CN111971304A - 在酸性pH结合至VISTA的抗体 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及在酸性pH下特异性结合至含有V‑结构域免疫球蛋白的T细胞活化抑制因子(VISTA)的抗体，和其在癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，所述抗体在酸性pH下特异性结合至人VISTA，但在中性或生理pH下不会显著结合至人VISTA。
Description
发明领域
本申请涉及在酸性pH特异性结合至含有V-结构域免疫球蛋白的T细胞活化抑制因子(VISTA)的抗体和其在癌症治疗中的用途。
背景技术
含有V-结构域Ig的T细胞活化抑制因子或VISTA是由粒单核细胞和其他白细胞表达的免疫受体的B7家族的共抑制成员。然而，对VISTA抑制免疫反应的机制知之甚少。
发明人已发现，不同于其他已知免疫受体，VISTA与其反受体接合且在酸性pH选择性发挥作用，并且在生理pH(例如7.3-7.4)具有较小活性。VISTA可由此在酸性微环境(例如肿瘤床或发炎部位)中抑制免疫反应，并且并不扰乱血液中的细胞循环或驻留于非发炎、非酸性组织中。另外，发明人已发现，抗VISTA抗体可经工程化以在酸性pH选择性结合至VISTA，并且在生理pH具有较小结合或并无结合，从而反映了VISTA的自有酸性pH选择性。相对于在生理pH结合VISTA的抗体，这些酸性pH选择性抗体可提供治疗疾病(例如癌症)的期望性质。
发明内容
本公开涉及在酸性pH(例如在酸性条件中)特异性结合至VISTA(例如人VISTA(“hVISTA”或“huVISTA”))的细胞外结构域(ECD)的抗体。本公开还涉及在酸性pH特异性结合至VISTA(例如hVISTA)的细胞外结构域(ECD)且在中性或生理pH具有较小结合或并无结合的抗体。发明人在本文中指出，hVISTA-ECD氨基酸序列包含诸多保守以及非保守组氨酸残基，并且组氨酸残基在VISTA ECD中的频率远高于其他B7家族成员和其他免疫球蛋白超家族成员。(参见图1A和1B。)在溶液中，氨基酸组氨酸具有约6.5的pKa，这意味着在或低于pH 6.5下蛋白质内的组氨酸残基通常发生质子化且由此带正电，而在pH高于pH 6.5时其越加未质子化且具有中性电荷。肿瘤微环境和发炎组织通常是酸性，并且由此发现于这些微环境中的VISTA蛋白可至少部分地在其组氨酸残基处发生质子化。如本文所论述，发明人已假设，组氨酸质子化可影响VISTA的构象、表面结构和/或电荷密度，这反过来可产生用于受体-配体相互作用和抗体结合的pH特异性或pH选择性表位。使用在酸性pH结合但在中性或生理pH不结合的抗体靶向VISTA可防止经由循环和淋巴样器官驻留性粒单核细胞进行的靶标介导的药物体内处置(disposition)，从而改善抗体PK、受体占据和肿瘤微环境中的活性。在诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和有效载荷(抗体-药物缀合物)递送等治疗方式的情形中，酸性pH选择性抗体也可改善VISTA抗体对肿瘤内(而非循环)靶细胞的特异性。
附图说明
使本申请要求优先权权益的美国临时申请含有至少一张彩图。假设临时申请随后可供公众使用，则在要求并支付必要费用之后可自美国专利和商标局(United StatesPatent and Trademark Office)获得带彩图的复本。
图1A-1C显示，VISTA的细胞外结构域含有格外高频率的组氨酸残基，这些组氨酸残基中的许多是保守的，并且这些组氨酸残基中的至少一些可参与受体-配体结合。图1A显示含有免疫球蛋白结构域的蛋白质的图形，其中每种蛋白质的细胞外结构域氨基酸残基的数量绘示于x轴上，并且每种蛋白质的细胞外结构域内的组氨酸残基的频率绘示于y轴上。每个数据点的大小对应于每种蛋白质的细胞外结构域中的组氨酸残基的总数。图1B显示人VISTA、食蟹猕猴VISTA和小鼠VISTA的细胞外结构域的比对氨基酸序列。标记出信号肽(Sig)和跨膜结构域(TMD)序列位置。所有三个物种中的保守组氨酸残基都以粗体和下划线显示；人和食蟹猕猴中的保守组氨酸残基仅以粗体显示。图1C显示人VISTA免疫球蛋白结构域的三维结构的模型。组氨酸残基绘示为球和棍迹线。
图2A-2B显示其中VISTA细胞外结构域中的组氨酸残基赋予针对酸性pH而非生理pH的反受体选择性的模型。图2A显示组氨酸残基中的吡咯铵基团(NH)在缺乏质子化和存在质子化之间的平衡。溶液中的组氨酸的pKa为6.5，从而指示组氨酸残基相对于较高pH在pH6.5和更低下更可能质子化，并且由此带正电。图2B显示显示其中VISTA在酸性pH选择性接合P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)或其他反受体和配体(“VISTA-R”)的模型。因此，在酸性pH而非在生理pH结合至VISTA的细胞外结构域的抗体可对于抑制或调节VISTA活性至关重要。
图3显示肿瘤浸润性巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、CD4+效应T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞上的VISTA表面表达程度(抗VISTA抗体染色的平均荧光强度(MFI))。VISTA表达于许多肿瘤浸润性白细胞、尤其髓系细胞上。肿瘤微环境通常是酸性，从而使得VISTA能够接合反受体和配体。
图4A-4G显示，VISTA选择性在酸性pH结合至白细胞和PSGL-1且在中性pH具有较小结合或并无结合，并且此结合可由抗VISTA抗体阻断。图4A在左侧显示结合至活化人CD4+ T细胞的荧光缀合的重组VISTA多聚体的代表性直方图。自较深灰色至较浅色，填充直方图绘示在pH 7.0、6.5、6.4、6.3、6.1和6.0下的结合。一些直方图用其相应pH标记。pH 6.0下的非VISTA对照多聚体结合显示为未填充直方图。在右侧，将在不同pH下结合至来自两种供体的活化人CD4+ T细胞的VISTA(圆形)和对照(三角形)多聚体的平均MFI绘图。图4B显示在pH6.0和pH 7.4下结合至外周血单核细胞(PBMC)的重组VISTA多聚体的代表性直方图。自较深灰色至较浅色，填充直方图绘示在pH 6.0下结合至CD19+ B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD56+NK细胞和CD14+单核细胞。未填充实线边界和未填充虚线边界直方图分别绘示在pH7.4下结合至总PBMC淋巴细胞和单核细胞。图4C显示在抗VISTA阻断性抗体(正方形)或非VISTA特异性同种型匹配对照抗体(圆形)存在下结合至活化人CD4+ T细胞的代表性重组VISTA多聚体。抗体浓度是以对数标度绘示。也显示非线性回归。三角形绘示来自未经重组VISTA多聚体染色的活化人CD4+T细胞的背景信号。图4D显示在pH 6.0下结合至经转染以表达人PSGL-1的硫酸乙酰肝素缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(细胞系pGSD-677，美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection))的重组VISTA多聚体的代表性二维流式细胞术绘图。在存在和不存在图4C中所显示的抗VISTA阻断性抗体下实施多聚体结合。未由重组VISTA多聚体染色的细胞显示为对照。PSGL-1抗体染色绘示于y轴上，并且VISTA多聚体染色绘示于x轴上。图4E显示在pH 6.0和pH 7.4下结合至小鼠脾细胞的重组小鼠VISTA-Fc融合蛋白的代表性直方图。自较深灰色至较浅色，填充直方图绘示在pH 6.0下结合至CD8+ T细胞、CD11b+髓系细胞和CD4+ T细胞。未填充直方图绘示在pH 7.4下结合至总脾细胞。图4F和4G显示，VISTA多聚体分别结合至单核细胞和中性粒细胞，并且在pH 6.0的结合强于在pH 7.4的结合。
图5A-5D显示，VISTA优先在酸性pH介导T细胞抑制和细胞：细胞粘附，并且两种效应都可经抗VISTA阻断性抗体回复。图5A显示表达hVISTA的293T细胞或载体对照(绘示于y轴上)和内源性表达细胞表面硫酸乙酰肝素的CHO细胞(在x轴上)之间在pH 6.0和7.0下的代表性细胞：细胞缀合物形成。图5B是相同细胞之间在pH 6.0下在抗VISTA阻断性抗体、抗VISTA非阻断性抗体或同种型匹配非VISTA特异性对照抗体存在下所形成细胞缀合物的频率的图形。图5C显示通过表达NFkB荧光素酶报告基因的Jurkat(人T细胞系)细胞在各种pH下与表达h VISTA和抗人T细胞受体激动剂抗体OKT3的单链可变片段的293T细胞(“人工抗原提呈细胞”)共培养之后所生成荧光素酶活性的代表性绘图。将抗VISTA阻断性抗体(正方形)或同种型匹配非VISTA特异性对照抗体(圆形)添加至共培养细胞中。在图5D中，将图5A中所显示的数据绘示为使用抗VISTA抗体治疗相对于对照的荧光素酶信号的倍数增加(“效应大小”)。
图6A-6G显示，VISTA可发现于细胞内内体、尤其Rab11+再循环内体中，并且可经由内体运输再循环进出细胞表面。图6A显示VISTA、Rab5(早期内体标记物)、Rab7(晚期内体标记物)和Rab11(再循环内体标记物)在表达人VISTA的293T细胞内的共定位。图6B显示VISTA和Rab11在人单核细胞内的共定位。细胞内VISTA与Rab11+再循环内体共定位。与VISTA抗体为相同同种型的非VISTA结合对照抗体(“cAb”)并不可检测地结合单核细胞。图6C显示三种抗VISTA抗体与重组VISTA在pH 7.4(黑色)、6.7(较深灰色)和6(较浅灰色)下的结合。图6D显示相同抗VISTA抗体1(倒三角形)、2(圆形)、3(正方形)或具有组织蛋白酶B敏感性接头和细胞毒性有效载荷的非VISTA特异性对照抗体(三角形)杀伤表达VISTA的急性髓系白血病(AML)细胞系的易感性。将细胞活力(CellTiter-Glo LU)绘示于y轴上且将抗体浓度绘示于x轴上。图6E比较抗VISTA抗体3与在酸性pH不展现受损结合的经工程化变体(“VISTA mAb3c”)的hVISTA结合。图6F显示比较抗VISTA抗体3(正方形)和3c(菱形)的效能的抗体药物缀合物测定。图6G显示内体运输的示意图，其中VISTA经由早期内体和再循环内体再循环进出细胞表面。
图7A-7F显示设计和筛选抗VISTA抗体变体库以获得酸性pH选择性抗体的方式。图7A显示在抗人VISTA抗体克隆P1-061029(缩写为‘029)的VH CDR 3中所进行用于产生筛选用‘029库的氨基酸取代。为潜在地改善在酸性pH与VISTA的富集组氨酸区域的结合，所述库容许取代带负电氨基酸天门冬氨酸盐和谷氨酸盐以及pH反应性组氨酸。X＝H、D或E。在合成中去除加括号序列以避免引入易患性。合成具有1-2个突变的P1-061029HCDR3的总共647个独特序列。图7B显示叠代性筛选和选择‘029库的酸性pH选择性抗体变体的程序。R表示选择轮数。图7C显示展现9轮选择后的变体池的代表性二维流式细胞术绘图数据。VISTA结合绘示于y轴上，并且变体抗体表达绘示于x轴上。显示在各种抗体浓度和pH下的结合数据。图7D显示P1-061029和其子代克隆在pH 6.0和7.4下与人VISTA的结合的图。图7E显示P1-061029和其子代克隆与人VISTA在pH 6.0下的解离速率的图。图7F显示抗体P1-068761、P1-068767和P1-061029与人VISTA在pH 6.0和pH 7.4下的SPR结合数据。
图8A-8F显示VISTA抗体P1-068761和P1-068767的酸性pH选择性细胞结合、阻断和效应活性。图8A和图8B显示结合至异位表达人VISTA的Raji细胞的酸性pH选择性抗体P1-068761(图8A)和P1-068767(图8B)的平均荧光强度。将细胞在大约pH 6.0(圆；图8A中的最高曲线)、6.1(正方形；第三高曲线)、6.2(三角形；第二高曲线)、6.4(倒三角形；第四高曲线且靠近pH 6.1曲线)、6.6(菱形；自底部的第四曲线)、7.0(圆；自底部的第三曲线)、7.2(正方形；自底部的第二曲线)和8.1(未填充三角形；图8A中的底部曲线)下染色。使用荧光缀合的抗人IgG二抗检测结合。图8C显示P1-068767(圆形)和同种型匹配非特异性对照抗体(三角形)在各种pH下与异位表达3125ng/mL人VISTA的Raji细胞的结合。“pH50”(损失50％的P1-068767结合的pH)大约为6.6。图8D显示结合至人单核细胞的同种型匹配非特异性对照抗体(pH 7.0和6.0分别为填充圆和未填充圆)、抗VISTA mAb 2(“对照”，参见图6C，pH 7.0和6.0分别为填充正方形和未填充正方形)、P1-068761(pH 7.0和6.0分别为填充三角形和未填充三角形)和P1-068767(pH 7.0和6.0分别为填充倒三角形和未填充倒三角形)的平均荧光强度(MFI)。通过荧光缀合的抗人IgG二抗检测结合。图8E显示P1-061029(正方形)、P1-068761(三角形)和P1-068767(倒三角形)在pH 6.0下对结合至活化人CD4+ T细胞的重组VISTA多聚体的相当的阻断，而非VISTA特异性对照抗体(圆形)并不阻断VISTA结合。图8F显示P1-068761(三角形)和P1-068767(倒三角形)在生理pH介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的减小的效能。还显示P1-061029(正方形)、非VISTA特异性阳性对照抗体(圆形)和非VISTA特异性阴性对照抗体(菱形)。靶细胞的NK细胞特异性裂解(以总靶细胞的百分比的形式)绘示于y轴上且抗体浓度绘示于x轴上。还显示非线性回归。
图9显示酸性pH选择性抗VISTA抗体在食蟹猕猴中的增强的药代动力学(PK)。所述图显示经VISTA抗体2(“对照”，圆，参见图6C)、VISTA抗体3(“酸性pH敏感性”，正方形，参见图6C)或P1-068767(三角形)治疗的食蟹猕猴中的随时间的血清抗体浓度。
图10A和10B显示酸性pH选择性抗VISTA抗体‘761和‘767中的突变的结合效应。图10A显示P1-068761回复突变体在pH 7.4、pH 6.7和pH 6.0下的动力学结合数据和其回复突变相对于P1-068761的位置。图10B显示P1-068767回复突变体在pH 7.4、pH 6.7和pH 6.0下的动力学结合数据和其回复突变相对于P1-068767的位置。
图11A-11C显示各种抗VISTA抗体的表位分箱(epitope binning)和作图。图11A显示P1-068761和P1-068767与P1-061029和VISTA抗体对照相比的VISTA表位竞争。图11B和图11C显示阻断性hVISTA抗体(图11B)与非阻断性hVISTA抗体(mAb1；图11C)相比的所有残基的表位(如表14中所列示)。氨基酸残基66(H)和162(A)用于表示分子定向。组氨酸残基呈灰色，并且表位残基呈黑色。
图12A-12C显示下列各项的成像毛细管等电聚焦(icIEF)数据：图12A：P1-061029，图12B：P1-068761，和图12C：P1-068767。指示主要物质(pI主要)以及pI标记物的等电点。
图13A和13B显示‘029和‘015子代克隆的可变区的比对。图13A显示‘029和其子代克隆的可变区的氨基酸序列的比对。图13B显示‘015和其子代克隆的可变区的氨基酸序列的比对。
图14显示含有和不含K16R和T84A取代的P1-068761的VH序列的比对。双下划线残基显示框架区的位置16和84且阴影部分显示CDR。
图15A-15O：向野生型C57BL6小鼠植入MC38肿瘤并使用非结合性同种型匹配对照抗体(黑色正方形)、小鼠VISTA阻断性抗体VISTA.10(向上三角形)、小鼠PD-1阻断性抗体(正方形)或VISTA和PD-1阻断性抗体的组合(向下三角形)进行治疗。所有抗体都是小鼠IgG1-D265A(Fc-惰性)同种型。(参见图15A-15D。)这些数据代表三个独立实验。图15A-15D显示随时间的肿瘤体积。n＝10/组。“TF”表示排斥肿瘤的小鼠。图15E和15F显示在开始治疗之后7天肿瘤内CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的频率。n＝5/组。单因子ANOVA以及邓尼特多重比较(Dunnett’s multiple comparison)，P＝0.0001。图15G和15H示出图15A-15D中所示的个体小鼠的结果。图151：向VISTA敲除小鼠和野生型同胎幼仔植入MC38肿瘤并使用非结合性同种型匹配对照抗体(上方的两条曲线0/7TF和0/5TF，使用圆和向下三角形标志)或小鼠PD-1阻断性抗体(下方的两条曲线0/5TF和5/8TF，使用正方形和向下三角形标志)进行治疗。邻接每条曲线显示中值肿瘤生长和在研究结束时无肿瘤(TF)小鼠的数量与小鼠总数(例如0/7TF)。这些数据代表两个独立实验。误差棒绘示四分位距。图15J-15M显示植入MC38肿瘤并使用非结合性同种型匹配对照抗体(图15J)、小鼠PD-1阻断性抗体(图15K)、小鼠PD-1阻断性抗体和非pH选择性人VISTA阻断性抗体P1-061029的组合(图15L)或小鼠PD-1阻断性抗体和酸性pH选择性人VISTA阻断性抗体P1-068767的组合(图15M)治疗的人VISTA敲入(KI)小鼠的肿瘤体积。所有抗体都是小鼠IgG1-D265A同种型。显示随时间变化的肿瘤体积。n＝5-8/组。这些数据代表一个独立实验。图15N显示在经静脉内注射5mg/kg P1-061029(WT，向下三角形；KI，正方形)或P1-068767(WT，向上三角形；KI，菱形)之后人VISTA KI和野生型同胎幼仔(WT)小鼠血清抗体浓度。P1-061029和P1-068767在KI小鼠中的计算血清平均滞留时间(MRT)据估计分别为4.1小时和71小时。针对每种抗体，n＝4只KI小鼠和1-2只WT小鼠。这些数据代表单一实验。图150显示在经静脉内注射5mg/kg VISTA.4(圆形)或P1-068767(正方形)之后的食蟹猕猴血清抗体浓度。VISTA.4和P1-061029的计算血清平均滞留时间(MRT)据估计分别为7.6小时和717小时。n＝1只猕猴/抗体。这些数据代表单一实验。若未另外指示，则误差棒绘示平均值的标准误差。
图16A-16C显示在开始治疗之后7天PD-1(图16A)、LAG-3(图16B)和TIM-3(图16C)的肿瘤内CD8+ T细胞表达的代表性直方图。误差棒绘示平均值的标准误差。
图17A-17C显示，VISTA在酸性pH结合至PSGL-1且此相互作用由VISTA抗体P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4阻断。图17A显示在pH 6.0和pH 7.4下结合至捕获PSGL1的P-选择素-Fc和VISTA-Fc的BLI结合传感图。图17B是显示抗体P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4抑制PSGL-1与hVISTA的结合的直方图。图17C显示VISTA.4(向上三角形)和抗PSGL-1抗体KPL-1(圆形)对VISTA-Fc与CHO-PSGL-1细胞的结合的抗体阻断。这些数据代表两个独立实验。误差棒绘示平均值的标准误差。
图18A-18E显示P1-068767Fab和hVISTA、或(在图18E中)非阻断性抗体VISTA.5和hVISTA的共晶体结构的代表图。VISTA IgV结构域的特征在于其中心β折叠的异常、富集组氨酸延伸区。VISTA IgV结构域与P1-068767抗原结合片段(Fab)共结晶。在
分辨率下测定VISTA+P1-068767复合物的晶体结构。图18A显示VISTA IgV结构域：P1-068767 Fab共晶体结构。图18A显示VISTA IgV结构域与P1-068767 Fab的复合物的整体结构(重链，深灰色；轻链，浅灰色)。图18B显示VISTA和PD-L1 IgV结构域的叠加。VISTA组氨酸残基以棍图绘示。图18B显示，VISTA IgV结构域拥有异常富集组氨酸β折叠延伸。图18C显示如由VISTA+P1-068767晶体结构揭示的P1-068767表位的分子表面(浅灰色静电表面)。图18C显示，阻断性抗体结合至VISTA的富集组氨酸β折叠延伸。图18D显示VISTA(灰色丝带卡通，其中以棍图绘示表位残基H121、H122和H123)和P1-068767(绘示为静电表面，其中其残基E100和D102呈棍图形式)之间的界面的放大视图。图18D显示，酸性pH选择性P1-068767使用酸性残基接合VISTA组氨酸。图18E显示，非阻断性抗体VISTA.5在与P1-068767不同的hVISTA区域结合。
图19显示如通过MS-HDX(MS迹线)测定的VISTA.4的表位。
图20显示基于图19中的数据的hVISTA氨基酸序列中的VISTA.4表位的位置。图19中也突出显示的残基57-68、86-97和148-165在图20中以较浅灰色文字和下划线绘示。
图21A和21B显示在pH 6.0下于抗体VISTA.4(三角形)、VISTA.5(正方形)和非VISTA结合抗体(对照，圆)存在下结合至活化人CD4+ T细胞的VISTA多聚体。图21B显示每种抗体相对于非阻断T细胞的阻断效率。单因子ANOVA以及邓尼特多重比较，***，P＜0.001。这些数据代表4个以上的独立实验。误差棒绘示平均值的标准误差。
图22显示，在酸性pH阻断VISTA结合的抗体是功能性的。阻断性抗体VISTA.4(正方形)、非阻断性抗体VISTA.5(三角形)和非VISTA结合(对照，圆)抗体对与经工程化以表达VISTA和TCR激动剂的293T细胞(293T-OKT3-VISTA)一起共培养的人CD4+ T细胞的增殖(图22A)和干扰素γ产生(图22B)的效应。单因子ANOVA以及邓尼特多重比较，*，P＜0.05。这些数据代表4个以上的独立实验。
图23显示在与293T-OKT3-VISTA细胞共培养后在不同pH下VISTA.4阻断对JurkatT细胞活化的效应(通过测量NF-kB抑制)。这些数据代表三个独立实验的组合。
图24显示pH对人CD4+ T细胞的VISTA抑制的效应。在指示pH下使用板涂覆OKT3和VISTA-Fc在VISTA.4(向上三角形)、VISTA.5(向下三角形)或非VISTA结合抗体(抗体对照，正方形)存在下刺激细胞。还显示使用板涂覆OKT3和对照IgG(VISTA对照，黑色圆)或不使用OKT3(无OKT3，灰色菱形)刺激的细胞。这些数据代表一个独立实验。
图25A-25E显示，通过组氨酸和磺基酪氨酸残基测定VISTA:PSGL-1结合特异性。如图25A中所显示，在具有或不具有唾液酰基路易斯(1ewis)X修饰(分别为SLX+和SLX-)的细胞中产生人PSGL-1 19聚体-Fc重组蛋白。显示所指示VISTA-Fc和P-选择素-Fc在pH 6.0(白色)和7.4(黑色)下的BLI结合强度。数据代表单一独立实验。如图25B中所显示，使用唾液酰基路易斯X修饰产生的人PSGL-1 19聚体-Fc糖肽分离成具有大于90％酪氨酸硫酸化(sY-富集)和小于1％酪氨酸硫酸化(sY-缺乏)的部分。显示所指示VISTA-Fc和P-选择素-Fc在pH6.0(白色)和7.4(黑色)下的BLI结合强度。这些数据代表单一独立实验。如图25C-25D中所提供，产生人VISTA-Fc重组蛋白，其中位置153-155的组氨酸残基保持完整(WT VISTA)或由丙氨酸(H2A突变体)、天门冬氨酸(H2D突变体)或精氨酸(H2R突变体)代替。图25C显示在pH6.0和7.4下结合至捕获PSGL-1的野生型和突变VISTA-Fc蛋白的BLI结合强度。这些数据代表单一实验。图25D显示WT VISTA(圆形)、H2A突变体(正方形)、H2D突变体(向下三角形)和H2R突变体(灰色向上三角形)以及对照(菱形)在pH 6.0下与CHO-PSGL-1细胞的VISTA-Fc结合。这些数据代表两个独立实验。图25E显示PSGL-1 19聚体糖肽(顶部)与VISTA的富集组氨酸配体界面(灰色丝带，底部)的复合物的计算模型。标记出VISTA残基H98、H100、H153和H154。还标记出PSGL-1残基Y46、Y48、E56、T57和Y58。
具体实施方式
定义
在本申请中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。在多项从属权利要求的背景中，所用的“或”仅以替代形式重新提及一个以上前述独立或从属权利要求。术语“包括”、“包含”和“具有”可在本文中互换使用。根据本发明，“经分离”分子是已自其天然环境取出的分子。因此，术语“经分离”未必反映分子的纯化程度。
术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物，并且并不限于最小长度。“蛋白质”可包括一个或多个多肽。此类氨基酸残基聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括(但不限于)肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质和其片段均被所述定义涵盖。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化和诸如此类。另外，出于本发明目的，“多肽”或“蛋白质”分别是指包括关于天然序列的修饰(例如缺失、添加和取代(通常是保守性质))的多肽或蛋白质，只要所述蛋白质维持期望活性即可。这些修饰可为特意的(如经由定点诱变)，或可为偶然的(例如经由宿主突变，这会因PCR扩增而产生蛋白质或误差)。蛋白质可包含两个或更多个多肽。
“VISTA”是含有V-结构域免疫球蛋白的T细胞活化抑制蛋白的缩写，其是免疫检查点调节因子的B7家族的成员。VISTA也称为PD-1同系物(PD1H)、B7-H5、C10orf54、ESC-1分化物(Dies-1)、血小板受体Gi24前体和死亡结构域1α(DD1α)。本文的术语“hVISTA”或“huVISTA”是指人VISTA蛋白。hVISTA(包括其信号肽)的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：1中，而不含信号肽的序列提供于SEQ ID NO：2中。(参见下文的序列表。)VISTA的细胞外结构域或“ECD”或“VISTA-ECD”是指VISTA蛋白中位于细胞外空间中的部分，其在hVISTA的情形下包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-162。(也参见图1B。)hVISTA的“IgV结构域”部分包含SEQ IDNO：2的残基5-135。
术语“前导肽”或“前导序列”是指位于多肽N末端的促进多肽自哺乳动物细胞分泌的氨基酸残基序列。前导序列可在将多肽自哺乳动物细胞输出后裂解，从而形成成熟蛋白质。前导序列可为天然或合成序列，并且其可与其所附接的蛋白质异源或同源。
术语“抗体”或“Ab”在本文中以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现期望的抗原结合活性。如本文中所使用，所述术语是指包含至少重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3和至少轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够结合至抗原。术语抗体包括(但不限于)能够结合抗原的片段(例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2)。术语抗体还包括(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和各种物种(例如小鼠、食蟹猕猴等)的抗体。
术语“重链”或“HC”是指至少包含重链可变区且含有或不含前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区的多肽，其含有或不含前导序列且含有或不含C-末端赖氨酸(K)。
术语“重链可变区”或“VH”是指包含重链的重链互补决定区(CDR)1、框架区(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。如下文所指定，在一些实施方案中，重链CDR1包含本文的VH SEQ ID NO的残基26-35；重链CDR2包含本文的VH SEQ ID NO的残基50-66，并且重链CDR3包含本文的VHSEQ ID NO的残基99-110。在其他实施方案中，若指定，则重链CDR1对应于Kabat残基31至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；并且重链CDR3对应于Kabat残基95至102。例如参见Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)。在一些实施方案中，重链CDR是如本文在(例如)下文序列表或表2中所指定。
术语“轻链”或“LC”是指至少包含轻链可变区且含有或不含前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区且含有或不含前导序列的多肽。
术语“轻链可变区”或“VL”是指包含轻链CDR1、FR2、HVR2、FR3和HVR3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FRI和/或FR4。如下文所指定，在一些实施方案中，轻链CDR1包含本文的VL SEQ ID NO的残基24-35；轻链CDR2包含本文的VL SEQ ID NO的残基51-57，并且轻链CDR3包含本文的VL SEQ ID NO的残基90-98。在其他实施方案中，若指定，则轻链CDR1对应于Kabat残基24至34；轻链CDR2对应于Kabat残基50至56；并且轻链CDR3对应于Kabat残基89至97。例如参见Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)。在一些实施方案中，轻链CDR是如本文在(例如)序列表中所指定。
“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种、而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体是指包含至少一个来自第一物种(例如小鼠、大鼠、食蟹猕猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(例如人、食蟹猕猴等)的恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猕猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区是来自第一物种且嵌合抗体的所有恒定区是来自第二物种。
“人源化抗体”是指非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸经来自人可变区的相应氨基酸代替的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体是Fab、scFv、(Fab’)2等。
本文所用的“人抗体”是指在人中产生的抗体、在非人动物中产生的包含人免疫球蛋白基因的抗体(例如
)和使用体外方法(例如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体谱是基于人免疫球蛋白序列。
本文所用的“VISTA抗体”或“抗VISTA抗体”是指在至少一些条件(例如酸性pH)下特异性结合至VISTA的抗体。在一些实施方案中，抗体可为“huVISTA抗体”或“抗huVISTA抗体”，这指示其在至少一些条件下(例如在酸性pH)特异性结合至人VISTA蛋白。举例而言，特异性结合至VISTA的细胞外结构域(ECD)的VISTA抗体可称为“VISTA-ECD抗体。”
在一些实施方案中，本文的抗体与特定、指定序列相比可含有一个或多个“保守取代”。本文的“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，本文抗体中的预测非必需氨基酸残基经来自相同侧链家族(例如碱性、酸性、β分枝、芳香族、不带电极性)的另一氨基酸残基代替。鉴别核苷酸和不消除抗原结合的氨基酸保守取代的方法已阐述于(例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))中。
在一些实施方案中，抗体可在酸性pH而非中性和/或生理pH以较高亲和力结合至VISTA。在一些实施方案中，抗体可在酸性pH以较高亲和力结合至VISTA且可在中性和/或生理pH仅可忽略地或非特异性地结合。
抗体结合蛋白质(例如VISTA-ECD蛋白)的“KD”或“解离常数”是抗体与蛋白质(例如VISTA-ECD蛋白)的亲和力或特异性结合的量度。较低KD指示相对于较高KD具有改善的结合或亲和力。KD是指抗体和多肽的“解离速率”或k解离或kd和“缔合速率”或k缔合或ka之间的比率。解离速率和缔合速率是两个结合配偶体在系统中缔合和解离的速率。因此，较缓慢解离速率(其中缔合速率保持大致恒定)产生较高整体亲和力且由此产生较低KD。如本文中所使用，特定值“或更小”的k解离指示，k解离或“解离速率”是如所指定或慢于指定速率。
术语“特异性结合(specific binding或specifically binds)”或类似术语表示，两种多肽(例如抗体和其多肽靶)的结合的KD小于存在于相同条件下的两种随机多肽之间的情形。换句话说，KD小于由多肽在系统中的非特异性聚集所致者。
在一些实施方案中，抗体在特定pH或pH范围特异性结合至VISTA-ECD蛋白。本文的“酸性”pH通常是指小于7.0的pH，“碱性”pH通常是指高于7.0的pH且“中性”pH通常是指约7.0的pH。本文的“生理pH”是指正常(即非癌性)生理条件中的pH，例如7.35至7.45或7.3至7.4，例如约7.4。本文中的诸如“在酸性条件中结合”或“在生理条件中结合”和诸如此类等片语(用于诸如VISTA和VISTA结合配偶体或VISTA和T细胞等两种分子的结合的背景中)是指分别在酸性pH中结合和在生理pH中结合。
在提及“阻断配体(或受体)或竞争抗体与受体(或配体)单独或在细胞上的结合”或“抑制所述结合”的抗体时，若与对照相比存在统计学显著的整体降低(例如50％或更大的整体降低，例如75％、80％、85％、90％、95％或更大的整体降低)，则结合被阻断。举例而言，“抗VISTA阻断性抗体”是可在至少一些条件下(例如在酸性pH)阻断VISTA结合至PSGL-1或另一VISTA配体或受体或硫酸乙酰肝素蛋白多糖者。
本文所用的“肿瘤模型”是指体内临床前测定，其可用于研究VISTA-ECD抗体的生物活性，并且包括异种移植物或天然小鼠肿瘤测定系统。在一些情形下，肿瘤模型可容许在使用抗体治疗时追踪肿瘤大小或生长和/或追踪肿瘤中的免疫细胞(例如特定类型的T细胞或NK细胞)的存在以测定抗体是否已触发或增强免疫反应。
本文所用的术语“免疫刺激剂”是指通过用作免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂或用作免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂来刺激免疫系统的分子。免疫刺激分子或免疫抑制分子可为免疫检查点调节因子，例如VISTA或另一B7家族成员或如下文另外阐述的另一分子。免疫刺激剂可为生物剂(例如抗体或抗体片段、其他蛋白质或疫苗)，或可为小分子药物。“免疫刺激分子”包括用于增强、刺激、诱导或另外“开启”免疫反应的受体或配体。如本文所定义的免疫刺激分子包括共刺激分子。“免疫抑制分子”包括用于减小、抑制、压制或另外“关断”免疫反应的受体或配体。如本文所定义的免疫抑制分子包括共抑制分子。此类免疫刺激分子和免疫抑制分子可为(例如)发现于免疫细胞(例如T细胞)上或发现于涉及先天性免疫性的细胞(例如NK细胞)上的受体或配体。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列并引入空位(若需要)以达到最大序列同一性百分比后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以所属领域技术人员所熟知的各种方式来达到，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。所属领域技术人员可测定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长范围内达到最大比对所需的任何算法。
术语“触发”或“增强”是指引发或增加任一事件(例如蛋白质配体结合)或引发或增加任一生物活性(例如免疫反应)或表型特性或引发或增加活性或特性的发生、程度或可能性。“触发”或“增强”是与参考相比开始或增加活性、功能和/或量。触发或增强未必是完全的。举例而言，在某些实施方案中，“增强”意指能够引起20％或更大的整体增加。在另一实施方案中，“增强”意指能够引起50％或更大的整体增加。在又一实施方案中，“增强”意指能够引起75％、85％、90％、95％或更大的整体增加。
术语“抑制(inhibition或inhibit)”更通常是指降低或中止任一事件(例如蛋白质配体结合)或降低或中止任一表型特性或降低或中止特性的发生、程度或可能性。“减小”或“抑制”是与参考相比降低、减小或阻止活性、功能和/或量。抑制或减小未必是完全的。举例而言，在某些实施方案中，“减小”或“抑制”意指能够引起20％或更大的整体降低。在另一实施方案中，“减小”或“抑制”意指能够引起50％或更大的整体降低。在又一实施方案中，“减小”或“抑制”意指能够引起75％、85％、90％、95％或更大的整体降低。
本文所用的“治疗”涵盖用于人疾病的任一治疗剂施用或施加，并且包括抑制疾病或疾病或一种或多种疾病症状的进展，抑制或减缓疾病或其进展或一种或多种其症状，阻止其发展，部分地或完全减轻疾病或一种或多种其症状，或预防一种或多种疾病症状的复发。
术语“受试者”和“患者”可在本文中互换使用且是指人。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指有效治疗受试者的疾病或病症(例如直至部分地或完全减轻一种或多种症状)的药物量。在一些实施方案中，“有效量”是指在所需剂量和时间段内有效达到期望治疗或预防结果的量。
术语“癌症”在本文中用于是指展现异常高程度的增殖和生长的细胞群。癌症可为良性(也称为良性肿瘤)、恶化前或恶性。癌细胞可为实体癌细胞或白血病癌细胞。术语“肿瘤生长”在本文中用于是指包括癌症的一个或多个细胞的增殖或生长，所述增殖或生长导致癌症的大小或程度发生相应增加。
适用于本文治疗方法的癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、涎腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌)。
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任一顺序同时(并行)和连续(依序)施用。
“药学上可接受的载剂”是指业内常与治疗剂一起使用且一起构成用于施用给受试者的药物组合物的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料、配方助剂或载剂。药学上可接受的载剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒且与配方的其他成份相容。药学上可接受的载剂适用于所采用配方。举例而言，若治疗剂拟口服施用，则载剂可为凝胶胶囊。若治疗剂拟经皮下施用，则载剂理想地对皮肤无刺激性且不引起注射位点反应。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。可在本文方法中施用的化学治疗剂的实例包括(但不限于)烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和
环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)和尿多巴(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包括其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(例如参见Agnew，ChemIntl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatrexate)；地磷酰胺(defosfamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(eflomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦辛(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamef)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verrucarin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类(taxoids)，例如
太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、
太平洋紫杉醇的无克列莫佛(Cremophor)、白蛋白工程化纳米颗粒配方(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
多西他赛(docetaxel)(
-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；
长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素(retinoids)，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)
)和减小细胞增殖的VEGF-A；和上述物质中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
可在本文方法中施用的其他非限制性实例性化学治疗剂包括用于调控或抑制对癌症的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素制剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
托瑞米芬(toremifene)；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调控肾上腺中雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、
伏罗唑(vorozole)、
来曲唑(letrozole)和
阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制剂(例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二噁烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制贴壁细胞增殖中涉及的信号传导途径中的基因表达者，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法疫苗，例如
疫苗、
疫苗和
痰苗；
rIL-2；
拓扑异构酶1抑制剂；
rmRH；和上述物质中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”是指直接或间接抑制血管生成、血管发生或不期望血管通透性的小分子量物质、多核苷酸(例如包括抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。应理解，抗血管生成剂包括那些结合血管生成因子或其受体且阻断其血管生成活性的剂。举例而言，可在本文方法中施用的抗血管生成剂可包括血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如VEGF-A抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab)
)或VEGF-A受体(例如KDR受体或Fit-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂(例如
(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、
/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinibmalate))、AMG706或阐述于(例如)国际专利申请WO 2004/113304中者)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑素(angiostatin)、内皮抑素等。例如参见Klagsbrun和D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit和Detmar(2003)Oncogene 22：3172-3179(例如列示恶性黑色素瘤中的抗血管生成疗法的表3)；Ferrara&Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12)：1359-1364；Tonini等人(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列示已知抗血管生成因子的表2)；和Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(例如列示用于临床试验中的抗血管生成剂的表1)。
本文所用的“生长抑制剂”是指在体外或在体内抑制细胞(例如表达VEGF的细胞)的生长的化合物或组合物。因此，可在本文方法中施用的生长抑制剂可为显著减小S期的细胞(例如表达VEGF的细胞)的百分比者。生长抑制剂的实例包括(但不限于)阻断细胞周期进展(在除S期外之处)的剂，例如诱导G1阻滞和M期阻滞的剂。经典M期阻断剂包括长春花提取物(vinca)(长春新碱和长春碱)、紫杉烷(taxane)和拓扑异构酶II抑制剂(例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素)。那些阻滞G1的剂也进一步阻滞S期，例如DNA烷基化剂，例如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其他信息可参见Mendelsohn和Israel编辑，The Molecular Basis ofCancer，第1章，标题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplasticdrugs”，Murakami等人(W.B.Saunders，Philadelphia，1995)，例如p.13。紫杉烷(太平洋紫杉醇和多西他赛)是均衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(
Rhone-Poulenc Rorer)是太平洋紫杉醇(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。太平洋紫杉醇和多西他赛促进微管自微管蛋白二聚体的组装并通过防止解聚而使微管稳定，这可抑制细胞有丝分裂。
术语“抗赘生组合物”是指可用于治疗癌症的包含至少一种活性治疗剂的组合物。举例而言，治疗剂的实例包括(但不限于)化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法中的剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂和用以治疗癌症的其他剂(例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼
血小板源生长因子抑制剂(例如
(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、干扰素、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA抗体伊匹单抗(ipilimumab)
)、PD-1或PD-L1抑制剂(例如
)、TIM3抑制剂(例如抗TIM3抗体)、细胞因子、结合至下列靶ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、CTLA4、TIM3或VEGF受体中的一者或多者的拮抗剂(例如中和抗体)、TRAIL/Apo2和其他生物活性与有机化学剂等)。其组合也包括在本公开中。
在酸性pH特异性结合至VISTA-ECD的抗体
因为VISTA在其细胞外结构域(ECD)中具有大量组氨酸残基，所以其折叠和整体结构以及可用于结合配体(例如抗体)的表面可在酸性pH与中性pH、尤其近pH 6.5(其是组氨酸的pKa)有所不同。因为肿瘤微环境通常是酸性，所以为结合至那些微环境中的VISTA，抗体可能需要在酸性pH特异性结合至VISTA，其中至少一些表面组氨酸残基更可能发生质子化。
下文序列表提供分别含有或不含信号肽的人VISTA(hVISTA)(SEQ ID NO：1和SEQID NO：2(成熟hVISTA))的氨基酸序列。信号肽构成SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-32。细胞外结构域(ECD)由SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-162组成)。IgV结构域构成SEQ ID NO：1的氨基酸残基37-167和SEQ ID NO：2的氨基酸残基5-135。茎部(stalk)区域位于SEQ ID NO：1的氨基酸残基172-194和SEQ ID NO：2的氨基酸残基136-162处；跨膜结构域位于SEQ ID NO：1的氨基酸残基195-216和SEQ ID NO：2的氨基酸残基163-184处。SEQ ID NO：1的氨基酸残基187和SEQ ID NO：2的155(粗体且加下划线)可为D或E，其代表hVISTA中的多态性。所述残基以粗体显示且加下划线。因此，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2涵盖所述残基处的两种人多态性。VISTA的ECD中的组氨酸残基是灰色阴影。
抗VISTA抗体(Ab)可在酸性pH特异性结合至VISTA-ECD或其片段(例如包含VISTA的IgV结构域或hVISTA中包含(例如)SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70、35-70、35-95、35-127或37-125的区域)。在某些实施方案中，Ab在小于pH 7.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.8的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.5的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.3的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.8的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.5的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.3的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。
某些Ab在pH 5.0-pH 7.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。某些Ab在pH5.0-pH 6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。某些Ab在pH 5.0-pH 6.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。某些Ab在pH 5.5-pH 7.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。某些Ab在pH 5.5-pH 6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。某些Ab在pH 6.0-6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。
本文还提供在6.5或更小的pH下以10-6M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白(例如hVISTA-ECD或其包含VISTA的IgV结构域或hVISTA中包含(例如)SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70、35-70、35-95、35-127或37-125的区域的片段)的Ab。在一些实施方案中，Ab以10- 7M或更小的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-8M或更小的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-9M的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-10M或更小的KD进行结合。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白。
本文还提供在pH 6.0-6.5范围内以10-6M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在一些实施方案中，Ab以10-7M或更小的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-8M或更小的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-9M的KD进行结合。在一些实施方案中，Ab以10-10M或更小的KD进行结合。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下(例如在pH 6.0-6.5范围内)以10-7M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白。另外，Ab可在6.5或更小的pH下(例如在pH 6.0-6.5范围内)以10-8M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白。Ab可在6.5或更小的pH下(例如在pH 6.0-6.5范围内)以10-9M或更小的KD结合至hVISTA-ECD。
本文还提供(例如)在6.5或更小的pH下以10-5s-1或更小的k解离在25℃下或在37℃下特异性结合至VISTA-ECD蛋白(例如hVISTA-ECD或其包含VISTA的IgV结构域或hVISTA中包含(例如)SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70、35-70、35-95、35-127或37-125的区域的片段)的Ab。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有10-4s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有2 10-4s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有5 10-4s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有7 10-4s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有10-3s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有2 10-3s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有5 10-3s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab具有在25℃下或在37℃下7 10-3s-1或更小的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有10-2s-1的k解离。在一些实施方案中，Ab在25℃下或在37℃下具有10-1s-1或更小的k解离。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-3s-1或更小的k解离在25℃下或在37℃下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。Ab可在6.5或更小的pH下以10-3s-1或更小的k解离在25℃下或在37℃下特异性结合至hVISTA-ECD。另外，Ab可在6.5或更小的pH下以10-2s-1或更小的k解离在25℃下或在37℃下特异性结合至VISTA-ECD蛋白。
本文提供(例如)在6.5或更小的pH下以(i)10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小或10-10M或更小的KD和(ii)10-5s-1或更小、10-4(或2、5或7 10-4)s-1或更小、10-3(或2、5或7 10-4)s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白(例如hVISTA-ECD或其包含VISTA的IgV结构域或hVISTA中包含(例如)SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70、35-70或35-95、35-95、35-127或37-125的区域的片段)的Ab。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD和10-3s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和10-3s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和10-2s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD和10-3s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD和10-3s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD和10-2s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和10-4(或2、5或7 10-4)s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和10-5(或2、5或7 10-5)s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD和10-4(或2、5或7 10-4)s-1的k解离速率或更小(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD和10-5(或2、5或7 10-5)s-1或更小的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。
本文提供(例如)在6.5或更小的pH下以104M-1s-1或更高的k缔合在25℃下或在37℃下特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在一些此类实施方案中，Ab可以105M-1s-1或更高的k缔合进行结合。在一些此类实施方案中，Ab可以106M-1s-1或更高的k缔合进行结合。在一些此类实施方案中，Ab可以107M-1s-1或更高的k缔合进行结合。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以106M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以106M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA的ECD。
本文提供(例如)在6.5或更小的pH下以(i)10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小或10-10M或更小的KD和(ii)104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD和106M-1s-1或更高的k缔合速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和106M-1s-1或更高的k缔合速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD和106M-1s-1的k缔合速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。举例而言，Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD和106M-1s-1或更高的k缔合速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至hVISTA-ECD。
在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD以及10-5s-1或更小、2 10-5s-1或更小、5 10-5s-1或更小、7 10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、2 10-4s-1或更小、510-4s-1或更小、7 10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、2 10-3s-1或更小、5 10-3s-1或更小、7 10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-10M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。
在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD以及104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD以及104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD以及104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-10M或更小的KD以及104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。
在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-7M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)和104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-8M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)和104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-9M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)和104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在6.5或更小的pH下以10-10M或更小的KD以及10-5s-1或更小、10-4s-1或更小、10-3s-1或更小、10-2s-1或更小或10-1s-1或更小的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)和104M-1s-1或更高、105M-1s-1或更高、106M-1s-1或更高、107M-1s-1或更高的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白。
如还在上文所述，在一些上述实施方案中，VISTA-ECD蛋白是hVISTA-ECD或是hVISTA-ECD的一部分(例如IgV结构域)。在一些上述实施方案中，Ab可特异性结合至包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95的表位。在一些上述实施方案中，Ab可特异性结合至包含SEQID NO：2的氨基酸20-70的表位。在一些上述实施方案中，Ab可特异性结合至包含SEQ IDNO：2的氨基酸35-95的表位。在一些上述实施方案中，Ab可特异性结合至包含SEQ ID NO：2的氨基酸35-70的表位。在一些上述实施方案中，表位是三维表位，其不仅包含SEQ ID NO：2中残基20-95、20-70、35-95或35-70的上述部分中的一者，而且也包含SEQ ID NO：2的另一部分(例如SEQ ID NO：2的残基95-105)。在某些实施方案中，Ab结合至WO2015/097536中阐述的Ab所结合的hVISTA表位。举例而言，Ab可与WO2015/097536中所公开的Ab竞争或交叉竞争结合至hVISTA。在某些实施方案中，Ab结合至人VISTA的构象表位。在某些实施方案中，Ab结合至包含人VISTA中SEQ ID NO：2的残基103-111和SEQ ID NO：2的136-146或存在于所述残基内的构象表位。在某些实施方案中，Ab结合至包含人VISTA的SEQ ID NO：2的残基24-36、54-65和100-102或存在于所述残基内的构象表位。在某些实施方案中，Ab结合至包含人VISTA的FG环中的氨基酸残基的构象表位。在一些实施方案中，Ab结合至包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35至127和/或37-125的多肽。在一些实施方案中，Ab结合至VISTA ECD多肽或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基350-127的其部分，但抗体并不结合或以减小的亲和力结合至包含氨基酸取代的VISTA ECD多肽或其部分，其中取代(1)是取代下列氨基酸残基中的一者：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127和SEQ ID NO：2或(2)取代下列氨基酸残基中的一者Y37、T39、R54、F62、Q63、H66、L115、V117、I119、S124或E125。在一些实施方案中，抗VISTA抗体与本文所阐述的抗体(例如如在实施例和/或权利要求中所陈述)具有相同结合特性(或显著相同的结合特性)。
一些上述抗体可基于pH对VISTA-ECD蛋白显示差异性结合亲和力。某些Ab在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白，也在中性和/或碱性pH以类似亲和力特异性结合VISTA-ECD蛋白(即其是“泛结合剂(pan binder)”)。举例而言，一些此类Ab可以10-7M或更小的KD在pH 6.5和pH 7.0下(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白，从而pH 6.5下的KD在pH 7.0下的KD的1.5倍内。一些此类Ab可以10-8M或更小的KD在pH 6.5和pH 7.0下(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白，从而pH 6.5下的KD在pH 7.0下的KD的1.5倍内。一些此类Ab可以10-8M或更小的KD在pH6.5和pH 7.0下(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至hVISTA-ECD，从而pH 6.5下的KD在pH 7.0下的KD的1.5倍内。
某些Ab在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白，可在中性、生理和/或碱性条件下以较低亲和力结合VISTA-ECD蛋白(“pH敏感性结合剂”或“pH敏感性Ab”)。某些Ab在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白，可在中性、生理和/或碱性条件中对VISTA-ECD蛋白具有非显著(例如几乎不可检测)结合。举例而言，在一些实施方案中，Ab可在pH 6.5下以10-8M或更小的KD和在pH 7.0和/或pH 7.4下以大于10-8M的KD结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在pH 6.5下以10-8M或更小的KD和在pH 7.0和/或pH 7.4下以高于pH 6.5下1.5倍以上的KD结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，提供pH敏感性Ab，其在pH 6.5下以低于pH 7.0下至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，在一些情形下，Ab在pH6.0下以小于pH 7.0和/或pH 7.4或更高pH至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白。
在某些实施方案中，Ab在酸性条件中以低于中性、生理或碱性条件的k解离特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，提供在酸性条件中于pH 6.5下以低于pH 7.0和/或pH 7.4下的k解离至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。换句话说，酸性pH下的解离速率慢于中性pH。举例而言，在一些实施方案中，Ab在pH 6.0下以低于pH 7.0和/或pH 7.4至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，提供在pH 6.5下以低于pH 7.4下的k解离至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在一些实施方案中，Ab在pH 6.0下以低于pH 7.4至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k解离速率(如例如在25℃下或在37℃下所测量)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，提供在pH 6.0-6.5下以低于pH 7.0-7.4下的k解离至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
在某些实施方案中，Ab在酸性条件中以高于中性、生理或碱性条件的k缔合特异性结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，提供在酸性条件中于pH 6.5下以高于pH 7.0和/或pH 7.4下的k缔合至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，在一些实施方案中，Ab在pH 6.0下以高于pH 7.0和/或pH 7.4至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。
在某些实施方案中，Ab特异性在至少一个组氨酸残基(例如SEQ ID NO：1中的His98)发生质子化的pH下结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，Ab在ECD中的大部分组氨酸残基发生质子化的pH下(其预计为pH 6.5或更小pH，例如介于pH 6.0与pH 6.5之间)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。
本文还涵盖在中性、生理或碱性pH下以高于酸性pH的亲和力特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab，条件是酸性pH下的结合亲和力保持较高。举例而言，Ab可在pH 6.5和pH 7.0下以10-8M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白，但Ab在pH 7.0下以低于pH 6.5至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍的KD进行结合。
本文还涵盖共有此部分的上述性质中的一者或多者的Ab。上述性质(例如特定KD、k解离、k缔合、特定表位)并不孤立处理。因此，Ab可结合至包含SEQ ID NO：2的上述区域之一的表位，并且也可具有如上文所阐述的泛结合或pH敏感性或pH选择性结合性质，如通过其KD、k解离或k缔合在不同pH下的一种或多种行为所显示。
在上述实施方案中的任一者中，Ab可为(例如)全长抗体(即包含全长重链(含有或不含C-末端赖氨酸)和全长轻链)或抗原结合片段(例如Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、scFv片段、Fv片段)，或Ab可为嵌合、人源化或人抗体，或Ab可为双特异性或多特异性抗体。
可使用若干不同方法来测定Ab如何在给定pH下充分结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，通过表面等离子共振(SPR)，例如通过
测定。实例性SPR测定包括使用固定捕获试剂(例如使用
抗人Fc捕获试剂盒，GE Healthcare，目录号BR-1008-39；或
抗小鼠捕获试剂盒，GE Healthcare，目录号BR-1008-39)将一种或若干抗体捕获于CM4传感器芯片上，并且使VISTA抗原(呈一定浓度系列的分析物)流动以测定在期望pH下于电泳缓冲液中的结合动力学和亲和力。在一个实施方案中，以0.1nM至500nM范围内的二至五个浓度(例如0.1nM、1nM、10nM、100nM、500nM)使用30uL/min的流速注射VISTA，最多4分钟缔合时间且最多10分钟解离时间。在结合循环之间，遵循各自捕获试剂盒的制造商说明书来再生捕获表面。使用参考流动槽和空白注射双重参考所有数据。使用
T200评估软件将具有简单1∶1动力学的数据拟合成具有传质的朗格缪尔(Langmuir)结合模型。也可使用实施例中所阐述的SPR方法。
可使用在表面上表达VISTA ECD多肽、PSGL-1或硫酸乙酰肝素的细胞来测定Ab对VISTA ECD多肽的亲和力，所述方法包括流式细胞术，并且其中在给定pH下(例如pH 6.5或更小pH)测定Ab与结合细胞的VISTA-ECD的结合。实例性流式细胞术测定包括下列步骤：将异位表达hVISTA ECD的293T细胞或其他细胞重悬于由HBSS+1％BSA组成且调节至期望pH(例如使用MES达到pH 6.0或使用HEPES达到pH 7.4)的缓冲液中。将针对hVISTA的Ab(例如人IgG)自大约20μg/mL连续稀释并与重悬细胞一起在4℃下培育30分钟。然后使用相同缓冲液将细胞洗涤两次，并且维持期望pH(例如pH 6.0或7.4)，并与识别一抗(例如人IgG)的荧光团缀合的二抗一起培育且在减小的pH下较为稳定。然后如之前所述洗涤细胞并立即获取于BD Fortessa或其他流式细胞仪上且并不固定。可如实施例中所阐述来测定Ab对VISTAECD多肽的亲和力。
在某些实施方案中，结合至hVISTA ECD的Ab会阻断hVISTA与其结合配偶体(例如VISTA受体)在(例如)细胞上的结合。抑制或阻断可为100％或至少99％、95％、90％、85％、80％、75％或50％。在某些实施方案中，Ab在酸性pH(例如pH 6.5或更小pH)结合至VISTA-ECD蛋白，并且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在某些实施方案中，Ab在小于pH 7.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.8的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.5的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.3的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 6.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.8的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.5的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.3的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。在某些实施方案中，Ab在小于pH 5.0的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。
某些Ab在pH 5.0-pH 7.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。某些Ab在pH 5.0-pH 6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。某些Ab在pH 5.0-pH 6.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。某些Ab在pH 5.5-pH 7.0范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。某些Ab在pH 5.5-pH 6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。某些Ab在pH 6.0-6.5范围内的pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白且将VISTA与其结合配偶体的结合抑制至少50％。可如实施例中所阐述来测定结合抑制。
VISTA结合配偶体可为PSGL-1(例如人PSGL-1)。人PSGL-1同种型的序列提供为本文的SEQ ID NO：3-10。VISTA结合至含有或不含唾液酰基路易斯X的PSGL-1。结合配偶体也可为(例如)存在于某些细胞上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖。
可在存在和不存在抗体下通过测量VISTA(或VISTA ECD或VISTA IgV结构域或VISTA阳性细胞)与VISTA结合细胞(例如T细胞(例如CD4+T细胞、CD8+ T细胞，活化或未活化)、NK细胞或其他VISTA结合细胞)的结合的抑制来测定与VISTA结合配偶体的结合的抑制。可用以测定抗体是否抑制VISTA与其结合配偶体或表达结合配偶体的T细胞的结合的实例性实验是流式细胞术测定，例如包括下列步骤的测定：将来自供体血液、血沉棕黄层或单采浓缩白细胞(1eukopak)的人外周血单核细胞重悬于由HBSS+1％BSA组成且调节至期望pH(例如使用MES达到pH 6.0或使用HEPES达到pH 7.4)的缓冲液中。然后将细胞在4℃下与20μg/mL由融合至人IgG1Fc的hVISTA ECD(VISTA-Fc)组成的重组嵌合蛋白以及不同浓度的候选VISTA阻断性抗体或对照抗体一起培育30分钟。然后将细胞在相同缓冲液中洗涤两次，维持期望pH(例如pH 6.0或7.4)，并在4℃下与识别VISTA-Fc的荧光团缀合的二抗(但无候选阻断性抗体或对照抗体)一起再培育30分钟，并且在减小的pH下较为稳定。然后如之前所述洗涤细胞并立即获取于BD Fortessa或其他流式细胞仪上且并不固定。可(例如)如实施例中所阐述来测定结合抑制。
在具体实施方案中，本文所阐述的Ab可触发或增强免疫反应(例如抗原特异性免疫反应)。在某些实施方案中，Ab尤其在酸性pH(例如发现于肿瘤微环境中)刺激T细胞活性。可(例如)在混合淋巴细胞反应(MLR)中或在体外测定中使用抗原提呈细胞(天然或人工)和T细胞来测量T细胞活性刺激。也可使用(例如)实施例中所阐述的Jurkat测定来测量T细胞活性刺激。也可通过测定来自T细胞的IFN-γ分泌来测量T细胞活性刺激，其中增强的IFN-γ分泌指示T细胞刺激。也可测量其他细胞因子自活化T细胞的分泌。在某些实施方案中，测量活化T细胞的信号转导(例如NF-kB含量)。在具体实施方案中，本文所阐述的Ab抑制细胞粘附，这可如实施例中所阐述来测量。
也可在单核细胞测定、ADCC测定和ADCP测定中尤其在酸性pH(例如发现于肿瘤微环境中)显示抗VISTA Ab的活性。
在某些实施方案中，抗VISTA Ab抑制肿瘤模型(例如人VISTA敲入肿瘤模型)中的肿瘤生长。
如本文实施例中所显示，抗VISTA Ab在内体中再循环以(例如)增强抗体的药代动力学(PK)性质(即半衰期)，这需要抗VISTA抗体在酸性条件中结合至VISTA。因此，如本文进一步所阐述，在低pH下(例如pH 6.5或更低pH)结合至VISTA的抗VISTA Ab也预计相对于在酸性pH不结合至VISTA的VISTA抗体具有较长可接受半衰期。
实例性hVISTA-ECD结合Ab
本文提供相对于生理pH或中性pH在酸性pH(例如在酸性条件中)优先结合至VISTA(ECD)的Ab。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VHCDR1、CDR2和/或CDR3的重链可变区(“VH”)。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVI STA Ab的VH CDR1、CDR2和CDR3的VH。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH CDR1、CDR2和/或CDR3的VH。所述物质中的每一者的VH CDR1、CDR2和CDR3包含下文序列表中所提供上述抗体物质中的每一者的VH序列的氨基酸位置26-35(VH CDR1)、50-66(VH CDR2)和99-110(VH CDR3)。下文序列表中所提供上述抗体物质的每个VH序列的CDR也加下划线且呈粗体。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VLCDR1、CDR2和CDR3的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有以下中的一者的VLCDR1、CDR2和CDR3的VL：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。所述物质中的每一者的VL CDR1、CDR2和CDR3包含下文序列表中所提供上述抗体物质中的每一者的VL序列的氨基酸位置24-35(VL CDR1)、51-57(VL CDR2)和90-98(VL CDR3)。那些序列中的每一者上的CDR也加下划线且呈粗体。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供的任一抗hVISTA Ab的VHCDR1、CDR2和/或CDR3的VH和含有本文所提供的任一抗hVISTA Ab的CDR1、CDR2和/或CDR3的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供的任一抗hVISTA Ab的VH CDR1、CDR2和CDR3的VH和含有本文所提供的任一抗hVISTA Ab的CDR1、CDR2和CDR3的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含：VH，其包含P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH CDR1、CDR2和/或CDR3；和VL，其包含P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VLCDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含P1-061029的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(b)包含P1-061015的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061015的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(c)包含P1-068757的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068757的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(d)包含P1-068759的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068759的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(e)包含P1-068761的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(f)包含P1-068763的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068763的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(g)包含P1-068765的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068765的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(h)包含P1-068767的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(i)包含P1-068769的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068769的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(j)包含P1-068771的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068771的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(k)包含P1-068773的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068773的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(l)包含P1-068775的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068775的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(m)包含P1-069059的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069059的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(n)包含P1-069061的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069061的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(o)包含P1-069063的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069063的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(p)包含P1-069065的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069065的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(q)包含P1-069067的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069067的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(r)包含P1-069069的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069069的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(s)包含P1-069071的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069071的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(t)包含P1-069073的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069073的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(u)包含P1-069075的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069075的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(v)包含P1-069077的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-069077的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(w)包含P1-068736的VHCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068736的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(x)包含P1-068738的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068738的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(y)包含P1-068740的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068740的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(z)包含P1-068742的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068742的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(aa)包含P1-068744的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068744的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(bb)包含P1-068746的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068746的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(cc)包含P1-068748的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068748的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(dd)包含P1-068750的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068750的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ee)包含P1-068752的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068752的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ff)包含P1-068754的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068754的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(gg)包含P1-068761_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(hh)包含P1-068761_H100G的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_H100G的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ii)包含P1-068761_E56N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(jj)包含P1-068761_E55A_E56N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A_E56N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(kk)包含P1-068761_E30D的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ll)包含P1-068761_E30D_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(mm)包含P1-068761_E56N_H100G的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N_H100G的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(nn)包含P1-068761_E30D_H100G的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_H100G的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(oo)包含P1-068761_E30D_E56N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E56N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(pp)包含P1-068761_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(qq)包含P1-068761_E55A_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(rr)包含P1-068761_H100G_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_H100G_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ss)包含P1-068761_E30D_H100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_H100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(tt)包含P1-068761_E56N_H100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N_H100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(uu)包含P1-068761_E32Y的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(vv)包含P1-068761_E32Y_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ww)包含P1-068761_E32Y_E56N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_E56N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(xx)包含P1-068761_E30D_E32Y的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E32Y的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(yy)包含P1-068761_E32Y_H100G的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_H100G的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(zz)包含P1-068761_E32Y_H100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_H100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(aaa)包含P1-068767_D52N_D102V的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_D102V的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(bbb)包含P1-068767_D52N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ccc)包含P1-068767_D52N_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ddd)包含P1-068767_E55A_D102V的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A_D102V的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(eee)包含P1-068767_D102V的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D102V的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(fff)包含P1-068767_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ggg)包含P1-068767_E30D_D52N的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_D52N的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(hhh)包含P1-068767_E30D_D102V的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_D102V的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(iii)包含P1-068767_E30D的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(jjj)包含P1-068767_E30D_E55A的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_E55A的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(kkk)包含P1-068767_E100fF_D102V的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E100fF_D102V的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(lll)包含P1-068767_E55A_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(mmm)包含P1-068767_D52N_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(nnn)包含P1-068767_E100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ooo)包含P1-068767_E30D_H100fF的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_H100fF的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ppp)包含P1-061029_F100fE_V102D的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_F100fE_V102D的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(qqq)包含P1-061029_F100fE的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_F100fE的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(rrr)包含P1-061029_V102D的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_V102D的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(sss)包含P1-061029_Y32E的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_Y32E的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL；或
(ttt)包含P1-061029_Y32E_F100fE的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_Y32E_F100fE的VL CDR1、CDR2和CDR3的VL。
同样，下文序列表提供具有IgG1.3重链恒定区(除非在表中指出不同HC恒定区)的上文所列示抗体的重链和轻链可变区序列和全长重链和轻链序列且指出其VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3的位置(通过氨基酸残基)，并且每个VH和VL序列中的CDR加粗体且加下划线。因此，举例而言，P1-061029的VH CDR1包含SEQ ID NO：67的氨基酸26-35，而VH CDR2包含SEQ ID NO：67的氨基酸50-66，并且VH CDR3包含SEQ ID NO：67的氨基酸99-110，等等，如通过序列表中所显示SEQ ID NO：67的粗体和加下划线氨基酸所指出。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH的氨基酸序列的VH。本文所提供特定抗体物质的个别VH序列列示于序列表中。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab包含以下抗体中的任一者的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE，但在VH序列的框架区中具有1、2、3、4或5个氨基酸取代，例如1、2、3、4或5个保守取代。在一些实施方案中，抗hVISTA Ab包含抗体P1-061029或其诸如以下等子代中的任一者的VH：P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-068766、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE，但在序列表中所显示VH序列的框架区中具有一个或多个种系回复取代，例如K16R和/或T84A取代中的一者或两者。具有此类氨基酸取代的实例性VH序列提供于序列表中，其中残基16和84以粗体和加下划线突出显示。应注意，P1-061015在其VH框架区的位置16含有R且在位置84含有A。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH CDR的氨基酸序列的VH CDR1、CDR2和CDR3，并且包含与本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有与以下物质的VH的氨基酸序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。在某些实施方案中，抗体的VH与序列表中所显示VH序列因VH序列框架区中的1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)或(例如)P1-061029或其子代中的K16R和/或T84A取代中的一者或两者而有所不同。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含由本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH的氨基酸序列组成的VH。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含由P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH的氨基酸序列组成的VH，所述VH任选地具有K16R和/或T84A取代中的一者或两者。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL的氨基酸序列的VL。在某些实施方案中，抗hVI STA Ab包含含有P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VL的氨基酸序列的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR1、CDR2和CDR3，并且包含与本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有与以下物质的VL的氨基酸序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的VL：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。在某些实施方案中，抗体的VL与序列表中所显示的VL序列因VL序列的框架区中的1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)而有所不同。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含由本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL的氨基酸序列组成的VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含由P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VL的氨基酸序列组成的VL。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH的氨基酸序列的VH，并且包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL的氨基酸序列的VL。在某些所述实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH的氨基酸序列的VH；和含有P1-061029或P1-061015的VL的氨基酸序列的VL。
然而，在某些实施方案中，抗体的VH是P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE的VH，但在VH序列的框架区中具有1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)，并且VL是P1-061029或P1-061015的VL。然而，在某些实施方案中，抗体的VH是P1-061029或其子代(例如P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-068766、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH，但具有K16R或T84A取代中的一者或两者，并且VL是P1-061029或P1-061015的VL。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH和VL的氨基酸序列的VH和VL，并且任选地，其中VH包含K16R和/或T84A取代中的一者或两者。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH CDR的氨基酸序列的VH CDR1、CDR2和CDR3以及含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的VL CDR的氨基酸序列的VL CDR1、CDR2和CDR3，并且还包含各自与本文所提供任一抗hVISTA Ab的相应VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL。在某些实施方案中，抗体的VH和VL与序列表中所显示的VH和VL序列因序列框架区中的1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)或(例如)VH序列中的K16R和/或T84A取代中的一者或两者而有所不同。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含由本文所提供任一抗hVISTA Ab的VH和VL的氨基酸序列组成的VH和VL。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含各自由P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的VH和VL的氨基酸序列组成的VH和VL，并且任选地，其中VH包含K16R和/或T84A取代中的一者或两者。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含P1-061029中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029中VL的氨基酸序列的VL；
(b)包含P1-061015中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061015中VL的氨基酸序列的VL；
(c)包含P1-068757中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068757中VL的氨基酸序列的VL；
(d)包含P1-068759中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068759中VL的氨基酸序列的VL；
(e)包含P1-068761中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761中VL的氨基酸序列的VL；
(f)包含P1-068763中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068763中VL的氨基酸序列的VL；
(g)包含P1-068765中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068765中VL的氨基酸序列的VL；
(h)包含P1-068767中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767中VL的氨基酸序列的VL；
(i)包含P1-068769中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068769中VL的氨基酸序列的VL；
(j)包含P1-068771中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068771中VL的氨基酸序列的VL；
(k)包含P1-068773中VH的氨基酸序列的VH和包含-068773中VL的氨基酸序列的VL；
(1)包含P1-068775中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068775中VL的氨基酸序列的VL；
(m)包含P1-069059中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069059中VL的氨基酸序列的VL；
(n)包含P1-069061中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069061中VL的氨基酸序列的VL；
(o)包含P1-069063中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069063中VL的氨基酸序列的VL；
(p)包含P1-069065中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069065中VL的氨基酸序列的VL；
(q)包含P1-069067中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069067中VL的氨基酸序列的VL；
(r)包含P1-069069中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069069中VL的氨基酸序列的VL；
(s)包含P1-069071中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069071中VL的氨基酸序列的VL；
(t)包含P1-069073中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069073中VL的氨基酸序列的VL；
(u)包含P1-069075中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069075中VL的氨基酸序列的VL；
(v)包含P1-069077中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-069077中VL的氨基酸序列的VL；
(w)包含P1-068736中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068736中VL的氨基酸序列的VL；
(x)包含P1-068738中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068738中VL的氨基酸序列的VL；
(y)包含P1-068740中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068740中VL的氨基酸序列的VL；
(z)包含P1-068742中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068742中VL的氨基酸序列的VL；
(aa)包含P1-068744中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068744中VL的氨基酸序列的VL；
(bb)包含P1-068746中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068746中VL的氨基酸序列的VL；
(cc)包含P1-068748中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068748中VL的氨基酸序列的VL；
(dd)包含P1-068750中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068750中VL的氨基酸序列的VL；
(ee)包含P1-068752中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068752中VL的氨基酸序列的VL；
(ff)包含P1-068754中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068754中VL的氨基酸序列的VL；
(gg)包含P1-068761_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(hh)包含P1-068761_H100G中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_H100G中VL的氨基酸序列的VL；
(ii)包含P1-068761_E56N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N中VL的氨基酸序列的VL；
(jj)包含P1-068761_E55A_E56N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A_E56N中VL的氨基酸序列的VL；
(kk)包含P1-068761_E30D中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D中VL的氨基酸序列的VL；
(11)包含P1-068761_E30D_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(mm)包含P1-068761_E56N_H100G中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N_H100G中VL的氨基酸序列的VL；
(nn)包含P1-068761_E30D_H100G中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_H100G中VL的氨基酸序列的VL；
(oo)包含P1-068761_E30D_E56N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E56N中VL的氨基酸序列的VL；
(pp)包含P1-068761_E100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(qq)包含P1-068761_E55A_E100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E55A_E100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(rr)包含P1-068761_H100G_E100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_H100G_E100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(ss)包含P1-068761_E30D_H100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_H100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(tt)包含P1-068761_E56N_H100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E56N_H100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(uu)包含P1-068761_E32Y中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y中VL的氨基酸序列的VL；
(vv)包含P1-068761_E32Y_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(ww)包含P1-068761_E32Y_E56N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_E56N中VL的氨基酸序列的VL；
(xx)包含P1-068761_E30D_E32Y中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E30D_E32Y中VL的氨基酸序列的VL；
(yy)包含P1-068761_E32Y_H100G中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_H100G中VL的氨基酸序列的VL；
(zz)包含P1-068761_E32Y_H100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068761_E32Y_H100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(aaa)包含P1-068767_D52N_D102V中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_D102V中VL的氨基酸序列的VL；
(bbb)包含P1-068767_D52N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N中VL的氨基酸序列的VL；
(ccc)包含P1-068767_D52N_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(ddd)包含P1-068767_E55A_D102V中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A_D102V中VL的氨基酸序列的VL；
(eee)包含P1-068767_D102V中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D102V中VL的氨基酸序列的VL；
(fff)包含P1-068767_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(ggg)包含P1-068767_E30D_D52N中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_D52N中VL的氨基酸序列的VL；
(hhh)包含P1-068767_E30D_D102V中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_D102V中VL的氨基酸序列的VL；
(iii)包含P1-068767_E30D中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D中VL的氨基酸序列的VL；
(jjj)包含P1-068767_E30D_E55A中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_E55A中VL的氨基酸序列的VL；
(kkk)包含P1-068767_E100fF_D102V中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E100fF_D102V中VL的氨基酸序列的VL；
(lll)包含P1-068767_E55A_E100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E55A_E100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(mmm)包含P1-068767_D52N_D100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_D52N_D100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(nnn)包含P1-068767_E100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(ooo)包含P1-068767_E30D_H100fF中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-068767_E30D_H100fF中VL的氨基酸序列的VL；
(ppp)包含P1-061029_F100fE_V102D中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_F100fE_V102D中VL的氨基酸序列的VL；
(qqq)包含P1-061029_F100fE中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_F100fE中VL的氨基酸序列的VL；
(rrr)包含P1-061029_V102D中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_V102D中VL的氨基酸序列的VL；
(sss)包含P1-061029_Y32E中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_Y32E中VL的氨基酸序列的VL；或
(ttt)包含P1-061029_Y32E_F100fE中VH的氨基酸序列的VH和包含P1-061029_Y32E_F100fE中VL的氨基酸序列的VL。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029的VL的氨基酸序列的VL；
(b)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068757的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068757的VL的氨基酸序列的VL；
(c)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068759的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068759的VL的氨基酸序列的VL；
(d)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761的VL的氨基酸序列的VL；
(e)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068763的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068763的VL的氨基酸序列的VL；
(f)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068765的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068765的VL的氨基酸序列的VL；
(g)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767的VL的氨基酸序列的VL；
(h)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068769的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068769的VL的氨基酸序列的VL；
(i)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068771的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068771的VL的氨基酸序列的VL；
(j)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068773的VH的氨基酸序列的VH；和包含-068773的VL的氨基酸序列的VL；
(k)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068775的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068775的VL的氨基酸序列的VL；
(l)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069059的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069059的VL的氨基酸序列的VL；
(m)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069061的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069061的VL的氨基酸序列的VL；
(n)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069063的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069063的VL的氨基酸序列的VL；
(o)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069065的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069065的VL的氨基酸序列的VL；
(p)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069067的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069067的VL的氨基酸序列的VL；
(q)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069069的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069069的VL的氨基酸序列的VL；
(r)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069071的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069071的VL的氨基酸序列的VL；
(s)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069073的VH的氨基酸序列的VH；包含P1-069073的VL的氨基酸序列的VL；
(t)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069075的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069075的VL的氨基酸序列的VL；
(u)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-069077的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-069077的VL的氨基酸序列的VL；
(v)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(w)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_H100G的VL的氨基酸序列的VL；
(x)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E56N的VL的氨基酸序列的VL；
(y)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E55A_E56N的VL的氨基酸序列的VL；
(z)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D的VL的氨基酸序列的VL；
(aa)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(bb)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E56N_H100G的VL的氨基酸序列的VL；
(cc)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D_H100G的VL的氨基酸序列的VL；
(dd)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D_E56N的VL的氨基酸序列的VL；
(ee)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(ff)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E55A_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(gg)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_H100G_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(hh)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D_H100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D_H100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(ii)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E56N_H100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E56N_H100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(jj)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E32Y的VL的氨基酸序列的VL；
(kk)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E32Y_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(ll)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E32Y_E56N的VL的氨基酸序列的VL；
(mm)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E30D_E32Y的VL的氨基酸序列的VL；
(nn)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E32Y_H100G的VL的氨基酸序列的VL；
(oo)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068761_E32Y_H100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068761_E32Y_H100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(pp)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_D52N_D102V的VL的氨基酸序列的VL；
(qq)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_D52N的VL的氨基酸序列的VL；
(rr)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_D52N_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(ss)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E55A_D102V的VL的氨基酸序列的VL；
(tt)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列的VH；包含P1-068767_D102V的VL的氨基酸序列的VL；
(uu)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(vv)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E30D_D52N的VL的氨基酸序列的VL；
(ww)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E30D_D102V的VL的氨基酸序列的VL；
(xx)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E30D的VL的氨基酸序列的VL；
(yy)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E30D_E55A的VL的氨基酸序列的VL；
(zz)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E100fF_D102V的VL的氨基酸序列的VL；
(aaa)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E55A_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(bbb)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_D52N_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(ccc)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(ddd)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-068767_E30D_E100fF的VL的氨基酸序列的VL；
(eee)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029_F100fE_V102D的VL的氨基酸序列的VL；
(fff)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029_F100fE的VL的氨基酸序列的VL；
(ggg)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029_V102D的VL的氨基酸序列的VL；
(hhh)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029_Y32E的VL的氨基酸序列的VL；或
(iii)包含通过K16R和/或T84A取代修饰的P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列的VH；和包含P1-061029_Y32E_F100fE的VL的氨基酸序列的VL。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含P1-061029中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029的VL CDR的VL；和与P1-061029的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(b)包含P1-061015中VH的VH CDR的VH和包含P1-061015的VL CDR的VL；和与P1-061015的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(c)包含P1-068757中VH的VH CDR的VH和包含P1-068757的VL CDR的VL；和与P1-068757的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(d)包含P1-068759中VH的VH CDR的VH和包含P1-068759的VL CDR的VL；和与P1-068759的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(e)包含P1-068761中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761的VL CDR的VL；和与P1-068761的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(f)包含P1-068763中VH的VH CDR的VH和包含P1-068763的VL CDR的VL；和与P1-068763的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(g)包含P1-068765中VH的VH CDR的VH和包含P1-068765的VL CDR的VL；和与P1-068765的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(h)包含P1-068767中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767的VL CDR的VL；和与P1-068767的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(i)包含P1-068769中VH的VH CDR的VH和包含P1-068769的VL CDR的VL；和与P1-068769的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(j)包含P1-068771中VH的VH CDR的VH和包含P1-068771的VL CDR的VL；和与P1-068771的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(k)包含P1-068773中VH的VH CDR的VH和包含P1-068773的VL CDR的VL；和与P1-068773的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(l)包含P1-068775中VH的VH CDR的VH和包含P1-068775的VL CDR的VL；和与P1-068775的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(m)包含P1-069059中VH的VH CDR的VH和包含P1-069059的VL CDR的VL；和与P1-069059的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(n)包含P1-069061中VH的VH CDR的VH和包含P1-069061的VL CDR的VL；和与P1-069061的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(o)包含P1-069063中VH的VH CDR的VH和包含P1-069063的VL CDR的VL；和与P1-069063的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(p)包含P1-069065中VH的VH CDR的VH和包含P1-069065的VL CDR的VL；和与P1-069065的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(q)包含P1-069067中VH的VH CDR的VH和包含P1-069067的VL CDR的VL；和与P1-069067的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(r)包含P1-069069中VH的VH CDR的VH和包含P1-069069的VL CDR的VL；和与P1-069069的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(s)包含P1-069071中VH的VH CDR的VH和包含P1-069071的VL CDR的VL；和与P1-069071的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(t)包含P1-069073中VH的VH CDR的VH和包含P1-069073的VL CDR的VL；和与P1-069073的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(u)包含P1-069075中VH的VH CDR的VH和包含P1-069075的VL CDR的VL；和与P1-069075的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(v)包含P1-069077中VH的VH CDR的VH和包含P1-069077的VL CDR的VL；和与P1-069077的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(w)包含P1-068736中VH的VH CDR的VH和包含P1-068736的VL CDR的VL；和与P1-068736的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(x)包含P1-068738中VH的VH CDR的VH和包含P1-068738的VL CDR的VL；和与P1-068738的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(y)包含P1-068740中VH的VH CDR的VH和包含P1-068740的VL CDR的VL；和与P1-068740的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(z)包含P1-068742中VH的VH CDR的VH和包含P1-068742的VL CDR的VL；和与P1-068742的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(aa)包含P1-068744中VH的VH CDR的VH和包含P1-068744的VL CDR的VL；和与P1-068744的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(bb)包含P1-068746中VH的VH CDR的VH和包含P1-068746的VL CDR的VL；和与P1-068746的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(cc)包含P1-068748中VH的VH CDR的VH和包含P1-068748的VL CDR的VL；和与P1-068748的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(dd)包含P1-068750中VH的VH CDR的VH和包含P1-068750的VL CDR的VL；和与P1-068750的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ee)包含P1-068752中VH的VH CDR的VH和包含P1-068752的VL CDR的VL；和与P1-068752的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ff)包含P1-068754中VH的VH CDR的VH和包含P1-068754的VL CDR的VL；和与P1-068754的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(gg)包含P1-068761_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068761_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(hh)包含P1-068761_H100G中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_H100G的VL CDR的VL；和与P1-068761_H100G的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ii)包含P1-068761_E56N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E56N的VL CDR的VL；和与P1-068761_E56N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(jj)包含P1-068761_E55A_E56N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E55A_E56N的VL CDR的VL；和与P1-068761_E55A_E56N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(kk)包含P1-068761_E30D中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ll)包含P1-068761_E30D_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(mm)包含P1-068761_E56N_H100G中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E56N_H100G的VL CDR的VL；和与P1-068761_E56N_H100G的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(nn)包含P1-068761_E30D_H100G中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D_H100G的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D_H100G的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(oo)包含P1-068761_E30D_E56N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D_E56N的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D_E56N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(pp)包含P1-068761_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E100fF的VLCDR的VL；和与P1-068761_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(qq)包含P1-068761_E55A_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E55A_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068761_E55A_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(rr)包含P1-068761_H100G_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_H100G_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068761_H100G_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ss)包含P1-068761_E30D_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(tt)包含P1-068761_E56N_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E56N_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068761_E56N_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(uu)包含P1-068761_E32Y中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E32Y的VL CDR的VL；和与P1-068761_E32Y的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(vv)包含P1-068761_E32Y_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E32Y_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068761_E32Y_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ww)包含P1-068761_E32Y_E56N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E32Y_E56N的VL CDR的VL；和与P1-068761_E32Y_E56N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(xx)包含P1-068761_E30D_E32Y中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E30D_E32Y的VL CDR的VL；和与P1-068761_E30D_E32Y的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(yy)包含P1-068761_E32Y_H100G中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E32Y_H100G的VL CDR的VL；和与P1-068761_E32Y_H100G的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(zz)包含P1-068761_E32Y_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068761_E32Y_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068761_E32Y_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(aaa)包含P1-068767_D52N_D102V中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_D52N_D102V的VL CDR的VL；和与P1-068767_D52N_D102V的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(bbb)包含P1-068767_D52N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767的VL CDR_D52N的VL；和与P1-068767_D52N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ccc)包含P1-068767_D52N_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_D52N_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068767_D52N_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ddd)包含P1-068767_E55A_D102V中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E55A_D102V的VL CDR的VL；和与P1-068767_E55A_D102V的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(eee)包含P1-068767_D102V中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_D102V的VL CDR的VL；和与P1-068767_D102V的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(fff)包含P1-068767_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068767_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ggg)包含P1-068767_E30D_D52N中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E30D_D52N的VL CDR的VL；和与P1-068767_E30D_D52N的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(hhh)包含P1-068767_E30D_D102V中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E30D_D102V的VL CDR的VL；和与P1-068767_E30D_D102V的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(iii)包含P1-068767_E30D中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E30D的VL CDR的VL；和与P1-068767_E30D的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(jjj)包含P1-068767_E30D_E55A中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E30D_E55A的VL CDR的VL；和与P1-068767_E30D_E55A的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(kkk)包含P1-068767_E100fF_D102V中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E100fF_D102V的VL CDR的VL；和与P1-068767_E100fF_D102V的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(lll)包含P1-068767_E55A_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E55A_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068767_E55A_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(mmm)包含P1-068767_D52N_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_D52N_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068767_D52N_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(nnn)包含P1-068767_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E100fF的VLCDR的VL；和与P1-068767_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ooo)包含P1-068767_E30D_E100fF中VH的VH CDR的VH和包含P1-068767_E30D_E100fF的VL CDR的VL；和与P1-068767_E30D_E100fF的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ppp)包含P1-061029_F100fE_V102D中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029_F100fE_V102D的VL CDR的VL；和与P1-061029_F100fE_V102D的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(qqq)包含P1-061029_F100fE中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029_F100fE的VLCDR的VL；和与P1-061029_F100fE的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(rrr)包含P1-061029_V102D中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029_V102D的VL CDR的VL；和与P1-061029_V102D的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(sss)包含P1-061029_Y32E中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029_Y32E的VL CDR的VL；和与P1-061029_Y32E的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
(ttt)包含P1-061029_Y32E_F100fE中VH的VH CDR的VH和包含P1-061029_Y32E_F100fE的VL CDR的VL；和与P1-061029_Y32E_F100fE的VH和VL有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH和VL氨基酸序列；
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些上述实施方案中，VH和/或VL与物质(a)至(ttt)中的每一者的序列的区别可在于存在1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)。在一些实施方案中，VH可包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)由P1-061029中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029的VL组成的VL；
(b)由P1-061015中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061015的VL组成的VL；
(c)由P1-068757中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068757的VL组成的VL；
(d)由P1-068759中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068759的VL组成的VL；
(e)由P1-068761中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761的VL组成的VL；
(f)由P1-068763中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068763的VL组成的VL；
(g)由P1-068765中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068765的VL组成的VL；
(h)由P1-068767中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767的VL组成的VL；
(i)由P1-068769中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068769的VL组成的VL；
(j)由P1-068771中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068771的VL组成的VL；
(k)由P1-068773中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068773的VL组成的VL；
(l)由P1-068775中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068775的VL组成的VL；
(m)由P1-069059中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069059的VL组成的VL；
(n)由P1-069061中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069061的VL组成的VL；
(o)由P1-069063中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069063的VL组成的VL；
(p)由P1-069065中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069065的VL组成的VL；
(q)由P1-069067中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069067的VL组成的VL；
(r)由P1-069069中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069069的VL组成的VL；
(s)由P1-069071中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069071的VL组成的VL；
(t)由P1-069073中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069073的VL组成的VL；
(u)由P1-069075中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069075的VL组成的VL；
(v)由P1-069077中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-069077的VL组成的VL；
(w)由P1-068736中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068736的VL组成的VL；
(x)由P1-068738中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068738的VL组成的VL；
(y)由P1-068740中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068740的VL组成的VL；
(z)由P1-068742中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068742的VL组成的VL；
(aa)由P1-068744中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068744的VL组成的VL；
(bb)由P1-068746中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068746的VL组成的VL；
(cc)由P1-068748中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068748的VL组成的VL；
(dd)由P1-068750中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068750的VL组成的VL；
(ee)由P1-068752中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068752的VL组成的VL；
(ff)由P1-068754中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068754的VL组成的VL；
(gg)由P1-068761_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(hh)由P1-068761_H100G中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_H100G中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ii)由P1-068761_E56N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E56N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(jj)由P1-068761_E55A_E56N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E55A_E56N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(kk)由P1-068761_E30D中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ll)由P1-068761_E30D_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(mm)由P1-068761_E56N_H100G中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E56N_H100G中VL的氨基酸序列组成的VL；
(nn)由P1-068761_E30D_H100G中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D_H100G中VL的氨基酸序列组成的VL；
(oo)由P1-068761_E30D_E56N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D_E56N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(pp)由P1-068761_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(qq)由P1-068761_E55A_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E55A_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(rr)由P1-068761_H100G_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_H100G_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ss)由P1-068761_E30D_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(tt)由P1-068761_E56N_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E56N_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(uu)由P1-068761_E32Y中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E32Y中VL的氨基酸序列组成的VL；
(vv)由P1-068761_E32Y_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E32Y_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ww)由P1-068761_E32Y_E56N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E32Y_E56N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(xx)由P1-068761_E30D_E32Y中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E30D_E32Y中VL的氨基酸序列组成的VL；
(yy)由P1-068761_E32Y_H100G中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E32Y_H100G中VL的氨基酸序列组成的VL；
(zz)由P1-068761_E32Y_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068761_E32Y_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(aaa)由P1-068767_D52N_D102V中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_D52N_D102V中VL的氨基酸序列组成的VL；
(bbb)由P1-068767_D52N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_D52N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ccc)由P1-068767_D52N_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_D52N_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ddd)由P1-068767_E55A_D102V中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E55A_D102V中VL的氨基酸序列组成的VL；
(eee)由P1-068767_D102V中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_D102V中VL的氨基酸序列组成的VL；
(fff)由P1-068767_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ggg)由P1-068767_E30D_D52N中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E30D_D52N中VL的氨基酸序列组成的VL；
(hhh)由P1-068767_E30D_D102V中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E30D_D102V中VL的氨基酸序列组成的VL；
(iii)由P1-068767_E30D中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E30D中VL的氨基酸序列组成的VL；
(jjj)由P1-068767_E30D_E55A中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E30D_E55A中VL的氨基酸序列组成的VL；
(kkk)由P1-068767_E100fF_D102V中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E100fF_D102V中VL的氨基酸序列组成的VL；
(lll)由P1-068767_E55A_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E55A_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(mmm)由P1-068767_D52N_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_D52N_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(nnn)由P1-068767_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ooo)由P1-068767_E30D_E100fF中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-068767_E30D_E100fF中VL的氨基酸序列组成的VL；
(ppp)由P1-061029_F100fE_V102D中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029_F100fE_V102D中VL的氨基酸序列组成的VL；
(qqq)由P1-061029_F100fE中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029_F100fE中VL的氨基酸序列组成的VL；
(rrr)由P1-061029_V102D中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029_V102D中VL的氨基酸序列组成的VL；
(sss)由P1-061029_Y32E中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029_Y32E中VL的氨基酸序列组成的VL；或
(ttt)由P1-061029_Y32E_F100fE中VH的氨基酸序列组成的VH和由P1-061029_Y32E_F100fE中VL的氨基酸序列组成的VL；
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在某些实施方案中，抗VISTA Ab包含上文和本文其他处所阐述抗体的可变区和/或可变区CDR 1-3中的任一者，例如：
(1)VH CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者：
(2)VH CDR1、CDR2和CDR3：
(3)VH：
(4)VH CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者和VL CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者：
(5)VH CDR1、CDR2和CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3：
(6)VH和VL：
或
(7)VL和VH，VH中的K16R取代和T84A取代中的一者或两者除外(在P1-061029或其子代的情形下)，所述部分是来自以下物质：
P1-061029，P1-068757，P1-068759，P1-068761，P1-068763，P1-068765，P1-068767，P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE；并且抗VISTA Ab也是IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其修饰形式)，如下文部分中所阐述。在一些实施方案中，恒定区具有效应子功能，并且在一些实施方案中，恒定区是无效应子的。在某些实施方案中，恒定区是IgG1.3的恒定区。
在某些实施方案中，抗VISTA Ab包含上文和本文其他处所阐述抗体的可变区和/或可变区CDR 1-3中的任一者，例如：
(1)VH CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者：
(2)VH CDR1、CDR2和CDR3：
(3)VH：
(4)VH CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者和VL CDR1、CDR2和CDR3中的一者或多者：
(5)VH CDR1、CDR2和CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3：
(6)VH和VL：
或
(7)VL和VH，VH中的K16R取代和T84A取代中的一者或两者除外(在P1-061029和其子代的情形下)，所述部分是来自以下物质：
P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767FD52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE，
且进一步包含下列特性中的一者或多者：
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)特异性结合至hVISTA(例如ECD的富集组氨酸区域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-127的多肽)；
-在生理pH或中性pH(例如pH 7.4或pH 7.0)不会显著结合至hVISTA(例如ECD的富集组氨酸区域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-127的多肽)；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)特异性结合至食蟹猕猴VISTA(例如ECD的富集组氨酸区域)；
-在生理pH或中性pH(例如pH 7.4或pH 7.0)不会显著结合至食蟹猕猴VISTA(例如ECD的富集组氨酸区域)；
-相对于具有SEQ ID NO：2的hVISTA ECD，较小程度地结合至在下列氨基酸中的一者或多者处具有取代的hVISTA-ECD：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、1119、H121、H122、S124、E125、R127；
-与P1-061029、P1-068761、P1-068767和/或P1-061015交叉竞争结合至hVISTA；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)抑制hVISTA与表达VISTA的人T细胞(例如初始或活化T细胞)的结合；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)抑制hVISTA与PSGL-1的结合(例如抑制具有SEQID NO：1的hVISTA的H153和H154与PSGL-1酪氨酸Y46和Y48之间的相互作用)，其中PSGL-1含有或不含唾液酰基路易斯X，并且其中酪氨酸优选是磺基酪氨酸；
-食蟹猕猴中的平均滞留时间(MRT)为至少100、200、300、350、400、450、500、600或700小时(例如至少350小时)，如实施例中所阐述来测量；
-通过(例如)增强T细胞增殖、增强IFN-γ自T细胞的产生和/或刺激T细胞受体介导的NF-kB信号传导来刺激T细胞活化；
-抑制VISTA介导的细胞：细胞粘附；
-特异性结合至表达VISTA的人肿瘤细胞样本或发炎人组织样本中的hVISTA；
-经由一个或多个(例如至少1-3、1-5、1-10、5-10、5-15个或全部)能量上重要的接触残基Y37、T39、R54、F62、H66、V117、1119或S124接触hVISTA，如(例如)使用实施例15中所阐述的酵母表面展示和NGS测定所测定；并且其中编号是成熟hVISTA的编号；
-结合至具有SEQ ID NO：1的hVISTA的区域1：s7LGPVDKGHDVTF68(SEQ ID NO：566)；区域2：86RRPIRNLTFQDL97(SEQ ID NO：567)；和区域3：148VVEIRHHHSEHRVHGAME165(SEQ IDNO：568)，并且任选地其中与区域2的结合最强，如通过如实施例21中所阐述的MS-HDX所测定；
-结合至hVISTA的富集组氨酸β折叠延伸，如(例如)通过如(例如)在实施例中所阐述的结晶学所测定；
-经由(例如)氢键接触成熟hVISTA的H121、H122和/或H123(4.0埃
或更小的距离)，如(例如)通过如(例如)在实施例中所阐述的结晶学所测定；
-经由位于VH CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个或多个谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基接触hVISTA；和
和权利要求和/或实施例中所陈述的任一其他特性。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab的重链的氨基酸序列的重链(HC)。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有如下文在序列表中所显示包含IgG1.3重链恒定区的P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029.IgG1.3(SEQID N0：69)、P1-068757.IgG1.3、P1-068759.IgG1.3、P1-068761.IgG1.3、P1-068763.IgG1.3、P1-068765.IgG1.3、P1-068767.IgG1.3、P1-068769.IgG1.3、P1-068771.IgG1.3、P1-068773.IgG1.3、P1-068775.IgG1.3、P1-069059.IgG1.3、P1-069061.IgG1.3、P1-069063.IgG1.3、P1-069065.IgG1.3、P1-069067.IgG1.3、P1-069069.IgG1.3、P1-069071.IgG1.3、P1-069073.IgG1.3、P1-069075.IgG1.3、P1-069077.IgG1.3、P1-061015.IgG1.3、P1-068736.IgG1.3、P1-068738.IgG1.3、P1-068740.IgG1.3、P1-068742.IgG1.3、P1-068744.IgG1.3、P1-068766.IgG1.3、P1-068748.IgG1.3、P1-068750.IgG1.3、P1-068752.IgG1.3、P1-068754.IgG1.3、P1-068761_E55A.IgG1.3、P1-068761_H100G.IgG1.3、P1-068761_E56N.IgG1.3、P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3、P1-068761_E30D.IgG1.3、P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3、P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3、P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3、P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3、P1-068761_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3、P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E32Y.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3、P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3、P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3、P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3、P1-068767_D52N.IgG1.3、P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3、P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3、P1-068767_D102V.IgG1.3、P1-068767_E55A.IgG1.3、P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3、P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3、P1-068767_E30D.IgG1.3、P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3、P1-068767_E100fF_D102V.IgG1.3、P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3、P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3、P1-068767_E100fF.IgG1.3、P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3、P1-061029_F100fE_V102D.IgG1.3、P1-061029_F100fE.IgG1.3、P1-061029_V102D.IgG1.3、P1-061029_Y32E.IgG1.3、或P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3)的重链的氨基酸序列的重链，任选地其中VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有本文所提供任一抗hVISTA Ab(其包含IgG1.3重链恒定区)的重链的氨基酸序列的重链和本文所提供任抗hVISTA Ab的轻链的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗hVISTA Ab包含含有包含IgG1.3HC恒定区的P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029.IgG1.3(SEQ ID N0：69)、P1-068757.IgG1.3、P1-068759.IgG1.3、P1-068761.IgG1.3、P1-068763.IgG1.3、P1-068765.IgG1.3、P1-068767.IgG1.3、P1-068769.IgG1.3、P1-068771.IgG1.3、P1-068773.IgG1.3、P1-068775.IgG1.3、P1-069059.IgG1.3、P1-069061.IgG1.3、P1-069063.IgG1.3、P1-069065.IgG1.3、P1-069067.IgG1.3、P1-069069.IgG1.3、P1-069071.IgG1.3、P1-069073.IgG1.3、P1-069075.IgG1.3、P1-069077.IgG1.3、P1-061015.IgG1.3、P1-068736.IgG1.3、P1-068738.IgG1.3、P1-068740.IgG1.3、P1-068742.IgG1.3、P1-068744.IgG1.3、P1-068766.IgG1.3、P1-068748.IgG1.3、P1-068750.IgG1.3、P1-068752.IgG1.3、P1-068754.IgG1.3、P1-068761_E55A.IgG1.3、P1-068761_H100G.IgG1.3、P1-068761_E56N.IgG1.3、P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3、P1-068761_E30D.IgG1.3、P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3、P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3、P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3、P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3、P1-068761_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3、P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3、P1-068761_E32Y.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3、P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3、P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3、P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3、P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3、P1-068767_D52N.IgG1.3、P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3、P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3、P1-068767_D102V.IgG1.3、P1-068767_E55A.IgG1.3、P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3、P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3、P1-068767_E30D.IgG1.3、P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3、P1-068767_E100fF_D102V.IgG1.3、P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3、P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3、P1-068767_E100fF.IgG1.3、P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3、P1-061029_F100fE_V102D.IgG1.3、P1-061029_F100fE.IgG1.3、P1-061029_V102D.IgG1.3、P1-061029_Y32E.IgG1.3或P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3)的VH的氨基酸序列的重链，任选地其中VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者；和包含P1-061029或P1-061015的轻链的氨基酸序列的轻链。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含P1-061029.IgG1.3(SEQ ID N0：69)的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029(SEQ ID N0：70)的轻链氨基酸序列的轻链；
(b)包含P1-061015.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061015的轻链氨基酸序列的轻链；
(c)包含P1-068757.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068757的轻链氨基酸序列的轻链；
(d)包含P1-068759.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068759的轻链氨基酸序列的轻链；
(e)包含P1-068761.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761的轻链氨基酸序列的轻链；
(f)包含P1-068763.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068763的轻链氨基酸序列的轻链；
(g)包含P1-068765.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068765的轻链氨基酸序列的轻链；
(h)包含P1-068767.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767的轻链氨基酸序列的轻链；
(i)包含P1-068769.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068769的轻链氨基酸序列的轻链；
(j)包含P1-068771.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068771的轻链氨基酸序列的轻链；
(k)包含P1-068773.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068773的轻链氨基酸序列的轻链；
(l)包含P1-068775.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068775的轻链氨基酸序列的轻链；
(m)包含P1-069059.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069059的轻链氨基酸序列的轻链；
(n)包含P1-069061.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069061的轻链氨基酸序列的轻链；
(o)包含P1-069063.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069063的轻链氨基酸序列的轻链；
(p)包含P1-069065.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069065的轻链氨基酸序列的轻链；
(q)包含P1-069067.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069067的轻链氨基酸序列的轻链；
(r)包含P1-069069.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069069的轻链氨基酸序列的轻链；
(s)包含P1-069071.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069071的轻链氨基酸序列的轻链；
(t)包含P1-069073.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069073的轻链氨基酸序列的轻链；
(u)包含P1-069075.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069075的轻链氨基酸序列的轻链；
(v)包含P1-069077.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-069077的轻链氨基酸序列的轻链；
(w)包含P1-068736.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068736的轻链氨基酸序列的轻链；
(x)包含P1-068738.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068738的轻链氨基酸序列的轻链；
(y)包含P1-068740.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068740的轻链氨基酸序列的轻链；
(z)包含P1-068742.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068742的轻链氨基酸序列的轻链；
(aa)包含P1-068744.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068744的轻链氨基酸序列的轻链；
(bb)包含P1-068746.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068746的轻链氨基酸序列的轻链；
(cc)包含P1-068748.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068748的轻链氨基酸序列的轻链；
(dd)包含P1-068750.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068750的轻链氨基酸序列的轻链；
(ee)包含P1-068752.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068752的轻链氨基酸序列的轻链；
(ff)包含P1-068754.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068754的轻链氨基酸序列的轻链；
(gg)包含P1-068761_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(hh)包含P1-068761_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(ii)包含P1-068761_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(jj)包含P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(kk)包含P1-068761_E30D.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(ll)包含P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(mm)包含P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(nn)包含P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(oo)包含P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(pp)包含P1-068761_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(qq)包含P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(rr)包含P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ss)包含P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(tt)包含P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(uu)包含P1-068761_E32Y.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(vv)包含P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ww)包含P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(xx)包含P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(yy)包含P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(zz)包含P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(aaa)包含P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(bbb)包含P1-068767_D52N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(ccc)包含P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ddd)包含P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(eee)包含P1-068767_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(fff)包含P1-068767_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ggg)包含P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(hhh)包含P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(iii)包含P1-068767_E30D.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(jjj)包含P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(kkk)包含P1-068767_E100fF_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(lll)包含P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(mmm)包含P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(nnn)包含P1-068767_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；或
(ooo)包含P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链。
(ppp)包含P1-061029_F100fE_V102D的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(qqq)包含P1-061029_F100fE.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
(rrr)包含P1-061029_V102D.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(sss)包含P1-061029_Y32E.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列的轻链；或
(ttt)包含P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3的重链氨基酸序列的重链和包含P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
抗hVISTA Ab可包含：
(a)包含P1-061029中HC的HC CDR的重链(HC)和包含P1-061029的LC CDR的轻链(LC)；和与P1-061029.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(b)包含P1-061015中HC的HC CDR的HC和包含P1-061015的LC CDR的LC；和与P1-061015.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(c)包含P1-068757中HC的HC CDR的HC和包含P1-068757的LC CDR的LC；和与P1-068757.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(d)包含P1-068759中HC的HC CDR的HC和包含P1-068759的LC CDR的LC；和与P1-068759.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(e)包含P1-068761中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761的LC CDR的LC；和与P1-068761.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(f)包含P1-068763中HC的HC CDR的HC和包含P1-068763的LC CDR的LC；和与P1-068763.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(g)包含P1-068765中HC的HC CDR的HC和包含P1-068765的LC CDR的LC；和与P1-068765.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(h)包含P1-068767中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767的LC CDR的LC；和与P1-068767.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(i)包含P1-068769中HC的HC CDR的HC和包含P1-068769的LC CDR的LC；和与P1-068769.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(j)包含P1-068771中HC的HC CDR的HC和包含P1-068771的LC CDR的LC；和与P1-068771.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(k)包含P1-068773中HC的HC CDR的HC和包含P1-068773的LC CDR的LC；和与P1-068773.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(1)包含P1-068775中HC的HC CDR的HC和包含P1-068775的LC CDR的LC；和与P1-068775.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(m)包含P1-069059中HC的HC CDR的HC和包含P1-069059的LC CDR的LC；和与P1-069059.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(n)包含P1-069061中HC的HC CDR的HC和包含P1-069061的LC CDR的LC；和与P1-069061.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(o)包含P1-069063中HC的HC CDR的HC和包含P1-069063的LC CDR的LC；和与P1-069063.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(p)包含P1-069065中HC的HC CDR的HC和包含P1-069065的LC CDR的LC；和与P1-069065.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(q)包含P1-069067中HC的HC CDR的HC和包含P1-069067的LC CDR的LC；和与P1-068767.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(r)包含P1-069069中HC的HC CDR的HC和包含P1-069069的LC CDR的LC；和与P1-069069.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(s)包含P1-069071中HC的HC CDR的HC和包含P1-069071的LC CDR的LC；和与P1-069071.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(t)包含P1-069073中HC的HC CDR的HC和包含P1-069073的LC CDR的LC；和与P1-069073.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(u)包含P1-069075中HC的HC CDR的HC和包含P1-069075的LC CDR的LC；和与P1-069075.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(v)包含P1-069077中HC的HC CDR的HC和包含P1-069077的LC CDR的LC；和与P1-069077.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(w)包含P1-068736中HC的HC CDR的HC和包含P1-068736的LC CDR的LC；和与P1-068736.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(x)包含P1-068738中HC的HC CDR的HC和包含P1-068738的LC CDR的LC；和与P1-068738.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(y)包含P1-068740中HC的HC CDR的HC和包含P1-068740的LC CDR的LC；和与P1-068740.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(z)包含P1-068742中HC的HC CDR的HC和包含P1-068742的LC CDR的LC；和与P1-068742.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(aa)包含P1-068744中HC的HC CDR的HC和包含P1-068744的LC CDR的LC；和与P1-068744.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(bb)包含P1-068746中HC的HC CDR的HC和包含P1-068746的LC CDR的LC；和与P1-068746.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(cc)包含P1-068748中HC的HC CDR的HC和包含P1-068748的LC CDR的LC；和与P1-068748.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(dd)包含P1-068750中HC的HC CDR的HC和包含P1-068750的LC CDR的LC；和与P1-068750.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ee)包含P1-068752中HC的HC CDR的HC和包含P1-068752的LC CDR的LC；和与P1-068752.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(f)包含P1-068754中HC的HC CDR的HC和包含P1-068754的LC CDR的LC；和与P1-068754.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(gg)包含P1-068761_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E55A的LCCDR的LC；和与P1-068761_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(hh)包含P1-068761_H100G.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_H100G的LC CDR的LC；和与P1-068761_H100G.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ii)包含P1-068761_E56N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E56N的LCCDR的LC；和与P1-068761_E56N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(jj)包含P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E55A_E56N的LC CDR的LC；和与P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(kk)包含P1-068761_E30D.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D的LCCDR的LC；和与P1-068761_E30D.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ll)包含P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D_E55A的LC CDR的LC；和与P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(mm)包含P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E56N_H100G的LC CDR的LC；和与P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(nn)包含P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D_H100G的LC CDR的LC；和与P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(oo)包含P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D_E56N的LC CDR的LC；和与P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(pp)包含P1-068761_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(qq)包含P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E55A_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(rr)包含P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_H100G_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ss)包含P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(tt)包含P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E56N_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(uu)包含P1-068761_E32Y.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E32Y的LCCDR的LC；和与P1-068761_E32Y.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(vv)包含P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E32Y_E55A的LC CDR的LC；和与P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ww)包含P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E32Y_E56N的LC CDR的LC；和与P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(xx)包含P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E30D_E32Y的LC CDR的LC；和与P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(yy)包含P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E32Y_H100G的LC CDR的LC；和与P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(zz)包含P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068761_E32Y_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(aaa)包含P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_D52N_D102V的LC CDR的LC；和与P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(bbb)包含P1-068767_D52N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_D52N的LC CDR的LC；和与P1-068767_D52N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ccc)包含P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_D52N_E55A的LC CDR的LC；和与P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ddd)包含P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E55A_D102V的LC CDR的LC；和与P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(eee)包含P1-068767_D102V.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_D102V的LC CDR的LC；和与P1-068767_D102V.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(fff)包含P1-068767_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E55A的LC CDR的LC；和与P1-068767_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ggg)包含P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E30D_D52N的LC CDR的LC；和与P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(hhh)包含P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E30D_D102V的LC CDR的LC；和与P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(iii)包含P1-068767_E30D.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E30D的LC CDR的LC；和与P1-068767_E30D.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(jjj)包含P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E30D_E55A的LC CDR的LC；和与P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(kkk)包含P1-068767_E100fFfFD102V.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E100fF_D102V的LC CDR的LC；和与P1-068767_E100fF_D102V.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(lll)包含P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E55A_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(mmm)包含P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_D52N_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(nnn)包含P1-068767_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068767_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ooo)包含P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-068767_E30D_E100fF的LC CDR的LC；和与P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(ppp)包含P1-061029_F100fE_V102D.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-061029_F100fE_V102D的LC CDR的LC；和与P1-061029_F100fE_V102D.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(qqq)包含P1-061029_F100fE.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-061029_F100fE的LC CDR的LC；和与P1-061029F100fE.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(rrr)包含P1-061029_V102D.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-061029_V102D的LC CDR的LC；和与P1-061029V102D.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；
(sss)包含P1-061029_Y32E.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-061029_Y32E的LC CDR的LC；和与P1-061029_Y32E.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列；或
(ttt)包含P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3中HC的HC CDR的HC和包含P1-061029_Y32E_F100fE的LC CDR的LC；和与P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3的HC和LC分别有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HC和LC氨基酸序列。
在一些上述实施方案中，HC和/或LC与物质(a)至(ttt)中的每一者的序列的区别可在于存在1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)。在一些实施方案中，举例而言，P1-061029或一种其子代的HC可在HC的VH区域中包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者(P1-061015和其子代已分别在那些位置具有R和A)。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含：
(a)由P1-061029.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(b)由P1-061015.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061015的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(c)由P1-068757.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068757的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(d)由P1-068759.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068759的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(e)由P1-068761.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(f)由P1-068763.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068763的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(g)由P1-068765.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068765的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(h)由P1-068767.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(i)由P1-068769.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068769的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(j)由P1-068771.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068771的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(k)由P1-068773.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068773的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(l)由P1-068775.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068775的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(m)由P1-069059.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069059的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(n)由P1-069061.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069061的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(o)由P1-069063.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069063的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(p)由P1-069065.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069065的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(q)由P1-069067.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069067的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(r)由P1-069069.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069069的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(s)由P1-069071.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069071的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(t)由P1-069073.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069073的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(u)由P1-069075.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069075的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(v)由P1-069077.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-069077的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(w)由P1-068736的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068736的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(x)由P1-068738.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068738的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(y)由P1-068740.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068740的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(z)由P1-068742.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068742的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aa)由P1-068744.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068744的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bb)由P1-068746.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068746的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(cc)由P1-068748.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068748的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(dd)由P1-068750.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068750的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ee)由P1-068752.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068752的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ff)由P1-068754的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068754的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(gg)由P1-068761_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hh)由P1-068761_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ii)由P1-068761_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jj)由P1-068761_E55A_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kk)由P1-068761_E30D.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ll)由P1-068761_E30D_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mm)由P1-068761_E56N_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nn)由P1-068761_E30D_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(oo)由P1-068761_E30D_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(pp)由P1-068761_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qq)由P1-068761_E55A_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rr)由P1-068761_H100G_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ss)由P1-068761_E30D_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(tt)由P1-068761_E56N_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(uu)由P1-068761_E32Y.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(vv)由P1-068761_E32Y_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ww)由P1-068761_E32Y_E56N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(xx)由P1-068761_E30D_E32Y.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(yy)由P1-068761_E32Y_H100G.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(zz)由P1-068761_E32Y_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aaa)由P1-068767_D52N_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bbb)由P1-068767_D52N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ccc)由P1-068767_D52N_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ddd)由P1-068767_E55A_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(eee)由P1-068767_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(fff)由P1-068767_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ggg)由P1-068767_E30D_D52N.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hhh)由P1-068767_E30D_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(iii)由P1-068767_E30D.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jjj)由P1-068767_E30D_E55A.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kkk)由P1-068767_E100fF_D102V.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(lll)由P1-068767_E55A_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mmm)由P1-068767_D52N_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nnn)由P1-068767_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ooo)由P1-068767_E30D_E100fF.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ppp)由P1-061029_F100fE_V102D.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qqq)由P1-061029_F100fE.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rrr)由P1-061029_V102D.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(sss)由P1-061029_Y32E.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列组成的轻链；或
(ttt)由P1-061029_Y32E_F100fE.IgG1.3的重链氨基酸序列组成的重链和由P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链，
其中，任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含以下各项的抗VISTA mAb：
由上文所列示(a)至(ttt)的重链氨基酸序列组成且后接有Lys残基的重链；和
由所上文列示(a)至(ttt)的轻链氨基酸序列组成的轻链；
其中重链和轻链氨基酸序列是选自来自上文所列示(a)至(ttt)的相同抗体物质。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含含有本文抗体物质的VH氨基酸序列的重链氨基酸序列，但不包含IgG1.3重链恒定区(如本文序列表的HC序列中所提供，并且参见SEQ ID NO：163)，所述抗体可包含不同重链恒定区序列，例如人野生型IgG1恒定区(例如人IgG1异型f(IgG1f)(SEQ ID NO：182))或经修饰人IgG1恒定区(例如IgG1.1f(SEQ ID NO：183))或经修饰人IgG1恒定区(例如IgG1.P238K(SEQ ID NO：184))。因此，本公开的实施方案包括含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)包含(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的轻链；
(b)包含(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061015的轻链氨基酸序列的轻链；
(c)包含(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068757的轻链氨基酸序列的轻链；
(d)包含(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068759的轻链氨基酸序列的轻链；
(e)包含(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761的轻链氨基酸序列的轻链；
(f)包含(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068763的轻链氨基酸序列的轻链；
(g)包含(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068765的轻链氨基酸序列的轻链；
(h)包含(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767的轻链氨基酸序列的轻链；
(i)包含(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068769的轻链氨基酸序列的轻链；
(j)包含(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068771的轻链氨基酸序列的轻链；
(k)包含(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068773的轻链氨基酸序列的轻链；
(l)包含(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068775的轻链氨基酸序列的轻链；
(m)包含(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069059的轻链氨基酸序列的轻链；
(n)包含(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069061的轻链氨基酸序列的轻链；
(o)包含(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069063的轻链氨基酸序列的轻链；
(p)包含(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069065的轻链氨基酸序列的轻链；
(q)包含(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069067的轻链氨基酸序列的轻链；
(r)包含(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069069的轻链氨基酸序列的轻链；
(s)包含(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069071的轻链氨基酸序列的轻链；
(t)包含(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069073的轻链氨基酸序列的轻链；
(u)包含(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069075的轻链氨基酸序列的轻链；
(v)包含(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-069077的轻链氨基酸序列的轻链；
(w)包含(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068736的轻链氨基酸序列的轻链；
(x)包含(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068738的轻链氨基酸序列的轻链；
(y)包含(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068740的轻链氨基酸序列的轻链；
(z)包含(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068742的轻链氨基酸序列的轻链；
(aa)包含(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068744的轻链氨基酸序列的轻链；
(bb)包含P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068746的轻链氨基酸序列的轻链；
(cc)包含(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068748的轻链氨基酸序列的轻链；
(dd)包含(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068750的轻链氨基酸序列的轻链；
(ee)包含(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068752的轻链氨基酸序列的轻链；
(ff)包含(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068754的轻链氨基酸序列的轻链；
(gg)包含(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(hh)包含(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(ii)包含(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(jj)包含(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(kk)包含(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(ll)包含(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(mm)包含(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(nn)包含(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(oo)包含(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(pp)包含(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(qq)包含(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(rr)包含(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ss)包含(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(tt)包含(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(uu)包含(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(vv)包含(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ww)包含(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(xx)包含(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(yy)包含(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(zz)包含(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(aaa)包含(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(bbb)包含(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(ccc)包含(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ddd)包含(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(eee)包含(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(fff)包含(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ggg)包含(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(hhh)包含(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(iii)包含(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(jjj)包含(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(kkk)包含(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(lll)包含(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(mmm)包含(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(nnn)包含(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ooo)包含(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ppp)包含(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(qqq)包含(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
(rrr)包含(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(sss)包含(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列的轻链；或
(ttt)包含(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链，
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些实施方案中，LC可如上述(a)至(ttt)中所指定，但HC可与物质(a)至(ttt)中的每一者的序列因存在1、2、3、4或5个氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守取代)而有所不同。在一些实施方案中，举例而言，P1-061029或一种其子代的HC可在HC的VH区域中包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者(P1-061015和其子代已具有VH位置16的R和VH位置84的A)。
本公开的某些实施方案包含含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)由(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)组成的轻链；
(b)由(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061015的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(c)由(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068757的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(d)由(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068759的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(e)由(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(f)由(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068763的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(g)由(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068765的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(h)由(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(i)由(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068769的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(j)由(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068771的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(k)由(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068773的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(l)由(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068775的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(m)由(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069059的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(n)由(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069061的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(o)由(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069063的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(p)由(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069065的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(q)由(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069067的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(r)由(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069069的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(s)由(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069071的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(t)由(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069073的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(u)由(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069075的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(v)由(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069077的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(w)由(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068736的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(x)由(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068738的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(y)由(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068740的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(z)由(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068742的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aa)由(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068744的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bb)由P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068746的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(cc)由(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068748的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(dd)由(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068750的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ee)由(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068752的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ff)由(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068754的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(gg)由(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hh)由(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ii)由(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jj)由(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kk)由(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ll)由(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mm)由(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nn)由(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(oo)由(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(pp)由(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qq)由(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rr)由(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ss)由(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(tt)由(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(uu)由(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(vv)由(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ww)由(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(xx)由(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(yy)由(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(zz)由(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aaa)由(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bbb)由(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ccc)由(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ddd)由(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(eee)由(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(fff)由(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ggg)由(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hhh)由(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(iii)由(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jjj)由(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kkk)由(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(lll)由(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mmm)由(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nnn)由(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ooo)由(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ppp)由(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qqq)由(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rrr)由(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(sss)由(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列组成的轻链；或
(ttt)由(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链，
其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：182的N-末端氨基酸形成肽键；并且
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含以下各项的抗VISTA mAb：
重链，其由(i)上文所列示(a)至(ttt)的VH的氨基酸序列、(ii)SEQ ID NO：182的氨基酸序列和(iii)Lys残基组成，其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：182的N-末端氨基酸形成肽键且其中SEQ ID NO：182的C-末端氨基酸接合至Lys的N-末端；和
轻链，其由上文所列示(a)至(ttt)的轻链氨基酸序列组成；
其中VH和轻链氨基酸序列是选自来自上文所列示(a)至(ttt)的相同抗体物质。
本公开的某些实施方案包含含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)包含(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的轻链；
(b)包含(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061015的轻链氨基酸序列的轻链；
(c)包含(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068757的轻链氨基酸序列的轻链；
(d)包含(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068759的轻链氨基酸序列的轻链；
(e)包含(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761的轻链氨基酸序列的轻链；
(f)包含(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068763的轻链氨基酸序列的轻链；
(g)包含(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068765的轻链氨基酸序列的轻链；
(h)包含(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767的轻链氨基酸序列的轻链；
(i)包含(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068769的轻链氨基酸序列的轻链；
(j)包含(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068771的轻链氨基酸序列的轻链；
(k)包含(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068773的轻链氨基酸序列的轻链；
(l)包含(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068775的轻链氨基酸序列的轻链；
(m)包含(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069059的轻链氨基酸序列的轻链；
(n)包含(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069061的轻链氨基酸序列的轻链；
(o)包含(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069063的轻链氨基酸序列的轻链；
(p)包含(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069065的轻链氨基酸序列的轻链；
(q)包含(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069067的轻链氨基酸序列的轻链；
(r)包含(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069069的轻链氨基酸序列的轻链；
(s)包含(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069071的轻链氨基酸序列的轻链；
(t)包含(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069073的轻链氨基酸序列的轻链；
(u)包含(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069075的轻链氨基酸序列的轻链；
(v)包含(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-069077的轻链氨基酸序列的轻链；
(w)包含(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068736的轻链氨基酸序列的轻链；
(x)包含(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068738的轻链氨基酸序列的轻链；
(y)包含(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068740的轻链氨基酸序列的轻链；
(z)包含(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068742的轻链氨基酸序列的轻链；
(aa)包含(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068744的轻链氨基酸序列的轻链；
(bb)包含P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068746的轻链氨基酸序列的轻链；
(cc)包含(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068748的轻链氨基酸序列的轻链；
(dd)包含(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068750的轻链氨基酸序列的轻链；
(ee)包含(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068752的轻链氨基酸序列的轻链；
(ff)包含(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068754的轻链氨基酸序列的轻链；
(gg)包含(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(hh)包含(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(ii)包含(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(jj)包含(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(kk)包含(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(ll)包含(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(mm)包含(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(nn)包含(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(oo)包含(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(pp)包含(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(qq)包含(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(rr)包含(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ss)包含(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(tt)包含(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(uu)包含(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(vv)包含(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ww)包含(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(xx)包含(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(yy)包含(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(zz)包含(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(aaa)包含(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(bbb)包含(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(ccc)包含(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ddd)包含(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(eee)包含(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(fff)包含(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ggg)包含(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(hhh)包含(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(iii)包含(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(jjj)包含(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(kkk)包含(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(lll)包含(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(mmm)包含(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(nnn)包含(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ooo)包含(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ppp)包含(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(qqq)包含(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
(rrr)包含(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(sss)包含(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列的轻链；或
(ttt)包含(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E _F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
本公开的某些实施方案包含含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)由(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)组成的轻链；
(b)由(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061015的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(c)由(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068757的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(d)由(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068759的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(e)由(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(f)由(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068763的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(g)由(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068765的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(h)由(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(i)由(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068769的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(j)由(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068771的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(k)由(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068773的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(l)由(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068775的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(m)由(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069059的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(n)由(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069061的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(o)由(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069063的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(p)由(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069065的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(q)由(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069067的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(r)由(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069069的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(s)由(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069071的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(t)由(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069073的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(u)由(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069075的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(v)由(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069077的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(w)由(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068736的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(x)由(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068738的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(y)由(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068740的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(z)由(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068742的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aa)由(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068744的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bb)由P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068746的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(cc)由(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068748的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(dd)由(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068750的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ee)由(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068752的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ff)由(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068754的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(gg)由(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hh)由(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ii)由(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jj)由(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kk)由(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ll)由(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mm)由(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nn)由(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(oo)由(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(pp)由(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qq)由(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rr)由(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ss)由(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(tt)由(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(uu)由(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(vv)由(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ww)由(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(xx)由(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(yy)由(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(zz)由(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aaa)由(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bbb)由(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ccc)由(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ddd)由(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(eee)由(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(fff)由(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ggg)由(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hhh)由(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(iii)由(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jjj)由(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kkk)由(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(lll)由(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mmm)由(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nnn)由(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ooo)由(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ppp)由(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qqq)由(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rrr)由(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(sss)由(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列组成的轻链；或
(ttt)由(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链。
其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：183的N-末端氨基酸形成肽键；并且
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含以下各项的抗VISTA mAb：
重链，其由(i)上文所列示(a)至(ttt)的VH的氨基酸序列、(ii)SEQ ID NO：183的氨基酸序列和(iii)Lys残基组成，其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：183的N-末端氨基酸形成肽键且其中SEQ ID NO：183的C-末端氨基酸接合至Lys的N-末端；和
轻链，其由上文所列示(a)至(ttt)的轻链氨基酸序列组成；
其中VH和轻链氨基酸序列是选自来自上文所列示(a)至(ttt)的相同抗体物质。
本公开的其他实施方案包含含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)包含(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)的轻链；
(b)包含(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061015的轻链氨基酸序列的轻链；
(c)包含(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068757的轻链氨基酸序列的轻链；
(d)包含(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068759的轻链氨基酸序列的轻链；
(e)包含(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761的轻链氨基酸序列的轻链；
(f)包含(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068763的轻链氨基酸序列的轻链；
(g)包含(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068765的轻链氨基酸序列的轻链；
(h)包含(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767的轻链氨基酸序列的轻链；
(i)包含(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068769的轻链氨基酸序列的轻链；
(j)包含(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068771的轻链氨基酸序列的轻链；
(k)包含(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068773的轻链氨基酸序列的轻链；
(l)包含(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068775的轻链氨基酸序列的轻链；
(m)包含(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069059的轻链氨基酸序列的轻链；
(n)包含(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069061的轻链氨基酸序列的轻链；
(o)包含(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069063的轻链氨基酸序列的轻链；
(p)包含(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069065的轻链氨基酸序列的轻链；
(q)包含(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069067的轻链氨基酸序列的轻链；
(r)包含(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069069的轻链氨基酸序列的轻链；
(s)包含(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069071的轻链氨基酸序列的轻链；
(t)包含(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069073的轻链氨基酸序列的轻链；
(u)包含(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069075的轻链氨基酸序列的轻链；
(v)包含(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-069077的轻链氨基酸序列的轻链；
(w)包含(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068736的轻链氨基酸序列的轻链；
(x)包含(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068738的轻链氨基酸序列的轻链；
(y)包含(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068740的轻链氨基酸序列的轻链；
(z)包含(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068742的轻链氨基酸序列的轻链；
(aa)包含(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068744的轻链氨基酸序列的轻链；
(bb)包含P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068746的轻链氨基酸序列的轻链；
(cc)包含(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068748的轻链氨基酸序列的轻链；
(dd)包含(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068750的轻链氨基酸序列的轻链；
(ee)包含(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068752的轻链氨基酸序列的轻链；
(ff)包含(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068754的轻链氨基酸序列的轻链；
(gg)包含(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(hh)包含(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(ii)包含(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(jj)包含(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(kk)包含(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(ll)包含(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(mm)包含(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(nn)包含(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(oo)包含(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(pp)包含(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(qq)包含(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(rr)包含(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ss)包含(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(tt)包含(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(uu)包含(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(vv)包含(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ww)包含(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列的轻链；
(xx)包含(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列的轻链；
(yy)包含(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列的轻链；
(zz)包含(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(aaa)包含(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(bbb)包含(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(ccc)包含(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ddd)包含(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(eee)包含(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(fff)包含(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(ggg)包含(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列的轻链；
(hhh)包含(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(iii)包含(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列的轻链；
(jjj)包含(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列的轻链；
(kkk)包含(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列的轻链；
(lll)包含(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(mmm)包含(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(nnn)包含(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ooo)包含(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列的轻链；
(ppp)包含(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(qqq)包含(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；
(rrr)包含(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列的轻链；
(sss)包含(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列的轻链；或
(ttt)包含(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列的重链；和包含P1-061029_Y32E _F100fE的轻链氨基酸序列的轻链；并且
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
本公开的其他实施方案包含含有以下各项的抗VISTA Ab：
(a)由(i)P1-061029的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：70)组成的轻链；
(b)由(i)P1-061015的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061015的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(c)由(i)P1-068757的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068757的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(d)由(i)P1-068759的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068759的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(e)由(i)P1-068761的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(f)由(i)P1-068763的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068763的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(g)由(i)P1-068765的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068765的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(h)由(i)P1-068767的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(i)由(i)P1-068769的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068769的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(j)由(i)P1-068771的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068771的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(k)由(i)P1-068773的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068773的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(l)由(i)P1-068775的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068775的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(m)由(i)P1-069059的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069059的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(n)由(i)P1-069061的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069061的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(o)由(i)P1-069063的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069063的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(p)由(i)P1-069065的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069065的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(q)由(i)P1-069067的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069067的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(r)由(i)P1-069069的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069069的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(s)由(i)P1-069071的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069071的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(t)由(i)P1-069073的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069073的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(u)由(i)P1-069075的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069075的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(v)由(i)P1-069077的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-069077的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(w)由(i)P1-068736的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068736的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(x)由(i)P1-068738的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068738的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(y)由(i)P1-068740的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068740的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(z)由(i)P1-068742的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068742的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aa)由(i)P1-068744的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068744的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bb)由P1-068746的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068746的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(cc)由(i)P1-068748的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068748的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(dd)由(i)P1-068750的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068750的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ee)由(i)P1-068752的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068752的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ff)由(i)P1-068754的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068754的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(gg)由(i)P1-068761_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hh)由(i)P1-068761_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ii)由(i)P1-068761_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jj)由(i)P1-068761_E55A_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kk)由(i)P1-068761_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ll)由(i)P1-068761_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mm)由(i)P1-068761_E56N_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nn)由(i)P1-068761_E30D_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(oo)由(i)P1-068761_E30D_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(pp)由(i)P1-068761_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qq)由(i)P1-068761_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rr)由(i)P1-068761_H100G_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_H100G_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ss)由(i)P1-068761_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(tt)由(i)P1-068761_E56N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E56N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(uu)由(i)P1-068761_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(vv)由(i)P1-068761_E32Y_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ww)由(i)P1-068761_E32Y_E56N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E56N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(xx)由(i)P1-068761_E30D_E32Y的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E30D_E32Y的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(yy)由(i)P1-068761_E32Y_H100G的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_H100G的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(zz)由(i)P1-068761_E32Y_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068761_E32Y_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(aaa)由(i)P1-068767_D52N_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(bbb)由(i)P1-068767_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ccc)由(i)P1-068767_D52N_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ddd)由(i)P1-068767_E55A_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(eee)由(i)P1-068767_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(fff)由(i)P1-068767_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ggg)由(i)P1-068767_E30D_D52N的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D52N的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(hhh)由(i)P1-068767_E30D_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(iii)由(i)P1-068767_E30D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(jjj)由(i)P1-068767_E30D_E55A的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E55A的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(kkk)由(i)P1-068767_E100fF_D102V的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF_D102V的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(lll)由(i)P1-068767_E55A_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E55A_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(mmm)由(i)P1-068767_D52N_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_D52N_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(nnn)由(i)P1-068767_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ooo)由(i)P1-068767_E30D_E100fF的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-068767_E30D_E100fF的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(ppp)由(i)P1-061029_F100fE_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(qqq)由(i)P1-061029_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(rrr)由(i)P1-061029_V102D的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_V102D的轻链氨基酸序列组成的轻链；
(sss)由(i)P1-061029_Y32E的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E的轻链氨基酸序列组成的轻链；或
(ttt)由(i)P1-061029_Y32E_F100fE的VH的氨基酸序列和(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列组成的重链；和由P1-061029_Y32E_F100fE的轻链氨基酸序列组成的轻链。
其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：184的N-末端氨基酸形成肽键；并且
任选地其中(a)至(ttt)中的任一者中的VH包含K16R取代和T84A取代中的一者或两者。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含以下各项的抗VISTA mAb：
重链，其由(i)上文所列示(a)至(ttt)的VH的氨基酸序列、(ii)SEQ ID NO：184的氨基酸序列和(iii)Lys残基组成，其中VH的C-末端氨基酸和SEQ ID NO：184的N-末端氨基酸形成肽键且其中SEQ ID NO：184的C-末端氨基酸接合至Lys的N-末端；和
轻链，其由上文所列示(a)至(ttt)的轻链氨基酸序列组成；
其中VH和轻链氨基酸序列是选自来自上文所列示(a)至(ttt)的相同抗体物质。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含与P1-061029的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸VH序列，其中所述抗体包含P1-061029的VH CDR1、CDR2和/或CDR3且其中至少一个残基已经D、E或H取代。在一些实施方案中，P1-061029的VH CDR1、CDR2和CDR3中的每一者含有经D、E或H取代的一个、两个或三个残基。在一些实施方案中，抗hvISTA Ab可包含与P1-061029的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸vH序列，其中所述抗体包含在CDR1的氨基酸位置4、5或7含有一个或两个D或E残基的VH CDR1，和/或包含在CDR2的位置3、5、6或7具有一个、两个或三个D、E或H残基的vH CDR2，和/或包含在CDR 3的位置6、12或14具有一个、两个或三个D、E或H残基的VH CDR3。(这些实施方案内的抗体实例可参见下表5。)在此类情形下，轻链可变区可包含P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fFD102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的CDR1、CDR2和/或CDR3，和/或轻链可变区可与P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含与P1-061015的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸VH序列，其中所述抗体包含P1-061015的vH CDR1、CDR2和/或CDR3且其中至少一个残基已经D、E或H取代。在一些实施方案中，P1-061015的VH CDR1、CDR2和CDR3中的每一者含有经D、E或H取代的一个、两个或三个残基。在一些实施方案中，抗hVISTA Ab可包含与P1-061015的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸vH序列，其中所述抗体包含在CDR1的氨基酸位置6、7、8和9含有一个或两个D、E或H残基的VH CDR1，和/或包含在CDR2的位置1、2、4或8-11具有一个、两个或三个D、E或H残基的vH CDR2，和/或包含在CDR 3的位置2、3、6、7或12具有一个、两个或三个D、E或H残基的VH CDR3。(这些实施方案内的抗体实例可参见下表6。)在此类情形下，轻链可变区可包含P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fFD102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的CDR1、CDR2和/或CDR3，和/或轻链可变区可与P1-061029或P1-061015或其子代(例如P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068766、P1-068748、P1-068750、P1-068752、P1-068754、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G、P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE)的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在一些实施方案中，此类经修饰抗hVISTA P1-061029或P1-061015子代拥有下列特性中的一者或多者：
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)特异性结合至hVISTA(例如ECD的富集组氨酸区域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-127的多肽)；
-在生理pH或中性pH(例如pH 7.4或pH 7.0)不会显著结合至hVISTA(例如ECD的富集组氨酸区域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-127的多肽)；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)特异性结合至食蟹猕猴VISTA(例如ECD的富集组氨酸区域)；
-在生理pH或中性pH(例如pH 7.4或pH 7.0)不会显著结合至食蟹猕猴VISTA(例如ECD的富集组氨酸区域)；
-相对于具有SEQ ID NO：2的hVISTA_ECD，较小程度地结合至在下列氨基酸中的一者或多者处具有取代的hvISTA-ECD：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127；
-与P1-061029、P1-068761、P1-068767和/或P1-061015交叉竞争结合至hVISTA；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)抑制hVISTA与表达VISTA的人T细胞(例如初始或活化T细胞)的结合；
-在酸性pH(例如pH 6.0或pH 6.5)抑制hVISTA与PSGL-1的结合(例如抑制具有SEQID NO：1的hVISTA的H153和H154与PSGL-1酪氨酸Y46和Y48之间的相互作用)，其中PSGL-1含有或不含唾液酰基路易斯X，并且其中酪氨酸优选是磺基酪氨酸；
-食蟹猕猴中的平均滞留时间(MRT)为至少100、200、300、350、400、450、500、600或700小时(例如至少350小时)，如实施例中所阐述来测量；
-通过(例如)增强T细胞增殖、增强IFN-γ自T细胞的产生和/或刺激T细胞受体介导的NF-kB信号传导来刺激T细胞活化；
-抑制VISTA介导的细胞：细胞粘附；
-特异性结合至表达VISTA的人肿瘤细胞样本或发炎人组织样本中的hVISTA；
-经由一个或多个(例如至少1-3、1-5、1-10、5-10、5-15个或全部)能量上重要的接触残基Y37、T39、R54、F62、H66、V117、I119或S124接触hVISTA，如(例如)使用实施例15中所阐述的酵母表面展示和NGS测定所测定；并且其中编号是成熟hVISTA的编号；
-结合至具有SEQ ID NO：1的hVISTA的区域1：57LGPVDKGHDVTF68(SEQ ID NO：566)；区域2：86RRPIRNLTFQDL97(SEQ ID NO：567)；和区域3：148VVEIRHHHSEHRVHGAME165(SEQ IDNO：568)，并且任选地其中与区域2的结合最强，如通过如实施例21中所阐述的MS-HDX所测定；
-结合至hVISTA的富集组氨酸β折叠延伸，如(例如)通过例如在实施例中所阐述的结晶学所测定；
-经由(例如)氢键接触成熟hVISTA的H121、H122和/或H123(4.0埃
或更小的距离)，如(例如)通过如(例如)在实施例中所阐述的结晶学所测定；
-经由位于VH CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个或多个谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基接触hVISTA；和
和权利要求和/或实施例中所陈述的任一其他特性。
实例性抗体恒定区
在一些实施方案中，本文所阐述的抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区是选自IgA、IgG和IgD的同种型的恒定区。在一些实施方案中，人轻链恒定区是选自κ和λ的同种型的恒定区。在一些实施方案中，本文所阐述的抗体包含人IgG恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，本文所阐述的抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些此类实施方案中，本文所阐述的抗体在人IgG4恒定区中包含S241P突变。在一些实施方案中，本文所阐述的抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
重链恒定区的选择可测定抗体是否具有体内效应子功能。在一些实施方案中，此类效应子功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可使得杀死抗体所结合的细胞。在一些治疗方法(包括治疗一些癌症的方法)中，可期望细胞杀死，例如在抗体结合至支持肿瘤的维持或生长的细胞时。可支持肿瘤的维持或生长的实例性细胞包括(但不限于)肿瘤细胞自身、有助于使血管系统募集至肿瘤的细胞和提供支持或促进肿瘤生长或肿瘤存活的配体、生长因子或反受体的细胞。在一些实施方案中，在期望效应子功能时，选择包含人IgG1重链或选择人IgG3重链的抗体。
在某些实施方案中，改变本文所提供抗体以增加或降低抗体被糖基化的程度。抗体糖基化位点的添加或缺失可方便地通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来实现。
在抗体包含Fc区时，其所附接的碳水化合物可能有所变化。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具支链、二分枝寡糖，其通常通过N-键联附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。例如参见Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。所述寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及附接至二分枝寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可修饰本发明抗体中的寡糖以产生具有某些改善性质的抗体。举例而言，在一些实施方案中，可(例如)通过使通常含岩藻糖糖基化或经由其他方式进行糖基化的残基(例如Asn297)发生突变来使抗体变得无岩藻糖基化。在一些实施方案中，本文的抗体可包含无岩藻糖基化人IgG1恒定区。
进一步提供二等分寡糖的抗体，例如，其中附接至抗体Fc区的二分枝寡糖由GlcNAc二等分。此类抗体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体的实例阐述于(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利第6,602,684号(Umana等人)和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。此类抗体可具有改善的CDC功能。此类抗体阐述于(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
还提供具有氨基末端前导延伸区的抗体。举例而言，氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任一条或多条重链或轻链的氨基末端处。实例性氨基末端前导延伸区包含三个存在于抗体的一或两条轻链的氨基酸残基VHS或由其组成。
可(例如)在施用具有变体Fc区的多肽的转基因小鼠、人或非人灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽的体内或血清半衰期。例如参见Petkova等人，InternationalImmunology 18(12)：1759-1769(2006)。
在本发明的一些实施方案中，与包含岩藻糖的亲本抗体相比，无岩藻糖基化抗体在人效应细胞存在下更有效地介导ADCC，通常，可使用如本文所公开的体外ADCC测定来测定ADCC活性，但涵盖测定ADCC活性的其他测定或方法(例如在动物模型中等)。
在某些实施方案中，通过使用不同氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322、330和/或331的氨基酸可被不同氨基酸残基代替，从而抗体具有改变的对效应配体的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可为(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方式进一步详细阐述于Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中。
在一些实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸可被不同氨基酸残基代替，从而抗体具有经改变的C1q结合和/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方式进一步详细阐述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在一些实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基以借此改变抗体结合补体的能力。此方法进一步阐述于Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中。在一些实例中，可通过修饰下列位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或降低对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。实例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。实例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F7324T。可对Fc进行的其他Fc修饰是用于降低或除去与FcγR和/或补体蛋白的结合者，借此降低或除去Fc介导的效应子功能(例如ADCC、ADCP和CDC)。实例性修饰包括(但不限于)在位置234、235、236、237、267、269、325、328、330和/或331(例如330和331)的取代、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。实例性取代包括(但不限于)234A、235E、236R、237A、267R、269R、325L、328R、330S和331S(例如330S和331S)，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于减小FcγR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V以及通过突变或酶促方式或通过在并不使蛋白质糖基化的生物体(例如细菌)中产生来去除位置297的糖基化。这些和其他修饰综述于Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology20：685-691。举例而言，人IgG1.3 Fc恒定区含有L234A、L235E和G237A取代。IgG1fa.P238K(或IgG1.P238K)含有P238K取代。IgG1.1f包含L234A、L235E、G237A、A330S和P331S取代。
也可使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。此类变体可提供具有与FcγRIIb细胞(例如包括B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方案中，Fc变体提供相对于一种或多种活化受体与FcγRIIb选择性增强的亲和力。用于改变FcγRIIb结合的修饰包括在选自由以下组成的组的位置的一种或多种修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328、330、331和332(根据EU索引)。用于增强FcγR1lb亲和力的实例性取代包括(但不限于)234A、234D、234E、234F、234W、235D、235E、235F、235R、235Y、236D、236N、237A、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y、330S、331S和332E。实例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强FcγRIIb结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
用于增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括(但不限于)取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051和396L。这些和其他修饰综述于Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中。增加Fcγ受体结合的Fc修饰包括在以下Fc区氨基酸位置中的任一者或多者的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中的残基编号是EU索引的编号，如在专利公布第WO 00/42072号中。
任选地，Fc区可在其他和/或替代位置包含所属领域技术人员已知的非天然氨基酸残基(例如参见美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号；PCX专利公布WO 00/42072；WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/0201 14)。
Fc区对其配体的亲和力和结合性质可通过所属领域内已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，所述方法包括(但不限于)平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，BIACORE分析)和其他方法，例如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可在所检查组分的一者或多者上利用标记和/或采用多种检测方法，其包括(但不限于)发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编辑，Fundamental immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其针对抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方式是可能的。举例而言，这可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来达到。举例而言，下列残基中的一者或多者可发生突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375号中所阐述。具体实例性取代包括下列中的一者或多者：T252L、T254S和/或T256F。或者，为增加生物半衰期，可在CH1或CL区内改变抗体以含有自IgG的Fc区中CH2结构域的两个环所获取的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所阐述。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学特性的其他实例性变体包括在位置259、308、428和434的取代，包括(例如)2591、308F、428L、428M、434S、43411.434F、434Y和434X1。增加Fc与FcRn的结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216；Hinton等人，2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal ofBiological Chemistry，2001，276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人，Journal ofImmunology，2002，169：5171-5180；Dall’Acqua等人，2006，Journal of BiologicalChemistry 281：23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰阐述于Yeung等人，2010，JImmunol，182：7663-7671中。
在某些实施方案中，可使用具有特定生物特性的杂合IgG同种型。举例而言，可通过使用来自IgG3的两个同种型不同的位置的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可构建包含一个或多个取代(例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R和436F)的杂合变体IgG抗体。在本文所阐述的一些实施方案中，可通过使用来自IgG1的两个同种型不同的位置的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建包含一个或多个取代的杂合变体IgG抗体，所述取代是(例如)以下氨基酸取代中的一者或多者：233E、234L、235L、-236G(是指在位置236插入甘氨酸)和327A。
另外，已定位人IgG1上针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已阐述具有经改善结合的变体(参见Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334和339的改善FcγRIII结合的特异性突变。另外，显示改善FcγRIII结合的下列组合突变体：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，所述组合突变体已显示可展现增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields等人，2001)。已鉴别具有强烈增强的与FcγRIIIa的结合的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，其在食蟹猕猴中显示对FcγRIIIa的亲和力最大增加、FcγRIIb结合减少和强的细胞毒性活性(Lazar等人，2006)。向抗体(例如阿伦单抗(alemtuzumab)(CD52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20特异性)和西妥昔单抗(cetuximab)(EGFR特异性))中引入三重突变转译成大大增强的体外ADCC活性，并且S239D/I332E变体显示在猴中增强的耗尽B细胞的能力(Lazar等人，2006)。另外，已鉴别含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，其在B细胞恶性病和乳腺癌的模型中在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中展现增强的与FcγRIIIa的结合和同时增强的ADCC活性(Stavenhagen等人，2007；Nordstrom等人，2011)。可使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L如M428L/N434S。
在某些实施方案中，选择具有降低的与FcγR的结合的Fc。具有降低的FcγR结合的实例性Fc(例如IgG1 Fc)包含下列三个氨基酸取代：L234A、L235E和G237A。
在某些实施方案中，选择具有降低的补体结合的Fc。具有降低的补体结合的实例性Fc(例如IgG1 Fc)具有下列两个氨基酸取代：A330S和P331S。
在某些实施方案中，选择基本上不具效应子功能的Fc，即，其具有降低的与FcγR的结合和降低的补体固定。无效应子的实例性Fc(例如IgG1 Fc)包含下列五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。
在使用IgG4恒定结构域时，其可包括取代S228P，所述取代模拟IgG1中的铰链序列且借此稳定IgG4分子。
也可使用WO 2017/087678或WO2016081746中所阐述的Fc修饰。
在某些实施方案中，修饰抗体的糖基化。举例而言，可制备无糖基化抗体(即，抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来达到。举例而言，可进行一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除所述位点处的糖基化。此类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和性。此类方式进一步详细阐述于Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中。
可通过将N297残基突变成另一残基(例如N297A)和/或通过突变毗邻氨基酸(例如298)以借此降低N297上的糖基化来防止N297上恒定区的糖基化。
另外或或者，可制备具有经改变糖基化类型的抗体，例如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证实，此类经改变糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过(例如)在具有经改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体来达到。具有经改变糖基化机构的细胞在所属领域内已有所阐述且可用作其中表达本文所阐述重组抗体的宿主细胞以由此产生具有经改变糖基化的抗体。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195阐述具有编码岩藻糖基转移酶的功能被破坏的FUT8基因的细胞系，从而在此类细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835阐述将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低的变体CHO细胞系Led 3细胞，也导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342阐述经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经工程化细胞系中表达的抗体展现增加的二等分GlcNac结构，从而增强抗体的ADCC活性(也参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
本文所阐述抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。在一些实施方案中，聚乙二醇化是通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文中所使用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖PEG的已用于衍生其他蛋白质的任一形式，例如单(CI-CIO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，拟经聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法在所属领域内已知且可应用于本文所阐述的抗体。例如参见Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
在各个实施方案中，本文所阐述结合至VISTA的抗体经修饰以选择性阻断其中抗原结合将有害的组织和环境中的抗原结合，但容许其中其将有益的抗原结合(“可活化抗体”)。在一个实施方案中，产生特异性结合至抗体的抗原结合表面且干扰抗原结合的阻断肽“遮罩”，所述遮罩通过肽酶可裂解接头连接至抗体的每一结合臂。例如参见颁予CytomX的美国专利第8,518,404号。此类构建体可用于治疗在肿瘤微环境中蛋白酶含量与非肿瘤组织相比极大增加的癌症。选择性裂解肿瘤微环境中的可裂解接头容许遮蔽/阻断肽解离，这使得能够在肿瘤而非抗原结合可引起不期望副效应的外周组织中进行选择性抗原结合。连接至抗体的阻断肽的实例提供于WO 2018/08555中。
或者，在相关实施方案中，开发出包含两个抗原结合结构域的二价结合化合物(“遮蔽配体”)，其结合至(二价)抗体的两个抗原结合表面且干扰抗原结合，其中两个结合结构域遮罩通过(例如)可经肽酶裂解的可裂解接头彼此连接(而非与抗体连接)。例如参见颁予Tegopharm Corp的国际专利申请公布第WO 2010/077643号。遮蔽配体可包含或源自抗体旨在结合的抗原或可独立地产生。此类遮蔽配体可用于治疗在肿瘤微环境中蛋白酶含量与非肿瘤组织相比极大增加的癌症。选择性裂解肿瘤微环境中的可裂解接头容许两个结合结构域彼此解离，从而降低对抗体的抗原结合表面的亲合力。遮蔽配体与抗体的所得解离使得能够在肿瘤而非抗原结合可能引起不期望副效应的外周组织中进行选择性抗原结合。
核酸和宿主细胞
还提供编码抗体或其重链或轻链或其部分的核酸。实例性核酸提供于序列表中。本文涵盖任一与序列表中的核酸有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸。还涵盖包含编码本文所提供抗体的核酸的组合物以及包含这些组合物的细胞和制备抗体的方法，所述方法包括培养使用编码抗VISTA抗体的核酸转化的细胞，和自培养基或细胞分离抗体。
使用VISTA-ECD结合Ab和相关药物组合物的治疗方法
在某些实施方案中，在低pH结合至VISTA且(例如)在中性或生理pH不会显著结合的抗VISTA抗体可为VISTA拮抗剂抗体，即抑制VISTA作用以便刺激免疫反应的抗体。所述抗体可用于治疗其中期望刺激免疫系统或免疫反应的疾病，例如增殖性疾病(良性或恶性)、癌症和传染性疾病(例如病毒感染)。
在某些实施方案中，在低pH结合至VISTA且(例如)在中性或生理pH不会显著结合的抗VISTA抗体可为VISTA激动剂抗体，即增加VISTA作用以便抑制免疫反应的抗体。此类抗体可用于治疗其中期望抑制免疫系统或免疫反应的疾病，例如自身免疫疾病和发炎性病状，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、舍格伦综合征(Sjoigren’ssyndrome)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、发炎性肠病、牛皮癣、强直性脊柱炎、移植物抗宿主病、过敏和气喘。
本文所阐述的抗体可用于(例如)治疗癌症。在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括向患者施用有效量的本文所阐述的抗体。在一些实施方案中，Ab可触发或增强患者中的免疫反应(例如抗原特异性免疫反应)。在一些实施方案中，Ab可刺激T细胞活性。在一些实施方案中，Ab可抑制患者中的至少一种肿瘤的生长。
本文提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所阐述的抗VISTA抗体，从而治疗受试者。抗VISTA抗体可单独使用。或者，抗VISTA抗体可与另一剂联合使用，如下文进一步所阐述。
可使用如本文所阐述在酸性条件下特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab治疗的癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。可使用本文所阐述Ab治疗的癌症还包括通常对免疫疗法具有反应的癌症和通常并不对免疫疗法具有反应者。可治疗的癌症还包括VISTA阳性癌症，例如具有VISTA阳性肿瘤浸润细胞(例如淋巴细胞、髓系细胞或单核细胞)的癌症。癌症可为具有实体肿瘤或血液恶性病(液体肿瘤)的癌症。
用于治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或癌瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，例如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括那些由石棉诱导者)、病毒相关癌症或病毒起源的癌症(例如，人乳头瘤病毒(HPV相关或起源的肿瘤))和源自两种主要血细胞谱系(即髓系细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血栓细胞、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))中的任一者的血液学恶性病，例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(MO)、髓细胞性白血病(M1)、髓细胞性白血病(M2；细胞成熟)、早幼粒细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、粒单核细胞性白血病(具有嗜酸性粒细胞增多的M4或M4变体[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、分离的粒细胞性肉瘤和绿色瘤(chloroma)；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞血液学恶性病(例如B细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、前体T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴母细胞性肿瘤；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增生性病症、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系的造血性肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样霉菌病(mycosis fungoides)或塞扎里综合征(Sezary syndrome))和具有华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞淋巴瘤；髓系谱系的造血性肿瘤、间充质起源的肿瘤(包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)；精细原胞瘤、畸形癌、中枢和周围神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精细原胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸形癌、淋巴谱系的造血性肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括(但不限于)T细胞病症，例如T前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑回状细胞类型；T细胞类型的大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多型和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性髓系淋巴瘤以及所述癌症的任何组合。本文所阐述方法也可用于治疗转移性癌症、不可切除性癌症、难治性癌症(例如，对例如使用阻断性CTLA-4或PD-1抗体的先前免疫疗法具有难治性的癌症)和/或复发性癌症。
在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患有癌症的受试者施用如本文所阐述在酸性条件中特异性结合至huVISTA的经分离抗体。在一些实施方案中，提供本文所阐述的抗体用于治疗癌症的用途。
在某些实施方案中，将本文所阐述的抗体施用给患有针对先前治疗(例如使用免疫肿瘤学或免疫疗法药物的先前治疗)展现不适当反应或有所进展的癌症的患者。在一些实施方案中，癌症针对先前治疗具有难治性或抗性，所述难治性或抗性是固有的(例如针对PD-1路径拮抗剂的难治性)，或获得抗性或难治性状态。举例而言，可单独或与另一疗法(例如抗PD-1路径拮抗剂疗法)组合将本文所阐述的抗体施用给对第一疗法无反应或反应不足或在治疗(例如抗PD-1路径拮抗剂治疗)后具有疾病进展的受试者。在其他实施方案中，向先前未接受(即，经治疗)免疫-肿瘤剂(例如PD-1路径拮抗剂)的患者施用本文所阐述的抗体。
在某些实施方案中，治疗受试者的癌症的方法包括首先测定受试者中肿瘤的肿瘤突变负荷(TMB)，并且基于结果(例如)向发现具有高TMB的受试者施用抗VISTA抗体。
与免疫刺激剂的组合
在一些实施方案中，组合施用如本文所阐述的抗体(例如本文所阐述的拮抗剂VISTA抗体)与至少一种免疫刺激剂。举例而言，所述治疗剂可在大致相同时间一起输注或注射。在一些实施方案中，依序施用抗体和至少一种免疫刺激剂。举例而言，在一些实施方案中，在至少一种免疫刺激剂之前或之后依序施用抗体，从而间隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或两周来施用两种治疗剂。
在一些实施方案中，在施用至少一种免疫刺激剂之前施用至少一个剂量、至少两个剂量、至少三个剂量、至少五个剂量或至少十个剂量的抗体。在一些实施方案中，在施用抗体之前施用至少一个剂量、至少两个剂量、至少三个剂量、至少5五剂量或至少十个剂量的至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，在抗体的第一剂量之前至少一天、两天、三天、五天或十天或一周、两周、三周、五周、十二周或二十四周施用免疫刺激剂的最后剂量。在一些实施方案中，在至少一种免疫刺激剂的第一剂量之前至少一天、两天、三天、五天或十天或一周、两周、三周、五周、十二周或二十四周施用抗体的最后剂量。在一些实施方案中，受试者已接受或正接受使用至少一种免疫刺激剂的疗法且将VISTA-ECD结合抗体添加至治疗方案中。
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含T细胞活化抑制因子的拮抗剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含T细胞活化刺激因子的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含CTLA4、LAG-3、PD-1、PD-L1、半乳糖凝集素(Galectin)1、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD25、CD69、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、ILT4、IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF、KIR、LAG-3、腺苷A2A受体、PI3Kδ或IDO的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD27、CD40、CD40L、DR3、CD28H、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα、STING的激动剂或Toll样受体激动剂(例如TLR2/4激动剂)。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至膜结合蛋白的B7家族的另一成员(例如B7-1、B7-2、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4和B7-H6)的剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至TNF受体家族成员的剂或结合至TNF受体家族成员的共刺激或共抑制分子，所述TNF受体家族成员是(例如)CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn 14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、EDA1、EDA2、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DeR3、HVEM、VEGL/TL1A、TRAMP/DR3、TNFR1、TNFβ、TNFR2、TNFα、1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY或NGFβ。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含拮抗或抑制抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF)的剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含刺激T细胞活化的细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和IFNα)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含趋化因子(例如CXCR2、CXCR4、CCR2或CCR4)的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含抗体。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂可包含疫苗，例如间皮素靶向疫苗或减毒利斯特菌(listeria)癌症疫苗(例如CRS-207)。
举例而言，本文所阐述的抗VISTA抗体可与下列剂中的一者或多者一起施用：
(l)抑制T细胞活化的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2和LAG-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-3和TIM-4)的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)；和/或(2)刺激T细胞活化的蛋白质(例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H)的激动剂。
可与本文所阐述的抗VISTA抗体组合用于治疗癌症的实例性剂包括：
(伊匹单抗)或曲美木单抗(Tremelimumab)(针对CTLA-4)、加利昔单抗(galiximab)(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、阿特珠单抗(atezolizumab)
阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、PDR001(Novartis)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(ProvidenceHealth Services)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)(针对CD40)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(针对CD40)、莫罗单抗(Muromonab)-CD3(针对CD3)；抗GITR抗体MK4166、TRX518、Medi1873、INBRX-110、LK2-145、GWN-323、GITRL-Fc或其任一组合。
可与抗VISTA抗体组合治疗癌症的其他分子包括NK细胞上抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上活化受体的激动剂(例如KIR激动剂，例如立鲁单抗(lirilumab))。
也可通过可溶性细胞因子来调控T细胞活化。在一些实施方案中，抗VISTA抗体可与旨在抑制T细胞活化的细胞因子拮抗剂或刺激T细胞活化的细胞因子激动剂组合施用。举例而言，抗VISTA抗体可与以下各项组合使用：(i)抑制T细胞活化的IgSF家族或B7家族或TNF家族蛋白质的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫抑制性细胞因子”)的拮抗剂，和/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF家族的刺激性受体或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂。
用于组合疗法的其他剂包括抑制或耗尽巨噬细胞或单核细胞的剂，包括(但不限于)CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、W013/87699、W013/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；W013169264；WO14/036357)。
抗VISTA抗体也可与抑制TGF-β信号传导的剂一起施用。
可与抗VISTA抗体组合的其他剂包括增强肿瘤抗原提呈的剂，例如树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸和咪喹莫特(imiquimod)，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)。
可与抗VISTA抗体组合的其他疗法包括耗尽或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合至CD25的剂。
可与抗VISTA抗体组合的另一疗法是抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法。
可与抗VISTA抗体一起使用的另一类剂包括抑制腺苷形成(例如CD73抑制剂)或抑制腺苷A2A受体的剂。
可与抗VISTA抗体组合治疗癌症的其他疗法包括回复/防止T细胞失能或衰竭的疗法和触发肿瘤位点处的固有免疫活化和/或发炎的疗法。
可与抗VISTA抗体组合用于治疗癌症的其他疗法包括阻断IL-8的疗法，例如
-IL8。
抗VISTA抗体可与一种以上免疫-肿瘤剂组合，并且可(例如)与旨在靶向免疫路径的多个要素的组合方法组合，例如以下各项中的一者或多者：增强肿瘤抗原提呈的疗法(例如，树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；通过(例如)抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2路径和/或耗尽或阻断Treg或其他免疫抑制细胞抑制负性免疫调控的疗法；利用(例如)刺激CD-137、OX-40和/或CD40或GITR路径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂刺激正性免疫调控的疗法；全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的疗法；使用(例如)CD25的拮抗剂(例如，达利珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠粒耗尽来耗尽或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法；影响肿瘤中的抑制因子髓系细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)；包括经遗传修饰的细胞(例如由嵌合抗原受体修饰的细胞)的过继性T细胞或NK细胞转移(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺加双氧酶(IDO)、加双氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；回复/防止T细胞失能或衰竭的疗法；在肿瘤位点处触发先天免疫活化和/或发炎的疗法；施用免疫刺激性细胞因子；或阻断免疫抑制性细胞因子。
本文所阐述的抗VISTA抗体可与以下剂中的一者或多者一起使用：接合阳性共刺激性受体的激动剂、减弱经由抑制性受体信号传导的阻断剂、拮抗剂和一种或多种全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的剂、克服肿瘤微环境内的不同免疫抑制性路径(例如，阻断抑制性受体接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗尽或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如达利珠单抗)或通过离体抗CD25珠粒耗尽)、抑制代谢酶(例如IDO)或回复/防止T细胞无反应或衰竭)的剂和在肿瘤位点处触发先天免疫活化和/或发炎的剂。
在某些实施方案中，若受试者呈BRAF V600突变阳性，则将抗VISTA抗体与BRAF抑制剂一起施用给受试者。
适用于本文所阐述组合疗法中的PD-1拮抗剂包括(但不限于)配体、抗体(例如，单克隆抗体和双特异性抗体)和多价剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
实例性抗PD-1抗体是纳武利尤单抗(nivolumab)(BMS-936558)或包含WO 2006/121168中所阐述抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11中的一者的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是WO2012/145493中所阐述的MK-3475(兰布鲁珠单抗(Lambrolizumab))、WO 2012/145493中所阐述的AMP-514或PDR001。其他已知PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包含阐述于WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利第7,635,757号和第8,217,149号和美国专利公布第2009/0317368号中者。也可使用WO2013/173223中所公开的任一抗PD-1抗体。与所述抗体中的一者竞争结合和/或结合至与所述抗体中的一者相同的PD-1表位的抗PD-1抗体也可用于组合治疗中。
在一些实施方案中，可用于组合疗法的抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利第7,943,743号中称为12A4)或包含3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4(其阐述于PCT公布WO 07/005874和美国专利第7,943,743号中)的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(也称为德瓦鲁单抗和抗B7-H1)、MPDL3280A(也称为阿特珠单抗和RG7446)、MSB0010718C(也称为阿维鲁单抗；WO2013/79174)或rHigM12B7。也可使用公开于WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美国专利第7,635,757号和第8，217，149号和美国公布第2009/145493号中的任一抗PD-L1抗体。与所述抗体中的任一者竞争和/或结合至与所述抗体中的任一者相同的表位的抗PD-L1抗体也可用于组合治疗中。
在某些实施方案中，本发明的抗VISTA抗体可与CTLA-4拮抗剂(例如抗CTLA-4抗体)一起使用。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是选自以下组的抗体：
(伊匹单抗或抗体10D1，阐述于PCT公布WO 01/14424中)、曲美木单抗(先前的替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206)、阐述于下列出版物中的任一者中的单株或抗CTLA-4抗体：WO98/42752；WO 00/37504；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：文摘号2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res.58：5301-5304。也可使用WO2013/173223中所公开的抗CTLA-4抗体中的任一者。
在一些实施方案中，组合使用本发明的抗VISTA抗体与LAG3拮抗剂。抗LAG3抗体的实例包括含有抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5(其阐述于美国专利公布第US2011/0150892号、WO10/19570和WO2014/008218中)的CDR或可变区的抗体。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可使用的其他所属领域内所认可抗LAG-3抗体包括阐述于US2011/007023、WO08/132601和WO09/44273中的IMP731和IMP-321。与这些抗体中的任一者竞争和/或结合至相同表位的抗LAG-3抗体也可用于组合治疗中。
在一些实施方案中，本发明的抗VISTA抗体可与CD137(4-1BB)激动剂(例如激动性CD137抗体)组合施用。适宜CD137抗体包括(例如)乌瑞鲁单抗(urelumab)或PF-05082566(W012/32433)。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体可与OX40激动剂(例如激动性OX40抗体)组合施用。适宜OX40抗体包括(例如)MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一个实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与CD40激动剂(例如激动性CD40抗体)。在某些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD40拮抗剂，例如拮抗性CD40抗体。适宜CD40抗体包括(例如)鲁卡木单抗(HCD122)、达西珠单抗(SGN-40)、CP-870,893或Chi Lob 7/4。
在一个实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与CD27激动剂(例如激动性CD27抗体)。适宜CD27抗体包括(例如)瓦利珠单抗(varlilumab，CDX-1127)。
在某些实施方案中，抗VISTA抗体与抗GITR抗体一起施用，例如具有6C8的CDR序列的抗体，例如具有如例如WO2006/105021中所阐述的6C8的CDR的人源化抗体；包含WO2011/028683中所阐述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含JP2008278814中所阐述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含WO2015/031667、WO2015/187835、WO2015/184099、WO2016/054638、WO2016/057841或WO2016/057846中所阐述的抗GITR抗体的CDR的抗体或本文所阐述或提及的其他抗GITR抗体。
在一些实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与MGA271(针对B7H3)(WO11/109400)。
在一些实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与KIR拮抗剂(例如立鲁单抗)。
在一些实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与IDO拮抗剂。适宜IDO拮抗剂包括(例如)INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚莫德(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)或F001287。
在一些实施方案中，组合施用抗VISTA抗体与Toll样受体激动剂，例如TLR2/4激动剂(例如卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin))；TLR7激动剂(例如喜通诺(Hiltonol)或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如瑞喹莫德(resiquimod))；或TLR9激动剂(例如CpG7909)。
在一个实施方案中，组合施用抗VISTA与TGF-β抑制剂(例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1)。
在某些实施方案中，将抗VISTA剂(例如抗体)与抗PSGL-1抗体一起施用。
其他组合疗法
也可在其他治疗模式(例如手术、化学疗法、放射疗法或施用生物剂，例如另一治疗抗体)之前、基本上同时或之后提供本文的Ab。在一些实施方案中，在选自手术、化学疗法和放射疗法或其组合的疗法后，癌症已复发或恶化。举例而言，在出现存在微转移的风险时和/或为了降低复发的风险，可作为辅助疗法来施用如本文所阐述的抗VISTA抗体。
为治疗癌症，所述组合可与一种或多种其他抗癌剂(例如化学治疗剂、生长抑制剂、抗癌疫苗(例如基因疗法疫苗)、抗血管生成剂和/或抗赘生组合物)联合施用。可与本发明抗体组合使用的化学治疗剂、生长抑制剂、抗癌疫苗、抗血管生成剂和抗赘生组合物的非限制性实例在本文中提供于“定义”下。
在一些实施方案中，抗发炎性药物可与所述组合一起施用，例如类固醇或非类固醇抗发炎性药物(NSAID)。在期望组合使用本文所阐述抗VISTA抗体治疗或在其之前使异常增殖细胞静止的情形下，也可向患者施用激素和类固醇(包括合成类似物)，例如17a-炔雌醇(17a-Ethinylestradiol)、二乙基己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolonepropionate)、睾内酯、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基泼尼松龙(Methylprednisolone)、甲基-睾酮、泼尼松龙(Prednisolone)、曲安西龙(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羟基孕酮(Hydroxyprogesterone)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、雌莫司汀(Estramustine)、乙酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、
在采用本文所阐述的方法或组合物时，也可视需要施用用于调节临床环境中的肿瘤生长或转移的其他剂，例如抗模拟物。
本文所阐述的抗体也可与免疫原性剂(例如癌性细胞、经纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞的肽(进一步论述于下文中)。
在人体中，一些肿瘤已显示免疫原性，例如黑色素瘤。经由VISTA抑制减小T细胞活化的阈值，可活化宿主中的肿瘤反应，从而容许治疗非免疫原性肿瘤或具有有限免疫原性的那些。
本文所阐述的抗VISTA抗体也可与接种疫苗方案进行组合。已设计许多用于针对肿瘤接种疫苗的实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development of Cancer Vaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C，2000，ASCO Educational BookSpring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational Book Spring：730-738；还参见Restifo，N.和Sznol，M.，CancerVaccines，Ch.61，pp.3023-3043，DeVita等人(编辑)，1997，Cancer：Principles andPractice of Oncology，第五版)。在这些策略中的一者中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。这些细胞疫苗已显示在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原提呈的有效力的活化剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。
不同肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已产生所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg，SA(1999)Immunity 10：281-7)。在许多情形下，这些肿瘤特异性抗原是表达于肿瘤和产生肿瘤的细胞中的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，这些抗原中有许多可显示为宿主中所发现肿瘤特异性T细胞的靶。VISTA抑制可与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用以产生针对这些蛋白质的免疫反应。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原且由此对其耐受。肿瘤抗原可包括蛋白端粒酶，其是染色体的端粒的合成所需的且在85％以上人癌症和仅有限数量的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。由于改变蛋白质序列或在两条不相关序列(即费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)之间产生融合蛋白或来自B细胞肿瘤的受试者基因型的体细胞突变，肿瘤抗原也可为在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可包括来自参与人癌症的病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(Kaposi’s Herpes Sarcoma Virus，KHSV))的蛋白质。可与VISTA抑制联合使用的另一形式的肿瘤特异性抗原是自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白的片段且这些HSP高度有效地递送至抗原提呈细胞以用于引发肿瘤免疫性(Suot和Srivastava(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。
溶瘤病毒也可与VISTA抗体组合使用。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性反应的强力抗原提呈细胞。DC可离体产生且载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人(1998)Nature Medicine4：328-332)。DC也可通过遗传方式转导以表达这些肿瘤抗原。DC也直接融合至肿瘤细胞以用于免疫化目的(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可有效地与VISTA抑制组合来活化更强效的抗肿瘤反应。
传染性疾病治疗
本文所阐述方法也可用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本公开还涵盖治疗受试者的传染性疾病的方法，其包括向受试者施用如本文所阐述的抗体(例如拮抗剂VISTA抗体)，从而治疗受试者的传染性疾病。类似于如上文所论述抗体介导的VISTA抑制对于肿瘤的应用，其可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫反应。此治疗方式可尤其有用的病原体的实例包括当前并无有效疫苗的病原体或常规疫苗不能完全有效的病原体。这些病原体包括(但不限于)HIV、肝炎(A、B和C型)、流行性感冒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。VISTA抑制可针对由在感染过程中提呈改变抗原的试剂(例如HIV)的确立感染有用。
引起可由本文所阐述方法治疗的感染的病原体病毒的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱波斯坦-巴尔病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流行性感冒病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰白质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可由本文所阐述方法治疗的感染的病原体细菌的一些实例包括衣原体属(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsiai bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团菌属(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌属(salmonella)、杆菌属(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病细菌(Lymes disease bacteria)。
引起可由本文所阐述方法治疗的感染的病原体真菌的一些实例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉菌属(GenusMucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可由本文所阐述方法治疗的感染的病原体寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，VISTA抑制可与其他形式的免疫疗法(例如本文所阐述者，例如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2))或可提供增强的肿瘤抗原提呈的双特异性抗体疗法组合(例如参见Holliger(1993)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)。
施用途径和载剂
在各个实施方案中，可在体内通过各种途径施用抗体，包括(但不限于)口服、动脉内、非经肠、鼻内、肌内、心脏内、心室内、气管内、经颊、直肠、腹膜内、真皮内、局部、经皮和鞘内或另外通过植入或吸入。可将主题组合物调配成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括(但不限于)片剂、胶囊、粉剂、粒剂、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。可将编码抗体的核酸分子涂覆于金微颗粒上并通过颗粒轰击装置或“基因枪”经真皮内递送，如文献中所阐述(例如参见Tang等人，Nature 356：152-154(1992))。可根据预期应用来选择适当配方和施用途径。
在各个实施方案中，将包含抗体的组合物与各种药学上可接受的载剂一起提供于配方中(例如参见Gennaro，Remington：The Science and Practice of Pharmacy withFacts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版(2003)；Ansel等人，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，PharmaceuticalPress(2000))。可利用各种药学上可接受的载剂，其包括媒介物、佐剂和稀释剂。此外，也可利用各种药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂和诸如此类。非限制性实例性载剂包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和其组合。
在各个实施方案中，可通过以下方式来调配包含抗体的组合物以用于注射(包括皮下施用)：将其和(若期望)常规添加剂(例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其他油、合成脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸的酯或丙二醇)中。在各个实施方案中，可(例如)使用加压可接受推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和诸如此类)调配组合物以用于吸入。在各个实施方案中，也可(例如)使用生物可降解或生物不可降解聚合物将组合物调配成持续释放微胶囊。非限制性实例性生物可降解配方包括聚乳酸-乙醇酸聚合物。非限制性实例性生物不可降解配方包括聚甘油脂肪酸酯。制备此类配方的某些方法阐述于(例如)EP 1 125 584 A1中。
还提供包括一个或多个容器的药物包装和试剂盒，每个容器含有一个或多个剂量的抗体或抗体组合。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的包含抗体或抗体组合且含有或不含一种或多种其他剂的组合物。在一些实施方案中，以注射用单用途预填充注射器形式供应这种单位剂量。在各个实施方案中，含于单位剂量中的组合物可包含盐水、蔗糖或诸如此类；缓冲剂，例如磷酸盐或诸如此类；和/或在稳定和有效的Ph范围内调配。或者，在一些实施方案中，组合物可提供为冻干粉末，其可在添加适当液体(例如无菌水)后发生重构。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括(但不限于)蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，本发明组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
以有效治疗或预防特定适应症的量施用药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗受试者的体重、其身体或健康状况、拟治疗病状的延伸性或所治疗受试者的年龄。一般而言，可以约10μg/kg体重/剂量至约100mg/kg体重/剂量范围的量施用抗体。在一些实施方案中，可以约50μg/kg体重/剂量至约5mg/kg体重/剂量范围的量施用抗体。在一些实施方案中，可以约100μg/kg体重/剂量至约10mg/kg体重/剂量范围的量施用抗体。在一些实施方案中，可以约100μg/kg体重/剂量至约20mg/kg体重/剂量范围的量施用抗体。在一些实施方案中，可以约0.5mg/kg体重/剂量至约20mg/kg体重/剂量范围的量施用抗体。
可视需要向受试者施用抗体组合物。施用频率可由所属领域技术人员(例如主治医师)基于以下考虑来确定：所治疗病状、所治疗受试者的年龄、所治疗病状的严重程度、所治疗受试者的一般健康状态和诸如此类。在一些实施方案中，向受试者施用有效剂量的抗体一次或多次。在各个实施方案中，每月一次、每月小于一次(例如每两个月一次或每三个月一次)向受试者施用有效剂量的抗体。在其他实施方案中，每月一次以上(例如每三周一次、每两周一次或每周一次)施用有效剂量的抗体。在一些实施方案中，每1、2、3、4或5周一次施用有效剂量的抗体。在一些实施方案中，每周两次或三次施用有效剂量的抗体。向受试者施用有效剂量的抗体至少一次。在一些实施方案中，可施用有效剂量的抗体多次，包括至少一个月、至少6个月或至少一年的时段。
在某些实施方案中，抗VISTA抗体和本文所论述的第二剂的组合可以于药学上可接受的载剂中的单一组合物形式同时施用，或以抗VISTA抗体和第二剂于药学上可接受的载剂中的单独组合物形式同时施用。在一个实施方案中，可依序施用抗VISTA抗体和第二剂的组合。两种剂的施用可开始于(例如)间隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周的时间，或第二剂的施用可开始于在已施用第一剂之后(例如)30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一周或多周。
鉴别低pH结合性hVISTA-ECD Ab的方法
本文还提供鉴别在酸性(或低pH)条件中特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab的方法。在某些实施方案中，鉴别在pH 6.5或更小pH下特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab的方法包括使一个测试Ab或多个测试Ab与VISTA-ECD蛋白在pH 6.5或更小pH下接触，并且选择以10-7M、10-8M、10-9M或更小的KD结合至VISTA蛋白的ECD的测试Ab。在一些实施方案中，所述方法是在pH 6.5下实施，而在其他实施方案中，其是在pH 6.0下或在pH 5.5下或在pH 5.0下实施。在一些实施方案中，VISTA-ECD蛋白是hVISTA-ECD蛋白，或包含hVISTA IgV结构域，或是包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95或SEQ ID NO：2的氨基酸20-70、35-95或35-70的多肽。在一些实施方案中，多肽还包含SEQ ID NO：2的氨基酸95-105。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸35-127或37-125。
在一些实施方案中，所述方法还包括测试所述测试Ab或多个测试Ab在中性、生理或碱性pH(例如在pH 7.0或pH 7.4下)的结合。在一些实施方案中，所述方法还包括选择不仅在pH 6.5或更低pH下以10-7M、10-8M、10-9M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白且也在pH7.0或pH 7.4下特异性结合至多肽的抗体。在一些实施方案中，选择在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白且也在中性和/或碱性pH以类似亲和力特异性结合VISTA-ECD蛋白的测试Ab(即其是“泛结合剂”)。举例而言，一些此类Ab可在pH 6.5下和在pH 7.0或pH 7.4下(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)以10-7M、10-8M、10-9M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白，从而pH 6.5下的KD在pH 7.0下的KD的1.5倍内。
可选择某些在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)以高于中性或碱性pH的亲和力特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab(“pH敏感性结合剂”或“pH敏感性Ab”)。举例而言，在一些实施方案中，Ab可以10-8M或更小的KD在pH 6.5下和以大于10-8M的KD在pH 7.0或pH 7.4下结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在pH 6.5下以10-8M或更小的KD和在pH 7.0或pH 7.4下以高于pH 6.5下1.5倍以上的KD结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，选择在pH 6.5下以低于pH 7.0或pH 7.4下至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白的pH敏感性Ab。举例而言，在一些情形下，选择在pH 6.0下以小于pH 7.0或pH 7.4或更高pH至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
在某些实施方案中，选择在酸性条件中以低于中性、生理或碱性条件的k解离特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在某些实施方案中，选择在酸性条件中于pH 6.5下以低于pH7.0或pH 7.4下的k解离至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，在一些实施方案中，选择在pH6.0下以低于pH 7.0或pH 7.4至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
在某些实施方案中，选择在酸性条件中以高于中性或碱性条件的k缔合结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在某些实施方案中，选择在酸性条件中于pH 6.5下以低于pH 7.0或pH7.4下的k缔合至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，在一些实施方案中，选择在pH 6.0下以低于pH7.0或pH 7.4至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
改善VISTA-ECD结合Ab的pH敏感性的方法
可工程化结合至VISTA-ECD蛋白但在pH 6.5或更小pH下并不结合或在pH 6.5或更小pH下并不以高亲和力结合的Ab以增加其在pH 6.5或更低pH下的结合亲和力。举例而言，可(例如)通过取代一个或多个氨基酸残基来使Ab上的配位(paratope)发生突变。举例而言，在一些实施方案中，Ab重链或轻链中作为VISTA-ECD接触残基的1至8(例如1至6、1至4、1至3、1至2或1)个氨基酸残基(例如一个或多个CDR中的残基)可经不同氨基酸残基代替。然后，可测试突变Ab在pH 6.5或更小pH下与VISTA-ECD蛋白的结合且可选择以高于亲本抗体的亲和力结合的Ab物质。若期望，可重复上述步骤，从而对Ab实施两轮或更多轮诱变和选择且选择在酸性pH的最高亲和力结合剂。在一些实施方案中，此类选择可改善所得抗体较其亲本的抗肿瘤功效。
上述选择方法也可经设计以遵循VISTA-ECD蛋白特异性结合抗体的前述一般选择。即，在某些实施方案中，选择在pH 6.5下以10-8M或更小的KD结合至VISTA蛋白的ECD的经改善Ab。在一些实施方案中，在pH 6.0下或在pH 5.5下或在pH 5.0下而非在pH 6.5下实施选择。在一些实施方案中，用于选择过程的VISTA-ECD蛋白是完整hVISTA-ECD蛋白，或是包含hVISTA IgV结构域的多肽，或是包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95或SEQ ID NO：2的氨基酸20-70、35-95或35-70的多肽。在一些实施方案中，多肽也包含SEQ ID NO：2的氨基酸95-105。在一些实施方案中，使用包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-127的多肽。
在一些实施方案中，改善VISTA抗体在酸性pH与VISTA ECD的结合的方法包括增加一个或多个VH或VL CDR(例如VH CDR1、CDR2和CDR3或仅VH CDR1和CDR3)中的谷氨酸、天门冬氨酸和/或组氨酸残基的数量。在某些实施方案中，方法包括增加接触hVISTA的抗体区域中的谷氨酸、天门冬氨酸和/或组氨酸残基的数量，如(例如)通过结晶学所测定。
在一些实施方案中，所述方法还包括测试所选Ab在中性、碱性或生理pH(例如在pH7.0或7.4下)的结合。在一些实施方案中，所述方法还包括选择不仅在pH 6.5或更低pH下以10-8M或更小的KD结合至VISTA-ECD蛋白且也在pH 7.0或7.4下特异性结合至多肽的抗体。在一些此类实施方案中，选择在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白且也在中性和/或碱性或生理pH以类似亲和力特异性结合VISTA-ECD蛋白的Ab(即其是“泛结合剂”)。举例而言，一些此类Ab可以10-8M或更小的KD在pH 6.5和pH 7.0下(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白，从而pH 6.5下的KD在pH 7.0下或pH 7.4下的KD的1.5倍内。
可选择某些在酸性条件中(例如在pH 6.5或更小pH下)以高于中性、生理或碱性pH的亲和力特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab(“pH敏感性结合剂”或“pH敏感性Ab”)。举例而言，在一些实施方案中，Ab可以10-8M或更小的KD在pH 6.5下和以大于10-8M的KD在pH 7.0下结合至VISTA-ECD蛋白。在一些此类实施方案中，Ab可在pH 6.5下以10-8M或更小的KD和在pH7.0下以高于pH 6.5下1.5倍以上的KD结合至VISTA-ECD蛋白。在某些实施方案中，选择pH敏感性Ab，其在pH 6.5下以低于pH 7.0或pH 7.4下至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)特异性结合至VISTA-ECD蛋白。举例而言，在一些情形下，选择在pH 6.0下以小于pH 7.0或pH 7.4或更高pH至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍或5000倍的KD(在恒定温度下，例如在25℃或37℃下)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
在某些实施方案中，所述方法还包括在两种pH值下测定k解离。在一些此类实施方案中，选择在酸性条件中以低于中性、生理或碱性条件的k解离特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在某些实施方案中，选择在酸性条件中于pH 6.5下以低于pH 7.0或pH 7.4下的k解离至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，在一些实施方案中，选择在pH 6.0下以低于pH 7.0至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k解离(如例如在25℃下或在37℃下所测量)特异性结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
在某些实施方案中，所述方法还包括在两种pH值下测定k缔合。在一些此类实施方案中，选择在酸性条件中以高于中性、生理或碱性条件的k缔合结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。在某些实施方案中，选择在酸性条件中于pH 6.5下以低于pH 7.0或pH 7.4下的k缔合至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。举例而言，在一些实施方案中，选择在pH 6.0下以低于pH 7.0或pH 7.4至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的k缔合(如例如在25℃下或在37℃下所测量)结合至VISTA-ECD蛋白的Ab。
可通过以下方式来鉴别相对于中性或生理pH在酸性pH结合优先至huVISTA的抗体：正向筛选在酸性pH(例如pH 6.0或6.5)结合的VISTA抗体或Fab或scFv的库，并且负向筛选在中性pH(例如pH 7.0)或生理pH(例如pH 7.4)并不结合的库。库可富集谷氨酸、天门冬氨酸和组氨酸残基以(例如)选择可带电且更很可能在酸性pH结合至VISTA的结合结构域。所述筛选可涉及在酸性pH的正向选择和在中性或生理pH的负向选择。正向和负向选择可交替进行。
或者，可工程化在中性和酸性pH结合至VISTA的抗体以在中性pH并不结合且维持或甚至增强在酸性pH的结合。举例而言，可通过取代(例如)一个或多个CDR中的VH和任选地VL氨基酸残基且筛选库(通过正向选择在酸性pH结合至hVISTA的抗体且负向选择在中性(或生理学)pH不结合至VISTA的抗体)来产生库。可使用类似方法来工程化具有期望pH选择性、pH依赖性或pH非依赖性VISTA结合特征的VISTA结合抗体。
特定实施方案
本公开的其他实施方案包括下列各项：
1.一种经分离抗体(Ab)，其特异性结合至人含有V-结构域免疫球蛋白的T细胞活化抑制因子(hVISTA)细胞外结构域(ECD)，其中所述Ab：
a.在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的亲和力常数(KD)结合至hVISTA-ECD；
b.在pH 6.5或更小pH下以10-3sec-1或更小的解离速率常数(k解离)结合至hVISTA-ECD；或
c.在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD和10-3sec-1或更小的k解离结合至hVISTA-ECD。
2.如实施方案1所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5或更小pH下以10-8M或更小的KD结合至hVISTA-ECD。
3.如实施方案2所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5或更小pH下以10-9M或更小的KD结合至hVISTA-ECD。
4.如实施方案1至3中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5或更小pH下以10-4sec-1或更小的k解离结合至hVISTA-ECD。
5.如实施方案1至4中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 7.0或更高pH下以以下参数结合至hVISTA-ECD：
a.10-7M或更小的KD；
b.10-3sec-1或更小的k解离；或
c.10-7M或更小的KD和10-3sec-1或更小的k解离。
6.如实施方案5所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 7.0或更高pH下以10-8M或更小的KD结合至hVISTA-ECD。
7.如实施方案6所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 7.0或更高pH下以10-9M或更小的KD结合至hVISTA-ECD。
8.如实施方案5至7中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 7.0或更高pH下以10-4sec-1或更小的k解离结合至hVISTA-ECD。
9.如实施方案5至8中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以类似于在pH 7.0下的亲和力结合至hVISTA-ECD。
10.如实施方案9所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以高于在pH 7.0下的亲和力结合至hVISTA-ECD。
11.如实施方案10所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少1.5倍的KD结合至hVISTA-ECD。
12.如实施方案11所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少2倍的KD结合至hVISTA-ECD。
13.如实施方案11所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少5倍的KD结合至hVISTA-ECD。
14.如实施方案10至13中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下的k解离结合至hVISTA-ECD。
15.如实施方案14所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少1.5倍的k解离结合至hVISTA-ECD。
16.如实施方案15所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少2倍的k解离结合至hVISTA-ECD。
17.如实施方案16所述的经分离Ab，其中所述Ab在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少5倍的k解离结合至hVISTA-ECD。
18.如实施方案1至17中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab在其中hVISTA-ECD的至少一种组氨酸残基发生质子化的条件下特异性结合至hVISTA-ECD。
19.如实施方案18所述的经分离Ab，其中所述Ab结合至hVISTA-ECD的IgV结构域。
20.如实施方案19所述的经分离Ab，其中所述Ab结合至位于SEQ ID NO：2的氨基酸20和95内的区域。
21.如实施方案20所述的经分离Ab，其中所述Ab结合至位于SEQ ID NO：2的氨基酸20和70内的区域。
22.如实施方案21所述的经分离Ab，其中所述Ab结合至位于SEQ ID NO：2的氨基酸35和70内的区域。
23.如实施方案20至22中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab进一步结合至hVISTA的所述ECD的另一区域。
24.如实施方案23所述的经分离Ab，其中所述另一区域位于SEQ ID NO：2的氨基酸95和105内。
25.如实施方案18至24中任一项所述的经分离Ab，其中通过氢-氘交换质谱(HDX-MS)来测定结合。
26.如实施方案1至25中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab抑制hVISTA与hVISTA原本所结合细胞的结合。
27.如实施方案1至26中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab触发或增强肿瘤模型中的免疫反应。
28.如实施方案27所述的经分离Ab，其中所述Ab触发或增强肿瘤模型中的T细胞活性。
29.如实施方案1至28中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab抑制肿瘤模型中的肿瘤生长。
30.如实施方案1至29中任一项所述的经分离Ab，其中所述Ab抑制hVISTA与T细胞的结合。
31.如实施方案30所述的Ab，其中所述Ab在pH 6.5或更小pH下较在pH 7.0或更高pH下更强烈地抑制hVISTA与T细胞的结合，例如其中所述抗体在pH 6.5下较在pH 7.0下更强烈抑制hVISTA与T细胞的结合。
32.一种组合物，其包含如实施方案1至31中任一项所述的经分离Ab和药学上可接受的载剂。
33.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如实施方案32所述的组合物。
34.一种鉴别在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD的Ab的方法，其包括使一个测试Ab或多个测试Ab与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70或35-70的片段在pH 6.5或更小pH下接触，和选择以10-7M或更小的KD结合至所述多肽的一种或多种测试Ab。
35.一种鉴别在pH 6.5或更小pH下以10-3sec-1或更小的K解离结合至hVISTA-ECD的Ab的方法，其包括使一个测试Ab或多个测试Ab与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70或35-70的片段在pH 6.5或更小pH下接触，和选择以10-3sec-1或更小的K解离结合至所述多肽的一种或多种测试Ab。
36.一种鉴别在pH 6.5下以类似于在pH 7.0下的亲和力特异性结合至hVISTA-ECD的Ab的方法，其包括：
a.使一个测试Ab或多个测试Ab在pH 6.5下与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70或35-70的片段接触；
b.使测试Ab或多个测试Ab在pH 7.0下与(a)的所述多肽接触；和
c.选择在pH 6.5下和在pH 7.0下以10-7M或更小的KD结合至所述多肽的测试Ab。
37.一种鉴别在pH 6.5下较在pH 7.0下以较高亲和力结合至hVISTA-ECD的Ab的方法，其包括：
a.使一个测试Ab或多个测试Ab在pH 6.5下与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-95、20-70或35-70的片段接触；
b.使测试Ab或多个测试Ab在pH 7.0下与(a)的所述多肽接触；和
c.选择在pH 6.5下以低于在pH 7.0下至少2倍的KD结合至所述多肽的测试Ab。
38.一种鉴别用于治疗癌症的特异性结合至hVISTA-ECD的Ab的方法，其包括
a.根据(例如)如实施方案32-35的方法鉴别在pH 6.5或更小pH下特异性结合至hVISTA-ECD的Ab；和
b.选择在pH 6.5或更小pH下触发或增强肿瘤模型中的免疫反应或抑制肿瘤生长的Ab。
39.如实施方案38所述的方法，其中步骤(b)包括测量T细胞活性。
40.如实施方案38或39所述的方法，其还包括测量所述Ab的抗肿瘤效应。
41.一种改善结合至hVISTA-ECD的Ab的抗肿瘤功效的方法，其包括
a.提供在pH 6.5或更小pH下以小于期望值的亲和力，例如以10-7M或更大，例如10-6M、10-5M或更大的KD和/或10-2sec-1或更大的k解离结合至hVISTA-ECD的Ab；
b.使用不同氨基酸残基代替所述Ab的重链或轻链中的1至5个氨基酸残基，其中所述1至5个氨基酸残基是hVISTA-ECD的接触残基；
c.测定(b)中所获得的所述Ab是否在pH 6.5或更小pH下具有高于(a)的所述Ab的hVISTA-ECD亲和力；和
d.重复步骤(a)至(c)多轮以足以获得在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD的Ab。
42.一种改善结合至hVISTA-ECD的Ab的抗肿瘤功效的方法，其包括：
a.提供在pH 6.5或更小pH下以小于期望值的亲和力，例如以10-7M或更大，例如10-6M、10-5M或更大的KD和/或10-2sec-1或更大的k解离结合至hVISTA-ECD的Ab；
b.制备(a)的所述Ab的变体库，其中每个变体包括使用不同氨基酸残基取代所述Ab的重链或轻链中的1至5个氨基酸残基，其中所述1至5个氨基酸残基是hVISTA-ECD的接触残基；
c.选择(b)的所述变体库中在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD的Ab；和任选地，
d.在肿瘤模型中测试(c)的所述Ab的抗肿瘤功效。
43.一种改善抗体结合至人VISTA ECD的药代动力学的方法，其包括增强所述抗体在酸性条件中，例如在等于或低于pH 6.5下结合至人VISTA的能力。
44.一种选择结合至人VISTA且具有延长半衰期(良好药代动力学性质)的抗体的方法，其中所述方法包括选择在酸性条件中，例如在等于或低于pH 6.5下结合至人VISTA的抗体。
其他实例性实施方案提供于下文的权利要求中。
实施例
下文所论述实施例仅旨在示范本发明且不应视为以任何方式限制本发明。所述实施例并不旨在表示下文实验是所实施的所有实验或唯一实验。已努力确保所用数值(例如量、温度等)的精确度，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度以℃表示，并且压力为大气压力或接近大气压力。
实施例1：VISTA的细胞外结构域格外富含组氨酸
此实施例显示，VISTA的细胞外结构域格外富含组氨酸残基，这些组氨酸残基在进化中保守，并且其可有助于涉及VISTA的受体-配体相互作用。
自uniprot和swiss-prot数据库提取含有免疫球蛋白结构域的蛋白质的细胞外结构域(ECD)的氨基酸序列且分析组氨酸含量。图1A将此分析的结果绘示成图。对于每种蛋白质而言，组氨酸残基的频率(以占所有细胞外结构域氨基酸残基的百分比形式)绘示于y轴上，并且细胞外结构域氨基酸残基的总数绘示于x轴上。每个数据点的直径对应于每种蛋白质的细胞外结构域中的组氨酸残基的总数。VISTA(经标记)在其细胞外结构域中含有格外高频率的组氨酸残基。
然后评价VISTA中的组氨酸残基的进化保守。图1B显示人VISTA、食蟹猕猴VISTA和小鼠VISTA的比对氨基酸参考序列，不包括信号肽(“Sig”)、跨膜结构域(“TMD”)和细胞内结构域。在所有三个物种中均保守的组氨酸残基加粗体且加下划线。在人VISTA和食蟹猕猴VISTA中保守的组氨酸残基加粗体且并不加下划线。许多VISTA细胞外结构域组氨酸残基在进化中保守，从而表明其对于VISTA的高组氨酸含量具有重要生物作用。
基于对PDB数据库中的可用解析结构的序列同源性分析来产生hVISTA IgV结构域的三维模型。图1C中所显示的模型指示，VISTA ECD中的许多组氨酸暴露于分子表面处，在此其可在配体结合以及抗体识别中发挥作用。组氨酸残基绘示为球和棍。
实施例2：组氨酸质子化可调控肿瘤和其他酸性微环境中的VISTA受体-配体接合和免疫抑制性活性
此实施例阐述因回应于生理相关酸性pH的组氨酸质子化以及其中VISTA细胞外结构域组氨酸在酸性pH而非生理pH赋予反受体或配体选择性的模型。
图2A显示组氨酸残基中的吡咯铵基团(NH)缺乏质子化与存在质子化之间的平衡。组氨酸在溶液中的pKa为6.5，从而指示组氨酸残基相对于在较高pH下更可能在pH 6.5和更低pH下发生质子化且由此带正电。VISTA ECD表面因质子化而产生的正电荷增加可影响受体或配体结合以及VISA结构和/或功能。因此，pH变化也可修饰抗体结合表位和/或使得抗体亲和力有所变化。
图2B显示其中VISTA在酸性pH选择性接合PSGL-1或其他反受体和配体(“VISTA-R”)的模型。在生理pH(例如在血液中)，VISTA ECD上的组氨酸残基预计并不质子化。因此，VISTA在生理pH与PSGL-1或其他反受体和配体的结合可忽略不计。与之相比，在往往具有酸性细胞外pH的位置(例如肿瘤微环境或发炎部位)，酸性pH可部分地或完全驱动VISTA ECD组氨酸质子化且由此使得VISTA能够接合PSGL-1或其他反受体和配体。因此，在酸性pH范围强烈结合至VISTA-ECD蛋白的抗体可更有效地抑制肿瘤中的VISTA活性。
实施例3：通过肿瘤中的粒单核细胞表达VISTA
此实施例显示，通常通过肿瘤中的粒单核细胞(包含巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞)表达VISTA。
在冰冷PBS中洗涤手术切除的非小细胞肺癌、肾透明细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌和其他肿瘤样本，切割成大约15mm3大小的切片，并悬浮于补充有2％热灭活FBS和2mM EDTA(Fisher Scientific 15575020)的冰冷RPMI-1640培养基(Fisher Scientific目录号11875093)中。将每个样本转移至大型玻璃研磨装置(Tenbroeck Tissue Grinders)中，并研磨直至目测组织切片已分离为止。悬浮液通过70μM尼龙筛网过滤并离心。弃除上清液，并且在室温下，将细胞团粒重悬于补充有0.1％牛血清白蛋白和250mg/mL无菌过滤的DNase 1(等级II，来自牛胰脏，Roche目录号10104159001)的室温PBS中保持3分钟。然后在冰冷经补充RPMI中洗涤细胞并重悬于冰冷PBS中。添加细胞活力染料且将细胞于暗处在冰上培育。在20分钟之后，通过添加4％正常大鼠血清、4％正常小鼠血清、20％来自AB血浆的人血清和稀释1∶125的人TruStain FcXTM(Biolegend目录号422302)来阻断非特异性抗体染色。于暗处在冰上，使用悬浮于Brilliant染色缓冲液(BD Biosciences目录号562794)中的针对HLA-DR(BD Biosciences目录号564040)、CD8(Fisher Scientific目录号46-0087-42)、CD14(Biolegend目录号325620)、CD45(Biolegend目录号304017)、CD4(BD Biosciences目录号563875)、CD11c(BD Biosciences目录号744439)、CD15(BD Biosciences目录号563142)、PD-1(BD Biosciences目录号565299)、CD3(BD Biosciences目录号565515)、CD56(FisherScientific目录号61-0567-42)、CD19(BD Biosciences目录号564977)和VISTA(缀合至AlexaFluorTM 647的VISTA抗体3，Fisher Scientific目录号A20186)的荧光团缀合的抗体将细胞染色30分钟。在冰冷PBS中洗涤经染色细胞，固定(Fisher Scientific目录号00-5523-00)，并于流式细胞仪上读取数据。使用FlowJoTM软件(BD Biosciences)分析数据。如图3中所显示，在巨噬细胞和粒细胞上的VISTA细胞表面表达最高，在树突状细胞上的表达为中等，并且在T细胞、自然杀伤细胞和B细胞上的表达低。
实施例4：VISTA细胞结合性展现酸性pH选择性
此实施例显示，多聚的人VISTA ECD在酸性pH下，比在中性或生理pH下更有效地结合至经刺激的人CD4+ T细胞和人外周血单核细胞，并且此结合可通过抗人VISTA阻断性抗体来阻断。也显示酸性pH选择性二聚合小鼠VISTA ECD结合至小鼠脾细胞。
通过RosetteSepTM(Stemcell目录号15062)自健康供体血液富集人CD4+ T细胞并在体外使用人T-活化因子CD3/CD28 DynabeadsTM(Fisher Scientific目录号111.32D)和重组人IL-2(Peprotech目录号200-02)在补充有10％热灭活FBS、GlutamaxTM(FisherScientific目录号35050061)、非必需氨基酸(Fisher Scientific 11140050)、丙酮酸钠(Fisher Scientific目录号11360070)和2-巯基乙醇(Fisher Scientific 21985023)的RPMI-1640中刺激大约4天。使用以28：1摩尔比率加载于藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素(streptavidin)迪克拉美(dextramer)(目录号DX01-PE)的单生物素化hVISTA ECD分子(Phe 33-Ala 194(登录号AAH20568)-聚组氨酸；AcroBiosystems，Inc.B75-H82F3)(稀释至使用mM MES(Sigma，1317-100ML)酸化至各种pH的汉克氏缓冲盐溶液(Hank’s BufferedSalt Solution)(HBSS，Fisher Scientific目录号14025134)中)将经活化CD4+ T细胞在室温下染色30分钟。作为对照，使用未加载hVISTA的PE缀合的链霉亲和素迪克拉美将活化CD4+ T细胞染色。使用HBSS+MES洗涤经染色细胞并获取于流式细胞仪上。使用FlowJoTM软件(BDBiosciences)分析数据。图4A中所绘示的结果显示，hVISTA在pH＞6.5下与对照相比并不更佳地结合CD4+ T细胞。与之相比，hVISTA在pH＜6.5下展现渐强的CD4+ T细胞结合。在左侧，自较深灰色至较浅色，填充直方图绘示在pH 7.0、6.5、6.4、6.3、6.1和6.0下的结合。一些直方图用其对应pH标记。pH 6.0下的非VISTA对照多聚体结合显示为未填充直方图。在右侧，将经加载hVISTA的迪克拉美(圆形)或未加载迪克拉美(三角形)染色的CD4+ T细胞在各种pH下的PE平均荧光强度(MFI)绘图。
通过ficoll梯度离心(Ficoll-Paque Plus，GE Life Sciences目录号17144003)自健康供体血液富集外周血单核细胞(PBMC)并使用如上文所阐述稀释于HBSS+MES缓冲液中的加载hVISTA的迪克拉美(也称为多聚体)和荧光团缀合抗体的染色。图4B显示填充直方图，其自较深灰色至较浅色绘示在pH 6.0下与CD19+ B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD56+NK细胞和CD14+单核细胞的结合。未填充、实线边界和虚线边界直方图分别绘示在pH 7.4下与总PBMC淋巴细胞和单核细胞的结合。图4F和4G显示，VISTA结合至单核细胞和中性粒细胞，并且在pH 6.0下的结合强于在pH 7.4下。结果显示，hVISTA可在酸性pH结合许多白细胞，但在生理pH的结合并不显著。
使用hVISTA多聚体在pH 6下于经滴定抗人VISTA抗体或同种型匹配非VISTA特异性抗体存在下将经活化人CD4+ T细胞染色。图4C中所绘示结果显示相对于抗体浓度的VISTA多聚体MFI。抗hVISTA抗体(VISTA抗体3；正方形)以浓度依赖性方式阻断hVISTA与经活化CD4+ T细胞的结合，但非VISTA特异性对照抗体(圆形)并不阻断。包含未经加载hVISTA的多聚体染色的CD4+ T细胞的PE MFI作为对照(单三角形)。
图4D显示经转染以表达全长人PSGL-1(SEQ ID NO：3；核酸NM_003006.4)的硫酸乙酰肝素突变中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(细胞系PGSD-677，美国模式培养物保藏所)在pH 6.0下的VISTA多聚体染色的代表性二维流式细胞术绘图。在存在或不存在经滴定抗VISTA阻断性抗体(mAb 3)下实施染色。未由VISTA多聚体染色的细胞显示为对照。pSGL-1抗体(BDBiosciences目录号562758)染色绘示于y轴上，并且VISTA多聚体染色绘示于x轴上。
自C57BL6/J小鼠(Jackson实验室目录号000664)收集脾细胞并使用mVISTA ECD/人IgG Fc(片段，可结晶)嵌合融合蛋白、随后使用荧光团缀合的抗人IgG Fc二抗(JacksonImmunoresearch目录号109-065-098)在pH 6.0或7.4下染色。由图4E中的直方图绘示的结果显示，mVISTA在pH 6.0下较在生理pH(大约pH 7.4)更有效地结合鼠类脾细胞。自较深灰色至较浅色，填充直方图绘示在pH 6.0下结合至CD8+ T细胞、CD11b+髓系细胞和CD4+ T细胞。未填充直方图绘示在pH 7.4下结合至总脾细胞。
实施例5：VISTA在酸性pH选择性介导细胞：细胞粘附和免疫抑制
此实施例显示，VISTA在酸性pH较在中性或生理pH更强力地介导细胞：细胞粘附并抑制T细胞活化。
确立基于酸性pH相容性流式细胞术的细胞/细胞缀合测定。使用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；Fisher Scientific目录号C34554)标记异位表达全长人VISTA的293T细胞(永生化人胚胎肾细胞系，ATCC目录号CRL-3216)或载体。使用CellTraceTM Far Red(FisherScientific目录号C34564)标记CHO细胞。然后将载体或VISTA 293T细胞与CHO细胞以1∶1比率混合于pH7.0或pH6.0缓冲液中并在室温下培育1小时。通过流式细胞术评价CHO和293T细胞/细胞缀合物的形成。图5A-B中所显示的结果证实，表达VISTA的293T细胞在酸性pH优先粘附至CHO细胞且纳入抗VISTA阻断性抗体(VISTA mAb 3；白色条)抑制VISTA介导细胞/细胞粘附。
确立酸性pH相容性T细胞抑制测定。将表达NFkB启动子驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞(永生化人T细胞系，ATCC目录号TIB-152)与异位表达全长人VISTA和抗人T细胞受体激动剂抗体克隆OKT3的单链可变片段的293T细胞(永生化人胚胎肾细胞系，ATCC目录号CRL-3216)一起以10∶1 Jurkat∶293T细胞比率共培养于各种pH的HBSS+MES缓冲液中。将抗VISTA阻断性抗体(VISTA mAb 3)或同种型匹配非VISTA特异性对照抗体以10μg/mL添加至共培养物中。在培育之后，通过测量荧光素酶活性(1秒间隔，Promega目录号G7940)量化Jurkat T细胞活化。结果显示于图5C-D中。图5C显示经抗VISTA(正方形)或对照抗体(圆形)在不同pH下处理的Jurkat的荧光素酶单位的绘图。图5D显示在每个测试pH下经抗VISTA抗体处理的共培养物的荧光素酶信号除以经对照抗体处理的共培养物的荧光素酶信号的绘图。结果显示，VISTA介导的T细胞抑制在酸性pH下最为强力。
实施例6：VISTA经由细胞内再循环内体进行运输
此实施例显示，VISTA可发现于细胞内内体、尤其Rab11+再循环内体中，并且可经由内体运输再循环进出细胞表面。抗VISTA抗体在酸性pH结合VISTA的强度会影响其在内体运输期间保持结合VISTA的能力。
通过磁活化细胞分选自PBMC分离单核细胞。然后将单核细胞和293T细胞固定于4％低聚甲醛中并针对Rab5、Rab7或Rab11且使用抗VISTA或对照抗体进行细胞内染色。对照抗体(“cAb”，其是与抗VISTA抗体具有相同同种型的非VISTA结合抗体)并不可检测地结合表达人VISTA的单核细胞或293T细胞。使用Alexa488直接标记抗VISTA和对照抗体。使用Alexa594抗兔Ig二抗检测Rab抗体。实施Hoescht33342染色以鉴别细胞核。使用转盘式共聚焦显微镜捕获图像。图6A显示VISTA、Rab5(早期内体标记物)、Rab7(晚期内体标记物)和Rab11(再循环内体标记物)在表达人VISTA的293T细胞内的共定位。图6B显示VISTA和Rab11在人单核细胞内的共定位。细胞内VISTA与Rab11+再循环内体共定位。
为评价VISTA经由内体再循环的能力，使用三种在生理学和酸性pH具有不同VISTA结合性质的抗hVISTA抗体(VISTA mAb1、2和3)实施内吞溶酶体依赖性抗体药物缀合杀死测定。首先实施SPR测定以比较所有三种VISTA抗体在pH 7.4、6.7和6.0下的hVISTA结合特征。在含有固定蛋白质A的
T100(GE Healthcare)CM5生物传感器上捕获VISTA抗体，然后使100nM hVISTA-ECD(具有7xHis尾部的SEQ ID NO：1的氨基酸32-193，即AFKVATPYSL YVCPEGQNVT LTCRLLGPVD KGHDVTFYKT WYRSSRGEVQ TCSERRPIRN LTFQDLHLHHGGHQAANTSH DLAQRHGLES ASDHHGNFSI TMRNLTLLDS GLYCCLVVEI RHHHSEHRVH GAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQESENI TAHHHHHHH；SEQ ID NO：325)在37℃下于指示pH的BST电泳缓冲液中流动。将扣除参考的传感图归一化至“结合”报告点并绘图。VISTA抗体3“mAb 3”(图6C顶部)在酸性pH展现最大程度的VISTA结合缺损，随后是VISTA抗体2“mAb2”(图6C，中间)，其仅中等受损。VISTA抗体1“mAb 1”在酸性和生理pH条件下维持强VISTA结合(图6C，底部)。
内吞溶酶体依赖性抗体药物缀合杀死测定实施如下。将内源性表达人VISTA的AML3细胞(永生化人单核细胞系，ATCC CRL-9589)与经滴定抗VISTA抗体或非VISTA特异性对照抗体和缀合至组织蛋白酶B敏感性接头和细胞毒性微管溶素(tubulysin)有效载荷的抗人IgG二抗一起培养。由于组织蛋白酶B主要在晚期内体和溶酶体中有活性，故利用VISTA经由早期内体和再循环内体再循环的抗VISTA抗体将经历低程度的接头裂解和由此低程度的细胞毒性有效载荷释放和细胞死亡。在酸性内体中自VISTA解离并分选至晚期内体和溶酶体中的抗VISTA抗体将经历较高程度的接头裂解。在5天之后于培养物中通过Cell Titer
(Promega目录号G7573)测量细胞活力。图6D显示此测定的结果，其中AML3活力(CellTiter Glo)绘示于y轴上且一抗浓度绘示于x轴上。一抗的计算EC50如下：VISTA抗体1，倒三角形，0.485μg/mL；VISTA抗体2，圆，0.092μg/mL；VISTA抗体3，正方形，0.006μg/mL；对照，三角形，1.085μg/mL。抗体效能与在酸性pH的抗VISTA抗体结合逆相关。
为证实在酸性pH的结合负责效能差异，将VISTA抗体3亲和力最佳化，从而改善其在酸性pH结合VISTA的能力。图6E显示SPR测定，其使用针对图6C所阐述的测定条件比较VISTA抗体3与此变体VISTA抗体3c的hVISTA抗体结合特征。VISTA抗体3同样在酸性pH展现VISTA结合缺损，而变体VISTA抗体3c在酸性和生理pH展现相当的VISTA结合。图6F显示VISTA抗体3c(菱形)在针对图6D所阐述的杀死测定中的活性。VISTA抗体3的酸性pH最佳化变体展现低于原始抗体31倍的效能，从而指示，在酸性pH结合的受损抗VISTA抗体在VISTA再循环期间损失抗体结合。
基于这些发现，提出再循环模型，其中VISTA经由早期内体和再循环内体再循环进出细胞表面。此模型绘示于图6G中。可使用VISTA经由所述内体再循环抗VISTA抗体，从而维持靶接合。然而，在酸性pH具有受损VISTA结合的VISTA抗体、尤其在酸性pH具有迅速解离速率者可在再循环期间自VISTA解离且在细胞内部捕集或降解，从而产生较差靶接合且连续耗用循环抗体。与之相比，在酸性pH结合至VISTA且保持结合的抗体可维持较高程度的靶接合、尤其在酸性微环境(例如肿瘤)中且展现较长体内平均滞留时间。
实施例7：在生理pH并不结合的VISTA抗体的优良性
发明人已证实，VISTA是酸性pH选择性免疫受体，从而证实了使用在酸性pH充分结合的抗体靶向VISTA重要性和用途。另外，出于若干原因，在生理pH不结合或可忽略地结合至VISTA的抗体较为有利。首先，因VISTA相对大量地表达于循环粒单核细胞、尤其单核细胞和中性粒细胞中，故在生理pH结合VISTA的抗体受试者在血液中具有较高程度的靶标介导的药物体内处置(TMDD)。此效应可因VISTA倾向于经由细胞内内体再循环而加剧，从而产生抗VISTA抗体内化和降解。此二级效应对于在酸性pH具有受损结合的抗体而言尤其成问题，如可针对结合VISTA的富集组氨酸配体界面的抗体所观察。两种效应均将减小循环中的抗VISTA抗体量，从而减小到达肿瘤的抗体量且由此减小抗体的预期生物学活性。第二，在生理pH结合VISTA且拥有效应子功能(例如诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或递送免疫调节性有效载荷)的抗体将使循环粒单核细胞经受所述效应子功能，从而潜在地产生不期望效应(例如循环中性粒细胞耗尽或活化)。因此，发明人发现，在酸性pH结合至huVISTA但在生理pH可忽略的抗体具有以下双重优点：(1)较佳暴露于相关位点(例如肿瘤)和(2)减小具有效应子功能(例如ADCC、ADCP或递送免疫调节性有效载荷)的抗体情形的毒性。另外，因VISTA本身是酸性pH选择性免疫受体，故在生理pH阻断VISTA的配体界面很可能不能调节VISTA受体-配体活性。因此，如下文所阐述来生成在酸性pH结合至huVISTA但在生理pH不会显著结合的抗体。
实施例8：在酸性pH较生理pH优先结合至人VISTA的抗VlSTA抗体的分离
此实施例阐述在低(酸性)pH相对于中性或生理pH优先结合至人VISTA的抗体的生成。
如下所述来构建抗体的抗VISTA抗原结合片段的库并筛选。使用自使用全长人VISTA(hVISTA)实施免疫的HuMab小鼠分离的基因材料产生抗体库。将这些抗体格式化为scFv且经由mRNA显示针对在低pH(pH 6.0)下的全长hVISTA结合进行选择(Xu L等人(2002)Chemistry&Biology 9：933；Roberts RW和JW Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：12297；Kurz等人(2000)Nucleic Acids Res.28(18)：E83)。经由下一代测序(NGS)分析选择输出，并且鉴别显示在低pH下富集VISTA结合的库成员，再格式化为IgG 1.3(由具有氨基酸突变L234A、L235E和G237A的IgG1 Fc组成的无效应子IgG1恒定区)，并通过SPR针对VISTA结合进行筛选。
使用
T200仪器(GE Healthcare)实施表面等离子共振(SPR)分析以测量VISTA Ab在酸性和生理pH的缔合速率(定义为ka或k缔合，单位1/Ms)、解离速率(定义为kd或k解离，单位s-1)和亲和力常数(定义为KD，单位M)。将蛋白质A(Fisher Scientific目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽6，000RU的蛋白质A固定密度。在37℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4和6.0下实施SPR实验。将抗体在pH 7.4 PBST中稀释至20nM，并且以5ul/min在活性生物传感器流动槽中捕获50秒。在pH 7.4和6.0电泳缓冲液中制备50-0.2nM浓度系列的单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)，并且以40ul/min注射于经捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。对于每种VISTA抗体而言，计算pH 6下k解离/pH 7.4下k解离的比率以鉴别在酸性pH展现缓慢解离速率且在生理pH展现迅速解离速率的抗体。
六种再格式化为IgG1.3抗体的抗体在pH 6和pH 7.4下显示接近等效的亲和力。特定而言，两种抗体在pH 6.0下的解离速率慢于在pH 7.4下(即在pH 7.4下的k解离快于pH6.0)。所述两种huVISTA抗体的可变区称为P1-061015和P1-061029且包含这些可变区且格式化为IgG1.3抗体的抗体分别称为P1-061015.IgG1.3和P1-061029.IgG1.3。P1-061015.IgG1.3和P1-061029.IgG1.3的k解离速率提供于表1中。
表1：所选抗体在pH 6.0和pH 7.0下的k解离
| 抗体名称 | pH 6k<sub>解离</sub>(s<sup>-1</sup>) | pH 7k<sub>解离</sub>(s<sup>-1</sup>) | pH 6/pH 7k<sub>解离</sub> |
| P1-061015.IgG1.3 | 1.4×10<sup>-3</sup> | 2.3×10<sup>-3</sup> | 0.6 |
| P1-061029.IgG1.3 | 4.8×10<sup>-3</sup> | 9.1×10<sup>-3</sup> | 0.5 |
P1-061015和P1-061029的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列提供于下文表2中且也显示于在本公开实施例部分后的序列表中。
表2：在pH 6.0下较pH 7.4优先结合至huVISTA的huVISTA抗体的氨基酸序列
实施例9：进一步工程化P1-061015和P1-061029抗VISTA Ab以产生酸性pH选择性抗体
此实施例阐述进一步工程化实施例2中所鉴别的可变区P1-061015和P1-061029以获得在pH 6.0下的结合相对于pH 7.4具有较高k解离比率的抗huVISTA可变区。
通过分别在P1-061015和P1-061029的VH CDR中引入特异性突变来构建两个库。所述库仅容许最可能改善低pH下的结合的氨基酸取代，即天门冬氨酸盐、谷氨酸盐和组氨晚所述库也容许每个CDR中的单一和双氨基酸取代和CDR中的重组(每条链中最多6个氨基酸取代)。图7A显示引入P1-061029的重链CDR3氨基酸序列中以形成P1-061029库的突变。所述图指示，排除特定序列以避免引入易患性(例如DG)。
通过在pH 6.0下结合至全长hVISTA数轮经由酵母表面展示来筛选’029和‘015库。通过在正向(pH 6.0 huVISTA结合)和负向(pH 7.4 huVISTA结合)(显示于图7B中)选择之间双态切换来实施其他轮选择，其中在负向选择轮中收集并不在pH 7.4下结合至VISTA的库成员。通过NGS分析选择输出。经由流式细胞术分析在第9轮选择之后在pH 6.0下结合至huVISTA的’029库成员在pH 6.0和pH 7.4下与人VISTA的结合。图7C显示代表性二维流式细胞术绘图，其显示在第9轮选择之后的变体池。VISTA结合绘示于y轴上，并且变体抗体表达绘示于x轴上。显示各种抗体浓度和pH下的结合数据。所述结果证实了尤其在20nM下与人VISTA的极强pH 6选择性结合。
使用不同方法自‘029库分离其他‘029子代克隆。一些克隆与通过第一方法所鉴别者相同，并且分离9种其他克隆。
将自‘029库分离且选择用于进一步测定的19种克隆再格式化为IgG1.3抗体。这些克隆的重链CDR相对于‘029VH CDR的氨基酸差异显示于表5中。
表5：衍生自‘029亲本抗体的抗体的VH CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(由下划线隔开)
通过表面等离子共振(SPR)测量每个‘029子代克隆和亲本‘029抗体(格式化为IgG1.3抗体)的若干制剂在pH 6.0和7.4与人VISTA的结合。使用
T100仪器(GEHealthcare)实施SPR分析以测量VISTA Ab在酸性和中性pH的k解离和KD结合亲和力测量值。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽2，000RU的蛋白质A固定密度。在37℃使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％
20)电泳缓冲液在pH 7.4和6.0实施SPR实验。将抗体在pH 7.4 PBST中稀释至25nM，并且以5ul/min通过活性生物传感器流动槽捕获60秒。在pH 7.4和6.0电泳缓冲液中制备50-5nM浓度系列的单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)，并且以40ul/min注射于捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。将每种VISTA抗体的亲和力常数KD计算为速率常数比率k解离/k缔合。
每种抗体的最大(或量级)人VISTA结合反应定义为在50nM VISTA注射结束时扣除参考的“结合”报告点反应，并且以反应单位(RU)报告。每种抗体的最大人VISTA结合反应(RU)绘示于图7D中。将平均结合反应(二至四个重复抗体之间)绘图，并且误差棒代表标准偏差。结果指示，所选‘029子代克隆在pH 6.0结合至hVISTA，但在pH 7.4并不结合(代表pH7.4结合的空圆均位于图形底部，亲本‘029克隆除外)。
通过SPR使用上述方法测定‘029和其子代在pH 6.0的k解离速率，并且表示于图7E中。图中的虚线代表‘029的k解离速率，并且虚线左侧的克隆在pH 6.0的k解离速率慢于亲本‘029抗体，而在右侧者在pH 6.0的k解离速率快于亲本‘029抗体。
‘029、‘761和‘767抗体在中性和酸性pH的代表性hVISTA SPR结合传感图示于图7F中。绘示扣除参考的50nM和5nM huVISTA传感图。在中性pH，观察到‘761和‘767具有＜10RU的VISTA结合信号，因此为适当测量和比较‘761和‘767与‘029的k解离和KD，需要利用μMVISTA浓度在生理pH的SPR动力学测定。
对于此测定而言，将‘029、‘761和‘767再格式化为hIgG1f同种型且表示为标准hIgG1f和hIgG1f无岩藻糖基化形式以与hIgG1.3f Fc进行比较。使用
T100仪器(GE Healthcare)实施SPR动力学测定以测量VISTA Ab在酸性和生理pH的k解离和KD结合亲和力。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20μg/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽2，000RU的蛋白质A固定密度。在37℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4和6.0下实施SPR实验。将抗体在pH 7.4PBST中稀释至25nM，并且以5ul/min通过活性生物传感器流动槽捕获45秒。在电泳缓冲液中制备1600-0.78nM(pH 7.4)和100-0.78nM(pH 6.0)的浓度系列的单价hVISTA-ECD(SEQ IDNO：325)，并且以40ul/min注射于捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。每种VISTA抗体的亲和力常数KD计算为速率常数比率k解离/k缔合。计算在pH7.4/pH 6.0下的k解离和KD比率以比较在酸性pH相对于生理pH的解离速率和亲和力改善。尽管先前不能使用50nM hVISTA测定‘761和‘767的中性pH结合速率常数(图7D和7F)，但增加中性pH VISTA浓度范围至1.6μM使得这些克隆产生拟合至1∶1结合模型的结合反应(＞10RU)。这些酸性选择性VISTA抗体的动力学数据显示于表6中。‘029亲本在两种pH下展现等效k解离，而‘761和‘767展现pH 6较pH 7.4具有10倍以上的k解离选择性且和pH 6较pH 7.4具有2000倍以上的KD选择性。人VISTA结合速率常数在hIgG1.3f、hIgG1f和无岩藻糖基化hIgG1f同种型变体中是保守的。
表6：如通过SPR所测定的VISTA抗体的结合特性
使用
T100仪器(GE Healthcare)在介于pH 7.4与pH 6.0之间的pH值下(即在pH 6.9和pH 6.45下)测量P1-061029(“‘029”)、P1-068761(“‘761”)和P1-068767(“‘767”)(呈IgG1.3抗体形式)的人VISTA结合动力学。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽2,000RU的蛋白质A固定密度。在37℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4、6.9、6.45和6.0下实施测定。将抗体在pH 7.4 PBST中稀释至25nM，并且以5ul/min在活性生物传感器流动槽中捕获45秒。在pH 7.4、6.9、6.45和6.0电泳缓冲液中制备100-0.78nM浓度系列的单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)，并且以40ul/min注射于经捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。每种VISTA抗体的亲和力常数KD计算为速率常数比率k解离/k缔合。计算k解离和KD在每个pH下相对于pH 6.0的比率以评估VISTA k解离和KD如何随缓冲液pH移位至生理pH而变化，并且显示于表7中。‘029亲本在每个测试pH下展现一致的k解离，而‘761和‘767子代展现在pH 6.9下与pH 6.0相比VISTA k解离迅速至少10倍且VISTA KD弱100倍。随着缓冲液pH自酸性值移位至生理学值，‘761和‘767的VISTA k解离和KD均变弱。自表7参考用于比较的‘761和‘767的生理pH数据且使用星号(*)指出。
表7：‘029、‘761和‘767抗体在不同pH值下的动力学结合特性
表7中的数据指示，‘761和‘767在pH 6.45下对hVISTA的结合亲和力低于pH 6.0至少10倍；‘761和‘767在pH 6.9下对hVISTA的结合亲和力低于pH 6.0至少100倍并且‘761和‘767在pH 7.4下对hVISTA的结合亲和力低于pH 6.0至少1000倍。
‘015库也显示与VISTA的pH 6选择性结合的轻微偏好。子代克隆相对于‘015VHCDR的氨基酸差异显示于表8中。经由SPR使用与针对上述‘029分析所阐述相同的方法来测量每个‘015子代克隆和亲本‘015(均呈IgG1.3抗体形式)的若干制剂与人VISTA在pH 6.0和7.4下的结合，并且显示于表8中。
表8：衍生自‘015亲本抗体的抗体的VH CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(由下划线隔开)
‘029和‘015和其子代克隆与huVISTA在pH 6.0和7.4下的结合动力学(如通过SPR所测定)的汇总显示于表9和10中。
因此，鉴别若干如下‘029子代克隆：其与‘029亲本相比维持或改善在pH 6.0下关于VISTA-ECD的k解离，并且还在生理pH显示较弱k解离或损失VISTA结合。‘015子代对VISTA-ECD展现酸性pH选择性结合，并且在中性pH未检测到VISTA结合，但所有测定的‘015子代均在pH6.0下产生快于‘015亲本的k解离。
实施例10：酸性pH选择性‘029子代显示酸性pH依赖性细胞结合和效应子功能同时维持VISTA阻断活性
测量克隆‘761和‘767与经工程化以异位表达全长人VISTA(具有D187E取代的SEQID NO：1)的Raji细胞的pH依赖性结合。在此实验中，将‘761和‘767格式化为IgG1.3抗体，并且通过抗人IgG二抗(Jackson Immunoresearch目录号109-065-098)测量结合。显示于图8A-8B中的结果指示，‘761(图8A)和‘767克隆(图8B)在pH 7.2和8.1下具有较差结合，但在酸性pH、尤其在pH 6.0、6.1、6.2和6.4下具有较佳结合。结合MFI绘示于y轴上且一抗浓度以对数标度绘示于x轴上。还显示非线性回归。
图8C显示来自图8A-B中所阐述的实验的数据，所述实验测量P1-068767(圆形)和同种型匹配非特异性对照抗体(三角形)在不同pH下与表达3125ng/mL人VISTA的Raji细胞的结合。“pH50”(损失50％的P1-068767结合的pH)大约为6.6。结合MFI绘示于y轴上，并且缓冲液pH绘示于x轴上。还显示非线性回归。
图8D显示结合至人单核细胞的同种型匹配非特异性对照抗体(pH 7.0和6.0分别为填充圆和未填充圆)、抗VISTA mAb 2(“对照”，参见图6C，pH 7.0和6.0分别为填充正方形和未填充正方形)、P1-068761(pH 7.0和6.0分别为填充三角形和未填充三角形)和P1-068767(pH 7.0和6.0分别为填充倒三角形和未填充倒三角形)的MFI。如图8A-B中所阐述来检测结合。非pH选择性VISTA对照抗体(mAb 2)在两种pH下均结合单核细胞。两种经工程化酸性pH选择性抗体均在pH 6.0下充分结合单核细胞，但在pH 7.0下的结合并不优于非特异性同种型匹配对照。因此，克隆‘761和‘767在中性pH对VISTA具有弱结合或并不结合，而在酸性pH选择性结合细胞上的VISTA。
图8E显示‘029(正方形)、‘761(三角形)和‘767(倒三角形)同等阻断重组VISTA多聚体在pH 6.0下与活化人CD4+ T细胞的结合，而非VISTA特异性对照抗体(圆形)并不阻断VISTA结合。如实施例4中所阐述来实施此阻断测定。这些数据显示，经工程化酸性pH选择性VISTA抗体仍能够在酸性pH阻断VISTA受体-配体结合。
测量P1-061029.IgG1f、P1-068761.IgG1f、P1-068767.IgG1f抗体、非VISTA特异性抗体和非VISTA特异性阴性对照抗体(均表示为无岩藻糖基化IgG1抗体)经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在生理pH对靶细胞(与图8A-B中所阐述相同的表达人VISTA的Raji细胞)的NK细胞特异性裂解。自PBMC经由负向珠粒选择(StemCell Technologies目录号19055)富集NK细胞并在补充有1μM氢化可的松(hydrocortisone)(StemCell Technologies目录号07904)和500U/mL重组人IL-2(Peprotech目录号200-02)的MyelocultTM培养基(StemCellTechnologies目录号05150)中过夜培养。在测定当天，使用Calcein AM(LifeTechnologies目录号C3100MP)标记异位表达人VISTA的Raji细胞(阐述于图8A-B中)且与经培养NK细胞一起以10∶1 NK∶靶细胞比率以及P1-061029.IgG1f、P1-068761.IgG1f、P1-068767.IgG1f抗体、非VISTA特异性抗体和非VISTA特异性阴性对照抗体在生理pH共培养2小时。自上清液荧光信号(EnVisionTM读板仪)来内插特异性裂解。自不含抗体的共培养物获得自发性裂解信号，并且通过使用
裂解缓冲液(PerkinElmer目录号4005-0010)裂解靶细胞来测定最大裂解信号。抗体特异性裂解计算为所观察裂解除以(最大裂解信号减去自发性裂解信号)的百分比。
图8F中所提供的结果显示P1-068761.IgG1f和P1-068767.IgG1f在生理pH介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的效能小于P1-061029和阳性对照。
实施例11：VISTA抗体的食蟹猕猴PK
向人抗体初始食蟹猕猴经静脉内注射单一5mpk剂量的在酸性和中性pH同等结合的VISTA抗体(“对照”；mAb2)、在酸性pH具有受损结合的VISTA抗体(“酸性pH敏感”，mAb3)或酸性pH选择性抗体‘767以测定所述抗体的食蟹猕猴PK。
此实施例中所用抗体的SPR结合动力学提供于表11中，并且如下所述来测定。在酸性和中性pH评估酸性pH选择性和对照抗VISTA抗体的食蟹猕猴VISTA交叉反应性。使用
T100仪器(GE Healthcare)测量VISTA Ab的结合亲和力。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽2，000RU的蛋白质A固定密度。在37℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4和6.0下运行测定。将抗体(格式化为IgG1.3抗体)在pH 7.4 PBST中稀释至25nM，并且以5ul/min在活性生物传感器流动槽中捕获45秒。在电泳缓冲液中制备1600-0.78nM(pH 7.4)和100-0.78nM(pH 6.0)单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)和食蟹猕猴VISTA-ECD(AFKVATLYSL YVCPEGQNVT LTCRVFGPVD KGHDVTFYKTWYRSSRGEVQ TCSERRPIRN LTFQDLHLHH GGHQAANTSH DLAQRHGLESASDHHGNFSI TMRNLTLLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH GAMELQVQTG KDAPSSCVAYPSSSQESENITAHHHHHHH；(SEQ ID NO：326)的浓度系列，并且以40ul/min注射于经捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。每种VISTA抗体的亲和力常数KD计算为速率常数比率k解离/k缔合。计算k解离和KD在pH 7.4/pH 6.0下的比率以比较在酸性pH相对于中性pH的解离速率和亲和力差异，并且显示于表11中。所测试所有抗VISTA抗体在所测试两个pH下均展现相当(在2倍内)的人和食蟹猕猴VISTA动力学结合参数，从而证实与食蟹猕猴VISTA的交叉反应性。两种抗VISTA对照抗体均在生理pH展现与酸性pH相比改善的kd和较强KD，并且酸性pH敏感性对照在酸性pH所展现的VISTA kd快于对照抗体。
表11：VISTA抗体与食蟹猕猴VISTA的SPR结合动力学
向人抗体初始食蟹猕猴经静脉内注射单一5mpk剂量的VISTA mAb2(“对照”)、VISTA mAb3(“酸性pH敏感性”)或P1-068767.IgG1.3。每种抗体在注射后的血清浓度显示于图9中。P1-068767.IgG1.3和对照抗VISTA抗体的平均滞留时间分别为717小时和22小时，从而指示酸性pH选择性大大减小VISTA抗体靶标介导的药物体内处置(TMDD)。尽管对照抗体(mAb 2)和酸性pH敏感性抗体(mAb 3)在生理pH等效结合VISTA，但酸性pH敏感性抗体具有7.6小时的较低平均滞留时间，从而证实了酸性pH结合对VISTA抗体再循环的重要性，如实施例6和7中所阐述。结果显示，酸性pH选择性抗体具有优良PK且由此更容易地在肿瘤或其他微环境中达到靶接合。
实施例12：pH选择性‘029子代并不非特异性结合至高pI蛋白质
通过SPR在中性和酸性pH使用
T100仪器(GE Healthcare)评估‘029、‘761和‘767克隆与VISTA和其他高pI蛋白质的结合特异性。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM3生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽800RU的蛋白质A固定密度。在25℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4和6.0下实施SPR实验。将抗体(格式化为IgG1.3抗体)在pH 7.4 PBST中稀释至50nM，并且以5ul/min在活性生物传感器流动槽中捕获60秒。在pH 7.4和6.0电泳缓冲液中制备100-10nM单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)、亲和素(ThermoFisher Scientific目录号21128)、细胞色素C(Sigma目录号C2867)、BSA(Calbiochem目录号126593)和单价对照抗原(“Ag”)的浓度系列，并且以50ul/min注射于经捕获抗体上以评估结合特异性。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。使用
T200评估软件v.2.0检查参考流动槽和0nM空白扣除传感图。结果显示于表12中。
表12：VISTA克隆与具有高pI的蛋白质的结合
在表12中，通过填充灰色盒指示特异性结合，其定义为在样本注射结束时＞10RU的SPR结合反应。“抗Ag”是结合VISTA的对照Ab。‘029克隆在酸性和中性pH对VISTA具有特异性。‘029子代克隆‘761和‘767在酸性pH对VISTA具有特异性，而对照抗体也维持抗原特异性。在此测定中未观察到pI对照蛋白与蛋白质A参考表面的非特异性结合(“NSB”)。
因此，引入‘761和‘767的VH CDR中的带电氨基酸并不导致这些抗体静电结合至其他高pI蛋白质(例如亲和素和细胞色素C)或低pI蛋白质(例如BSA)。
实施例13：通过抗体‘761和‘767抑制T细胞活化
此实施例阐述可经实施以测定抗体‘761和‘767阻断Jurkat T细胞活化的hVISTA抑制的能力的测定。
使用与实施例5中所阐述相同的测定。简而言之，将表达NFkB荧光素酶报告基因的Jurkat(人T细胞系)细胞在各种pH下与表达人VISTA和抗人T细胞受体激动剂抗体OKT3的单链可变片段的293T细胞一起共培养。将抗VISTA抗体‘761和‘767或同种型匹配非VISTA特异性对照抗体添加至经共培养细胞中。Jurkat活化显示为荧光素酶单位和在使用抗VISTA治疗相对于对照时荧光素酶信号的倍数增加。
实施例14：突变分析鉴别赋予VISTA抗体pH依赖性结合性质的关键残基
抗体P1-068761.IgG1.3和P1-068767.IgG1.3含有5-6个来自P1-061029的突变(表7)。实施突变分析以鉴别赋予VISTA抗体pH依赖性性质的重要关键残基。因此，合成P1-068761和P1-068767的N-1(相对于P1-061029具有1个氨基酸回复)和N-2(相对于P1-061029具有2个氨基酸回复)变体组，表示为IgG1.3，并且测定其在pH 6、pH 6.7和pH 7.4下与huVISTA的结合。
使用
T 100仪器(GE Healthcare)测量结合动力学。将蛋白质A(ThermoFisher目录号21181)在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至20ug/ml并遵循制造商的胺偶联方案固定于CM5生物传感器(GE Healthcare)的流动槽上，目标为每个流动槽2,000RU的蛋白质A靶固定密度。在37℃下使用PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)电泳缓冲液在pH 7.4、6.7和6.0下实施测定。将抗体在pH 7.4 PBST中稀释至25nM，并且以5ul/min在活性生物传感器流动槽中捕获40秒。在pH 7.4、6.7和6.0电泳缓冲液中制备100-10nM浓度系列的单价hVISTA-ECD(SEQ ID NO：325)，并且以40ul/min注射于经捕获抗体上以测量缔合和解离。在测定循环之间，使用10mM pH 1.5甘氨酸的两个15秒注射来再生蛋白质A捕获表面。自参考流动槽和0nM空白扣除传感图推导速率常数ka(k缔合)和kd(k解离)，并且在
T200评估软件v.2.0中拟合至1∶1结合模型。
每种VISTA抗体的亲和力常数KD计算为速率常数比率k解离/k缔合。计算Rmax％以比较pH如何影响抗体对VISTA的结合能力，并且代表相对于预计最大VISTA结合反应的所测量最大VISTA结合反应。Rmax％定义为每种抗体在100nM VISTA注射结束时扣除参考的“结合”报告点反应(Rmax)相对于预计VISTA结合反应(Rexp)的比率。Rexp计算如下：Rexp＝[(VISTA-ECD分子量/mAb分子量)×(mAb“捕获”报告点反应(RU)]×2个结合位点/mAb。
针对P1-068761回复变体所获得的SPR结果显示于图10A中，其根据pH 6.0 k解离自最缓慢至最迅速进行分级。在表格中，将对100nM hVISTA展现弱或不结合反应(＜10RU)的抗体归类为非结合性(NB)。结果指示，需要位置32的E(即‘761的VH CDR1中的氨基酸残基7)和100f(‘761的VH CDR3中的氨基酸残基12)二者来维持酸性pH选择性，这是因为相对于P1-061029亲本序列的这些回复容许在生理pH显著结合hVISTA(Rmax％＞10)。进一步的分析揭示，具有E55A(‘761的VH CDR2中的氨基酸残基6)回复的变体维持酸性pH选择性且展现在P1-068761 2倍内的相当的结合动力学。与之相比，尽管具有H100G、E56N和E30D(分别为‘761的VH CDR3的氨基酸残基12、VH CDR2的氨基酸残基7和VH CDR1的氨基酸残基4)回复的变体维持酸性pH选择性，但这些mAb也展现在酸性pH的k解离快于P1-068761约3倍，从而使得这些突变体在酸性pH的解离速率较接近P1-061029亲本。因此，向原始P1-061029克隆中添加G100H、N56E和/或D30E突变有助于观察于酸性选择性P1-068761克隆中的酸性pH VISTA亲和力改善。
针对P1-068767回复变体所获得的SPR结果显示于图10B中，其根据pH 6.0 k解离自最缓慢至最迅速进行分级。结果指示，需要位置102的D(‘767的VH CDR3中的氨基酸残基14)来维持酸性pH选择性，并且D102V回复回P1-061029亲本序列容许在中性pH显著结合hVISTA(Rmax％＞10)。进一步的分析揭示，具有E30D、D52N和E55A(分别为‘767的VH CDR1的氨基酸残基4、VH CDR2的氨基酸残基3和VH CDR3的氨基酸残基6)回复的变体维持酸性pH选择性且展现在P1-068767 2倍内的相当的pH 6.0结合动力学。与之相比，具有E100fF(‘767的VHCDR3的氨基酸残基12)回复的变体维持酸性pH选择性，但在酸性pH的k解离快于P1-068767 3倍以上。显而易见，具有E100fF回复的变体在酸性pH所展现的k解离远快于亲本mAbP1-061029。
使用一些回复突变体获得确认性动力学结合数据(使用实施例9中所阐述的方法)，并且数据显示于表22和23中。
因此，P1-068761和P1-068767(酸性pH选择性)相对于P1-061029(pH耐受性)的回复突变体汇总于下表13中(HCDR1、HCDR2和HCDR3由下划线隔开)。
表13： Seq Id.
表13中的P1-061029、P1-068761和P1-068767的上述VH CDR序列分别位于SEQ IDNO：67、51、55的氨基酸(“aa pos.”)26-35、50-66和99-110处。酸性pH选择性所需的关键突变以粗体指示，并且对pH 6.0 kd的影响为P1-068761和P1-068767的3倍以上的突变加下划线。
接下来，将突变F100fE、V102D和Y32E单独或一起引入‘029中以测定这些氨基酸取代是否足以达到‘029pH选择性。产生下列抗体：P1-061029_F100fE_V102D(P1-072000)；P1-061029_F100fE(P1-072002)；P1-061029_V102D(P1-072004)；P1-061029_Y32E(P1-072006)和P1-061029_Y32E_F100fE(P1-072008)，并且如实施例9中所阐述来测定其结合动力学。其CDR的氨基酸序列显示于表23中。显示于表22中的结果指示，V102D足以达到’029 pH选择性，但在F100fE也存在时可改善结合动力学。然而，F100fE或Y32E自身并不达到’029 pH选择性。
实施例15：VISTA抗体表位的定位
通过2种不同方法：BLI(生物膜干涉技术)竞争和酵母表面展示来测定‘015、‘029、‘761和‘767(格式化为IgG1.3抗体)的hVISTA表位。
实施竞争性BLI表位分箱测定以评估酸性pH选择性VISTA抗体P1-068761和P1-068767与P1-061029亲本、P1-061015和相关VISTA对照抗体1、2和3相比是否保留VISTA上的类似或重叠表位。在OctetRed384 BLI仪器(PALL/ForteBio)上实施夹心形式和串联形式分箱测定。所有测定步骤均是在30℃和1000rpm振荡速度下实施，并且所用缓冲液是酸性(pH6.0)或中性(pH 7.4)PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween20)。对于夹心形式而言，抗人IgG-Fc传感器(AHC，PALL/ForteBio)首先在pH 7.4下捕获VISTA抗体组，然后抗人捕获传感器经总人IgG(Jackson 009-000-002号)阻断。接下来在pH6.0下捕获人VISTA-ECD，并且最后在pH 6.0下评价所有可能抗体组合的竞争。在串联形式测定中，经链霉亲和素涂覆的生物传感器(SAX，PALL/ForteBio)首先在pH 7.4下捕获生物素化hVISTA-ECD，然后传感器在pH 6.0下捕获全VISTA抗体套组，从而确保每种抗体在VISTA上的完全结合饱和，然后使用所有可能抗体组合在pH 6.0下评估竞争。
通过竞争矩阵汇总竞争性BLI表位分箱测定的结果(图11A)。在此图中，以行来列示第一捕获抗体，并且其对(第二)竞争剂抗体的结合或阻断活性显示于每一列中。两种测定形式的竞争矩阵相同。对于夹心式测定而言，通过介于0.4-1.2nm之间的信号来定义竞争剂抗体的结合(浅灰色)，并且阻断性抗体(黑色)展现＜0.1nm的非结合信号。对于串联测定而言，通过介于0.3-0.8nm之间的信号来定义竞争剂抗体的结合，并且阻断性抗体展现＜0.2nm的非结合信号。尽管“VISTA mAb 3”通过SPR在37℃下自hVISTA-ECD展现快速酸性pH解离(图6C)，但其在任一BLI测定形式(实施于30℃下)中并不快速解离。这些竞争性测定指示，P1-061015、P1-061029、酸性-pH选择性抗体P1-068761和P1-068767和VISTA抗体2和3均彼此竞争VISTA上的类似或重叠表位。然而，VISTA抗体1结合至单独且不同的表位。因此，引入P1-061029的VH CDR中以生成酸性选择性克隆P1-068761和P1-068767的带电氨基酸突变不会显著改变VISTA结合表位。
还使用酵母表面展示和NGS根据以下文献的方法来定位抗体‘029、‘015、‘761和‘767的表位：Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342：539-550；Oliphant等人(2006)J.Virol.80：12149-12159；和Kowalsky等人(2015)J.Biol.Chem.290：26457-26470。简而言之，生成VISTA ECD的单一点突变体的饱和诱变库且展示于酵母表面上。分选并不结合至所定位的抗体但保持结合至非阻断性抗体(mAb1)的VISTA突变体并测序。因保持结合至mAb1，这些突变体很可能正确折叠，并且可见的与所定位的抗体的结合损失很可能是由于损失了能量上重要的接触残基。这些突变的位置在抗体表位中指定为能量上重要的残基且显示表14中。
表15包括来自表14的详述数据，并且列示hVISTA中很可能减小每种列示抗体的结合的氨基酸残基(基于在酵母表面展示/NGS方法中所观察的残基频率)
表15：很可能减小所列示抗体的结合的VISTA氨基酸取代
图11B和图11C显示如表14中所列示涵盖所有阻断性hVISTA抗体的残基的表位(图11B)与非阻断性hVISTA抗体的表位(mAb1；图11C)相比的代表图。氨基酸残基66(H)和162(A)用于表示分子定向。组氨酸残基呈灰色，并且表位残基呈黑色。显而易见，所有阻断性抗VISTA mAb均占据相同表位区域，这与octet分箱数据(显示其彼此竞争)一致，其中在查询抗体中具有微小残基差异。与之相比，非阻断性hVISTA抗体(mAb1)占据hVISTA分子上的不同表位区域，并且这可通过octet分箱数据进一步支持，所述octet分箱数据显示，并无阻断性mAb与mAb1竞争。
实施例16：‘761和‘767的生物物理性质
通过下列分析与生物物理技术比较P1-068761和P1-068767的物理和化学性质与亲本P1-061029(均具有IgG1.3恒定区)的性质。
使用Agilent 1260 HPLC仪器且使用ShodexTM Kw403-4F柱(4.6mmID×300mmL)在含有100mM磷酸钠、150mM氯化钠的缓冲液(pH7.3，0.2um过滤，以0.30mL/min的流速运行)中获取分析型SEC数据。通过经设定在280nm下收集的Agilent 1260 Infinity二极管阵列检测器收集数据并通过Agilent Chemstation软件(Agilent，Santa Clara，CA)进行分析。
在具有Alcott 720NV自动采样仪的ProteinSimple iCE3仪器上获取成像毛细管等电聚焦(icIEF)数据。将抗体样本与分离混合物混合以产生以下最终浓度：0.2mg/ml抗体、0.35％甲基纤维素、2.0M脲、1％v/v pharmalyte pI 5-8和3％v/v pharmalyte pI 8-10.5。使用1500V下的1min预聚集时间和3000V下的10min聚焦时间在ProteinSimple cIEFFC涂覆柱(产品号101701)中分析这些样本。使用iCE CFR软件V4.3.1.5352分析数据。
通过动态光散射(DLS)测定抗体流体力学大小且通过荧光光谱法和静态光散射(SLS)使用UNcle分子表征仪器(Unchained Labs)来表征热稳定性。以2mg/ml浓度在1×PBS缓冲液中制备抗体P1-061029、P1-068761和P1-068767，并且然后在不同pH下使用40mMTris 1∶1稀释于1×PBS中或使用40mM柠檬酸盐稀释于1×PBS中以产生1mg/ml抗体在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0下于20mM Tris/1×PBS或20mM柠檬酸盐/1×PBS中的最终样本。将这些样本加载至UNi比色柱(cuvette cartridge)中并在稀释成不同pH配方1小时内进行分析。在25℃下收集DLS数据，每5s获取4次。使用UNcle分析软件V2.0版拟合强度自相关函数。通过自25℃至90℃扫描样本来获得热变性数据，扫描速率为0.5o/min且在266nm和473nm下激发。在250nm-720nm的范围内获取荧光数据。使用UNcle分析软件V2.0版分析荧光和SLS数据。
在UNcle分子表征仪器(Unchained Labs)上使用基于珠粒的DLS方法(其测量聚苯乙烯珠粒在所调配抗体溶液存在下的扩散速率)根据Unchained Labs推荐方案来测量抗体P1-061029、P1-068761和P1-068767的表观粘度。简而言之，在含有0.5％tween 80的调配缓冲液中制备100nm聚苯乙烯珠粒(Thermo Scientific目录号3100A)的10％溶液。将3ul此聚苯乙烯珠粒混合物添加至30ul调配抗体(不同Ab浓度，于20mM组氨酸、260mM pH 6.0蔗糖中)中且将所得蛋白质/珠粒混合物加载至UNi比色柱的3个单独泳道(每个泳道9ul)以用于一式三份测定。使用UNcle分析软件V2.0版且使用1.3cP的参考粘度来分析数据。
在加速应力条件下通过在20mM组氨酸、260mM pH 6.0蔗糖中制备50mg/ml抗体样本且暴露于40℃热应力4周来研究抗体P1-061029、P1-068761和P1-068767的物理稳定性。在即将40℃培育之前(时间0＝t0)以及在1周(1w)和4周(4w)热应力之后取出样本，并且使用调配缓冲液将样本稀释至2mg/ml并通过aSEC进行分析。使用Agilent 1260 HPLC仪器且使用Shodex KW403-4F柱(4.6mmID×300mmL)在含有100mM磷酸钠、150mM氯化钠的缓冲液(pH7.3，0.2um过滤，以0.30mL/min的流速运行)中获取aSEC数据。通过经设定在280nm下收集的Agilent 1260 Infinity二极管阵列检测器收集数据并通过Agilent Chemstation软件(Agilent，Santa Clara，CA)进行分析。
结果如下所述。分析型尺寸排阻色谱法(aSEC)数据显示，所有三种抗体均可纯化至高纯度，其中每种抗体样本由大于99.3％的单体(主峰)、小于0.7％的高分子量(HMW)物质和不可检测含量的低分子量(LMW)物质组成(表16)。
表16：抗VISTA抗体的分析型SEC数据，其显示高分子量物质百分比(HMW％)、单体/主要物质百分比(主要％)和低分子量物质百分比(LMW％)。
| 样本名称 | HMW％ | 主要％ | LMW％ |
| P1-061029 | 0.4 | 99.6 | 0.0 |
| P1-068761 | 0.6 | 99.4 | 0.0 |
| P1-068767 | 0.5 | 99.5 | 0.0 |
如通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)针对抗体P1-061029所测定的电荷变体特征显示存在等电点(pI)为8.56的主要物质(69.4％)和30.6％的酸性物质。(图12A-C.)P1-068761显示pI为6.69的主要物质(66.4％)和33.6％的酸性物质。P1-068767显示pI为6.63的主要物质(61.4％)和38.6％的酸性物质。因此，三种抗体中的酸性、碱性和主要物质的分布是类似的，但经工程化抗体P1-068761和P1-068767的等电点显著低于亲本P1-061029抗体。
在pH 3-9范围内使用动态光散射(DLS)于不同pH的缓冲液中来测定P1-061029、P1-068761和P1-068767的寡聚状态。每种抗体的所有流体力学半径(Rh)值均在4.8-5.7nM范围内，这是单体抗体样本的典型值(表17)。这表明，这些抗体在1mg/ml下于稀释至pH介于3-9之间的配方中之后第一小时内并不形成可检测含量的高分子量聚集物质。
表17：如通过DLS针对1mg/ml抗VISTA抗体样本在pH3-pH9的pH范围内所测定的流体力学半径。
在pH 3-9范围内通过监测在不同pH的缓冲液中随温度而变化的荧光和静态光散射来测量P1-061029、P1-068761和P1-068767的热稳定性。通过荧光测定第一热变性转变温度(Tm1)(其通常代表IgG1抗体的CH2结构域的变性)且显示于表18中，并且通过静态光散射测量聚集起始温度(Tagg)(其通常代表IgG1抗体的FAB结构域的变性)且显示于表19中。在中性pH(pH 7.0)于Tris/PBS配方中，三种抗体的Tm1值为P1-061029(67.4℃)、P1-068761(67.0℃)和P1-068767(65.3℃)，其中Tagg值为P1-061029(67.8℃)、P1-068761(67.5℃)和P1-068767(65.8℃)。每种抗体在柠檬酸盐/PBS配方中于相同中性pH 7.0或略高酸性pH6.0下的Tm1均在Tris/PBS pH 7.0值的0.7°内。然而，对于每种抗体而言，Tm1值在较碱性pH8-9下略低(低0.3°-1.1°)，并且在较酸性pH 3-5下显著更低。与中性pH相比，P1-061029的Tagg在较碱性pH 8.0-9.0下在pH 7.0值的0.1°内，在pH 5.0下低1.0°，并且在最酸性pH条件pH 3.0-4.0下更低(低6.1°-19.6°)。P1-068761和P1-068767在pH 3.0-4.0下的Tagg也显著较低。然而，在pH 5.0下，P1-068761的Tagg仅低于pH 6.0下的Tagg 0.2°，而P1-068767在pH 5.0下的Tagg低于在pH 6.0下2.2°，从而证实每种抗体的Tagg具有一定差异(表19)。
表18：P1-061029、P1-068761、P1-068767在pH3-pH 9的pH范围内的热稳定性(Tm1值)，如通过荧光光谱法所测定
表19：P1-061029、P1-068761、P1-068767在pH3-pH 9的pH范围内的热稳定性(Tagg值)，如通过静态光散射所测定
使用基于珠粒的DLS方法测量P1-061029、P1-068761和P1-068767的表观粘度，所述方法测量聚苯乙烯珠粒在经调配抗体溶液存在下的扩散速率。所有三种抗体在44mg/ml下的比较显示，两种经工程化抗体与亲本抗体在所述条件下具有类似粘度(表20)。在第二研究中，将P1-068761和P1-068767的其他蛋白质材料浓缩至较高浓度以分析在136mg/ml、100mg/ml和50mg/ml下的粘度。这些数据显示在较高抗体浓度下具有增加的表观粘度，其中P1-068761在136mg/ml下的最大表观粘度为5.7±0.7且P1-068767为5.3±0.6。
表20：抗体在25℃下于20mM组氨酸、260mM pH 6.0蔗糖中的表观粘度(以cP表示)，如通过基于珠粒的DLS方法所测定。值代表来自三个UNi泳道的数据的平均值和标准偏差
在40℃的加速应力条件下研究P1-061029、P1-068761和P1-068767的50mg/ml样本在20mM组氨酸、260mM pH6.0蔗糖中的物理稳定性4周。通过aSEC在即将40℃培育之前(时间0＝t0)以及在40℃应力1周(1w)和4周(4w)之后监测抗体样本的寡聚状态。这些数据显示，所有三种抗体均在40℃下4周之后保留96％以上的单体以及低含量HMW物质(＜1.6％HMW)和低含量LMW物质(＜2.0％LMW)(表21)。
表21：抗VISTA抗体加速稳定性样本的aSEC数据，其显示t0、1w和4w样本的高分子量物质百分比(HMW％)、单体/主要物质百分比(主要％)和低分子量物质百分比(LMW％)。
实施例17：具有种系重链框架区取代的抗VISTA抗体的生成
制备抗VISTA抗体P1-061029或其子代、具体而言P1-068761、P1-068767、P1-068761_E55A(P1-070868)、P1-068767_D52N(P1-070906)、P1-068767_E55A(P1-070908)和P1-068767_D52N_E55A(P1-070916)，其中通过K16R取代和T84A取代中的一者或两者来修饰重链可变区框架区。(换句话说，抗体P1-070868具有抗体P1-068761E55A的VH和VL的氨基酸序列，但在重链框架区中具有K16R和T84A取代。)实施这些取代，从而所述抗体更密切地类似于包含残基16R和84A的重链框架区种系序列。图14提供显示这些氨基酸残基中的每一者相对于P1-068761的VH和其CDR序列的位置的比对。P1-068761和其他抗体的VH中的K16R和T84A取代绘示于序列表中。
这些取代改变了所述两个位置的氨基酸残基，从而其与衍生‘029重链的种系含有相同氨基酸。16R和84A残基也存在于P1-61015VH框架区中(参见SEQ ID NO：95)。
如实施例9中所阐述来测量这些抗体与hVISTA的结合。结果提供于表22中，并且所述抗体的氨基酸取代显示于表23中。结果指示，K16R和T84A不会显著影响’029子代的结合动力学。
因此，本文所阐述的任一抗hVISTA抗体可包含K16R和/或T84A。构建具有K16R和/或T84A的抗体P1-061029_F100fE_V102D(P1-072000)、P1-061029_F100fE(P1-072002)、P1-061029_V102D(P1-072004)、P1-061029_Y32E(P1-072006)和P1-061029_Y32E_F100fE(P1-072008)且如本文所阐述来测试其结合。
因此，此实施例鉴别在酸性pH以大于在生理pH 200-10,000倍的亲和力结合至人VISTA的抗人VISTA抗体。在细胞结合测定中，这些酸性pH选择性VISTA抗体在大约pH 6.5下展现结合强度的拐点，这类似于针对VISTA与T细胞的结合所观察。
实施例18：抗VISTA抗体和抗PD-1抗体协同作用以诱发肿瘤排斥
为表征阻断VISTA的酸性pH选择性配体界面在肿瘤中的效应，产生小鼠代用抗体VISTA.10，所述抗体阻断小鼠VISTA在酸性pH与小鼠T细胞的结合。(VISTA.10也在生理pH结合mVISTA。)为避免Fc受体接合和任何后续效应子功能，将VISTA.10转化成具有点突变D265A的IgG1同种型以避免Fc受体接合和效应子功能{Clynes，2000}。将MC38肿瘤经皮下植入小鼠中，并且在肿瘤达到约70mm2时，每三天向小鼠施用下列治疗：组1：4个剂量的抗KLHmIgG1-D265A，30mpk；组2：两个剂量的抗PD-1 mIgG1-D265A，5mg/kg；组3：4个剂量的抗VISTAmIgG1-D265A，30mg/kg；和组4：抗PD-1+抗VISTA组合。VISTA.10和PD-1阻断性抗体的组合治疗可在大部分植入MC38结肠直肠腺癌肿瘤的小鼠中诱发肿瘤排斥(图15A-D)。抗PD-1和VISTA.10单一药剂治疗适当延迟肿瘤进展，但并不预防(图15A-15D)。
与这些结果一致，来自治疗小鼠的肿瘤的离体分析显示，在经VISTA.10和抗PD-1治疗的小鼠中，肿瘤浸润性CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的频率分别增加5倍和10倍(图15E-F)。其他白细胞子组大多不受影响。组合疗法也使得显著降低PD-1、LAG-3和TIM-3、T细胞衰竭和功能障碍的所有标记物在肿瘤浸润性CD8+ T细胞上的表达(图15E)。使用PD-1或VISTA抗体单独治疗仅对T细胞频率和表型具有中等效应(图15E-15F)。肿瘤内髓系细胞子组频率(包括巨噬细胞、单核细胞髓系源抑制细胞(MDSC)和粒细胞性MDSC的频率)大多不受VISTA抗体治疗影响。
为情景化VISTA抗体活性，向VISTA敲除小鼠植入MC38肿瘤并使用PD-1阻断性或对照抗体治疗。如图15I中所显示，在对照治疗组中，MC38肿瘤在VISTA敲除小鼠和其野生型同胎幼仔中等效生长。VISTA敲除小鼠对抗PD-1展现增加的反应性，从而暗示VISTA和PD-1组合功效。此反应性同样与增加的肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞相关。这些数据指示，在酸性pH阻断VISTA结合的抗体足以回复VISTA介导的免疫抑制。
因VISTA在酸性pH选择性发挥作用，故假设VISTA介导的抗肿瘤反应抑制主要发生于肿瘤床自身内。测试了酸性pH选择性人VISTA阻断性抗体P1-068767(’767)和其非pH选择性亲本抗体P1-061029(’029)在表达人VISTA细胞外结构域而非内源性VISTA细胞外结构域的转基因小鼠(人VISTA敲入小鼠，genOway)中的活性。与上述组合和VISTA敲除实验一致，P1-061029和P1-068767在与小鼠PD-1阻断性抗体组合时诱发相当的功效(图15J-15M)。
测量P1-068767和P1-061029在人VISTA敲入小鼠中的半衰期。如图15N中所显示，P1-068767展现长于P1-061029几乎20倍的平均滞留时间(MRT)，这指示在pH7.4下的弱VISTA结合和由此减小的TMDD(分别为71小时和4.1小时)。
为在非转基因模型中评价外周VISTA的抗体接合，使用P1-068767和中性pH偏好抗体(称为VISTA.4，相同申请人的单独专利申请家族进一步阐述VISTA.4)如下所述来治疗食蟹猕猴。在经静脉内向蛋白质初始食蟹猕猴中以5mg/kg的剂量(n＝1/抗体)输注10分钟后评估VISTA.4和P1-068767。在输注后0.17、0.5、2、4、6、24、48、72、168、216、240、336小时收集连续血样。随后，获得血清样本以用于使用配体结合测定进行抗体浓度分析，所述测定采用重组VISTA作为捕获剂且使用抗人IgGFcmAb作为检测剂。测定的量化下限为1ng/mL。通过血清mAb浓度-时间数据的非分室分析使用Kinetica软件(5.0版，Thermo FisherScientific)估计平均滞留时间。结果显示，P1-068767同样展现极长的MRT(分别为717小时和7.6小时，图6O)。这些结果表明，肿瘤微环境(而非在血液和非酸性组织中)中的VISTA阻断可驱动抗肿瘤功效。
实施例19：VISTA.4抑制VISTA与PSGL-1的结合
免疫受体P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在先前鉴别为VISTA配体(参见WO2018132476)。PSGL-1是选择素、尤其P-选择素的受体，并且结合至其一级配体，P-选择素是充分描述的白细胞、血小板和内皮细胞之间的粘附相互作用的促进剂(Carlow，D.A.，等人，PSGL-1 function in immunity and steady state homeostasis.Immunol Rev，2009.230(1)：p.75-96，和Abadier，M.和K.Ley，P-selectin glycoprotein ligand-1 in Tcells.Curr Opin Hematol，2017.24(3)：p.265-273.18)。PSGL-1也已在慢性病毒感染、癌症肿瘤免疫性和一些自身免疫疾病的背景中鉴别为T细胞反应的负性调节因子(Angiari，S.等人，Regulatory T cells suppress the late phase of the immune response inlymph nodes through P-selectin glycoprotein ligand-1.J Immunol，2013.191(11)：p.5489-500；Matsumoto，M.，M.Miyasaka和T.Hirata，P-selectin glycoprotein ligand-1negatively regulates T-cell immune responses.J Immunol，2009.183(11)：p.7204-11；Nunez-Andrade，N.等人，P-selectin glycoprotein ligand-1 modulates immuneinflammatory responses in the enteric lamina propria.J Pathol，2011.224(2)：p.212-21；Perez-Frias，A.等人，Development of an autoimmune syndrome affectingthe skin and internal organs in P-selectin glycoprotein ligand 1 leukocytereceptor-deficient mice.Arthritis Rheumatol，2014.66(11)：p.3178-89；Tinoco，R.等人，PSGL-1 Is an Immune Checkpoint Regulator that Promotes T CellExhaustion.Immunity，2016.44(5)：p.1190-203)。此免疫抑制性功能似乎独立于已知PSGL-1配体(Tinoco，R.等人，PSGL-1：A New Player in the Immune CheckpointLandscape.Trends Immunol，2017.38(5)：p.323-335)。
在基于细胞的测定中，重组PSGL-1和重组P-选择素显示均能够阻断VISTA多聚体与经活化人CD4+ T细胞的结合。通过CRISPR自经活化CD4+ T细胞缺失PSGL-1也消融VISTA多聚体结合。另外，PSGL-1的异位表达显示足以使得VISTA能够在酸性pH结合至CHO细胞，并且VISTA表达足以使得PSGL-1能够在酸性pH结合至293T细胞。
此实施例显示，PSGL-1在酸性和生理pH等效结合P-选择素，但仅在酸性pH结合VISTA(图17A)。使用Octet生物传感器测定利用VISTA、P-选择素和先前显示支持高亲和力P-选择素结合的最小PSGL-1糖肽(氨基酸1-19，具有磺基酪氨酸和唾液酰基路易斯X碳水化合物翻译后修饰)来实施实验(Sako，D.等人，A sulfated peptide segment at the aminoterminus of PSGL-1 is critical for P-selectin binding.Cell，1995.83(2)：p.323-319)。
PSGL-1的配体界面依赖于带负电磺基酪氨酸和唾液酰基路易斯-X翻译后修饰来以高亲和力结合P-选择素(Sako等人，1995 Cell 83(2)：p.323-319)，并且表达经非唾液酰基路易斯X修饰的PSGL-1的初始T细胞由此不能有效接合P-选择素。经唾液酰基路易斯X修饰的PSGL-1组成型表达于循环单核细胞和中性粒细胞上，并且诱导型表达于经活化T细胞上，这与VISTA与这些细胞类型在酸性pH的强结合一致。然而，发现VISTA结合至初始和活化T细胞，从而表明，不同于P-选择素，VISTA独立于唾液酰基路易斯X结合PSGL-1。在其他Octet生物传感器测定中发现，尽管VISTA和P-选择素二者优先结合至具有唾液酰基路易斯X修饰的PSGL-1糖肽，但仅VISTA结合不含唾液酰基路易斯X的PSGL-1糖肽。另外，在不表达酶葡萄糖氨基(N-乙酰基)转移酶(GCNT1)和α(1，3)-岩藻糖基转移酶-7酶(FUT7)的细胞中产生的PSGL-1缺乏唾液酰基路易斯X修饰且较差地结合至P-选择素(图25A)。与之相比，VISTA独立于唾液酰基路易斯X结合PSGL-1(图25A)。此结果与VISTA(而非P-选择素)结合至缺乏唾液酰基路易斯X的初始T细胞一致。
同样类似于P-选择素，VISTA在酸性pH适当结合至硫酸乙酰肝素。
另外，阻断P-选择素结合的PSGL-1抗体并不阻断VISTA结合。这些数据指示，VISTA结合类似于但不同于由P-选择素所结合界面的PSGL-1界面。
此实施例另外显示，阻断VISTA与T细胞的结合的抗体P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4也阻断VISTA与PSGL-1糖肽的结合。
实施竞争性Octet测定以评估酸性pH选择性α-VISTA抗体P1-068761和P1-068767、P1-061029 pH非依赖性亲本和酸性pH敏感性VISTA.4是否阻断VISTA与PSGL1的结合。在OctetRed384生物膜干涉技术(BLI)仪器(PALL/ForteBio)上实施结合测定。在30℃和1000rpm振荡速度下实施所有测定步骤，并且所用缓冲液是pH 6.0 PBST(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸盐缓冲液、0.05％Tween 20)。将人VISTA-Fc(R&D Systems 7126-B7号)在pH 6.0 PBST中稀释至400nM且与0nM、40nM和400nM滴定系列的P1-068761、P1-068767、P1-061029和VISTA.4预混合30分钟。将人PSGL1 19聚体-huFc蛋白(由融合至人Fc的成熟PSGL1的氨基末端19氨基酸组成)捕获于抗人IgG-Fc传感器(AHC，PALL/ForteBio)上。接下来使用总人IgG(Jackson 009-000-002号)阻断抗人捕获传感器。接下来测量经捕获PSGL1与VISTA-Fc/α-VISTA抗体混合物的结合以评价α-VISTA抗体是否防止VISTA结合至PSGL1。对于每种抗体滴定系列而言，将VISTA与PSGL1的结合量级(nm位移)归一化至设定于100％的0nM未阻断VISTA:PSGL1反应。来自此测定的结果汇总于图17B中。在此测定中，400nM浓度的P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4均显示阻断活性。可防止VISTA-Fc蛋白结合至经捕获人PSGL1-19聚体-huFc蛋白，如通过观察到的减小的VISTA结合所指示。
另外证实，VISTA与CHO-PSGL-1细胞的结合由VISTA.4和P-选择素阻断性PSGL-1抗体KPL-1阻断(图17C)。在PSGL-1抗体阻断测定中，将细胞与指示抗体KPL-1(BDBiosciences或Biolegend)或PL2(MBL)一起预培育，然后使用32nM加载的VISTA多聚体或VISTA-Fc嵌合蛋白进行标记。通过抗IgG(Jackson ImmunoResearch)或抗6xhis(ColumbiaBiosciences)抗体检测VISTA-Fc结合。通过流式细胞术或均相时间分辨荧光(HTRF)获取细胞。
实施例20：结合至hVISTA的P1-068767的晶体结构
为表征VISTA的结构和VISTA抗体结合的分子决定子，制备hVISTA IgV结构域与P1-068767抗原结合片段(Fab)的共晶体。在
分辨率下测定所得复合物的结构(图18)。VISTA IgV结构域通常是其家族的特性，其与PD-L1具有一定相似之处(图18B)。然而，不同于PD-L1和大部分其他B7家族或免疫球蛋白超家族成员，VISTA IgV结构域的两个C-末端β链含有多个其他残基，从而产生异常狭长和富集组氨酸的中心β折叠(图18B)。P1-068767(阻断性抗体)在此β折叠延伸处结合VISTA，而非阻断性抗体VISTA.5结合不同区域(图18C)。VISTA的β折叠延伸由三个组氨酸残基：H121、H122和H123封端。P1-068767残基E110和D112分别与VISTA残基H121和H122形成氢键(图18D)。这些相互作用与先前实施例中所阐述的发现非常吻合，即，需要P1-068767残基E110和D112来达到酸性pH选择性且其足以胜任。在共晶体中，VISTA残基H123与来自沉淀剂的硫酸盐分子相互作用且与P1-068767残基E1形成盐桥；但VISTA H123可与P1-068767在不存在硫酸盐下形成真正的氢键(图18D)。其他相互作用提供于表24中。这些数据表明，VISTA IgV结构域的异常、富集组氨酸β折叠延伸是VISTA的酸性pH选择性受体-配体界面的关键组分。
表24详述在VISTA原子4埃
内的‘767 Fab HC原子之间的距离(以
表示)。
实施例21：VISTA.4的表位定位
在先前阐述于实施例15中的竞争性BLI表位分箱测定中使用VISTA.4。结果指示，VISTA.4与上述抗体P1-061015、P1-061029、P1-068761和P1-068767竞争结合至人VISTA，并且由此与这些抗体属相同表位组(组A)。VISTA.4并不与VISTA mAb 1竞争结合至人VISTA(参见图11A)。
还使用酵母表面展示和NGS如实施例15中针对抗体P1-061015、P1-061029、P1-068761和P1-068767所阐述来定位VISTA.4的表位。分选并不结合至所定位抗体但保持结合至非阻断性抗体(mAb1)的VISTA突变体并测序。因保持结合至mAb1，这些突变体很可能正确折叠，并且可见的与所定位抗体中的结合损失很可能是由于损失了能量上重要的接触残基。使得损失结合且指定为抗体表位中的在能量上重要的残基的突变位置显示于表31中，并且显示抗体P1-061015、P1-061029、P1-068761和P1-068767的能量上重要的接触残基(也显示于上文表14中)。
利用氢/氘交换质谱(HDX-MS)来探究人VISTA与mAb VISTA.4的结合表位。HDX-MS在溶液中通过监测主链酰胺氢原子的氘交换速率和程度来探究蛋白质构象和构象动力学(Huang和Chen(2014)Analytical and Bioanalytical Chemistry 406，6541-6558；Wei等人，Drug Discovery Today(2014)19，95-102)。HDX的程度取决于主链酰胺氢原子和蛋白质氢键的溶剂可及性。可通过MS精确地测量HDX时蛋白质的质量增加。在此技术与酶消化配对时，可拆分肽层面的结构特征，从而使得能够区分表面暴露的肽与内部折叠者或隔离于蛋白质-蛋白质复合物界面处者。通常，实施氘标记和随后骤冷实验，随后实施酶消化、肽分离和MS分析。
在表位定位实验之前，实施非氘化实验以生成重组人VISTA(15μM)和VISTA与mAbVISTA.4的蛋白质复合物(1∶1摩尔比率)的常用肽的清单。在HDX-MS实验中，将5μL每个样本(VISTA或VISTA与mAb VISTA.4)稀释至55μL D2O缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，D2O，pH7.0)中以开始标记反应。经以下不同时间段实施反应：1min、10min和240min。截至每一标记反应时段结束，通过添加骤冷缓冲液(含有4M GdnCl和0.4M TCEP的100mM磷酸盐缓冲液，pH2.5，1∶1，v/v)来骤冷反应，并且将50μL骤冷样本注射至Waters HDX-MS系统中用于分析。在VISTA.4不存在/存在下监测常见胃蛋白酶解肽的氘摄取量。获得序列覆盖率为82％。
HDX-MS实验提供人VISTA的85％序列覆盖率。如图19中所显示，在人VISTA中针对VISTA.4的HDX-MS数据分析指示，VISTA.4的表位包含人VISTA的三个区域，其中区域2是一级表位(残基编号对应于天然人VISTA序列，图20)：
区域1：57LGPVDKGHDVTF68(SEQ ID NO：566)
区域2：86RRPIRNLTFQDL97(SEQ ID NO：567)
区域3：148VVEIRHHHSEHRVHGAME165(SEQ ID NO：568)
抗体VISTA.4在酸性和中性充分等效pH结合。其他轮选择产生在pH 6.0下以高于在pH 7.4下200倍的亲和力结合VISTA的变体。使用VISTA阻断性抗体的类似工作产生在pH6.0下的选择性最高10,000倍于pH 7.4的变体。使用这些抗体在酸性和中性pH来定位VISTA的受体-配体结合界面。pH非依赖性、中性pH选择性和酸性pH选择性VISTA阻断性抗体结合几乎相同的表位，从而表明仅组氨酸质子化(不含所标记的构象变化)即控制VISTA在酸性pH接合其反受体的能力。(VISTA.4进一步阐述于相同申请人的另一申请家族中。)
实施例22：VISTA.4抑制VISTA在酸性pH与T细胞的结合
此实施例显示，表位组A中的VISTA.4和其他抗体阻断VISTA在酸性pH与T细胞的结合，而表位组B中的VISTA.5(mAb1)和其他抗体则不阻断(图21A和B)。
基本上如实施例4中所阐述来实施此实施例。
实施例23：VISTA.4增强T细胞增殖和IFN-γ产生
此实施例显示，VISTA阻断性Ab(表位组A)增强T细胞增殖和IFN-γ产生(图22)。并非阻断性抗体的VISTA.5(mAb1)则不增强T细胞增殖或IFN-γ产生。在将T细胞与不表达VISTA的293T-OKT3细胞共培养时，VISTA.4并无效应。
通过将VISTA抗添加体至与经工程化以表达人VISTA和T细胞受体激动剂抗体OKT3的单链可变片段的293T细胞(293T-OKT3-VISTA)一起共培养的CD4+ T细胞中来实施此实验。
实施例24：VISTA抑制T细胞受体介导的NF-kB信号传导
实施此实施例以进一步评价pH对VISTA功能的影响，并且显示，VISTA在酸性pH较在中性pH更强力地抑制T细胞受体介导的NF-kB信号传导(图23A)。在低于pH 6.5下达到最大抑制，这类似于VISTA:T细胞结合(图23A和图4A)。
使用报告NFkB的Jurkat T细胞基本上如实施例5和13中所阐述来测量NF-kB信号传导。工程化Jurkat细胞以在NF-kB-诱导型启动子的控制下表达荧光素酶。将这些JurkatNFkB-荧光素酶细胞与未辐照293T-OKT3-VISTA细胞一起以4∶1的比率在使用MES酸化至各种pH的HBSS(ThermoFisher)中以及人抗人VISTA抗体共培养4小时。通过荧光素酶底物测定(Promega)测量Jurkat细胞活化。VISTA介导的抑制在酸性pH最为强力，但在pH7.0和以上维持中等活性程度。类似地，重组VISTA在酸性pH较在pH 7.4下更强烈地抑制T细胞NFkB磷酸化(图23B)。这些结果指示，VISTA优先在酸性pH抑制T细胞，并且此活性由在酸性pH阻断T细胞结合的抗体回复。
因此，这些数据表明，阻断VISTA的酸性pH选择性受体-配体界面可回复免疫抑制。
实施例25：通过组氨酸和磺基酪氨酸残基测定VISTA:PSGL-1结合特异性
为表征PSGL-1结合特异性，除通过唾液酰基路易斯X所提供(阐述于实施例19中)外，还检验了有助于P-选择素结合的酪氨酸硫酸化翻译后修饰。为测试酪氨酸硫酸化的作用，通过阴离子交换液相色谱将PSGL-1糖肽分级分离成富集磺基酪氨酸峰(＞90％)和磺基酪氨酸缺乏峰(＜1％)。VISTA或P-选择素均不可检测地结合至缺乏磺基酪氨酸的PSGL-1(图25B)。VISTA也不能结合其中酪氨酸经丙氨酸取代的PSGL-1糖肽(未显示于图中)。这些结果指示，磺基酪氨酸残基是PSGL-1与VISTA的结合的关键媒介。
假设VISTA结合特异性是由发现于VISTA阻断性抗体表位内的相同组氨酸残基：H153、H154和H155介导(参见实施例20)。使用不带电丙氨酸或带负电天门冬氨酸代替这些组氨酸残基可显著减小VISTA与重组PSGL-1和CHO-PSGL-1细胞的结合(图25C-25D)。通过瞬时转染Expi293细胞来产生H153、H154和H155残基突变成丙氨酸、天门冬氨酸或精氨酸的VISTA-Fc蛋白。这些突变体也不能在功能上抑制T细胞(未显示于图中)。与之相比，使用带正电精氨酸残基进行代替可保留VISTA结合和功能(图25C-25D)。阻断性抗体VISTA.4和P1-068767充分结合至丙氨酸和精氨酸突变VISTA，但较差地结合至天门冬氨酸突变VISTA(未显示)。非阻断性抗体VISTA.5等效结合至野生型和突变VISTA蛋白(未显示)。
然后使用PSGL-1结合至P-选择素和VISTA结合至P1-068767Fab(图18)的解析结构来开发衔接至VISTA的PSGL-119聚体糖肽的计算模型(图25E)。在此模型中，PSGL-1酪氨酸残基Y46和Y48与VISTA组氨酸残基H153和H154(
距离)产生离子相互作用。PSGL-1 Y51较远离VISTA(约
)，但可与VISTA H100显著相互作用。PSGL-1E56也与VISTA H98和H100形成离子相互作用。可经唾液酰基路易斯X修饰的PSGL-1 T57的羟基远离VISTA，这与唾液酰基路易斯X对VISTA:PSGL-1结合的可忽略影响一致。总而言之，这些数据和建模表明，VISTA在酸性pH与PSGL-1的结合主要由VISTA组氨酸残基H153、H154和H155以及PSGL-1硫酸化酪氨酸残基Y46和Y48驱动。
序列表
下文是本申请中所提及的某些序列的表格。在SEQ ID NO：2中，氨基酸位置187可为D或E。
在下文的抗体序列中，VH CDR1、CDR2和CDR3序列分别位于包含氨基酸26-35、50-66和99-110的氨基酸位置，并且VL CDR1、CDR2和CDR3序列分别位于包含氨基酸24-35、51-57和90-98的氨基酸位置。VH CDR1是根据AbM来编号(AA 26-35；Abhinandan和Martin(2008)Mol.Immunol.45：3832-3839；Swindells等人(2017)J.Mol.Biol.429：356-364)且所有其他CDR(VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1-3)是根据Kabat来编号。对于特定抗体物质的CDR序列而言，其VH和VL序列在下文中加粗体和加下划线。
Claims (212)
1.一种经分离的抗体，其在酸性条件中特异性结合至人VISTA(hVISTA)。
2.如权利要求1所述的经分离的抗体，其在酸性条件中特异性结合至hVISTA，但在中性或生理条件中不会显著结合。
3.如权利要求1或2所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的KD比在中性或生理条件下的KD低至少10倍。
4.如权利要求1至3中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的KD比在中性或生理条件下的KD低至少100倍。
5.如权利要求1至4中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的KD比在中性或生理条件下的KD低至少1000倍。
6.如权利要求1至5中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以10-5M或更大的KD结合至hVISTA。
7.如权利要求1至6中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以10-4M或更大的KD结合至hVISTA。
8.如权利要求1至7中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以10-3M或更大的KD结合至hVISTA。
9.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-7M或更小的KD结合至hVISTA。
10.如权利要求1至9中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10- 8M或更小的KD结合至hVISTA。
11.如权利要求1至10中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-9M或更小的KD结合至hVISTA。
12.如权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-7或更小的KD结合至hVISTA且在中性或生理条件中以10-4或更大的KD结合至hVISTA。
13.如权利要求1至12中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-7或更小的KD结合至hVISTA且在中性或生理条件中以10-5或更大的KD结合至hVISTA。
14.如权利要求1至13中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的K解离比在中性或生理条件下的K解离低至少5倍。
15.如权利要求1至14中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的K解离比在中性或生理条件下的K解离低至少10倍。
16.如权利要求1至15中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的K解离比在中性或生理条件下的K解离低至少50倍。
17.如权利要求1至16中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下与hVISTA结合的K解离比在中性或生理条件下的K解离低至少100倍。
18.如权利要求1至17中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以7×10-3s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
19.如权利要求1至18中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以5×10-3s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
20.如权利要求1至19中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以3×10-3s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
21.如权利要求1至20中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-3s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
22.如权利要求1至21中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以7×10-4s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
23.如权利要求1至22中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以5×10-4s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
24.如权利要求1至23中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以3×10-4s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
25.如权利要求1至24中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-4s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
26.如权利要求1至25中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以7×10-5s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
27.如权利要求1至26中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以5×10-5s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
28.如权利要求1至21中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以3×10-5s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
29.如权利要求1至28中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-5s-1或更小的k解离结合至hVISTA。
30.如权利要求1至29中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
31.如权利要求1至30中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以3×10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
32.如权利要求1至31中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以5×10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
33.如权利要求1至32中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以7×10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
34.如权利要求1至33中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
35.如权利要求1至34中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以3×10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
36.如权利要求1至35中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以5×10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
37.如权利要求1至36中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在中性或生理条件中以7×10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
38.如权利要求1至37中任一项所述的经分离的抗体，其中经由例如表面等离子共振(SPR)，无法检测到所述抗体在中性或生理条件下与hVISTA的结合。
39.如权利要求1至38中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以5×10-3s-1或更小的k解离且在中性或生理条件中以7×10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
40.如权利要求1至39中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-4s-1或更小的k解离且在中性或生理条件中以10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
41.如权利要求1至40中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-8M或更小的KD和5×10-3s-1或更小的k解离且在中性或生理条件中以10-6M或更大的KD和7×10-3s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
42.如权利要求1至41中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-8M或更小的KD和3×10-3s-1或更小的k解离且在中性或生理条件中以10-6M或更大的KD和10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
43.如权利要求1至42中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-12至10-8M的KD和10-4至5×10-3s-1的k解离且在中性或生理条件中以10-7至10-4M的KD和3×10-3至10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA。
44.如权利要求1至43中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-12至10-8M的KD和10-4至5×10-3s-1的k解离且在中性或生理条件中以10-7至10-4M的KD和3×10-3至10-2s-1或更大的k解离结合至hVISTA；并且其中所述抗体以10-7或更小的KD结合至食蟹猕猴VISTA。
45.如权利要求1至44中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH 6.9下与hVISTA结合的KD比在pH 7.4下低至少10倍，和/或KD在pH 6.5下比在pH 7.4下低至少100倍，和在pH 6.0下比在pH 7.4下低至少1000倍。
46.如权利要求1至45中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合至食蟹猕猴(cyno)VISTA。
47.如权利要求46所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件下相对于在生理条件下，以较高亲和力结合至cyno VISTA。
48.如权利要求45至47中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在酸性条件中以10-8或更小的KD和/或10-2或更小的k解离且在生理条件中以10-6或更大的KD和/或10-2或更大的k解离结合至cyno VISTA。
49.如权利要求1至48中任一项所述的经分离的抗体，其中酸性条件是pH 6.5或更小的条件。
50.如权利要求1至49中任一项所述的经分离的抗体，其中酸性条件是pH 6.0至6.5的条件。
51.如权利要求1至50中任一项所述的经分离的抗体，其中中性条件是pH 7.0的条件。
52.如权利要求1至51中任一项所述的经分离的抗体，其中生理条件是pH 7.35至7.45的条件。
53.如权利要求1至52中任一项所述的经分离的抗体，其中生理条件是pH 7.4的条件。
54.如权利要求1至53中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体抑制hVISTA结合至人T细胞，例如人CD4+T细胞(拮抗剂抗体)。
55.如权利要求54所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件下抑制hVISTA与人T细胞的结合。
56.如权利要求1至55中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体抑制hVISTA与人PSGL-1(huPSGL-1)的结合和/或与huPSGL1竞争结合至hVISTA。
57.如权利要求56所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中抑制hVISTA与huPSGL-1的结合。
58.如权利要求1至57中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体抑制hVISTA与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合。
59.如权利要求58所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中抑制hVISTA与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合。
60.如权利要求55、57或59中任一项所述的经分离的抗体，其中pH小于pH 7.0的条件是受试者中肿瘤或pH小于pH 7.0的任一患病区域，并且其中期望刺激免疫。
61.如权利要求1至60中任一项所述的经分离的抗体，其中通过例如：增强T细胞增殖；增强T细胞产生IFN-γ；和/或刺激T细胞受体介导的NF-kB信号传导来证实所述抗体刺激T细胞活化。
62.如权利要求61所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中刺激T细胞活化。
63.如权利要求1至62中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体降低VISTA介导的细胞-细胞粘附。
64.如权利要求1至53中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体刺激VISTA的活性(激动剂抗体)。
65.如权利要求1至53和64中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体刺激hVISTA结合至人T细胞，例如人CD4+T细胞。
66.如权利要求65所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中刺激hVISTA与人T细胞的结合。
67.如权利要求1至53和64至66中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体刺激hVISTA与huPSGL-1的结合。
68.如权利要求67所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中刺激hVISTA与huPSGL-1的结合。
69.如权利要求1至53和64至68中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体刺激hVISTA与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合。
70.如权利要求69所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH小于pH 7.0的条件中刺激hVISTA与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的结合。
71.如权利要求66、68和70中任一项所述的经分离的抗体，其中pH小于pH 7.0的条件是受试者中的自身免疫(例如类风湿性关节炎和狼疮)环境、发炎部位或pH小于pH 7.0的任一患病区域，并且其中期望抑制免疫。
72.如权利要求1至71中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在食蟹猕猴中具有至少100、200、300、400或500天的平均滞留时间(MRT)。
73.如权利要求1至72中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体并不会与接受施用的受试者的外周血中的VISTA阳性细胞，例如中性粒细胞显著结合。
74.如权利要求1至73中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体并不会显著耗尽接受施用的受试者的外周血中的VISTA阳性细胞，例如中性粒细胞。
75.如权利要求1至74中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体已经工程化以在酸性pH结合至hVISTA，但不会在中性或生理pH下结合。
76.如权利要求75所述的经分离的抗体，其中所述抗体已通过使用谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基替代hVISTA结合抗体的VH CDR1、CDR2和/或CDR3中的1至8个氨基酸来进行工程化。
77.如权利要求1至63和72至76中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061029或其变体的VH CDR1、CDR2和/或CDR3，所述变体相对于抗体P1-061029在VH CDR1、CDR2和/或CDR3中包含1至6个或1至8个氨基酸差异，其中至多1、2或3个氨基酸变化存在于任一CDR中。
78.如权利要求77所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061029或其变体的VHCDR1、CDR2和CDR3，所述变体相对于P1-061029在VH CDR1、CDR2和/或CDR3中包含1至6个或1至8个氨基酸差异。
79.如权利要求77或78所述的经分离的抗体，其中氨基酸变化是取代成谷氨酸残基(E)、天门冬氨酸残基(D)或组氨酸残基(H)。
80.如权利要求77至79中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
-包含GFTX1X2DX3AMH的CDR1，其中X1是D或L，X2是E或D，并且X3是E或Y(SEQ ID NO：563)；
-包含GIX4WX5SX6X7IGYADSVKG的CDR2，其中X4是D或N，X5是D或N，X6是D、E、H或A，并且X7是D、E、H或N(SEQ ID NO：564)；和/或
-包含VPGYSX8GWIDAX9DX10的CDR3，其中X8是E、H或G，X9是E、D或F，并且X10是D、E或V(SEQID NO：565)。
81.如权利要求80所述的抗体，其中所述抗体包含：
-包含GFTX1X2DX3AMH的CDR1，其中X1是D或L，X2是E或D，并且X3是E或Y(SEQ ID NO：563)；
-包含GIX4WX5SX6X7IGYADSVKG的CDR2，其中X4是D或N，X5是D或N，X6是D、E、H或A，并且X7是D、E、H或N(SEQ ID NO：564)；和
-包含VPGYSX8GWIDAX9DX10的CDR3，其中X8是E、H或G，X9是E、D或F且X10是D、E或V(SEQ IDNO：565)。
82.如权利要求80或81所述的经分离的抗体，其中X3是E且X9是E。
83.如权利要求80至82中任一项所述的经分离的抗体，其中X2是E，X7是E，和/或X8是H。
84.如权利要求83所述的经分离的抗体，其中符合下列三个条件中的两者或更多者：X2是E，X7是E，和/或X8是H。
85.如权利要求84所述的经分离的抗体，其中X2是E，X7是E且X8是H。
86.如权利要求80至85中任一项所述的经分离的抗体，其中X6是E。
87.如权利要求80至85中任一项所述的经分离的抗体，其中X6是A。
88.如权利要求80至86中任一项所述的经分离的抗体，其中X1是L，X4是N，X5是N和/或X10是V。
89.如权利要求88所述的经分离的抗体，其中符合下列4个条件中的两者或更多者：X1是L，X4是N，X5是N和/或X10是V。
90.如权利要求89所述的经分离的抗体，其中符合下列4个条件中的三者或更多者：X1是L，X4是N，X5是N和/或X10是V。
91.如权利要求90所述的经分离的抗体，其中X1是L，X4是N，X5是N和/或X10是V。
92.如权利要求80至91中任一项所述的经分离的抗体，其中X10是D。
93.如权利要求80至92中任一项所述的经分离的抗体，其中X9是E。
94.如权利要求80至93中任一项所述的经分离的抗体，其中X2是E，X4是D和/或X6是E。
95.如权利要求94所述的经分离的抗体，其中符合下列条件中的两者或更多者：X2是E，X4是D和/或X6是E。
96.如权利要求95所述的经分离的抗体，其中X2是E，X4是D且X6是E。
97.如权利要求80至96中任一项所述的经分离的抗体，其中X1是L，X3是Y，X5是N，X7是N和/或X8是G。
98.如权利要求97所述的经分离的抗体，其中符合下列条件中的两者或更多者：X1是L，X3是Y，X5是N，X7是N和/或X8是G。
99.如权利要求98所述的经分离的抗体，其中符合下列条件中的三者或更多者：X1是L，X3是Y，X5是N，X7是N和/或X8是G。
100.如权利要求99所述的经分离的抗体，其中符合下列条件中的四者或更多者：X1是L，X3是Y，X5是N，X7是N和/或X8是G。
101.如权利要求100所述的经分离的抗体，其中X1是L，X3是Y，X5是N，X7是N且X8是G。
102.如权利要求77至101中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含以下各者的VH CDR1、CDR2和/或CDR3：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G或P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。
103.如权利要求102所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含以下各者的VH CDR1、CDR2和CDR3：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。
104.如权利要求77至103中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061029的VL的VL CDR1、CDR2和CDR3。
105.如权利要求1至63和72至104中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有与以下各者有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE；或包含以下各者的经1、2、3、4或5个氨基酸取代修饰、经1、2、3、4或5个保守氨基酸取代修饰或经K16R取代和T84A取代中的一者或两者修饰的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。
106.如权利要求1至63和72至105中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有以下各者的VH氨基酸序列的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G或P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E、或P1-061029_Y32E_F100fE；或
包含以下各者的经K16R取代和T84A取代中的一者或两者修饰的VH：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE。
107.如权利要求1至106中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有与P1-061029的氨基酸序列有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的VL。
108.如权利要求107所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061029的VL。
109.如权利要求1至63和72至76中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061015或其变体的VH CDR1、CDR2和/或CDR3，所述变体相对于P1-061015在VH CDR1、CDR2和/或CDR3中包含1至6或1至8个氨基酸差异，其中至多1、2或3个氨基酸变化存在于任一CDR中。
110.如权利要求109所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061015或其变体的VHCDR1、CDR2和CDR3，所述变体相对于所述P1-061015在VH CDR1、CDR2和/或CDR3中包含1至6个氨基酸差异，其中至多1、2或3个氨基酸变化存在于任一CDR中。
111.如权利要求108或109所述的经分离的抗体，其中氨基酸变化是取代成谷氨酸残基(E)、天门冬氨酸残基(D)或组氨酸残基(H)。
112.如权利要求108至111中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
-包含GFTFX1X2X3MH的CDR1，其中X1是E、D、H或S；X2是H或Y；并且X3是D或A(SEQ ID NO：569)；
-包含X4X5WX6DGSX7X8X9X10ADSVKG的CDR2，其中X4是E、H或I；X5是D或I；X6是D或Y；X7是D或N；X8是D、H或K；X9是D、H或Y；并且X10是E或Y(SEQ ID NO：570)；和/或
-包含DX11X12FYX13X14YYDFX15的CDR3，其中X11是E或S；X12是E或G；X13是D、E或S；X14是D或S；并且X15是D、E或Y(SEQ ID NO：571)。
113.如权利要求108至112中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含
-包含GFTFX1X2X3MH的CDR1，其中X1是E、D、H或S；X2是H或Y；并且X3是D或A(SEQ ID NO：569)；
-包含X4X5WX6DGSX7X8X9X10ADSVKG的CDR2，其中X4是E、H或I；X5是D或I；X6是D或Y；X7是D或N；X8是D、H或K；X9是D、H或Y；并且X10是E或Y(SEQ ID NO：570)；和
-包含DX11X12FYX13X14YYDFX15的CDR3，其中X11是E或S；X12是E或G；X13是D、E或S；X14是D或S；并且X15是D、E或Y(SEQ ID NO：571)。
114.如权利要求98至102中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的VH CDR1、CDR2和/或CDR3。
115.如权利要求114所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的VH CDR1、CDR2和CDR3。
116.如权利要求98至115中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含P1-061015的VL的VL CDR1、CDR2和CDR3。
117.如权利要求98至116中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含VH，所述VH包含与P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的氨基酸序列有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或包含P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的VH经1、2、3、4或5个氨基酸取代修饰或经1、2、3、4或5个保守氨基酸取代修饰的氨基酸序列。
118.如权利要求98至117中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含VH，所述VH包含P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的VH的氨基酸序列；或包含P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754的VH经1、2、3、4或5个氨基酸取代修饰或经1、2、3、4或5个保守氨基酸取代修饰的氨基酸序列。
119.如权利要求98至118中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有与P1-061015的氨基酸序列有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的VL。
120.如权利要求119所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有P1-061015的氨基酸序列的VL。
121.如权利要求1至120中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体在hVISTA的富集组氨酸区域或附近，例如富集组氨酸β折叠延伸处结合。
122.如权利要求121所述的经分离的抗体，其中所述抗体在pH6.0至6.5的条件中在hVISTA的富集组氨酸区域或附近，例如富集组氨酸β折叠延伸处结合。
123.如权利要求1至122中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体与一种或多种本文所述例如包含以下的VH和VL的抗体竞争或交叉竞争结合至hVISTA：P1-061029、P1-068757、P1-068759、P1-068761、P1-068763、P1-068765、P1-068767、P1-068769、P1-068771、P1-068773、P1-068775、P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069069、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-069077、P1-068761_E55A、P1-068761_H100G、P1-068761_E56N、P1-068761_E55A_E56N、P1-068761_E30D、P1-068761_E30D_E55A、P1-068761_E56N_H100G、P1-068761_E30D_H100G或P1-068761_E30D_E56N、P1-068761_E100fF、P1-068761_E55A_E100fF、P1-068761_H100G_E100fF、P1-068761_E30D_E100fF、P1-068761_E56N_E100fF、P1-068761_E32Y、P1-068761_E32Y_E55A、P1-068761_E32Y_E56N、P1-068761_E30D_E32Y、P1-068761_E32Y_H100G、P1-068761_E32Y_E100fF、P1-068767_D52N_D102V、P1-068767_D52N、P1-068767_D52N_E55A、P1-068767_E55A_D102V、P1-068767_D102V、P1-068767_E55A、P1-068767_E30D_D52N、P1-068767_E30D_D102V、P1-068767_E30D、P1-068767_E30D_E55A、P1-068767_E100fF_D102V、P1-068767_E55A_E100fF、P1-068767_D52N_E100fF、P1-068767_E100fF、P1-068767_E30D_E100fF、P1-061029_F100fE_V102D、P1-061029_F100fE、P1-061029_V102D、P1-061029_Y32E或P1-061029_Y32E_F100fE、P1-061015、P1-068736、P1-068738、P1-068740、P1-068742、P1-068744、P1-068748、P1-068750、P1-068752或P1-068754)，如例如通过实施例15中所述的竞争性生物膜干涉技术(BLI)表位分箱测定所测定。
124.如权利要求1至123中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体分箱至表位组A，如例如通过实施例15中所述的竞争性生物膜干涉技术(BLI)表位分箱测定所测定。
125.如权利要求1至124中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体不会显著结合至其中一个或多个下列氨基酸残基已突变而修饰的hVISTA：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127，例如通过实施例中所述的酵母突变分析所测定。
126.一种经分离的抗体，其结合至由SEQ ID NO：1或2组成的hVISTA，但不会显著结合至其中一个或多个下列氨基酸残基已突变而修饰的hVISTA：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127。
127.如权利要求1至126中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体不会显著结合至其中2、3、4、5个或更多个下列氨基酸残基已突变而修饰的hVISTA：T35、Y37、K38、T39、Y41、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127。
128.如权利要求125至127中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体不会结合至其中一个或多个下列残基已突变为表15中所示其中一个对应残基而修饰的hVISTA：H68、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127。
129.一种经分离的抗体(Ab)，其在酸性条件下，例如在pH 6.5下，结合至hVISTA(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)，其中所述Ab抑制hVISTA与(a)T细胞和/或(b)PSGL-1之间的相互作用，并且其中所述Ab经由本文所述抗体，如：P1-061015、P1-061029、P1-068761或P1-068767中一个或多个(例如至少1至3、1至5、1至10、5至10、5至15个或所有)能量上重要接触残基来接触hVISTA，如：一个或多个选自下列能量上重要接触残基的组中的一者的氨基酸：(i)V34、T35、Y37、K38、T39、Y41、S52、R54、T61、F62、Q63、L65、H66、L67、H68、H69、F97、L115、V117、I119、H121、H122、S124、E125、R127；(ii)V34、T35、Y37、T39、Y41、S52、R54、F62、L65、H66、H68、L115、V117、I119、R120、H121、H122、S124、E125；或(iii)Y37、T39、R54、F62、H66、L115或V117，如例如使用实施例15中所述的酵母表面展示法和NGS测定法所测定，并且其中编号是成熟hVISTA的编号。
130.一种经分离的Ab，其在酸性条件下，例如在pH 6.5结合至hVISTA(例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)，其中所述Ab抑制hVISTA与(a)T细胞和/或(b)PSGL-1之间的相互作用，并且其中所述Ab经由一个或多个(例如至少1至3、1至5、1至10、5至10、5至15个或全部)能量上重要接触残基Y37、T39、R54、F62、H66、V117、I119或S124来接触hVISTA，如例如使用实施例15中所述的酵母表面展示法和NGS测定法所测定，并且其中编号是成熟hVISTA的编号。
131.一种经分离的Ab，其在酸性条件下，例如在pH 6.5下结合至hVISTA(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)，其中所述Ab抑制hVISTA与(a)T细胞和/或(b)PSGL-1之间的相互作用，并且其中所述Ab经由P1-061015、P1-061029、P1-068761或P1-068767或本文所述的其他抗体的一个或多个(例如至少1至3、1至5、1至10、5至10、5至15个或全部)能量上重要接触残基来接触hVISTA，如例如使用实施例15中所述的酵母表面展示法和NGS测定法所测定，并且其中编号是成熟hVISTA的编号。
132.如权利要求1至131中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab结合至hVISTA的FG环。
133.如权利要求1至132中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab结合至hVISTA的富集组氨酸β折叠延伸，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述。
134.如权利要求1至133中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab经由如：氢键接触成熟hVISTA的H121、H122和H123(组氨酸三联体)(例如4.0埃
或更小的距离)，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述。
135.如权利要求1至134中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab经由VH CDR1和VHCDR3，并且例如不会显著经由VH CDR2和/或经由VL CDR接触hVISTA。
136.如权利要求1至135中任一项所述的经分离的Ab，其中所述抗体的氨基酸残基110和112分别与hVISTA的H121和H122形成氢键，并且任选地，其中所述抗体的氨基酸残基与hVISTA的H123形成氢键。
137.如权利要求1至136中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab经由至少一个或多个位于VH CDR1、CDR2或CDR3中的谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基接触hVISTA。
138.如权利要求1至137中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab在中性或生理pH不会显著结合至hVISTA(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)。
139.如权利要求1至138中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab在酸性条件下，例如在pH 6.5下，与hVISTA结合的KD和/或k解离比其在中性或生理pH下与hVISTA结合的KD和/或k解离低至少10倍、100倍或1000倍(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)。
140.如权利要求1至139中任一项所述的经分离的Ab，其中所述Ab在中性或生理pH不会显著结合至hVISTA(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)。
141.一种经分离的抗体(Ab)，其在酸性条件下，例如在pH 6.5下，结合至hVISTA(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)，其中所述Ab：
ο抑制hVISTA与(a)T细胞和/或(b)PSGL-1之间的相互作用(例如抑制具有SEQ ID NO：1的hVISTA的H153和H154与PSGL-1酪氨酸Y46和Y48之间的相互作用)；
ο通过例如增强T细胞增殖、增强T细胞产生IFN-γ和/或刺激T细胞受体介导的NF-kB信号传导，来增强T细胞活化；
ο经由一个或多个(例如至少1至3、1至5、1至10、5至10、5至15个或全部)能量上重要接触残基Y37、T39、R54、F62、H66、V117、I119或S124来接触hVISTA，如例如使用实施例15中所述的酵母表面展示法和NGS测定法所测定；并且其中编号是成熟hVISTA的编号；
ο结合至hVISTA的富集组氨酸β折叠延伸，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述；
ο例如经由氢键接触成熟hVISTA的H121、H122和/或H123(4.0埃
或更小的距离)，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述；
ο结合至具有SEQ ID NO：1的hVISTA的区域1：57LGPVDKGHDVTF68(SEQ ID NO:566)；区域2：86RRPIRNLTFQDL97(SEQ ID NO:567)；和区域3：148VVEIRHHHSEHRVHGAME165(SEQ ID NO:568)，并且任选地其中与区域2的结合最强，通过如实施例21中所述的MS-HDX所测定；
ο与本文所述的一种或多种抗体，例如P1-061015、P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4竞争结合至hVISTA(双向竞争)；
ο经由位于VH CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个或多个谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基接触hVISTA；和/或
ο具有低靶标介导的药物体内处置，导致至少100、200、300、400、500、600或700小时的平均滞留时间(MRT)，如例如实施例中所述测量。
142.一种经分离的抗体(Ab)，其在酸性条件下，例如在pH 6.5下与hVISTA结合的KD或k解离比其在中性或生理pH下与hVISTA结合的KD或k解离低至少10倍、100倍或1000倍(如例如通过实施例中所述测定中的一者所测量)，其中所述Ab：
ο抑制hVISTA与(a)T细胞和/或(b)PSGL-1之间的相互作用(例如抑制具有SEQ ID NO：1的hVISTA的H153和H154与PSGL-1酪氨酸Y46和Y48之间的相互作用)；
ο通过例如增强T细胞增殖、增强T细胞产生IFN-γ和/或刺激T细胞受体介导的NF-kB信号传导，来增强T细胞活化；
ο经由一个或多个(例如至少1至3、1至5、1至10、5至10、5至15个或全部)能量上重要接触残基Y37、T39、R54、F62、H66、V117、I119或S124来接触hVISTA，如例如使用实施例15中所述的酵母表面展示法和NGS测定法所测定；并且其中编号是成熟hVISTA的编号；
ο结合至hVISTA的富集组氨酸β折叠延伸，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述；
ο例如经由氢键接触成熟hVISTA的H121、H122和/或H123(4.0埃
或更小的距离)，如例如通过结晶学测定，例如实施例中所述；
ο结合至具有SEQ ID NO：1的hVISTA的区域1：57LGPVDKGHDVTF68(SEQ ID NO:566)；区域2：86RRPIRNLTFQDL97(SEQ ID NO:567)；和区域3：148VVEIRHHHSEHRVHGAME165(SEQ ID NO:568)，并且任选地其中与区域2的结合最强，通过如实施例21中所述的MS-HDX所测定；
ο与本文所述的一种或多种抗体，例如P1-061015、P1-061029、P1-068761、P1-068767和VISTA.4竞争结合至hVISTA(双向竞争)；
ο经由位于VH CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个或多个谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基接触hVISTA；和/或
ο具有低靶标介导的药物体内处置，导致至少100、200、300、400、500、600或700小时的平均滞留时间(MRT)，如例如实施例中所述测量。
143.如权利要求1至142中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体具有介于6.5与6.8之间的等电点(pI)，如例如通过icIEF所测量。
144.如权利要求1至143中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体展现低聚集性，例如类似或低于抗体‘029、‘761或‘767(分别是P1-061015、P1-061029、P1-068761或P1-068767)的聚集性，例如实施例中所测定。
145.如权利要求1至144中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体展现类似或低于‘029、‘761或‘767的粘度，例如实施例中所测定。
146.如权利要求1至145中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体展现类似或低于‘029、‘761或‘767的流体力学半径，例如实施例中所测定。
147.如权利要求1至146中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体展现类似或高于‘029、‘761或‘767的熔融温度(Tm1)，例如实施例中所测定。
148.如权利要求1至147中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体展现类似或低于‘029、‘761或‘767的高分子量物质的量，例如实施例中所测定。
149.如权利要求1至148中任一项所述的经分离的抗体，其是IgG抗体。
150.如权利要求149所述的经分离的抗体，其是IgG1、IgG2或IgG4抗体(任选地具有S228P的IgG4)。
151.如权利要求1至150中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是无效应子抗体，例如缺乏ADCC和/或CDC；和/或不会显著结合至一种或多种FcγR、例如FcγRIII的抗体。
152.如权利要求151所述的经分离的抗体，其中恒定区包含野生型重链恒定区中的1至5个突变，所述突变相对于所述对应野生型重链恒定区会减小所述抗体的效应子功能和/或结合至一种或多种FcγR、例如FcγRIII的能力。
153.如权利要求1至152中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体的恒定区是IgG1.3、IgG1.1或是具有P238K取代的IgG1(例如IgG1.P238K)。
154.如权利要求1至150中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体具有效应子功能和/或结合至一种或多种FcγR，例如FcγRIII。
155.如权利要求154所述的经分离的抗体，其中所述抗体是无岩藻糖基化的(例如无岩藻糖基化IgG1抗体)。
156.如权利要求154或155所述的经分离的抗体，其中恒定区包含1至5个突变，所述突变相对于对应野生型恒定区会增强所述抗体的效应子功能和/或结合至一种或多种FcγR、例如FcγRIII的能力。
157.如权利要求1至156中任一项所述的经分离的抗体，其是全长抗体或包含全长重链(含有或不含C末端赖氨酸)和全长轻链的抗体。
158.如权利要求1至156中任一项所述的经分离的抗体，其是所述抗体的抗原结合片段。
159.如权利要求1至158中任一项所述的经分离的抗体，其是多聚体(例如二聚体或三聚体)抗体。
160.如权利要求1至159中任一项所述的经分离的抗体，其连接(例如共价连接)至另一分子。
161.如权利要求160所述的经分离的抗体，其中所述另一分子是标记物。
162.如权利要求160或161所述的经分离的抗体，其中所述另一分子是肽。
163.如权利要求1至162中任一项所述的经分离的抗体，其是抗体药物缀合物(ADC)或可活化抗体。
164.一种经分离的核酸，其编码如权利要求1至163或206至212中任一项所述的抗体。
165.一种经分离的核酸，其编码如权利要求1至163或206至212中任一项所述的抗体的重链和/或轻链。
166.一种组合物，其包含编码如权利要求1至163或206至212中任一项所述的抗体的重链的经分离的核酸和编码所述抗体的轻链的核酸。
167.一种细胞，其包含如权利要求164至166中任一项所述的经分离的核酸。
168.一种制备抗体的方法，其包括在表达所述抗体的条件下培养如权利要求167所述的细胞。
169.一种组合物，其包含如权利要求1至168中任一项所述的经分离的抗体、核酸、组合物或细胞和药学上可接受的载剂。
170.如权利要求169所述的组合物，其包含第二治疗剂。
171.如权利要求170所述的组合物，其中所述第二治疗剂是免疫刺激剂或化学治疗剂。
172.如权利要求171所述的组合物，其中所述第二治疗剂是免疫刺激剂，其是免疫抑制分子、例如PD-1/PD-L1、CTLA-4和LAG-3的拮抗剂，或免疫刺激分子、例如GITR和OX40的激动剂。
173.一种治疗受试者癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至172或206至212中任一项所述的组合物或经分离的抗体，其会刺激免疫反应和/或是VISTA拮抗剂抗体。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述受试者具有VISTA阳性细胞，例如在所述癌症的肿瘤中。
175.如权利要求174所述的方法，其中细胞是VISTA阳性浸润淋巴细胞(例如T细胞)或粒单核细胞。
176.如权利要求173至175中任一项所述的方法，其中首先测试所述受试者的肿瘤中VISTA阳性细胞的存在。
177.如权利要求173至176中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用第二疗法。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述第二疗法是化学疗法、放射疗法、手术或施用第二剂。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述第二疗法是第二剂且所述第二剂是免疫刺激剂或化学治疗剂。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述第二治疗剂是免疫刺激剂，其是免疫抑制分子、例如PD-1/PD-L1、CTLA-4和LAG-3的拮抗剂，或免疫刺激分子、例如GITR和OX40的激动剂。
181.一种治疗受试者的传染性疾病(例如病毒性疾病)的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至172或206至212中任一项所述的组合物或经分离的抗体，其会刺激免疫反应和/或是VISTA拮抗剂。
182.一种治疗发炎、发炎性病状和自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病或可因降低免疫反应而受益的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至172或206至212中任一项所述的组合物或经分离的抗体，其会抑制免疫反应、例如T细胞活化或是VISTA激动剂。
183.一种鉴别在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的方法，其包括使一个测试Ab或多个测试Ab与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至95、20至70、35至70至127或35至127的片段在pH 6.5或更小pH下接触，和选择以10-7M或更小的KD结合至所述多肽的一个测试Ab或多个测试Ab。
184.一种鉴别在pH 6.5或更小pH下以5×10-3sec-1或更小的K解离结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的方法，其包括使一个测试Ab或多个测试Ab与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至95、20至70、35至70或35至127的片段在pH 6.5或更小pH下接触，和选择以5×10-3sec-1或更小的K解离结合至所述多肽的一个测试Ab或多个测试Ab。
185.一种鉴别在pH 6.5下以类似于在pH 7.0下时的亲和力结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的方法，其包括：
a.使一个测试Ab或多个测试Ab在pH 6.5，与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至95、20至70、或35至70、或35至127的片段接触；
b.使所述测试Ab或多个测试Ab在pH 7.0，与(a)的多肽接触；和
c.选择在pH 6.5和在pH 7.0下以10-7M或更小的KD结合至所述多肽的测试Ab。
186.一种鉴别在pH 6.5下以高于在pH 7.0下时的亲和力结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的方法，其包括：
a.使一个测试Ab或多个测试Ab在pH 6.5，与包含hVISTA-ECD的多肽或其包含hVISTA-ECD的IgV结构域或包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至95、20至70、35至70或35至127的片段接触；
b.使所述测试Ab或多个测试Ab在pH 7.0，与(a)的多肽接触；和
c.选择在pH 6.5下以低于在pH 7.0下时至少2倍的KD或k解离结合至所述多肽的测试Ab。
187.一种鉴别用于治疗癌症的特异性结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的方法，其包括
a.根据权利要求183至186所述的方法，鉴别在pH 6.5或更小pH下特异性结合至hVISTA-ECD的Ab；和
b.选择在pH 6.5或更小pH下触发或增强肿瘤模型中的免疫反应或抑制肿瘤生长的(a)的所述Ab。
188.如权利要求187所述的方法，其中步骤(b)包括测量T细胞活性。
189.如权利要求187或188所述的方法，其还包括测量所述Ab的抗肿瘤效应。
190.一种改善结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的抗肿瘤功效的方法，其包括
a.提供在pH 6.5或更小pH下以小于期望值的亲和力结合至hVISTA-ECD的Ab；
b.使用不同氨基酸残基(例如使用谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基)取代所述Ab的重链或轻链中的1至5个氨基酸残基，其中所述1至5个氨基酸残基是与hVISTA-ECD接触的残基，例如氨基酸残基26、30、31、32、110和112中的一者或多者(示于表24中；SEQ ID NO：67、51或55中的编号)；
c.测定(b)中所获得的Ab是否在pH 6.5或更小pH下具有高于(a)的Ab的hVISTA-ECD亲和力；和
d.多次重复步骤(a)至(c)，直到足以获得在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD的Ab。
191.一种改善结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的抗肿瘤功效的方法，其包括：
a.提供在pH 6.5或更小pH下以小于期望值的亲和力结合至hVISTA-ECD的Ab；
b.制备(a)的Ab的变体库，其中每个变体包括使用不同氨基酸残基(例如使用谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸残基)取代所述Ab的重链或轻链中的1至5个氨基酸残基，其中所述1至5个氨基酸残基是与hVISTA-ECD接触的残基，例如氨基酸残基26、30、31、32、110和112中的一者或多者(示于表24中；SEQ ID NO：67、51或55中的编号)；
c.选择(b)的变体库中在pH 6.5或更小pH以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD的Ab；和
d.任选地在肿瘤模型中测试(c)的所述Ab的抗肿瘤功效。
192.一种改善结合至人VISTA细胞外结构域(ECD)的抗体的药代动力学的方法，其包括增强所述抗体在酸性条件中，例如在等于或低于pH 6.5结合至人VISTA的能力。
193.一种选择会结合至人VISTA且具有延长半衰期(良好药代动力学性质)的抗体的方法，其中所述方法包括选择在酸性条件，例如等于或低于pH 6.5下，会结合至人VISTA的抗体。
194.一种改善结合至人VISTA(hVISTA)的抗体的功效的方法，其包括增加所述抗体的一个或多个VH CDR中天门冬氨酸、谷氨酸和/或组氨酸残基的数量，以增强所述抗体在酸性pH下与hVISTA的结合。
195.一种分离结合至人VISTA(hVISTA)且在人血液中具有长半衰期和/或刺激肿瘤环境中T细胞的抗体的方法，其包括在结合至hVISTA的抗体库中筛选会在酸性pH下结合但不会在中性pH下结合者。
196.如权利要求183至195中任一项所述的方法，其包括反向选择在生理pH下结合的抗体。
197.如权利要求183至196中任一项所述的方法，其还包括选择是VISTA拮抗剂或VISTA激动剂的抗体。
198.如权利要求183至197中任一项所述的方法，其包括选择那些抑制VISTA与VISTA共受体(例如PSGL-1)之间的相互作用和/或VISTA与T细胞或粒单核细胞之间的相互作用的抗体。
199.如权利要求183至198中任一项所述的方法，其还包括选择具有P1-068761或P1-068767的一种或多种性质的抗体。
200.一种改善结合至人VISTA细胞外结构域(hVISTA-ECD)的抗体(Ab)的抗肿瘤功效的方法，其包括
a.提供在pH 7.0下结合至hVISTA-ECD但在pH 6.5不会显著结合的Ab；
b.使用不同氨基酸残基取代所述Ab的重链或轻链、例如CDR中的1至5个氨基酸残基，其中例如所述1至5个氨基酸残基是hVISTA-ECD的接触残基，例如氨基酸残基26、30、31、32、110和112中的一者或多者(示于表24中；SEQ ID NO：67、51或55中的编号)；
c.测定(b)中所获得的Ab在pH 6.5下对hVISTA-ECD的亲和力是否高于在pH 7.0下时，和/或测定(b)中所获得的Ab在pH 6.5下是否具有类似于或高于亲本抗体((a)的抗体)的亲和力且在pH 7.0下是否具有低于(a)的抗体的亲和力；和
d.多次重复步骤(a)至(c)，直到足以获得在pH 6.5或更小pH下以10-7M或更小的KD结合至hVISTA-ECD且在pH 7.0或更大pH下以10-6M或更大的KD结合至hVISTA-ECD的Ab。
201.一种检测样本中VISTA的方法，其包括使所述样本与如权利要求1至163或206至212中任一项所述的VISTA抗体接触。
202.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用结合至人VISTA(hVISTA)且抑制hVISTA的活性(例如T细胞活化)的经分离的抗体和PD1/PD-L1路径拮抗剂，造成例如所述受试者肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的数量增加。
203.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用结合至人VISTA(hVISTA)且抑制hVISTA的活性(例如T细胞活化)的经分离的抗体和PD1/PD-L1路径拮抗剂，造成例如所述受试者的肿瘤中衰竭T细胞和/或表达PD-1、LAG3和/或TIM-3的T细胞的数量减小。
204.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用结合至人VISTA(hVISTA)且抑制hVISTA的活性(例如T细胞活化)的经分离的抗体和PD1/PD-L1路径拮抗剂，造成例如所述受试者的肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的数量增加且例如所述受试者的肿瘤中衰竭T细胞和/或表达PD-1、LAG3和/或TIM-3的T细胞的数量减小，和/或本文所述的其他特征。
205.如权利要求202至204中任一项所述的方法，其中所述结合至hVISTA的抗体是本文所述的抗体，例如如权利要求1至163或206至212中任一项所述的抗体。
206.如权利要求1至205中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体包含一种或多种(例如1至5、5至10、10至15、10至20或15至20种)与表24中所列的hVISTA的相互作用。
207.如权利要求1至206中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体在位置26、30、31、110、111和112中的一者或多者包含谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸(例如表24中由结晶学鉴别的接触残基)，其中所述编号是根据SEQ ID NO：67、51和55中的编号。
208.一种经分离的抗体，其在pH 6.5下结合至人VISTA细胞外结构域且任选地在pH7.0下不会显著结合，其中所述抗体在位置26、30、31、110、111和112中的一者或多者包含谷氨酸、天门冬氨酸或组氨酸(例如表24中由结晶学鉴别的接触残基)，其中所述编号是根据SEQ ID NO：67、51和55中的编号。
209.如权利要求1至208中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体不包含以下任一者的重链可变区：P1-069059、P1-069061、P1-069063、P1-069065、P1-069067、P1-069071、P1-069073、P1-069075、P1-069077、P1-068761、P1-068767、P1-068773、P1-068765、P1-061029、P1-068757、P1-068771、P1-068775、P1-068769、P1-068759、P1-068763、P1-061015、P1-068748、P1-068744、P1-068736、P1-068752、P1-068740、P1-068742、P1-068746、P1-068750、P1-068738、P1-068754、P1-069293、P1-069298、P1-069302、P1-069312、P1-069309、P1-069307、P1-070864、P1-070866、P1-070868、P1-070870、P1-070872、P1-070874、P1-070876、P1-070878、P1-070880、P1-070882、P1-070884、P1-070886、P1-070888、P1-070890、P1-070892、P1-070894、P1-070896、P1-070898、P1-070900、P1-070902、P1-070904、P1-070906、P1-070908、P1-070910、P1-070912、P1-070914、P1-070916、P1-070918、P1-070920、P1-070922、P1-070924、P1-070926、P1-070928、P1-070930、P1-070932(即SEQ IDNo：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305、309、313、317、321)，或不包含国际公布WO2018/169993中所公开任一抗体的重链可变区。
210.如权利要求1至209中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体抑制hVISTA细胞外结构域(ECD)与PSGL-1之间的相互作用。
211.如权利要求1至210中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体与本文所述的抗体、例如‘761和‘767竞争结合至hVISTA ECD(例如使用本文所述的BLI)，和/或经由与本文所述抗体、例如‘761和‘767相同的氨基酸残基结合至hVISTA ECD。
212.如权利要求1至211中任一项所述的抗体、组合物或方法，其中所述抗体与组氨酸三联体(成熟hVISTA的H121、122和123)相互作用，如通过X射线结晶学所测定，例如本文所测定。
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