CN116948023B - Tau蛋白抗体及其应用 - Google Patents
Tau蛋白抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116948023B CN116948023B CN202311186548.5A CN202311186548A CN116948023B CN 116948023 B CN116948023 B CN 116948023B CN 202311186548 A CN202311186548 A CN 202311186548A CN 116948023 B CN116948023 B CN 116948023B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- variable region
- chain variable
- antibody
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 4
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 4
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 4
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- -1 FR4 nucleic acid Chemical class 0.000 description 2
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 2
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 2
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009448 modified atmosphere packaging Methods 0.000 description 2
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002739 subcortical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000024571 Pick disease Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- QKEOZZYXWAIQFO-UHFFFAOYSA-M mercury(1+);iodide Chemical compound [Hg]I QKEOZZYXWAIQFO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了Tau蛋白抗体及其应用,具体涉及抗Tau单克隆抗体及其功能片段,偶联物和组合物,该抗体能够以高亲和性识别并结合Tau蛋白。本发明还公开了该单克隆抗体及其功能片段的重链可变区和轻链可变区。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及Tau蛋白抗体及其应用。
背景技术
Tau蛋白是一种微管相关蛋白,在中枢神经系统的神经元非常丰富而少见于其它细胞,在中枢神经系统的星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达量也很低。Tau蛋白有缺陷并不再正常稳定微管时,可导致神经系统病变和失智症,如阿兹海默病。Tau蛋白的多种蛋白异型体是由单个基因(人类基因组中为MAPT)mRNA的选择性剪接而形成的。
Tau蛋白是一种高度可溶的微管相关蛋白(MAP)。与非神经元细胞相较,人体内Tau更多地在神经元内发现。Tau蛋白的主要功能之一是维持轴突微管的稳定性。而其它神经系统中的MAPs家族蛋白也有着相似的功能,这体现在Tau敲除的小鼠并没有发现其脑组织的发育受到影响。这可能是在Tau缺失后,其它MAPs家族蛋白在神经元内起到代偿Tau的作用,从而继续维持轴突微管的稳定,保证脑功能的正常运作。Tau并不在树突发挥功能,而主要作用在轴突远端维持微管的稳定性和必要的灵活性。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明提供了如下的技术方案:
本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其功能片段,其包含:
1)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1;
2)如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2;
3)如YFF所示的重链可变区CDR3;
4)如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区CDR1;
5)如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR2;和
6)如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3。
术语“CDR”和“互补决定区”可互换使用,并且是指抗体的参与结合至抗原的可变链的一部分。因此,CDR是“抗原结合位点”的一部分或者是“抗原结合位点”。在一些实施例中,单克隆抗体包含共同形成抗原结合位点的三个重链可变区CDR与三个轻链可变区CDR。“CDR”可指由本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。
进一步,所述CDR的划分方式包括但不限于Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统。
进一步,所述CDR的划分方式为Kabat规则。
进一步,所述Kabat规则包括CDR1使用“CXXXXXXXX”的方式划分,CDR3使用“CXX+···+WGXG”的方式划分,其中X代表任何氨基酸。
术语“片段”或“功能性片段”可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定修饰,条件是与未修饰的肽或蛋白质相比,片段的活性不会显著改变或受损。
进一步,所述单克隆抗体或其功能片段还包括:
1)如SEQ ID NO:6所示的重链可变区FR1;
2)如SEQ ID NO:7所示的重链可变区FR2;
3)如SEQ ID NO:8所示的重链可变区FR3;
4)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区FR4;
5)如SEQ ID NO:11所示的重链可变区FR1;
6)如SEQ ID NO:12所示的重链可变区FR2;
7)如SEQ ID NO:13所示的重链可变区FR3;和
8)如SEQ ID NO:14所示的重链可变区FR4。
进一步,所述的单克隆抗体或其功能片段,其包括:
1)如SEQ ID NO:10的氨基酸序列所示的重链可变区;和
2)如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的轻链可变区。
进一步,所述单克隆抗体或其功能片段还包括与单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽,和/或与单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。
进一步,所述的单克隆抗体或其功能片段,其还包括:
1)如SEQ ID NO:31的氨基酸序列所示的第一信号肽;和/或
2)如SEQ ID NO:32的氨基酸序列所示的第二信号肽。
在本发明的上下文中,“信号肽”用于引导外源蛋白的分泌表达。“分泌”是指蛋白质或肽的分子在细胞内合成后被转运到细胞外。
在某些具体的实施例中,本发明所述的单克隆抗体或其功能片段与人Tau特异性结合。在某些实施例中,依照本发明的抗体结合 Tau 蛋白,其为人 Tau 蛋白。在具体的实施例中,依照本发明的抗体为全长 IgG1 抗体。
在某些具体的实施例中,本发明所述的单克隆抗体或其功能片段包括与SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有如下同一性的氨基酸序列:至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%,每种可能性代表本公开的一个单独的实施例。
在某些具体的实施例中,本发明所述的单克隆抗体或其功能片段包括与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有如下同一性的氨基酸序列:至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%,每种可能性代表本公开的一个单独的实施例。
进一步,所述单克隆抗体或其功能片段为人抗体,但在某些可替代的实施例中,所述单克隆抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施例中,依照本发明的抗体结合 Tau 蛋白,其为聚集的微管相关的和/或高磷酸化 Tau 蛋白,诸如成对螺旋丝 (PHF) 中存在的。
本发明提供了一种免疫偶联物,其包含与治疗剂连接的前面所述的单克隆抗体或其功能片段。
进一步,所述治疗剂包括细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂。
如本文所用,术语“治疗剂”是能够在疾病、障碍或状况的治疗或预防中提供治疗活性、反应或作用的任何分子、物质或化合物,包括诊断和预防剂。如本文其他部分所述,术语“治疗剂”不包括或涵盖辅助表位或佐剂,其在本说明书中被单独描述并且是本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒中可包括或可不包括的不同组分。
本发明提供了一种组合物,其包含前面所述的单克隆抗体或其功能片段,前面所述的免疫偶联物,和药物可接受的载体。
进一步,所述药物可接受的载体包括通过静脉注射、皮下注射、腹腔注射、肌肉注射、玻璃体注射所需的载体。
在某些具体的实施例中,所述药物可接受的载体包括生理盐水、D5W、林格氏乳酸、透明质酸酶、溶液张力调节剂、溶液渗透压调节剂、冻干粉的冻干保护剂、降粘辅料、缓冲液或表面活性剂。
本发明提供了一种分离的核酸分子及其载体,其编码前面所述的单克隆抗体或其功能片段。
进一步,编码重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3核酸分子具有与SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、TATTTTTTC所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3核酸分子具有与SEQ ID NO:18、19、20所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码重链可变区的FR1、FR2、FR3、FR4核酸分子具有与SEQ ID NO:21、22、23、24所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码轻链可变区的FR1、FR2、FR3、FR4核酸分子具有与SEQ ID NO:26、27、28、29所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码重链可变区的核酸分子具有与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码轻链可变区的核酸分子具有与SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码单克隆抗体重链的第一信号肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
进一步,编码单克隆抗体重链的第二信号肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列至少95%序列同一性的核苷酸序列。
在某些具体的实施例中,本发明所述的单克隆抗体或其功能片段包括与SEQ IDNO:25的核苷酸序列具有如下同一性的核苷酸序列:至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%,每种可能性代表本公开的一个单独的实施例。
在某些具体的实施例中,本发明所述的单克隆抗体或其功能片段包括与SEQ IDNO:30的核苷酸序列具有如下同一性的核苷酸序列:至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%,每种可能性代表本公开的一个单独的实施例。
进一步,所述载体包括质粒常规载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、piggyBac载体或Sleeping Beauty转座载体。
本发明提供了一种细胞,其包含前面所述的分离的核酸分子及其载体。
进一步,所述细胞包括原核细胞和/或真核细胞。
进一步,所述原核细胞包括细菌,放线菌、蓝细菌、支/衣原体等。
进一步,所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、植物细胞、酵母细胞。
在某些具体的实施例中,本发明使用的承载单克隆抗体或其功能片段的核苷酸和/或氨基酸序列的细胞为杂交瘤细胞。
在某些实施例中,本发明涉及生成抗体的方法,其包括培养此类宿主细胞,使得该抗体生成。
本发明提供了前面所述的单克隆抗体或其功能片段在制备用于诊断、治疗或预防以表达Tau蛋白为特征的疾病的产品中的用途。
进一步,所述产品包括试剂盒、试纸、药物、药物组合物、芯片。
在某些具体的实施例中,本发明提供了一种治疗或预防以表达Tau蛋白为特征的疾病的产品,包括给受试者施用有效治疗或预防该疾病的量的本发明的单克隆抗体或其功能片段。所述疾病可以是,例如,阿尔兹海默症、Pick病(Pick′s disease)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy, PSP)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease, AGD)、胶质细胞球形包涵体tau蛋白病(globular glial tauopathy)、进行性皮质下胶质细胞增生症(progressivesubcortical gliosis)、仅有神经原纤维缠结痴呆(neurofibrillary tangle-onlydementia,NFT-dementia)、星形胶质细胞斑(astrocytic plaques)等。
在一些实施例中,依照本发明的抗体可用于治疗个体中的 Tau 蛋白相关疾病或病症。在特定的实施例中,依照本发明的抗体可用于治疗个体中的 Tau 病。在一个具体的实施例中,依照本发明的抗体可用于治疗个体中的阿尔茨海默氏病 (AD)。在一个具体的实施例中,依照本发明的抗体可用于治疗个体中的Pick病。在一些实施例中,依照本发明的抗体可用于治疗个体中的认知功能损伤或丧失。在一个具体的实施例中,依照本发明的抗体可用于降低或调控个体脑中 Tau 蛋白的总水平。在一个具体的实施例中,依照本发明的抗体可用于降低或调控个体脑中磷酸化或高磷酸化 Tau 蛋白的总水平。
在一些实施例中,依照本发明的抗体用于制备药物,该药物用于降低或调控个体脑中Tau蛋白的总水平。在一些实施例中,依照本发明的抗体用于制备药物,该药物用于降低或调控个体脑中磷酸化或高磷酸化Tau蛋白的水平。
在具体的实施例中,依照本文所述方法治疗的个体为人。在具体的实施例中,该抗体用于施用于人。在具体的实施例中,本文所述用途为用于治疗人。
本发明提供了一种制备抗Tau的单克隆抗体或其功能片段的方法,包括在前面所述的细胞中表达该单克隆抗体或其功能片段,并且从该细胞中分离出该单克隆抗体或功能片段。
术语“抗 Tau 单克隆抗体”和“结合 Tau 的单克隆抗体”指能够以足够亲和力结合 Tau,使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向 Tau 的抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用,并且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体 ( 例如双特异性抗体 )、和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。
本发明提供了一种检测试剂盒,其包含前面所述的单克隆抗体或其功能片段,或前面所述的免疫偶联物,或前面所述的组合物。
进一步,所述检测试剂盒包括使用双抗体夹心ELISA所需要的试剂。
进一步,所述检测试剂盒还包括其他单克隆抗体或其功能片段。
在某些具体的实施例中,所述其他单克隆抗体或其功能片段包括代号为23H9E4的单克隆抗体或其功能片段。
附图说明
图1是western检测18G1G8单克隆抗体培养上清对重组抗原识别能力图;
图2是纯化抗体23H9E4和18G1G8联合检测与抗原结合的特异性图。
具体实施方式
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述,不应将这些实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均引入本文作为参考。
实施例1 抗Tau蛋白抗体的制备
1、实验方法
1)动物免疫:选取BALB/c小鼠,常规方法免疫。经三次免疫后,用间接ELISA方法测试抗血清效价,选取效价高的小鼠进行后续实验,使用western测试抗血清对重组抗原的识别。
2)脾细胞制备:引颈处死小鼠,无菌条件下取出脾脏,置于已消毒的90~100目不锈钢网中。用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液,反复抽吸数次获取细胞,再制成细胞悬液。把细胞悬液注入50ml离心管中,加10~20ml培养液,轻轻吹打数次,室温中静置5分钟。离心(800~1000转/分)计数,备用。
3)细胞融合:将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞按1:5比例混合,离心弃去上清,并以消毒滤纸吸净多余上清。将1 ml 40%的PEG溶液60秒内逐滴加入到细胞团中,同时并不断轻微转动离心管。在不断转动的离心管中,60秒内逐滴加入1 ml无血清培养液。而后于5 分钟内缓慢加完20 ml无血清培养基。离心(800 转/分,8 分钟),去上清,用完全培养液10 ml悬浮,轻轻混匀。将细胞悬液加入96孔板内,每孔50微升。37℃ CO2培养箱中培养24小时后更换成HAT选择性培养液。
4)融合后细胞培养:以重组蛋白作为抗原包被酶标板,包被抗原浓度为1 μg/ml,100 μl/孔。包被缓冲液为PBS(PH=7.4)。4℃放置过夜。次日PBS洗涤3次,每次5分钟。以1%BSA封闭,每孔加入200 μl。37℃恒温箱孵育2小时。弃去BSA,加入含有单克隆抗体的细胞培养上清,每孔100 μl。以小鼠的阳性抗血清作为阳性对照,以空白培养上清作为阴性对照。37℃恒温箱孵育2小时。弃去一抗,洗涤液洗5次,加Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,37℃恒温箱孵育1小时。加入底物显色后,以酶标仪测定吸光值。
将检测的阳性细胞进行再一轮的克隆化培养,经验证后确定阳性细胞株,增殖后进行冻存和体外培养。
2、实验结果
在1:10的稀释条件下,抗体的吸光值>2.9,远远大于阴性对照值0.069,说明抗体对重组蛋白抗原有很好的亲和力,检测结果如表1所示。
表1抗体识别Tau重组蛋白
实施例2单克隆抗体的纯化及测序
1、实验方法
首先将产生单克隆抗体的培养液,应用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀,进行初步浓缩和纯化;再用亲和层析法进一步纯化。
1)用饱和硫酸铵溶液进行盐析。临用前取所需的量,用2 mol/L NaOH调PH至7 .8;将产生抗体的培养液移入烧杯中,边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液5 ml,继续缓慢搅拌30分钟;10000 rpm/min离心15分钟;弃去上清液,沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮,搅拌作用30分钟,同法离心;重复前一步1-2次;沉淀物溶于PBS(0 .01 mol/L PH7 .2)缓冲液中。
用透析法对盐析样本进行脱盐。将透析袋于2% NaHCO3,1 mmol/L EDTA溶液中煮10分钟,用蒸馏水清洗透析袋内外表面,再用蒸馏水煮透析袋10分钟,冷至室温即可使用。将盐析样品装入透析袋中,对50-100倍体积的PBS缓冲液透析(4℃)12-24小时,其间更换5次透析液,用萘氏试剂(碘化汞11.5 g,碘化钾8 g,加蒸馏水50 ml,待溶解后,再加20%NaOH 50 ml)检测,直至透析外液无黄色物形成为止。
2)亲和层析法进行抗体纯化:将初步纯化的抗体溶液经过protein A/G亲和层析柱过滤,经过结合、洗脱、收集,得到高纯度的抗体。利用分光光度计测定抗体浓度。将纯化的抗体分装后在-80℃保存。
3)单克隆抗体序列的测定:取对数生长期的杂交瘤细胞18G1G8,采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA,逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后,通过TA克隆插入载体,测序、进行序列分析。
2、实验结果
序列检测结果如表2所示。
表2 单克隆抗体18G1G8的序列
实施例3 单克隆抗体的鉴定
1、实验方法
1)以临床样本中的Tau蛋白作为抗原,以小鼠杂交瘤细胞18G1G8的单克隆培养上清进行检测,使用间接ELISA方法检测抗体识别抗原的能力。
2)以临床样本中的Tau蛋白作为抗原,以含有单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞18G1G8培养上清进行检测,使用western blot检测抗体抗原的结合能力。
3)应用双抗体夹心ELISA方法,以23H9E4为包被抗体,以18G1G8-biotin抗体作为检测抗体,检测抗体对抗原的识别和捕获作用。
以2.5 μg/ml的纯化抗体包被酶标板,包被液为PBS(pH=7.4),4℃放置过夜。洗涤液洗涤3次,加入重组蛋白作为抗原,抗原浓度分别为0、1、10、100 ng/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次,加入生物素标记的检测抗体,浓度为1 μg/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次,加入HRP标记的链酶亲和素,与检测抗体结合,浓度为1 mg/ml,1:10,000稀释,每孔加入100 μl。37℃孵育30分钟。加底物显色,酶标仪测定吸光值。
4)将单克隆抗体23H9E4与抗体18G1G8-biotin配对组合,检测纯化抗体与抗原结合的特异性,将抗原进行倍比稀释,根据抗原浓度与吸光值进行绘图。
2、实验结果
以临床样本中的人Tau蛋白作为抗原,以含有单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞培养上清进行检测。在目标位置,出现强阳性条带,说明抗体对临床样本中的抗原有很强的结合力,结合结果如图1所示。
双抗夹心ELISA检测结果如表3所示,单克隆抗体23H9E4与抗体18G1G8-biotin配对成功,随着抗体含量的增加,吸光值随之上升。抗原浓度为100 ng/ml 时,吸光值>1.7,明显高于阴性对照。说明该抗体对抗原有很强的识别和捕获作用。
表3纯化抗体对Tau抗原的识别
单克隆抗体23H9E4与抗体18G1G8-biotin配对组合检测抗原抗体的特异性结合如图2所示,随着抗原浓度升高,吸光值也随之升高,说明抗体与抗原结合具有特异性。
Claims (8)
1.一种分离的结合Tau蛋白的单克隆抗体或其功能片段,其包含:
1)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1;
2)如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2;
3)如YFF所示的重链可变区CDR3;
4)如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区CDR1;
5)如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR2;和
6)如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其功能片段,其包括:
1)如SEQ ID NO:10的氨基酸序列所示的重链可变区;和
2)如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的轻链可变区。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或其功能片段,所述单克隆抗体或其功能片段还包括与单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽,和/或与单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。
4.一种分离的核酸分子及其载体,所述分离的核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其功能片段,所述载体包括分离的核酸分子。
5.一种细胞,其包含权利要求4所述的分离的核酸分子及其载体。
6.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其功能片段在制备用于检测Tau蛋白的产品中的用途。
7.一种制备抗Tau的单克隆抗体或其功能片段的方法,包括在权利要求5的细胞中表达该单克隆抗体或其功能片段,并且从该细胞中分离出该单克隆抗体或功能片段。
8.一种检测试剂盒,其包含权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311186548.5A CN116948023B (zh) | 2023-09-14 | 2023-09-14 | Tau蛋白抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311186548.5A CN116948023B (zh) | 2023-09-14 | 2023-09-14 | Tau蛋白抗体及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116948023A CN116948023A (zh) | 2023-10-27 |
CN116948023B true CN116948023B (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=88446376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311186548.5A Active CN116948023B (zh) | 2023-09-14 | 2023-09-14 | Tau蛋白抗体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116948023B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018170351A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-phf-tau antibodies and uses thereof |
CN116375856A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-07-04 | 陕西师范大学 | 一种抗Tau蛋白的单克隆抗体1A5-47H7和基于其的产品以及应用 |
-
2023
- 2023-09-14 CN CN202311186548.5A patent/CN116948023B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018170351A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-phf-tau antibodies and uses thereof |
CN116375856A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-07-04 | 陕西师范大学 | 一种抗Tau蛋白的单克隆抗体1A5-47H7和基于其的产品以及应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Tau蛋白外显子特异性单抗制备及初步应用;刘恋;陈嘉;胡超;夏影;杨微;王琳;石琦;董小平;陈志宝;陈操;;病毒学报(第02期);全文 * |
单克隆抗体技术在阿尔茨海默病中的应用;赵正卿;万琪;;国外医学(老年医学分册)(第06期);全文 * |
微管相关蛋白I轻链3(LC3)的基因表达及单克隆抗体制备;张海;师长宏;赵勇;缪珊;张廷芬;伍静;;中国比较医学杂志(第10期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116948023A (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3878863A1 (en) | Anti-claudin18.2 antibody and use thereof | |
JP2023075294A (ja) | 抗cd47抗体及びその応用 | |
CN109438576B (zh) | 一种抗人cd47单克隆抗体的制备及其应用 | |
RU2610665C2 (ru) | Антитело, блокирующее agr2, и его применение | |
CN111234020B (zh) | 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN110699327A (zh) | 杂交瘤细胞株6f9、抗体及其应用 | |
CN111253488A (zh) | Cd47抗体及其制备方法和应用 | |
KR20230020394A (ko) | Tau 결합 화합물 | |
CN113508140A (zh) | 与切断型的突变型Calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药 | |
CN115109154A (zh) | 一种靶向cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
CN117088976B (zh) | 一种抗nfl的单克隆抗体 | |
CN116731169B (zh) | 一种分拣蛋白1特异性的纳米抗体及其应用 | |
CN113817052A (zh) | 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
CN115052899B (zh) | Pcsk9的单域抗体及其应用 | |
CN116769729B (zh) | 靶向cd150的抗体或抗原结合片段及其应用 | |
CN113402607A (zh) | 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 | |
CN116948023B (zh) | Tau蛋白抗体及其应用 | |
CN113912712B (zh) | 抗α-突触核蛋白的单克隆抗体的制备及其应用 | |
US20220064272A1 (en) | Anti-tauc3 antibodies and uses thereof | |
CN113831411A (zh) | 针对l1cam的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
CN110734897A (zh) | 杂交瘤细胞株12g6、抗体及其应用 | |
CN112062848B (zh) | 抗cd47单克隆抗体及其应用 | |
TWI816621B (zh) | 抗體及其應用 | |
CN113354736B (zh) | 靶向人pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
CN118598998A (zh) | 一种抗ccr8抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |