VL de inmunoglobulina de humano es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. En una modalidad, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al. En una modalidad, para VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al.
Una "estructura consenso de subgrupo III VH" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en subgrupo III de cadena variable de Kabat et al.
Una "estructura consenso subgrupo I VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en subgrupo I kappa ligero variable de Kabat et al.
Una "estructura de humano no modificada" es una estructura de humano que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la estructura de humano de aceptación, por ejemplo sin sustitución (es) de aminoácido de humano a no humano en la estructura de humano de aceptación.
Una "región hipervariable alterada" para los propósitos en la presente es una región hipervariable que comprende una o más (por ejemplo una a aproximadamente 16) sustitución (es) de aminoácido en la misma.
Una "región hipervariable no modificada" para los propósitos en la presente es una región hipervariable teniendo la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo no humano del cual se deriva, es decir uno que carece de una o más sustituciones de aminoácido en la misma.
El término "región hipervariable" , "HV " , "HV" o "CDR" , cuando se utiliza en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3 ) , y tres en el VL (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3) . Un número de delineaciones de región hipervariable están en uso y se comprenden en la presente . Las Regiones de Determinación de Capacidad de Complementación Kabat (CDRs) son con base en variabilidad de secuencia y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en su lugar a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987) ) . Las regiones hipervariables de "contacto" son con base en un análisis de las estructuras de cristal complejas disponibles . Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se observan abajo. al menos que se denote de otra manera, se empleará numeración Kabat. Las ubicaciones de región hipervariable son generalmente como sigue: aminoácidos 24-34 (CDR-L1) , aminoácidos 49-56 (CDR-L2) , aminoácidos 89-97 (CDR-L3) , aminoácidos 26-35A (CDR-H1) , aminoácidos 49-65 (CDR-H2) , y aminoácidos 93-102 (CDR-H3).
Las regiones hipervariables también pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" como sigue: aminoácidos 24-36 (Ll) , y aminoácidos 46-56 (L2) en el VL. Los residuos de dominio variable se enumeran de acuerdo a Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.
Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente.
Un "anticuerpo de humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho utilizando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos de humano como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo de humano de manera específica excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión de antígeno no humano.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no posee aquella(s) alteración (es) . Los anticuerpos maduros por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos maduros por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe maduración por afinidad por mezclado de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Sc ier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7) :3310-9 (1995); y Ha kins et al, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992).
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonista preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
Un "oligopéptido de unión TAT" es un oligopéptido que se une, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de unión TAT son usualmente de al menos aproximadamente 5 aminoácidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos en longitud o más, en donde tales oligopéptidos son capaces de unión, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión TAT puede identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se observa que las técnicas para seleccionar bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de unirse de manera específica a un polipéptido objetivo se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones PCT Nos. WO 84/03506 y W084/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotec nol . , 2:668).
Una "molécula orgánica de unión TAT" es una molécula orgánica diferente a un oligopéptido o anticuerpo como se define en la presente que se une, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Las moléculas orgánicas de unión TAT pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión TAT son usualmente menores a aproximadamente 2000 daltones en tamaño, alternativamente menores a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltones en tamaño, en donde tales moléculas orgánicas que son capaces de unión, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente, pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se observa que las técnicas para seleccionar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de unión a un polipéptido objetivo se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y O00/39585) .
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "que une" un antígeno de interés, por ejemplo un antígeno de polipéptido asociado a tumor objetivo, es uno que une el antígeno con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona significativamente con otras proteínas. En tales modalidades, el grado de unión del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una proteína "no objetivo" será menor a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a su proteína objetivo particular como se determina por análisis de clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) . Con respecto a la unión de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una molécula objetivo, el término "unión específica" o "se une de manera específica a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular objetivo significa la unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. la unión específica puede medirse, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula comparada con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse por competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no marcado. En este caso, se indica la unión específica si la unión del objetivo marcado a una sonda se inhibe de manera competitiva en exceso de objetivo no marcado. El término "unión específica" o "se une de manera específica a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular objetivo como se utilizan en la presente pueden mostrarse, por ejemplo, por una molécula teniendo Kd para el objetivo de al menos aproximadamente io-4 , alternativamente al menos aproximadamente io-5 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"6 M, alternativamente al menos aproximadamente io-7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"8 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"10 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"11 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"12 M, o mayor . En una modalidad, el término "unión específica" se refiere a unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polipéptido TAT" o un anticuerpo "inhibidor de crecimiento" , oligopéptido u otra molécula orgánica es uno que resulta en inhibición de crecimiento medible de células cancerosas que expresan o sobreexpresan el polipéptido TAT apropiado. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-TAT inhibidores de crecimiento preferidos, oligopéptidos o moléculas orgánicas inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan TAT por más de 20%, preferentemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, e incluso más preferentemente, por más de 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado, el control típicamente siendo células tumorales no tratadas con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que se trata. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 a 30 pg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de células tumorales al anticuerpo. La inhibición de crecimiento de células tumorales in vivo puede determinarse en varias maneras tal como se describe en la sección de Ejemplos Experimentales abajo. El anticuerpo es inhibidor de crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 q/kg a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal resulta en reducción en tamaño de tumor o proliferación de célula tumoral dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce apoptosis" es uno que induce muerte celular programada como se determina por unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación de célula, y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferentemente la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de próstata, mama, ovario, estómago, endometrial, pulmón, riñon, colon, vejiga. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, transubicación de serina de fosfatidilo (PS) puede medirse por unión de anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través del ascenso de ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con fragmentación de ADN puede evaluarse por cualquier incremento en células hipodiploides . Preferentemente, el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que induce apoptosis es uno que resulta en aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferentemente aproximadamente 10 a 50 veces, inducción de unión de anexina relativa a célula no tratada en un ensayo de unión de anexina.
Las "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y variar con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; unión de receptor Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B.
La "Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual Ig^ secretada, unida sobre receptores Fe (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células Asesinas naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan de manera específica a una célula objetivo que lleva antígeno y matan subsiguientemente la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para mediar ADCC, células NK, expresar solamente FcyRIII, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vitro, tal como aquel descrito en Patente de E.U.A. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998).
El "Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. FcR preferido es un FcR de humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas divididas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación) y FcyRIIB (un "receptor de inhibición")/ que tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos . El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación con base a tirosina de xnmunoreceptor (ITA ) en un dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición con base a tirosina de xnmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (ver reseña M. en Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs se reseñan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos para ser identificados en el futuro, se comprenden por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs de mamífero al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"Las células efectoras de humano" son leucocitos que expresan una o más FcRs y realizan funciones efectoras.
Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos de humano que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos,· prefiriéndose PBMCs y células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
La "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la trayectoria de complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen a su antígeno semejante. Para valorar la activación complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. ethods 202:163 (1996).
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignancias linfoide. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándula salivar, cáncer renal o de riñon, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de célula B, cáncer cerebro, así como cabeza y cuello, y metástasis asociada.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno proliferativo celular es cáncer.
"Tumor", como se utiliza en la presente, se refiere a todo crecimiento celular neoplásico y proliferación, ya sea maligno o benigno, y todos los tejidos y células pre-cancerosas o cancerosas .
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce la muerte celular" es uno que causa que una célula viable se vuelva no viable . La célula es una que expresa un polipéptido TAT, preferentemente una célula que sobreexpresa un polipéptido TAT en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula cancerosa. Preferentemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrial, glándula salivar, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreática o de vejiga. La muerte celular in vitro puede determinarse en la ausencia de células efectoras inmunes y complemento para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para muerte celular puede realizarse utilizando suero inactivado por calor (es decir, en la ausencia de complemento) y en la ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es capaz de inducir muerte celular, la pérdida de integridad de membrana según se evalúa por la toma de yoduro de propidio (PI) , azul de tripano (ver Moore et al. Cytotec nology 17:1-11 (1995)) o 7AAD puede valorarse relativa a células no tratadas. Los anticuerpos, oligopéptidos u otra moléculas orgánicas que inducen la muerte celular preferidos, son aquellos que inducen la toma PI en el ensayo de toma PI en células BT474.
Una "célula que expresa TAT" es una célula que expresa un polipéptido TAT transfectado o endógeno ya sea en la superficie celular o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa TAT" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido TAT presente en la superficie celular o que producen o secretan un polipéptido TAT. Un "cáncer que expresa TAT" opcionalmente produce niveles suficientes de polipéptido TAT en la superficie celular del mismo, de manera que un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica pueden unirse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer que expresa TAT" opcionalmente produce y secreta niveles suficientes de polipéptido TAT, de manera que un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica antagonista puede unirse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a lo último, el antagonistaa puede ser un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe o previene la producción y secreción del polipéptido TAT secretado por células tumorales . Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido TAT es uno que tiene niveles significativamente más altos de polipéptido TAT en la superficie celular del mismo, o se produce y secreta, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede causarse por amplificación genética o por traducción o transcripción incrementado. La sobreexpresión de polipéptido TAT puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o pronóstico al evaluar niveles incrementados de la proteína TAT presente en la superficie de una célula, o secretada por la célula (por ejemplo, a través de un ensayo de inmunohistoquimica utilizando anticuerpos anti-TAT preparados contra un polipéptido TAT aislado que puede prepararse utilizando tecnología de ADN recombinante de un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido TAT; análisis FACS, etc.). Alternativamente, o adicionalmente, uno puede medir los niveles de ácido nucleico que codifica el polipéptido TAT o ARNm en la célula, por ejemplo, a través de hibridación fluorescente in situ utilizando una prueba basada en ácido nucleico que corresponde a un ácido nucleico que codifica TAT o el complemento del mismo; (FISH; ver W098/45479 publicada en Octubre, 1998) , Southern blotting, Northern blotting, o técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) , tal como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También uno puede estudiar la sobreexpresión de polipéptido TAT al medir el antígeno mudado en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo, utilizando ensayos a base de anticuerpo (ver también, por ejemplo. Patente de E.U.A. No. 4,933,294 emitida el 12 de Junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de Abril de 1991; Patente de E.U.A. 5,401,638 emitida el 28 de Marzo 1995; y Sias et al., J. Immunol. Métodos 132:73-80 (1990)). Además de los ensayos anteriores, están disponibles varios ensayos in vivo para el practicante experimentado. Por ejemplo, uno puede exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que se marca opcionalmente con una marca detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a células en el paciente, por ejemplo, por exploración externa para radioactividad o al analizar una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo .
Como se utilizan en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") co las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente al sitio de unión y reconocimiento del antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM.
La palabra "marca" cuando se utiliza en la presente se refiere a una composición o compuesto detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica para generar un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "marcado (a) " . La marca puede ser detectable por sí misma (por ejemplo marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de una composición o compuesto de sustrato que es detectable.
El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53 , BÍ212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los varios agentes anticáncer o antitumor descritos abajo. Otros agentes citotóxicos se describen abajo. Un agente tumoricidal causa la destrucción de células tumorales .
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamide CYTOXA ®; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacl; colchicinas ; ácido betulínico una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatin; calistatin; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin y bizelesin) podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatin; duocarmicin (incluyendo los análogos sintéticos, K -2189 y CB1-TM1) ; eleuterobin,- pancratistatin; una sarcodictiin; espongistatin; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracil; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, incluyendo dinemicin A; una esperamicin; así como cromóforo de neocarzinostatin y cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados) , aclacinomisinas, actinomicin, autramicin, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, cromomicinis, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicin (incluyendo morfolino-doxorubicin, cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin y deoxydoxorubicin) , epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tales como mitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-merca topurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenos de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM libre de Cremophor, formulación de nanopartícula diseñada de albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; cloranbucil; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicin; aminopterin; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de lo anterior tal como CHOP, una abreviación para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviación para un régimen de tratamiento con oxaliplatin (ELOXATINTM) combinada con 5-FU y leucovovin.
También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear, o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y con frecuencia están en la forma de tratamiento de cuerpo entero, o sistémico. Pueden ser hormonas por sí mismos. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo NOLVADEX® tamoxifen) , EVISTA® raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; anti-progesteronas ; subreguladores del receptor de estrógeno (ERDs) ,- agentes que funcionan para suprimir o eliminar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona de liberación de hormo leutinizante (LHRH) tales como LUPRON® y acetato de leuprólido ELIGARD®, acetato de goserelin, acetato de buserelin y tripterelin; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa de enzima, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX® . Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tal como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico ZOMETA®/zoledronato, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID®, o risedronato ACTONEL® ; así como troxacitabina (un análogo de citosina de 1, 3-dioxolano nucleósido) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en trayectorias de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tal como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia de gen, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasal LURTOTECAN® ; ABARELIX® rmRH; ditosilato lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina cinasa dual ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa TAT, ya sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de Células que expresan TAT en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en lugar diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen la detención Gl y detención de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopósido, y bleomicin. Aquellos agentes que detienen Gl también se desbordan hacia la detención de fase S, por ejemplo, agentes de ADN alquilantes tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, y ara-C. La información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds . , Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Sabajos: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol de tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado de tejo Europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de microtúbules de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la depolimerización, que resulta en la inhibición de mitosis en células.
La "Doxorubicin" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de doxorubicin es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3 , 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9,10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-naftacenediona .
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas de polipéptidos tradicionales. Se incluyen entre las citocinas la hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento de humano, hormona de crecimiento de humano de N-metionil, y hormona de crecimiento bovino; hormona de paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxin; prorelaxin; hormonas de glicoproteína tal como hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona estimulante de tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placental; factor de necrosis de tumor- y -ß; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibin; activin; factor de crecimiento endotelial vascular; integrin; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento del nervio tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaqueta; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor I y -II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tal como interferon -ar -ßt y -y; factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleuquinas (ILs) tales como IL-1, IL- la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y kit ligando (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El término "folleto" se utiliza para referirse a instrucciones incluidas de manera acostumbrada en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o avisos concernientes al uso de tales productos terapéuticos .
II. Composiciones y Métodos de la Invención A. Anticuerpos Anti-TAT En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAT que pueden encontrar uso en la presente como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Anticuerpos ejemplificativos incluyen anticuerpos policlonal, monoclonal, humanizado, biespecíf co, y heteroconjugado. 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se aumentan preferentemente en animales por inyección subcutánea múltiple (se) o intraperitoneal (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se utilizan péptidos sintéticos) con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizarse. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con la hemocianina extraída de molusco llamado 'lapa californiana' (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de semilla de soya, utilizando un agente de derivación o bifuncional, por ejemplo, maleimidobenzoil éster sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y Rl son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos , o derivados al combinar, por ejemplo, 100 µ? o 5 de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se estimulan con 1/5 a 1/10 la cantidad original de péptido o conjugan en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después, los animales sangran y el suero se analiza para concentración de anticuerpo. Los animales se estimulan hasta que la concentración se estabiliza. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes de acumulación tales como alum se utilizan de manera adecuada para aumentar la respuesta inmune . 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse utilizando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (Patente de E.U.A. No. 4,816,567).
En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe arriba para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de manera específica a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y fusionan entonces con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) .
Las células de hibridoma de esta manera preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado, tal medio preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parenteral, no fusionadas (también referidas como un compañero de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma parenteral carecen de la transfer asa e fosforibosil de guanina de hipoxantina (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterin, y timidina (medio HAT) , tales sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma del compañero de fusión preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan producción a alto nivel estable de anticuerpo por células que producen anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio selectivo que se selecciona contra las células parenterales sin fusionar. Las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados por ejemplo, las células X63-Ag8-653 disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, Virginia, EUA. Las líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp. 51-63 ( arcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
El medio de cultivo en el cual se desarrollan las células de hibridoma, se analiza para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) .
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980).
Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada se identifican, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y se desarrollan por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Adem s, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo en tumores ascitis en un animal, por ejemplo, por inyección intraperitoneal de las células en ratones .
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan por separado de manera adecuada del medio de cultivo, fluido ascitis, o suero por procedimientos de purificación de anticuerpo convencional tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando Sepharose de proteína A o proteína G) o cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Los artículos de reseña de expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).
En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de humano y murino, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos de humano de alta afinidad (rango riM) por mezcla de cadena (Marks et ai., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et ai., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales .
El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpo de fusión o quimérico, por ejemplo, al sustituir secuencias de dominio constante de cadena ligera y cadena pesada de humano (CH y CL) para las secuencias de murino homologas (Patente de E.Ü.A. No. 4,816,567; y Morrison, et ai., Proc . Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o al fusionar la secuencia de codificación de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido de no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptido de no inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen para los dominios variables e un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 3. Anticuerpos Humanizados y de Humano Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos de humano adicionales. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab1 , F(ab')2 u otras subsecuencias de unión de antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en el cual los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo teniendo la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de estructura Fv de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones Fr son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . , 2:593-596 (1992)].
Los métodos para humanizar anticuerpos no humano se conocen bien en la materia. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humano con frecuencia se refiere a "residuos" de importación, que se toman típicamente de un dominio variable de "importación" . La humanización puede realizase esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir las secuencias CDR o CDRs de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo de humano. De acuerdo con lo anterior, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U.A. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable de humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos de humano en los cuales los residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor .
La elección de dominios variables de humano, tanto de cadena ligera como pesada, a utilizarse para hacer los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo anti-ratón de humano) cuando el anticuerpo está pensado para uso terapéutico. De acuerdo al así llamado método "de mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable de humano conocidas. Se identifica la secuencia de dominio V de humano que está más cercana a aquella del roedor y la región de estructura de humano (FR) dentro de ella aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos de humano de un subgrupo particular de cadenas, ligera o pesada. La misma estructura puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad de unión para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr este objetivo, de acuerdo a un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parenerales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenteral y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares a aquellos expertos en la materia. Los programas computacionales están disponibles, que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unir su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de importación y receptor de manera que se alcanza la característica de anticuerpo deseado, tal como afinidad incrementada para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de región hipervariable se incluyen directamente o más sustancialmente para tener influencia en la unión de antígeno .
Se contemplan varias formas de un anticuerpo anti- TAT humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agente (s) citotóxico (s) para generar un inmunoconj gado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto.
Como una alternativa a humanización, pueden generarse los anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, en inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos de humano en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigosa del gen de región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quimérica resulta en la inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de gen de inmunoglobulina de línea germinal de humano hacia tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto de antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todo de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852.
Alternativamente, la tecnología de despliegue de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553
[1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos de humano y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados . De acuerdo a esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en estructura en ya sea un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y desplegaron como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de filamento sencillo del genoma de fago, las selecciones con base a las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas proteínas. De estas maneras, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede realizarse en una variedad de formatos, reseñada en por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para despliegue de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca de combinación aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores de humano no inmunizados puede construirse y los anticuerpos para un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, también, Patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905.
Como se trata arriba, los anticuerpos de humano también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U.A. 5,567,610 y 5,229,275). 4. Fragmentos de anticuerpo En ciertas circunstancias existen ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos enteros . El tamaño más pequeño de los fragmentos permite el despeje rápido, y puede conducir a acceso mejorado a tumores sólidos .
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985) ) . Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células huésped recombinantes . Fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv todos pueden expresarse en y secretarse de E. coli, permitiendo de esta manera la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fago de anticuerpo tratadas arriba. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) ) . De acuerdo a otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de célula huésped recombinante . Los fragmentos Fab y F(ab')2 con vida media in vivo incrementada que comprenden un receptor de rescate que une los residuos de epítopo se describen en Patente de E.U.A. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante experimentado. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de E.U.A. No. 5,571,894; y Patente de E.U.A. No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistas de regiones constantes; de esta manera, son adecuadas para unión no específica reducida durante uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para producir fusión de una proteína efectora en ya sea el término amino o carboxi de un sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U.A. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . 5. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplificativos pueden unirse a dos epítopos diferentes de una proteína TAT como se describe en la presente. Otros tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión TAT con un sitio de unión para otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-TAT puede combinarse con un brazo que se une a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD3) , o receptores Fe para IgG (FcyR) , tales como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , para enfocar y localizar mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa T. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar los agentes citotóxicos para células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión TAT y un brazo que une el agente citotóxico (por ejemplo, saporin, anti-interferon-a, alcaloide vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).
WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIII y Patente de E.U.A. No. 5,837,234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRI . Un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fca se muestra en WO98/02463. Patente de E.U.A. No. 5,821,337 enseña un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la diversidad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespcífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se hace por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante problemática, y las producciones de producto son bajas. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo a un planteamiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de las regiones de articulación, CH2, y CH3. Se prefiere tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario para unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transíectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan la producción óptima del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible, insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión único cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales resulta en altas producciones o cuando las proporciones no tienen efecto significativo en la producción de combinación de cadena recombinante .
En una modalidad preferida de este planteamiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseada, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este planteamiento se describe en O 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
De acuerdo a otro planteamiento descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfase de la primer molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptofan) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la(s) cadena (s) lateral (es) larga (s) se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido largas con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros .
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugado" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la materia, y se describen en la Patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con un número de técnicas reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se penetran proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de composición ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles próximos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB se convierte de nuevo al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreta por separado de E. coli y se somete a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico de esta manera formado fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T de humano normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos de humano contra objetivos de tumor de mama de humano. También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante . Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión de gen. Los omodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monótneros y después volver a oxidase para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico . Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL por un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con lo anterior, los dominios VH y VL de un fragmento se forman para formar pares con los dominios VH y VL complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión de antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) también se han reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Los anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 6. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de E.U.A. No. 4,676,980], y para tratamiento de infección de VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vi tro utilizando métodos conocidos en química de proteina sintética, incluyendo aquellos agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en Patente de E.U.A. No. 4,676,980. 7. Anticuerpos Multivalente Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase Ig ) con tres o más sitios de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión de antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferentemente dos cadenas de polipéptido) ; en donde la(s) cadena (s) de polipéptido comprende (n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido puede(n) comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede (n) comprender: una cadena VH-CHl-enlazador flexible -VH-CH1-región Fe; o cadena VH-CH1-VH-CH1-región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente preferentemente comprende además al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente, por ejemplo, puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. 8. Diseño de Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para mejorar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el (los) residuos de cisteína puede (n) introducirse en la región Fe, permitiendo así la formación de enlace de disulfuro de interceden en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular mediada por complemento incrementado y citotoxiciad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando agentes de reticulación heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993).
Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo que tiene regiones Fe duales y así puede tener capacidades ADCC y lisis de complemento mejoradas. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) .
Para incrementar la vida media del suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en Patente de E.U.A. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo de unión de receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media de suero in vivo de la molécula IgG. 9. Inmunoconjugados La invención también pertenece a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radiocon ugado) .
Se han descrito arriba los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados . Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricin A, cadena de abrin A, cadena e modecin A, alfa-sarcin, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantin, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicina, y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos está disponible para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212BÍ, 1311, 1311?, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados funcionales de imidoestéres (tal como HCL adipimidato de dimetil) , ásteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) exanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos bis-flúor activos (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético marcado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificativo para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como una calicheamicina, maitansinoides , un tricoten, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente .
Maitansina y maitansinoides En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-TAT (longitud completa o fragmentos) de la invención se conjuga con una o más moléculas de maitansinoide .
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló primero de arbusto Maytenus de África del Este (Patente de E.U.A. No. 3,896,111). Subsiguientemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (Patente de E.U.A. No. 4,151,042). Se describen maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo, por ejemplo, en Patentes de E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia.
Conjugados de maitansinoide-anticuerpos En un intento por mejorar su índice terapéutico, la maitansina y maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de célula tumoral. Los inmunoco jugados conteniendo maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en Patentes de E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y Patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describió inmunoconjugados que comprenden una maitansinoide designada DM1 enlazada al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal de humano. Se encontró que el conjugado es altamente citotóxico hacia células cancerosas de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un crecimiento in vivo del ensayo de tumor. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en los cuales una maitansinoide se conjugó a través de un enlazador de disulfuro al anticuerpo A7 de murino que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon de humano, o a otro TA.l de anticuerpo monoclonal de murino que une el oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea celular SK-BR-3 de cáncer de mama de humano, que expresa 3 x 105 HER-2 antígenos de superficie por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco de maitansinoide libre, que podría incrementarse al incrementar el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7 -maitansinoide mostró citotoxicidad sistémica baja en ratones.
Conjugados de anticuerpo anti-polipéptido TAT-maitansinoide ( inmunoconjugados) Los conjugados de anticuerpo anti-TAT-maitansinoide se preparan al enlazar químicamente un anticuerpo anti-TAT a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de ya sea el anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar de manera negativa la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejore la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Maitansinoides se conocen bien en la materia y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en Patente de E.U.A. No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones de no patente referidas en la presente anteriormente. Maitansinoides preferidas son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinol, tales como varios ásteres de maitansinol.
Existen muchos grupos de enlace conocidos en la materia para hacer conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente de E.U.A. No. 5,208,020 o EP Patente 0425235B1, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y Patente de E.U.A. No. de Solicitud 10/960,602, presentada el 8 de Octubre de 2004, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC pueden prepararse como se describe en la Patente de E.U.A. No. de Solicitud 10/960,602, presentada el 8 de Octubre de 2004. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles, o grupos esterasa lábiles, como se describe en las patentes arriba identificadas, prefiriéndose grupos disulfuro y tioéter. Los grupos de enlacé adicionales se describen y ejemplifican en la presente.
Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados funcionales de imidoestéres (tal como HCL adipimidato de dimetil) , ásteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos bis-flúor activos (tal como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737
[1978]) y N-succinimidil-4 -(2-piridilthio) entanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro.
En enlazador puede unirse a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales . La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetil, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 teniendo un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. Auristatinas y Dolostatinas En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o derivados y análogos peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de E.U.A. Nos. 5,635,483; 5,780,588). Dolastatinas y auristatinas han mostrado interferir con dinámicas de microtúbulo, hidrólisis GTP, y división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12) : 3580-3584) y tienen actividad anticáncer (US 5,663,149) y antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965) . La porción de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) de la porción de fármaco peptídica ( O 02/088172) .
Las modalidades de auristatina ej emplificativas incluyen las porciones de fármaco de monometilauristatin enlazadas al término N DE y DF (es decir, MMAE y MMAF) , descritas en "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cáncer Research, Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de Marzo de 2004, la descripción de la cual se incorpora expresamente para referencia en su totalidad.
Típicamente, las porciones de fármaco con base de péptido pueden prepararse al formar un enlace de péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales enlaces de péptido pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo al método de síntesis de fase líquida (ver E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides" , volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que se conoce bien en el campo de química de péptido. Las porciones de fármaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo a los métodos de: US 5,635,483; US 5,780,588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans . 1 5:859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7) : 778-784.
Calicheamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-TAT conjugado con una o más moléculas calicheamicina. La familia calicheamicina de antibióticos es capaz de producir rompimientos de ADN de doble filamento en concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina, ver Patentes de E.U.A. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas para la Compañía American Cyanamid) . Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ???, 2?, 3?, N-acetil-??? , PSAG y T?1 (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de E.U.A. arribas mencionadas para American Cyanamid) . Otro fármaco anti-tumor con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la toma celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora sus efectos citotóxicos .
Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse con los anticuerpos anti-TAT de la invención incluyen BCNU, estreptozoicin, vincristina y 5-fluorouracil, la familia de agentes conocidos de manera colectiva complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de E.U.A. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (Patente de E.U.A. 5,877,296).
Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena de exotoxin A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricin A, cadena de abrin A, cadena de modecin A, alfa-sarcin, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantin, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993.
La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonuclease o una endonucleasa de ADN tal como una deoxiribonucleasa; DNasa) .
Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos está disponible para la producción de anticuerpos anti-TAT radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el conjugado para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o una marca giratoria para formación de imágenes de resonancia magnética nuclear ( MR) (también conocida como formación de imágenes de resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Las radio-marcas u otras pueden incorporarse en el conjugado en maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis de aminoácido química utilizando precursores de aminoácido adecuados que incluyen, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc99m o 1123, .Rel86, Rel88 e Inlll pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados funcionales de imidoestéres (tal como HCL adipimidato de dimetil) , ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos bis-flúor activos (tal como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminepentaacético marcado con Carbono 14 ( X-DTPA) es un agente quelante ejemplificativo para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador penetrable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetil o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de E.U.A. No. 5,208,020).
Los compuestos de la invención contemplan de manera expresa, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos de reticulación: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. , U.S.A). Ver páginas 467-498, Aplicaciones 2003-2004 Applications Manual y Catálogo.
Alternativamente, puede hacerse una proteina de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAT y agente citotóxico, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre si o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal estreptavidin) para uso en pre-direccionamiento de tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por retiro de conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidin) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . 10. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-TAT descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas . Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agente tensoactivo que es útil para suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes de la liposoma se ordenan comúnmente en una formación de bicapa, similar al orden de lípido de las membranas biológicas . Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); H ang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicadas el 23 de Octubre de 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en Patente de E.U.A. No. 5,013,556.
Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas, como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico se contiene opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19) :1484 (1989).
B. Oligopéptidos de Unión ??? Oligopéptidos de unión TAT de la presente invención son oligopéptidos que se unen, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de unión TAT son usualmente de al menos aproximadamente 5 aminoácidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos en longitud o más, en donde tales oligopéptidos son capaces de unión, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de unión TAT puede identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se observa que las técnicas para seleccionar bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de unirse de manera específica a un polipéptido objetivo se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668) .
En este aspecto, despliegue de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite que uno seleccione bibliotecas grandes de oligopéptido para identificar miembro (s) de aquellas bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo. El despliegue de fago es una técnica por la cual los polipéptidos variantes se despliegan como proteínas de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386) . La utilidad de despliegue de fago se basa en el hecho de que las bibliotecas grandes de variantes de proteína selectivamente aleatorias (o ADNcs aleatoriamente clonados) pueden clasificarse rápida y eficientemente para esas secuencias que se unen a una molécula objetivo con alta afinidad. El despliegue de bibliotecas de péptido (C irla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fago se han utilizado para seleccionar millones de polipéptidos u oligopéptidos por unos con propiedades de unión específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). La clasificación de bibliotecas de fago de imitantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo, y un medio para evaluar los resultados de los enriquecimiento de unión. Patentes de E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.
Aunque la mayoría de los métodos de despliegue de fago han utilizado fago filamentoso, también se conocen sistemas de despliegue de fago lambdoide (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de despliegue de fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de despliegue de fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5, 766, 905) .
Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de despliegue de fago básico se han desarrollado ahora. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de despliegue para seleccionar bibliotecas de péptido para unirse a moléculas objetivo seleccionadas y desplegar proteínas funcionales con el potencial de seleccionar estas proteínas para propiedades deseadas. Se han desarrollado los dispositivos de reacción de combinación para reacciones de despliegue de fago (WO 98/14277) y bibliotecas de despliegue de fago se han utilizado para analizar y controlar interacciones biomoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales limitados (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue de fago se contacta con una solución en la cual se unirá el ligando a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se unirá a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de unión. WO 97/46251 describe un método para selección por afinidad de una biblioteca de despliegue de fago aleatorio con un anticuerpo purificado por afinidad y después aislar el fago de unión, seguido por un proceso de micro selección utilizando cavidades de microplaca para aislar fago de unión de alta afinidad. También se ha reportado el uso de protelna A de Staphlylococcus aureus como una marca de afinidad (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de substracción de substrato para distinguir las especificidades de enzima utilizando una biblioteca de combinación que puede ser una biblioteca de despliegue de fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para usarse en detergentes que utilizan despliegue de fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de unión específicas se describen en Patentes de E.U.A. Nos. 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833.
Métodos para generar bibliotecas de péptido y seleccionar estas bibliotecas también se describen en Patentes de E.U.A. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.
C . Moléculas Orgánicas de Unión TAT Moléculas orgánicas de unión TAT son moléculas orgánicas diferentes a oligopéptidos o anticuerpos como se define en la presente que se unen, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Las moléculas orgánicas de unión TAT pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión TAT son usualmente menores a aproximadamente 2000 daltones en tamaño, alternativamente menores a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltones en tamaño, en donde tales moléculas orgánicas que son capaces de unión, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se observa que las técnicas para seleccionar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de unión a un polipéptido objetivo se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT Nos.
WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión TAT pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hirazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, quetales, tioquetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinas, dioles, alcoholes amino, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas , tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonil, compuestos diazo, cloruos ácidos, o lo similar.
D . Selección de Anticuerpos Anti-TAT, Oligopéptidos de Unión TAT y Moléculas Orgánicas de Unión TAT Con las Propiedades Deseadas Se han descrito arriba las técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas que se unen a polipéptidos TAT. Uno puede seleccionar además anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee.
Los efectos inhibidores de crecimiento de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención pueden valorarse por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, utilizando células que expresan un polipéptido TAT ya sea endógenamente o siguiendo la transfección con el gen TAT. Por ejemplo, las líneas celulares de tumor apropiadas y células transfectadas TAT pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención a varias concentraciones por unos pocos días (por ejemplo, 2-7) días y colorearse con violeta cristal o MTT o analizarse por algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir la proliferación sería al comparar la toma de 3H-timidina por las células tratadas en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT de la invención. Después de tratamiento, se recolectan las células y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN se cuantificó en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor de crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular. La inhibición de crecimiento de células tumorales in vivo puede determinarse en varias maneras conocidas en la materia. Preferentemente, la célula tumoral es una que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferentemente, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT inhibirá proliferación celular de una célula tumoral que expresa TAT in vitro o in vivo por aproximadamente 25-100% comparado con la célula tumoral no tratada, más preferentemente, por aproximadamente 30-100%, e incluso más preferentemente por aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 g/ml. La inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 \iq/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor de crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 Ug/kg a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal resulta en reducción en tamaño de tumor o reducción de proliferación de célula tumoral dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
Para seleccionar un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT que induce la muerte celular, pérdida de integridad de membrana como se indica mediante, por ejemplo, yoduro de propidio (PI) , azul tripan o toma 7AAD puede valorarse en relación al control. Un ensayo de toma PI puede realizarse en la ausencia de células efectoras inmunes y de complemento. Células tumorales que expresan polipéptido TAT se incuban con medio sólo o medio conteniendo el anticuerpo anti-TAT apropiado (por ejemplo, a aproximadamente 10ug/ml) , oligopéptido de unión TAT o molécula orgánica de unión TAT. Las células se incuban por un periodo de tiempo de 3 días. Siguiendo cada tratamiento, las células se enjuagan y se colocan en alícuota en tubos 12 x 75 cubiertos con una coladera de 35 mm (lml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retiro de grumos de célula. Los tubos que reciben PI (??µ?/???) . Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y software CellQuest FACSCO VERT® (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión TAT o moléculas orgánicas de unión TAT que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, como se determina por toma PI, pueden seleccionarse como anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión TAT o moléculas orgánicas de unión TAT que inducen muerte celular.
Para seleccionar los anticuerpos, oligopéptidos u otra moléculas orgánicas que se unen a un epítopo en un polipéptido TAT unido por un anticuerpo de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo transversal de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Este ensayo puede utilizarse para determinar si un anticuerpo prueba, oligopéptido u otra molécula orgánica se une al mismo sitio o epítopo como un anticuerpo anti-TAT conocido. Alternativa, o adicionalmente, el trazado de epítopo puede realizarse por métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpos puede mutagenizarse tal como por exploración de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se prueba inicialmente para unirse con anticuerpo policlonal para asegurar el doblez apropiado. En un método diferente, los péptidos que corresponden a diferentes regiones de un polipéptido TAT pueden utilizarse en ensayos de competición con los anticuerpos prueba o con un anticuerpo prueba y un anticuerpo con un epítopo conocido o caracterizado.
E. Terapia de Profármaco Mediada por Enzima Dependiente de Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en ADEPT al conjugar el anticuerpo con una enzima que activa el profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO81/01145) en un fármaco anti-cáncer activo. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y Patente de E.U.A. No. 4,975,278.
El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco en tal manera para convertirlo en su forma más activa, citotóxica.
Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; deaminasa de citosina útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracil; proteasas, tales como proteasa de serracia, termolisin, subtilisin, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útil para convertir profármacos que contienen sustituyentes de aminoácido D; enzimas de penetración de carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamsa en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tal como amidasa de penicilina V o amidasa de penicilina G, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógeno de amina con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas" , pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para suministro de la abziraa a una población de células tumorales .
Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-TAT por técnicas bien conocidas en la materia tal como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales tratados arriba.
Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención enlazado a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden construirse utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) .
F. Polipéptidos TAT de Longitud Completa La presente invención también proporciona secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican polipéptidos referidos en la presente solicitud como polipéptidos TAT. En particular, se han identificado y aislado ADNcs (parciales y de longitud completa) que codifican varios polipéptidos TAT, como se describe en detalles adicionales en los Ejemplos abajo.
Como se describe en los Ejemplos abajo, los varios clones ADNc se han depositado con ATCC. Las secuencias de nucleótidos actuales de aquellos clones pueden determinarse fácilmente por el experto al secuenciar el clon depositado utilizando métodos de rutina en la materia. La secuencia de aminoácidos predicha puede determinarse de la secuencia de nucleótidos utilizando experiencia de rutina. Para los polipéptidos TAT y ácidos nucleicos de codificación descritos en la presente, en algunos casos, los solicitantes han identificado lo que se cree es el marco de lectura mejor identificable con la información de secuencia disponible al momento .
G. Variantes de Anticuerpo Anti-TAT y Polipéptido TAT Además de los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente, se contempla que pueden prepararse las variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden prepararse al introducir cambios de nucleótido apropiados en el ADN de codificación, y/o por síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácido pueden alterar los procesos post-traducción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT, tal como cambiando el número o posición de sitios de glicosilación o alterando las características de sujeción de membrana.
Las variaciones en los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT descritas en la presente, pueden hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos como se compara con el anticuerpo o polipéptido de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La guía para determinar que residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar de manera adversa la actividad deseada puede encontrarse al comparar la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con aquella de moléculas de proteína conocidas homologas y minimizar el número de cambios de secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácido conservador. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos . La variación permitida puede determinarse al hacer sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes para actividad mostrada por la secuencia nativa madura o de longitud completa.
Se proporcionan los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT en la presente. Tales fragmentos pueden truncarse en el término N o término C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína o anticuerpo nativo de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
Los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden prepararse por cualquiera de un número de técnicas convencionales . Los fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un planteamiento alternativo incluye generar fragmentos de anticuerpo o polipéptido por digestión enzimática, por ejemplo, al tratar la proteína con una enzima conocida para penetrar proteínas en sitios definidos por particular residuos de aminoácido particulares, o al digerir el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislar el fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada incluye aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, por reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen los términos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-TAT nativo o polipéptido TAT descrito en la presente.
En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplificativas en la Tabla 1, o como se describe abajo en referencia a las clases de aminoácido, y se seleccionan los productos.
Tabla 1 Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ej emplificativas Preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp, Gln Asp Gly (G) Pro; Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Leu Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Val; lie Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Leu Ala; Norleucina Las modificaciones sustanciales en función o identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se realizan al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la colocación del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación helicoidal o de hoja, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo; o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de manera natural se dividen en grupos con base a las propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie,- (2) hidrofílico neutral: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de cadena: Gly, Pro; y (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras comprenderán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase . Tales residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadores o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados) .
Las variaciones pueden hacerse utilizando métodos conocidos en la materia tales como mutagénesis (dirigida en sitio) mediada por oligonucleótido, exploración de alanina, y mutagénesis PCR. Mutagénesis dirigida en sitio [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN variante de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
El análisis de aminoácido de exploración también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos se encuentran aminoácidos neutrales, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. Alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina también se prefiere típicamente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en tanto posición enterrada como expuesta [Crochoon, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse aminoácido isotérico.
Cualquier residuo de cisteína no incluido para mantener la conformación apropiada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. De manera conversa, el (los) enlace (s) de cisteína puede (n) agregarse al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un f agmento Fv) .
Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional incluye sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo de humano o humanizado). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo adicional habrán mejorado las propiedades biológicas relativas al anticuerpo de origen del cual se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales incluye maduración de afinidad utilizando despliegue de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de esta manera se despliegan en una manera monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas de fago se seleccionan entonces por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. Para identificar los sitios de región hipervariable candidato para modificación, puede realizarse mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a unión de antígeno. Alternativa, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y polipéptido TAT de humano. Tales residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para sustitución de acuerdo a las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en la presente y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TAT se preparan por una variedad de métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que ocurren de manera natural) o preparación por mutagénesis (o dirigida a sitio) mediada por oligonucleótido, mutagénesis PCR, y mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-TAT.
H. Modificaciones de Anticuerpos Anti-TAT y Polipéptidos TAT Las modificaciones covalentes de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos de aminoácido dirigidos de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos the N- o C-terminal del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La derivación con agentes bifimcionales es útil, por ejemplo, para reticular el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT a una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para usarse en el método para purificar anticuerpos anti-TAT, y vice-versa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidil tal como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidata .
Otras modificaciones incluyen deamidación de residuos de asparaginilo y glutaminilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de seril o treonil, metilación de los grupos -amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Crochoon, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del anticuerpo o polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se propone para propósitos en la presente para significar eliminar una o más porciones de carbohidratos encontradas en polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT de secuencia nativa (ya sea al remover el sitio de glicosilación subyacente o al eliminar la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, incluyendo un cambio en la naturaleza y proporciones de las varias porciones de carbohidrato presentes .
La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos es ya sea típicamente N-enlazada o O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipépido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptidos arriba descritas (para sitios de glicosilación N-enlazada) . La alteración también puede hacerse por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT original (para sitios de glicosilación O-enlazada) . La secuencia de aminoácidos de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede alterarse opcionalmente a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente al mutar el ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en bases preseleccionadas, de manera que se generan los codones que se traducirán en los aminoácidos deseados .
Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT son por acoplamiento enzimático o químico de glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la materia, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev.
Biochem., p. 259-306 (1981).
El retiro de porciones de carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede realizarse química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácido que sirven como objetivos para glicosilación. Las técnicas de deglicosilación químicas se conocen en la materia y describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Aren. Biochem. Biophys . , 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La penetración enzimática de porciones de carbohidrato en polipéptidos puede alcanzarse por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987) .
Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT comprende enlazar el anticuerpo o polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteínico, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol , o polioxialquilenos, en una manera establecida Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed. , (1980).
El anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de la presente invención también puede modificarse en una manera para formar moléculas quiméricos que comprenden un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT fusionado a otro, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos .
En una modalidad, tal una molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo antietiqueta. La etiqueta de epítopo generalmente se coloca en el término amino o carboxilo del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También, la provisión de la etiqueta de epítopo permite que el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se purifique fácilmente por purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta de epítopo. Varios polipéptidos de etiqueta y sus anticuerpos respectivos se conocen bien en la materia. Ejemplos incluyen etiquetas poli-histidina (poly-his) o poli-histidina-glicina (poly-his-gly) ; el polipéptido de etiqueta HA de gripa y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G , B7 y 9E10 para la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glicoproteína D (gD) de virus de Herpes Simple y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido de ep topo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido de epítopo de o¡-tubulin [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta de péptido de proteína 10 de gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990) ] .
En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina" ) , tal función podría ser a la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de articulación, CH2 y CH3, o de articulación, CH1, CH2 y CH3 de una Molécula IgGl. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también Patente de E.U.A. No. 5,428,130 emitida el 27 de Junio de 1995.
I . Preparación de Anticuerpos Anti-TAT y Polipéptidos TAT La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT al cultivar células transformadas o transfectadas con un vector conteniendo ácido nucleico que codifica el polipéptido TAT y anticuerpo anti-TAT. Por supuesto, se contempla que los métodos alternativos, que se conocen bien en la materia, puedan emplearse para preparar anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones de la misma, puede producirse por síntesis de péptido directa utilizando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. , San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automática puede realizarse, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptido de Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Las varias porciones del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos o enzimáticas para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT deseado. 1. Aislamiento de ADN que Codifica Anticuerpo Anti-TAT o Polipéptido TAT ADN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y expresarlo a un nivel detectable De acuerdo con lo anterior, el ADN de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada de tejido de humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT también puede obtenerse de una biblioteca genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automática) .
Las bibliotecas pueden seleccionarse con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. La selección de ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede conducirse utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT es utilizar metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] .
Las técnicas para seleccionar una biblioteca de ADNc se conocen bien en la materia. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente inambiguas que se minimizan los falsos positivos . El oligonucleótido se marca preferentemente de manera que puede detectarse en la hibridación a ADN en la biblioteca que se selecciona. Los métodos de marcado se conocen bien en la materia, e incluyen el uso de radiomarcas como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcado de enzima. Las condiciones de hibridación, incluyendo severidad moderada y alta severidad, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tal como GenBank u otras bases de datos de secuencia privadas. La identidad de secuencia (en ya sea el nivel de nucleótido o aminoácido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa, puede determinarse utilizando métodos conocidos en la materia y como se describe en la presente.
El ácido nucleico que tiene la secuencia que codifica la proteína puede obtenerse al seleccionar bibliotecas genómicas o ADNc seleccionado utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos de extensión de cebador convencionales como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores y procesar los compuestos intermediarios de ARNm que puede no haberse transcrito de modo inverso en ADNc. 2. Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de clonación o expresión descritos en la presente para producción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y se cultivan en medio nutriente modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y lo similar, pueden seleccionarse por el experto sin experimentación indebida. En general, principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al. , supra.
Los métodos de transfección de célula eucariótica y transformación de célula procariótica se conocen por el experto ordinario, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediada por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas a tales células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación se utiliza generalmente para procariotas . La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para transformación de ciertas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de transfecciones de sistemas huésped de célula de mamífero se han descrito en Patente de E.U.A. No. 4,399,216. La transformación en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo al método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (USA) , 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en las células, tal como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacterial con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina . Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente incluyen células procariota, levadura, o eucariota más altas. Las procariotas adecuadas incluyen pero no se limitan a eubacteria, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tal como cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa W3110 E. coli (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tal como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia , por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella , así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de Abril de 1989) , Pseudomonas tal como P. aeruginosa , y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa 3110 es un huésped particularmente preferido o huésped de origen debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante . Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo cepa W3110 E. coli 1A2, que tiene el genotipo completo tonA ; cepa W3110 9E4 E. coli, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; cepa W3110 E. coli 27C7 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; £. coli cepa W3110 37D6, que tiene the complete genotipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; cepa W3110 E. coli 40B4, que es cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP resistente a no canamicina; y una cepa E. coli teniendo proteasa periplásmica mutante descrita en Patente de E.U.A. No. 4,946,783 emitida el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.
El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, y proteínas de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y función efectora Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en destrucción de célula tumoral . Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, U.S. 5,648,237 (Cárter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), y U.S. 5,840,523 (Simmons et. al.) que describen la región de inicio de traducción (TIR) y secuencias de señale para optimizar la expresión y secreción, estas patentes incorporadas en la presente para referencia. Después de la expresión, el anticuerpo se aisla de la pasta de célula de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final puede llevarse a cabo similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado por ejemplo, en células CHO.
Además de las procariotas, los microbios ecuratióticos tales como levadura u hongos filamentosos son adecuados para huéspedes de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismos huésped eucariótico inferior comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140
[1981]; EP 139,383 publicada el 2 de Mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de E.U.A. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis ( W98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2) : 737-742
[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol . , 28:265-278
[1988]); Candida; Trichoderma reesla (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de Octubre 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991) , y huéspedes Aspergillus tal como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 112:284-289
[1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221
[1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474
[1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, E BO J. , 4:475-479
[1985] ) . Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionado de los géneros que consisten de Hansenula , Candida, Kloeckera , Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula . Una lista de especies específicas que son ejemplificativas de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Metilotrophs , 269 (1982) .
Las células huésped adecuadas para la expresión anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, papa, semilla de soya, petunia, tomate, y tabaco. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (Caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta), y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfeccion está públicamente disponible, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de acuerdo a la presente invención, particularmente para transfeccion de células Spodoptera frugiperda.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son línea CV2 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon de embrión de humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical de humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón de humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado de humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); 5 células MRC; células FS4 ; y una línea de hepatoma de humano (Hep G2) .
Las células huésped se transforman con los vectores de clonación expresión descritos arriba para producción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y cultivarse en medios de nutriente convencionales modificados según sea apropiado para promotores de inducción, trasformadores de selección, o amplificación de genes que codifica las secuencias deseadas. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede insertarse en un vector replicable para clonar (amplificación del ADN) o para expresión. Los diversos vectores están públicamente disponibles. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado utilizando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, una o más de una secuencia de señal, un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos compuestos emplea técnicas de ligación estándar que se conocen por el experto.
El TAT puede producirse recombinantemente no solamente de manera directa, sino que también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido teniendo un sitio de penetración específico en el término N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o guías de enterotoxina II estables en calor. Para secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, la guía de invertasa de levadura, guía de factor alfa (incluyendo guías de factor de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en Patente de E.U.A. No. 5,010,182), o guía de fosfatasa ácida, la guía C. albicans glucoamilasa (EP 362,179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En expresión de célula de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas, así como guías secretoras virales.
Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levadura, y virus. El origen de réplica del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negati o, el origen de plásmido de 2µ es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementa las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran los nutrientes críticos no disponibles de medios complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina recemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT, tal como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, prepara y propaga como se describe por Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) . Un gen de selección adecuado para usarse en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de desarrollarse en triptofan, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor enlazado operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen bien los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Los promotores adecuados para usarse con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofan (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tal como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para usarse en sistemas bacteriales también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usarse con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzima Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, hexocinasa, decarboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de glucosa-6- fosfato, mutasa de 3 -fosfoglicerato, cinasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa, y glucocinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para dehidrogenasa 2 de alcohol, isocitocromo C, fosfatasas ácida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, y enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los promotores y vectores adecuados para usarse en la expresión de levadura se describen además en EP 73,657.
La transcripción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar (UK 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40) , de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de ataque cardiaco, estipulando que tales promotores son compatibles con los sistemas de célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT por eucariotas más altas puede incrementarse al insertar una secuencia aumentadora en el vector. Los aumentadores son elementos de accionamiento cis de ADN, usualmente aproximadamente de 10 a 300 bp, que actúan en un promotor que incrementa su transcripción. Muchas secuencias aumentadoras se conocen ahora de genes de mamífero (globin, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, uno utilizará un aumentador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el aumentador SV40 en el último lado del origen de réplica (bp 100-270) , el aumentador promotor temprano de citomegalovirus , el aumentador de polioma en el último lado del origen de réplica, y aumentadores de adenovirus . El aumentador puede dividirse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de codificación de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT, pero se ubica preferentemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongos, insecto, vegetal, animal, humano, o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducir 5' y, ocasionalmente 3', de ADNcs o ADNs virales o eucarióticos . Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
Todavía otros métodos, vectores, y células huésped adecuadas para adaptación a la síntesis de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en cultivo celular de vertebrado recombinante se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Cultivar las Células Huésped Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102 : 255 (1980), Patentes de E.U. Nos. 4,161,104; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U.A. Re. 30,985 pueden utilizarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrin, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato) , tampones (tal como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como fármaco GENTAMYCIN™) , elementos indicadores (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente . Cualquier otro complemento necesario también puede incluirse a concentraciones apropiadas que se conocerían por aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y lo similar, son aquellas utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán aparentes para el experto ordinario en la materia. 5. Detección de Amplificación/Expresión de Gen La amplificación y/o expresión de gen puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, por Southern blotting, Northern blotting convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análisis ADN) , o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, con base en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer los dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo donde el dúplex se une a una superficie, de manera que en la formación de dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
La expresión de gen, alternativamente, puede medirse por métodos inmunológicos , tales como coloración inmunohistoquímica de secciones de tejido o células y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto genético. Los anticuerpos útiles para coloración inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales , y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido TAT de secuencia nativa o contra un péptido sintético con base a las secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra secuencia exógena fusionada a ADN TAT y que codifica un epítopo de anticuerpo específico. 6. Purificación de Anticuerpo Anti-TAT y Polipéptido TAT Las formas de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden recuperarse de medio de cultivo o de lisatos de célula huésped. Si se une a membrana, puede liberarse de la membrana que utiliza una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por penetración enzimática. Las células empleadas en expresión de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden interrumpirse por varios medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, interrupción mecánica, o agentes de lisis celular.
Puede desearse purificar anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT de polipéptidos o proteínas de célula recombinante . Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por división en una columna de intercambio de ion; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de catión tal como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Sep arose de proteína A para remover contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para unir formas marcadas con epítopo del anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Pueden emplearse varios métodos de purificación de proteína y tales métodos se conocen en la materia y describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La(s) etapa (s) de purificación seleccionada (s) depender (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT particulares, producidos.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si se produce el anticuerpo intracelularmente, como una primer etapa, los residuos particulares, ya sea células huésped o fragmentos de lisis, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta de célula se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden removerse por centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolísis y los antibióticos pueden incluirse para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.
La composición de anticuerpo preparada de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad siendo la técnica de purificación preferida. La capacidad de adecuación de proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ??, ?2 o ?4 de humano (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 de humano (Guss et al., E BO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une, es más con frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden alcanzarse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tal como división en una columna de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ en una resina de intercambio de catión o anión (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperase.
Siguiendo cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, aproximadamente 0-0.25M de sal).
J. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión TAT, moléculas orgánicas de unión TAT y/o polipéptidos TAT utilizados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de amonio de octadecildimetilbencil; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol de butil o bencil; parabenos de alquilo tales como paraben de metil o propil; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ,- polipéptidos de bajo peso molecular (menor a aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agente tensoactivo tal como polisorbato; contraiones que forman sal tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) ; y/o agente tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo preferentemente comprende el anticuerpo a una concentración de entre 5-200 mg/ml, preferentemente entre 10-100 mg/ml.
Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratarse, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, además de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión TAT, o molécula orgánica de unión TAT, puede ser deseable incluir en la formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAT que se une a diferente epítopo en el polipéptido TAT, o un anticuerpo a algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. Alternativa, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal, y/o cardioprotector . Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado.
Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, Liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .
Pueden prepararse las preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contiene el anticuerpo, tales matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Patente de E.U. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tal como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
K. Diagnóstico y Tratamiento con Anticuerpos Anti-TAT, Oligopéptidos de Unión TAT y Moléculas Orgánicas de Unión TAT Para determinar la expresión TAT en el cáncer, están disponibles varios ensayos de diagnóstico. En una modalidad, la sobreexpresión de polipéptido TAT puede analizarse por inmunohistoquímica (IHC) . Las secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo IHC y de acuerdo a un criterio de intensidad de coloración de proteína TAT como sigue: Punto 0 - no se observa coloración o se observa coloración de membrana en menos de 10% de células tumorales.
Punto 1+ - se detecta una coloración de membrana casi/apenas perceptible en más de 10% de células tumorales. Las células se colorean solamente en parte de su membrana.
Punto 2+ - se observa una coloración de membrana completa débil a moderada en más de 10% de células tumorales.
Punto 3+ - se observa coloración de membrana completa moderada a fuerte en más de 10% de células tumorales .
Aquellos tumores con puntos 0 o 1+ para expresión de polipéptido TAT pueden caracterizarse como no sobreexpresando TAT, mientras aquellos tumores con puntos 2+ o 3+ pueden caracterizarse como sobreexpresando TAT.
Alternativa, o adicionalmente, los ensayos FISH tales como INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo en tejido de tumor incrustado en parafina, fijo en formalina para determinar el grado (si hay) de sobreexpresion TAT en el tumor.
La sobreexpresion o amplificación TAT pueden evaluarse utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, al administrar una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica) que une la molécula a detectarse y se etiqueta con una marca detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o una marca fluorescente) y explorar de manera externa al paciente para localización de la marca.
Como se describe arriba, los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención pueden ser útiles para diagnóstico y clasificación de cánceres que expresan polipéptido TAT (por ejemplo, en radioformación de imágenes) . Anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas también son útiles para purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAT de células, para detección y cuantificación de polipéptido TAT in vitro, por ejemplo, en ELISA o Western blot, para matar o eliminar las células que expresan TAT de una población de células mezcladas como una etapa en la purificación de otras células .
Actualmente, dependiendo de la etapa de cáncer, el tratamiento de cáncer incluye una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para remover el tejido canceroso, terapia de radiación, y quimioterapia. La terapia de anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica puede ser especialmente deseable en pacientes de edad avanzada quienes no toleran bien la toxicidad y efectos secundarios de quimioterapia y en enfermedad metastática donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la invención que tienen como objetivo el tumor son útiles para aliviar los cánceres que expresan TAT en el diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica pueden utilizarse solos, o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiogenes, o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. Tratamiento de anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica puede administrarse junto con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre- o postconvencional . Los fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel) , TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se utilizan para tratar cáncer, en particular, en pacientes en buen riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar cáncer, al paciente con cáncer puede administrarse anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica junto con tratamiento con el uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular, se contempla la terapia de combinación con palictaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517) . El anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica se administración una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica se administra junto con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. Physicians' Desk Reference (PDR) describe dosificaciones de estos agentes que se han utilizado en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos arriba mencionados que son terapéuticamente efectivos, dependerá del cáncer particular que se trata, el grado de enfermedad y otros factores familiares para el médico de experiencia en la materia y pueden determinarse por el médico.
En una modalidad particular, un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica conjugado con un agente citotóxico se administra al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteína TAT se interna por la célula, resultando en eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado para matar la célula cancerosa a la cual se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico tiene como objetivo o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Ejemplos de tales agentes citotóxicos se describen arriba e incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN.
Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, moléculas orgánicas o conjugados de toxina de los mismos se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tal como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal , intracerobrospinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica.
Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración del anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferentemente tal terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinergístico .
También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas, con administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno de tumor asociado con el cáncer particular.
En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención incluyen la administración combinada de un anticuerpo anti-TAT (o anticuerpos) , oligopéptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agente inhibidor de crecimientos, incluyendo la co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatin, 5-fluorouracil , melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tal como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el practicante experimentado. Los horarios de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) .
El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden combinarse con un compuesto an i-hormonal ; por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812) ; o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Donde el cáncer a tratarse es cáncer independiente de andrógeno, el paciente previamente pudo haberse sometido a terapia anti-andrógeno y, después de que el cáncer se vuelve independiente de andrógeno, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) puede administrarse al paciente.
Algunas veces, puede ser benéfico co-administrar también un cardioprector (para prevenir o reducir la disfunción al miocardio asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a retiro quirúrgico de células cancerosas y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente con, o post terapia de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica. Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes co-administrados de arriba son aquellos actualmente utilizados y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica .
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación y modo de administración se elegirá por el médico de acuerdo a criterios conocidos. La dosificación apropiada de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, como se define arriba, la severidad y curso de la enfermedad, mientras el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, oligopeptido o molécula orgánica, y la discreción del médico. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra de manera adecuada al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra por infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas . Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 yg/kg a aproximadamente 50 mg/kg peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0. l-15mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosificación candidato inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAT. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. El progreso de esta terapia puede monitorearse fácilmente por métodos convencionales y ensayos y con base a criterios conocidos por el médico u otras personas de experiencia en la materia.
Después de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud completa la administración del anticuerpo por terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se comprende por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo" . Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de Marzo de 1996 que concierne al uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares .
Hay dos planteamientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células de paciente, in vivo y ex vivo. Para suministro in vivo se inyecta ácido nucleico directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde se requiere el anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, las células del paciente se remueven, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implanta en el paciente (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácido nucleicos en células viable. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico hacia células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para suministro ex vivo del ge es un vector retroviral .
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simple I, o virus adeno-asociado) y los sistemas con base lípida (lípidos útiles para transferencia mediada por lípido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para reseña de los protocolos de terapia de gen y marcado de gen actualmente conocidos ver Anderson et ai., Science 256:808-813 (1992) . Ver también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.
Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden estar en las diferentes formas comprendidas por la definición de "anticuerpo" en la presente. De esta manera, los anticuerpos incluyen longitud completa o anticuerpo intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia nativa o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconj gados, y fragmentos funcionales de los mismos . En anticuerpos de fusión, una secuencia de anticuerpos se fusiona a una secuencia de polipéptidos heteróloga. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fe para proporcionar las funciones efectoras deseadas. Como se trata en más detalle en las secciones en la presente, con las regiones Fe apropiadas, el anticuerpo desnudo unido en la superficie celular, puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o al reclutar el complemento en citotoxicidad dependiente de complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, donde sea deseable eliminar o reducir la función efectora, para minimizar los efectos secundarios o complicaciones terapéuticas, pueden utilizarse ciertas otras regiones Fe.
En una modalidad, el anticuerpo compite para unión o unirse substancialmente al, mismo epítopo que los anticuerpos de la invención. También se contemplan los anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos anti-TAT de la invención, específicamente incluyendo el direccionamiento de tumor in vivo y cualquier inhibición de proliferación celular o características citotóxicas.
Se describen en detalle en la presente los métodos para producir los anticuerpos anteriores .
Los presentes anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas son útiles para tratar un cáncer que expresa TAT o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Tal un cáncer incluye cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer ovárico, más específicamente, adenocarcinoma de próstata, carcinomas de célula renal, adenocarcinomas colorectales, adenocarcinomas de pulmón, carcinomas de célula escamosa de pulmón, y mesotelioma pleural . Los cánceres comprenden cánceres metastáticos de cualquiera de lo anterior. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es capaz de unirse a al menos una porción de las células cancerosas que expresan polipéptido TAT en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es efectiva para destruir o matar células tumorales que expresan TAT o inhibir el crecimiento de tales células tumorales, in vitro o in vivo, al unir al polipéptido TAT en la célula. Tal un anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAT desnudo (no conjugado con ningún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades de inhibición de crecimiento celular o citotóxicas, pueden endurecerse además con un agente citotóxico para volverlos más potentes en destrucción de la célula tumoral. Las propiedades citotóxicas pueden conferirse a un anticuerpo anti-TAT al, por ejemplo, conjugar el anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente. El agente citotóxico o un agente inhibidor de crecimiento es preferentemente una molécula pequeña. Las toxinas tales como calicheamicina o una maitansinoide y análogos o derivados de las mismas, son preferible.
La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención, y un vehículo. Para los propósitos de tratar cáncer, las composiciones pueden administrarse al paciente en necesidad de tal tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAT presentes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes inhibidores de crecimiento o citotóxicos, incluyendo agentes quimioterapéuticos . La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención, y un vehículo. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-TAT. Ácidos nucleicos que codifican tanto la cadena H como L y especialmente los residuos de región hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa así como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo, se comprenden.
La invención también proporciona métodos útiles para tratar un cáncer que expresa polipéptido TAT o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, comprendiendo administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica puede administrarse a corto plazo (agudo) o crónico, o intermitentemente según lo indique el médico. También se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento de, y muerte de una célula que expresa polipéptido TAT.
La invención también proporciona kits y artículos de fabricación que comprende al menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. Los kits que contienen anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas encuentran uso, por ejemplo, para ensayos de muerte de célula TAT, para purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAT de células. Por ejemplo, para aislamiento y purificación de TAT, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica acoplado a las perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse los kits que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para detección y cuantificación de TAT in vitro, por ejemplo, en ELISA o Western blot. Tal anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica útil para detección puede proporcionarse con una marca tal como una fluorescente o radiomarca .
L. Artículos de Fabricación y Kits Otra modalidad de la invención es un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de cáncer que expresa anti-TAT. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o folleto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente conserva una composición que es efectiva para tratar la condición de cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. La etiqueta o folleto indica que la composición se utiliza para tratar cáncer. La etiqueta o folleto comprenderá además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al paciente con cáncer. Adicionalmente, el articulo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua baterioestática para inyección (BWFI) , salina de tampón de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables dése un punto de vista del usuario y comercial, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.
También se proporcionan los kits que son útiles para varios propósitos, por ejemplo, para célula que expresa ensayos de muerte TAT, para purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAT de células. Para aislamiento y purificación de polipéptido TAT, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica acoplada a las perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse los kits que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para detección y cuantificación de polipéptido TAT in vitro, por ejemplo, en ELISA o Western blot. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o folleto en o asociado con el recipiente. El recipiente conserva una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. Pueden incluirse los recipientes adicionales que contiene, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control.
La etiqueta o folleto puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso propuesto in vitro o de diagnóstico.
M. Usos para Ácidos Nucleicos que Codifican Polipéptidos TAT y TAT-Polipéptido Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican polipéptidos TAT tienen varias aplicaciones en la materia de biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en trazado de gen y cromosoma y en la generación de sondas de ADN y ARN anti-sentido. El ácido nucleico que codifica TAT también será útil para la preparación de polipéptidos TAT por las técnicas recombinantes descritas en la presente, en donde aquellos polipéptidos TAT pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos anti-TAT como se describe en la presente.
El gen TAT de secuencia nativa de longitud completa, o porciones del mismo, puede utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar ADNc TAT de longitud completa o aislar todavía otros ADNs (por ejemplo, aquellos que codifican variantes que ocurren de manera natural de TAT o TAT de otras especies) que tiene una identidad de secuencia deseada con la secuencia TAT nativa descrita en la presente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases.
Las sondas de hibridación pueden derivarse de al menos regiones parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud completa en donde aquellas regiones pueden determinarse sin experimentación indebida o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos aumentadores e intrones de TAT de secuencia nativa. A manera de ejemplo, un método de selección comprenderá aislar la región de codificación del gen TAT utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse por una variedad de marcas, incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35S, o marcas enzimáticas tal como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidin/biotin. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a aquella del gen TAT de la presente invención pueden utilizarse para seleccionar bibliotecas de ADNc de humano, ADN genómico o ARNm para determinar con que miembros de tales bibliotecas se híbrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en detalle adicional en los Ejemplos de abajo. Cualquier secuencia EST descrita en la presente solicitud puede emplearse similarmente como sondas, utilizando los métodos descritos en la presente.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican TAT incluyen oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de filamento sencillo (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias ARNm objetivo (sentido) o ADN TAT (antisentido) . Los oligonucleótidos sentido o antisentido, de acuerdo a la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de ADN TAT. Tal un fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, con base a secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos sentido o antisentido a secuencias de ácidos nucleicos objetivo resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno o varios medios, incluyendo degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transcripción o traducción, o por otros medios. Tales métodos se comprenden por la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido de esta manera pueden utilizarse para bloquear la expresión de proteínas TAT, en donde aquellas proteínas TAT pueden jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos. Los oligonucleótidos sentido o antisentido comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistencias a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir degradación enzimática) pero mantienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos objetivo.
Los sitios intragénicos preferidos para unión antisentido incluyen la región que incorpora el codón de inicio/principio de traducción (5'-AUG / 5'-ATG) o codón de terminación/fin (5'-UAA, 5 ' -UAG y 5-UGA / 5 ' -TAA, 5"-TAG y 5 ' -TGA) del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del ARNm o gen que comprende de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') de un codón de inicio o terminación de traducción. Otras regiones preferidas para unión antisentido incluyen: intrones, exones, uniones de intrón-exón, la estructura de lectura abierta (ORF) o "región de codificación" que es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción; la tapa 5' de un ARNm que comprende un residuo de guanosina N7-metilada unido al residuo más 5' del ARNm a través de un enlace de trifosfato 5' -5' e incluye la estructura de tapa 5' por sí misma asi como los primeros nucleótidos adyacentes a la tapa, la región sin traducir 5 (5'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de inicio de traducción, e incluyendo de esta manera nucleótidos entre el sitio de tapa 5' y el codón de inicio de traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen; y la región sin traducir 3' (3'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 3' del codón de terminación de traducción, e incluyendo de esta manera nucleótidos entre el codón de terminación de traducción y extremo 3 ' de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen.
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de proteínas TAT incluyen ologinucleótidos que contienen estructuras modificadas o enlaces de intemucleósido no natural. Los oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas incluyen aquellos que mantienen un átomo de fósforo en la estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los propósitos de esta especificación, y como algunas veces se hace referencia en la materia, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura de intemucleósido que no tienen un átomo de fósforo en su estructura de intemucleósido, también pueden considerarse por ser oligonucleósidos . Las estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, metil y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3 ' -alquileno, fosfonatos de 5' -alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 31 -amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos , tionofosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres , selenofosfatos y borano-fosfatos teniendo enlaces normales 3' -5', análogos enlazados 2' -5' de estos, y aquellos teniendo polaridad invertida en donde uno o más enlaces de internucleotido es un enlace 3' a 31 , 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferidos que tiene polaridad invertida comprenden un enlace sencillo de 3' a 31 en el enlace de internucleotido más 3' es decir un residuo de nucleósido invertido sencillo que puede ser básico (falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en lugar de la misma) . También se incluyen varias sales, sales mezcladas y formas ácidas libres. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos. 3, 687, 808 4,469, 863 4,476,301 5, 023,243 5,177,196 5, 188, 897 5,264,423 5,276, 019 5, 278, 302 5, 286, 717 5,321,131 5,399,676 5,405, 939 5, 453,496 5,455,233 5,466,677 5,476, 925 5, 519, 126 5, 536, 821 5, 541, 306 5,550,111 5,563,253 5, 571, 799 5, 587,361 5,194,599 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.
Las estructuras de oligonucleótido modificado preferido que no incluyen un átomo de fósforo en el mismo tienen estructuras que se forman por enlaces de internucleósido de cicloalquilb o alquilo de cadena corta, heteroátomo mezclado y enlaces de internucleósido de cicloalquilo o alquilo, o uno o más enlaces de internucleósido heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces de morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetil y tioformacetil; estructuras de formacetil y tioformacetil de metileno; estructuras de riboacetil; estructuras conteniendo alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y metilenihidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otros teniendo partes de componentes N, O, S y CH.sub.2 mezcladas. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales oligonucleósidos incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.
En otros oligonucleótidos antisentido preferidos, tanto el enlace de azúcar como internucleósido, es decir, la estructura, de las unidades de nucleótido se reemplazan con nuevos grupos. Las unidades base se mantienen por hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Un tal compuesto oligomérico, una imitación de oligonucleótido que se ha mostrado por tener excelentes propiedades de hibridación, se refiere como un ácido nucleico de péptido (PNA) . En compuestos PNA, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con une estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la estructura. Patentes de Estados Unidos Representativas que enseñan la preparación de compuestos PNA incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos.: 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia, la enseñanza adicional de compuestos PNA pueden encontrarse en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Los oligonucleótidos antisentido preferidos incorporan estructuras de fosforotioato y/o estructuras de heteroátomo, y en particular -CH2-NH-0-CH2- , -CH2-N (CH3 ) -O-CH2- [conocida como estructura de metileno (metilimino) o MMI] , -CH2-0-N(CH3) -CH2-, -CH2- (CH3 ) - (CH3 ) -CH2- y -O-N(CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura de fosfodiéster nativa se representa como -0-P-0-CH2-] descrita en la Patente de E.U. No. 5,489,677 mencionada arriba, y las estructuras amida de la Patente de E.U. No. 5,602,240 mencionada arriba. También se prefieren los oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras morfolino de la Patente de E.U. No. 5,034,506 mencionada arriba.
Los oligonuicleótidos modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar sustituidas . Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; O-alquil, S-alquil, o N-alquil; O-alquenil, S-alqueinil, o N-alquenil; O-alquinil, S-alquinil o N-alquinil; o O-alquil-O-alquil, en donde el alquil, alquenil y alquinil puede ser alquil Cl a CIO o alquenil C2 a CIO y alquinil sustituido o no sustituido. Se prefieren particularmente O [ (CH2 ) nO] mCH3 , 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y O (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2 , donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : alquil inferior Cl a CIO, alquil inferior sustituido, alquenil, alquinil, alcaril, aralquil, O-alcaril o O-aralquil, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN, CF3 , 0CF3, S0CH3 , S02 CH3 , ON02, N02 , N3 , NH2 , heterocicloalquil, heterocicloalcaril, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de penetración ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes teniendo propiedades similares. Una modificación preferida incluye 21 -metoxietoxi (2 ' -0-CH2CH20CH3, también conocido como 21 -0- (2-metoxietil) o 2'-M0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi . Una modificación preferida adicional incluye 21 -dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0(CH2) 20N(CH3) 2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la materia como 2 ' -O-dimetilaminoetoxietil o 21 -DMAEOE) , es decir, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2) .
Una modificación preferida adicional incluye Ácidos Nucleicos Fijos (LNAs) en los cuales el grupo 2'-hidroxil se enlaza en el átomo de carbono 3 ' o ' del anillo de azúcar formando así una porción de azúcar bicíclica. En enlace es preferentemente un grupo metelina (-CH2-)n que une el átomo de oxigeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2.
LNAs y la preparación del mismo se describe en WO 98/39352 y WO 99/14226.
Otras modificaciones preferidas incluyen 21 -metoxi (2·-0-0?3), 2' -aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2 NH2) , 21 -alil (2·-CH2-CH=CH2) , 2 ' -O-alil (2 ' -0-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación 21 puede estar en la posición arabino (arriba) o posición ribo (abajo). Una modificación de 2'-arabino preferida es 2'-F. Las modificaciones similares también pueden hacerse en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 31 del azúcar en el nucleótido 3* terminal o en los oligonucleótidos 2' -5' enlazados y la posición 5' de nucleótido 5' terminal. Oligonucleótidos también pueden tener imitaciones de azúcar tales como porciones de ciclobutil en lugar de azúcar de pentofuranosil . Patentes de Estados Unidos Representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
Los oligonucleótidos también pueden incluir sustituciones o modificaciones de nucleobase (con frecuencia referida en la materia simplemente como "base" ) . Como se utilizan en la presente, nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracil (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases naturales y sintéticas tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracil y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracil y citosina y otros derivados de alquinil de bases pirimidina, 6-azo uracil, citosina y timina, 5-uracil (pseudouracil) , 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras 8-adeninas y guanines sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otras uracil y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (lH-pirimido [5, -b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -ona, fenotiazina citidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4] benzotiazin-2(3H)-ona), G-abrazaderas tales como una citidina de fenoxazina sustituida (por ejemplo 9- (2-aminoetoxi) -H- pirimido [5, 4-b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -ona) , carbazol citidina (2H-pirimido [ , 5-b] indol-2-ona) , piridoindol citidina (H-pirido [3 ' , 21 :4, 5] pirrólo [2, 3-d] pirimidin-2-ona) . Nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en Patente de E.U. No. 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Enciclopedia Of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas N-2, N-6 y 0-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil y 5-propinilcitosina . Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan estabilidad dúplex de ácido nucleico por 0.6-1.2. grados C. (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones base preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 21 -O-metoxietil . Patentes de Estados Unidos Representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a: Patente de E.U. No. 3,687,808, así como Patentes de E.U. NOS.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.
Otra modificación de oligonucleótidos antisentido se enlazan químicamente al ologonucleótido de una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la toma celular del oligonucleótido . Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugado unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primario o secundario. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos de catión, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, biotin, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas, y tintes. Grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran toma de oligómero, mejorar la resistencia de oligómero a degradación, y/o reforzar hibridación específica de secuencia con ARN. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran toma de oligómero, distribución, metabolismo o excreción. Las porciones de conjugado incluyen pero no se limitan a porciones de lípido tal como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alif tica, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecil (Saison-Behmoaras et al., EMBO J. , 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett . , 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3 -H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético de adamantano (Manoharan et al. r Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción de palmitil (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol . Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse con substancias de fármaco activo, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofen, suprofen, fenbufen, ketoprofen, (S) - (+) -pranoprofen, carprofen, dansilsarcosina, ácido 2 , 3 , 5-triiodobenzóico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicin, un barbiturato, una cefalosporin, un fármaco sulf , un antidiabético, un antibacterial o un antibiótico. Los conjugados oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en Solicitudes de Patente de E.U.A. No. Ser. 09/334,130 (presentada el 15 de Junio de 1999) y Patentes de E.U. NOS. : 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5, 525, 465; 5, 541, 313; 5,545, 730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5, 580, 731; 5, 591, 584; 5,109,124; 5,118,802; 5, 138, 045; 5,414, 077; 5,486,603; 5,512,439; 5, 578, 718; 5, 608, 046; 4,587,044; 4, 605, 735; 4, 667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4, 835, 263; 4,876,335; 4, 904, 582 ; 4, 958, 013 ; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5,214, 136 ; 5, 082, 830; 5, 112, 963 ; 5,214,136; 5,245, 022; 5,254,469; 5, 258, 506; 5,262,536; 5, 272, 250; 5,292, 873; 5,317, 098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente, y de hecho más de una de las modificaciones arriba mencionadas pueden incorporarse en un compuesto único o incluso a un nucleósido único dentro de un oligonucleótido . La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos . Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada elaboración de al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región en donde se modifica el oligonucleótido para conferir al oligonucleótido resistencia incrementada a degradación de nucleasa, toma celular incrementada, y/o afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capas de penetrar los híbridos ARN: DN o ARN:ARN. A manera de ejemplo, RNase H es un endonucleasa celular que penetra el filamento ARN de un dúplex ARN:ADN.
La activación de RNase H, por lo tanto, resulta en penetración del objetivo ARN, mejorado así grandemente la eficiencia de inhibición de oligonucleótido de expresión genética. Consecuentemente, los resultados comparables pueden obtenerse con frecuencia con ologinucleótidos más cortos cuando se utilizan los oligonucleótidos quiméricos, en comparación con deoxioligonucleótidos de fosforotionato hibridándose con la misma región objetivo. Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleótidos y/o imitaciones de oligonucleótido como se describe arriba. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos preferidos incorporan al menos un azúcar 2' modificada (preferentemente 21 -0-(CH2) 2-0-CH3) en la 3' terminal para conferir resistencia a nucleasa y una región con al menos 4 2'-H azúcares contiguas para conferir la actividad de RNase H. Tales compuestos también se refieren en la materia como híbridos o gapmers . Los gapmers preferidos tienen una región de 2' grupos modificados (preferentemente 2 ' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la 3'-terminal y en la 5 ' terminal separada por al menos una región teniendo al menos 4 2 ' -H azúcares contiguas y preferentemente incorporan los enlaces de estructura de fosforotioato. Patentes de Estados Unidos Representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
Los compuestos antisentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden hacerse conveniente y rutinariamente a través de técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. El equipo para tal síntesis se vende por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para tal síntesis conocida en la material puede emplearse adicional o alternativamente. Se sabe bien utilizar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los derivados de fosforotioatos y alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse , conjugarse con o de otra manera asociarse con otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas objetivo receptor, formulaciones oral, rectal, tópica u otra, para ayudar en la toma, distribución y/o absorción. Patentes de Estados Unidos Representativas que enseñan la preparación de tales formulaciones de toma, distribución y/o para ayudar a la absorción incluyen, pero no se limitan a, Patentes de E.U. Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.
Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o no sentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se enlazan covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquellas descritos en WO 90/10048, y otras porciones que incrementa la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli- (L-lisina) . Incluso, agentes de intercalado, tal como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido sentido o antisentido para la secuencia de nucleótidos objetivo.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos objetivo por cualquier método de transferencia de gen, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaP04 , electroporación, o al utilizar vectores de trasferencia de gen tal como virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido sentido o antisentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula conteniendo la secuencia de ácidos nucleicos objetivo se contacta con el vector retroviral recombinante in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) .
Los oligonucleótidos antisentido o sentido también pueden introducirse en una célula que contiene secuencias de nucleótido objetivo por la formación de un conjugado con una molécula de unión de ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión de ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citosinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión de ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión de ligando para unirse a su receptor o molécula correspondiente, o bloquear la entrada de oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula conteniendo la secuencia de ácidos nucleicos por formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido-lípido se disocia preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena.
Las moléculas de ADN o ARN sentido o antisentido generalmente son de al menos aproximadamente 5 nucleotidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleotidos en longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleotidos a la que se hace referencia más o menos 10% de esa longitud a la que se hace referencia.
Las sondas también pueden emplearse en técnicas PCR para generar un grupo de secuencias para identificación de secuencias de codificación TAT cercanamente relacionadas.
Las secuencias de nucleotidos que codifican un TAT también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para trazar el gen que codifica ese TAT y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente pueden trazarse a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma que utiliza técnicas conocidas, tal como hibridación in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos, y selección de hibridación con bibliotecas .
Cuando las secuencias de codificación para TAT codifican una proteína que se une a otra proteína (ejemplo, donde TAT es un receptor) , TAT puede utilizarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas incluidas en la interacción de unión. Por tales métodos, pueden identificarse inhibidores de la interacción de unión de receptor/ligando. Las proteínas incluidas en tales interacciones de unión también pueden utilizarse para seleccionar inhibidores de molécula pequeña o péptido o agonistas de la interacción de unión. También, el receptor TAT puede utilizarse para aislar ligando (s) correlativo (s) . Los ensayos de selección pueden designarse para encontrar compuestos guía que imitan la actividad biológica de un TAT nativo o un receptor para TAT. Tales ensayos de selección incluirán ensayos dispuestos a selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos de fármaco de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos . Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de proteína-proteína, ensayos de selección bioquímicos, inmunensayos y ensayos con base celular, que se caracterizan bien en la materia.
Los ácidos nucleicos que codifican TAT o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar ya se animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, tal transgen se introduce en el animal o un ancestro del animal en la etapa prenatal, por ejemplo, una embriónica. Un transgen es un ADN que se integra en el genoma de una célula de cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, ADNc que codifica TAT puede utilizarse para clonar el ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan TAT de codificación de ADN. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la materia y se describen por ejemplo, en Patentes de E.U.A.
Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares se tendrían como objetivo para incorporación de transgen TAT con mejoradores específicos de antígeno. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica TAT introducido en la línea germinal del animal y a una etapa embriónica pueden utilizarse para examinar el efecto de expresión incrementada de ADN que codifica TAT. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos buscados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, comparada con animales sin tratar, que llevan el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica Alternativamente, homólogos no humanos de TAT pueden utilizarse para construir un animal nknock out" TAT que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica TAT como un resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica TAT y ADN genómico alterado que codifica TAT introducido en una célula madre embriónica del animal. Por ejemplo, ADNc que codifica TAT puede utilizarse para clonar ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica TAT puede eliminarse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionadle que puede utilizarse para monitorear la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN de flanqueo sin alterar (tanto en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos] . El vector se introduce en una línea celular madre embriónica (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado de manera homologa con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de adición [ver por ejemplo, Bradley, en Teratocareinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) , pp. 113-152] . Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal de crianza hembra pseudoembarazada adecuado y el embrión llegó a término para crear un animal "knock out" . La progenie que aloja el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales puede identificarse por técnicas estándar y utilizarse para reproducir animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales knockout pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse 'contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a las ausencias del polipéptido TAT, El ácido nucleico que codifica los polipéptidos TAT también puede utilizarse en terapia genética. En aplicaciones de terapia genética, los genes se introducen en células para lograr síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, para reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia genética" incluye tanto terapia genética convencional donde un efecto duradero se lograr por un tratamiento sencillo, como la administración de agentes terapéuticos genéticos, que incluye la administración de una vez o repetida de un ARNm o ADN terapéuticamente efectivo. ADNs y ARNs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que los ologonucleotidos antisentido cortos pueden importarse hacia células donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su toma restringida por la membrana celular (Zamecnik et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146
[1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su toma, por ejemplo, al sustituir sus grupos fosfodiéster negativamente cargados por grupos no cargados .
Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas pueden variar dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico hacia células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de gen in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retroviral) y transfección mediada por proteína-liposoma de revestimiento viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210
[1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que tiene como objetivo las células dirigidas, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Donde se emplean los liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden utilizarse para dirigir y/o facilitar la toma, por ejemplo, proteínas cápsido o fragmentos de las mismas típicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en ciclo, proteínas que dirigen la ubicación intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990) . Para reseña de marcado de gen, y protocolos de terapia genética ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) .
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos TAT o fragmentos de los mismos descritos en la presente son útiles para identificación de cromosoma. En este aspecto, existe una necesidad en proceso de identificar nuevos marcadores de cromosoma, ya que relativamente pocos reactivos marcadores de cromosoma, con base a los datos de secuencia actual, están disponibles ahora. Cada molécula de ácido nucleico TAT de la presente invención puede utilizarse como un marcador de cromosoma.
Los polipéptidos TAT y moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden usarse en modo de diagnóstico para tipificar el tejido, en donde los polipéptidos TAT de la presente invención pueden expresarse de manera diferencial en un tejido en comparación con otro, preferentemente en un tejido enfermo en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico TAT encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western.
Esta invención comprende métodos para seleccionar compuestos para identificar aquellos que imitan al polipéptido AT (agonistas) o previenen el efecto del polipéptido TAT (antagonistas) . Los ensayos de selección para candidatos fármaco antagonistas se diseñan para identificar los compuestos que se unen o componen con los polipéptidos TAT codificados por los genes identificados en la presente, o que de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, incluyendo, por ejemplo, inhibir la expresión de polipéptido TAT de células. Tales ensayos de selección incluirán ensayos dispuestos a selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos fármaco de molécula pequeña.
Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión de proteína-proteína, ensayos de selección bioquímica, y ensayos basados en célula, los cuales se caracterizan bien en la materia.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes de manera que pueden llamar a contacto al fármaco candidato con un polipéptido TAT codificado por un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir a estos dos componentes interactuar.
En los ensayos de unión, la interacción es vinculante y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido TAT codificado por el gen identificado en la presente o el fármaco candidato se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microconcentración, mediante uniones covalentes y no covalentes. La unión no covalente en lo general se logra al revestir la superficie sólida con una solución del polipéptido TAT y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para que el polipéptido TAT se inmovilice, puede utilizarse para sujetarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo al agregar el componente no inmovilizado, el cual puede etiquetarse por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie revestida que contiene el componente sujetado. Cuando la reacción se completa, los componentes sin reaccionar se remueven, por ejemplo, mediante lavado, y los complejos sujetados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada en la superficie indica que ocurrió el acomple amiento. Donde el componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, el acomplejamiento puede detectarse, por ejemplo, al utilizar un anticuerpo etiquetado específicamente uniendo el complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interactúa con pero no se une a un polipéptido TAT particular codificado por un gen identificado en la presente, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse mediante los métodos bien conocidos para detectar las interacciones de proteína-proteína. Tales ensayos incluyen los procedimientos tradicionales, tales como, por ejemplo, degradación, co-inmunoprecipitación, y la co-purificación a través de los gradientes o columnas cromatográficas . Además, las interacciones de proteína-proteína pueden monitorearse al utilizar un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y asociados (Fields y Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se divulga por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Varios activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4 , consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno actuando como el dominio de unión por ADN, el otro funcionando como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones precedentes (en lo general, referido como el "sistema doble híbrido") toma ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio de unión por ADN de GAL4 , y otra, en la cual las proteínas activadoras candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador GALl-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 por medio de la interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos en interacción, se detectan con un sustrato cromogénico para ß-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKERTM) para identificar las interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas que utilizan la técnica doble híbrido se encuentra comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para trazar los dominios de proteína incluidos en las interacciones de proteína específicos así como para precisar los residuos de aminoácido que son cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido TAT identificado en la presente y otros componentes intra- o extracelulares, pueden probarse como sigue: normalmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y por un tiempo que permite la interacción y unión de los dos productos. Para probar la habilidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se ejecuta en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, puede agregarse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitorea como se describe anteriormente. La formación de un complejo en la (s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su pareja de reacción.
Para ensayar los antagonistas, el polipéptido TAT puede agregarse a una célula junto con el compuesto a ser seleccionado para una actividad particular y la habilidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipéptido TAT indica que el compuesto es un antagonista al polipéptido TAT. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse al combinar el polipéptido TAT y un antagonista potencial con receptores de polipéptido TAT unido por membrana o receptores recombinantes bajo condiciones adecuadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido TAT puede etiquetarse, tal como por radioactividad, de tal manera que el número de moléculas de polipéptido TAT unidas al receptor, puede utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, cribado de ligando y clasificación FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991) . Preferentemente, se emplea la clonación por expresión en donde el ARN poliadenilado se prepara de una célula responsiva al polipéptido TAT y una biblioteca ADNc creada de este ARN se divide en grupos y se utiliza para transfectar las células COS u otras células que no son responsivas al polipéptido TAT. Las células transfectadas que se desarrollan en portaobjetos de vidrio, se exponen al polipéptido TAT etiquetado. El polipéptido TAT puede etiquetarse por una variedad de medios incluyendo la yodinacion o inclusión de un sitio de reconocimiento para una cinasa de proteína específica de sitio. Siguiente a la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autoradiográfico . Los grupos positivos se identifican y los sub-grupos se preparan y se re-transfectan utilizando un proceso de re-selección y sub-agrupación interactiva, produciendo eventualmente un clon único que codifica el receptor putativo.
Como un planteamiento alternativo para identificación de receptor, polipéptido TAT marcado puede enlazarse por fotoafinidad con la membrana celular o extraer preparaciones que expresan la molécula receptora. El material reticulado se resuelve por PAGE y expone a película de rayos X. El complejo etiquetado que contiene el receptor puede cortarse, resolverse en fragmentos de péptido, y someterse a micro-secuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de micro-secuenciación se utilizará para designar un conjunto de sondas de ologonucleótidos degeneradas para seleccionar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor serían incubadas con el polipéptido TAT etiquetado en la presencia del compuesto candidato. La habilidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción pudiera entonces medirse .
Los ejemplos más específicos de los antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido TAT, y, en particular, los anticuerpos que incluyen, sin limitación, los anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como los anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido TAT que reconoce el receptor pero no imparte efecto, de ese modo inhibiendo competitivamente la acción del polipéptido TAT.
Otro antagonista de polipéptido TAT potencial es una construcción de ADN o ARN antisentido preparada que utiliza la tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm al hibridarse al ARNm objetivo e impidiéndose la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ARN o ADN antisentido, ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos TAT maduros en la presente, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares base en longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen incluido en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al . , Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impidiendo de ese modo la transcripción y la producción del polipéptido TAT. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido TAT (antisentido - Okano, Neurochem. , 56:560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos anteriormente descritos también pueden entregarse a las células de tal manera que el ADN o ARN antisentido pueden expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido TAT. Cuando se utiliza el ADN antisentido, las oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos de gen objetivo, se prefieren.
Los antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido TAT, bloqueando de ese modo la actividad biológica normal del polipéptido TAT. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, pequeños péptidos o moléculas tipo péptido, preferentemente péptidos solubles, y compuestos inorgánicos u orgánicos no peptidilo sintéticos.
Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la división especifica de ARN. Los ribozimas actúan por hibridación específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por la división endonucleolítica . Los sitios de división de ribozima específicos dentro de un objetivo de ARN potencial pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales, véase por ejemplo Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y Publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997) .
Las moléculas de ácido nucleico en la formación de tiple hélice utilizada para inhibir la transcripción deberían ser de filamento único y componerse de deoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de tal manera que promueve la formación de triple hélice por medio de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, las cuales en lo general requieren tramos cuantiosos de purinas o pirimidinas en un filamento de un dúplex. Para mayores detalles, véase, por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante cualquiera o más de los ensayos de selección anteriormente discutidos y/o mediante cualquiera de las otras técnicas de selección bien conocidas por aquellos expertos en la materia.
El ácido nucleico que codifica el polipétido TAT aislado puede utilizarse en la presente para producir de manera recombinante el polipéptido TAT utilizando las técnicas bien conocidas en la materia y como se describen en la presente. A su vez, los polipétidos TAT producidos pueden emplearse para generar los anticuerpos anti-TAT utilizando las técnicas bien conocidas en la materia y como se describen en la presente .
Los anticuerpos que específicamente unen un polipéptido TAT identificado en la presente, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de selección anteriormente descritos, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos, incluyendo cáncer, en la forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido TAT es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren los anticuerpos de internalización. Sin embargo, las lipofecciones o liposomas también pueden utilizarse para suministrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, a las células. Donde se utilizan los fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibitorio más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo, se prefiere. Por ejemplo, con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la habilidad para unir la secuencia de proteínas objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante . Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) .
La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Alternativamente, o en adición, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito planeado.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen limitar el alcance de la presente invención en cualquier manera.
Todas las referencias de literatura y patente citadas en la presente especificación se incorporan por la presente para referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Los reactivos comercialmente disponibles referidos en los Ejemplos se utilizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante al menos que se indique de otra manera. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y por toda la especificación, por los números de acceso ATCC es la Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, VA.
EJEMPLO 1 : Descripción de Expresión del Tejido Utilizando GeneExpress® Una base de datos registrada que contiene la información de expresión genética (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) se analizó en un intento por identificar polipéptidos (y sus ácidos nucleicos de codificación) cuya expresión se supraregula significa y detectablemente en tejido(s) de tumor de humano particular de interés en comparación con otro(s) tumor (es) de humano y/o tejidos de humano normales. Específicamente, el análisis de la base de datos GeneExpress® se condujo utilizando ya sea software disponible de Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, para uso con la base de datos GeneExpress® o con software registrado escrito y desarrollado en Genentech, Inc. para uso con la base de datos GeneExpress®. La clasificación de los hits positivos en el análisis se basa en varios criterios incluyendo, por ejemplo, especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos de proliferación normales y/o esenciales normales. Utilizando este análisis de expresión de ARNm, se determinó que ARNm que codifica el polipéptido TAT194 se sobreexpresa significativa, reproducible y detectablemente en tumores de mama y pulmón de humano (incluyendo pulmón de célula no pequeña) en comparación con los tejidos normales correspondientes de mama y pulmón de humano, respectivamente.
EJEMPLO 2 : Análisis de Nicroconjunto para Detectar la Supraregulación de Polipéptidos TAT en Tumores Cancerosos Los microconjuntos de ácido nucleico, con frecuencia conteniendo miles de secuencias de gen, son útiles para identificar genes expresados de manera diferencial en tejidos enfermos en comparación con sus contrapartes normales. Utilizando; microconjuntos de ácido nucleico, las muestras de ARNm de prueba y control de las muestras de tejido de prueba y control, se transcriben de manera inversa y marcan para generar sondas de ADNc . Las sondas de ADNc se hibridan entonces con un conjunto de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El conjunto se configura de manera que se conoce la secuencia y posición de cada miembro del conjunto. Por ejemplo, una selección de genes conocidos por expresarse en ciertos estados de enfermedad pueden agruparse en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro del conjunto particular indica que la muestra de la cual se derivó la sonda expresa ese gen. Si la señal de hibridación de una sonda de una muestra de prueba (tejido de enfermedad) es mayor que la señal de hibridación de una sonda de una muestra de control (tejido normal) , se identifican el gen o genes sobreexpresados en el tejido de enfermedad. La implicación de este resultado es que una proteína sobreexpresada en un tejido de enfermedad es útil no solamente como un marcador de diagnóstico de la presencia de la condición de enfermedad, sino que también como un objetivo terapéutico para tratamiento de la condición de enfermedad.
La metodología de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de microconjunto se conoce bien en la materia. En el presente ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para hibridación y sondas, portaobjetos, y condiciones de hibridación se detallan todas en Solicitud de Patente PCT No. de Serie PCT/US01/10482 , presentada el 30 de Marzo de 2001 y que se incorpora en la presente para referencia.
En el presente ejemplo, los tumores cancerosos derivados de varios tejidos humanos se estudiaron para expresión genética supraregulada relativa a los tumores cancerosos de diferentes tipos de tejido y/o tejidos de humano no cancerosos en un intento por identificar aquellos polipéptidos que se sobreexpresan en un tumor canceroso particular. En ciertos experimentos, el tejido de tumor de humano canceroso y tejido de tumor de humano no canceroso del mismo tipo de tejido (con frecuencia del mismo paciente) se obtiene y analizan para expresión de polipéptido TAT. Adicionalmente, el tejido de tumor de humano canceroso de cualquiera de una variedad de diferentes tumores de humano se obtiene y compara como una muestra de control epitelial "universal" que se preparó al agrupar tej idos de humano no cancerosos de origen epitelial, incluyendo hígado, riñon, y pulmón. El ARNm aislado de los tejidos epiteliales agrupados representa una mezcla de productos genéticos expresados de varios tejidos epiteliales diferentes, proporcionando así un excelente control negativo con el cual se comparan cuantitativamente los niveles de expresión genética en tumores de origen epitelial. Los experimentos de hibridación de microconjunto utilizando las muestras de control agrupadas generaron un trazo lineal en un análisis de dos colores. La inclinación de la línea generada en un análisis de 2 colores se utilizó entonces para normalizar las proporciones de (detección de prueba: control) dentro de cada experimento. Las proporciones normalizadas de varios experimentos se compararon entonces y utilizaron para identificar el grupo de expresión genética. De esta manera, la muestra de "control universal" agrupada no solamente permitió las determinaciones de expresión genética relativas efectivas en una comparación simple de 2 muestras, también permitió las comparaciones de múltiples muestras a través de varios experimentos .
En los presentes experimentos, las sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido TAT descritas en la presente, se utilizaron en la creación del microconjunto y ARN de varios tejidos de tumor se utilizó para la hibridación al mismo. Un valor con base en la proporción normalizada:proporción experimental se designa como una "proporción de corte" . Solamente se determinaron significativos valores que están arriba de esta proporción de corte. El significado de proporciones se estimó de la cantidad de ruido o dispersión asociada con cada experimento, pero típicamente, se utilizó un corte en proporción de 1.8 veces - 2 veces o mayor para identificar genes candidato relativamente sobreexpresados en muestras de tumor en comparación con el tejido normal correspondiente y/o el control universal epitelial normal, agrupado. Las proporciones para genes identificados en esta manera como sobreexpresándose relativamente en muestras de tumor variaron de 2 veces a 40 veces, o incluso más. En comparación, en un experimento de control en el cual el mismo AR se marcó en cada color e hibridó contra sí mismo, para virtualmente todos los genes con señales arriba de lo anterior, la proporción observada es significativamente menor a 1.8 veces . Esto indica que el ruido experimental arriba de una proporción de 1.8 veces es extremadamente bajo, y un cambio de veces observado de 1.8 veces o mayor se espera que represente una diferencia real, detectable y reproducible en la expresión entre las muestras analizadas y comparadas.
Los datos de estos experimentos demostraron que el polipéptido TAT194 se sobreexpresa significativa, detectable y reproduciblemente en tej idos de tumor de mama de humano en comparación con el tejido de mama de humano de contraparte normal y/o el tejido de control epitelial normal agrupado. Estos datos son consistentes con reportes anteriores que indican que los polipéptidos TAT194 se supraregulan en cánceres de mama de humano (ver Esseghir et al., Cáncer Research 67 (24) : 11732-11741 (2007). Cuantitativamente, los datos de estos experimentos demostraron que la proporción de expresión de TAT194 en ciertas muestras de tejido de tumor de mama de humano en comparación con tejido de mama de humano normal varió de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces más alta en las muestras de tumor de mama. Como se describe arriba, estos datos demuestran que los polipéptidos TAT194 de la presente invención son útiles no solamente como marcadores de diagnóstico para la presencia de uno o más tumores cancerosos, sino que también sirven como objetivos terapéuticos para el tratamiento de aquellos tumores que sobreexpresan polipéptido TAT194.
EJEMPLO 3 : Análisis Cuantitativo de Expresión de ARNm de TAT En este ensayo, un ensayo de 5' nucleasa (por ejemplo, Taq an®) y PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se utilizaron para encontrar genes que se sobreexpresan significativamente en un tumor canceroso o tumores en comparación con otros tumores cancerosos o tejido no canceroso normal . La reacción de ensayo de 5 ' nucleasa es una técnica con base a PCR fluorescente que hace uso de la actividad de 5' exonucleasa de enzima de polimerasa de ADN Taq para monitorear la expresión genética en tiempo real. Dos cebadores de oligonucleótido (cuyas secuencias se basan en el gen o secuencia EST de interés) se utilizan para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se designa para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores PCR.
La sonda no es extensible por enzima de polimerasa de ADN Taq, y se marca con un tinte fluorescente informador y un tinte fluorescente apagador. Cualquier emisión inducida por láser del tinte informador se apaga por el tinte de apagado cuando los dos tintes se ubican juntos a medida que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación de PCR, la enzima de polimerasa de ADN Taq penetra la sonda en una manera dependiente del templado. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del tinte informador liberado está libre del efecto de apagado del segundo fluoróforo. Una molécula de tinte informador se libera para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte informador no apagado proporciona la base para interpretación cuantitativa y cualitativa de los datos . Este ensayo se conoce bien y se utiliza de manera rutinaria en la materia para identificar cuantitativamente las diferencias de expresión genética entre dos muestras diferentes de tejido de humano, ver, por ejemplo, Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al., PCR Métodos Appl., 4:357-362 (1995); Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996); Pennica et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95 (25) : 14717-14722 (1998); Pitti et al., Nature 396 (6712) : 699-703 (1998) y Bieche et al., Int. J. Cáncer 78:661-666 (1998).
El procedimiento de 5' nucleasa se corre en un dispositivo PCR cuantitativa en tiempo real tal como para la Detección de Secuencia ABI Prism 7700TM. El sistema consiste de un termociclador, láser, cámara del dispositivo acoplado a carga (CCD) y computadora. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 cavidades en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recolecta en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todas las 96 cavidades, y detecta en CCD. El sistema incluye software para correr el instrumento y analizar los datos .
El material inicial para la selección fue AR m aislado de una variedad de diferentes tejidos cancerosos. El ARNm se cuantifica de manera precisa, por ejemplo, fluorométricamente. Como un control negativo, AUN se aisló de varios tejidos normales del mismo tipo de tejido que los tejidos cancerosos que se prueban. Frecuentemente, la(s) muestra (s) de tumor se compara (n) directamente con muestra (s) normales "igualadas" del mismo tipo de tejido, significando que las muestras normales y de tumor se obtienen del mismo individuo.
Los datos de ensayo de 5' nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Este se define como el ciclo en el cual la señal informadora se acumula arriba del nivel anterior de fluorescencia. Los valores ACt se utilizan como medición cuantitativa del número relativo de copias iniciales de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico cuando se comparan los resultados de ARNm de cáncer con resultados de ARNm de humano normal . Ya que una unidad Ct corresponde a 1 ciclo PCR o aproximadamente un incremento relativo de 2 veces al normal, dos unidades corresponden a un incremento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponden a un incremento relativo de 8 veces y así sucesivamente, uno puede medir cuantitativa y cualitativa el incremento relativo en veces en expresión de ARNm entre dos o más tejidos diferentes. En este aspecto, se acepta bien en la materia que este ensayo es suficientemente sensible técnicamente para detectar de manera reproducible un incremento de al menos 2 veces en expresión de ARNm en una muestra de tumor de humano relativa a un control normal.
Utilizando está técnica, se ha determinado que los polipéptidos TAT194 se sobreexpresan significativa y detectablemente (en comparación con tejido de mama de humano normal) en 4 de 8 muestras de tumor de mama básicas de humano, 12 de 14 muestras de tumor de mama de humano HER2+, y 11 de 19 muestras de tumor de mama luminal de humano. De nuevo, estos datos confirman los reportes previos de supraregulación de expresión de proteína TAT194 en cánceres de mama de humano (ver Esseghir et al., Cáncer Research 67(24) : 11732-11741 (2007).
EJEMPLO 4 : Preparación de Anticuerpos que se Unen a Polipéptidos TAT194 Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unir, de manera específica, TAT19 .
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden emplearse incluyen TAT purificado, proteínas de fusión que contienen TAT, y células que expresan TAT recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede hacerse por el experto sin experimentación indebida.
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno TAT emulsionado en adyuvante de Freund completo e inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e inyecta en las plantas traseras del animal. Los ratones inmunizados se estimulan entonces 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, por varias semanas, los ratones también pueden estimularse con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones por sangrado retro-orbital para prueba en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-TAT.
Después de que se ha detectado una concentración de anticuerpo adecuada, los animales "positivos" para anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de TAT. Tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células de bazo. Las células de bazo se fusionan entonces (utilizando 35% de polietilenglicol) a una línea celular de mieloma de murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden colocarse entonces en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades conteniendo medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de célula de bazo .
Las células de hibridoma se seleccionarán en un ELISA por reactividad contra TAT. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra TAT está dentro de la experiencia en la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singenéicos para producir ascitis conteniendo los anticuerpos monoclonales anti-TAT. Alternativamente, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matraces de cultivo de tejido o botellas giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis puede realizarse utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión de gel . Alternativamente, puede emplearse la cromatografía de afinidad con base a la unión de anticuerpo a la proteína A o proteína G.
Utilizando la técnica arriba descrita, se ha generado una variedad de líneas celulares de hibridoma separadas y distintas, cada una de las cuales produce anticuerpos monoclonales que se unen a polipéptido TAT19 . Los anticuerpos monoclonales producidos por estas líneas de hibridoma son funcionales en que se ha mostrado que se unen al polipéptido TAT194 utilizando técnicas empleadas de manera rutinaria y bien conocidas tales como Western blot, análisis ELISA, análisis de clasificación FACS de células que expresan el polipéptido TAT194 (tanto 293 células transfectadas para expresar el polipéptido TAT194 en la superficie celular y ciertas líneas celulares de tumor de humano que expresan polipéptido TAT194) y/o análisis de inmunohistoquímica . Ciertos de estos anticuerpos se designan en la presente R4203, R4204, R4205, R4206, R4207, R4208, R4209, R4210, y R4212 (cada uno de los cuales se ha mostrado que se unen específicamente a polipéptido TAT194 en la superficie celular) y las secuencias de aminoácidos asociadas con estos anticuerpos monoclonales, incluyendo de los dominios VL, VH y/o CDR, se muestran en las Figuras 4-11. Los valores de Kd (nM) (determinados a través de análisis BIAcore estándar) y EC50 (determinados por análisis FACS) para ciertos de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 2 abajo.
Tabla 2 Anticuerpo kd (nM) EC50 R4203 0.1 ND R4204 169 3.7 R4205 0.18 2.76 R4206 0.34 2.61 R4207 0.54 1.98 R4208 1.25 3.3 R4209 2.55 2.32 R4212 105 ND EJEMPLO 5: Análisis de Inmunohistoqu mica Los anticuerpos contra polipéptido TAT194 se prepararon como se describe arriba y el análisis de inmunohistoquímica se realizó utilizando el anticuerpo anti-TAT194 monoclonal R4210 (VL - SEC ID NO: 56, VH - SEC ID NO:65) como sigue. Las secciones de tejido se fijaron primero por 5 minutos en acetona/etanol (congelada o incrustada en parafina) . Las secciones se enjuagaron entonces en PBS y después se bloquearon con avidina y biotina (kit Vector) por 10 minutos cada una seguida por un enjuague en PBS. Las secciones se bloquearon entonces con 10% suero por 20 minutos y después se secan para remover el exceso. Un anticuerpo primario se agregó entonces a las secciones a una concentración de 10pg/ml por 1 hora y después las secciones se enjuagaron en PBS . Un anticuerpo secundario biotinilado (anticuerpo anti-primario) se agregó entonces a las secciones por 30 minutos y después las secciones se enjuagaron con PBS. Las secciones se expusieron entonces a los reactivos del kit vector ABC por 30 minutos y después las secciones se enjuagaron en PBS. Las secciones se expusieron entonces a Diaminobenzidina (Pierce) por 5 minutos y después se enjuagan en PBS. Las secciones se contracolorean entonces con hematoxilina Mayers, cubren con una cubierta y se visualizan. El análisis de inmuno istoquímica también puede realizarse como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 y Ausubel et al., Current Protocole of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997) .
Los resultados de estos análisis demuestran que el anticuerpo monoclonal anti-TAT194 empleado identificó la expresión de TAT194 en 19 de 48 (40%) muestras de cáncer de mama de humano primarias, independientes, en donde 8 de esas 19 muestras independientes identificadas como siendo positivas para la expresión de TAT194 evidenciaron mediada a fuerte la expresión de TAT194 en la superficie de las células tumorales . Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal anti-TAT194 empleado identificó la expresión de TAT194 en 17 de 48 (35%) muestras de cáncer de mama de humano metastático independientes, en donde 9 de aquellas 17 muestras independientes identificadas como siendo positivas para la expresión de TAT194 evidenciaron moderada a fuerte la expresión de TAT194 en la superficie de las células tumor les .
EJEMPLO 6 : Ensayo de Internalización de Anticuerpo Anti-TAT194 Este ejemplo demuestra que anticuerpos tnonoclonales anti-TAT194 se internalizan en células subsiguiente a la unión de anticuerpo a polipéptido TAT194 en la superficie de esas células .
Específ camente, 293 células se transfectaron con un vector que codifica el polipéptido TAT194 y se identificó un clon (293 -RET) que expresó el polipéptido TAT194 en la superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT194 se conjugaron con Alexa-Fluor 488 e incubaron con 293 -RET células a 4°C por 1 hora y después se enjuagaron las células. Las células unidas a anticuerpo se incubaron entonces a 37 °C por 2 horas para permitir que ocurra la internalización del anticuerpo unido, y entonces las células se incubaron a 4°C por 20 minutos en la presencia de un anticuerpo anti-Alexa-Fluor 488. Se determinó entonces tanto la superficie celular como la intensidad de fluorescencia promedio interna.
Los resultados de estos análisis demostraron que R4203, R4204, R4205, R4206, R4207, R4208 y R4209 todos evidenciaron excelente habilidad de internalización en células en la unión al polipéptido TAT194 en la superficie celular. El anticuerpo R4212 también fue capaz de internalizar, pero a niveles cuantitativos inferiores a los otros anticuerpos anti-TAT194 probados. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-TAT194 probados en este ensayo sirven como reactivos efectivos para dirigir internamente los compuestos (por ejemplo, toxinas de célula) a células que expresan polipéptido TAT194 en la superficie celular .
EJEMPLO 7 : Preparación de Anticuerpos Conjugados con Toxina que Unen TAT194 El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) , es decir, inmunoconjugados, para el suministro local de agentes citotóxicos o citoestáticos, es decir fármacos para matar o inhibir las células tumorales en el tratamiento de cáncer (Payne (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; E.U.A. 4,975,278), permite el suministro dirigido de la porción de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en la misma, donde la administración sistémica de estos agentes de fármaco no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad a células normales asi como las células tumorales que se buscan eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies ¾ 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Se busca así la eficacia máxima con toxicidad mínima. Los esfuerzos para designar y refinar ADC se han enfocado en la selectividad de anticuerpos monoclonales (mAbs) así como propiedades de liberación de fármaco y enlace de fármaco. Tanto los anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas de planta tal como ricina, toxinas de molécula pequeña tal como geldanamicina (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cáncer Inst. 92 (19) : 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode et al. (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342).
En los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga con una o más porciones de fármaco (D) , por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 20 porciones de fármaco por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . ADC teniendo la fórmula: Ab- (L-D)p pueden prepararse por varias rutas, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones, y reactivos conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido por reacción con una porción de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una porción de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los métodos adicionales para preparar ADC se describen en la presente .
El enlazador puede componerse de uno o más componentes enlazadores . Componentes enlazadores ejemplificativos incluyen 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonil ( "PAB" ) , N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4 - (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC), y N-Succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Los componentes enlazadores adicionales se conocen en la materia y algunos se describen en la presente.
En algunas modalidades, el enlazador puede comprender residuos de aminoácido. Los componentes enlazadores de aminoácido ejemplificativos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Los dipéptidos ejemplificativos incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplificativos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácido que comprenden un componente enlazador de aminoácido incluyen aquellos que ocurren de manera natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácido que ocurren de manera no natural, tal como citrulina. Los componentes enlazadores de aminoácido pueden designarse y optimizarse en su selectividad para división enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Los grupos nucleofílieos en anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) Grupos amina N-terminal , (ii) grupos amina de cadena lateral, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar donde se glicosila el anticuerpo. Grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina. tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida son nucleofxlicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ésteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos, y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo, y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros de intercadena reducibles, es decir puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente de cisteína, de esta manera formará, teóricamente, dos nucleofilos de tiol. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en la conversión de una amina en un tiol . Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) al introducir uno, dos, tres, cuatro, o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácido de cisteína no nativa) .
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofílicas , que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de per odato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o porciones de fármaco. Los grupos base Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con ya sea oxidasa de galactosa o meta-periodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteina que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas conteniendo residuos de treonina o serina N-terminal pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, resultando en la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; EUA 5362852). Tal aldehido puede reaccionarse con una porción de fármaco o nucleófilo enlazador.
Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede hacerse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes una a otra o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal estreptavidina) para uso en pre-direccionamiento del tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por retiro del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) .
Las técnicas específicas para producir conjugados de anticuerpo-fármaco al enlazar toxinas a anticuerpos purificados se conocen bien y emplean de manera rutinaria en la materia. Por ejemplo, la conjugación de un anticuerpo monoclonal purificado con la toxina DM1 puede realizarse como sigue. El anticuerpo purificado se deriva con N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato para introducir grupos ditiopiridilo. El anticuerpo (376.0 mg, 8 mg/mL) en 44.7 mi de 50 mM tampón de fosfato de potasio (pH 6.5) conteniendo NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trata con SPP (5.3 equivalentes molares en 2.3 mi etanol) . Después de la incubación por 90 minutos bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra por gel a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 35 mM citrato de sodio, 154 mM NaCl y 2 mM EDTA. Las fracciones conteniendo anticuerpo se agrupan y ensayan entonces. Anticuerpo-SPP-Py (337.0 mg con grupos 2-tiopiridina liberables) se diluye con 35 mM tampón de citrato de sodio anterior, pH 6.5, a una concentración final de 2.5 mg/ml. DM1 (1.7 equivalentes, 16.1 moles) en 3.0 mM dimetilacetamida (DMA, 3% v/v en la mezcla de reacción final) se agrega entonces a la solución de anticuerpo. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente bajo argón por 20 horas. La reacción se carga en una columna de filtración por gel Sephacryl S300 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) equilibrada con 35 mM citrato de sodio, 154 mM NaCl, pH 6.5. La velocidad de flujo es 5.0 ml/min y se recolectan 65 fracciones (20.0 mi cada una). Las fracciones se agrupan y ensayan, en donde el número de moléculas de fármaco DM1 enlazadas por molécula de anticuerpo (?') se determina al medir la absorbencia a 252 nm y 280 nm.
Para propósitos ilustrativos, la conjugación de un anticuerpo monoclonal purificado con la toxina DM1, también puede realizarse como sigue. El anticuerpo purificado se deriva con (Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introducir el enlazador SMCC. El anticuerpo se trata a 20 mg/ml en 50mM fosfato de potasio/ 50 mM cloruro de sodio/ 2 mM EDTA, pH 6.5 con 7.5 equivalentes molares de SMCC (20 mM en DMSO, 6.7 mg/ml) . Después de agitar por 2 horas bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 50mM fosfato de potasio/50 mM cloruro de sodio/2 mM EDTA, pH 6.5. Las fracciones conteniendo anticuerpo se agrupan y ensayan. Anticuerpo-SMCC se diluye entonces con 50mM fosfato de potasio/50 mM cloruro de sodio/2 mM EDTA, pH 6.5, a una concentración final de 10 mg/ml, y reacciona con 10 mM solución de DM1 (1.7 equivalentes asumiendo 5 SMCC/anticuerpo, 7.37 mg/ml) en dimetilacetamida . La reacción se agita a temperatura ambiente bajo argón 16.5 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtra entonces a través de una columna de filtración de gel Sephadex G25 (1.5 x 4.9 cm) con 1 x PBS a pH 6.5. La proporción de DMl/anticuerpo (p) se mide entonces por la absorbencia a 252 nm y a 280 nm.
Además, una cisteína libre en un anticuerpo de elección puede modificarse por el reactivo bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), dejando un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto puede realizarse al disolver BM(PEO)4 en una mezcla de 50% etanol/agua a una concentración de 10 mM y agregar un exceso molar de diez veces a una solución conteniendo el anticuerpo en salina en tampón de fosfato a tina concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolar) y permitirle reaccionar por 1 hora. El exceso de BM(PEO)4 se remueve por filtración de gel en 30 mM citrato, pH 6 con 150 mM tampón NaCl . Un exceso molar 10 veces aproximado de DM1 se disuelve en acetamida de dimetilo (DMA) y se agrega al compuesto intermediario de anticuerpo-BMPEO. Formamida de dimetilo (DMF) también puede emplearse para disolver el reactivo de porción de fármaco. La mezcla de reacción se deja reaccionar durante la noche antes de la filtración de gel o diálisis en PBS para remover el fármaco sin reaccionar. La filtración de gel en columnas S200 en PBS se utiliza para remover agregados de alto peso molecular y proporcionar conjugado e anticuerpo-BMPEO-DM1 purificado.
Los fármacos citotóxicos se han conjugado típicamente con anticuerpos a través de los residuos de lisina con frecuencia numerosos del anticuerpo. También se ha realizado la conjugación a través de grupos tiol presentes, o diseñados en, el anticuerpo de interés. Por ejemplo, residuos de cisteína se han introducido en proteínas por técnicas de ingeniería genética para formar sitios de unión covalentes para ligandos (Better et al. (1994) J. Biol . Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc . Nati. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98 (15) : 8480-8484; Patente de E.U.A. No. 6,248,564). Una vez que existe un residuo de cisteina libre en el anticuerpo de interés, las toxinas pueden enlazarse a ese sitio. Como un ejemplo, los reactivos enlazadores de fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE) , es decir MC-MMAE, maleimidocaproil-monometil auristatina F (MMAF) , es decir MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE o MC-val-cit-PAB-MMAF, disuelta en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se agrega a anticuerpo derivado de cisteina enfriada en salina en tampón de fosfato (PBS) . Después de aproximadamente una hora, se agrega un exceso de maleimida para apagar la reacción y cubrir cualquier grupo tiol de anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y el anticuerpo conjugado con toxina se purifica y desala por elución a través de la resina G25 en PBS, filtra a través de filtros de 0.2m bajo condiciones estériles, y congela para almacenamiento .
Adicionalmente, anticuerpos anti-TAT194 de la presente invención pueden conjugarse con auristatina y toxinas de dolostatina (tales como MMAE y MMAF) utilizando la siguiente técnica. Anticuerpo, disuelto en 500mM borato de sodio y 500 mM cloruro de sodio a pH 8.0 se trata con un exceso de lOOmM ditiotreitol (DTT) . Después de la incubación a 37 °C or aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambia por elución «obre resina Sephadex G25 y eluye con PBS con lmM DTPA. El valor de tiol/Ab se verifica al determinar la concentración de anticuerpo reducida de la absorbencia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbencia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfria en hielo.
El reactivo enlazador de fármaco, (1) maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE) , es decir MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE, o (4) MC-val-cit-PAB-MMAF disuelta en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se agrega al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se agrega un exceso de maleimida para apagar la reacción y cubrir cualquier grupo tiol de anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y el anticuerpo conjugado se purifica y desala por elución a través de resina G25 en PBS, filtra a través de filtros de 0.2 m bajo condiciones estériles, y congela para almacenamiento .
Tanto los anticuerpos anti-TAT194 conjugados con toxina DM1 como MMAE descritos en la presente se prepararon como se describe y se probaron utilizando análisis FACS estándar para determinar si la conjugación a cualquier toxina afectó la capacidad del anticuerpo para unirse a polipéptido TAT194 en la superficie celular que expresan TAT194. Los resultados de estos análisis demostraron que no se observó pérdida en la unión a polipéptido TAT194 al conjugar los anticuerpos con la toxina.
EJEMPLO 8: Humanización de anticuerpos anti-TAT194 El clon 4205 de anticuerpo monoclonal de murino anti-RET se humanizó como se describe abajo. Los números de residuo son de acuerdo a Kabat et al., Sequences of proteínas of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD (1991) .
Injertos de región hipervariable directos sobre la estructura consenso de humano de aceptación Las variantes construidas durante la humanización del clon 4205 se valoraron en la forma de una IgG. Los dominios VL y VH de clon 4205 de murino se alinearon con las secuencias consenso de kappa IV VL (VLKiV) de humano y subgrupo I VH de humano (VHi) . Las regiones hipervariables de los anticuerpos de clon 4205 de murino se diseñan en estructuras de aceptación de humano. Aquellos residuos que se encontró son parte de los residuos de estructura actuando como zona "Vernier" , pueden ajustar estructura CDR y sintonizar de manera fina el ajuste de antígeno. Ver, por ejemplo, Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992). Estas definiciones CDR incluyen las posiciones definidas por su hipervarlabilidad de secuencia ( u, T. T. & Kabat, E. A. (1970) ) , su ubicación estructural (Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)) y su inclusión en los contactos de antígeno-anticuerpo (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) ) .
EJEMPLO 9: Ensayo de Muerte de Célula Tumoral In Vitro Las células mamíferas que expresan el polipéptido TAT194 de interés pueden obtenerse utilizando vector de expresión estándar y técnicas de clonación. Alternativamente, muchas líneas celulares de tumor que expresan polipéptidos TAT194 de interés están públicamente disponibles, por ejemplo, a través de ATCC y pueden identificarse de manera rutinaria utilizando análisis FACS o ELISA estándar. Los anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT194 (y derivados conjugados con toxina de los mismos) pueden emplearse en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para mater las células que expresan polipéptido TAT194 in vitro.
Por ejemplo, las células que expresan el polipéptido TAT194 de interés se obtienen como se describe arriba y se colocan en platos de 96 cavidades. En un análisis, el conjugado de anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) se incluye por toda la incubación de célula por un periodo de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células se incuban por 1 hora con el conjugado de anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y después se enjuagan e incuban en la ausencia de conjugado de anticuerpo/toxina por un periodo de 4 días. En todavía otro análisis independiente, las células genéticamente diseñadas para expresar polipéptido TAT194 en su superficie celular (y células de control que no expresan polipéptido TAT194) pueden tratarse con anticuerpo anti-TAT194 conjugado con toxina, y se hacen comparaciones. La viabilidad celular se mide entonces utilizando el Ensayo de Viabilidad de Célula Luminescente CellTiter-Glo de Promega (Cat# G7571) . Las células sin tratar sirven como un control negativo.
En un primer experimento y con respecto a la presente invención, varias concentraciones de conjugados de toxina ADC MC-vc-PAB-MMAE de ciertos anticuerpos anti-TAT194 (R4204, R4205, R4206, y R4209) se probaron para la capacidad de unirse a y matar (i) 293 células genéticamente diseñadas para expresar polipéptido TAT194 en la superficie celular (293/células RET) , y (ii) 293 células que no expresan polipéptido TAT194 en la superficie celular (293 células) . Los resultados de estos análisis se muestran en las Figuras 12-15 y demuestran que cada uno de los anticuerpos anti-TAT194 conjugados con toxina MAE causaron niveles significativos de muerte celular específica de TAT194 objetivo en las 293/células RET (es decir, células que expresan polipéptido TAT194 en la superficie celular) , mientras no se observa muerte celular específica de TAT194 objetivo significativa en las 293 células. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-TAT194 son capaces de unirse al polipéptido TAT194 en la superficie celular que expresan ese polipéptido y causan la muerte de esas células.
En un segundo experimento independiente, varias concentraciones de conjugados de toxina ADC CC-DM1 de ciertos anticuerpos anti-TAT194 (R4204, R4205, R4206, y R4209) se probaron para la capacidad de unirse a y matar (i) 293/células RET, y (ii) 293 células. Los resultados de estos análisis se muestran en las Figuras 16-19 y demuestran que cada uno de los anticuerpos anti-TAT194 conjugados con toxina DM1 causaron niveles significativos de muerte celular específica de TAT194 objetivo en las 293/células RET (es decir, células que expresan polipéptido TAT194 en la superficie celular) , mientras no se observa muerte celular específica de TAT194 objetivo significativo en las 293 células . Estos datos de nuevo demuestran que los anticuerpos anti-TAT194 son capaces de unirse al polipéptido TAT194 en la superficie celular que expresan ese polipéptido y causan la muerte de aquellas células .
Estos datos demuestran que los varios anticuerpos anti-TAT194 empleados en estos ensayos son capaces de unirse al polipéptido TAT194 en la superficie celular e inducir la muerte de esas células a las cuales se une el anticuerpo. EJEMPLO 10: Uso de TAT como una sonda de hibridación siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAT como una sonda de hibridación para, es decir, diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero.
ADN que comprende la secuencia de codificación de TAT maduro o de longitud completa como se describe en la presente también puede emplearse como una sonda para seleccionar los ADNs homólogos (tales como aquellas que codifican las variantes que ocurren de manera natural de TAT) en bibliotecas de ADNc de tejido de humano o bibliotecas genómicas de tejido de humano.
La hibridación y enjuague de filtros que contienen cualquier ADN de la biblioteca se realiza bajo las siguientes condiciones de alta severidad. La hibridación de sonda derivada TAT radiomarcada a los filtros, se realiza en una solución de 50% formamida, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% pirofosfato de sodio, 50 mM fosfato de sodio, pH 6.8, 2x solución de Denhardt, y 10% sulfato de dextran a 42°C por 20 horas. El enjuague de los filtros se realiza en una solución acuosa de O.lx SSC y 0.1% SDS a 42°C.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica TAT de secuencia nativa de longitud completa, pueden entonces identificarse utilizando técnicas estándar conocidas en la materia.
EJEMPLO 11: Expresión de TAT en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TAT por expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizando cebadores PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia de tetraciclina y ampicilina. El vector se digiere con enzima de restricción y desfosforila . Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector incluirá preferentemente secuencias que codifican un gen de resistencia antibiótica, un promotor trp, una guía polyhis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polyhis, y sitio de división de enteroquinasa) , la región de codificación TAT, terminador transcripcional lambda, y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza entonces para transformar una cepa E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformadores se identifican por su capacidad para desarrollarse en placas LB y se seleccionan entonces colonias resistentes a antibiótico. ADN de plásmido puede aislarse y confirmarse por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados pueden desarrollarse durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos . El cultivo durante la noche puede utilizarse subsiguientemente para inocular un cultivo a gran escala. Las células se desarrollan entonces a una densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células por varias horas más, las células se recolectan entonces por centrifugación. La pastilla celular obtenida por la centrifugación puede solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en la materia, y la proteína TAT solubilizada puede entonces purificarse utilizando una columna quelante de metal bajo condiciones que permiten la unión hermética de la proteína.
El TAT puede expresarse en E. coli en una forma etiquetada poly-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizando cebadores PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan inicio de traducción eficiente y confiable, rápida purificación en una columna de quelación de metal, retiro proteolítico con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poly-His, amplificadas por PCR se ligan entonces en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli con base en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformadores se desarrollan primero en LB que contiene 50 mg/ml carbenicilina a 30°C con agitación hasta que se alcanza O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyen entonces 50-100 veces en medio CRAP (preparado al mezclar 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g citrato de sodio*2H20, 1.07 g KCl, 5.36 g extracto de levadura Difco, 5.36 g Sheffield hycase SF en 500 mL agua, así como 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (p/v) glucosa y 7 mM MgS04) y se desarrollaron por aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Las muestras se remueven para verificar la expresión por análisis SDS-PAGE, y el cultivo voluminoso se centrifuga para formar las células en pastillas. Las pastillas de célula se congelan hasta purificarse y doblarse de nuevo.
La pasta de E. coli de fermentaciones de 0.5 a 1 L (pastillas de 6-10 g) se vuelve a suspender en 10 volúmenes (p/v) en 7 M guanidina, 20 mM Tris, tampón pH 8. Sulfito de sodio sólido y tetraionato de sodio se agregan para hacer concentraciones finales de 0.1M y 0.02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4°C. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cistelna bloqueados por sul itolizacón. La solución se centrifugó a 40,000 rpm en un Beckman Ultracentifuge por 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato de metal (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH 7.4) y se filtró a través de filtros de 0.22 micrones para aclarar. El extracto aclarado se carga sobre una columna de quelato de metal Ni-NTA Qiagen de 5 mi equilibrada en el tampón de columna de quelato de metal. La columna se enjuaga con tampón adicional conteniendo 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol) , pH 7.4. La proteína se eluye con tampón conteniendo 250 mM imidazol . Las f acciones conteniendo la proteína deseada se agrupan y almacenan a 4°C. La concentración de proteína se estima por su absorbencia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de aminoácidos .
Las proteínas se vuelven a doblar al diluir la muestra lentamente en tampón vuelto a doblar preparado recientemente que consiste de: 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cisterna, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Se eligen los volúmenes para volver a doblar, de manera que la concentración de proteína final es entre 50 a 100 microgramos/ml . La solución para volver a doblar se agita gentilmente a 4°C por 12-36 horas. La reacción de doblar de nuevo se apaga por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 micrones y se agrega acetonitrilo a 2-10% de concentración final. La proteína doblada de nuevo se cromatografía en una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un tampón móvil de 0.1% TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Las alícuotas de fracciones con absorbencia A280 se analizan en geles de poliacrilamida SDS y se agrupan las fracciones que contienen la proteína doblada de nuevo homogénea. Generalmente, las especies apropiadamente dobladas de nuevo de la mayoría de las proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo ya que aquellas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente a concentraciones más altas de acetonitrilo. Además de resolver las formas mal dobladas de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también remueve la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido TAT doblado deseado se agrupan y se remueve el acetonitrilo utilizando una corriente gentil de nitrógeno dirigida en la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6.8 con 0.14 M cloruro de sodio y 4% manitol por diálisis o por filtración de gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y se filtran estériles.
Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado exitosamente y purificado utilizando esta(s) técnicas (s).
EJEMPLO 12 : Expresión de TAT en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de TAT por expresión recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (ver EP 307,247, publicada el 15 de Marzo de 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de TAT se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de TAT utilizando los métodos de ligación tal como se describe en Sambrook et al., supra. El vector resultante se llama pRK5 - AT.
En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser 293 células. Se desarrollan 293 células de humano (ATCC CCL 1573) para confluenciar en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM complementado con suero de bovino fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 ADN de pRK5-TAT se mezcla con aproximadamente 1 µg ADN que codifica el gen ARN VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disuelve en 500 µ? de 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2. A esta mezcla se agrega, gota a gota, 500 µ? de 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaP04 , y se deja formar un precipitado por 10 minutos a 25°C. El precipitado se suspende y se agrega a las 293 células y se deja reposar por aproximadamente cuatro horas a 37°C. El medio de cultivo se aspira y 2 mi de 20% glicerol en PBS se agrega por 30 segundos. Las 293 células se enjuagan entonces con medio libre de suero, se agrega medio fresco y las células se incuban por aproximadamente 5 días .
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se remueve y reemplaza con medio de cultivo (sólo) o medio de cultivo conteniendo 200 pCi/ml 35S-cisteína y 200 uCi/ml 35S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado se recolecta, concentra en un filtro giratorio, y carga sobre un 15% gel SDS. El gel procesado puede secarse y exponerse a película por un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido TAT. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados .
En una técnica alternativa, TAT puede introducirse en 293 células de manera transitoria utilizando el método de sulfato de dextran descrito por Somparyrac et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se desarrollaron 293 células a densidad máxima en un matraz giratorio y se agregaron 700 pg ADN pRK5-TAT. Las células se concentran primero del matraz giratorio mediante centrifugación y se enjuagan con PBS. El precipitado de ADN-dextran se incuba en la pastilla de célula por cuatro horas. Las células se prueban con 20% glicerol por 90 segundos, enjuagan con medio de cultivo de tejido, y vuelven a introducir en el matraz giratorio conteniendo medio de cultivo de tejido, 5 pg/ml insulina de bovino y 0.1 pg/ml transferrina de bovino. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y filtra para remover células y residuos. La muestra conteniendo TAT expresado puede concentrarse entonces y purificarse por cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.
En otra modalidad, TAT puede expresarse en células CHO. pRK5-TAT puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 o DEAE-dextran. Como se describe arriba, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio reemplazarse con medio de cultivo (sólo) o medio conteniendo una radioetiqueta tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia de polipéptido TAT, el medio de cultivo puede reemplazase con medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban por aproximadamente 6 días, y después se recolecta el medio acondicionado. El medio conteniendo el TAT expresado puede concentrarse y purificarse entonces por cualquier método seleccionado.
El TAT etiquetado con epítopo también puede expresarse en células CHO huésped. TAT puede subclonarse fuera del vector pRK5. La inserción de subclon pude experimentar PCR para fusionarse en estructura con una etiqueta de epítopo seleccionado tal como una etiqueta poly-his en un vector de expresión de Baculovirus. La inserción TAT etiquetada con poly-his puede subclonarse entonces en un vector activado SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (como se describe arriba) con el vector activado SV40. El marcado puede realizarse, como se describe arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene TAT etiquetado poly-His expresado puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método seleccionado, tal como por cromatografía de afinidad de Ni2+-quelato.
El TAT también puede expresarse en células CHO y/o COS por un procedimiento de expresión transitorio o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina) , en la cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante IgGl que contiene los dominios de articulación, CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada poly-His.
Después de la amplificación PCR, ADNs respectivos se subclonan en un vector CHO de expresión utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocole of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997) . Los vectores de expresión CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir la mezcla conveniente de ADNcs. El vector utilizado en la expresión en células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucí. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996) , y los usos de promotor anterior/aumentador SV40 para activar la expresión del ADNc de interés y reductasa de dihidrofolato (DHFR) . La expresión de DHFR permite la selección de mantenimiento estable del plásmido después de la transíección.
Doce microgramos del ADN de plásmido deseado se introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comercialmente disponibles SUPERFECT® (Quiagen) , DOSPER® o FUGENE® (Boehringer Mannheim) . Las células se desarollaron como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 107 células se congelan en una ampolla para producción y crecimiento adicional como se describe abajo.
Las ampollas conteniendo el AND de plásmido se descongela por colocación en baño de agua y se mezclan al colocar en vórtice. Los contenidos se entuban en un tubo centrífugo conteniendo 10 mLs de medio y se centrifugan a 1000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se vuelven a suspender en 10 mL de medio selectivo (0.2 µ?? PS20 filtrado con 5% 0.2 µp? suero de bovino fetal diafiltrado) . Las células se colocan en alícuota entonces en un centrifugador de 100 mL conteniendo 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren en un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo e incuban a 37°C. Después de otros 2-3 días, centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL se llenan con 3 x 105 células/mL. El medio celular se intercambia con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque cualquier medio CHO adecuado puede emplearse, puede utilizarse en realidad el miedo de producción descrito en Patente de E.U.A. No. 5,122,469, emitida el 16 de Junio de 1992. Un centrif gador de producción de 3L se llena con 1.2 x 106 células/mL. El día 0, se determina el pH del número celular. El día 1, se toman muestras del centrifugador y se comienza a rociar con aire filtrado. El día 2, se toman muestras del centrifugador, la temperatura cambió a 33 °C, y se toman 30 mL de 500 g/L glucosa y 0.6 mL de 10% antiespuma (por ejemplo, 35% emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) . Por toda la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo a alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo de 70%, el cultivo celular se recolecta por centrifugación y filtración a través de un filtro de 0.22 m. El filtrado se almacenó ya sea a 4°C o se cargó inmediatamente sobre columnas para purificación.
Para las construcciones etiquetadas poly-His, las proteínas se purifican utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de purificación, se agrega imidazol a los medios acondicionados a una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre una columna Ni-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7.4, tampón que contiene 0.3 M NaCl y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo 4-5 ml/min. a 4°C. Después de la carga, la columna se enjuaga con tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrio conteniendo 0.25 M imidazol. La proteína altamente purificada se desala subsiguientemente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl y 4% manitol, pH 6.8, con una columna de 25 mi G25 Superfine (Pharmacia) y almacena a -80°C.
Las construcciones de inmunoadhesina (conteniendo Fe) se purifican del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una columna de Proteína A de 5 mi (Pharmacia) que se ha equilibrado en 20 mM tampón de fosfato Na, pH 6.8. Después de carga, la columna se enjuaga de manera extensiva con tampón de equilibrio antes de elución con 100 mM ácido cítrico, pH 3.5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 mi en tubos que contienen 275 µ?? de 1 M tampón Tris, pH 9. La proteína altamente purificada se desala subsiguientemente en tampón de almacenamiento como se describe arriba para las proteínas etiquetadas poly-His. La homogeneidad se valora por geles de poliacrilamida SDS y por secuenciación de aminoácidos N-terminal por degradación Edman.
Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente esta(s) técnica (s) .
EJEMPLO 13 : Expresión de TAT en Levadura El siguiente método describe la expresión recombinante de TAT en levadura.
Primero, los vectores de expresión de levadura se construyen para producción intracelular o secreción de TAT del promotor ADH2/GAPDH. ADN que codifica TAT y el promotor se inserta en sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAT. Para secreción, ADN que codifica TAT puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal TAT nativo u otro péptido de señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alta de levadura o secuencia guía/señal secretora de invertasa, y secuencias enlazadoras (si son necesarias) para la expresión de TAT.
Las células de levadura, tal como AB110 de levadura, pueden entonces transformarse con los plásmidos de expresión descritos arriba y cultivarse en medios de fermentación seleccionados . Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse por precipitación con 10% ácido tricloroacético y separación por SDS-PAGE, seguido por coloración de los geles con color azul de Coomassie.
TAT recombinante puede aislarse subsiguientemente y purificarse al remover las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentrar el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene TAT puede purificarse además utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.
Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado exitosamente y purificado utilizando esta(s) técnica (s) .
EJEMPLO 14 : Expresión de TAT en Células de Insecto Infectadas con Baculovirus El siguiente método describe expresión recombinante de TAT en células de insecto infectadas con Baculovirus.
La codificación de secuencia para TAT se fusiona corriente arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus . Tales etiquetas de epítopo incluyen etiquetas poly-his y etiquetas de inmunoglobulina (como región Fes de IgG) . Puede emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tal como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la porción deseada de la secuencia de codificación de TAT tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína de transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5 ' y 31. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción de flanqueo (seleccionados) . El producto se digiere entonces con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera al co-transfectar el plásmido anterior y ADN de virus BACULOGOLD™ virus (Pharmingen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28°C, los virus liberados se recolectan y utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y expresión de proteína se realizan como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) .
El TAT etiquetado con poly-his expresado puede entonces purificarse, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de Ni2+-quelato como sigue. Los extractos se separan de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se enjuagan, vuelven a suspender en tampón de sonicación (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 m MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% glicerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) , y sonican dos veces por 20 segundos en hielo. Los sonicatos se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7.8) y filtra a través de un filtro de 0.45 t?. Una columna de NÍ2+-NTA agarosa (comercialmente disponible de Qiagen) se prepara con un volumen de lecho de 5 mL, enjuaga con 25 mL de agua y equilibra con 25 mL de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga sobre la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se enjuaga con el punto de referencia A280 con tampón de carga, en tal punto se inicia la recolección de la fracción. Después, la columna se enjuaga con un tampón de enjuague secundario (50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6.0), que eluye proteína no específicamente unida. Después de alcanzar la base A280 de nuevo, la columna se desarrolla con 0 a 500 mM de un gradiente de Imidazol en el tampón de enjuague secundario.
Las fracciones de un mL se recolectan y analizan por SDS-PAGE y entintan con color plata o Western blot con conjugado Ni2+-NTA con fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones conteniendo TAT etiquetado con HislO eluidas se agrupan y dializan contra tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del TAT etiquetado con IgG (o etiquetado Fe) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía de columna de proteína G o Proteína A.
Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente utilizando esta(s) técnica (s) .
EJEMPLO 15: Purificación de Polipéptidos TAT Utilizando Anticuerpos Específicos Los polipéptidos TAT nativos o recombinantes pueden purificarse por una variedad de técnicas estándar en la materia de purificación de proteína. Por ejemplo, polipéptido pro-TAT, polipéptido TAT maduro, o polipéptido pre-TAT se purifica por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido TAT de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye al acoplar covalentemente el anticuerpo anti-polipéptido TAT a una resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan de sueros inmunes ya sea por precipitación con sulfato de amonio o por purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Del mismo modo, los anticuerpos monoclonales se preparan de fluido de ascitis de ratón por precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se enjuaga de acuerdo a las instrucciones del fabricante .
Tal columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido TAT al preparar una fracción de las células que contiene polipéptido TAT en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida a través de centrifugación diferencial por la adición de detergente o por otros métodos bien conocidos en la materia. Alternativamente, polipéptido TAT soluble conteniendo una secuencia de señal puede secretarse en cantidad útil en el medio en el cual se desarrollan las células.
Una preparación que contiene polipéptido TAT soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se enjuaga bajo condiciones que permiten la absorbencia preferencial de polipéptido TAT (por ejemplo, tampones de alta resistencia iónica en la presencia de detergente) . Después, la columna se eluye bajo condiciones que interrumpen la unión de anticuerpo/polipéptido TAT (por ejemplo, un tampón de pH bajo tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un agente caotrópico tal como urea o ion de tiocianato) , y se recolecta el polipéptido TAT. EJEMPLO 16: Ensayo de Muerte de Célula Tumoral In Vivo en Modelo de Tumor de Xenoinjerto de Humano Intraperitoneal La potencia in vivo de conjugados de anticuerpo-fármaco puede medirse por tratamiento de ratones desnudos NCR que tienen tumores de humano implantados (así llamados xenoinjertos) . Estos estudios utilizaron líneas celulares de melanoma de humano y tumores de humano propagados en ratones a través del implante de las muestras de tumor. En el estudio cada uno tiene un tumor de mama (aproximadamente 100-200mm3) , y se tratan IV a través de la vena de la cola, con una dosis única, como se indica. Las mediciones de tumores llevadas a cabo por todo el periodo de prueba, seguidas por una colección de muestras tumorales, se fijan entonces con formalina o congelan rápidamente para análisis "TaqMan®" así como examinación histológica.
Las líneas celulares de mama de humano y tumores establecidos por pasaje serial en ratones desnudos se implantan ya sea intraperitonealmente o subcutáneamente o como se establezca de otra manera, y el crecimiento se midió durante el estudio. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño adecuado, los grupos de tratamiento de ratones se dosificaron con conjugados de anticuerpo-fármaco. El retardo del crecimiento del tumor de xenoinjerto es una característica de eficacia relativa al control de vehículo o anticuerpo de control. En general, estos resultados demuestran la especificidad y eficacia de los conjugados anti-RET-fármaco en crecimiento in vivo de los modelos de tumor. El volumen de tumor se mide en cada ratón en los días indicados después de la inyección para determinar la eficacia de cada tratamiento para reducir el volumen del tumor. Adicionalmente, se determina el % de supervivencia animal diariamente a través de -30 días post-tratamiento.
Los resultados de estos análisis in vivo demuestran que los ratones tratados con vehículo sólo o con el anticuerpo conjugado con toxina no específico de RET muestran poca reducción observable en progresión de tumor subsiguiente al tratamiento. Tales resultados demuestran que los anticuerpos no se unen a polipéptido RET, incluso si se conjugan con toxina, proporcionan efecto terapéutico no específico. En contraste, la mayoría de los animales en los grupos prueba evidenciaron una reducción reproducible aparente y significativa en la progresión del tumor posttratamiento, cuando se tratan con los anticuerpos anti-RET conjugados con vc-MMAE (incluyendo 4204, 4205, y 4209) que demuestran que los conjugados de anticuerpo anti-RET-fármaco proporcionan un efecto terapéutico in vivo especifico con animales que tienen tumores que expresan el polipéptido RET.
Más específicamente, la Figura 20 muestra los datos obtenidos de tal un experimento en donde se analizó la eficacia terapéutica in vivo de un conjugado vc-MMAE de los anticuerpos anti-RET de murino. Los xenoinjertos derivados de la línea celular de mama MCF7neoHER2 (células que expresan polipéptido RET en la superficie celular) se propagaron en ratones desnudos en la almohadilla de grasa mamaria como se describe arriba, y los ratones se tratan entonces subsiguientemente como se describe arriba con vehículo sólo, un anticuerpo de control conjugado con MMAE que no se une a polipéptido RET, o varias cantidades de anti-RET-ve-MMAE . Los datos de estos análisis demuestran que el anticuerpo conjugado con toxina anti-RE -ve-MMAE es capaz de matar las células que expresan RET de la superficie de esas células.
Además, la Figura 21 muestra un experimento de murino de xenoinjerto in vivo, esta vez utilizando un modelo de xenoinjerto KPLl subcutáneamente implantado y solamente la variante de anti-RET 4205 en dos dosis, 1 mg/kg y 3 mg/kg. Estos datos demostraron que los anticuerpos anti-RE conjugados con toxina también fueron capaces de inhibir el crecimiento de tumores de xenoinjerto en una manera dependiente de dosis y específica de objetivo.
Además, la eficacia de los conjugados de anticuerpo anti-RET- fármaco se investigó utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de mama BT474M1, que expresa polipéptido RET en la superficie celular. Cinco millones de células BT474M1 en HBSS-matrigel se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria torácica de ratones desnudos beige, que se complementaron con pastilla de estrógeno (0.36mg/pastilla, liberación en 60 días) uno a tres días antes del implante de tumor. Cuando los tumores alcanzaron 100-300 mm3 de tamaño, a los ratones se les da una inyección intravenosa única de 5 mg/kg de conjugados anti-RET (clones 4205, 4206 o 4209) vc-MMAE de murino, conjugados de control anti-gpl20 vc-MMAE de murino (que no se unen al polipéptido RET) , Herceptin-DMl, o vehículo sólo. Como se muestra en la Figura 22, la inhibición de crecimiento sustancial del tumor se alcanzó con los tres conjugados anti-RET vc-MMAE y Trastuzumab-DM1.
La eficacia de los conjugados de anticuerpo anti-RET -fármaco se investigó utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de mama MDA-MB-175, que expresa el polipéptido RET en la superficie celular. Los fragmentos de tumor MDA-MB-175 (aproximadamente 2mm x 2mm en longitud) se implantaron en la almohadilla de grasa mamaria torácica de ratones desnudos beige, que se complementaron con pastilla de estrógeno (0.36 mg/pastilla, liberación en 60 días) uno a tres días antes del implante del tumor. Cuando los tumores alcanzaron 80-250 mm3 de tamaño, a los ratones se les dan inyecciones intravenosas por dos semanas de 5 mg/kg de conjugado anti-RET (4205) vc-MMAE de murino, conjugado de control anti-gpl20 vc-MMAE de murino (que no se une al polipéptido RET) , conjugado anti-Her2 vc-MMAE humanizado, o vehículo sólo. Como se muestra en la Figura 23, la inhibición de crecimiento sustancial del tumor se alcanzó con conjugados anti-RET vc-MMAE y anti-Her2 vc-MMAE.
Tales datos de modelo de murino claramente demuestran que los conjugados de anticuerpo anti-RET-fármaco proporcionan un efecto terapéutico in vivo específico, significativo y reproducible para el tratamiento de tumores que expresan el polipéptido RET.
La especificación escrita anterior se considera ser suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. La presente invención no debe limitarse en alcance por la construcción depositada, ya que la modalidad depositada se propone como una ilustración única de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que es funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invención. El depósito de material en la presente no constituye una admisión que la descripción escrita en la presente contenida es adecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe construirse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Ciertamente, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes a aquellos expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (65)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que comprende al menos una secuencia CDR seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia CDR-L1 de cualquiera de SEC ID NOS : 4-10; (b) una secuencia CDR-L2 de cualquiera de SEC ID NOS: 11-16; (c) una secuencia CDR-L3 de cualquiera de SEC ID NOS: 17-24; (d) una secuencia CDR-H1 de cualquiera de SEC ID NOS: 25-32 O 67; (e) una secuencia CDR-H2 de cualquiera de SEC ID NOS: 33-40 O 68; y (f) una secuencia CDR-H3 de cualquiera de SEC ID NOS:41-48 O 69-73.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un fragmento de anticuerpo.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo quimérico o humanizado.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se conjuga con un agente inhibidor del crecimiento.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se conjuga con un agente citotóxico.
6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas .
7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde el agente citotóxico es una toxina.
8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maitansinoide, calicheamicina y auristatina.
9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde la toxina es una auristatina.
10. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se produce en bacterias .
11. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se produce en células CHO.
12. El anticuerpo de la reivindicación 1 que induce la muerte de una célula a la cual se une.
13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde dicha célula es una célula de cáncer de mama.
14. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde dicha célula es una célula de cáncer de pulmón.
15. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se etiqueta de manera detectable .
16. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia VH y una secuencia VL, en donde dicha secuencia VL es de cualquiera mostrada en SEC ID NOS: 49-57 o 74.
17. El anticuerpo aislado de la reivindicación 16, en donde la secuencia VH es de cualquiera mostrada en SEC ID NOS:58-66 o 75-79.
18. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 49 y la secuencia VH es SEC ID NO: 58.
19. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 50 y la secuencia VH es SEC ID NO: 59.
20. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO : 51 y la secuencia VH es SEC ID NO: 60.
21. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 52 y la secuencia VH es SEC ID NO: 61.
22. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 53 y la secuencia VH es SEC ID NO: 62.
23. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 54 y la secuencia VH es SEC ID NO: 63.
24. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 55 y la secuencia VH es SEC ID NO: 64.
25. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 56 y la secuencia VH es SEC ID NO: 65.
26. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 57 y la secuencia VH es SEC ID NO: 66.
27. Una célula que produce un anticuerpo de la reivindicación 1.
28. Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la reivindicación 1.
29. Un método para identificar un primer anticuerpo que se une a un epítopo antigénico TAT194 unido por un segundo anticuerpo, en donde dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, comprendiendo dicho método determinar la capacidad de dicho primer anticuerpo para bloquear la unión de dicho segundo anticuerpo a un polipéptido TAT194, en donde la capacidad de dicho primer anticuerpo para bloquear la unión de dicho segundo anticuerpo a dicho polipéptido TAT194 por al menos 40% y a concentraciones iguales de anticuerpo es indicativa de que dicho primer anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo unido por dicho segundo anticuerpo.
30. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un polipéptido TAT194, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido TAT194 causa una inhibición de crecimiento de dicha célula.
31. El método de la reivindicación 30, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o un dominio extracelular de la misma.
32. El método de la reivindicación 30, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o un dominio extracelular de la misma .
33. El método de la reivindicación 30, en donde dicha célula es una célula de cáncer de mama.
34. El método de la reivindicación 30, en donde dicha célula es una célula de cáncer de pulmón.
35. Un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan un polipéptido TAT194, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, tratando así de manera efectiva a dicho mamífero.
36. El método de la reivindicación 35, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o un dominio extracelular de la misma .
37. El método de la reivindicación 35, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o un dominio extracelular de la misma.
38. El método de la reivindicación 35, en donde dichas células son células de cáncer de mama.
39. El método de la reivindicación 35, en donde dichas células son células de cáncer de pulmón.
40. Un método para determinar la presencia de una proteína TAT194 en una muestra sospechosa de contener dicha proteína, comprendiendo dicho método exponer dicha muestra a un anticuerpo de la reivindicación 1 y determinar la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína en dicha muestra, en donde la unión del anticuerpo a dicha proteína es indicativa de la presencia de dicha proteína en dicha muestra.
41. El método de la reivindicación 40, en donde dicha muestra comprende una célula sospechosa de expresar dicha proteína.
42. El método de la reivindicación 41, en donde dicha célula es una célula de cáncer de mama.
43. El método de la reivindicación 41, en donde dicha célula es una célula de cáncer de pulmón.
44. El método de la reivindicación 40, en donde dicho anticuerpo se etiqueta de manera detectable.
45. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido TAT194 en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero y en una muestra de control de células normales conocidas del mismo origen de tejido, en donde un nivel mayor de expresión de dicho polipéptido TAT194 en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de prueba.
46. El método de la reivindicación 45, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicho polipéptido comprende emplear un oligonucleótido en una hibridación in situ o análisis RT-PCR.
47. El método de la reivindicación 45, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicha proteína comprende emplear un anticuerpo en un análisis inmunohistoquímico o Western blot .
48. El método de la reivindicación 45, en donde dicho tumor es un tumor de mama o pulmón.
49. El método de la reivindicación 45, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o un dominio extracelular de la misma.
50. El método de la reivindicación 45, en donde dicho polipéptido TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o un dominio extracelular de la misma.
51. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero con un anticuerpo de la reivindicación 1 y detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y una proteína TAT194 en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en dicho mamífero.
52. El método de la reivindicación 51, en donde dicha muestra de prueba de células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso.
53. El método de la reivindicación 52, en donde dicho tumor canceroso es un tumor de mama o pulmón.
54. El método de la reivindicación 51, en donde dicha proteína TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o un dominio extracelular de la misma.
55. El método de la reivindicación 51, en donde dicha proteína TAT194 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o un dominio extracelular de la misma.
56. Un método para suministrar un agente citotóxico o de diagnóstico a una célula que expresa un polipéptido TAT194, comprendiendo dicho método proporcionar un agente citotóxico o agente de diagnóstico conjugado con un anticuerpo que se une a dicho polipéptido TAT194 para formar un conjugado de anticuerpo-agente, y exponer dicha célula al conjugado de anticuerpo-agente.
57. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 75.
58. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 76.
59. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 77.
60. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 78.
61. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, en donde la secuencia VL es SEC ID NO: 74 y la secuencia VH es SEC ID NO: 79.
62. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende : (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO: 6; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO: 13; (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO: 19; (d) una secuencia CDR-Hl de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 69.
63. El anticuerpo aislado de la reivindicación que comprende: (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO: 6; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO: 13 (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO: 19, (d) una secuencia CDR-H1 de SEC ID NO: 67, (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68, (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 70.
64. El anticuerpo aislado de la reivindicación que comprende : (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO: 6; (b) una secuencia CDR- L2 de SEC ID NO: 13; (c) una secuencia CDR- L3 de SEC ID NO: 19; (d) una secuencia CDR-Hl de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68; Y (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 71.
65. El anticuerpo aislado de la reivindicación ;nde : (a) una secuencia CDR- Ll de SEC ID NO: 6.; (b) una secuencia CDR- L2 de SEC ID NO: 13; (c) una secuencia CDR- L3 de SEC ID NO: 19; (d) una secuencia CDR- Hl de SEC ID NO: 67; (e) una secuencia CDR- H2 de SEC ID NO: 68; Y (f) una secuencia CDR- H3 de SEC ID NO: 72. anticuerpo aislado de la reivindicación que comprende: (a) una secuencia CDR-Ll de SEC ID NO: 6; (b) una secuencia CDR-L2 de SEC ID NO: 13 (c) una secuencia CDR-L3 de SEC ID NO: 19 (d) una secuencia CDR-Hl de SEC ID NO: 67 (e) una secuencia CDR-H2 de SEC ID NO: 68 (f) una secuencia CDR-H3 de SEC ID NO: 73
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