JP7337959B2 - α－シヌクレインプロトフィブリル結合抗体 - Google Patents
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Description
本出願は、２０２０年６月２６日に出願された米国仮出願第６３／０４４８８１号及び２０２０年８月２７日に出願された米国仮出願第６３／０７１１５０号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
配列表への参照
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものは、本明細書に開示される核酸及びアミノ酸配列を含む、配列番号１～配列番号２０を含む、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＡＶＲ－７１９２５＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題される配列表である。配列表は、ＥＦＳを介してＡＳＣＩＩテキスト形式で本明細書と共に電子的に提出されている。配列表は２０２１年６月１７日に最初に作成され、サイズは１８，４１７バイトである。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものは、本明細書に開示される核酸及びアミノ酸配列を含む、配列番号１～配列番号２０を含む、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＡＶＲ－７１９２５＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題される配列表である。配列表は、ＥＦＳを介してＡＳＣＩＩテキスト形式で本明細書と共に電子的に提出されている。配列表は２０２１年６月１７日に最初に作成され、サイズは１８，４１７バイトである。
国際特許出願第２０１１／１０４６９６号Ａ１（参照により本明細書に組み込まれている）は、α－シヌクレインのプロトフィブリル型に結合するマウスモノクローナルＩｇＧ抗体ｍＡｂ４７を開示している。ヒトでの使用に適したα－シヌクレインのプロトフィブリル型に選択的に結合する抗体の必要性が残っている。
（発明の要旨）
本開示は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、オリゴマー／プロトフィブリルなどのヒトα－シヌクレイン凝集体を選択的に標的とする、すなわち、モノマーと比較してα－シヌクレインプロトフィブリルへの非常に強い結合を持つ。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリル結合比を比較した場合、ｍＡｂ４７よりもより良い選択性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗α－シヌクレイン抗体である。
本開示は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、オリゴマー／プロトフィブリルなどのヒトα－シヌクレイン凝集体を選択的に標的とする、すなわち、モノマーと比較してα－シヌクレインプロトフィブリルへの非常に強い結合を持つ。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリル結合比を比較した場合、ｍＡｂ４７よりもより良い選択性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗α－シヌクレイン抗体である。
一態様では、本開示は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有するオリゴマー／プロトフィブリルなどのヒトα－シヌクレイン凝集体を選択的に標的とする、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、モノクローナル抗体であるＢＡＮ０８０５に関する。興味深いことに、ＢＡＮ０８０５はまた、ｍＡｂ４７よりも低いα－シヌクレインモノマー結合を示し、その結果、α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリル結合比を比較した場合、ＢＡＮ０８０５は、ｍＡｂ４７よりも、より良い選択性を持つ。さらに、β－及びγ－シヌクレインモノマー又はＡβ－プロトフィブリルへの結合は、ＢＡＮ０８０５では検出されなかった。
本開示はさらに、パーキンソン病（ＰＤ）を含むがこれに限定されない、α－シヌクレイン病状を伴う神経変性障害の治療を改善するための抗体に関する。
特許又は出願書には、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。このカラー図面付きの特許又は特許出願の出版物のコピーは、請求及び必要な料金の支払いにより、庁から提供される。
本開示は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有する抗体に関する。
本明細書に開示されるように、本開示は、以下の実施形態に関する。
実施形態１。配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体。
実施形態２。ＩｇＧアイソタイプのものである、実施形態１に記載の抗体。
実施形態３。ＩｇＧ４アイソタイプのものである、実施形態１に記載の抗体。
実施形態４。α－シヌクレインのモノマー型への結合についてのＫＤ値よりも少なくとも１１００００倍小さい、α－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についてのＫＤ値を有する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態５。最大で１８ｐＭのα－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についてのＫＤ値及び少なくとも２２００ｎＭのα－シヌクレインのモノマー型への結合についてのＫＤ値を有する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態６。α－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についての前記抗体のＫＤ及びα－シヌクレインのモノマー型への結合についての前記抗体のＫＤが、ＳＰＲによって測定される、実施形態４又は５いずれかの抗体。
実施形態７。配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体。
実施形態８。２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む、実施形態７の抗体。
実施形態９。配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸。
実施形態１０。配列番号１１～１４及び１７～２０からなる群から選択される配列を含む、実施形態９の核酸。
実施形態１１。実施形態１～８のいずれか１つの抗体をコードする、１つ以上の核酸。
実施形態１２。
（ａ）配列番号１１及び１２の配列を含む、
（ｂ）配列番号１３及び１４の配列を含む、
（ｃ）配列番号１７及び１８の配列を含む、又は
（ｄ）配列番号１９及び２０の配列を含む、
実施形態１１に記載の１つ以上の核酸。
（ａ）配列番号１１及び１２の配列を含む、
（ｂ）配列番号１３及び１４の配列を含む、
（ｃ）配列番号１７及び１８の配列を含む、又は
（ｄ）配列番号１９及び２０の配列を含む、
実施形態１１に記載の１つ以上の核酸。
実施形態１３。実施形態９、１０、１１又は１２のいずれか１つの核酸を含む、１つ以上のベクター。
実施形態１４。実施形態９～１２のいずれか１つの核酸を含む、宿主細胞。
実施形態１５。実施形態１３の１つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態１６。実施形態１～８のいずれか１つの抗体を発現する、宿主細胞。
実施形態１７。実施形態１～８のいずれか１つの少なくとも１つの抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
一態様では、本開示は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体に関する。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。
一実施形態では、本開示に記載される抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、特にヒトＩｇＧアイソタイプのものである。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ４アイソタイプのものである。
本開示において、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対する高い親和性とは、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルについて１０－７Ｍ未満の解離定数ＫＤを指す。したがって、一実施形態では、本開示に記載される抗体は、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルについて、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１Ｍ又は１０－１２Ｍ未満のＫＤを有する。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、並びにヒトα－シヌクレインプロトフィブリルについて、１１．２～２５．８ｐＭのＫＤを有する。
別の実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ヒトα－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有する。例えば、α－シヌクレインのモノマー型への結合についての本開示に記載される抗体のＫＤは、少なくとも１５００ｎＭ、少なくとも１６００ｎＭ、少なくとも１７００ｎＭ、少なくとも１８００ｎＭ、少なくとも１９００ｎＭ、少なくとも２０００ｎＭ、少なくとも２１００ｎＭ、少なくとも２２００ｎＭ、少なくとも２３００ｎＭ、少なくとも２４００ｎＭ、少なくとも２５００ｎＭ、少なくとも２６００ｎＭ、少なくとも２７００ｎＭ、少なくとも２８００ｎＭ、少なくとも２９００ｎＭ又は少なくとも３０００ｎＭである。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、並びにヒトα－シヌクレインモノマーについて、１６５０ｎＭ～２７３０ｎＭのＫＤを有する。
一実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、モノマーα－シヌクレインと対比して、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して、８００００倍を超える、９００００倍を超える、１０００００倍を超える、１１００００倍を超える又は１２００００倍を超える選択性を有する。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、並びにモノマーα－シヌクレインと対比して、ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して、６４０００倍～２４４０００倍の選択性を有する。
一実施形態では、これらの結合親和性は、例えば、実施例３に記載されるように、阻害ＥＬＩＳＡを使用して測定される。別の実施形態では、これらの結合親和性は、例えば、実施例３に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。
別の態様では、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸が、本明細書において提供される。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。核酸は、配列番号１１～１４及び１７～２０からなる群から選択される配列を含んでもよい。
別の態様では、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸が、本明細書において提供される。一実施形態では、１つ以上の核酸は、配列番号１１及び１２の配列を含む。別の実施形態では、１つ以上の核酸は、配列番号１３及び１４の配列を含む。一実施形態では、１つ以上の核酸は、配列番号１７及び１８の配列を含む。一実施形態では、１つ以上の核酸は、配列番号１９及び２０の配列を含む。
別の態様では、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが、本明細書において提供される。そのようなベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターを含むが、これらに限定されない。一態様では、１つ以上のベクターが、本発明の抗体をコードすることを提供している。一実施形態では、１つ以上のベクターは、配列番号１１及び１２の配列を含む。別の実施形態では、１つ以上のベクターは、配列番号１３及び１４の配列を含む。一実施形態では、１つ以上のベクターは、配列番号１７及び１８の配列を含む。一実施形態では、１つ以上のベクターは、配列番号１９及び２０の配列を含む。
別の態様では、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。一実施形態では、宿主細胞は、本発明の抗体をコードする核酸を含む。本明細書に記載の宿主細胞は、Ｂ細胞、ハイブリドーマ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、ヒト細胞である。
別の態様では、本発明の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が、本明細書において提供される。
［実施例１］ 抗体候補の生成
ｍＡｂ４７の初期変異体は、ｍＡｂ４７ ＣＤＲをヒトフレームワーク配列に直接移植し、さまざまな位置でマウス残基に逆変異を起こすことによって生成された。初期変異体には、α－シヌクレインに対して望ましい結合特性を示すものがなかった。したがって、新しい変異体を生成するためのより可能性のある変異を見つけるために、新しいモデルを構築して解析した。
ｍＡｂ４７の初期変異体は、ｍＡｂ４７ ＣＤＲをヒトフレームワーク配列に直接移植し、さまざまな位置でマウス残基に逆変異を起こすことによって生成された。初期変異体には、α－シヌクレインに対して望ましい結合特性を示すものがなかった。したがって、新しい変異体を生成するためのより可能性のある変異を見つけるために、新しいモデルを構築して解析した。
ｍＡｂ４７を改善するための第２の試みでは、標的と相互作用する可能性が低い残基と、決定されたＣＤＲから４Åの残基がチェックされた。配列番号３に示される重鎖配列を有し、配列番号４に示される軽鎖配列を有する抗体変異体が生成され、ＢＡＮ０８０５と名付けられた。逆変異Ｖ７１Ｋ及びＲ９４Ｋは、ＢＡＮ０８０５に同時に存在するが、他の変異体で除去されると結合が失われるため、これらの抗体の結合能力にとって重要であることがわかった。
ＢＡＮ０８０５は、同等の変異体よりも１つ少ない逆変異を有し、モノマー種よりもプロトフィブリルに対する結合及び選択性を示しているため、ＢＡＮ０８０５が主要候補として選ばれた。
［実施例２］ 抗体候補の特性評価
熱安定性を決定するために、抗体は１０分間高温に供され、４℃に冷却され、各候補のＥＣ８０濃度（普通は５～５０ｎｇ／ｍＬ）でＥＬＩＳＡアッセイに使用された。ＢＡＮ０８０５は安定であり、キメラマウス抗体ｃ４７又はｃｍＡｂ４７（ヒトＩｇＧ４及びｍＡｂ４７の可変領域を組み合わせたキメラ）の結合はおよそ５℃早く大幅に低下した一方で、α－シヌクレインとの結合能力は、低下し始める７５℃まで維持していた。
熱安定性を決定するために、抗体は１０分間高温に供され、４℃に冷却され、各候補のＥＣ８０濃度（普通は５～５０ｎｇ／ｍＬ）でＥＬＩＳＡアッセイに使用された。ＢＡＮ０８０５は安定であり、キメラマウス抗体ｃ４７又はｃｍＡｂ４７（ヒトＩｇＧ４及びｍＡｂ４７の可変領域を組み合わせたキメラ）の結合はおよそ５℃早く大幅に低下した一方で、α－シヌクレインとの結合能力は、低下し始める７５℃まで維持していた。
抗体の融解温度を決定するために、ｃｍＡｂ４７は、ＢＡＮ０８０５に対してサーマルシフトアッセイで試験された。融解温度データは、ＢＡＮ０８０５のＴｍが、７０℃のキメラのものよりも低い、６５－６５．４℃であると計算されることを示した。
さらに、１ｍｇ／ｍＬの精製サンプルは、ＨＰＬＣシステムのサイズ排除カラムに０．４ｍＬ／分で注入され、絶対モル質量を決定し、凝集をチェックするために、マルチアングル光散乱により解析された。データは、ＢＡＮ０８０５の凝集の懸念がなかったことを示唆している。ＢＡＮ０８０５は単分散であった（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）。質量回収率は１００％（注入質量に対する計算質量）であり、これは良好なタンパク質回収を示している。
バルク精製されたヒトポリクローナルＩｇＧを使用した相互作用クロマトグラフィーは、非特異的なタンパク質間相互作用をモニタリングするための技術であり、可溶性抗体と不溶性抗体を区別するために使用することができる。高い保持指数（ｋ’）は、自己相互作用の傾向と低い溶解度を示す。ＢＡＮ０８０５は、ｃｍＡｂ４７の０．０３５を下回る０．０２５の保持指数を示し、これは、非特異的相互作用の傾向が低く、溶解性が良好であることを示している。
凍結／解凍ストレス解析のために、１ｍｇ／ｍＬの精製抗体候補のサンプルを、－８０℃で１５分間の後、室温で１５分間の解凍に１０サイクル施した。熱誘導ストレス解析については、１ｍｇ／ｍＬの精製抗体候補のサンプルを、ａ）４℃、ｂ）２５℃、ｃ）３７℃及びｄ）５０℃の温度に２週間さらした。その後、サンプルをＳＥＣ－ＭＡＬＳにより解析して、凝集をチェックした。データは、凍結解凍サイクル及び熱ストレスがＢＡＮ０８０５で凝集を引き起こさなかったことを示唆している。図１を参照されたい。
ＢＡＮ０８０５を解析し、ＩＭＧＴ ＣＤＲ定義及びＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎツールに従って、最も近い生殖細胞系列（ＨＫについてはＩＧＶＨ４－５９＊０３／ＩＧＨＪ３＊０１、ＫＡについてはＩＧＶＫ２－２８＊０１／ＩＧＫＪ２＊０２）と比較した。ヒト生殖細胞系列との全体的な同一性は、軽鎖で８６．５％であり、この解析でヒト化されたと見なされるための８５％のカットオフを超えている。重鎖については、ＣＤＲを移植し、２つのマウスの逆変異を導入した後、ヒト生殖細胞系列との同一性のパーセンテージは８１％を下回るまで低下した。これは、ＩＭＧＴ ＣＤＲ２がここで使用されているＫａｂａｔの定義よりも大幅に短いため、フレームワーク３の始めにより多くの数のマウス残基の挿入が起きたという事実によって説明することができる。
［実施例３］ ＢＡＮ０８０５のヒトα－シヌクレインプロトフィブリルへの選択的結合
ＢＡＮ０８０５のヒトα－シヌクレインプロトフィブリルへの結合選択性は、阻害ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の両方によって測定された。
ＢＡＮ０８０５のヒトα－シヌクレインプロトフィブリルへの結合選択性は、阻害ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の両方によって測定された。
α－シヌクレインプロトフィブリルのＩＣ５０値は、ｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５で非常に類似しており（それぞれ２．７ｎＭ及び２．２ｎＭ）、プロトフィブリルへの結合特性がヒト化後に変化しなかったことを示している。対照的に、α－シヌクレインモノマーへの結合は変化し、その結果、ＢＡＮ０８０５のα－シヌクレインモノマーへの結合強度が低下した。このことにより、ｍＡｂ４７（３４０倍）と比較して、ＢＡＮ０８０５について、α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリルのより良い選択性をもたらした（９１０倍）。図２を参照されたい。
しかしながら、検出限界により、より低いＩＣ５０値であっても検出することを可能にするために抗体濃度をさらに下げることはできず、「真の」ＩＣ５０値に近づくことはできなかった。したがって、示されたＩＣ５０値は、全てのｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５バッチに使用されている阻害ＥＬＩＳＡの現在の手順に従って得られたものであり、プロトフィブリルのＩＣ５０値は過大評価されている可能性がある（すなわち、結合強度は過小評価されている可能性がある。）。より正確な結合、したがって選択性は、以下に説明するＳＰＲを使用して得られた。
ｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５の結合選択性は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲによって確認された。抗体の顕著なアビディティ依存性と組み合わせた標的抗原の複雑さによって引き起こされる実現可能性問題のために、異なるアッセイ設定を使用して、α－シヌクレインプロトフィブリル及びモノマー結合をそれぞれ評価した。モノマーへの結合を測定するために、チップをｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５に対する抗マウス又は抗ヒト抗体でそれぞれコーティングした。その後、０．２５～１．５μｇ／ｍｌのｍＡｂ４７又はＢＡＮ０８０５を表面に捕捉し、続いてα－シヌクレインモノマーを５倍希釈のシングルサイクルカイネティクス（ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で注入した。プロトフィブリル（ＰＦ）への結合を測定するために、チップを０．５μｇ／ｍｌ ＰＦでコーティングし、ｍＡｂ４７又はＢＡＮ０８０５の２倍希釈液を、シングルサイクルカイネティクスを使用して注入した。ｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５の代表的なセンサグラムを図３に示している。
α－シヌクレインプロトフィブリルのＫＤ値は、ｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５について類似しており、ｍＡｂ４７の修飾がα－シヌクレインプロトフィブリルへの強い結合に影響を与えなかったことを示し（表１）、阻害ＥＬＩＳＡの結果を確認した。しかしながら、ＫＤ値はｐＭ範囲内であり、阻害ＥＬＩＳＡで前述の制限を確認することとなった。重要なことには、ＳＰＲにより、α－シヌクレインモノマーに対するＢＡＮ０８０５の親和性がｍＡｂ４７と比較して減少していることが確認された。ＳＰＲで測定されたＫＤ値は、ＢＡＮ０８０５及びｍＡｂ４７でモノマーと対比して、ＰＦについて、それぞれ１１００００倍及び１８０００倍の選択性をもたらした。α－シヌクレインモノマーとプロトフィブリルについてのｍＡｂ４７及びＢＡＮ０８０５の平均ＫＤ値を表１に示している。
β－又はγ－シヌクレインなどの相同タンパク質及びＡβのような他の凝集しやすいタンパク質の交差反応性は、直接ＥＬＩＳＡ（ここでは、高密度コーティングがコーティングされたタンパク質の凝集型を模倣している。）並びに阻害ＥＬＩＳＡの両方を使用して試験された。ここでは、ｍＡｂ４７とＢＡＮ０８０５の交差反応性が、阻害ＥＬＩＳＡによって比較されながら解析された。阻害ＥＬＩＳＡは、β－シヌクレインモノマー、γ－シヌクレインモノマー及びＡβ－プロトフィブリルを抗原として用いて実行された。結果は、ＢＡＮ０８０５のβ－若しくはγ－シヌクレインモノマー又はＡβ－プロトフィブリルへの検出可能な結合がなかったことを示している。阻害ＥＬＩＳＡにおけるβ－又はγ－シヌクレインに対する代表的なＢＡＮ０８０５交差反応性試験が図４に示されている。データは表２に示される。
阻害ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）Ｂｉａｃｏｒｅデータの結果は両方とも、α－シヌクレインモノマーに対するＢＡＮ０８０５の親和性がｍＡｂ４７と比較して減少したことを示しており、これは、ｍＡｂ４７と比較してＢＡＮ０８０５のより良い選択性を示している。さらに、ＢＡＮ０８０５について試験した濃度（最大μＭ範囲）では、β－及びγ－シヌクレインモノマー又はＡβ－プロトフィブリルへの結合は見られなかった。
したがって、本開示は、α－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、α－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有しており、マウスｍＡｂ４７と比較して以下の特徴を有する抗体に関する：
（１）ＢＡＮ０８０５は、モノマーと比較して、α－シヌクレインプロトフィブリルへの結合がはるかに強力である；
（２）α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリル結合比を比較した場合、α－シヌクレインモノマー結合はＢＡＮ０８０５と比較してｍＡｂ４７についてより強く、その結果、ｍＡｂ４７よりもＢＡＮ０８０５のより良い選択性が、阻害ＥＬＩＳＡとＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅデータの両方で示された（すなわち、ＢＡＮ０８０５はｍＡｂ４７と比較して、望ましくないモノマーα－シヌクレイン標的に結合する傾向が低い。）；並びに
（３）ＢＡＮ０８０５について試験した濃度（最大μＭ範囲）では、β－及びγ－シヌクレインモノマー又はＡβ－プロトフィブリルへの結合が見られなかった。
（１）ＢＡＮ０８０５は、モノマーと比較して、α－シヌクレインプロトフィブリルへの結合がはるかに強力である；
（２）α－シヌクレインモノマーと対比して、α－シヌクレインプロトフィブリル結合比を比較した場合、α－シヌクレインモノマー結合はＢＡＮ０８０５と比較してｍＡｂ４７についてより強く、その結果、ｍＡｂ４７よりもＢＡＮ０８０５のより良い選択性が、阻害ＥＬＩＳＡとＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅデータの両方で示された（すなわち、ＢＡＮ０８０５はｍＡｂ４７と比較して、望ましくないモノマーα－シヌクレイン標的に結合する傾向が低い。）；並びに
（３）ＢＡＮ０８０５について試験した濃度（最大μＭ範囲）では、β－及びγ－シヌクレインモノマー又はＡβ－プロトフィブリルへの結合が見られなかった。
［実施例４］ ＢＡＮ０８０５の生産
ＢＡＮ０８０５を生産するために、シグナルペプチドを含むＢＡＮ０８０５ ＶＨ（配列番号１３）及びＶＬ（配列番号１４）をコードする最適化ＤＮＡ配列を合成し、ＧＳベクターｐＸＣ－ＩｇＧ４Ｐｒｏ（ｄｅｌｔａＫ）及びｐＸＣ－Ｋａｐｐａ（Ｌｏｎｚａ）にそれぞれクローニングした。次に、得られたＨＣ及びＬＣ ＳＧＶを使用して、ＨＣ及びＬＣ遺伝子の両方を含む二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を生成した。ＢＡＮ０８０５重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードする最適化ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１１及び１２に示されている。ＢＡＮ０８０５重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする最適化ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１３及び１４に示されている。配列番号１１～１４は全て、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む（表３Ｂを参照）。シグナルペプチドを除くＢＡＮ０８０５ ＨＣ、ＬＣ、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１７、１８、１９及び２０に示されている。ＢＡＮ０８０５のＣＤＲ配列が、表３Ａに列挙されている。Ｃｈｏｔｈｉａ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、６、及び７に示されている。Ｋａｂａｔ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、１６及び７に示されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ－３）のアミノ酸配列は同じであり、配列番号７に記載されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ命名法による軽鎖ＣＤＲ（ＶＬ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は同じであり、それぞれ配列番号８、９及び１０に示されている。
ＢＡＮ０８０５を生産するために、シグナルペプチドを含むＢＡＮ０８０５ ＶＨ（配列番号１３）及びＶＬ（配列番号１４）をコードする最適化ＤＮＡ配列を合成し、ＧＳベクターｐＸＣ－ＩｇＧ４Ｐｒｏ（ｄｅｌｔａＫ）及びｐＸＣ－Ｋａｐｐａ（Ｌｏｎｚａ）にそれぞれクローニングした。次に、得られたＨＣ及びＬＣ ＳＧＶを使用して、ＨＣ及びＬＣ遺伝子の両方を含む二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を生成した。ＢＡＮ０８０５重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードする最適化ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１１及び１２に示されている。ＢＡＮ０８０５重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする最適化ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１３及び１４に示されている。配列番号１１～１４は全て、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む（表３Ｂを参照）。シグナルペプチドを除くＢＡＮ０８０５ ＨＣ、ＬＣ、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１７、１８、１９及び２０に示されている。ＢＡＮ０８０５のＣＤＲ配列が、表３Ａに列挙されている。Ｃｈｏｔｈｉａ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、６、及び７に示されている。Ｋａｂａｔ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、１６及び７に示されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ命名法による重鎖ＣＤＲ（ＶＨ－ＣＤＲ－３）のアミノ酸配列は同じであり、配列番号７に記載されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ命名法による軽鎖ＣＤＲ（ＶＬ－ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列は同じであり、それぞれ配列番号８、９及び１０に示されている。
次に、ｐＢＡＮ０８０５／ＤＧＶと呼ばれる得られたＤＧＶを、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、アセンブルされた抗体の分泌をもたらす条件下で培養した。次に、分泌された抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
表３．配列表
Ａ． ＢＡＮ０８０５
Ａ． ＢＡＮ０８０５
ＶＨ：
ＶＬ：
重鎖
軽鎖
ＣＤＲ
ＶＨ－ＣＤＲ－１ （Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ （配列番号５）
ＶＨ－ＣＤＲ－１ （Ｋａｂａｔ）： ＳＹＧＶＨ （配列番号１５）
ＶＨ－ＣＤＲ－２ （Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＳＡＡＦ （配列番号６）
ＶＨ－ＣＤＲ－２ （Ｋａｂａｔ）： ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＳＡＡＦＭＳ （配列番号１６）
ＶＨ－ＣＤＲ－３ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＬＬＲＳＶＧＧＦＡＤ （配列番号７）
ＶＬ－ＣＤＲ－１ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＲＳＳＱＴＩＶＨＮＮＧＮＴＹＬＥ （配列番号８）
ＶＬ－ＣＤＲ－２ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＫＶＳＮＲＦＳ （配列番号９）
ＶＬ－ＣＤＲ－３ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ （配列番号１０）
ＶＨ－ＣＤＲ－１ （Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ （配列番号５）
ＶＨ－ＣＤＲ－１ （Ｋａｂａｔ）： ＳＹＧＶＨ （配列番号１５）
ＶＨ－ＣＤＲ－２ （Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＳＡＡＦ （配列番号６）
ＶＨ－ＣＤＲ－２ （Ｋａｂａｔ）： ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＳＡＡＦＭＳ （配列番号１６）
ＶＨ－ＣＤＲ－３ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＬＬＲＳＶＧＧＦＡＤ （配列番号７）
ＶＬ－ＣＤＲ－１ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＲＳＳＱＴＩＶＨＮＮＧＮＴＹＬＥ （配列番号８）
ＶＬ－ＣＤＲ－２ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＫＶＳＮＲＦＳ （配列番号９）
ＶＬ－ＣＤＲ－３ （Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）： ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ （配列番号１０）
表３Ａは、Ｃｈｏｔｈｉａ命名法によるＣＤＲ配列としての下線の配列と、Ｋａｂａｔ命名法によるＣＤＲ配列としての太字の配列を列挙している。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、左（Ｎ末端）から右（Ｃ末端）に出現した標準的順番で示されている。
Ｂ．ＢＡＮ０８０５重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列
シグナル配列を有するＢＡＮ０８０５ ＨＣ遺伝子（配列番号１１）
シグナル配列を有するＢＡＮ０８０５ ＨＣ遺伝子（配列番号１１）
シグナル配列を有するＢＡＮ０８０５ ＬＣ遺伝子（配列番号１２）
シグナル配列を有するＢＡＮ０８０５ ＶＨ遺伝子（配列番号１３）
シグナル配列を有するＢＡＮ０８０５ ＶＬ遺伝子（配列番号１４）
ＢＡＮ０８０５ ＨＣ遺伝子（配列番号１７）
ＢＡＮ０８０５ ＬＣ遺伝子（配列番号１８）
ＢＡＮ０８０５ ＶＨ遺伝子（配列番号１９）
ＢＡＮ０８０５ ＶＬ遺伝子（配列番号２０）
シグナルペプチドをコードする配列には下線が引かれている。開始コドンは太字で、終止コドンはイタリック体で示されている。
Claims (15)
- ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、ヒトα－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体。
- ＩｇＧアイソタイプのものである、請求項１に記載の抗体。
- ＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１に記載の抗体。
- ヒトα－シヌクレインのモノマー型への結合についてのＫＤ値よりも少なくとも１１００００倍小さい、ヒトα－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についてのＫＤ値を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
- 最大で１８ｐＭのヒトα－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についてのＫＤ値及び少なくとも２２００ｎＭのヒトα－シヌクレインのモノマー型への結合についてのＫＤ値を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトα－シヌクレインのプロトフィブリル型への結合についての前記抗体のＫＤ及びヒトα－シヌクレインのモノマー型への結合についての前記抗体のＫＤが、ＳＰＲによって測定される、請求項４又は５のいずれかに記載の抗体。
- ヒトα－シヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を有し、ヒトα－シヌクレインモノマーに対して低い親和性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体。
- ２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む、請求項７に記載の抗体。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体をコードする、１つ以上の核酸。
- （ａ）配列番号１１及び１２の配列を含む、
（ｂ）配列番号１３及び１４の配列を含む、
（ｃ）配列番号１７及び１８の配列を含む、又は
（ｄ）配列番号１９及び２０の配列を含む、
請求項９に記載の１つ以上の核酸。 - 請求項９～１０のいずれか一項に記載の核酸を含む、１つ以上のベクター。
- 請求項９～１０のいずれか一項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項１１に記載の１つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体を発現する、宿主細胞。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
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