CN112457406B - 一种抗mmae的单克隆抗体、其编码序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗MMAE的单克隆抗体、其编码序列及应用。所述抗MMAE的单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列。本申请的单克隆抗体显示出与TROP2‑ADC的良好的结合活性，可作为偶联MMAE的抗体药物的检测试剂或作为血浆中游离MMAE的清除药物。

Description

一种抗MMAE的单克隆抗体、其编码序列及应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地，本发明涉及一种抗MMAE的单克隆抗体、其编码序列及应用。
背景技术
在肿瘤的治疗中，具有抗癌活性的小分子化合物，由于其对正常组织的毒性而限制了其使用，而将其与单克隆抗体偶联可以很好地解决小分子化合物对于正常细胞产生毒性的问题。因此，抗体-化合物药物偶联物(Antibody Drug Conjugate，ADC)应运而生。
在抗体-化合物药物偶联物(ADC)中，现有技术中已有单甲基奥里斯他汀E(MMAE)偶联抗体药物的报道，其在治疗霍奇金淋巴瘤和系统性渐变性大细胞淋巴瘤中显示出良好的效果。由此，现有技术中需要相关的对偶联MMAE小分子抗体药物进行检测的试剂。
在ADC的临床应用中，小分子毒物比如MMAE能够从ADC分子上非特异性地脱落下来，引起毒副作用。用可以结合MMAE的药物可以加速游离MMAE的代谢，降低毒副作用。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种可用于检测偶联MMAE小分子抗体药物的单克隆抗体，其编码序列及应用。
一方面，本发明提供一种抗单甲基奥里斯他汀E(MMAE)的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列。
在具体实施方式中，所述单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO:8定义的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种编码前述单克隆抗体的核酸。优选地，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO:3定义的核苷酸序列，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO:4定义的核苷酸序列。
在具体实施方式中，编码所述单克隆抗体的重链的核酸具有SEQ ID NO:5定义的核苷酸序列；编码所述单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO:6定义的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种上文所述的单克隆抗体在制备偶联MMAE的抗体药物的检测试剂中的用途。
再一方面，本发明提供一种偶联MMAE的抗体药物的检测试剂，其至少包含上文所述的单克隆抗体。
再一方面，本发明提供一种清除血浆中游离MMAE的制剂，其至少包含上文所述的单克隆抗体。
在具体实施方式中，所述游离MMAE从抗体-化合物药物偶联物脱落所产生。
再一方面，本发明提供上述单克隆抗体在制备用于清除血浆中游离MMAE的制剂中的用途。
在具体实施方式中，所述游离MMAE从抗体-化合物药物偶联物脱落所产生。
有益效果
本发明制备的抗MMAE的单克隆抗体显示出与TROP2-ADC的良好的结合活性，因此可被开发为偶联MMAE的抗体药物的检测试剂。同时，该抗体可以用于结合血浆中游离的MMAE，以加速游离MMAE的代谢，降低ADC分子的毒副作用。
附图说明
图1为显示本申请制备的抗体的SDS-PAGE检测结果的图。
图2为本申请制备的抗体通过HPLC-SEC法检测的色谱图。
图3显示通过夹心ELISA法测定本申请制备的抗体与TROP2-ADC的结合活性的结果的图。
具体实施方式
以下通过具体实施例描述本发明以使本申请得到更好的理解，然而这些实施例并不意图限制本发明的范围。
实施例1：抗MMAE的单克隆抗体cDNA的制备
(1)将MMAE小分子抗原(获自南京联宁生物)与完全弗氏佐剂等体积混合，免疫4只4-5周龄BALB/C雌性小鼠(获自南方模式动物中心)，每次免疫，每只注射体积为0.5ml；
(2)第三周开始，将1mg MMAE小分子抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合，每间隔3周免疫一次，最后一次免疫于融合前的3-5天，共免疫5次，刺激B细胞表达抗原特异性的抗体；
(3)抗体效价检测，每只完成四次免疫的小鼠，都要进行眼眶采血，然后进行效价检测，检测时间一般为第4次免疫后的7-10天。
(4)骨髓瘤细胞准备，在融合前一周，从液氮里复苏冻存的小鼠骨髓瘤细胞(苏州大学赠予)。(预先经过HAT杀伤实验，1xHAT处理一周，若细胞能全杀死则可以用)融合前一晚，半量换液，使细胞处于对数生长期。
(5)铺滋养层细胞：取正常小鼠脾脏细胞，研磨制备单细胞悬液，铺板，24过夜培养。
(6)5次免疫结束后，摘取小鼠脾脏，并研磨制备单细胞悬液。
(7)细胞融合：将准备好的脾细胞悬液与骨髓瘤细胞按照5:1进行融合。
(8)筛选及亚克隆：利用ELISA的方法进行初步的筛选，将筛选得到的阳性抗体进行有限稀释，直至得到单个亚克隆细胞。
(9)RNA提取：将阳性的亚克隆进行RNA提取。
(10)cDNA制备：以RNA为模板进行反转录获得cDNA，并用PCR的方式扩增轻重链的基因。
实施例2：单克隆抗体基因的克隆
(1)轻重链基因的获取：利用鼠源特异性的引物，对实施例1中制备的cDNA中进行扩增，分别将扩增到的VH及VL的DNA序列克隆至pUC19载体中，然后进行转化涂板，挑取克隆进行测序分析。
(2)抗体的轻重链可变区基因的分析：根据测序结果对VH及VL的进行分析，最终获得两条轻链序列，一条重链序列(SEQ ID NO:5)，再结合相关生物信息学的分析，确定最终的轻链序列(SEQ ID NO:6)，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
(3)将轻、重链基因克隆至表达载体：将从(2)中分析所得的VH及VL序列，采取N段加信号肽，C端加恒定区的方式，将二者克隆至表达载体pCAT1.0和pCAT2.0中。
实施例3：抗MMAE抗体在真核表达系统中的表达、纯化
(1)将测序正确的轻、重链基因分别克隆至真核表达载体pCAT1.0和pCAT2.0中；
(2)将克隆后的载体进行进一步的测序鉴定，然后将正确的克隆提质粒；
(3)培养HEK293F悬浮细胞，将细胞培养在Freestyle 293培养基中，当密度达到1×106/ml,成活率＞90％时进行细胞转染；
(4)转染方法：PEI/质粒的质量比为3:1，按照1μg质粒/1ml HEK293F细胞的比例转染；
(5)转染后5-7天，收集细胞上清，用Protein G树脂进行亲和纯化获得高纯度的抗体蛋白，并用超滤柱将洗脱缓冲液置换成PBS。得到的抗体蛋白的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
测试实施例1：SDS-PAGE检测抗MMAE的抗体的纯度
(1)抗体浓度测定：根据抗体的氨基酸序列，利用相关的生物信息学软件进行序列分析，得到理论的消光系数，然后利用Nanodrop进行浓度测定，取1μl进行检测，根据检测的浓度及抗体的消光系数计算出实际的浓度；
(2)抗体小量分装保存：将纯化之后的抗MMAE的抗体按照50μg/管进行分装冻存，取少量进行相关的实验检测；
(3)SDS-PAGE初步鉴定MMAE抗体的纯度及分子量大小：取5μg蛋白加入适量的上样缓冲液，使总体积为20μl，根据电泳的要求同时制备还原性SDS-PAGE样品及非还原性SDS-PAGE样品；根据相应的方法制备10％的SDS-PAGE胶；配制上样用电泳缓冲液，然后进行上样，首先80V进行电泳30min，然后120V电泳直至条带分隔清晰；染色及脱色：将电泳后的PAGE胶取下，然后进行考马斯亮蓝染色，15min之后将染色液去掉，用清水冲洗干净，然后加入脱色液进行脱色，直至看到清晰的条带为止。
图1显示得到的抗体的SDS-PAGE检测结果。从图中可以看到制备得到了纯度高的抗体。
测试实施例2：HPLC-SEC检测抗MMAE的抗体的纯度
(1)抗体准备：将纯化之后的抗体稀释至1mg/ml，取30μl备用，12000g离心2min，尽量去除可能存在的沉淀，然后将离心之后的上清吸取出来加入到内插管中，排尽气泡，待上机。
(2)流动相准备：配制HPLC用50mM的磷酸盐缓冲液，调pH至7.0，并将缓冲液进行真空抽滤处理除菌，然后将其置于超声仪中进行超声除气，备用。
(3)仪器的准备：开机，然后打开高效液相色谱各个模块，进行开机预热处理，首先对仪器系统进行排气泡处理，然后接入空柱子用无菌水对整个仪器进行清洗，清洗完之后将安捷伦SEC柱子接入到仪器中，然后进行排气泡，再用无菌水对柱子进行清洗，清洗完之后用平衡缓冲液对柱子进行平衡，待用。
(4)上样：打开软件，进行方法学编辑，生成序列，然后进行上样。
(5)结果分析及处理：打开软件，导入结果，进行分析，生成分析报告。
图2显示本申请实施例3制备的抗体通过HPLC-SEC检测的色谱图。
测试实施例3：夹心ELISA方法检测抗MMAE的抗体的活性
(1)包被：将人TROP2-6×His抗原包被在酶联免疫吸附板中，浓度为2μg/ml，体积为50μl，4℃包被过夜。
(2)封闭：将洗涤之后的ELISA板，用1％Casein进行封闭，200μl/孔，室温封闭2小时。
(3)洗涤：将封闭好的ELISA板用1x PBS洗涤3次。
(4)结合：加入偶联了MMAE小分子的抗体药物—TROP2-ADC分子，2μg/ml，50μl/孔，室温结合1小时。
(5)洗涤：将结合完之后多余的ADC分子去除掉，将ELISA板用0.5％PBST洗涤3次。
(6)一抗孵育：加入实施例3制备的抗MMAE的抗体以及实验室制备的Anti-hTGFbeta mIgG1抗体(对照)，100nM开始，按照1:3的比例进行系列稀释，然后50μl/孔，室温结合1小时。
(7)洗涤：将结合完之后多余的抗MMAE的抗体去除掉，将ELISA板用0.5％PBST洗涤3次。
(8)二抗孵育：加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，按照1:2000的比例进行稀释，然后50μL/孔，室温结合1小时。
(9)洗涤：将结合完之后多余的二抗去除掉，将ELISA板用0.5％PBST洗涤3次。
(10)显色：准备底物，将TMB与H2O2等比例进行混合，然后按照50μl/孔加入到ELISA板中进行显色，时间约为5min。
(11)终止：显色结束后加入终止液(2N H2SO4)终止显色。
(12)记录OD450 nm数值：将ELISA板置于酶联仪中进行读数，并将结果导出成Excel格式。
(13)数据分析：利用Prism软件进行数据分析及作图，拟合EC50。
图3显示通过夹心ELISA法测定本申请制备的抗MMAE的单克隆抗体与TROP2-ADC的结合活性。从图中可以看出抗MMAE的单克隆抗体与TROP2-ADC具有良好的结合活性。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 一种抗MMAE的单克隆抗体、其编码序列及应用
<130> DI20-2115-XC03
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile His Pro Thr Asn Gly Asn Thr Arg Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Asn Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Arg Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
115 120
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区核苷酸序列
<400> 3
gaggtgcagc tggaggagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatc 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tacactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attcatccta ccaatggtaa tactagggac 180
aaccagaagt tcatgggcaa ggccacattg actgtgaaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcaacctgac atctgatgat tctgcagtct attactgtgc aagacgagag 300
aggttgctga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区核苷酸序列
<400> 4
gatattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链核苷酸序列
<400> 5
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<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链核苷酸序列
<400> 6
gatattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60
atctcttgta gttctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaagtttc acatgttcct 300
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt 657
<210> 7
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链氨基酸序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile His Pro Thr Asn Gly Asn Thr Arg Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Asn Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Arg Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210 215 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290 295 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305 310 315 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340 345 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355 360 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370 375 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 8
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215

Claims (6)

1.抗单甲基奥里斯他汀E（MMAE）的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO: 7所述的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO: 8所述的氨基酸序列。
3. 编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核酸，其中，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核酸具有SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序列，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核酸具有SEQ ID NO: 4所述的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的核酸，其中，编码所述单克隆抗体的重链的核酸具有SEQ IDNO: 5所述的核苷酸序列；编码所述单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO: 6所述的核苷酸序列。
5.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备偶联MMAE的抗体药物的检测试剂中的用途。
6.一种偶联MMAE的抗体药物的检测试剂，其至少包含如权利要求1或2所述的单克隆抗体。
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