UA123774C2 - Антитіла проти c5 та способи застосування - Google Patents

Антитіла проти c5 та способи застосування Download PDF

Info

Publication number
UA123774C2
UA123774C2 UAA201805269A UAA201805269A UA123774C2 UA 123774 C2 UA123774 C2 UA 123774C2 UA A201805269 A UAA201805269 A UA A201805269A UA A201805269 A UAA201805269 A UA A201805269A UA 123774 C2 UA123774 C2 UA 123774C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
antibodies
acid sequence
binding
Prior art date
Application number
UAA201805269A
Other languages
English (en)
Inventor
Дзендзіро Сампеі
Дзендзиро Сампеи
Original Assignee
Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся, Чугаи Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Publication of UA123774C2 publication Critical patent/UA123774C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Description

Галузь техніки
Цей винахід стосується антитіл проти С5 та способів їх застосування.
Попередній рівень техніки
Система комплементу відіграє центральну роль у кліренсі імунних комплексів та в імунних реакціях на інфекційні агенти, сторонні антигени, інфіковані вірусом клітини та пухлинні клітини.
Існує приблизно 25-30 білків комплементу, які зустрічаються як зібрання комплексів білків плазми та мембранних кофакторів. Компоненти комплементу досягають своїх імунних захисних функцій внаслідок взаємодії у ряді розгалужених ферментативних розщеплень та подій мембранного зв'язування. Внаслідок каскадів реакцій комплементу відбувається виробництво продуктів з опсонічними, імунорегуляторними та літичними функціями.
У цей час загальновизнано, що систему комплементу можна активувати трьома відмінними шляхами: класичним шляхом, лектиновим шляхом та альтернативним шляхом. Ці шляхи мають багато спільних компонентів, та, незважаючи на те, що вони мають різні початкові етапи, вони сходяться та мають спільні однакові кінцеві компоненти комплементу (від С5 до С9), які відповідають за активацію та руйнування клітин-мішеней.
Класичний шлях зазвичай активується внаслідок утворення комплексів антиген-антитіло.
Незалежно від цього, перший етап активації лектинового шляху - це зв'язування специфічних лектинів, таких як лектин, що зв'язує манан (МВ), Н-фіколін, М-фіколін, І -фіколін та лектин С- типу, СІ-11. На відміну від цього, альтернативний шлях спонтанно зазнає низького рівня зворотної активації яку можна легко ампліфікувати на сторонніх або інших аномальних поверхнях (бактеріях, дріжджах, інфікованих вірусом клітинах або пошкоджених тканинах). Ці шляхи сходяться у точці, де компонент комплементу СЗ3 розщеплюється активною протеазою, внаслідок чого утворюються СЗа та СЗБ.
СЗа - це анафілатоксин. СЗЬ зв'язується з бактеріальними та іншими клітинами, а також з певними вірусами та імунними комплексами, та мітить їх для видалення з обігу (роль, відома як опсонін). ЗБ також утворює комплекс з іншими компонентами, внаслідок чого утворюється конвертаза С5, яка розщеплює С5 на С5а та С5р.
С5 - це білок у 190 кДа, який зустрічається у здоровій сироватці у концентрації приблизно 80 мкг/мл (0,4 мкМ). С5 глікозилований на приблизно 1,5-3 95 від його маси, що відносяться до
Зо вуглеводу. Зрілий С5 - це гетеродимер альфа-ланцюга у 115 кДа, який має дисульфідний зв'язок з бета-ланцюгом у 75 кДа. С5 синтезується як одноланцюговий білок-попередник (попередник про-С5) у 1676 амінокислот (дивись, наприклад, патентний документ 1 та патентний документ 2). Попередник про-С5 розщеплюється, внаслідок чого утворюються бета- ланцюг, як аміно-термінальний фрагмент, та альфа-ланцюг, як карбоксил-термінальний фрагмент. Ці поліпептидні фрагменти, альфа-ланцюг та бета-ланцюг, з'єднуються один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку, та вони складають зрілий білок С5.
Зрілий С5 розщеплюється на фрагменти С5ба та С5Б під час активації шляхів комплементу.
Сб5а відщеплюється від альфа-ланцюга С5 С5-конвертазою як аміно-термінальний фрагмент, який включає перші 74 амінокислоти альфа-ланцюга. Решта зрілого С5 - це фрагмент С5б, який містить решту альфа-ланцюга, зв'язаного дисульфідним зв'язком з бета-ланцюгом. Приблизно 20 95 маси у 11 кДа С5а відноситься до вуглеводу.
Сба - це інший анафілатоксин. С5Б об'єднується з Сб, С7, С8 та С9, утворюючи мембраноатакуючий комплекс (МАС, С5р-9, термінальний комплекс комплементу (ТСС)) на поверхні клітини-мішені. Коли достатня кількість МАС вставляється у мембрани клітин-мішеней, тоді утворюються пори МАС, які опосередковують швидкий осмотичний лізис клітин-мішеней.
Як згадується вище, СЗа та Сб5а - це анафілатоксини. Вони можуть започатковувати дегрануляцію тучних клітин, внаслідок чого вивільняються гістамін та інші медіатори запалення, що спричиняє скорочення гладкої мускулатури, підвищення проникності судин, активацію лейкоцитів та інші запальні явища, включаючи клітинну проліферацію, наслідком якої є підвищення вмісту паренхіматозних клітин. Сба також функціонує як хемотаксичний пептид, який притягує гранулоцити, такі як нейтрофіли, еозинофіли, базофіли та моноцити, до місця активації комплементу.
Активність Сба регулюється ферментом плазми карбоксипептидазою М, що видаляє карбокси-термінальний аргінін з Сба, утворюючи при цьому похідне Сба-дез-Агу. Сба-дез-Аг9 демонструє лише 195 анафілактичної активності та поліморфноядерної хемотаксичної активності немодифікованого Са.
Незважаючи на те, що належним чином функціонуюча система комплементу спричиняє потужний захист проти інфікуючих мікробів, передбачається, що невідповідна регуляція або активація комплементу є причиною патогенезу різноманітних розладів, які включають, бо наприклад, ревматоїдний артрит (КА); вовчаковий нефрит; ішемічно-реперфузійне пошкодження; пароксизмальну нічну гемоглобінурію (РМН); атиповий гемолітично-уремічний синдром (ани5); хворобу щільного осаду (000); макулярну дегенерацію (наприклад, пов'язану з віком макулярну дегенерацію (АМО)); синдром гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГІ-Р-синдром)); тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР)); спонтанну втрату плоду; малоїмунний васкуліт; булезний епідермоліз; рецидивну втрату плоду; множинний склероз (М5); черепно-мозкову травму; та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу (дивись, наприклад, непатентний документ 1). Отже, інгібування надмірної або неконтрольованої активації каскаду реакцій комплементу може надати клінічних переваг пацієнтам з такими розладами.
Пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН) - це рідкісне захворювання крові, при якому еритроцити є пошкодженими та внаслідок цього руйнуються більш швидко, ніж здорові еритроцити. РМН є наслідком клонального розмноження кровотворних стовбурових клітин з соматичними мутаціями у гені РІС-А (фосфатидилінозитол глікан класу А), який розташовується на Х-хромосомі. Мутації у РІС-А спричиняють раннє блокування синтезу глікозилфосфатидилінозитолу (ОРІ), молекули, яка є необхідною для фіксації багатьох білків на клітинних поверхнях. Отже, кров'яні клітини при РМН мають дефіцит СОРІ-фіксованих білків, які включають білки, що регулюють комплемент, СО55 та СО59. За нормальних обставин ці білки, що регулюють комплемент, блокують утворення МАС на клітинних поверхнях, тим самим запобігаючи лізису еритроцитів. Відсутність зРІ-фіксованих білків спричиняє опосередкований комплементом гемоліз при РМН.
РМН характеризується гемолітичною анемією (знижена кількість еритроцитів), гемоглобінурією (присутність гемоглобіну у сечі, особливо очевидну після сну) та гемоглобінемією (присутність гемоглобіну у кров'яному потоці). Відомо, що індивідууми, які страждають на РМН, мають напади хвороби, які визначаються тут як випадки з сечею темного кольору. Гемолітична анемія є наслідком внутрішньосудинного руйнування еритроцитів компонентами комплементу. Інші відомі симптоми включають дисфазію, втому, імпотенцію, тромбоз та періодичний біль в животі.
Екулізумаб - це гуманізоване моноклональне антитіло, спрямоване проти білка С5 комплементу, та він є першим терапевтичним засобом, ухваленим для лікування
Зо пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН) та атипового гемолітично-уремічного синдрому (ан!из) (дивись, наприклад, непатентний документ 2). Екулізумаб інгібує розщеплення С5 С5- конвертазою на С5ба та С5Б, що запобігає утворенню кінцевого комплексу комплементу С5р-9.
Як Сб5а, так і С5р-9 викликають опосередковані кінцевим комплементом події, які є характерними для РМН та анНиз (дивись також патентний документ 3, патентний документ 4, патентний документ 5 та патентний документ 6).
У декількох повідомленнях описано антитіла проти С5. Наприклад, у патентному документі 7 описано антитіло проти С5, яке зв'язується з альфа-ланцюгом С5, але не зв'язується з С5а, та яке блокує активацію С5, проте у патентному документі 8 описано моноклональне антитіло проти С5, яке інгібує утворення С5а. З іншого боку, у патентному документі 9 описано антитіло проти С5, яке розпізнає протеолітичний сайт для С5-конвертази на альфа-ланцюгу С5 та яке інгібує перетворення С5 на С5а та С5Б. У патентному документі 10 описано антитіло проти С5, яке має константу афінності, яка становить принаймні 1 х 107 М".
Антитіла (дос) зв'язуються з неонатальним Ес-рецептором (ЕсКп) та мають тривалий час утримання у плазмі. Зв'язування ДС з ЕсКп зазвичай спостерігається за кислотних умов (наприклад, рН 6,0), та його рідко спостерігають за нейтральних умов (наприклад, рН 7,4).
Зазвичай, (до неспецифічно включаються у клітини шляхом ендоцитозу, та вони повертаються до клітинних поверхонь внаслідок зв'язування з ендосомним ЕсКп за кислотних умов в ендосомах. Після цього дО дисоціюються від ЕсКп за нейтральних умов у плазмі. до, яким не вдалося зв'язатися з ЕсКп, руйнуються в лізосомах. Коли спроможність зв'язування до з ЕсКп за кислотних умов скасовується внаслідок здійснення мутацій у його Ес-ділянці, тоді ДО не повертається з ендосом назад у плазму, що спричиняє помітне погіршення утримання Ідс у плазмі. Для того, щоб покращити утримання ІдсС у плазмі, повідомлялося про спосіб, який підвищує їх зв'язування з ЕсКп за кислотних умов. Коли зв'язування Ідс з ЕРсКп за кислотних умов покращується внаслідок здійснення амінокислотного заміщення у його Ес-ділянці, тоді до ефективніше повертається з ендосом назад у плазму, тим самим демонструючи покращене утримання у плазмі. Між тим, також повідомлялося, що до з підсиленим зв'язуванням з ЕсКп за нейтральних умов не дисоціюється від ЕсКп за нейтральних умов у плазмі, навіть коли він повертається до клітинної поверхні внаслідок його зв'язування з БсКп за кислотних умов в ендосомах, та, як слідство, його утримання у плазмі залишається незмінним або іноді 60 погіршується (дивись, наприклад, непатентний документ 3; непатентний документ 4;
непатентний документ 5).
Нещодавно повідомлялося про антитіла, які зв'язуються з антигенами залежним від рн чином (дивись, наприклад, патентний документ 11 та патентний документ 12). Ці антитіла сильно зв'язуються з антигенами за нейтральних умов у плазмі та дисоціюються від антигенів за кислотних умов в ендосомах. Після дисоціації від антигенів антитіла набувають спроможності ще раз зв'язуватися з антигенами, коли вони повертаються з ендосом назад у плазму за допомогою ЕсКп. Отже, єдина молекула антитіла може повторно зв'язуватися з численними молекулами антигенів. Взагалі, утримання антигену у плазмі є набагато коротшим, ніж утримання антитіла, яке має вищезгаданий механізм опосередкованої ЕсКп рециркуляції. Отже, коли антиген зв'язується з антитілом, тоді антиген зазвичай демонструє подовжене утримання у плазмі, внаслідок чого відбувається підвищення концентрації антигену у плазмі. З іншого боку, повідомлялося, що вищеописані антитіла, які зв'язуються з антигенами залежним від рН чином, усувають антигени з плазми швидше, ніж звичайні антитіла, оскільки вони дисоціюються від антигенів усередині ендосом під час процесу опосередкованої ЕсКп рециркуляції. У патентному документі 13 також описано аналіз за допомогою комп'ютерного моделювання, який демонструє, що антитіло із залежним від рН зв'язуванням, спрямоване проти С5, може подовжувати нокдаун-ефект стосовно антигену.
Перелік цитувань
Патентні документи
Патентний документ 1 - Патент США Мо 6,355,245
Патентний документ 2 - Патент США Мо 7,432,356
Патентний документ 3-М/О 2005/074607
Патентний документ 4-4/О 2007/106585
Патентний документ 5-40 2008/069889
Патентний документ 6--МО 2010/054403
Патентний документ 7-ЖМО 95/29697
Патентний документ 8-МО 02/30985
Патентний документ 9-0 2004/007553
Патентний документ 10-М/О 2010/015608
Ко) Патентний документ 11-4М/О 2009/125825
Патентний документ 12-М/О 2011/122011
Патентний документ 13-М/О 2011/111007
Непатентні документи
Непатентний документ 1-Ноїегз сеї а!., Іттипої. Нем. 223:300-316 (2008)
Непатентний документ 2-ЮОтуніиК еї аІ., Те Опсоіодівії 13(9):993-1000 (2008)
Непатентний документ 3-Уеипа еї аї., У Іттипої!. 182(12): 7663-7671 (2009)
Непатентний документ 4-Оана-Маппап еї аї., У Віої. Спет. 282(3):1709-1717 (2007)
Непатентний документ 5-ОаїГАсдпа еї аї., у. Іттипої. 169(9):5171-5180 (2002)
Суть винаходу
Технічна задача
Завдання винаходу - отримати антитіла проти С5 та способи їх застосування.
Вирішення задачі
Винаходом пропонуються антитіла проти С5 та способи їх застосування.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах домену МО1-МО2 бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга (5ЕО ІЮ МО: 40) С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (ЗЕО ІО МО: 40) С5, який включає принаймні один амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з СіІш48, А5р51, Ні70, Нівз72, Гуз109 та Ніб110 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 40. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8. В іншому варіанті здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 2. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з таким самим бо епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 2, з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8. У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 7 або 8. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 7 або 8, з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН 5ЕО ІЮО МО: 1 та МІ 5ЕО ІО МО: 11; (Б) МН 5ЕО ІО МО: 5 та МІ ЗЕО ІО МО: 15; (с) МН 5ЕО ІО МО: 4 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 14; (94) МН
ЗЕО ПО МО: 6 та МІ 5ЕО ІО МО: 16; (є) МН 5ЕО ІО МО: 2 та МІ. 5ЕО ІЮО МО: 12; () МН 5ЕО ІО МО:
З та МІ ЗЕО ІЮ МО: 13; (9)у МН 5ЕО ІЮО МО: 9 та МІ 5ЕО ІО МО: 19; (п) МН 5ЕО ІО МО: 7 та МІ
ЗЕО ІЮ МО: 17; (ї) МН 5ЕО ІО МО: 8 та МІ 5ЕО ІО МО: 18; та () МН 5ЕО ІО МО: 10 та МІ 5ЕО ІЮ
МО: 20. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу має характеристику, вибрану з групи, що складається з: (а) антитіло контактує з амінокислотами 051 та КІ09 С5 (5ЕО ІО МО: 39); (5) афінність антитіла до С5 (5БО ІЮ МО: 39) є вищою, ніж афінність антитіла до мутанта С5, який включає заміщення Е48А в 5ЕО ІЮО МО: 39; або (с) антитіло зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 39, при рН 7,4, проте не зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО: 39 із заміщенням Н72МУ, при рН 7,4. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується 3 С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію
С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію варіанта К885Н С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це антитіло людини, гуманізоване антитіло або химерне антитіло. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це фрагмент антитіла, який зв'язується
Зо з С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це повнорозмірне антитіло ЇДО1 або Ід.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає (а) НМК-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність ОХ1С1УХ» х з РТІНАМХАа х 5, де Хі - це о або А, Х» - це
М, О або 0, Хз - це Т або У, Ха - це М або Н, Х5 - це Ї або м (5ЕО ІО МО: 128), (5) НУВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність ОХ: ТХ2Ма5МУСМХ», де Хі - це 5, С, М або Т, Хе - це Е або
К, Хз - це А, Т або Н (ЗЕО ІО МО: 131), та (с) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність
ХИХгТОБОАХзЗУХААХОМУХКО, де Хі - це С, А або с, Хо - це У або Е, Хз - це Т, О або Е, Ха - це У,
К або О, Х5 - це 5, О або Е, Хв - це А або М (ЗЕО ІЮО МО: 127).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає (а) НМК-
НІ, яка включає амінокислотну послідовність З5УУХІ х 2, де Хі - це М або М, Х» - це Сабо А (5БЕО 10 МО: 126), (Б) НМВ-Н?2, яка включає амінокислотну послідовність
ХИХгТОБОАХзЗУХААХ»МУХКО, де Хі - це С, А або с, Хо - це У або Е, Хз - це Т, О або Е, Ха - це У,
К або 0, Х5 - це 5, О або Е, Хв - це А або М (5ЕО ІЮ МО: 127), та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність ОХ УХ»2 х зРТНАМХУХАа х 5, де Хі - це б або А, Хо - це М, О або 0, Хз - це Т або У, Ха - це У або Н, Хб5 - це Ї або М (ЗЕО ІО МО: 128). У подальших варіантах здійснення антитіло включає (а) НМВ-11, яка включає амінокислотну послідовність ХІ'АБОХ»ІХзоХАї А, де Хі - це О або ЕК, Хе - це М, О або С, Хз - це С або 5, Ха - це О, К або 5 (ЗЕО ІЮ МО: 129); (в) НМЕ-
Ї2, яка включає амінокислотну послідовність ЗА5Х х 2Хз5, Де Хі - це К, Е або Т, Хо - це Ї або Т,
Хз - це А, Н, Е або О (ЗЕО ІЮО МО: 130); та (с) НМЕ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність
ОХІТХх2Уа55УСМХ», де Хі: - це 5, С, М або Т, Х» - це Е або К, Хз - це А, Т або Н (5ЕО ІО МО: 131).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає (а) НМА-
Ї1, яка включає амінокислотну послідовність ХІАБОХ»ІХзОХАаї А, де Хі - це О або К, Хг- цем, о або сб, Хз - це б або 5, Х; - це О, К або 5 (ЗЕБЕО ІЮО МО: 129); (Б) НМК-12, яка включає амінокислотну послідовність САБХ 1 х 2Хз5, Де Хі - це К, Е або Т, Хг - цеІ або Т, Хз-це А, Н, Е або 0 (ЗЕБЕО ІО МО: 130) та (с) НМК-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність
ОХІТХх2Уа55УСМХ», де Хі: - це 5, С, М або Т, Х» - це Е або К, Хз - це А, Т або Н (5ЕО ІО МО: 131).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає каркасну бо ділянку ЕКТ варіабельного домену важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 132-134; ЕК2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 135-136; ЕКЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ
МО: 137-139; та ЕК4, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 140- 141. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає каркасну ділянку ЕК! варіабельного домену легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБО ОО МО: 142-143; ЕМК2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБО ОО МО: 144-145; ЕКЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 146-147; та ЕК4, яка включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 148.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає (а) послідовність УН, яка є принаймні на 95 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь- якою з 5ЕО ІЮО МО: 10, 106-110; (Б) послідовність Мі, яка є принаймні на 95 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 20, 111-113; або (с) послідовність УН, як у (а), та послідовність МІ, як у (б). У подальших варіантах здійснення антитіло включає послідовність МН за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У подальших варіантах здійснення антитіло включає послідовність МІ. за будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 20, 111-113.
Винаходом пропонується антитіло, яке включає послідовність МН за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 10, 106-110, та послідовність МІ. за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 20, 111-113.
Винаходом також пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, які кодують антитіло проти С5 цього винаходу. Винаходом також пропонуються клітини-хазяїни, які містять нуклеїнову кислоту цього винаходу. Винаходом також пропонується спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна цього винаходу, так щоб вироблялося антитіло.
Винаходом далі пропонується спосіб отримання антитіла проти С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає домен МО 1-
МО2 (ЗЕО ІЮ МО: 43) бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 33 до 124 бета-ланцюга (ЗЕО ІО МО: 40) С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110 бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5. У деяких
Зо варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає фрагмент бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з СіІш48, Азр51, Ні70, Ні 72, І ух109 та Нів110.
Винаходом також пропонується фармацевтичний склад, який включає антитіло проти С5 цього винаходу та фармацевтично прийнятний носій.
Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування як лікарського засобу. Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування у лікуванні опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування у підвищенні кліренсу С5 з плазми.
Антитіла проти С5 цього винаходу можна застосовувати у виробництві лікарського засобу.
У деяких варіантах здійснення лікарський засіб призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. У деяких варіантах здійснення лікарський засіб призначений для підвищення кліренсу С5 з плазми.
Винаходом також пропонується спосіб лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 цього винаходу. Винаходом також пропонується спосіб підвищення кліренсу
С5 з плазми у індивідуума. У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 цього винаходу для підвищення кліренсу С5 з плазми.
Стислий опис ілюстративного матеріалу
Фігура 1
Фігура 1 ілюструє епітоп-специфічне сортування антитіл проти С5, як описано у Прикладі 2.2. Антитіла, згруповані в одну епітопну групу, окреслено жирною лінією.
Фігура 2А
Фігура 2А ілюструє сенсограми ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 при рн 7,4 (суцільна лінія) та при рН 5,8 (штрихова лінія) для оцінки залежності від рН, як описано у Прикладі 3.2. СЕАОЗ30О5, СЕРАО307, СЕАОЗ6б6, СЕАОБО1, СЕАО538 та СЕАОБ599 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, як описано у Прикладі 2.2. бо Фігура 28
Фігура 2В ілюструє сенсограми ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 при рн 7,4 (суцільна лінія) та при рН 5,8 (штрихова лінія) для оцінки залежності від рН, як описано у Прикладі 3.2. СЕАО66б6, СЕАОб672 та СЕАОб675 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗ30О та СЕАОЗ341 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у
Прикладі 2.2. 3051 05 - це гуманізоване антитіло СЕАОЗО5, як описано у Прикладі 2.3.
Фігура З
Фігура З ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів, які походять від бета-ланцюга
С5 (амінокислоти 19-180, 161-340, 321-500 та 481-660 5ЕО ІО МО: 40) та які злиті з З5Т-міткою, як описано у Прикладі 4.1. СЕАО30О5, СЕАОЗ307, СЕАОЗб6б, СЕАОБОЇ, СЕАО538, СЕАОБ599,
СЕАОббб, СЕАОб672 та СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С. Антитіло проти О5Т - це позитивне контрольне антитіло. Позицію злитих з 551 фрагментів С5 (46-49 кДа) позначено стрілкою.
Фігура 4
Фігура 4 ілюструє сенсограми ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 стосовно домену МО1-МО2 бета ланцюга С5, як описано у Прикладі 4.3. Верхня панель демонструє результати СЕАОЗО5 (суцільна лінія), СЕАОЗО0О7 (штрихова лінія), СЕАдОЗ6б6 (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія), Середня панель демонструє результати СЕАОБО1 (суцільна лінія), СЕАО599 (штрихова лінія), СЕАО538 (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія). Нижня панель демонструє результати СЕАОб66 (суцільна лінія), СЕАО672 (штрихова лінія), СЕАО675 (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія). СЕАО30О5, СЕРАОЗ307, СЕАОЗ6б6, СЕАОБО1, СЕАО538, СЕАО599, СЕАОббб, СЕАОбЄ72 та
СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С. Екулізумаб - це контрольне антитіло проти
С5.
Фігура 5А
Фігура 5А ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів пептиду, які походять від домену МО1-МО2 (амінокислоти 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 та 45-111 5ЕО ІЮО МО: 40) та які злиті з міткою 5517, як описано у Прикладі 4.4. Антитіло проти 5511 застосовується як антитіло для реакції. Позицію злитих з 5571 фрагментів С5 (35-37 кДа) позначено стрілкою.
Фігура 5В
Зо Фігура 5В ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів пептиду, які походять від домену МО1-МО2 (амінокислоти 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 та 45-111 5ЕО ІЮО МО: 40) та які злиті з міткою О5Т, як описано у Прикладі 4.4. СЕАОЗО5 застосовується як антитіло для реакції.
Фігура 5С
Фігура 5С підсумовує реакції зв'язування антитіл проти С5 з фрагментами, що походять від бета-ланцюга С5, як описано у Прикладі 4.4. Фрагменти, з якими зв'язуються антитіла проти С5, згруповані в епітопну групу С (СЕАОЗ3О5, СЕРАОЗ307, СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАОБ5З38, СЕАОБО99,
СЕАОббб, СЕРАОб72 та СЕАОб75), зображено сірим кольором, фрагменти, з якими вони не зв'язуються, зображено білим кольором.
Фігура 6
Фігура 6 ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно точкових мутантів С5, у яких Е48, 051 та
К109 бета-ланцюга заміщені аланіном (Е48А, Ю5Т1А та К1О09А, відповідно), як описано у
Прикладі 4.5. На лівій панелі екулізумаб (антитіло проти С5, яке зв'язується з альфа-ланцюгом) застосовується як антитіло для реакції, а положення альфа-ланцюга С5 (приблизно 113 кДа) позначено стрілкою. На правій панелі СЕАОЗО5 (згруповане в епітопну групу С, воно зв'язується з бета-ланцюгом) застосовується як антитіло для реакції а положення бета-ланцюга С5 (приблизно 74 кДа) позначено наконечником стрілки.
Фігура 7
Фігура 7 представляє сенсограми ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), які демонструють взаємодію екулізумаб-76004 (верхня панель) або 305.05 (нижня панель) з мутантами С5, як описано у Прикладі 4.6. Сенсограми отримали внаслідок впорскування С5-ул (товста суцільна крива), С5-Е48А (крива з короткими штрихами), С5-О51А (крива з довгими штрихами) та С5-КІ0О9А (тонка суцільна крива), відповідно, уздовж сенсорної поверхні з іммобілізованим екулізумабом-Е76004 або 305І 05. Екулізумаб - це контрольне антитіло проти
С5. 3051 05 - це гуманізоване антитіло СЕАОЗО5 (згруповане в епітопну групу С), як описано у
Прикладі 2.3.
Фігура 8
Фігура 8 представляє сенсограми ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), які демонструють взаємодію 3051 05 з мутантами С5 із заміщеним Ні для оцінки залежності від бо рН, як описано у Прикладі 4.7. Сенсограми отримали внаслідок впорскування С5-м/і (товста суцільна крива), С5-Н7ОМ (крива з довгими штрихами), С5-Н72У (крива з короткими штрихами),
С5-НІТ1О0У (пунктирна крива) та С5-Н7ОМяНІТ10У (тонка суцільна крива), відповідно, уздовж сенсорної поверхні з іммобілізованим 30505. Щоб оцінити залежні від рН взаємодії, комплексам антитіло/лантиген дозволили дисоціюватися при рН 7,4 з наступною додатковою дисоціацією при рН 5,8 (вказано стрілкою).
Фігура ЗА
Фігура 9А ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 5.1. Показано результати для антитіл СЕАОЗ305, СЕАОЗ3О07,
СЕАОЗ6б, СЕАОБ5О1, СЕАО538, СЕАО599, СЕАОбЄб6, СЕАОбЄТ7Т2 та СЕАОб75, згрупованих в епітопну групу С, як описано у Прикладі 2.2.
Фігура 98
Фігура 9В ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 5.1. Показано результати для антитіл СЕАОЗ30 та
СЕАОЗ341, згрупованих в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фігура 10А
Фігура 10А ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5ба, як описано у
Прикладі 5.2. Концентрації С5а кількісно визначили в надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 9А.
Фігура 108
Фігура 108 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5ба, як описано у
Прикладі 5.2. Концентрації С5а кількісно визначили в надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 98.
Фігура 11
Фігура 11 ілюструє інгібування антитілами проти С5 активованого комплементом гемолізу, як описано у Прикладі 5.3. Комплементи активували, застосовуючи класичний шлях.
Фігура 12
Фігура 12 ілюструє інгібування антитілами проти С5 активованого комплементом гемолізу, як описано у Прикладі 5.4. Комплементи активували, застосовуючи альтернативний шлях.
Фігура 13
Зо Фігура 13 ілюструє часову динаміку концентрації С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення тільки С5 людини або С5 людини та антитіла проти С5 людини під час оцінювання кліренсу С5 у мишей, як описано у Прикладі 6.2. СЕАОЗ30О5, СЕАОЗ3О07, СЕАОЗ66,
СЕАОБ5О1, СЕАО538, СЕРАО599, СЕАОбб6б, СЕАОб72 та СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗ3О та СЕАОЗ341 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фігура 14
Фігура 14 ілюструє часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення С5 людини та антитіла проти С5 людини під час оцінювання фармакокінетики антитіла у мишей, як описано у Прикладі 6.3. СЕАОЗ30О5, СЕАОЗО07, СЕАОЗ66,
СЕАОБО1, СЕРАО538, СЕАО599, СЕАОббб, СЕРАОбУ2 та СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗ3О та СЕАОЗ341 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фігура 15
Фігура 15 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл 305 015-5І0:422, 305 016-512422, 305І 018-5Ш0422, 305І 019-52:422, 3051 020-56422 та 3051 020-512:115.
Фігура 16
Фігура 16 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл 305 015-50115 та 305 023-513429.
Фігура 17
Фігура 17 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл 305 022-5(2115, 305 022-5Ц13422, 3051 023-50115 та 305 023-5С21422.
Фігура 18
Фігура 18 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5а, як описано у Прикладі 9.2. Концентрації Сба кількісно визначили у надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 15.
Фігура 19 бо Фігура 19 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5а, як описано у Прикладі
9.2. Концентрації Сба кількісно визначили у надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 16.
Фігура 20
Фігура 20 ілюструє інгібування активності комплементу у мавпячій плазмі антитілами проти
С5, як описано у Прикладі 9.3. Антитіла проти С5 вводили яванським макакам, а активність комплементу у плазмі мавп вимірювали за допомогою аналізу гемолізу.
Фігура 21
Фігура 21 ілюструє інгібування біологічної активності природного С5 (МТ) та варіантів С5 (М145І, Мк4490, М802І, к885Н, кКУ280, 0966У, 51310М та Е14370) антитілом проти С5 (екулізумабом), як описано у Прикладі 9.4.
Фігура 22
Фігура 22 ілюструє інгібування біологічної активності природного С5 (МТ) та варіантів С5 (М145І, к4490, М802І, к885Н, кКУ280, 0966У, 51310М та Е14370) антитілом проти С5 (варіантом 305), як описано у Прикладі 9.4.
Фігура 23
Фігура 23 ілюструє інгібування антитілами проти С5 (ВМУ441 та варіантом 305) активованого комплементом лізису ліпосом, як описано у Прикладі 9.5.
Фігура 24
Фігура 24 ілюструє часову динаміку концентрації С5 яванських макак у плазмі після внутрішньовенного введення антитіла проти С5 людини під час оцінювання кліренсу С5 у яванських макак, як описано у Прикладі 10.2.
Фігура 25
Фігура 25 ілюструє часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення антитіла проти С5 людини під час оцінювання фармакокінетики антитіла у яванських макак, як описано у Прикладі 10.3.
Фігура 26
Фігури 26А та 26В ілюструють кристалічну структуру Раб 305, зв'язаного з доменом (пС5)-
МО1 С5 людини, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 26А ілюструє асиметричну одиницю. МО1 зображено як поверхню, а Раб 305 зображено як стрічки (темно-сірі - важкий ланцюг, світло-сірі
Зо - легкий ланцюг). Фігура 268 ілюструє молекули 1 та 2, накладені одна на одну (темно-сіра - молекула 1, світло-сіра - молекула 2).
Фігура 27А
Фігура 27А ілюструє епітоп контактної ділянки стосовно Бар 305 на домені МО, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 27А ілюструє картування епітопів в амінокислотній послідовності МО 1 (темно-сірі - ближче, ніж 3,0 ангстрема, світло-сірі - ближче, ніж 4,5 ангстрема).
Фігура 278
Фігура 27В ілюструє епітоп контактної ділянки стосовно Бар 305 на домені МО, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 27В ілюструє картування епітопів у кристалічній структурі (темно-сірі кульки - ближче ніж 3,0 ангстрема, світло-сірі гілки - ближче ніж 4,5 ангстрема).
Фігура 28А
Фігура 28А ілюструє крупний план взаємодій Е48, 051 та К109 (представлені як гілки) з бар 305 (представлений як поверхня), як описано у Прикладі 11.7.
Фігура 288
Фігура 288 ілюструє взаємодії між Е48 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раб, світло-сіра пунктирна лінія - опосередкований водою водневий зв'язок), як описано у Прикладі 11.7.
Фігура 280
Фігура 28С ілюструє взаємодії між 051 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раб), як описано у Прикладі 11.7.
Фігура 280
Фігура 280 ілюструє взаємодії між КІ09 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раб, світло-сіра пунктирна лінія - сольовий місток з Н-СОКЗ 095), як описано у Прикладі 11.7.
Фігура 29А
Фігура 29А ілюструє крупний план взаємодій Н7О, Н72 та НІ110 (представлені як гілки) з бар 305 (представлене як поверхня), як описано у Прикладі 11.8, у такій самій орієнтації, як на Фігурі 28А.
Фігура 298
Фігура 298 ілюструє взаємодії між Н7О та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8. бо Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Водневий зв'язок вказано пунктирною лінією.
Фігура 290
Фігура 29С ілюструє взаємодії між Н72 та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8.
Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Водневий зв'язок вказано пунктирною лінією.
Фігура 290
Фігура 290 ілюструє взаємодії між НІ110 та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8.
Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Відстань між НІ10 та Н-СОВЗ НІТООс зображено пунктирною лінією.
Опис варіантів здійснення
Способи та процедури, які описані у цьому описі або на які посилаються у цьому описі, взагалі є добре зрозумілими, та вони зазвичай застосовуються із використанням традиційної методології фахівцями у галузі, такої як, наприклад, методології, які широко застосовуються та які описано у затогоок еї аї., МоїІесціаг СіІопіпд: А І арогаїогу Мапиаї за еайіоп (2001) Соїа 5ргіпд
Нарбог І арогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпд Натбог, М.М.; Сицтепі Ргоїосоїв іп Моїесшіаг Віоіоду (Р.М.
А!йзибеї, еї аїЇ. еав5., (2003)); у серії МеШйоа5 іп ЕплутоЇоду (Асадетіс Рге55, Іпс.); РСК 2: А
Ргасіїса! Арргоасі (М.). МасРНегзоп, В.О. Натез апа а.Н8. Тауїог єдв. (1995)), Напом апа ГІ апе, едз5. (1988) Апііродіев, А І арогаїюгу Мапиаї, апа Апіта! Се! Сийите (В.І. ЕРгезНпеєу, ей. (1987));
Оїїдописієоїіде 5упіпевів (М./. Саїй, єд., 1984); Меїносдз іп Моіесціаг Віоіоду, Нитапа Ргез5; СеїЇ
Віоіоду: А І арогаїогу Моїероок (У.Е. Сеїї5, єд., 1998) Асадетіс Ргев5; Апіта! Сеї!Ї Сийиге (В.І.
ЕгезПпеу), єд., 1987); Іпігодисійоп о СеїЇ апа Тізвие Сийиге (у. Р. Маїнег апа Р.Е. НРобетгів5, 1998)
Ріепит Ргев5; СеїЇ апа Тізвиє СийПиге: І арогаюгу Ргоседигез (А. Ооуїє, У.В. Стіййнв5, апа О.а.
Мемеї, едв5., 1993-8) У. ММіІеу апа бопев; Напаброок ої Ехрегітепіа! Іттипоїіоау (О.М. М/вїг апа 0.6.
ВіасКмуеїЇ, еад5.); Сепе Тгапеоїег Месюг5 ог Маттаїйап Сеїв (9У.М. МіПег апа М.Р. Сапов, єдв., 1987);
РСВ: Те Роїутегазе СНаіп Реасійп, (Миїїїв єї аї!., єдв., 1994); Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду (У.Е. Соїїдап еї аї., ед5., 1991); Зно РгоїосоЇв іп МоїІесшаг Віооду (УУПеу апа бопв, 1999);
Ітітипобіоіоду (С.А. дапежау апа Р. Тгамег5, 1997); Апіїбодієв (Р. Ріпсі, 1997); Апіїродіев: А
Ргасіїсаї Арргоасп! (0. Сацу., єд., ІВ Ргев5, 1988-1989); Мопосіопа! Апііродієв: А Ргасіїіса)
Арргоасп (Р. Зперпега апа б. Оєап, єдв., Охіога Опімегейу Ргезв, 2000); Овіпд Апііродієв: А
Коо) ІГарогаїогу Мапиа! (Е. Напйом апа 0. Гапе (Со 5рііпд Нагбог Іарогаїогу Ргев5, 1999); Те
Апіїродіє5 (М. 7апейі апа 9. 0. Сарга, ед5., Нагиоой Асадетіс Рибіїзпег5, 1995); та Сапсег:
Ргіпсірієх апа Ргасіїсе ої Опсоіоду (У.Т. Оеміна єї а)., єдв., У.В. І ірріпсой Сотрапу, 1993).
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
Якщо інше не визначається, технічні та наукові терміни, які застосовуються у цьому описі, мають таке саме значення, яке є зазвичай зрозумілим для звичайного фахівця у галузі, до якої належить цей винахід. 5іпдієїп еї аї!., Оіспопагу ої Місгобіоюду апа МоїІесшіаг Віоіоду 2па еад., ..
УМіеу 4 Зоп5 (Мем Мо, М.М. 1994), та Магсі, Адмапседй Огдапіс Спетівігу Веасійопв,
Меспапізт5 апа Зігисіиге 4 ей., дУопп УМіеу 5 Зоп5 (Мем! МоїК, М.У. 1992) пропонують фахівцю у галузі загальну інструкцію для багатьох термінів, які застосовуються у цій заявці. Усі посилання, процитовані у цьому описі, включаючи патентні заявки та публікації, включено до посилань у їхньому повному обсязі.
З метою тлумачення цього опису винаходу будуть застосовуватися наступні визначення там, де це є доречним, терміни, які застосовуються в однині, будуть також застосовуватися у множині, та навпаки. Слід розуміти, що термінологія, яка застосовується у цьому описі, призначена для опису тільки особливих варіантів здійснення, та вона не призначена для обмеження. У випадку, коли будь-яке запропоноване нижче визначення конфліктує з будь-яким документом, включеним у цей опис шляхом посилання, запропоноване нижче визначення буде переважним. "Акцепторна каркасна ділянка людини" для цілей цього опису - це каркасна ділянка, яка включає амінокислотну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) або каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга (МН), що походять від каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, як визначається нижче. Акцепторна каркасна ділянка людини, "яка походить від" каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, може включати таку саму її амінокислотну послідовність, або вона може мати зміни в амінокислотній послідовності. У деяких варіантах здійснення кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше або 2 або менше. У деяких варіантах здійснення акцепторна каркасна ділянка варіабельної ділянки легкого ланцюга людини є ідентичною за своєю послідовністю послідовності каркасної ділянки бо варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну людини або послідовності консенсусної каркасної ділянки людини. "Афінність" означає силу сукупності нековалентних взаємодій між єдиним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) та її партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо інше не вказано, як застосовується у цьому описі, "афінність зв'язування" означає притаманну афінність зв'язування, яка відображає взаємодію 1:11 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом та антигеном). Афінність молекули Х до її партнера У можна взагалі представити константою дисоціації (Ка). Афінність можна вимірювати за допомогою звичайних відомих у галузі способів, включаючи способи, описані у цьому описі. Специфічні ілюстративні приклади варіантів здійснення вимірювання афінності зв'язування описано далі.
Антитіло "зі зрілою афінністю" означає антитіло з однією або більше змінами в одній або більше гіперваріабельних ділянках (НУК), порівняно з початковим антитілом, яке не має таких змін, при цьому такі зміни зумовлюють покращення афінності антитіла до антигену.
Терміни "антитіло проти С5" та "антитіло, яке зв'язується з С5" означають антитіло, яке є спроможним зв'язуватися з С5 з достатньою афінністю, так що антитіло є корисним як діагностичний та/або терапевтичний агент, коли воно націлене на С5. В одному варіанті здійснення ступінь зв'язування антитіла проти С5 з неспорідненим білком, який не є С5, становить менш ніж 10 95 від зв'язування антитіла з С5, що вимірюється, наприклад, за допомогою радіоіїмунологічного аналізу (КІА). У певних варіантах здійснення антитіло, яке зв'язується з С5, має константу дисоціації (Ка), яка становить 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше або 0,001 нм або менше (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 102 М до 10-33 М, наприклад, від 109 М до 10-33 М). У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом С5, який є консервативним серед С5 від інших видів тварин.
Термін "антитіло" у цьому описі застосовується в найширшому сенсі, та він охоплює різні структури антитіл, включаючи, проте не обмежуючись ними, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, доки вони демонструють бажану антигензв'язувальну активність. "Фрагмент антитіла" означає молекулу, відмінну від інтактного антитіла, яка включає частину інтактного антитіла, яка зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло.
Приклади фрагментів антитіла включають, проте не обмежуються ними, Ем, Раб, Раб", Бар'-5Н,
Каб)»; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгового антитіла (наприклад, 5сЕм) та мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіла. "Антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом", що і посилальне антитіло, означає антитіло, яке блокує зв'язування посилального антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі, та/або навпаки, посилальне антитіло блокує зв'язування цього антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі У цьому описі запропоновано приклад аналізу конкурентного зв'язування.
Термін "химерне" антитіло означає антитіло, у якому частина важкого та/або легкого ланцюга походить від певного джерела або виду, тоді як решта важкого та/або легкого ланцюга походить від іншого джерела або виду. "Клас" антитіла означає тип константного домену або константної ділянки, притаманний його важкому ланцюгу. Існує п'ять головних класів антитіл: ІдА, дО, ІДЕ, дос та ІДМ, та декілька з них можна далі розподілити на підкласи (ізотипи), наприклад, Іде, ІДС», ІдСз, Са, ІА: та Ід».
Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються альфа, дельта, іпсилон, гамма та мю, відповідно.
Термін "цитотоксичний агент", як застосовується у цьому описі, означає речовину, яка інгібує або перешкоджає клітинній функції талабо призводить до загибелі або руйнування клітини.
Цитотоксичні агенти включають, проте не обмежуються ними, радіоактивні ізотопи (наприклад,
А", 91, 125, 90, Ве86, Де Оп »з, Ві? ра, рр? та радіоактивні ізотопи и); хіміотерапевтичні агенти або ліки (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); агенти інгібування росту; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеотичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як токсини з дрібними молекулами, або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти та/або варіанти; та різні протипухлинні та протиракові агенти, описані нижче. "Ефекторні функції" означають ті біологічні види активності, притаманні Ес-ділянці антитіла, які різняться залежно від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв'язування С1д та комплементзалежну цитотоксичність (СОС); зв'язування з рецептором Ес; бо антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЮСС); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин) та активацію В-клітин. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичного складу, означає кількість, яка є ефективною при дозуванні та протягом необхідних періодів часу, щоб досягти бажаного терапевтичного або профілактичного результату.
Термін "епітоп" включає будь-яку детермінанту, яка має властивість бути зв'язаною антитілом. Епітоп - це ділянка антигену, яка зв'язується антитілом, яке улучає в антиген, та яка включає специфічні амінокислоти, які безпосередньо контактують з антитілом. Епітопні детермінанти можуть включати хімічно активні поверхневі угрупування молекул, такі як амінокислоти, цукрові бічні ланцюги, фосфорильні або сульфонільні групи, та вони можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні характеристики заряду.
Взагалі, антитіла, специфічні для певного антигену-мішені, будуть переважно розпізнавати епітоп на антигені-мішені у складній суміші білків та/або макромолекул.
Термін "Ес-ділянка" у цьому описі застосовується для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, який містить принаймні частину константної ділянки. Термін включає
Ес-ділянки нативної послідовності та варіантні Ес-ділянки. В одному варіанті здійснення Ес- ділянка важкого ланцюга Ідс людини простягається від Суз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак, С-кінцевий лізин (Іуз447) або гліцин-лізин (залишки 446-447) Ес-ділянки можуть бути присутніми або відсутніми. Якщо інше не вказується у цьому описі, нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі Європейської номенклатури, яка також називається ЕО-індекс, як описано у
Кавбаї еї а!., Зедиепсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неайцй 5егуісе, Маїйопаї
Іпвійшез ої Неанй, Веїпезаа, МО, 1991. "Каркасна ділянка" або "ЕК" означає залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок (НМК). ЕК варіабельного домену взагалі складається з чотирьох доменів ЕК: ЕК1, ЕК2, ЕКЗ та ЕК4. Отже, послідовності НМК та ЕК зазвичай розташовані у наступному порядку у МН (або М): ЕК1-НІ(11)-ЕН2-Н2 (І 2)-ЕВЗ-НЗІІ 3)-ЕВА.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" та "повне антитіло" застосовуються у цьому описі взаємозамінним чином, та вони означають антитіло, яке має структуру, по суті подібну до структури нативного антитіла, або яке має важкі ланцюги, які містять Ес-ділянку, як
Зо визначається у цьому описі.
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" та "культура клітин-хазяїнів" застосовуються взаємозамінним чином, та вони означають клітини, у які було введено екзогенну нуклеїнову кислоту, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформанти" та "трансформовані клітини", які включають первинні трансформовані клітини та потомство, що походить від них, незважаючи на кількість пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним початковій клітині щодо нуклеїновокислотного вмісту, проте воно може містити мутації. У цей опис включено мутантне потомство, яке має таку саму функцію або біологічну активність, що встановлено шляхом скринінгу або відбору для первинно трансформованої клітини. "Антитіло людини" - це антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності антитіла, яке вироблено людиною або клітиною людини, або яке походить від джерела, яке не є людиною, та яке використовує спектри антитіл людини або інші послідовності, що кодують антитіло людини. Це визначення антитіла людини специфічно виключає гуманізоване антитіло, яке включає залишки, які зв'язуються з антигеном і не є людськими. "Консенсусна каркасна ділянка людини" - це каркасна ділянка, яка представляє найчастіше виникаючі амінокислотні залишки при відборі послідовностей каркасної ділянки МІ або УНН імуноглобуліну людини. Взагалі, відбір послідовностей Мі або МН імуноглобуліну людини відбувається з підгрупи послідовностей варіабельного домену. Взагалі, підгрупа послідовностей - це підгрупа, як вказано у Кабаї єї аї., Зедиепсез ої Ргоїєїп5 ої Іттипо|одіса! Іпіегеві, БИ
Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, Вешезаа МО (1991), моїів. 1-3. В одному варіанті здійснення, для
МІ, підгрупа - це підгрупа каппа І, як вказано у Кабаї еї аІ., див. вище. В одному варіанті здійснення, для МН, підгрупа - це підгрупа І, як вказано у КарБбаї єї а!., див. вище. "Гуманізоване" антитіло означає химерне антитіло, яке включає амінокислотні залишки
НУК, які не є людськими, та амінокислотні залишки з ЕК людини. У певних варіантах здійснення гуманізоване антитіло включатиме по суті усі з принаймні одного або зазвичай двох варіабельних доменів, у яких усі або по суті усі НМА (наприклад, СОК) відповідають гіперваріабельним ділянкам антитіла, яке не є людським, та усі або по суті усі ЕК відповідають каркасним ділянкам антитіла людини. Гуманізоване антитіло довільно може включати 60 принаймні частину константної ділянки антитіла, яка походить від антитіла людини.
"Гуманізована форма" антитіла, наприклад, антитіла, яке не є людським, означає антитіло, яке зазнало гуманізації.
Термін "гіперваріабельна ділянка" або "НМА", як застосовується у цьому описі, означає кожну з ділянок варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними у послідовності (ділянки, що визначають комплементарність" або "СОК") та/або утворюють структурно визначені петлі ("гіперваріабельні петлі"), та/або містять залишки, що контактують з антигеном ("контакти антигену"). Взагалі, антитіла включають шість НМЕ: три у МН (НІ, Н2, НЗ) та три у М (І1, 12, 3). Приклади НУК у цьому описі включають: (а) гіперваріабельні петлі, які виникають на амінокислотних залишках 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) та 96-101 (НЗ) (Споїйіа, 9. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)); (5) СОР, які виникають на амінокислотних залишках 24-34 (11), 50-56 (12), 89-97 (І 3), 311-356 (НІ), 50-65 (Н2г) та 95-102 (НЗ) (Кабаї еї аї.,
Зедиеєпсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неайй 5егмісе, МІН, Веїйезаа, МО (1991)); (с) антигенні контакти, які виникають на амінокислотних залишках 27-36 (11), 46-55 (12), 89-96 (І 3), 30-356 (НІ), 47-58 (Н2) та 93-101 (НЗ) (МассСаїшт еї аї. У). Мої. Віо!І. 262:732-745 (1996)); та (4) комбінації (а), (5) та/або (с), які включають амінокислотні залишки НМЕ. 46-56 (І 2), 47-56 (І 2), 48-56 (І 2), 49-56 (12), 26-35 (НІ), 26-35Б (НІ), 49-65 (Нг), 93-102 (НЗ) та 94-102 (НЗ).
Якщо інше не вказано, залишки НУ. та інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) нумеруються у цьому описі згідно з Кабаї єї аї., див. вище. "Імунокон'югат" - це антитіло, кон'юговане з однією або більше гетерологічною (гетерологічними) молекулою (молекулами), включаючи, проте не обмежуючись ним, цитотоксичний агент. "Індивідуум" або "суб'єкт" - це ссавець. Ссавці включають, проте не обмежуються ними, свійських тварин (наприклад, корів, овець, котів, собак та коней), приматів (наприклад, приматів-людей та приматів, які не є людьми, таких як мавпи), кролів та гризунів (наприклад, мишей та щурів). У певних варіантах здійснення індивідуум або суб'єкт - це людина. "Виділене" антитіло - це антитіло, яке відокремили від компонентів його природного оточення. У деяких варіантах здійснення антитіло очищують більш ніж до 95 95 або 99 95 чистоти, як визначається за допомогою, наприклад, електрофорезу (наприклад, на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505-РАСЕ)), ізоелектричного
Зо фокусування (ІЕЕ), капілярного електрофорезу) або хроматографії (наприклад, іонообмінної або зворотно-фазової ВЕРХ (НРІС)). Для огляду способів оцінювання чистоти антитіла дивись, наприклад, Ріаїтап еї аї!., У. Спготайодг. В 848:79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота означає молекулу нуклеїнової кислоти, яку відокремили від компонентів її природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься у клітинах, які зазвичай містять цю молекулу нуклеїнової кислоти, проте існує молекула нуклеїнової кислоти, присутня назовні хромосоми або на хромосомній позиції, яка є відмінною від природної хромосомної позиції. "Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти С5" означає одну або більше молекул нуклеїнової кислоти, які кодують важкий та легкий ланцюги антитіла (або їх фрагменти), включаючи таку (такі) молекулу (молекули) нуклеїнової кислоти у єдиному векторі або окремих векторах та таку (такі) молекулу (молекули) нуклеїнової кислоти, які присутні у одному або більше місцях у клітині-хазяїні.
Термін "моноклональне антитіло", як застосовується у цьому описі, означає антитіло, отримане з популяції по суті гомогенних антитіл; тобто окремі антитіла, які містяться в популяції, є ідентичними та/або зв'язуються з одним і тим же епітопом, за виключенням можливих варіантів антитіл, наприклад тих, які мають природні мутації або які виникають під час отримання препарату моноклонального антитіла, при цьому такі варіанти зазвичай присутні у незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл спрямоване проти єдиної детермінанти на антигені. Отже, визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, як його отримують з по суті гомогенної популяції антитіл, та воно не інтерпретується як необхідне виробництво антитіла за допомогою будь-якого певного способу. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування згідно з цим винаходом, можна отримати за різноманітними способами, включаючи, проте не обмежуючись ними, спосіб гібридом, способи рекомбінантної ДНК, способи фагового дисплея та способи, у яких застосовуються трансгенні тварини, які містять всі або частину локусів імуноглобуліну людини, при цьому такі способи та приклади інших способів отримання моноклональних антитіл описуються у цьому описі винаходу. "Голе антитіло" означає антитіло, яке не кон'юговане з гетерологічною складовою бо (наприклад, цитотоксичною складовою) або радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути присутнім у фармацевтичному складі.
Термін "нативні антитіла" означає природні молекули імуноглобуліну з різними структурами.
Наприклад, нативні антитіла ІдсС - це гетеротетрамерні глікопротеїни масою біля 150000 дальтонів, які складаються з двох ідентичних легких ланцюгів та двох ідентичних важких ланцюгів, які мають дисульфідний зв'язок. Від М- до С-кінця кожен важкий ланцюг має варіабельну ділянку (МН), яка також називається варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, з наступними трьома константними доменами (СНІ,
СН? та СНЗ). Подібно до цього, від М- до С-кінця кожен легкий ланцюг має варіабельну ділянку (М), яка також називається варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, з наступним константним легким (СІ) доменом. Легкий ланцюг антитіла можна віднести до одного з двох типів, які називаються к (каппа) та А (лямбда), на основі амінокислотної послідовності його константного домену.
Термін "аркуш-вкладиш в упаковці" застосовується для посилання на інструкції, які традиційно вкладаються у комерційні упаковки терапевтичних виробів та які містять інформацію щодо показань, застосування, дозування, способів введення, комплексної терапії, протипоказань та/або попереджень щодо застосування таких терапевтичних виробів. "Ідентичність амінокислотної послідовності у відсотках (96), стосовно посилальної поліпептидної послідовності визначається як відсоткове відношення амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишкам у посилальній поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей та введення проміжків, якщо необхідно, щоб досягти максимальної ідентичності послідовностей у відсотках, при цьому будь- які консервативні заміщення не розглядаються як частина ідентичності послідовностей.
Вирівнювання з метою визначення ідентичності амінокислотних послідовностей у відсотках можна досягти за різними способами, які знаходяться у межах фахових знань у цій галузі, наприклад, застосовуючи публічно доступне комп'ютерне програмне забезпечення, таке як програмне забезпечення ВІА5БТ, ВІ АБЗТ-2, АСОМ, Медаїдп (ОМАБТАК) або СЕМЕТУХ (зареєстрована торговельна марка) (Сепеїух Со., ЦПа.). Фахівці у цій галузі можуть визначити відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання на повній довжині послідовностей, які
Зо порівнюються. Комп'ютерна програма порівнювання послідовностей АГІМ-2 була розроблена
Сепепіесі!, Іпс., та початкову програму було подано разом з документацією для користувачів у
Відомство Сполучених Штатів з авторських прав (05 Соругідні Опйісе), УМазпіпдіоп 0.С., 20559, де її зареєстровано за номером 5 Соругідні Кедізігайоп Мо. ТХО510087. Програма АГІСМ-2 є публічно доступною від Сепепіесй, Іпс., Бошій Зап РЕгапсібсо, Каліфорнія, або її можна завантажити з початкової програми. Програму АГІСМ-2 слід завантажувати для застосування на операційну систему ШМІХ, зокрема цифрову ОМІХ М4.00. Усі параметри порівнювання послідовностей задаються програмою АГ ІОМ-2, та вони не змінюються.
У випадках, коли програма АГІСМ-2 застосовується для порівнювання амінокислотних послідовностей, ідентичність амінокислотних послідовностей у відсотках даної амінокислотної послідовності А щодо, проти або з даною амінокислотною послідовністю В (яку можна альтернативно перефразувати як "дана амінокислотна послідовність А", яка має в цілому або в своїй частині певну ідентичність амінокислотних послідовностей у відсотках щодо, проти або з даною амінокислотною послідовністю В) розраховується наступним чином: помножений на 100 дріб Х/У; де Х - це кількість амінокислотних залишків, які враховано як ідентичні збіги програмою вирівнювання послідовностей АГІОМ-2 у цьому програмному вирівнюванні А та В, та де У - це загальна кількість амінокислотних залишків у В. Зрозуміло, що там, де довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, ідентичність амінокислотних послідовностей А та В у відсотках не буде дорівнювати ідентичності амінокислотних послідовностей В та А у відсотках. Якщо інше специфічно не вказується, усі значення ідентичності амінокислотних послідовностей у відсотках, які застосовуються у цьому описі, отримують із застосуванням комп'ютерної програми АГІСМ-2, як описано в попередньому абзаці.
Термін "фармацевтичний склад" означає препарат, який має таку форму, яка дозволяє біологічній активності активного інгредієнта, що міститься у ньому, бути ефективною, та який не містить додаткових компонентів, які Є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому склад буде вводитися. "Фармацевтично прийнятний носій" означає інгредієнт у фармацевтичному складі, відмінний від активного інгредієнта, який є нетоксичним для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає, проте не обмежується ними, буфер, наповнювач, стабілізуючий агент або консервант. бо Термін "С5", як застосовується у цьому описі, охоплює будь-який нативний С5 від будь-якого джерела: хребетних, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, люди та мавпи) та гризуни (наприклад, миші та щури). Якщо інше не вказано, термін "С5" означає білок С5 людини, який має амінокислотну послідовність, наведену у 5ЕО ІЮО МО: 39 та який містить послідовність бета-ланцюга, наведену у ЗЕО ІЮ МО: 40. Термін охоплює "повнорозмірний" необроблений С5, а також будь-яку форму С5, отриману внаслідок процесингу у клітині. Термін також охоплює природні варіанти С5, наприклад, сплайсовані варіанти або алельні варіанти.
Амінокислотну послідовність прикладу С5 людини наведено у 5ЕО ІЮ МО: 39 ("природний тип" або "МИТ" С5). Амінокислотну послідовність прикладу бета-ланцюга С5 людини наведено у 5ЕО
ІО МО: 40. Амінокислотні послідовності прикладів доменів МС1, МО2 та МО1-Мо2 бета-ланцюга
С5 людини наведено у 5ЕО ІЮ МО: 41, 42 та 43, відповідно. Амінокислотні послідовності прикладів С5 яванських макак (супотоЇди5 топКеу) та мишей наведено у 5ЕО ІО МО: 44 та 105, відповідно. Амінокислотні залишки 1-19 5ЕО ІЮО МО: 39, 40, 43, 44 та 105 відповідають сигнальній послідовності, яка видаляється під час процесингу у клітині, внаслідок чого вона не міститься у відповідному прикладі амінокислотної послідовності.
Як застосовується у цьому описі, термін "лікування" (та відповідні йому граматичні форми, такі як "лікувати" або "піддавати лікуванню") означає клінічне втручання з метою спроби змінити природний хід хвороби індивідуума, якого лікують, та його можна здійснювати або з метою профілактики, або під час перебігу клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають, проте не обмежуються ними, попередження появи або рецидиву хвороби, зменшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби, попередження метастазу, зниження швидкості розвитку хвороби, покращення або полегшення стану хвороби та ремісію або покращення прогнозу. У деяких варіантах здійснення антитіла цього винаходу застосовуються для затримки розвитку хвороби або уповільнення розвитку хвороби.
Термін "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" означає домен важкого або легкого ланцюга антитіла, який залучається у зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН та МІ, відповідно) нативного антитіла звичайно мають подібні структури, при цьому кожен домен включає чотири консервативні каркасні ділянки (ЕК) та три гіперваріабельні ділянки (НУК). (Дивись, наприклад, Кіпаї еї а!., Кибу Іттипоїоду, 6" єд.,
Зо М.Н. Егтеетап апа Со., раде 91 (2007). Єдиного домену МН або Мі може бути достатньо для надання антигензв'язувальної специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язуються з певним антигеном, можна виділити, застосовуючи домен МН або МУ від антитіла, яке зв'язується з цим антигеном, для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів УН або МІ, відповідно. Дивись, наприклад, Ропоїапо еї аї., У. Іттипої. 150:880-887 (1993); Сіаїкзоп еї аї., Маште 352:624-628 (1991).
Термін "вектор", як застосовується у цьому описі, означає молекулу нуклеїнової кислоти, спроможну породжувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона з'єднана. Термін включає вектор як нуклеїновокислотну структуру, що самореплікується, а також вектор, включений у геном клітини-хазяїна, у яку його було введено. Певні вектори спроможні спрямовувати експресію нуклеїнових кислот, до яких вони оперативно приєднані. Такі вектори називаються у цьому описі "вектори експресії".
І. КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ
В одному аспекті винахід базується, частково, на антитілах проти С5 та їх застосуванні. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла, які зв'язуються з С5. Антитіла винаходу є корисними, наприклад, для діагностики або лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
А. Приклади антитіл проти С5
В одному аспекті винаходом пропонуються виділені антитіла, які зв'язуються з С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета- ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах домену МО1-Мо2 бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 19-180 бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах домену МО1 (амінокислоти 20-124 5ЕО ІЮ МО: 40 (ЗЕО ІЮ МО: 41)) бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5 (5ЗЕБО ІЮ МО: 40). В іншому варіанті здійснення антитіло не зв'язується з фрагментом, який є коротшим за фрагмент, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5, наприклад, з фрагментом, який складається з амінокислот 45-124, 52-124, 33-111, 353-108 або 45-111 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ (510) МО: 40).
В іншому аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які демонструють характеристики залежного від рН зв'язування. Як застосовується у цьому описі, вираз "залежне від рН зв'язування" означає, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН, порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" (для цілей цього опису обидва вирази можна застосовувати як взаємозамінні). Наприклад, антитіла "з характеристиками залежного від рН зв'язування" включають антитіла, які зв'язуються з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіла цього винаходу зв'язуються з С5 з афінністю при нейтральному рн, яка принаймні у 2, 3,5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує афінність при кислотному рН. У деяких варіантах здійснення антитіла зв'язуються з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8. У подальших варіантах здійснення антитіла цього винаходу зв'язуються з С5 з афінністю при рН 7,4, яка принаймні у 2, 3,5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує афінність при рН 5,8. "Афінність" антитіла до С5 для цілей цього опису виражається як КО антитіла. КО антитіла означає рівноважну константу дисоціації взаємодії антитіла з антигеном. Чим вище значення КО для зв'язування антитіла з його антигеном, тим слабкішою є його афінність зв'язування до цього певного антигену. Отже, як застосовується у цьому описі, вираз "вища афінність при нейтральному рН, ніж при кислотному рН" (або еквівалентний вираз "залежне від рн зв'язування") означає, що КО для зв'язування антитіла з С5 при кислотному рН є більшою, ніж
КО для зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. Наприклад, у контексті цього винаходу, вважають, що антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, якщо КО зв'язування антитіла з С5 при кислотному рН принаймні у 2 рази перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. Таким чином, цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при кислотному рН з КО, яка принаймні у 2, 3, 5, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при нейтральному рН може становити 10 М, 109 М, 109 М, 1079 М, 10-77 М, 1072 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при
Ко) кислотному рН може становити 107 М, 109 М, 107 М, 105 М або більше.
У подальших варіантах здійснення вважають, що антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, якщо КО зв'язування антитіла з С5 при рН 5,8 принаймні у 2 рази перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при рН 7,4. У деяких варіантах здійснення запропоновані антитіла зв'язуються з С5 при рН 5,8 з КО, яка принаймні у 3,5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при рН 7,4. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 7,4 може становити 10- М, 109 М, 109 М, 1079 М, 10-77
М, 1072 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 5,8 може становити 107 М, 108 М, 10- М, 105 М або більше.
Зв'язувальні властивості антитіла стосовно певного антигену можна також виразити як Ка антитіла. Ка антитіла означає константу швидкості дисоціації антитіла відносно певного антигену, та вона визначається у обернених секундах (тобто секунда"). Підвищення значення
Ка вказує на слабкіше зв'язування антитіла з його антигеном. Отже, цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 з вищим значенням Ка при кислотному рН, ніж при нейтральному рН. Цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при кислотному рН з Ка, яка принаймні у 2,3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує Ка антитіл, які зв'язуються з С5 при нейтральному рн. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при нейтральному рН може становити 102 1/с, 103 1/с, 103 1/с, 105 1/с, 106 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла
БО при кислотному рН може становити 103 1/с, 1072 1/с, 107 1/с або більше. Винахід також включає антитіла, які зв'язуються з С5 з вищим значенням Ка при рН 5,8, ніж при рН 7,4. Цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при рН 5,8 з Ка, яка принаймні у 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує Ка антитіл, які зв'язуються з С5 при рН 7,4. В іншому варіанті здійснення значення
Ка антитіла при рН 7,4 може становити 1072 1/с, 103 1/с, 102 1/с, 105 1/с, 10-65 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 5,8 може становити 103 1/с, 1072 1/с, 10- 1 1/с або більше.
У певних випадках "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" виражається як відношення значення КО антитіла, яке бо зв'язується з С5 при кислотному рН, до значення КО антитіла, яке зв'язується з С5 при нейтральному рН (або навпаки). Наприклад, для цілей цього винаходу, можна вважати, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення КО в кислотних умовах / КО в нейтральних умовах, яке становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО при рН 5,5 / КО при рн 7,4 для антитіла цього винаходу становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО в кислотних умовах / КО в нейтральних умовах для антитіла цього винаходу може становити 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при нейтральному рН може становити 10- М, 108 М, 109 М, 10-79 М, 10-77 М, 10-72 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при кислотному рН може становити 109 М, 108 М, 10-77 М, 105 М або більше. У подальших випадках, для цілей цього винаходу, можна вважати, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення КО при рН 5,8 / КО при рн 7,4, яке становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО при рН 5,8 / КО при рН 7,4 для антитіла цього винаходу може становити 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 7,4 може становити 10 М, 109 М, 1079 М, 1079 М, 10-! М, 10-72 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 5,8 може становити 107 М, 109 М, 107
М, 10-56 М або більше.
У певних випадках "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" виражається як відношення значення Ка антитіла, яке зв'язується з С5 при кислотному рН, до значення Ка антитіла, яке зв'язується з С5 при нейтральному рН (або навпаки). Наприклад, для цілей цього винаходу, можна вважати, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення Ка в кислотних умовах / ка в нейтральних умовах, яке становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення Ка при рн 5,5 / Ка при рН 7,4 для антитіла цього винаходу становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення Ка в кислотних умовах / Ка в нейтральних умовах для антитіла цього винаходу може становити 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. У подальших прикладах варіантів здійснення відношення Ка при рН 5,8 / Ка при рН 7,4 для антитіла цього винаходу може становити 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при нейтральному рН може становити 1072 1/с, 103 1/с, 102 1/с, 105 1/с, 10-65 1/с або менше. У подальшому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 7,4 може становити 102 1/с, 103 1/с, 10 1/с, 105 1/с, 106 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при кислотному рН може становити 103 1/с, 102 1/с, 107 1/с або більше. У подальшому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 5,8 може становити 103 1/с, 1072 1/с, 107 1/с або більше.
Як застосовується у цьому описі, вираз "кислотне рн" означає рН від 4,0 до 6,5. Вираз "кислотне рН" включає значення рН за будь-яким 34,0,4,1,4,2,4,3,4,4,4,5, 4,6, 4,7,4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 61, 6,2, 6,3, 6,4 та 6,5. В особливих аспектах "кислотне рН" становить 5,8.
Як застосовується у цьому описі, вираз "нейтральне рН" означає рнН від 6,7 до приблизно 10,0. Вираз "нейтральне рН" включає значення рН за будь-яким з 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 та 10,0. В особливих аспектах "нейтральне рН" становить 7,4.
Значення КО та значення Ка, як виражено у цьому описі, можна визначити, застосовуючи біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу, щоб характеризувати взаємодії антитіла-антигену. (Дивись, наприклад, Приклад З у цьому описі). Значення КО та значення Ка можна визначити при 25 "С або при 37 "С.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5, який складається з домену МО1(5ЕО ІЮО МО: 41). У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з Тпг47, сіІц48, Аїа49,
Рпеб5о, Азр5б1, Аіаб2, ТНг53, І уз57, Нів70, Ма171, Нів72, бЗег74, С1Ии76, Ма!107, Зетов, І уз109 та бо Ніз110. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з СіІш48, А5р51, Ні70, Ні 72, І уз109 та Ніб110. У певних варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його зв'язуванням з природним С5, де мутантний С5 має принаймні одне амінокислотне заміщення на позиції, вибраній з групи, що складається з сіІш48, Авр5о1,
Нізт72 та Гузх109. В іншому варіанті здійснення залежне від рН зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його залежним від рН зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має принаймні одне амінокислотне заміщення на позиції, вибраній з групи, що складається з Нів70, Нібз72 та Нібз110. У подальшому варіанті здійснення у мутанті
С5 амінокислота на позиції, вибраній з (3Іц48, Аб5р51 та ІГу5109, заміщена аланіном, а амінокислота на позиції, вибраній з Ніє70, Ні72 та Ніб«110, заміщена тирозином.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі, вибрану з наступного: (а) МН 5ЕО ІЮО МО: 1 та МІ.
ЗЕО ІО МО: 11; (Б) МН 5ЕО ІО МО: 22 та МІ. 5ЕО ІО МО: 26; (с) МН 5БЕО ІЮО МО: 21 та МІ. 5ЕО ІЮ
МО: 25; (4) МН 5ЕО ІО МО: 5 та МІ 5ЕО ІО МО: 15; (є) МН БЕО ІО МО: 4 та МІ 5ЕО ІЮО МО: 14; (1)
МН 5ЕО ІО МО: 6 та МІ. 5ЕО ІО МО: 16; (9) МН 5ЕО ІО МО: 2 та МІ. 5ЕО ІО МО: 12; (п) МН 5ЕО ІЮ
МО: З та МІ ЗЕО ІО МО: 13; (Ї) МН ЗЕО І МО: 9 та МІ ЗЕО ІЮ МО: 19; (Ї) МН 5ЕО ІО МО: 7 та МІ.
ЗЕО ІЮ МО: 17; (К) МН 5ЕО ІО МО: 8 та МІ. 5ЕО ІЮО МО: 18; () МН 5ЕО ІО МО: 23 та МІ 5ЕО І
МО: 27 та (т) МН 5ЕО ІО МО: 10 та МІ 5ЕО ІЮО МО: 20.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою Азр51 (051) 5ЕО ІЮО МО: 39. У додаткових варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою Гуз109 (К109)
ЗЕО ІО МО: 39. У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою Авр51 (051) та амінокислотою ГГ у5109 (К109) 5ЕО ІО МО: 39.
У певних варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має заміщення
СіІш48Аїа (Е48А) в 5ЕО ІО МО: 39. В іншому варіанті здійснення залежне від рН зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його залежним від рН зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має заміщення СіІш48Аїа (Е48А) в БЕО ІЮ МО:
Зо 39.
У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО: 39, проте не зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 39 із заміщенням Н72У, де білок
С5 та білок С5 із заміщенням Н72У готують та піддають скринінгу в однакових умовах. У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 39 при рН 7,4, проте не зв'язується з білком С5 із заміщенням Н72У при рН 7,4.
Не обмежуючись якоюсь певною теорією, можна передбачити, що зв'язування антитіла проти С5 з С5 ослаблюється (або майже втрачається), коли амінокислотний залишок в С5 заміщений іншою амінокислотою, що означає, що цей амінокислотний залишок в С5 є вирішальним для взаємодій між антитілом проти С5 та С5 та що антитіло може розпізнавати епітоп навколо цього амінокислотного залишку в С5.
У цьому винаході було визначено, що група антитіл проти С5, які конкурують один з одним або зв'язуються з однаковим епітопом, можуть демонструвати характеристики залежного від рн зв'язування. Серед амінокислот гістидин, значення рКа якого становить приблизно від 6,0 до 6,5, може мати різні стани протонної дисоціації між нейтральним та кислотним рН. Отже, залишок гістидину в С5 спроможний сприяти залежним від рН взаємодіям між антитілом проти
С5 та С5. Не обмежуючись якоюсь певною теорією, можна передбачити, що антитіло проти С5 може розпізнавати конформаційну структуру навколо залишку гістидину в С5, яка є варіабельно залежною від рН. Таке передбачення може узгоджуватися з експериментальними результатами, описаними нижче, що залежність від рН антитіла проти С5 знижується (або майже втрачається), коли залишок гістидину в С5 заміщений іншою амінокислотою (тобто антитіло проти С5 з характеристиками залежного від рН зв'язування зв'язується з мутантом С5 із заміщеним гістидином з афінністю, подібною до афінності природного С5 при нейтральному рН, при цьому таке саме антитіло зв'язується з мутантом С5 із заміщеним гістидином з вищою афінністю, порівняно з афінністю при зв'язуванні з природним С5 при кислотному рН).
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 від більш ніж одного виду тварин. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 від людини та тварини, яка не є людиною. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 бо зв'язується з С5 від людини та мавпи (наприклад, яванської макаки (супотоїЇдив5), макаки резус,
мартишки, шимпанзе або павіана).
В одному аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які інгібують активацію С5. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які попереджають розщеплення
С5, внаслідок якого утворюються Сба та С5р, що, у свою чергу, попереджає генерування анафілатоксичної активності, пов'язаної з Сб5а, а також попереджає зборку мембраноатакуючого комплексу С5р-9 (МАС), пов'язаного з С5р. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують перетворення С5 на Сб5а та С5р конвертазою С5. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують доступ конвертази С5 до сайту розщеплення в С5. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують гемолітичну активність, яка є наслідком активації С5. У подальших варіантах здійснення антитіла проти С5 цього винаходу інгібують активацію С5 класичним шляхом та/або альтернативним шляхом.
В одному аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які інгібують активацію варіанта С5. Термін "варіант С5" означає генетичний варіант С5, який є наслідком генетичної варіації, такої як мутація, поліморфізм або алельна варіація. Генетична варіація може включати делецію, заміщення або вставку одного або більше нуклеотидів. Варіант С5 може мати одну або більше генетичних варіацій у С5. У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до біологічної активності природного С5. Такий варіант С5 може мати принаймні одну варіацію, вибрану з групи, що складається з М145І, К4496, М802І, К885Н, кК9280, 0966У, 51310М та Е1437О0. У цьому описі К885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію як природного С5, так і принаймні одного варіанта С5, вибраного з групи, що складається з М145І, К4490, М802І, Е885Н, К9280, роббУ, 51310М та Е14370.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло проти С5, яке включає принаймні одну, дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок (НМК), вибраних з наступного: (а)
НМУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45-54; (в) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 55-64; (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 65-74; (0) НУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 75-84; (є) НМУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 85-94; та (3 НМК-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95-104.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МН, вибрані з наступного: (а) НМК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 45-54; (р) НУМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55-64; та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 65-74. В одному варіанті здійснення антитіло включає НМК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65-74. В іншому варіанті здійснення антитіло включає НМК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО І МО: 65-74, та НМЕ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95-104. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає НМЕ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65-74,
НМВ-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 95-104, та НМЕ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 55-64. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає (а) НМК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 45-54; (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь- якою з ЗЕО ІЮ МО: 55-64; та (с) НМЕА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 65-74.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 75-84; (р) НМУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 85-94; та (с) НМЕ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104. В одному варіанті здійснення антитіло включає (а) НМЕ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ
МО: 75-84; (р) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 85- 94; та (с) НМЕ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104.
В одному аспекті антитіло винаходу включає (а) домен УН, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ї) НМЕК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 45-54, (ії) НМВ-Н2, яка включає 60 амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55-64, та (ії) НМАК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 65-74; та (Б) домен Мі, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМЕ. МІ, вибрані з наступного: (ї) НМА-
Ї1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 75-84, (ії) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 85-94, та (с) НМК-1І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95-104.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 45-54; (р) НУМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55-64; (с) НУМВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 65-74; (а) НМВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 75-84; (є) НМУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 85-94; та (3 НМК-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло проти С5, яке включає принаймні одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК, вибраних з наступного: (а) НМК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (р) НУМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120, 127; (с) НУВ-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128; (а)
НМВА-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 75, 84, 122, 129; (є) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 85, 94, 123- 124, 130; та () НМЕ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МН, вибрані з наступного: (а) НМК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (Б) НМК-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 55, 64, 118-120, 127; та (с)
НМУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65, 74, 121, 128. В одному варіанті здійснення антитіло включає НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128. В іншому варіанті здійснення антитіло включає
НМУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65, 74, 121, 128,
Ко) та НМА-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає НМК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128, НМЕ-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБО ІО МО: 95, 104, 125, 131, та НМК-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120, 127. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає (а) НМК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120, 127; та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: (а) НМЕ-І71, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 75, 84, 122, 129; (Б) НМК-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 85, 94, 123-124, 130; та (с)
НМВ-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
В одному варіанті здійснення антитіло включає (а) НМК-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 75, 84, 122, 129; (р) НУВ-І2 яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 85, 94, 123-124, 130; та (с) НМЕА-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
В одному аспекті антитіло винаходу включає (а) домен УН, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ї) НМЕК-НІ, яка включає
БО амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126, (і) НМА-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 55, 64, 118-120, 127, та (ії)
НМУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65, 74, 121, 128; та (6) домен МІ, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА. МІ, вибрані з наступного: (ї) НМА-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО
ІО МО: 75, 84, 122, 129, (ії) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з
ЗЕО І МО: 85, 94, 123-124, 130, та (с) НМК-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (Б) НМК-Н2, яка 60 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120, 127; (с) НУВ-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128; (а)
НМВА-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 75, 84, 122, 129; (є) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 85, 94, 123- 124, 130; та () НМЕ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
У певних варіантах здійснення будь-яка одна або більше амінокислот антитіла проти С5, як запропоновано вище, заміщені на наступних позиціях НМЕ: (а) у НМК-НІ (5ЕО ІО МО: 45) на позиціях 5 та 6; (в) у НМА-Н2 (ЗЕО ІО МО: 55) на позиціях 1, 3, 9, 11, 13 та 15; (с) у НМЕ-НЗ (5ЗЕО
ІО МО: 65) на позиціях 2, 5, 6, 12 та 13; (4) у НМК-І1 (5ЕО ІО МО: 75) на позиціях 1, 5, 7 та 9; (є) у НМА-1І2 (ЗЕО ІЮ МО: 85) на позиціях 4, 5 та 6 та () у НМА-ІЇ З (ЗЕО ІЮ МО: 95) на позиціях 2, 4 та 12.
У певних варіантах здійснення заміщення - це консервативні заміщення, як запропоновано у цьому описі. У певних варіантах здійснення будь-яке одне або більше з наступних заміщень можна виконати у будь-якій комбінації: (а) у НМАЕ-НІ1 (5ЕО ІО МО: 45) М5М або СбА; (Б) у НМК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО: 55) СТА або с, УЗЕ, Т90 або Е, У11К або О, 5130 або Е, або А15У; (с) у НМЕ-НЗ (ЗЕО ІО МО: 65) С2А, М5О або 0, ТУ, У12Н, або І 13У; (4) у НМА-11 (5ЕО ІО МО: 75) О18, М5О або б, 575, Б9К або 5; (є) у НМЕ-І 2 (ЗЕО ІЮ МО: 85) КАТ або Е, І 51 або АбН, АбЕ або АбО; (1) у НМК-ІЗ (ЗЕО ІЮ МО: 95) С25, С2М або С2Т, Р4К; або А12Т або А12Н.
Усі можливі комбінації вищезгаданих заміщень охоплюються консенсусними послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 126, 127, 128, 129, 130 та 131 для НМЕ-НІ, НУВ-Н2, НУВ-НЗ,
НМВ-І1, НМВА-12 та НМУК-/-3, відповідно.
У будь-якому з вищезгаданих варіантів здійснення антитіло проти С5 є гуманізованим. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 включає НУК, як у будь-якому з вищезгаданих варіантів здійснення, та також включає акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад, каркасну ділянку імуноглобуліну людини або консенсусну каркасну ділянку людини. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 включає НУЕ, як у будь-якому з вищезгаданих варіантів здійснення, та також включає МН або У, які включають послідовність ЕЕ, де послідовності ЕВ. є наступними. Для варіабельного домену важкого ланцюга ЕК! включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 132-134, ЕК2 включає амінокислотну послідовність за
Ко) будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 135-136, ЕКЗ включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО
ІО МО: 137-139, ЕН4 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 140-141.
Для варіабельного домену легкого ланцюга ЕК1 включає амінокислотну послідовність за будь- якою з 5ЕО ІЮ МО: 142-143, ЕК2 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ
МО: 144-145, ЕКЗ включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 146-147, ЕВ4 включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 148.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), яка є принаймні на 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 У, 94 95, 95 Уо, 96 У, 97 Уо, 98 Фо, 99 90 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 1-10. У певних варіантах здійснення послідовність МН, яка є принаймні на 90 Фо, 91 Фо, 92 Фо, 93 Ус, 94 Фо, 95 Фо, 966, 9795, 9895 або 9995 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-які з
ЗЕО ІЮ МО: 1-10. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність
МН у будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 1-10, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМК, вибрані з наступного: (а)
НМУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45-54, (в) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 55-64, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65-74. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М- кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ), яка є принаймні на 90 95, 91 Фо, 92 95, 93 о, 94 бо, 95 9, 96 9», 97 У, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 11-20. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 9195, 92 95, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, бо проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з
С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з БЕО ІЮО МО: 11-20. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ. у будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 11-20, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три
НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМК-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з
ЗЕО ІЮ МО: 75-84, (5) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ
МО: 85-94, та (с) НМК-І3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 95-104. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає УН, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та Мі, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовності МН та МІ. у будь-якій з ЗЕБЕО ІЮО МО: 1-10 та у будь-якій з 5ЕБО ІЮ МО: 11-20, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації таких послідовностей. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), яка є принаймні на 90 Ос, 91 95, 92 95, 93 У, 94 95, 95 Уо, 96 У, 97 Уо, 98 Фо, 99 90 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення послідовність УН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 9о, 94 905, 95 95, 96 96, 97 95, 98 95 або 9995 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з ЗЕБЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 10, 106-110, включаючи посттрансляційні
Зо модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення УН включає одну, дві або три
НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з
ЗЕО ІО МО: 45, 54, 117, 126, (5) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 55, 64, 118-120, 127, та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5БО ІЮ МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення послідовність УН, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 о, 94 Фо, 95 У, 96 Фо, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами
НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у будь-якій з
ЗЕБЕО 10 МО: 10, 106-110, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМК, вибрані з наступного: (а)
НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 45, 54, 117, 126,
БО (б) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 55, 64, 118- 120, 127, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 10. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 10. У певних варіантах здійснення послідовність МН, яка є принаймні на 90 9, 91 9», 92 Фо, 93 У, 94 9, 95 95, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичною, бо містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІЮ МО: 10. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК).
Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕБЕО ІЮО МО: 10, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМЕК-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 54, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5Е0
ІЮ МО: 64, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕБЕО ІЮ МО: 74.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО 0 МО: 106. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 106. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІО МО: 106. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІО МО: 106, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮО МО: 118, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти
Зо внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО 0 МО: 107. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 107. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІО МО: 107. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІО МО: 107, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮО МО: 119, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО 0 МО: 108. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 108. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІО МО: 108. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІО МО: 108, включаючи бо посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення УН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮО МО: 118, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО 0 МО: 109. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 109. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІО МО: 109. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІО МО: 109, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮО МО: 118, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 965, 9296, 93 90, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 110. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 110. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95
Зо ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у ЗЕО ІО МО: 110. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮО МО: 110, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМЕК, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (Б) НМЕ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮО МО: 120, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ), яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 9в, 93 У, 94 Ор, 95 9, 96 9», 97 У, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 20, 111-113. У певних варіантах здійснення послідовність МІ., яка є принаймні на 90 Фо, 91 95, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 90, 96 У, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з
С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 20, 111-113. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ. у будь-якій з БЕО ІЮ МО: 20, 111-113, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три НМК, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БО ІЮ МО: 75, 84, 122, 129, (5) НМК-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 85, 94, 123-124, 130, та (с) НМЕА-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну бо або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі.,, яка є принаймні на 90 то, 91 зо, 92 зо, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІЮО МО: 20. У певних варіантах здійснення послідовність МІ. - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІО МО: 20. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 9, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮО МО: 20. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у ЗЕО ІЮ МО: 20, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМК-Ї71, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 84, (в) НМК-12, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ
МО: 94, та (с) НМУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 104.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі, яка є принаймні на 90 то, 91 зо, 92 зо, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 111. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ. - це амінокислотна послідовність за ЗЕО І МО: 111. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 9, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮО МО: 111. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад,
Зо у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІЮ МО: 111, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМК-Ї71, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 122, (р) НМК-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕ
ІЮО МО: 123, та (с) НМА-ІЗ3, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕБЕО ІЮ МО: 125.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі.,, яка є принаймні на 90 то, 91 зо, 92 зо, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 112. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ. - це амінокислотна послідовність за ЗЕО І МО: 112. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 9, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮО МО: 112. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІЮ МО: 112, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три НМК, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 122, (в) НМК-12, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕО
ІЮО МО: 123, та (с) НМК-ІЗ3, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕБЕО ІЮ МО: 125.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі.,, яка є принаймні на 90 то, 91 зо, 92 зо, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 113. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ. - це амінокислотна послідовність за ЗЕО І МО: 113. У певних варіантах здійснення бо послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 9, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або
99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/(або стерто у ЗЕО ІЮО МО: 113. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НУК (наприклад, у ЕК). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІЮ МО: 113, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ. включає одну, дві або три НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМК-Ї71, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 122, (Б) НМК-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за зЕО
ІЮО МО: 124, та (с) НМК-ІЗ3, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕБЕО ІЮ МО: 125.
Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає МН, як описано у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та МІ, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовності
МН та Мі у будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 10, 106-110 та у будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 20, 111-113, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей. Посттрансляційні модифікації включають, проте не обмежуються нею, модифікацію глутаміну або глутамату на М- кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга до піроглутамінової кислоти внаслідок піроглутамінації. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ
МО: 10 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮ МО: 20. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за ЗЕО ІЮ МО: 106 та послідовність МІ за ЗЕО ІЮО МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за ЗЕО ІЮ МО: 107 та послідовність МІ. за 5ЕО І
МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 108 та послідовність МІ за 5БО І МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за ЗЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ. за ЗЕО ІЮО МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮО МО: 109 та послідовність МІ. за ЗЕО ІЮ
МО: 112. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ за 5ЕБО ІО МО: 113. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮО МО: 110 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮ МО: 113.
В одному аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 54, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 64, та (с) НМК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 74, та послідовність МІ, яка містить (а) НМАК-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 84; (в) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 94; та (с) НМЕ-1І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО
ІО МО: 104.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 117, (в) НМА-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕ ІЮ МО: 118, та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 121, та послідовність Мі, яка містить (а) НМА-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5БО ІО МО: 122; (5) НМК-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕБЕО ІО МО: 123; та (с) НМК-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність МН, яка містить (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 117, (в) НМА-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕ ІЮ МО: 119, та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 121, та послідовність МІ., яка містить (а) НМНА-11, яка
БО включає амінокислотну послідовність за 5БО ІО МО: 122; (5) НМК-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕБЕО ІО МО: 123; та (с) НМК-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 117, (в) НМА-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕ ІЮ МО: 118, та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 121, та послідовність Мі, яка містить (а) НМА-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5БО ІО МО: 122; (5) НМК-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕБЕО ІО МО: 124; та (с) НМК-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125. 60 В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН,
яка містить (а) НМЕ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 117, (в) НМА-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 120, та (с) НМЕК-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 121, та послідовність Мі, яка містить (а) НМА-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5БО ІО МО: 122; (5) НМК-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 124; та (с) НМК-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу включає МН, як у будь- якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та константну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 33, 34, 35, 114, 115 та 116. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу включає Мі, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та константну ділянку легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 36, 37 та 38.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і запропоноване у цьому описі антитіло проти С5. Наприклад, у певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у
Таблиці 2. Як продемонстровано нижче робочими прикладами, усі наведені у Таблиці 2 антитіла проти С5 згруповані в одну й ту ж епітопну групу стосовно С5, та вони демонструють характеристики залежного від рН зв'язування.
У додатковому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і запропоноване у цьому описі антитіло. У подальшому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у
Таблиці 7 або 8. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5 (ЗЕО ІЮ
МО: 40). У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5 (ЗЕО ІЮ МО: 40), який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга С5 (ЗЕО ІЮ
МО: 40), який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з Тпг47,
Сін48, Аіа49, Рпеб50, Авр5б1, АІаб2, Тпг53, І уз57, Нів70, МаІ71, Нівз72, Зег74, Сс1и76, Ма1І107,
Зо зег108, Гуз109 та Ніз110. В іншому варіанті здійснення епітоп антитіла проти С5 цього винаходу - це конформаційний епітоп.
У подальшому аспекті винаходу антитіло проти С5 згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це моноклональне антитіло, включаючи химерне антитіло, гуманізоване антитіло та антитіло людини. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 - це фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Бар, Рар', 5сЕм, діатіло або фрагмент Е(аб)». В іншому варіанті здійснення антитіло - це повнорозмірне антитіло, наприклад, інтактне антитіло Їдс1 або Ідсяі, або інший клас або ізотип антитіла, як визначається у цьому описі.
У подальшому аспекті антитіло проти С5 згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення може включати будь-які ознаки, окремо або у комбінації, як описано у Розділах 1-7 нижче. 1. Афінність антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло має константу дисоціації (Ка), яка становить 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше або 0,001 нм або менше (наприклад, 108 М або менше, наприклад від 109 М до 10-73 М, наприклад, від 109 М до 1073 М).
В одному варіанті здійснення Ка вимірюється за допомогою аналізу зв'язування міченого ізотопом антигену (КІА). В одному варіанті здійснення КІА виконується з версією ЕРар антитіла, яке представляє інтерес, та його антигеном. Наприклад, афінність зв'язування розчину Раб з антигеном вимірюється за допомогою урівноваження Рар мінімальною концентрацією міченого (25І) антигену у присутності титраційних серій неміченого антигену з наступним захопленням зв'язаного антигену планшетом, на який нанесено антитіло проти Раб (дивись, наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881 (1999)). Для того, щоб задати умови аналізу на планшети з багатьма комірками МІСКОТІТЕК (зареєстрована торговельна марка) (Тпепто 5сіепійіс) нанесли на ніч 5 мкг/мл захоплюючого антитіла проти Бар (Сарреї! І арх) у 50 мМ карбонаті натрію (рН 9,6), а потім блокували за допомогою 2 95 (маса/об'єм) бичачим сироватковим альбуміном у РВЗ протягом від 2 до 5 годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У неадсорбуючому планшеті (Мипс 2269620) 100 пМ або 26 пМ Г29І|-антигену змішали з серійними розведеннями Еаб, що представляє інтерес (наприклад, який узгоджується з оцінкою антитіла проти МЕСЕ, ЕРабр-12, у Ргезіа єї аІ., Сапсег Ке5. 57:4593-4599 (1997)). Раф, який представляє бо інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак, інкубація може тривати протягом тривалішого періоду (наприклад, приблизно 65 годин), щоб переконатися, що урівноваження досягнуто.
Після цього суміші переносять до захоплюючого планшета для інкубування при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють та планшет промивають вісім разів 0,1 95 полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-20 (зареєстрована торговельна марка)) у РВ5. Коли планшети висушено, тоді додають 150 мкл/комірку сцинтилятору (МІСКОЗСІМТ-20 7М; РасКага) та планшети рахують на гамма-лічильнику ТОРСОИШМТ "М (РаскКага) протягом 10 хвилин. Концентрації кожного Раб, які дають менш, ніж 20 95 від максимального зв'язування або рівно 20 95 від нього, вибирають для застосування в аналізі конкурентного зв'язування.
Згідно з іншим варіантом здійснення Ка вимірюється за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Наприклад, аналіз із застосуванням ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка)-2000 або ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка)-3000 (ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), Іпс.,
Різсагїаулау, МУ) виконується при 25 "С з чипами іммобілізованого антигену СМ5 при приблизно 10 одиницях відповіді (КО). В одному варіанті здійснення біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (СМ5, ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), Іпс.) активуються за допомогою М-етил-М'-(З-диметиламінопропіл)-карбодіїміду гідрохлориду (ЕЮОС) та М-гідроксисукциніміду (МН5Б) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розводять 10 мМ ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (приблизно 0,2 мкМ) перед впорскуванням з витратою потоку 5 мкл/хвилину, щоб досягти приблизно 10 одиниць відповіді (КИ) зв'язаного білку. Після впорскування антигену 1 М етаноламін впорскується, щоб блокувати групи, які не вступили в реакцію. Для вимірювання кінетики двократні серійні розведення Бар (від 0,78 до 500 нм) впорскуються у РВ5 з поверхнево-активною речовиною (РВ5Т) 0,05 95 полісорбату 20 (ТМУЕЕМ- 207М) при 25"С із витратою потоку приблизно 25 мкл/хвилину. Константи асоціації (Коп) та константи дисоціації (Кої) розраховуються за допомогою моделі зв'язування один-до-одного
Гапдтиїг (ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) ЕмаІчайноп 5опймаге версія 3.2) шляхом одночасного зіставлення сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Ка) розраховують як відношення Кок/Коп. Дивись, наприклад, Спеп еї аї., 9. Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо константа асоціації перебільшує 109 М" с" у вищезгаданому аналізі поверхневого плазмонного резонансу, то константу асоціації можна визначити за допомогою способу гасіння
Зо флюоресценції при якому вимірюється підвищення або зниження інтенсивності флуоресцентного випромінювання (збудження - 295 нм; випромінювання - 340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25 "С 20 нМ антитіла проти антигену (форма Раб) у РВ5, рн 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигену, що вимірюється у спектрометрі, такому як спектрофотометр, спроможний вимірювати за методом зупинки потоку (Амім Іпзігитепів), або спектрофотометр ЗІ М-АМІМСО "М серії 8000 (Тпеппозресігопіс) з кюветою, де здійснюється перемішування. 2. Фрагменти антитіл
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл включають, проте не обмежуються ними, фрагменти Еаб, Раб,
Еар-5Н, К(ар)»г, Ем та 5сЕм та інші фрагменти, описані нижче. Для огляду певних фрагментів антитіл дивись Ниазоп еї аї., Маї. Меа. 9:129-134 (2003). Для огляду фрагментів 5сЕм дивись, наприклад, РійсКкійип, у Те РІПагтасоїоду ої Мопосіопа! Апііродіе5, мої. 113, Козепригд апа
Мооге еєав., (Зргіпдег-Мепад, Мем Мої), рр. 269-315 (1994); дивись також УМО 93/16185 та патенти США МоМо 5,571,894 та 5,587,458. Обговорення фрагментів Бар та Р(аб)», які включають залишки епітопу зв'язування з рецептором реутилізації та які мають подовжене напівжиття іп мімо, дивись у патенті США Мо 5,869,046.
Діатіла - це фрагменти антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, які можуть бути двовалентними або біспецифічними. Дивись, наприклад, ЕР 404,097; МО 1993/01161; Ниазоп еї а!І., Маї. Мед. 9:129-134 (2003); та Ноїподег єї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90:6444-6448 (1993).
Триатіла та тетратіла також описано у Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла - це фрагменти антитіл, які включають увесь або частину варіабельного домену важкого ланцюга або увесь або частину варіабельного домену легкого ланцюга антитіла. У певних варіантах здійснення однодоменне антитіло - це однодоменне антитіло людини (ЮОотапії5, Іпс., УуУакпат, МА; дивись, наприклад, патент США Мо 6,248,516 ВІ).
Фрагменти антитіл можна отримати за різними способами, включаючи, проте не обмежуючись ними, протеолітичне перетравлення інтактного антитіла, а також продукування рекомбінантними клітинами-хазяїнами (наприклад, Е. Соїї або фаг), як описується у цьому описі. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це химерне антитіло. 60 Певні химерні антитіла описано, наприклад, у патенті США Мо 4,816,567; та Моїтізоп еї аї., Ргос.
Май. Асад. 5сі. ОБА 81:6851-6855 (1984)). В одному прикладі химерне антитіло включає варіабельну ділянку, яка не є людською (наприклад, варіабельну ділянку, яка походить від миші, щура, хом'яка, кроля або примата, який не є людиною, такого як мавпа), та константну ділянку людини. У подальшому прикладі химерне антитіло - це антитіло з "перемкнутим класом", у якому клас або підклас початкового антитіла змінено. Химерні антитіла включають їх антигензв'язувальні фрагменти.
У певних варіантах здійснення химерне антитіло - це гуманізоване антитіло. Зазвичай, антитіло, яке не є людським, гуманізують з метою зниження імуногенності для людей, при цьому зберігаються специфічність та афінність початкового антитіла, яке не є людським. Взагалі, гуманізоване антитіло включає один або більше варіабельних доменів, у яких НМК, наприклад,
СОК (або їх частини) походять від антитіла, яке не є людським, та ЕК (або їх частини) походять з послідовностей антитіла людини. Гуманізоване антитіло довільно також включатиме принаймні частину константної ділянки людини. У деяких варіантах здійснення деякі залишки
ЕК у гуманізованому антитілі заміщені відповідними залишками з антитіла, яке не є людським, (наприклад, антитіла, з якого походять залишки НУК), наприклад, щоб відновити або покращити специфічність або афінність антитіла.
Огляд гуманізованих антитіл та способів їх отримання наведено, наприклад, у АІтадго апа
Екгапвзоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008), та вони далі описуються, наприклад, у Кіесптапп еї а!., Майте 332:323-329 (1988); Ойееп еї аї., Ргос. Май! Асай. 5сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патентах США МоМо 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 та 7,087,409; КазПптіїгі еї аіІ., Мем под 36:25- 34 (2005) (де описується трансплантація ділянки, що визначає специфічність (ЗОК)); Раадіап,
МОЇ. Іттипої. 28:489-498 (1991) (де описується "перекладання" ("тезипасіпд")); Ба! Асдпа еї аї.,
Меїпоаз 36:43-60 (2005) (де описується "перестановка ЕК" ("ЄВА 5Пп!ийійпд")); та Озроит еї аї.,
Меїтпоаз 36:61-68 (2005) та КійткКа еї аї!., Вг. У. Сапсег. 83:252-260 (2000) (де описується підхід "керованої селекції" ("Зиїдейа зеІесіоп") до перемішування ЕК).
Каркасні ділянки людини, які можна застосовувати для гуманізації, включають, проте не обмежуються ними: каркасні ділянки, які вибираються із застосуванням способу "найкращої відповідності" ("реві-йй") (дивись, наприклад, 5ітв5 еї аї.,У. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні ділянки, які походять від консенсусної послідовності антитіл людини певної підгрупи варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюга (дивись, наприклад, Сагіег еї аї., Ргос. Маї!.
Асад. бсі. ОБА 89:4285 (1992); та Ргезіа еї аї., 9. Іттипої. 151:2623 (1993)); зрілі (соматично мутовані) каркасні ділянки людини або каркасні ділянки зародкової лінії людини (дивись, наприклад, АЇтадго апа Егапе5зоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008)); та каркасні ділянки, які отримані внаслідок скринінгу бібліотек ЕК (дивись, наприклад, Васа еї аї., 9. Віої. Спет. 272:10678-10684 (1997) та Козок еї аї., 9. Віої. Спет. 271:22611-22618 (1996)). 4. Антитіла людини
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це антитіло людини.
Антитіла людини можна отримати, застосовуючи різні відомі у цій галузі способи. Антитіла людини описано взагалі у мап бі)кК апа мап де У/іпКеї, Си. Оріп. Рпагтасої. 5:368-374 (2001) та
Гопрего, Сит. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Антитіла людини можна отримати шляхом введення імуногену трансгенній тварині, яку модифікували, щоб отримати інтактні антитіла людини або інтактні антитіла з варіабельними ділянками людини у відповідь на щеплення антигеном. Такі тварини зазвичай містять усі або частину локусів імуноглобуліну людини, які заміщують локуси ендогенного імуноглобуліну, або які присутні назовні хромосом або довільно інтегровані у хромосоми тварини. У таких трансгенних мишей локуси ендогенного імуноглобуліну зазвичай інактивовані. Огляд способів отримання антитіл людини від трансгенних тварин дивись у Гопбрего, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Дивись також, наприклад, патенти США МоМо 6,075,181 та 6,150,584, які описують технологію ХЕМОМОИШБЕ"М: патент США Мо 5,770,429, який описує технологію НиМар (зареєстрована торговельна марка); патент США Мо 7,041,870, який описує технологію. К-М
МОИЗЕ (зареєстрована торговельна марка) та публікацію патентної заявки США Мо 2007/0061900, яка описує технологію МеїЇосімМоизе (зареєстрована торговельна марка).
Варіабельні ділянки людини від інтактних антитіл, вироблених такими тваринами, можна далі модифікувати, наприклад, шляхом поєднання з відмінною константною ділянкою людини.
Антитіла людини можна також отримати за способами на основі гібридом. Було описано клітинні лінії мієломи людини та гетеромієломи миші-людини для отримання моноклональних антитіл людини. (Дивись, наприклад, Ко7рог 9. Іттипої., 133:3001 (1984); Вгодецг еї аї.,
Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіоп Тесппідне5 апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (ОеккКег, Іпс., Мем МО, 1987); та Воепег еї аї., У. Іттипої. 147:86 (1991)). Антитіла людини, одержані за допомогою 60 технології з використанням гібридоми В-клітин людини також описано у Гі еї аї., Ргос. Маї|. Асай.
Зсі. ОБА 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 7,189,826 (який описує отримання моноклональних антитіл (ЯМ людини від гибридомних клітинних ліній) та Мі, Хіапдаі Міапуїхие 26(4):265-268 (2006) (де описуються гібридоми типу "людина-людина"). Технологію з використанням гібридоми людини (технологія
Триоми) (Тіота їесппоіоду) також описано у МоїІтегв5, Нікоіоду апа НізіораїпоЇоду 20(3):927-937 (2005) та МоПтегв5, Меїпоаз апа Ріпаіпд5 в Ехрегітепіа! апа Сіїпіса! Рпаппасоїоду 27(3):185-191 (2005).
Антитіла людини можна також генерувати шляхом виділення послідовностей варіабельного домену клону Ем, вибраних з бібліотек фагового дисплея, які походять від людини. Такі послідовності варіабельного домену можна потім поєднувати з бажаним константним доменом людини. Способи вибору антитіл людини з бібліотек антитіл описано нижче. 5. Антитіла, які походять з бібліотек
Антитіла винаходу можна виділити шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек щодо антитіл з бажаною активністю або видами активності. Наприклад, у цій галузі відомі різноманітні способи генерування бібліотек фагового дисплея та скринінгу таких бібліотек щодо антитіл, яким притаманні бажані характеристики зв'язування. Огляд таких способів наведено, наприклад, у
Ноодепроот єї аї., Меїнодв іп Моїесшіаг Віоїоду 178:1-37 (О'"Віїєп єї аї., єд., Нитап Ргез5,
Тома, МУ, 2001), та вони також описані, наприклад, у МсоСапйПепу еї аї., Маїшге 348:552-554;
Сіаскзоп еї аї., Майте 352:624-628 (1991); Магкз5 еї аї., 9У. Мої. Віої. 222:581-597 (1992); МаїкКзв,
Меїйп.Мої. Вісі. 248:161-175 (Го, ед., Нитап Ргевзв, Тоїожа, МУ, 2003); Бідни еї аї., У. Мої. Віої. 338(2):299-310 (2004); І ее евї аї., у. Мої. Віої. 340(5):1073-1093 (2004); РеПоизе, Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 101(34)12467-12472 (2004); І ее вії аї., 9. Іттипої. Меїйоаз 284(1-2):119-132 (2004).
У певних способах фагового дисплея репертуари генів МН та МІ окремо клонуються за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСК) та довільно рекомбінуються у фагові бібліотеки, які потім можна піддати скринінгу щодо антигензв'язувального фагу, як описано у
Муіпіег єї аї., Апп. Веум. Іттипої. 12:433-455 (1994). Фаг зазвичай відображує фрагменти антитіла або як одноланцюгові фрагменти Ем (5сЕм), або як фрагменти Раб. Бібліотеки з імунізованих джерел пропонують високоафінні до імуногену антитіла без необхідності побудови гібридом.
Альтернативно, нативний репертуар можна клонувати (наприклад, від людини), щоб отримати єдине джерело антитіл для широкого діапазону як аутоантигенів, так і не-аутоантигенів без будь-якої імунізації, як описано у сгіййН5 еї аІ., ЕМВО 3. 12:725-734 (1993). Зрештою, нативні бібліотеки можна також отримати за допомогою синтезу шляхом клонування сегментів нереаранжированого У-гена зі стовбурових клітин із застосуванням праймерів РСБЕ, які містять довільну послідовність, щоб кодувати гіперваріабельні ділянки СОКЗ, та виконати реаранжирування іп міго, як описано у Ноодепроот, 9. Мої. ВіоІ. 227:381-388 (1992). Патентні публікації, у яких описано фагові бібліотеки антитіл людини, включають, наприклад: патент
США Мо 5,750,373 та патентні публікації США МоМо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 та 2009/0002360.
Вважають, що антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек антитіл людини, - це описані у цьому описі антитіла людини або фрагменти антитіл людини. 6. Мультиспецифічні антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла - це моноклональні антитіла, які мають специфічність зв'язування з принаймні двома різними сайтами. У певних варіантах здійснення одна зі специфічностей зв'язування - це специфічність до С5, а інша - специфічність до будь-якого іншого антигену. У певних варіантах здійснення біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами С5. Біспецифічні антитіла можна також застосовувати для локалізації цитотоксичних агентів стосовно клітин, які експресують С5.
Біспецифічні антитіла можна отримати як повнорозмірні антитіла або як фрагменти антитіл.
Способи отримання мультиспецифічних антитіл включають, проте не обмежуються ними, рекомбінантну спільну експресію двох імуноглобулінових пар важкого ланцюга та легкого ланцюга, які мають відмінну специфічність (дивись Міїбієїп апа СцепПо, Маїйге 305:537 (1983)),
УМО 93/08829 та ТгаипесКег еї аі., ЕМВО 3. 10:3655 (1991)), та конструкцію типу "виступ-у- западину" (дивись, наприклад, патент США Мо 5,731,168). Мультиспецифічні антитіла можна також отримати шляхом інженерії ефектів електростатичного регулювання для отримання гетеродимерних Ес-молекул антитіла (М/о 2009/089004А1); шляхом перехресного зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (дивись, наприклад, патент США Мо 4,676,980 та
Вгеппап еї аї., 5сіепсе, 229:81 (1985)); шляхом застосування лейцинової застібки для отримання біспецифічних антитіл (дивись, наприклад, КозіеїІпу еї аї., У). Іттипої. 148(5):1547-1553 (1992)); бо шляхом застосування технології "діатіла" для отримання фрагментів біспецифічних антитіл
(дивись, наприклад, Ноїїпдег еї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90:6444-6448 (1993)); та шляхом застосування одноланцюгових димерів Ем (5сЕм) (дивись, наприклад, Сгибег еї аї.,.). Іттипої. 152:5368 (1994)); та шляхом приготування триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, у
Тий еї аї., У. Іттипої. 147:60 (1991).
У цей опис також включено отримані шляхом побудови антитіла з трьома або більше функціональними антигензв'язувальними сайтами, включаючи "антитіла-восьминоги" ("осіорив апіїродіе5") (дивись, наприклад, О5 2006/0025576).
У цьому описі антитіло або фрагмент також включає "РАБ подвійної дії" (Юца! Асіїпу ЕАБ) або "ОАЕ", що включає антигензв'язувальний сайт, який зв'язується з С5, а також з іншим, відмінним, антигеном (дивись, наприклад, О5 2008/0069820). 7. Варіанти антитіл
У певних варіантах здійснення передбачаються варіанти амінокислотних послідовностей запропонованих у цьому описі антитіл. Наприклад, може бути бажаним покращити афінність зв'язування та/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можна отримати шляхом здійснення відповідних модифікацій нуклеотидної послідовності, яка кодує антитіло, або шляхом синтезу пептидів. Такі модифікації включають, наприклад, делеції з, та/"або вставки в, та/або заміщення залишків у межах амінокислотних послідовностей антитіла. Будь-яку комбінацію делеції, вставки та заміщення можна виконати, щоб отримати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевій конструкції притаманні бажані характеристики, наприклад, зв'язування з антигеном. а. Варіанти заміщень, вставок та делецій
У певних варіантах здійснення пропонуються варіанти антитіла, які мають одне або більше амінокислотних заміщень. Сайти, які представляють інтерес для замісного мутагенезу, включають НМК та ЕК. Консервативні заміщення наведено у Таблиці 1 під заголовком "переважні заміщення". Найбільш суттєві зміни запропоновані у Таблиці 1 під заголовком "типові заміщення", та вони описуються нижче з посиланням на класи амінокислотних бічних ланцюгів. Амінокислотні заміщення можна зробити в антитілі, яке представляє інтерес, та продукти можна піддати скринінгу щодо бажаної активності, наприклад, стосовно збереження / покращення зв'язування з антигеном, зниження імуногенності або покращення АЮСС або СОС.
Коо)
Зо
Таблиця 1
Початковий залишок | Типові заміщення Переважні заміщення
АВ (А) Уаї; Геш; Пе
ЛІВ) Гу5; Оп; Авп
Авп (М) Сп; Ні; Авр, у8; Аг Сів
Ахр (0) Спи; Авп Сян
Суб (с) 5ег; Аїа
Сп (0) Авп; Си Авп ств) ер: Ов
СТУ (0)
Нів (Н) Авп; Сїп; Шу: Аге
Пе Ген: Уаї; Ме; Аа; Рв: норлейцин
Ге (1 норлейцин; Це; Маї; Ме; Да: Рпе
Гу (ЮК) Аге; Сів; Авп
Мем) Ге: Рпе; Пе
Ре (ГТ) Тер; Г.си; Уаї; Пе; Аа; Туг
Рго (Р) зет (5) Тнг ТНг
Тиг (0) Уаї; ет
ПТ Тут: Рпє
Ти Є) Ттр; Ре; ТВ; Бег Ріє
Уа! СУ) Пе; Пец; Ме Ро; Аа; норлейцин Їец
Амінокислоти можна згрупувати згідно із загальними властивостями бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, І еи, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТНг, Азп, Сп; (3) кислотні: Азр, Сім; (4) лужні: Ні, Гуз, Агу; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга:
Су, Рго; та (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ре.
Неконсервативні заміщення будуть передбачати обмін члена одного з цих класів на інший клас.
Один тип варіанта, отриманого внаслідок заміщення, залучає заміщення одного або більше залишків гіперваріабельної ділянки початкового антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Взагалі, отриманий (отримані) варіант (варіанти), вибраний (вибрані) для подальшого дослідження, будуть мати модифікації (наприклад, покращення) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищення афінності, зниження імуногенності) порівняно з початковим антитілом та/або матиме (матимуть) по суті збережені певні біологічні властивості початкового антитіла. Приклад варіанта, отриманого внаслідок заміщення, - це антитіло зі зрілою афінністю, яке можна отримати зручним способом, наприклад, застосовуючи способи визрівання афінності на основі фагового дисплея, такі як способи, описані у цьому описі. Стисло кажучи, один або більше залишків НМЕ мутують, та варіанти антитіл відображаються на оболонці фага, та їх піддають скринінгу стосовно певної біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування).
Зміни (наприклад, заміщення) можна здійснювати у НМК, наприклад, щоб покращити афінність антитіла. Такі зміни можна здійснювати у варіативних точках ("поївзроїв") НМК, тобто на залишках, які кодуються кодонами, які зазнають мутації з високою частотою під час процесу соматичного визрівання (дивись, наприклад, Спожмапигу, Меїпоаз Мої. ВіоїЇ. 207:179-196 (2008)), та/або на залишках, які контактують з антигеном, при цьому отриманий варіант МН або МІ тестується щодо афінності зв'язування. Визрівання афінності внаслідок побудови та повторного відбору з вторинних бібліотек описано, наприклад, у Ноодепроот есеї аї!., у Мешйоа5 іп МоїІесшаг
Віооду 178:1-37 (О'Віієп еї аїЇ.,, ед., Нитап Ргеб55, Тоїожа, МУ, (2001). У деяких варіантах здійснення визрівання афінності роблять різноманітні зміни у мінливих генах, вибраних для визрівання, за будь-яким з численних способів (наприклад, РСК, що припускає помилки, переміщування ланцюгів або олігонуклеотид-спрямований мутагенез). Потім створюється вторинна бібліотека. Цю бібліотеку потім піддають скринінгу, щоб ідентифікувати варіанти антитіла з бажаною афінністю. У іншому способі досягнення різноманітності застосовуються
НМВ-спрямовані підходи, при яких рандомізуються декілька залишків НМК (наприклад, 4-6 залишків одночасно). Залишки НМК, що залучаються у зв'язування з антигеном, можна специфічно ідентифікувати, наприклад, застосовуючи аланін-скануючий мутагенез або моделювання. Зокрема, СОК-НЗ та СОК-І З часто вибирають мішенями.
У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції можуть здійснюватися у межах однієї або більше НМЕ, доки такі зміни суттєво не зменшують спроможність антитіла зв'язуватися з антигеном. Наприклад, консервативні зміни (наприклад, консервативні заміщення, як запропоновано у цьому описі), які суттєво не зменшують афінність зв'язування, можна здійснити у НМЕК. Такі зміни можуть бути, наприклад, у НМЕК поза залишків, що контактують з антигеном. У певних варіантах здійснення варіантних послідовностей МН та Мі, запропонованих вище, кожна з НУК. або не змінена, або містить не більш ніж одне, два або три амінокислотні заміщення.
Корисний спосіб ідентифікації залишків або ділянок антитіла, які можуть бути мішенями мутагенезу, називається "аланін-скануючий мутагенез", як описано у Сиппіпдпат, зЗсієепсе 244:1081-1085 (1989). У цьому способі залишок або група залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, таких як аго, азр, пів, Іу5 та дію) ідентифікують та заміщують нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити, чи здійснюється вплив на взаємодію антитіла з антигеном. Подальші заміщення можна зробити на амінокислотних позиціях, демонструючи функціональну чутливість до початкових заміщень. Альтернативно або додатково, за кристалічною структурою комплексу антиген-антитіло ідентифікують точки контакту між антитілом та антигеном. Такі контактні залишки або сусідні залишки можуть бути мішенями, або їх можна видалити як кандидатів на заміщення. Варіанти можна піддати скринінгу, щоб визначити, чи містять вони бажані
Зо властивості.
Вставки амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбоксил-кінцеві злиття, довжина яких змінюється у діапазоні від одного залишку до поліпептидів, які містять сто або більше залишків, а також вставки в послідовності одного або численних амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком.
Інші варіанти вставок молекули антитіла включають злиття М- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, АОЕРТ) або поліпептидом, який подовжує напівжиття антитіла у сироватці. р. Варіанти глікозилування
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому винаході антитіло змінюють, щоб підвищити або знизити ступінь, до якого антитіло глікозиловане. Додавання сайтів глікозилування до антитіла або їх делецію можна традиційно виконати шляхом зміни амінокислотної послідовності, так щоб утворити або видалити один або більше сайтів глікозилування.
Там, де антитіло включає Ес-ділянку, можна змінити приєднаний до неї вуглевод. Нативні антитіла, що виробляються клітинами ссавців, зазвичай включають розгалужений 2-антенарний олігосахарид, який зазвичай приєднується шляхом М-зшивання з А5зп297 домену СН2 Ес- ділянки. Дивись, наприклад, УМгідНні еї аїЇ.,, ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Цей олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СІСМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, приєднані до СІСМАс у "стовбурі" структури 2-антенарного олігосахариду. У деяких варіантах здійснення модифікації олігосахариду в антитілі винаходу можна виконати для того, щоб утворити варіанти антитіла з певними покращеними властивостями.
В одному варіанті здійснення пропонуються варіанти антитіла, які мають вуглеводневу структуру, якій бракує фукози, приєднаної (безпосередньо або опосередковано) до Ес-ділянки.
Наприклад, кількість фукози у такому антитілі може становити від 1 95 до 80 90, від 1 95 до 65 95, від 595 до 6595 або від 2095 до 40 95. Кількість фукози визначається шляхом розрахунку середньої кількості фукози у межах цукрового ланцюга на А5п297 відносно суми усіх глікоструктур (наприклад, складних, гібридних та високоманозних структур), приєднаних до
Азп297, що вимірюється за допомогою мас-спектроскопії МА! 0І-ТОЕ, як описано, наприклад, у бо УМО 2008/077546. Азп297 позначає аспарагіновий залишок, розташований на приблизно позиції
297 у Ес-ділянці (Європейська номенклатура залишків Ес-ділянок); проте, А5п297 може також розташовуватися приблизно на «/- З амінокислоти праворуч або ліворуч від позиції 297, тобто, між позиціями 294 та 300, що є наслідком незначних варіацій послідовностей в антитілах. Такі варіанти фукозилування можуть мати покращену функцію АОСС. Дивись, наприклад, патентні публікації США МоМео 05 2003/0157108 (Ргевзіа, І); 005 2004/0093621 (Куосула Накко Кодуо Со.,
Ма). Приклади публікацій, пов'язаних з "дефукозилованими" або "фукоза-дефіцієнтними" варіантами антитіла включають: 05 2003/0157108; УМО 2000/61739; УМО 2001/29246; 05 2003/0115614; 05 2002/0164328; 05 2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 05 2004/0110282; 05 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586;. МО 2005/035778; МО 2005/053742; МО 2002/031140; ОКалакКі єї аїЇ., У. Мої. Віої. 336:11239-1249 (2004); Матапе-ОппикКі еї аї., Віоїесп. Віоепд. 87:614 (2004). Приклади клітинних ліній, спроможних виробляти дефукозиловані антитіла, включають клітини Гес13 СНО з дефіцитом фукозилування білка (КірКа еї аї., Агсп. Віоспет. Віорпуб5. 249:533-545 (1986); опублікована патентна заявка США 2003/0157108, Ргевіа, І; та МО 2004/056312, Адатзв еї аї., особливо у
Прикладі 11), та нокаутні клітинні лінії, такі як клітини СНО, що є нокаутними щодо гену альфа- 1,6-фукозилтрансферази, РОТ8, (дивись, наприклад, Матапе-ОНпикі еї аї., Віоїесн. Віоепд. 87:614 (2004); Капаа еї а!., Віотесппої!. Віоепа. 94(4):680-688 (2006); та ММО 2003/085107).
Далі пропонуються варіанти антитіл з розділеними навпіл олігосахаридами, наприклад, олігосахаридами, у яких 2-антенарний олігосахарид, приєднаний до Ес-ділянки антитіла, розділяється навпіл М-ацетилглюкозаміном ((ІСМАс). Такі варіанти антитіл можуть мати зменшене фукозилування та/або покращену функцію АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описано, наприклад, у МО 2003/011878 (еап-Маїгеї еї аіІ.); патенті США Мо 6,602,684 (Штапа еї а!) та у 005 2005/0123546 (тапа еї аіІ.). Також пропонуються варіанти антитіл з принаймні одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до Ес-ділянки. Такі варіанти антитіл можуть мати покращену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описано, наприклад, у МО 1997/30087 (Рагеї еї аІ.); УМО 1998/58964 (Каїсй, 5.) та УМО 1999/22764 (Каїсм, 5.). с. Варіанти Ес-ділянок
У певних варіантах здійснення одну або більше амінокислотних модифікацій можна зробити у Ес-ділянці запропонованого у цьому описі антитіла, тим самим генеруючи варіант Ес-ділянки.
Варіант Ес-ділянки може включати послідовність Ес-ділянки людини (наприклад, Ес-ділянки
І9С1, Ідс2, ІдО3 або ІдО4 людини), яка має амінокислотну модифікацію (наприклад, заміщення) на одній або більше амінокислотних позиціях.
У певних варіантах здійснення винахід передбачає варіант антитіла, якому притаманні деякі, але не всі ефекторні функції, які роблять його бажаним кандидатом для застосування, при якому напівжиття антитіла іп мімо є важливим, при цьому певні ефекторні функції (такі як СОС та
АОС) є необов'язковими або шкідливими. Аналізи цитотоксичності іп міго та/або іп ммо, можна виконувати, щоб підтвердити зниження/виснаження активності СОС та/"або АОСС. Наприклад, аналізи зв'язування з рецептором Ес (ЕСК) можна виконувати, щоб переконатися, що антитілу бракує зв'язування з Ео-гамма-К (внаслідок цього ймовірна недостатня активність АЮОСС), але воно зберігає спроможність зв'язування з ЕсКп. Первинні клітини для опосередковування
АОСС, клітини МК, експресують тільки Ес-гамма-КІ, тоді як моноцити експресують Ес-гамма-ВІ,
Ес-гамма-КІЇ! та Ес-гамма-КІЇ. Експресію РсК на кровотворних клітинах узагальнено у Таблиці З на сторінці 464 в статті Камеїсп апа Кіпеї Аппи. Кем. ІпттипоїЇї. 9:457-492 (1991).
Необмежувальні приклади аналізів іп міго для оцінювання активності АЮОСС молекули, яка представляє інтерес, описано у патенті США Мо 5,500,362 (дивись, наприклад, Неїїбігот еї аї.,
Ргос. Маї! Асад. сі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) та Неїїбігот еї аї., Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОБА 82:1499-1502 (1985); у патенті США Мо 5,821,337 (дивись Вгиддетапп еї аї., У). Ехр. Меа. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно, можна застосовувати способи нерадіоактивних аналізів (дивись, наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТ1"М для проточної цитометрії (СеПТесппоїоду, Іпс. Мошипіаіїп Міем/, СА); та нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуїоТох 96 (зареєстрована торговельна марка) (Рготеда, Мадізоп, УМІ)). Корисні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеари периферійної крові (РВМС) та клітини-природні кілери (МК). Альтернативно або додатково, активність АЮОСС молекули, що представляє інтерес, можна оцінювати іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, так, як описано у Сіупез еї аї., Ргос.
Маг! Асад. 5сі. ОБА 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування з С1д можна також здійснювати, щоб підтвердити, що антитіло не спроможне зв'язуватися з С1д, та, як наслідок, йому бракує активності СОС. Дивись, наприклад, ЕГІ5А зі зв'язуванням з С1д та СЗс у УМО 2006/029879 та
МО 2005/100402. Щоб оцінити активацію комплементу, можна виконувати аналіз СОС (дивись, наприклад, Салапо-Запіого еї аї., У. Іттипої. Меїйоде 202:163 (1996); Стада еї аї!., Віоса бо 101:1045-1052 (2003); та Сгадд еї а!., Віоса 103:2738-2743 (2004)). Визначення зв'язування з
ЕсКп та кліренсу/напівжиття іп мімо можна також виконувати, застосовуючи відомі у цій галузі способи (дивись, наприклад, Реїкома еї аї., Іпе. Ітттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла із заміщенням одного або більше залишків Ес-ділянки: 238, 265, 269, 270, 297, 327 та 329 (патент США Мо 6,737,056). Такі мутанти Ес включають мутанти Ес із заміщеннями на двох або більше з наступних амінокислотних позицій: 265, 269, 270, 297 та 327, включаючи, так званий, мутант Ес "САМА" із заміщенням залишків 265 та 297 на аланін (патент США Мо 7,332,581).
Описані певні варіанти антитіл із покращеним або ослабленим зв'язуванням з ЕсКп. (Дивись, наприклад, патент США Мо 6,737,056; МО 2004/056312 та ЗПпівїд»5 еї аї., У. ВіоІ. Спет. 9(2): 6591-6604 (2001)).
У певних варіантах здійснення варіант антитіла включає Ес-ділянку з одним або більше амінокислотними заміщеннями, які покращують АЮСС, наприклад, заміщеннями на позиціях 298, 333 та/або 334 Рсо-ділянки (Європейська номенклатура залишків).
У деяких варіантах здійснення у Ес-ділянці здійснюють зміни, які призводять до зміни (тобто покращення або ослаблення) зв'язування з С1д та/або комплементзалежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано у патенті США Мо 6,194,551, УМО 1999/51642 та Ідихзодіє еї аї.,».
Іттипої. 164:4178-4184 (2000).
Антитіла з подовженим напівжиттям та покращеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Ес (ЕсКп), який відповідає за перенесення материнських дО плоду (сиуег еї аї., ).
Іттипої. 117:587 (1976) та Кіт еї аї., у. Іттипої. 24:249 (1994)), описуються у 052005/0014934 (Ніпоп еї а!.). Ці антитіла включають Ес-ділянку з одним або більше заміщеннями в ній, які покращують зв'язування Ес-ділянки з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають варіанти із заміщеннями на одному або більше залишках Ес-ділянки: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, із заміщенням залишку 434
Ес-ділянки (патент США Мо 7,371,826).
Дивись також Юипсап, Маїште 322:738-40 (1988); патент США Мо 5,648,260; патент США
Мо 5,624,821 та УМО 1994/29351, які розглядають інші приклади варіантів Ес-ділянки. а. Варіанти антитіл, сконструйовані з використанням цистеїну
У певних варіантах здійснення може бути бажаним створити антитіла, сконструйовані з використанням цистеїну, наприклад, "піомМАБб", у яких один або більше залишків антитіла заміщені залишками цистеїну. В особливих варіантах здійснення заміщення залишків здійснюють на доступних сайтах антитіла. Внаслідок заміщення цих залишків цистеїном реакційноздатні тіолові групи розташовуються на доступних сайтах антитіла, та їх можна застосовувати, щоб з'єднати антитіло з іншими складовими, такими як складові-ліки або складові "лінкер-ліки", щоб утворити імунокон'югат, як описано далі у цьому описі. У певних варіантах здійснення будь-який один або більше з наступних залишків можна замістити цистеїном: М205 (номенклатура Кебота) Ес-ділянки легкого ланцюга; А118 (Європейська номенклатура) Ес-ділянки важкого ланцюга та 5400 (Європейська номенклатура) Ес-ділянки важкого ланцюга. Антитіла, сконструйовані з використанням цистеїну, можна отримувати, як описано, наприклад, у патенті США Ко 7,521,541. е. Похідні антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло можна далі модифікувати так, щоб воно містило додаткові небілковоподібні складові, які відомі у цій галузі та легко доступні. Складові, придатні для отримання похідних антитіл, включають, проте не обмежуються ними, водорозчинні полімери. Необмежувальні приклади водорозчинних полімерів включають, проте не обмежуються ними, поліетиленгліколь (ПЕГ), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену і малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери), та декстран або полі(п-вінілпіролідон)полієтиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімери поліпропілен оксиду/етиленоксиду, поліоксиетиловані поліоли (наприклад, гліцерини), полівініловий спирт та їх суміші. Поліетиленгліколь-пропіональдегід може мати переваги під час виробництва завдяки його стійкості у воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу, та він може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до антитіла, може різнитися, та, якщо приєднаний більш ніж один полімер, вони можуть бути однаковими або різними молекулами. Зазвичай, кількість та/або тип полімерів, які застосовуються для отримання похідних, можна визначити на основі міркувань стосовно властивостей, які включають, проте не обмежуються ними, особливі властивості або функції антитіла, призначеного для покращення, щоб похідне антитіло застосовувалося під час терапії за 60 визначених умов, тощо.
В іншому варіанті здійснення пропонуються кон'югати антитіла та небілковоподібної складової, яку можна вибірково нагрівати, піддавши опромінюванню. В одному варіанті здійснення небілковоподібна складова - це вуглецева нанотрубка (Кат еї аї., Ргос. Маї). Асай.
Зсі. ОБА 102:11600-11605 (2005)). Опромінювання може мати будь-яку довжину хвилі, та воно має, проте не обмежується нею, довжину хвилі, яка не є шкідливою для звичайних клітин, але нагріває небілковоподібну складову до температури, при якій клітини, наближені до небілковоподібної складової антитіла, гинуть.
В. Рекомбінантні способи та композиції
Антитіла можна отримати, застосовуючи рекомбінантні способи та композиції, наприклад, як описано у патенті США Мо 4,816,567. В одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти С5, описане у цьому описі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, яка включає Мі антитіла, та/або амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла (наприклад, легкий та/або важкий ланцюги антитіла). У подальшому варіанті здійснення пропонуються один або більше векторів (наприклад, вектори експресії), які включають таку нуклеїнову кислоту. У подальшому варіанті здійснення пропонується клітина-хазяїн, яка містить таку нуклеїнову кислоту. В одному такому варіанті здійснення клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована ними): (1) вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає Мі. антитіла, та амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла, або (2) перший вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає Мі. антитіла, та другий вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн - це еукаріотична клітина, наприклад, клітина яєчника китайського хом'яка (СНО), або лімфоїдна клітина (наприклад, клітина МО, МБО, 5рг20). В одному варіанті здійснення пропонується спосіб отримання антитіла проти С5, де спосіб включає культивування клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, як запропоновано вище, в умовах, придатних для експресії антитіла, та, довільно, отримання антитіла від клітини-хазяїна (або культурного середовища клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного отримання антитіла проти С5 нуклеїнову кислоту, яка кодує це антитіло, наприклад, як описано вище, виділяють та вставляють в один або більше векторів для
Зо подальшого клонування та/або експресії у клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту можна легко виділити та секвенувати, застосовуючи традиційні способи (наприклад, застосовуючи олінуклеотидні зонди, які спроможні специфічно зв'язуватися з генами, які кодують важкий та легкий ланцюги антитіла).
Придатні клітини-хазяїни для клонування або експресії векторів, що кодують антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані у цьому описі. Наприклад, антитіла можна виробляти в бактеріях, особливо, коли глікозилування та ефекторні функції Ес не є потрібними. Стосовно експресії фрагментів антитіла та поліпептидів в бактеріях дивись, наприклад, патенти США МоМо 5,648,237, 5,789,199 та 5,840,523. (Дивись також Спаптшоп,
Метод іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, ед., Нитапа Ргезв, Тоїоула, МУ, 2003), рр. 245- 254, де описується експресія фрагментів антитіла у Е. соїї). Після експресії антитіло можна виділити з бактеріальноклітинної пасти у вигляді розчинної фракції та далі очистити.
Окрім прокаріотичних, еукаріотичні мікроби, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, є придатними хазяїнами для клонування або експресії векторами, що кодують антитіло, та вони включають штами грибів та дріжджів, чиї каскади глікозилування "гуманізували", внаслідок чого отримують антитіло з частковим або повним профілем людського глікозилування. Дивись
Сегпдгов5в, Маї. Віоїесн. 22:1409-1414 (2004), та | і еї аї., Маї. Віоїтесі. 24:210-215 (2006).
Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла також походять від багатоклітинних організмів (безхребетних та хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин та комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можна застосовувати у зв'язку з клітинами комах, особливо для трансфекції клітин 5родоріега
Тгидірегаа.
Як хазяїнів можна також застосовувати культури рослинних клітин. Дивись, наприклад, патенти США МоМо 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 та 6,417,429 (де описано технологію РІ АМТІВООІЕ5'"М для отримання антитіл у трансгенних рослинах).
Як хазяїнів можна також застосовувати клітини хребетних. Наприклад, можна застосовувати клітинні лінії ссавців, які адаптовані до росту у суспензії. Інші приклади корисних ліній клітин- хазяїнів ссавців - це лінія СМ1 нирки мавпи, трансформована за допомогою 5М40 (СО5-7); лінія ембріональної нирки людини (293 або клітини 293, як описано, наприклад, у сгапат еї аї.,.
Сеп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК); мишачі клітини Сертолі бо (клітини ТМА4, як описано, наприклад, у Маїпег, ВіоїЇ. Кергоа. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мартишки (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки сірого щура (ВК.
ЗА); клітини легеня людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 2); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТКІ, як описано, наприклад, у МаїПег еї аї., Аппаї!5 М.У. Асад.
Зсі. 383:44-68 (1982); клітини МЕС 5 та клітини Е54. Інші корисні лінії клітин-хазяїнів ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи клітини ОНЕЕСНО (пай еї аїІ,, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 77:4216 (1980)); та мієломні клітинні лінії, такі як МО, М50О та
Зрг/0. Для огляду певних ліній клітин-хазяїнів ссавців, придатних для виробництва антитіла, дивись, наприклад, Уалакі апа Уми, Метод іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, єд., Нитапа
Ргез55, Тоїома, МУ), рр. 255-268 (2003).
Поліклональні антитіла переважно утворюються у тваринах внаслідок численних підшкірних (5с) або внутрішньочеревних (ір) ін'єкцій відповідного антигену та ад'юванту. Може бути корисним кон'югувати відповідний антиген з білком, який є імуногенним для того виду тварин, що підлягає імунізації, наприклад, з гемоціаніном лімфи равлика, сироватковим альбуміном, бичачим тироглобуліном або соєвим інгібітором трипсину, застосовуючи при цьому біфункціональний або дериватизуючий агент, наприклад, малеімідобензоїл- сульфосукцинімідний естер (кон'югування через цистеїнові залишки), М-гідроксисукцинімід (через лізинові залишки), глютаральдегід, бурштиновий ангідрид, ЗОСІ» або В'МАС-МЕ, де В та
В" - це різні алкільні групи.
Тварин (зазвичай ссавців, які не є людиною) імунізують проти антигену, імуногенних кон'югатів або похідних шляхом поєднання 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кролів або мишей, відповідно) з З об'ємами повного ад'юванту Фрейнда та введення цього розчину шляхом крізьшкірної ін'єкції в численних місцях. За один місяць після цього тварин повторно стимулюють від 1/5 до 1/10 від оригінальної кількості пептиду або кон'югату у повному ад'юванті
Фрейнда шляхом підшкірної ін'єкції в численних місцях. За 7-14 днів після цього у тварин беруть кров, а сироватку аналізують щодо титру антитіла. Тварин стимулюють, поки титр не стабілізується. Переважно тварину стимулюють кон'югатом такого ж самого антигену, проте кон'югованого з відмінним білком та/або через інший реагент перехресного зшивання. Кон'югати можна також отримати у культурі рекомбінантних клітин як білки злиття. Крім того, агенти, які
Зо сприяють агрегації, такі як галун, придатним чином застосовуються для підсилення імунної реакції.
Моноклональні антитіла отримують з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, які складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій та/або посттрансляційних модифікацій (наприклад, ізомеризації, амідування), які можуть бути присутніми у незначних кількостях. Отже, термін "моноклональне" вказує на такий характер антитіла, коли воно не є сумішшю різних антитіл.
Наприклад, моноклональні антитіла можна отримати, застосовуючи спосіб гібридом, який вперше було описано КопПіег еї аї., Маїшге 256(5517):495-497 (1975). У способі гібридом мишу або іншу придатну тварину-хазяїна, таку як хом'як, імунізують, як описано вище у цьому описі, щоб утворити лімфоцити, які або виробляють, або спроможні виробляти антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, який застосовується для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можна імунізувати іп міїго.
Імунізуючий агент буде зазвичай включати антигенний білок або його варіант злиття.
Взагалі, застосовуються будь-які з лімфоцитів периферійної крові (РВІ), якщо бажаними є клітини, які походять від людини, або застосовуються клітини селезінки або клітини лімфатичних вузлів, якщо бажаними є джерела-ссавці, які не є людьми. Лімфоцити потім зливаються з безсмертними клітинними лініями із застосуванням придатного для злиття агенту, такого як поліетиленгліколь, щоб утворити гібридомну клітину (Содіпд, Мопосіопа! Апііродієв5:
Рііпсірієз апа Ргасіїсе, Асадетіс Ргев5 (1986), рр. 59-103).
Безсмертні клітинні лінії - це зазвичай трансформовані клітини ссавців, зокрема, мієломні клітини, які походять від гризунів, великої рогатої худоби та людей. Зазвичай, застосовуються лінії мієломних клітин щурів або мишей. Отримані в такий спосіб гібридомні клітини сіють та вирощують у придатному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або більше речовин, які інгібують ріст або виживання незлитих початкових мієломних клітин. Наприклад, якщо початковим мієломним клітинам бракує ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (НСОРКТ або НРКТ), то культуральне середовище для гібридом зазвичай включатиме гіпоксантин, аміноптерин та тимідин (середовище НАТ), які є речовинами, що попереджають ріст клітин з дефіцитом НОРКТ.
Переважні безсмертні мієломні клітини - це клітини, які ефективно зливаються, підтримують бо стійке виробництво антитіла на високому рівні вибраними клітинами, що виробляють антитіло,
Зб та які є чутливими до середовища, такого як середовище НАТ. Серед них переважними є мієломні лінії мишей, наприклад, які походять від пухлин мишей МОРС-21 та МРО-11, доступних від ЗаїЇК Іпзійше Сеї! Оібігібшщіоп Сепіег, зап Оіедо, Саїйогпіа О5А, та клітин 5Р-2 (та їх похідних, наприклад, Х63-А98-653), доступних від Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп, Мапаззав, Мігдіпіа
О5А. Лінії мієломних клітин людини та гетеромієломних клітин миші-людини для виробництва моноклональних антитіл людини також було описано (Кобог еї аї. У). Іттипої. 133(6):3001-3005 (1984); Вгодеиг єї аї., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіоп Тесппіднез апа Арріїсайоп5, Магсе! ОеккКег,
Іпс., Мем ХОІК, рр. 51-63 (1987)).
Культуральне середовище, у якому зростають гібридомні клітини, аналізується щодо виробництва моноклональних антитіл проти антигену. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, вироблених гібридомними клітинами, визначають за допомогою імунопреципітаційного аналізу або за допомогою аналізу зв'язування іп місто, такого як радіоїмунологічний аналіз (КІА) або твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА). Такі способи та аналізи відомі у цій галузі. Наприклад, афінність зв'язування можна визначити за допомогою аналізу Скетчарда, див. Мипзоп, Апаї. Віоспет. 107(1):220-239 (1980).
Після ідентифікації гібридомних клітин, які виробляють антитіла бажаної специфічності, афінності та/або активності, ці клони можна субклонувати за допомогою способів обмежувального розведення та вирощувати за стандартними способами (Содіпд, вище).
Придатні культуральні середовища для цієї мети включають, наприклад, середовище О-МЕМ або ЕРМІ-1640. Крім того, гібридомні клітини можна вирощувати іп мімо як пухлини у ссавця.
Моноклональні антитіла, які виділяються субклонами, придатним способом виділяють з культурального середовища, рідини асцитів або сироватки за допомогою традиційних способів очищення імуноглобуліну, таких як, наприклад, хроматографія на сефарозі з білком А, хроматографія на гідроксіапатиті, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія.
Антитіла можна отримати шляхом імунізації відповідної тварини-хазяїна проти антигену. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає повнорозмірний С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає бета-ланцюг (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає домен Ме1-Ма2 (5ЕО ІО МО: 43) бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає домен МО1 (ЗЕО ІЮ МО: 41) бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 19 до 180 бета- ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 33 до 124 бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110 бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає фрагмент бета-ланцюга С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з Тпг47, СІц48, АІа49, Рпеб50,
А5р5б1, АІа52, ТАг53, І уз57, Нібз70, Ма171, Ніз72, Зег/4, СІи76, МаІ107, Зег108, І уз109 та Нізх110.
В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає фрагмент бета-ланцюга С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з Сіш48, А5р51,
Ніз70, Ніз72, І уб109 та Нібх110. У цей винахід також включено антитіла, отримані внаслідок імунізації тварини проти антигену. Ці антитіла можуть включати будь-які ознаки, окремо або у комбінації, як описано вище у розділі "Приклади антитіл проти С5".
С. Аналізи
Запропоновані у цьому описі антитіла проти С5 можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або характеризувати щодо їх фізичних/хімічних властивостей та/або різних видів біологічної активності за допомогою різноманітних аналізів, відомих у галузі. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
В одному аспекті антитіло винаходу тестують щодо його активності зв'язування з антигеном, наприклад, за допомогою відомих способів, таких як ЕГІЗА, вестерн-блотинг, ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) тощо.
В іншому аспекті конкурентні аналізи можна застосовувати для того, щоб ідентифікувати антитіло, яке конкурує за зв'язування з С5 з антитілом проти С5, описаним у цьому описі. У певних варіантах здійснення, коли таке конкуруюче антитіло присутнє у надмірній кількості, воно блокує (наприклад, ослаблює) зв'язування посилального антитіла з С5 принаймні на 10 95, 15 то, 20 зо, 25 зо, Зо то, 35 то, 40 то, 45 то, 50 Зо, 55 У, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 Уо або більше. У деяких випадках зв'язування інгібується принаймні на 80 95, 85 95, 90 95, 95 956 або більше. У певних варіантах здійснення таке конкуруюче антитіло зв'язується з таким самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), який зв'язується антитілом проти С5, бо описаним у цьому описі (наприклад, антитілом проти С5, наведеним у Таблиці 2). Докладні приклади способів картування епітопу, з яким зв'язується антитіло, наведено у Моїті5, "Ерйоре
Марріпд Ргоїосої5, " в Меїйоа5 іп МоїІесшаг ВіоІоду мої. 66 (Нитапа Ргез5, Тоїсоу/а, МУ) (1996).
У прикладі конкурентного аналізу іммобілізований С5 інкубується у розчині, який містить перше мічене (посилальне) антитіло, яке зв'язується з С5, та друге немічене антитіло, яке тестується щодо його спроможності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з С5. Друге антитіло може бути присутнім у надосадовій рідині гібридоми. Як контрольний, іммобілізований
С5 інкубується у розчині, який включає перше мічене антитіло, проте не включає друге немічене антитіло. Після інкубування в умовах, які сприяють зв'язуванню першого антитіла з С5, решта незв'язаного антитіла видаляється та вимірюється кількість міток, асоційованих із іммобілізованим С5. Якщо кількість міток, асоційованих з іммобілізованим С5, є суттєво зниженою у випробовуваному зразку порівняно з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з С5. Дивись Нагіож апа І апе,
Апіїродієв: А І арогаїогу Мапиаї! сп.14 (Соїд Зргіпуд Нагбог І арогаїогу, Со 5ргіпд Набог, МУ) (1988).
В іншому прикладі конкурентного аналізу застосовується аналіз ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) для визначення спроможності випробовуваного антитіла проти С5 конкурувати за зв'язування з С5 з другим (посилальним) антитілом проти С5. У подальшому аспекті, у якому прилад ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) (наприклад, ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) 3000) застосовується згідно з рекомендаціями виробника, білок С5 захоплюється на чип СМ5 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) за допомогою стандартного відомого у галузі способу для того, щоб отримати поверхню з нанесеним С5.
Зазвичай 200-800 резонансних одиниць С5 зчіплюються з чипом (це така кількість, яка дозволяє легко вимірювати рівні зв'язування, але яку можна легко насичити при концентраціях випробовуваного антитіла, що застосовуються). Два антитіла (тобто, випробовуване та посилальне антитіла), які слід оцінювати стосовно їх спроможності конкурувати одне з одним, змішують при молярному співвідношенні 1:11 сайтів зв'язування у придатному буфері, щоб утворити суміш, що тестується. Коли концентрації розраховують на основі сайту зв'язування, тоді вважають, що молекулярна маса випробовуваного або посилального антитіла є загальною молекулярною масою відповідного антитіла, поділеною на кількість сайтів зв'язування з С5 на
Зо антитілі. Концентрація кожного антитіла (тобто, випробовуваного та посилального антитіл) у суміші, що тестується, мусить бути достатньо високою, щоб легко насичити сайти зв'язування для цього антитіла на молекулах С5, захоплених на чипі ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Випробовуване та посилальне антитіла у суміші мають однакову молярну концентрацію (на основі зв'язування), яка зазвичай становить від 1,00 до 1,5 мікромоль (на основі сайту 35 зв'язування). Також готують окремі розчини, які містять тільки випробовуване антитіло та тільки посилальне антитіло. Випробовуване антитіло та посилальне антитіло у цих розчинах мають бути в однаковому буфері та мати однакову концентрацію та однакові умови з умовами для суміші, що тестується. Суміш, яка тестується та яка містить випробовуване антитіло та посилальне антитіло, пропускається над чипом ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) з 40 нанесеним С5, та реєструється загальна кількість зв'язувань. Чип потім обробляють таким чином, щоб видалити зв'язане випробовуване антитіло або посилальне антитіло, не пошкоджуючи при цьому зв'язаний з чипом С5. Зазвичай, це виконується шляхом обробки чипа мМ НОСІ протягом 60 секунд. Розчин тільки випробовуваного антитіла потім пропускають над поверхнею з нанесеним С5 та реєструють кількість зв'язувань. Чип знов обробляють так, щоб видалити усе зв'язане антитіло, не пошкоджуючи при цьому зв'язаний з чипом С5. Розчин тільки посилального антитіла потім пропускають над поверхнею з нанесеним С5 та реєструють кількість зв'язувань. Потім розраховують максимальне теоретичне зв'язування суміші випробовуваного антитіла та посилального антитіла, та це є сумою зв'язування кожного антитіла (тобто, випробовуваного та посилального), коли їх окремо пропускають над поверхнею з С5. Якщо дійсно зареєстроване зв'язування суміші є меншим, ніж цей теоретичний максимум, то випробовуване антитіло та посилальне антитіло конкурують один з одним за зв'язування з
С5. Отже, взагалі, конкуруюче випробовуване антитіло проти С5 - це антитіло, яке буде зв'язуватися з С5 у вищеописаному аналізі блокування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), так що під час аналізу та у присутності посилального антитіла проти С5 зареєстроване зв'язування становить від 80 95 до 0,1 95 (наприклад, між 80 95 » до 4 95) від максимального теоретичного зв'язування, специфічно від 75595 до 0,195 (наприклад, 7595 - 4905) від максимального теоретичного зв'язування та більш специфічно від 70 95 до 0,1 95 (наприклад, 7095 - 45905) від максимального теоретичного зв'язування (як визначається вище) випробовуваного антитіла та посилального антитіла у комбінації. бо У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі, вибрану з антитіла СЕАОЗ341 та СЕАОЗ330. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, вибраним з:
СЕАО538, СЕАО5О1, СЕАО599, СЕАОЗ307, СЕАОЗ366, СЕАОбЄ75 та СЕАОб672. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕАОЗ329. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕАОб666.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі антитіла СЕАОЗО5 або 3051 05.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з:
СЕАО538, СЕАО5О1, СЕАО599, СЕАОЗ307, СЕАОЗ6б6, СРАОб675 та СЕАОб6Є72. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕАОб666б. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі антитіла
СЕАОЗО05 або 305І 05. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 26, або МН за 5ЕО ІЮО МО: 21 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 25. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за ЗЕО ІЮ МО: 5 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 15; (5) МН за 5ЗЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 14; (с) МН зазбЕоіІЮО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІО МО: 16; (4) МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за ЗЕО ІЮ МО: 12; (є) МН за ЗЕО ІЮ МО: З та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 13; (3 МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІО МО: 11; (9) УН за ЗЕО ІЮО МО: 9 та МІ за ЗЕО ІЮО МО: 19; (п) МН за ЗЕО ІО МО: 7 та МІ за ЗЕО ІО МО: 17; та (і)
МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО І МО: 18. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає МН за 5ЕО ІЮ МО: 23 та МІ за 5ЕО ІЮ МО:
Зо 27. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за БЕО ІЮ МО: 17.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 11; (Б) МН за 5ЕО ІО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІО МО: 26; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 21 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 25; (9) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за ЗЕО ІЮ МО: 15; (є) МН за ЗЕО ІО МО: 4 та МІ за ЗЕО
ІО МО: 14; () МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 16; (9) МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за ЗЕО
ІО МО: 12; (п) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; (І) МН за 5ЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 19; () МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 17; (К) МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 18; (Ї) МН за 5ЕО ІЮО МО: 23 та МІ. за 5ЕО ІО МО: 27; та (т) МН за 5ЕО ІО МО: 10 та МІ. за
ЗЕО І МО: 20.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з (а) МН за 5ЕО ІЮО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 26; (В) МН за 5ЕО ІО МО: 21 та МІ за 5ЕО ІО МО: 25; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ. за 5ЕО ІЮ
МО: 15; (8) МН за ЗЕО ІЮО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІО МО: 14; (е) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за ЗЕО ІЮ
МО: 16; () МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 12; (9) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 13; (п) МН за 5ЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЕО ІО МО: 19; (ї) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 17; () МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 18; (К) МН за 5ЕО ІО МО: 23 та МІ за 5ЕО І
МО: 27.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та М, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО І МО: 11, або МН за ЗЕО ІЮО МО: 10 та МІ за 5ЕО І МО: 20.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІО МО: 11; (5) МН за ЗЕО ІО МО: 5 та МІ за ЗЕО ІЮ МО: 15; (с) МН за ЗЕО ІЮ МО: 4 та МІ за БЕО ІЮО МО: 14; (4) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за ЗЕО ІЮ МО: 16; (є) МН за ЗЕО І МО: 2 та МІ за ЗЕО ІЮ МО: 12; (3 МН за ЗЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 13; (9) МН за ЗЕО ІЮ МО: 9 та Мі за ЗЕО ІЮ МО: 19; (п) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІО МО: 17; () МН за ЗЕО ІО МО: 8 60 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 18; та () МН за 5ЕО ІО МО: 10 та МІ за 5ЕО ІО МО: 20. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за ЗЕО ІО МО: 5 та Мі за 5ЕО ІО МО: 15; (Б) МН за
ЗЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІО МО: 14; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІО МО: 16; (а) МН за
ЗЕО ІО МО: 2 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 12; (є) МН за 5ЕО ІЮО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; () МН за
ЗЕО ІО МО: 1 та МІ за БЕО ІЮ МО: 11; (9) МН за 5ЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 19; (п) МН за
ЗЕО ІЮО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 17; та () МН за 5ЕО ІЮО МО: 8 та МІ за 5ЕО ІО МО: 18. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7.4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 11 або МН за 5ЕО І
МО: 10 та Мі за 5ЕО ІЮ МО: 20. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення, чи зв'язується антитіло проти С5 цього винаходу з певним епітопом, можна визначити наступним чином: точкові мутанти С5, у яких амінокислота (за виключенням аланіну) в С5 заміщена аланіном, експресують у клітинах 293, та зв'язування антитіла проти С5 з мутантами С5 тестують за допомогою ЕГІЗА, вестерн-блотингу або
ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка); де суттєве ослаблення або припинення зв'язування антитіла проти С5 з мутантом С5 відносно його зв'язування з природним С5 вказує на те, що антитіло проти С5 зв'язується з епітопом, який включає таку амінокислоту в С5. У певних варіантах здійснення амінокислота в С5, яку слід замістити аланіном, вибирається з групи, що складається з СіІш48, А5р51, Нів70, Ні 72, І уз109 та Ніб«110 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ
МО: 40). У подальших варіантах здійснення амінокислота в С5, яку слід замістити аланіном, - це
Авр51 або І уз109 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ МО: 40).
В іншому варіанті здійснення, чи зв'язується антитіло проти С5 з характеристиками залежного від рН зв'язування з певним епітопом, можна визначити наступним чином: точкові
Зо мутанти С5, у яких залишок гістидину в С5 заміщений іншою амінокислотою (наприклад, тирозином), експресують у клітинах 293, та зв'язування антитіла проти С5 з мутантами С5 тестують за допомогою ЕГІЗА, вестерн-блотингу або ВІАСОРЕ (зареєстрована торговельна марка); де суттєве ослаблення зв'язування антитіла проти С5 з природним С5 при кислотному рН відносно його зв'язування з мутантом С5 при кислотному рН, вказує на те, що антитіло проти
С5 зв'язується з епітопом, який включає такий залишок гістидину в С5. У подальших варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 з природним С5 при нейтральному рН суттєво не ослаблюється відносно його зв'язування з мутантом С5 при нейтральному рН. У певних варіантах здійснення залишок гістидину в С5, який слід замістити іншою амінокислотою, вибирається з групи, що складається з Ні70, Нібє72 та Ніз110 бета-ланцюга С5 (ЗЕО ІЮ МО: 40).
У подальшому варіанті здійснення залишок гістидину Ніз70 заміщений тирозином. 2. Аналізи активності
В одному аспекті пропонуються аналізи для ідентифікації антитіл проти С5, які мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, інгібування активності
С5, перешкоджання розщепленню С5, внаслідок якого утворюються Сба та С5р, блокування доступу конвертази С5 до сайту розщеплення в С5, блокування гемолітичної активності, спричиненої активацією С5, тощо. Також пропонуються антитіла, які мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міго.
У певних варіантах здійснення антитіло винаходу тестується щодо такої біологічної активності.
У певних варіантах здійснення, чи інгібує випробовуване антитіло розщеплення С5 на С5ба та С5р, визначається за способами, описаними у, наприклад, Ізептап еї аї., у) Іттипої. 124(1):326-331 (1980). В іншому варіанті здійснення це визначається за способами специфічного виявлення розщеплених білків Сб5а та/(або С5р, наприклад, за допомогою ЕГІЗА або вестерн-блотингу. Там, де знижена кількість продукту розщеплення С5 (тобто С5ба та/або
С5р) виявляється у присутності випробовуваного антитіла (або внаслідок контакту з ним), випробовуване антитіло ідентифікують як антитіло, яке спроможне інгібувати розщеплення С5.
У певних варіантах здійснення концентрацію та/або фізіологічну активність Сбза можна виміряти за допомогою способів, наприклад, хемотаксичних аналізів, КІА або ЕГІЗА (Дивись, наприклад,
Мага апа 2уайег 9. Сііп. Іпмеві. 50(3):606-616 (1971)). бо У певних варіантах здійснення, чи блокує випробовуване антитіло доступ конвертази С5 до
С5, визначається за способами виявлення білкових взаємодій між конвертазою С5 та С5, наприклад, ЕГІЗБА або ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Там, де взаємодії ослаблюються у присутності випробовуваного антитіла (або внаслідок контакту 3 ним), випробовуване антитіло ідентифікується як антитіло, яке спроможне блокувати доступ конвертази С5 до С5.
У певних варіантах здійснення активність С5 можна виміряти як функцію його спроможності лізувати клітини у рідинах організму суб'єкта. Спроможність С5 лізувати клітини або зменшувати їх кількість можна виміряти за добре відомими у галузі способами, наприклад, за допомогою традиційного гемолітичного аналізу, такого як аналіз гемолізу, описаний Кабаї апа Мауєег (едв),
Ехрегітепіаї! ІттипосПпетівігу, 2па4 Еайоп, 135-240, Зргіпоїйей, І, СС Тпотаз (1961), сторінки 135-139, за допомогою традиційного варіанта такого аналізу, такого як спосіб гемолізу еритроцитів курчати, як описано у, наприклад, Нійтеп еї аї., М. Епої. У. Меа. 350(6): 552-559 (2004). У певних варіантах здійснення активність С5 або її інгібування кількісно визначається за допомогою аналізу СН5бОед. Аналіз СН5Оед - це спосіб вимірювання загальної класичної активності комплементу у сироватці. Цей тест - це аналіз лізису, при якому застосовуються сенсибілізовані антитілом еритроцити як активатор класичного шляху комплементу та різні розведення випробовуваної сироватки для визначення кількості, необхідної для того, щоб відбувся 50 95 лізис (СН5О). Відсоткове відношення гемолізу можна визначити, наприклад, застосовуючи спектрофотометр. Аналіз СН5Оед дозволяє виконувати непряме вимірювання утворення комплексу кінцевого комплементу (ТСС), оскільки самі по собі ТСС безпосередньо відповідають за гемоліз, який вимірюється. Інгібування активації С5 можна також виявити та/або виміряти, застосовуючи способи, які описані далі, та приклади яких наведено у робочих прикладах. Застосовуючи аналізи цих або інших придатних типів, можна зробити скринінг антитіл-кандидатів, спроможних інгібувати активацію С5. У певних варіантах здійснення інгібування активації С5 включає зниження активації С5 в аналізі принаймні на 5 95, 10 95, 15 9, 2096, 25 96, 30 Ув, 35 95 або 40 95 або більше порівняно з ефектом негативного контрольного антитіла в подібних умовах. У деяких варіантах здійснення це стосується інгібування активації
С5 принаймні на 45 95, 50 95, 55 95, 60 Зо, 65 Зв, 70 Зо, 75 96, 80 9Уо, 85 9о, 90 90 або 95 95 або більше.
Зо О. Імунокон'югати
У деяких варіантах здійснення винаходом пропонуються імунокон'югати, які включають розкрите у цьому описі антитіло проти С5, кон'юЮговане з одним або більше цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти або ліки, агенти інгібування росту, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, або їх фрагменти), або радіоактивні ізотопи.
В одному варіанті здійснення імунокон'югат - це кон'югат антитіло-ліки (АОС), у якому антитіло кон'юговано з одним або більше ліками, включаючи, проте не обмежуючись ними, майтанзиноїд (дивись патенти США МоМо 5,208,020, 5,416,064 та європейський патент ЕР 0 425 235 ВІ); ауристатин, такий як складові ОЕ та ОРЕ лікарського засобу монометилауристатин (ММАЕ та ММАБЕ) (дивись патенти США МоМо 5,635,483, та 5,780,588, та 7,498,298); доластатин; каліхеміцин або його похідне (дивись патенти США МоМо 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 та 5,877,296; Ніптап еї аі!., Сапсег Кез. 53:3336-3342 (1993); та І оде єї аІ., Сапсег Ке5. 58:2925-2928 (1998)); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (дивись Кгаїх еї а!., Сигтгепі Мед. Спет. 13:477-523 (2006); Уейнтеу евї а!., Віоогдапіс а Мед. Спет. І ейеге 16:358-362 (2006); Тогдом єї аї., Віосопі. Спет. 16:717-721 (2005); Маду єї а!І., Рос. Маї). Асад. сі. ОБА 97:829-834 (2000); Вбиромснік єї аї!., Віоогд. 5 Мед. Спет. І еНег5 12:1529-1532 (2002); Кіпа еї аЇ., У. Мей. Спет. 45:4336-4343 (2002); та патент США Мо 6,630,579); метотрексат; віндезин; таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел та ортатаксел; трихотецен; та СС1065.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат включає антитіло, як описано у цьому описі, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи, проте не обмежуючись ними, А-ланцюг дифтерії, незв'язувальні активні фрагменти токсину дифтерії, А- ланцюг екзотоксину (з Рзейдотопах аєегидіпоза), А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки АїІеипгісгез гогаї, діантинові білки, білки Ріуіаса Атегісапа (РАРІ,
РАРІЇ та РАР-5), інгібітор, одержаний з гіркого огірка (тотогадіса спагапііа), курцин, кротин, інгібітор, одержаний з мильнянки лікарської (зараопагіа ойісіпаїіє), гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трикотецен.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат включає описане у цьому описі антитіло, кон'юговане з радіоактивним атомом, щоб утворити радіоактивний кон'югат. Для виробництва 60 радіоактивних кон'югатів доступні різноманітні радіоактивні ізотопи. Приклади включають АЇг",
81, 25, мо Де!86, Де!88,. пз, Віг12, рзг, Ррг2 та радіоактивні ізотопи и. Коли радіоактивний кон'югат застосовується для виявлення, тоді він може включати радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад іс99т або 1123, або спін-мітку для здійснення ядерної магнітно-резонансної (ММК) томографії (також відома як магнітно-резонансна томографія, пі), таку як йод-123 ("іодіпе-123 адаїп"), йод 131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, магній та залізо.
Кон'югати антитіла та цитотоксичного агента можна отримати, застосовуючи різноманітні агенти зшивання біфункціональних білків, такі як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат (5МСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоестерів (такі як диметиладипімідат НС), активні естери (такі як дисукцинімідил суберат), альдегіди (такі як глютаральдегід), біс-азидні сполуки (такі як біс(р- азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(р-діазонійбензоїл)-етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол 2,6-діїзоціанат) та біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4- динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин можна отримати, як описано у Міеца еї аї.,
Зсіепсе 238:1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилен- триамінопентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) - це приклад хелатуючого агента для кон'югування радіоактивного нуклеотиду з антитілом. Дивись М/О94/11026. Лінкер може бути "лінкером, який може розщеплюватися" та який сприяє вивільненню цитотоксичних ліків у клітині. Наприклад, можна застосовувати нестійкий до кислоти лінкер, чутливий до пептидази лінкер, нестійкий до світла лінкер, диметиловий лінкер або лінкер, що містить дисульфід (Спагі еї аЇ., Сапсег Кезв.
Б2:127-131 (1992); патент США Мо 5,208,020).
Імунокон'югати або кон'югати антитіло-ліки (АОС), описані у цьому описі, які особливо передбачаються, проте не обмежуються ними, - це такі кон'югати, які отримані за допомогою реагентів перехресного зшивання, які включають, проте не обмежуються ними, ВМР5, ЕМС5,
СМВ5, НВУБ5, І 0-5МСС, МВ5, МРВН, 5ВАР, ІА, ЗІАВ, ЗМСОС, ЗМРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМО5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМИ5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-5МСС, та сульфо-5МРВ, та 5МЗВ (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від
Рієгсе Віотесппоіоду, Іпс., ВоскКіога, ІГ., 0.5. А).
Е. Способи та композиції для діагностики та виявлення
Зо У певних варіантах здійснення будь-яке запропоноване у цьому описі антитіло проти С5 є корисним для виявлення присутності С5 у біологічному зразку. Термін "виявлення", як застосовується у цьому описі, охоплює кількісне та якісне виявлення. У певних варіантах здійснення біологічний зразок включає клітину або тканину, таку як сироватка, суцільна кров, плазма, зразок біопсії, зразок тканини, клітинна суспензія, слина, мокротиння, ротова рідина, спинномозкова рідина, навколоплідна рідина, асцитна рідина, молоко, молозиво, виділення молочної залози, лімфа, сеча, піт, слізна рідина, шлунковий сік, синовіальна рідина, рідина черевної порожнини, внутрішньоочна рідина та слиз.
В одному варіанті здійснення пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі діагностики або виявлення. У подальшому аспекті пропонується спосіб виявлення присутності
С5 у біологічному зразку. У певних варіантах здійснення спосіб включає контактування біологічного зразка з антитілом проти С5, як описано у цьому описі, в умовах, які дозволяють антитілу проти С5 зв'язуватися з С5, та виявлення того, чи утворився комплекс між антитілом проти С5 та С5. Такий спосіб може бути способом іп мйго або іп мімо. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 застосовується для вибору суб'єктів, придатних для лікування антитілом проти С5, наприклад коли С5 є біологічним маркером вибору пацієнтів.
В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб вибору індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, та який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, та (Б) вибір індивідуума, що є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума. В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб вибору терапії для індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, та (Б) вибір терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, для індивідуума, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або бо неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, (Б) вибір індивідуума, який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума, та (с) введення антитіла проти С5 цього винаходу індивідууму.
В іншому варіанті здійснення пропонується антитіло проти С5 цього винаходу для застосування під час лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення індивідуума лікують антитілом проти С5 цього винаходу, коли генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
В іншому варіанті здійснення пропонується застосування іп міїго генетичної варіації у С5 для вибору індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, та який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу. У певних варіантах здійснення індивідуум вибирається як такий, що є придатним для терапії, коли ця генетична варіація виявляється у
С5, що походить від індивідуума. В іншому варіанті здійснення пропонується застосування іп міго генетичної варіації у С5 для вибору терапії для індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
У певних варіантах здійснення терапія, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, вибирається для індивідуума, коли генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
Повідомлялося, що деякі пацієнти, які мають генетичну варіацію у С5, демонструють слабку реакцію на терапію, яка включає існуюче антитіло проти С5 (Мізпітига еї аїІ., М. Епої. У. Меа. 370:632-639 (2014)). Рекомендується, щоб такого пацієнта лікували за допомогою терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, оскільки таке антитіло має інгібуючу активність на активацію варіантів С5, а також природного С5, як показано у робочих прикладах далі.
Виявлення генетичної варіації у С5 можна здійснювати, застосовуючи спосіб, відомий з попереднього рівня техніки. Такий спосіб може включати секвенування, ПЛР (РСР), ПЛР зі зворотною транскриптазою (АТ-РСЕ) та спосіб на основі гібридизації, такий як саузерн-блотинг або нозерн-блотинг, проте спосіб не обмежується ними. Варіанти С5 можуть включати
Зо принаймні одну генетичну варіацію. Генетичну варіацію можна вибрати з групи, яка складається 3 М145І, К4490, М802І, к885Н, к9280, 0966У, 51310М та Е1437О0. У цьому описі К885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином. У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до біологічної активності природного С5.
Приклади розладів, які можна діагностувати із застосуванням антитіла винаходу, включають ревматоїдний артрит (КА); системний червоний вовчак (ЗЕ); вовчаковий нефрит; ішемічне реперфузійне пошкодження (ІКІ); астму; пароксизмальну нічну гемоглобінурію (РМН); гемолітично-уремічний синдром (НИ) (наприклад, атиповий гемолітично-уремічний синдром (ани5)); хворобу щільного осаду (000); оптикомієліт (ММО); багатофокальну моторну невропатію (МММ); множинний склероз (М5); системний склероз; макулярну дегенерацію (наприклад, пов'язану з віком макулярну дегенерацію (АМО)); синдром гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕ Р); тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР); спонтанну втрату плоду; бульозний епідермоліз; рецидивну втрату плоду; пре- еклампсію; черепно-мозкову травму; важку міастенію; хворобу холодової аглютинації; синдром
Сегрена; дерматоміозит; бульозний пемфігоїд; фототоксичні реакції; гемолітичний уремічний синдром, пов'язаний з токсином Шига Е. соїї; типовий або інфекційний гемолітичний уремічний синдром (ІНО5); гломерулонефрит СЗ3; васкуліт, пов'язаний з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморальне та васкулярне відторгнення трансплантату; опосередковане антитілом гостре відторгнення (АМК); дисфункцію трансплантації; інфаркт міокарду; алогенний трансплантат; сепсис; ішемічну хворобу серця; вроджений ангіоневротичний набряк; дерматоміозит; хворобу Грейвса; атеросклероз; хворобу
Альцгеймера (АБ); хворобу Гантінгтона; хворобу Крейцфельда-Якоба; хворобу Паркінсона; різні види раку; поранення; септичний шок; пошкодження спинного мозку; увеїт; пов'язані з діабетом очні хвороби; ретролентальну фіюроплазію; гломерулонефрит; мембранний нефрит; ІдА- нефропатію; синдром гострої респіраторної недостатності у дорослих (АКОБ); хронічне обструктивне захворювання легенів (СОРО)); муковісцидоз; гемолітичну анемію; пароксизмальну холодову гемоглобінурію; анафілактичний шок; алергію; остеопороз; остеоартрит; аутоїмунний тиреоїдит; діабет типу І; псоріаз; звичайну пузирчатку; аутоїмунну гемолітичну анемію (АЇІНА); ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ІГР); синдром Гудпасчера; хворобу Дегоса; бо антифосфоліпідний синдром (АРБ); катастрофічний АРЗ (САРБ); серцево-судинний розлад;
міокардит; церебрально-судинний розлад; розлад периферійних судин; вазоренальний розлад; мезентеральний/ентеральний судинний розлад; васкуліт; нефрит пурпури Шенлейна-Геноха; хворобу Такаясу; дилатаційну кардіоміопатію; діабетичну ангіопатію; хворобу Кавасакі (артрит); венозний газовий ембол (МОЕ); рестеноз після встановлення стента; ротаційну атеректомію; мембранну нефропатію; синдром Гійена-Барре; синдром Фішера; індукований антигеном артрит; синовіальне запалення; вірусні інфекції; бактеріальні інфекції; грибкові інфекції та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу.
У певних варіантах здійснення пропонуються мічені антитіла проти С5. Мітки включають, проте не обмежуються ними, мітки або складові, які виявляються безпосередньо (такі як флуоресцентні, хромофорні мітки, непроникні для електронів мітки, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також складові, такі як ферменти або ліганди; які виявляються опосередковано, наприклад, через ферментативну реакцію або молекулярну взаємодію.
Приклади міток включають, проте не обмежуються ними, радіоіїзотопи З2Р, 140, 125І, ЗН та "1, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних елементів або флюоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, данзил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люцифераза світлячка та бактеріальна люцифераза (патент США Мо 4,737,456), люциферин, 2,3- дигідрофталазиндіони, пероксидазу хріну (НКР), лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази сахаридів, наприклад, оксидазу глюкози, оксидазу галактози та глюкоза-б6-фосфат дегідрогеназу, гетероциклічні оксидази, такі як уриказа та ксантиноксидаза, зчеплені з ферментом, який застосовує пероксид водню, щоб окислити початковий барвник, такий як НЕР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/авідин, спін-мітки, бактеріофагові мітки, стійкі вільні радикали та їм подібне.
Е. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади антитіла проти С5, як описано у цьому описі, отримують шляхом змішування такого антитіла, яке має бажаний ступінь чистоти, з одним або більше довільними фармацевтично прийнятними носіями (Кетіпдіоп'є Рпаппасецшіїса! 5сіепсе5 161п еайіоп, О5оЇї, А.
ЕЯ. (1980)), у формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії є зазвичай нетоксичними для реципієнтів у дозах та концентраціях, що застосовуються, та вони включають, проте не обмежуються ними: буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні
Зо кислоти; антиоксиданти, які включають аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол; бутил або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол та т-крезол); низькомолекулярні (менш ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕОТА; цукри, такі як цукроза, маніт, трегалоза або сорбіт; противоіїони, що утворюють сіль, такі як натрій; металеві комплекси (наприклад, комплекси 2п-білок) та/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (РЕС). У цьому описі приклади фармацевтично прийнятних носіїв також включають агенти диспергування ліків у міжклітинному просторі, такі як розчинні нейтрально- активні гіалуронідазні глікопротетни (5НАБЕОСР), наприклад, розчинні гіалуронідазні глікопротеїни людини РН-20, такі як Г(НиРН2гОо (НУ ЕМЕХ (зареєстрована торговельна марка),
Вахіег Іпіегпайіопаї, Іпс.). Певні приклади 5НАБЕСР та способи їх застосування, включаючи
ГНиРН2О, описано у публікаціях США МоМо 2005/0260186 та 2006/0104968. В одному аспекті 5«НАБЕСР поєднується з однією або більше додатковими глікозамінгліканазами, такими як хондроїтинази.
Приклади ліофілізованих фармацевтичних складів антитіла описано у патенті США Мо 6,267,958. Водні фармацевтичні склади антитіла включають склади, описані у патенті США
Мо 6,171,586 та УМО 2006/044908, при цьому фармацевтичні склади з останнього посилання включають гістидин-ацетатний буфер.
У цьому описі фармацевтичний склад може також містити більш ніж один активний інгредієнт, якщо це необхідно для особливого показання лікування, переважно ті інгредієнти, що мають сумісні види активності, які не впливають шкідливо один на одного. Такі активні інгредієнти придатним чином присутні у комбінації у кількості яка є ефективною для призначеної мети.
Активні інгредієнти можуть бути поміщені у мікрокапсули, отримані, наприклад, за способами коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, мікрокапсули з гідроксиметилцелюлози або желатинові мікрокапсули та мікрокапсули 3 полі-(метил- 60 метакрилату), відповідно, у колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікрокульки, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або у макроемульсії. Такі способи описано у Кетіпдіоп'є Ріаптасеціїса! Зсіепсев 161п ейайоп, О5ої, А. Еа. (1980).
Можна отримати препарати з уповільненим вивільненням. Придатні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, при цьому матриці - це сформовані вироби, наприклад, плівки або мікрокапсули.
Фармацевтичні склади, які призначені для введення іп мімо, є зазвичай стерильними.
Стерильності можна легко досягти, наприклад, за допомогою фільтрування крізь стерильні фільтраційні мембрани. б. Терапевтичні способи та композиції
Запропоноване у цьому описі антитіло проти С5 можна застосовувати у терапевтичних способах.
В одному аспекті пропонується антитіло проти С5 для застосування як лікарського засобу. У подальших аспектах пропонується антитіло проти С5 для застосування під час лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі лікування. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
Коли антиген - це розчинний білок, тоді внаслідок зв'язування антитіла зі своїм антигеном може подовжитися напівжиття антигену у плазмі (тобто, може знизитися кліренс антигену з плазми), оскільки само антитіло має триваліше напівжиття у плазмі та воно слугує носієм для антигену. Це відбувається внаслідок рециркуляції комплексу антиген-антитіло за допомогою
ЕсКп через ендосомальний шлях у клітині (Коорепіап, Маї. Кем. Іттипої. 7(9):715-725 (2007)).
Проте очікується, що антитіло з характеристиками залежного від рН зв'язування, яке зв'язується
Зо зі своїм антигеном у нейтральному зовнішньоклітинному середовищі, при цьому вивільняючи його у кислотні ендосомальні компартменти після потрапляння у клітини, має неперевершені властивості з точки зору нейтралізації та кліренсу антигену порівняно з його аналогом, який зв'язується незалежним від рН чином (дама єї аї., Маї. Віоїесп... 28(11):1203-1207 (2010);
Ремапаброуїпа єї аї!., тАБрз 5(6):851-859 (2013); МО 2009/125825).
У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у підвищенні кліренсу С5 з плазми. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі підвищення кліренсу С5 з плазми у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген- антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рн зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування для інгібування активації С5. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі інгібування активації С5 у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення -- (516) це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується застосування антитіла проти С5 у виробництві або приготуванні лікарського засобу. В одному варіанті здійснення лікарський засіб призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5, при цьому спосіб включає введення індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, ефективної кількості лікарського засобу. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для підвищення кліренсу
С5 з плазми. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі підвищення кліренсу С5 з плазми у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген-антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти
С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому варіанті
Зо здійснення лікарський засіб призначений для інгібування активації С5. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі інгібування активації С5 у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. "Індивідуум" згідно з будь- яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, ефективної кількості антитіла проти С5. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб підвищення кліренсу С5 з плазми у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. В одному варіанті здійснення "Індивідуум" - це людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген- антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рн зв'язування. В одному варіанті здійснення "індивідуум" - це людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб інгібування активації С5 у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для бо інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5,
пригнічується внаслідок інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення "індивідуум" - це людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонуються фармацевтичні склади, які включають будь- які запропоновані у цьому описі антитіла проти С5, наприклад, для застосування у будь-якому із вищезгаданих терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке із запропонованих у цьому описі антитіл проти С5 та фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення фармацевтичний склад включає будь-яке із запропонованих у цьому описі антитіл проти С5 та принаймні один додатковий терапевтичний агент.
У подальшому аспекті фармацевтичний склад призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген-антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення фармацевтичний склад вводиться індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. "Індивідуум" за будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
В одному аспекті індивідуум має природний С5. В іншому аспекті індивідуум має варіант С5.
У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до активності природного С5. Такий варіант С5 може включати принаймні одну варіацію, вибрану з групи, що складається з М145І, К4490, У802І, К885Н, К9280, 0966У, 51310М та Е14370. У цьому описі
Зо К885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином.
У подальшому аспекті винаходом пропонуються способи отримання лікарського засобу або фармацевтичного складу, при цьому способи включають змішування будь-якого із запропонованих у цьому описі антитіл проти С5 з фармацевтично прийнятним носієм, наприклад, для застосування у будь-якому з вищезгаданих терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення способи приготування лікарського засобу або фармацевтичного складу також включають додавання принаймні одного додаткового терапевтичного агента до лікарського засобу або фармацевтичного складу.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, вибирається з групи, що складається з ревматоїдного артриту (КА); системного червоного вовчака (5 Е); вовчакового нефриту; ішемічного реперфузійного пошкодження (ІКІ); астми; пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН); гемолітично-уремічного синдрому (НО) (наприклад, атипового гемолітично-уремічного синдрому (анНиб5)); хвороби щільного осаду (000); оптикомієліту (ММО); багатофокальної моторної невропатії (МММ); множинного склерозу (М5); системного склерозу; макулярної дегенерації (наприклад, пов'язаної з віком макулярної дегенерації (АМО)); синдрому гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГІР); тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР); спонтанної втрати плоду; бульозного епідермолізу; рецидивної втрати плоду; пре-еклампсії; черепно-мозкової травми; важкої міастенії; хвороби холодової аглютинації; синдрому Сегрена; дерматоміозиту; бульозного пемфігоїду; фототоксичних реакцій; гемолітичного уремічного синдрому, пов'язаного з токсином Шига Е. соїї; типового або інфекційного гемолітичного уремічного синдрому (НИ5); гломерулонефриту
С3; васкуліту, пов'язаного з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморального та васкулярного відторгнення трансплантату; опосередкованого антитілом гострого відторгнення (АМК); дисфункції трансплантації; інфаркту міокарду; алогенного трансплантату; сепсису; ішемічної хвороби серця; вродженого ангіоневротичного набряку; дерматоміозиту; хвороби Грейвса; атеросклерозу; хвороби Альцгеймера (АБ); хвороби
Гантінгтона; хвороби Крейцфельда-Якоба; хвороби Паркінсона; різних видів раку; поранення; септичного шоку; пошкодження спинного мозку; увеїту; пов'язаних з діабетом очних хвороб; ретролентальної фіюроплазії; гломерулонефриту; мембранного нефриту; ІдА-нефропатії; бо синдрому гострої респіраторної недостатності у дорослих (АКОБ); хронічного обструктивного захворювання легенів (СОРО); муковісцидозу; гемолітичної анемії; пароксизмальної холодової гемоглобінурії; анафілактичного шоку; алергії; остеопорозу; остеоартриту; аутоімунного тиреоїдиту; діабету типу І; псоріазу; звичайної пузирчатки; аутоімунної гемолітичної анемії (АІНА); ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури (ІТР); синдрому Гудпасчера; хвороби Дегоса; антифосфоліпідного синдрому (АРБ); катастрофічного АРБ5 (САРБ); серцево-судинного розладу; міокардиту; церебрально-судинного розладу; розладу периферійних судин; вазоренального розладу; мезентеральноголоентерального судинного розладу; васкуліту; нефриту пурпури Шенлейна-Геноха; хвороби Такаясу; дилатаційної кардіоміопатії; діабетичної ангіопатії; хвороби Кавасакі (артриту); венозного газового емболу (МОЕ); рестенозу після встановлення стента; ротаційної атеректомії; мембранної нефропатії; синдрому Гійена-Барре; синдрому Фішера; індукованого антигеном артриту; синовіального запалення; вірусних інфекцій; бактеріальних інфекцій; грибкових інфекцій та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це стан офтальмологічної хвороби. У подальших варіантах здійснення офтальмологічний стан - це макулярна дегенерація. У подальших варіантах здійснення макулярна дегенерація - це АМО. У подальших варіантах здійснення АМО -- це суха форма АМО.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН).
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це інфаркт міокарда.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це ревматоїдний артрит (КА).
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це остеопороз або остеоартрит.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це запалення.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це рак.
Антитіла цього винаходу можна застосовувати або окремо, або у комбінації з іншими агентами під час лікування. Наприклад, антитіло цього винаходу можна вводити разом з принаймні одним додатковим терапевтичним агентом.
Такі зазначені вище комбіновані терапії охоплюють комбіноване введення (де два або більше терапевтичних агентів включено в один і той же або окремий фармацевтичний склад) та окреме введення, у випадку якого введення антитіла цього винаходу може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного агента або агентів. В одному варіанті здійснення введення антитіла проти С5 та введення додаткового терапевтичного агента здійснюють одне відносно іншого у межах приблизно одного місяця, або у межах приблизно одного, двох або трьох тижнів, або у межах приблизно одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести днів.
Антитіло винаходу (та будь-який додатковий терапевтичний агент) можна вводити за будь- якими придатними способами, включаючи парентеральне, внутрішньолегеневе та внутрішньоносове введення та, якщо це бажано для місцевого лікування, введення в осередок ураження. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Введення дози можна здійснювати за будь-яким придатним способом, наприклад шляхом ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, частково залежно від того, чи введення є короткочасним або постійним. У цьому описі передбачаються різні схеми введення препаратів, включаючи, проте не обмежуючись ними, одноразове або багаторазові введення через проміжки часу, болюсне введення або імпульсну інфузію.
Антитіла цього винаходу будуть включатися до фармацевтичного складу, дозуватися та вводитися за способом, що відповідає гарній медичній практиці. Фактори, які слід враховувати у цьому контексті, включають специфічний розлад, який слід лікувати, специфічного ссавця, якого слід лікувати, клінічну умову окремого пацієнта, причину розладу, ділянку доставки агента, спосіб введення, режим введення та інші фактори, відомі медикам-практикам. Антитіло не обов'язково, проте довільно входить до фармацевтичного складу з одним або більше агентами, які у цей час застосовуються для попередження або лікування даного розладу. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, присутнього у фармацевтичному складі, типу розладу або лікування та інших факторів, що обговорюються вище. Їх зазвичай застосовують у таких самих дозах та зі способами введення, описаними у цьому описі, або 60 приблизно від 1 95 до 99 95 від доз, описаних у цьому описі, або будь-якій дозі або за допомогою будь-якого способу введення, які емпірично/клінічно визначено як доречні.
Для профілактики або лікування хвороби відповідне дозування антитіла цього винаходу (коли воно застосовується окремо або у комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними агентами) залежатиме від типу хвороби, яку слід лікувати, типу антитіла, суворості та протікання хвороби, а також від того, чи вводиться антитіло з метою профілактики або з метою лікування, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта, та реакції на антитіло, та розсудливості лікаря, який веде пацієнта. Антитіло придатним чином вводиться пацієнтові одноразово або протягом сеансів лікування. Залежно від типу та суворості хвороби приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг) антитіла може бути початковою дозою- кандидатом для введення пацієнтові, чи то, наприклад, шляхом одного або більше окремих введень, чи то шляхом тривалої інфузії. Одна звичайна щоденна доза може становити діапазон від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, що залежить від вищезгаданих факторів. Для багаторазового введення протягом декількох днів або тривалішого часу, залежно від стану, лікування буде зазвичай продовжуватися, доки не відбудеться бажане пригнічення симптомів хвороби. Один приклад дозування антитіла буде становити діапазон від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Отже, одну або більше доз, які становлять приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію), можна вводити пацієнтові. Такі дози можна вводити с проміжками, наприклад, кожного тижня або кожні три тижні (наприклад так, щоб пацієнт отримував від приблизно двох до приблизно двадцяти або, наприклад, шести доз антитіла). Можна вводити початкову вищу ударну дозу з наступними однією або більше нижчими дозами. Прогрес цього лікування легко відстежується за допомогою традиційних способів та аналізів.
Зрозуміло, що будь-які з вищезгаданих складів та терапевтичних способів можна здійснювати, застосовуючи імунокон'югат винаходу замість або на додаток до антитіла проти
С5.
Н. Промислові вироби
В одному аспекті винаходом пропонується промисловий виріб, що містить матеріали, корисні для лікування, профілактики та/або діагностики розладів, описаних вище. Промисловий виріб включає контейнер та етикетку або листок-вкладиш, що або супроводжує контейнер, або
Зо розміщений на контейнері. Придатні контейнери включають, наприклад, пляшки, ампули, шприци, мішечки з розчином для внутрішньовенних ін'єкцій тощо. Контейнери можна виготовити з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер містить композицію, яка самостійно або у комбінації з іншою композицією є ефективною для лікування, профілактики або діагностики стану, та він може мати засіб для стерильного доступу (наприклад, контейнер може бути мішечком з розчином для внутрішньовенних ін'єкцій або ампулою, які мають пробку, що проколюється голкою для підшкірної ін'єкції). Принаймні один активний агент у композиції - це антитіло винаходу. На етикетці або у листку-вкладиші вказується, що композиція застосовується для лікування стану за вибором. Крім того, промисловий виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, яка міститься в ньому, де композиція містить антитіло винаходу; та (Б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, де композиція містить додатковий цитотоксичний агент або терапевтичний агент іншої дії. Промисловий виріб у цьому варіанті здійснення винаходу може також включати листок-вкладиш, на якому вказується, що композиції можна застосовувати для лікування певного стану. Альтернативно або додатково промисловий виріб може також включати другий (або третій) контейнер, який містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВУМЕЇ), сольовий розчин з фосфатним буфером, розчин Рінгера та розчин декстрози. Він може також включати інші матеріали, бажані з комерційної та споживчої точки зору, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки та шприци.
Зрозуміло, що будь-які з вищезгаданих промислових виробів можуть включати імунокон'югат винаходу замість або на додаток до антитіла проти С5.
Приклади
Далі описуються приклади способів та композицій винаходу. Зрозуміло, що на практиці можна застосовувати інші різноманітні варіанти здійснення, беручи до уваги запропонований вище загальний опис.
Приклад 1
Отримання С5 1.1. Експресія та очищення рекомбінантного С5 людини та яванської макаки
Рекомбінантний С5 людини (МСВІ СепВапк номер доступу: МР 001726.2, 5ЕБЕО ІЮО МО: 39) транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію ЕгеесіуІЇе293-Е (Тнегто РівзНег, Сапзрай, бо СА, США). Кондиційовані середовища, які експресують С5 людини, розвели рівним об'ємом води тій), потім нанесли на аніонообмінну колонку О-хзерпагозе ЕЕ або О-зерпагозе НР (СЕ
Ппеанвсаге, Оррзаїа, Швеція) з наступним елююванням в градієнті масі. Зібрали фракції, що містили С5 людини, а потім довели концентрацію солі масі та рН до 80 мМ та рН 6.4, відповідно. Отриманий зразок нанесли на катіонообмінну колонку ЗР-зерпагозе НР (СЕ
Ппеаквсаге, Оррзаїа, Швеція) та елюювали в градієнті масі. Фракції, що містили С5 людини, зібрали та завантажили у керамічну гідроксіапатітову колонку СНТ (Віо-Бай Іарогаюгієв,
Негсше5, СА, США). Елюат С5 людини потім завантажили до гель-фільтраційної колонки зЗирегдех 200 (СЕ Неайнсаге, Оррзаїа, Швеція). Фракції, що містили С5 людини, об'єднали та зберігали при -150 "С.
Експресію та очищення рекомбінантного С5 яванської макаки (МСВІ СепВапк номер доступу: ХР 005580972, ЗЕО ІЮ МО: 44) виконували за таким самим способом, як і людський аналог. 1.2. Очищення С5 яванської макаки (супосС5) від плазми
Зразок плазми яванської макаки нанесли на агарозу 551 7 (Іпмімодеп, Зап Оієедо, СА, США) з наступним елююванням 100 мМ ацетатом натрію, рН 3,5. Фракції, що містили супоС5, одразу нейтралізували та піддали обробці на колонці НР з Білком А (СЕ Ппеайпсаге, Оррзаїа, Швеція), а потім агарозою з Пептидом М (Іпмімодеп, зап Оіедо, СА, США). Потік крізь фракцію потім спрямували до гель-фільтраційної колонки Зирегдех 200 (ЗЕ Ппеайрсаге, Оррзаїа, Швеція).
Фракції, що містили супоС5, об'єднали та зберігали при -80 "С.
Приклад 2
Отримання антитіл проти С5 2.1. Скринінг антитіл
Антитіла проти С5 отримали, вибрали на проаналізували наступним чином.
Кролів МАМ (новозеландських білих кролів) віком від 12 до 16 тижнів імунізували С5 людини та/або С5 мавпи (50-100 мкг/дозу/кроля) шляхом інтрадермальної ін'єкції. Цю дозу повторювали 4-5 разів протягом 2 місяців. За один тиждень після кінцевої імунізації у імунізованих кролів узяли селезінку та кров. Антиген-специфічні В-клітини забарвили міченим антигеном, сортували за допомогою клітинного сортера ЕСМ (БАС5З агіа ШІ, ВО) та помістили у планшети з 96 комірками із щільністю по одній клітині/комірку разом з 25000 клітинами/комірку клітин ЕЇ 4
Зо (Еигореап СоПесіоп ої СеїЇ Сийигез) та активованим кондиційованим середовищем кролячих Т- клітин, розведеним у 20 разів, а потім культивували протягом 7-12 днів. Клітини ЕІ 4 обробляли мітоміцином С (Зідта, Саї Мо. М4287) протягом 2 годин та заздалегідь промили тричі.
Активоване кондиційоване середовище кролячих Т-клітин отримали шляхом культивування кролячих тимоцитів у КРМІ-1640, що містило фітогемаглютинін-М (Коспе, Саї Мо. 1 1082132- 001), форбол 12-міристат 13-ацетат (Зідта, Саї Мо. Р1585) та 2 95 ЕВ5. Після культивування культуральні надосадові рідини В-клітин зібрали для подальшого аналізу, а дебрис зберігали при низьких температурах.
Аналіз ЕГІБА застосовували для тестування специфічності антитіл у культуральній надосадовій рідині В-клітин. Шар стрептавідину (Сепезосгірі, Саї Мо. 202043) нанесли на
МАХІЗОгр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688) при 50 нМ у РВ5 на 1 годину при кімнатній температурі. Планшети потім блокували Віоскіпд Опе (Масаіаі Тех5дие, Саї Мо. 03953-95), розведеним у 5 разів. С5 людини або мавпи мітили МНЗ-РЕС4-Вісііп (РІЕВСЕ, Саї Мо. 21329) та додали до заблокованих планшетів ЕГІЗА, інкубували протягом 1 години та промили.
Культуральні надосадові рідини В-клітин додали до планшетів ЕГІ5А, інкубували протягом 1 години та промили. Зв'язування виявили за допомогою кон'югату пероксидази хріну з антитілом кози проти кролячого дос (ВЕТНУЇ, Саї Мо. А120-111Р), а потім додали АВТ5 (КРІ, Саї Мо. 50- 66-06).
Аналіз ЕГІЗА застосовували для оцінки залежного від рН зв'язування антитіл проти С5.
Ес козла проти дО кроля (ВЕТНМУЇ, Саї Мо. АТ120-111А), розведену до 1 мкг/мл РВБ(-) додали до МАХІЗогр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688), інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі та блокували Віоскіпд Опе (Масаіаії Тездие, Саї Мо. 03953-95), розведеним у 5 разів. Після інкубування планшети промили та додали культуральні надосадові рідини В-клітин. Планшети інкубували протягом 1 години, промили, та додали 500 пМ біотинілованого С5 людини або мавпи, та інкубували протягом 1 години. Після інкубування планшети промили та інкубували з буфером МЕЗ рН 5,8 (20 мМ МЕЗ5, 150 мМ Масі та 1,2 мМ
Сасі») або буфером МЕЗ рН 5,8 (20 мМ МЕЗ5, 150 мМ Масі та 1 мМ ЕОТА) протягом 1 години при кімнатній температурі. Після інкубування виявили зв'язування біотинілованого С5 за допомогою кон'югату пероксидаза хріну-стрептавідин (Тпегто Зсіепійіс, Саї Мо. 21132), а потім додали АВТ (КРІ., Саї Мо. 50-66-06). бо Систему Осії КЕЮОЗ384 (РаїЇ Ійе Зсіепсе5з) застосовували для оцінювання афінності та 5О0 залежного від рН зв'язування антитіл проти С5. Антитіла, секретовані у культуральну надосадову рідину В-клітин, завантажили на кінчик біосенсора Білка А (Раї! І їе бсіепсев5) та занурили у 50 нМ С5 людини або мавпи у буфері МЕЗ рН 7,4, щоб проаналізувати кінетику зв'язування. Кінетику дисоціації проаналізували як у буфері МЕ5З рн 7,4, так і у буфері МЕ5 рН 5,8.
Загалом 41439 ліній В-клітин піддали скринінгу щодо афінності та залежного від рн зв'язування з С5 людини або мавпи та 677 ліній відібрали та позначили СЕАО001-0677. РНК вибраних ліній очистили від дебрису кріоконсервованих клітин, застосовуючи набори 21-96
Оніск-КМА (2УМО КЕБЕАКСН, Саї Мо. К1053). ДНК, яка кодує варіабельні ділянки важкого ланцюга антитіла, у вибраних лініях ампліфікували за допомогою РСЖК зі зворотною транскрипцією та рекомбінували за допомогою ДНК, яка кодує константну ділянку важкого ланцюга Е76004 (ЗЕО ІО МО: 33) або Е939654 (5ЕО ІЮ МО: 34). ДНК, яка кодує варіабельні ділянки легкого ланцюга антитіла, ампліфікували за допомогою РСЖК зі зворотною транскрипцією та рекомбінували за допомогою ДНК, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга КОМТС (5ЕБО ІО МО: 36). Окремо синтезували гени важкого та легкого ланцюгів існуючого гуманізованого антитіла проти С5, екулізумабу (ЕсиН-с5204, 5ЕО ІО МО: 29 та Еси! -
КО, 5ЕО ІЮ МО: 30). ДНК, яка кодує МН (ЕсиН, 5ЕО ІО МО: 31), злили у рамці з ДНК, яка кодує модифіковану СН Ідо4 людини (76004, 5ЕО ІЮО МО: 33), а дНК, яка кодує МІ. (Есиї, ЗЕО І МО: 32), злили у рамці з ДНК, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга КО (ЗЕО ІЮ МО: 37).
Кожну зі злитих кодувальних послідовностей також клонували у вектор експресії. Антитіла експресували у клітинах ЕгеебБіуює"М 293-Е (Іпмйгодеп) та очищали від культуральної надосадової рідини, щоб оцінити функціональну активність. Нейтралізуючу активність антитіл оцінювали шляхом тестування інгібування активності комплементу, застосовуючи аналіз лізису ліпосом, як описано у Прикладі 5.1. 2.2. Аналіз зв'язування епітопу за допомогою сендвіч-ЕЇ ІБА
Для подальшого аналізу вибрали антитіла проти С5 з високою афінністю, залежністю від рн та нейтралізуючою активністю. Аналіз сендвіч-ЕГ І5ЗА застосовували, щоб згрупувати вибрані антитіла у різні епітопні групи, що зв'язуються з однаковими епітопами білка С5 або епітопами, що перекриваються. Немічені захоплені антитіла розвели РВЗ (-) до 1 мкг/мл та додали до
Зо планшетів МАХІЗогр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688). Планшети інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі та блокували розведеним у 5 разів ВіосКкіпд Опе (Масаїаї
Тездиє, Саї Мо. 03953-95). Планшети інкубували протягом 1 години, промили, додали 2 нМ С5 людини та інкубували протягом 1 години. Після інкубування планшети промили та додали мічені антитіла для виявлення (1 мкг/мл, біотиніловані за допомогою МНЗ-РЕС4-Віоїіп). Після інкубування протягом 1 години виявили зв'язування біотинілованого антитіла за допомогою кон'югату пероксидаза хріну-стрептавідин (Тпегто Зсіепіййс, Саї Мо. 21132), після чого додали
АВТЗ5 (КРІ, Саї Мо. 50-66-06).
Усі антитіла проти С5 застосовували як антитіло захоплення і як антитіло виявлення та їх спарували у повному обсязі. Як показано на Фігурі 1, антитіла, що взаємно конкурують, згрупували у 7 епітопних груп: СЕАОб66б8, СЕАОЗ334 та СЕРАОЗ319 згрупували в епітопну групу А,
СЕАОб47, СЕАО589, СЕАОЗ341, СЕАО639, СЕАОб635, СЕАОЗ30 та СЕАОЗ18 згрупували в епітопну групу В, СЕАО538, СЕАО5ОЇ, СЕАО599, СЕАОЗ307, СЕАОЗ6б6, СЕАОЗО5, СЕАОЄ75, СЕАОбб6б та
СЕАОб672 згрупували в епітопну групу С, екулізумаб та СЕАО322 згрупували в епітопну групу 0,
СЕАОЗ329 згрупували в епітопну групу Е, СЕАОЗ359 та СЕАО217 згрупували в епітопну групу Е, та
СЕАОБ579, СЕАОЗ328 та СЕАО272 згрупували в епітопну групу 0. Фігура 1 демонструє зв'язування з епітопом деяких химерних антитіл проти С5. Послідовності МН та Мі антитіл проти С5, згрупованих в епітопну групу С, наведено у Таблиці 2.
Таблиця 2
Антитіла проти С5, згруповані в епітоп С стою? 12137461 56166176 8696 о СЕАоБО МОВ 618 ВЯ о сРАОБІВ 55149889 17908999 свою 61161501 60180 во | ло освАЮЄТ В1Я 5206721 В 92 | 03 сво ав 5333 |В 93 | 3 2.3. Гуманізація та оптимізація
Гуманізацію варіабельної ділянки деяких антитіл проти С5 виконували з метою зниження можливої імуногенності антитіл. Гіперваріабельні ділянки (СОК) антитіла кроля проти С5 трансплантували на гомологічні каркасні ділянки (ЕК) антитіла людини, застосовуючи традиційний для трансплантації СОК підхід (Маїшге 321:522-525 (1986)). Гени, які кодують гуманізовані УН та МІ,, синтезували та поєднали з модифікованою СН людини (55402, 5ЕО ІЮ
МО: 35) та Сі Ідб людини (5К1, 5ЕО ІЮ МО: 38), відповідно, та кожну з комбінованих послідовностей клонували у вектор експресії.
Ряд мутацій та комбінацій мутацій досліджували, щоб ідентифікувати мутації та комбінації мутацій, які покращили властивості зв'язування деяких антитіл-лідерів. Численні мутації потім зробили в гуманізованих варіабельних ділянках, щоб підвищити афінність зв'язування з С5 при нейтральному рН або щоб знизити афінність зв'язування з С5 при кислотному рН. Внаслідок цього з СЕАОЗ3О5 отримали один з оптимізованих варіантів, 305 05 (МН, 5ЕО ІЮО МО: 10; МІ,
ЗЕО ІЮ МО: 20; НМВ-НІ, 5ЕО І МО: 54; НУВ-Н2, 5ЕО ІО МО: 64; НУВ-НЗ, 5ЕО І МО: 74; НУВ-
ІТ, 5ЕО ІЮ МО: 84; НУВ-12, ЗЕО ІЮ МО: 94; та НМЕ-І 3, 5ЕО ІЮ МО: 104).
Антитіла експресували у клітинах НЕК293, спільно трансфектованих сумішшю векторів експресії важкого та легкого ланцюгів, та очистили Білком А.
Приклад З
Характеристика зв'язування антитіл проти С5 3.1. Експресія та очищення рекомбінантних антитіл
Рекомбінантні антитіла транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію Егеезіуіе293-
Е (Тнепто Різпег, Сагізрай, СА, США). Очищення від кондиційованих середовищ, які експресують антитіла, виконували, застосовуючи традиційний спосіб з використанням Білка А.
За необхідністю, далі виконували гель-фільтрацію. 3.2. Оцінка залежності від рН
Кінетичні параметри антитіл проти С5 стосовно рекомбінантного С5 людини оцінювали при рН 7,4 та рН 5,8 при 37 "С, застосовуючи прилад 1200 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна
Зо марка) (СЕ Неайсаге). Ргод/с (Ріегсе) іммобілізували на сенсорному чипі СМ4, застосовуючи набір амінного зчеплення (ЗЕ Неакййсаге) згідно з рекомендованими налаштуваннями СЕ
Неансаге. Антитіла та аналіти розвели у відповідних рухомих буферах, АСЕЗ рН 7,4 та рН 5,8 (20 мМ АСЕ5, 150 мМ Масі, 1,2 мМ Сасі», 0,05 95 Гуееп 20, 0,005 95 МаМз). Кожне антитіло захопили на сенсорну поверхню за допомогою Ргод/5. Рівні захоплення антитіла становили зазвичай 60-90 резонансних одиниць (КІ). Після цього рекомбінантний С5 людини впорскували при концентраціях 10 нМ та 20 нМ або 20 нМ та 40 нМ, після чого відбувалася дисоціація.
Поверхню регенерували за допомогою 20 мМ Маон. Кінетичні параметри в умовах обох рн визначили шляхом узгодження сенсограм з моделлю зв'язування 1:1 із застосуванням програмного забезпечення для оцінки, 1200 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), версія 2.0 (СЕ Неайсаге). Сенсограми усіх антитіл наведено на Фігурах 2А та 28. Швидкість асоціації (Ка), швидкість дисоціації (Ка) та афінність зв'язування (КО) антитіл наведено у
Таблиці 3. Усі антитіла, за виключенням СЕАОЗ30 (МН, 5ЕО ІО МО: 21 та МІ, 5ЕО ІЮ МО: 25) та
СЕАОЗ341 (МН, 5ЕО ІЮ МО: 22 та МІ, 5ЕО ІЮО МО: 26), демонстрували відносно вищу швидкість дисоціації при рН 5,8, ніж при рН 7,4.
Таблиця З
Кінетичні параметри антитіл проти С5 при рН 7,4 та рн 5,8
Назва рн74 рн, антитла Ка ка ко Ка ка ко
СЕАДОЗО5 3.82Е-04 5.89Е-04 1.54Е-08 427404 1.836-02 4.30Е-07
СЕАОЗО? 324ЕО5 2636-03 8.136-09 2.046405 3.34Б-02 1.64Е-07
СЕАОоЗбб 1.04Е-О6 9.34Б-03 8.99Е-09 935605 7.03Е-02 7.52Е-08
СсЕАОБО1 4.74Е4О5 1.696Е-03 3.Б56Е-09 150605 2625-02 1.74Б-07
СЕАОБЗВ 4.73Е--05 1656-03 3.916-09 1.22Е05 3016-02 2.46Е-07
СЕАОБ599 4.74Е:А05 2.816-03 5.936-09 р 4.54Е405 3.736-02 8.21Е-08
СЕДОбОб З.65Е-ОБ5 6.26Е-04 1.71Е-09 2.82Е-05 9.39Е-03 З.33Е-08
СЕАОб72 5.234005 1.83Е-04 3516-10 Р 7.11Е-04 9.786503 1.386Е-07
СЕдОб75 3З.83ЕНОБ 4.12Е-04 1.08Е-09 р 3.89ЕН0О5 6616-03 1.70Е-08 305-005 4.48Е-05 2.11Е)-04 4.71Е-10 1 203Е-06 2856-02 1.40Е-О8
СЕАОЗЗ3О 166ЕНОб 2.02Е-04 1.22Е-10 1 1.22ЕН06 2.24Е-04 1.84Е-10
СЕАОЗАТ 6.28Е-0О5 9.77Е-05 1556-10 р 124606 7.39БЕ-05 5.95Е-11 3.3. Перевірка перехресної реактивності
Для того, щоб спостерігати перехресну реактивність антитіл проти С5 стосовно С5 людини (пС5) та С5 яванської макаки (супоС5), виконували кінетичний аналіз ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Налаштування аналізу були такими самими, як описано у Прикладі 3.2.
Рекомбінантний супоС5 впорскували при концентраціях 2, 10 та 50 нМ. Кінетичні параметри визначили за допомогою такого ж узгодження даних, як описано у Прикладі 3.2. Кінетичні параметри та афінність зв'язування при рН 7,4 наведено у Таблиці 4. Кінетичні параметри стосовно пПС5, наведені у Таблиці 4, - це результати з Прикладу 3.2. Усі антитіла проти С5, за виключенням СЕАОб672, демонстрували порівнянне КО стосовно пС5 та супоС5. КО антитіла
СЕАОб672 стосовно супоС5 було у 8 разів слабшим, ніж стосовно пС5.
Таблиця 4
Кінетичні параметри та афінність зв'язування антитіл проти С5 стосовно ПСО та супоС5 при рН 7,4
Назва афінність до НС5 афінність до супоС5 антитіла ка ка ко ка ка ко
СЕАОЗО5 382Е-04 5896-04 1546-08 | 1.21Єн04 6.700604 5546-09
СЕАОЗО7 324ЕНО5 2.63Е-03 8.13Е-09 1 2.90Е05 2.23Е-03 7.686Е-09
СЕДОЗбб 104Е06б 9.34Е-03 8.99Е-09 | 5.04Е05 904-033 1.79Е-08
СЕАОБО1 4.74ЕлО5 1.89Е-03 3.56Е-09 І 2.66Е-05 1.56Е-03 5.88Е-09
СЕдО5ЗВ 4.73Е0О5 1.85Е-03 3.91Е-09 | 3.056405 1666-03 5.44Е-09
СЕАОБОО 4.74ЕДО5 2,81Е-03 593Е-09 | 5.426405 2.35БЕ-03 4.53Е-09
СЕАдОб66 365ЕНО5 6.26Е-04 1.7У1Е-09 1 3.14Е05 АОЗЕ-04 1.Б7Е-О09
СЕАОб?2 5.23ЕО5 1.83Е-04 3.51Е-10 | 6.41Е:А05 1.85Е-03 2.88Е-09
СЕАОб?5 38305 4.12Е-04 1086-09 | 2946-05 3786-04 1.296Е-09
Приклад 4
Картування епітопів стосовно антитіл проти С5 4.1. Зв'язування МАБ проти С5 з пептидами, що походять від бета-ланцюга С5
Моноклональні антитіла проти С5 (МАБ) тестували щодо їх зв'язування з пептидами, що походять від бета-ланцюга С5, з використанням вестерн-блот аналізу. Пептиди С5: 19-180, 161- 340, 321-500 та 481-660,- злиті з міткою 5тТ (рОЕХ-41-1, СЕ Неайнсагеє І їє 5сіепсев, 28-9545-
49), експресували у Е. соїї (ОНбаїрпа, ТОМОВО, ОМА-903). Зразки Е. соїї зібрали після інкубування з 1 мМ ізопропіл-бета-0-1-тіогалактопірано-зидом (РТ) протягом 5 годин при 37"С та центрифугували при 20000 х д протягом 1 хвилини, та отримали осад. Осад суспендували у буферному розчині для зразків (2МЕ к) (Умако, 191-13272) та застосовували для вестерн-блот аналізу. Експресію кожного пептиду підтвердили антитілом проти 5тТ (Абсат, аБ9085) (Фігура 3). Стрілка вказує на пептиди С5, злиті з 55Т (46-49 кДа). МАБ проти С5:
СЕАОЗ305, СЕАОЗ307, СЕАОЗ6б6, СЕАОБ5О1, СЕАО538, СЕАО599, СЕАОбЄб6б6, СЕАОб672 та СЕАОб75, - зв'язані з пептидом 19-180 С5 (Фігура 3). 4.2. Експресія та очищення домену МО1-Маг2 (1-225) С5 людини
Рекомбінантний домен МОо1-МОе2 (ЗЕО ІЮ МО: 43) бета-ланцюга С5 людини транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію ЕгеезіуЇе293-Е (Тпепто Ріпег, Сагізрай, СА, США).
Кондиційовані середовища, які експресують домен МО1-Мо2, розвели У об'єму води тійо, а потім завантажили у аніонообмінну колонку СО-5ерпагозе ЕЕ (СЕ Ппеайпсаге, Оррзаїа, Швеція).
Потік крізь фракцію з аніонообмінної колонки довели до рнН 5,0 та завантажили у катіонообмінну колонку 5Р-зерпагозе НР (СЕ Ппеаййсаге, Оррзаїа, Швеція) та елюювали в градієнті Масі.
Фракції, що містили домен МО1-МО2, одержали з елюенту та потім завантажили у гель- фільтраційну колонку Зирегдех 75 (ЗЕ ПпПеайпсаге, Оррзаїа, Швеція), урівноважену 1 х РВ5.
Фракції, що містили домен МО1-МО2, потім об'єднали та зберігали при -80 "С. 4.3. Спроможність зв'язування з доменом МО1-МОа2
Спроможність зв'язування антитіл проти С5 з доменом МО1-МО2 вимірювали, застосовуючи такі самі налаштування для аналізу, як описано у Прикладі 3.2, за виключенням того, що вимірювання виконувалися тільки при рН 7,4. Домен МО1-МО2 впорскували при концентраціях 20 НМ та 40 нМ. Як показано на Фігурі 4, усі антитіла, за виключенням екулізумаб-760с4, демонстрували підсилення реакції зв'язування, вказуючи на те, що ці антитіла зв'язуються з
МИа1-МО2. Екулізумаб-Р76004, відоме як антитіло, що зв'язується з альфа-ланцюгом, не демонструвало зв'язування з доменом МО1-Ма2. 4.4. Зв'язування МАБ проти С5 з пептидами, що походять з домену МО1-МО2 С5
МАБ проти С5 тестували щодо їх зв'язування з пептидами, що походять з домену МО1-Маг2, із застосуванням вестерн-блот аналізу. Пептиди С5: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 та
Зо 45-111 (5ЕО ІО МО: 40),- злиті з міткою О5Т, експресували у Е. сої. Зразки Е.соїї зібрали після інкубування з 1мМ ІРТО протягом 5 годин при 37 "С, та центрифугували при 20000 х у протягом 1 хвилини, та отримали осад. Осад суспендували у буферному розчині для зразків (2МЕ жк) та застосовували для вестерн-блот аналізу. Експресію кожного пептиду, що походить з С5, підтвердили антитілом проти 51 (Фігура 5А). СЕАОЗО5 зв'язалося тільки з пептидом 33-124 (Фігура 58). СЕАОЗО5 зв'язалося з бета-ланцюгом рекомбінантного С5 людини (гпс5) (приблизно 70 кДа), який застосовувався як контрольний. На Фігурі 5С узагальнено реакцію МАБб проти С5 з пептидами, що походять з С5. 4.5. Зв'язування МАБ проти С5 з мутантами С5
Оскільки внаслідок аналізу кристалічної структури було передбачено, що три амінокислотні залишки у бета-ланцюгу С5-Е48, Ю51 та К109 - залучаються у зв'язування між С5 та МАБ проти
С5, то МАБ проти С5 тестували щодо їх зв'язування з точковими мутантами С5 людини з використанням вестерн-блот аналізу. Точкові мутанти С5, у яких будь-який з Е48, 051 та К109 був заміщений аланіном, експресували у клітинах Е5293 за допомогою ліпофекції. Культуральні середовища зібрали за 5 днів після ліпофекції, а після цього застосовували для вестерн- блотингу. ХО5З-РАСЕ виконували при відновлювальних умовах. Результати наведено на Фігурі б. Екулізумаб зв'язалося з альфа-ланцюгом природного (М/Т) С5 та трьома точковими мутантами С5, тоді як СЕАОЗО5 сильно зв'язалося з бета-ланцюгом М/Т С5, слабо зв'язалося з мутантом С5 Е48А та не зв'язалося з бета-ланцюгом мутантів С5 Ю51А та К109А, що вказує на те, що ці три амінокислотні залишки залучаються до взаємодії антитіло/антиген. У Таблиці 5 наведено узагальнені результати вестерн-блот аналізу МАБ проти С5 (СЕАОЗ30О5, СЕАОЗ07,
СЕАОЗ6б, СЕАОБОЇ, СЕРАО538, СЕАО599, СЕАОббб, СЕАОбУ2 та СЕАОб75). МАБ проти С5 згруповано в одну епітопну групу С, проте профілі зв'язування незначно різняться між антитілами, що дозволяє припустити, що ділянки зв'язування С5 з МАБ проти С5 розташовані близько одна до одної, проте вони не є ідентичними.
Таблиця 5
Узагальнення реакції МАБ проти С5 з мутантами С5
УУТ ЕЯ4ЗА 051А КІЗ
Екулізумаб я я я щі
СЕАОЗО5 я Е; - -
СЕАДО307 я - - -
СЕАОЗБЬ ке - - -
СЕДО5О1 ї - - -
СРАО538 ни - - -
СРАО599 я - - їх
СЕАОБбеб в - - Ж
СЕДОБ?72 я - - я
СЕАОБ75 я - - я 4.6. Аналіз зв'язування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти С5 з мутантами С5
Для того, щоб здійснити тест того, чи дійсно залишки Е48, 551 та К109 залучаються у взаємодію антитілолєантиген, виконували аналіз зв'язування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Приготували три мутанти С5-Е48А, С51А та КТО9А, - як описано у Прикладі 4.5. Зразки культуральних надосадових рідин, що містили мутантний С5, який надмірно експресувався у клітинах Е5293, приготували у концентрації 40 мкг/мл мутантного С5. Для аналізу зв'язування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) зразок розвели 10 х рухомим буфером ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) (АСЕ5 рн 7,4, 10 мг/мл В5А, 1 мг/мл карбоксиметилдекстрану) до кінцевої концентрації 4 мкг/мл зразка мутантного С5.
Взаємодії трьох мутантів С5 з антитілами проти С5 оцінювали при 37 "С за допомогою приладу 1200 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) (ЗЕ Неайвсаге), застосовуючи умови аналізу, описані у Прикладі 3.2. Буфер АСЕ5З рН 7,4, що містив 10 мг/мл ВЗА, 1 мг/мл карбоксиметилдекстрану, застосовували як рухомий буфер. Екулізумаб-Е760054 та 305І 05 захопили на різні потокові комірки за допомогою моноклонального мишачого антитіла проти ЇДО людини, яке є специфічним до фрагмента Ес (СЕ НеайПсаге). Потокову комірку 1 застосовували як посилальну поверхню. Білки природного та мутантного С5 впорскували на сенсорну поверхню у концентрації 4 мкг/мл, щоб вони взаємодіяли із захопленими антитілами. Наприкінці кожного циклу аналізу сенсорну поверхню регенерували за допомогою ЗМ МасСі». Результати проаналізували за допомогою програмного забезпечення Віа Емаїнцаййо, версія 2.0 (СЕ
Неайсаге). Криві посилальної потокової комірки (потокова комірка 1) та холостих впорскувань рухомого буферу відняли від кривих потокової комірки із захопленими антитілами.
Як показано на фігурі 7, усі три мутанти С5 змогли зв'язатися з екулізумабом з подібним до природного С5 профілем зв'язування. Для 305.05 усі три мутанти продемонстрували нижчу реакцію зв'язування з 305 05, порівняно з природним С5. Мутанти Ю51А та К109А знизили зв'язування С5 з 305І 05 до початкового рівня. 4.7. Ідентифікація залишків Ні в С5, які сприяють залежній від рН взаємодії між антитілом
Зо проти С5 та С5
Аналіз кристалічної структури дозволив виявити, що три гістидинові залишки в С5 людини розташовані в зоні взаємодії антитіло/антиген. Відомо, що залишок гістидину зі звичайним рКа, що становить приблизно 6,0, сприяє залежній від рН взаємодії білок-білок (Ідама еї аї., Віоспіт
Віорпуз Асіа 1844(11):1943-1950 (2014)). Для того, щоб дослідити, які із залишків Ні в зоні взаємодії антитіло/"антиген сприяють залежним від рН взаємодіям між антитілом проти С5 та
С5, виконували аналіз зв'язування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). Три мутанти
С5 людини з єдиною мутацією Ніз (Н7ОУ, Н72У та НІ110У) та мутанта з подвійною мутацією Ні (Н7ТОЖаеНІТ10У) отримали наступним чином: мутантів з єдиним Ні, у яких будь-який з Н7О, Н72 та НІ10 заміщений тирозином, та мутанта з подвійним Ніх5, у якому обидва Н7О та НІ110 заміщені тирозином, експресували у клітинах Е5293 за допомогою ліпофекції. Властивості антигенного зв'язування мутантів С5 із заміщеним Ні5 з 30505, що є залежним від рн антитілом проти С5, визначили за допомогою модифікованого аналізу ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка), як описано у Прикладі 4.6. Стисло кажучи, додаткову фазу дисоціації при рН 5,8 здійснювали в аналізі ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) одразу після фази дисоціації при рН 7,4 для того, щоб оцінити залежну від рН дисоціацію утворених при рН 7,4 комплексів антитіла та антигену. Швидкість дисоціації при рН 5,8 визначили шляхом обробки та узгодження даних, застосовуючи програмне забезпечення узгодження кривих бсгиррег 2.0 (ВіоГ одіс 5ОПмМаге).
Як показано на фігурі 8, єдина мутація Ніх у С5 на Н7О або НІ110 та подвійна мутація Ніб (Н7О ж НІ10) не вплинули на зв'язування С5 з 305І 05 при нейтральному рН. Між тим, єдина мутація Ніх на Н72 демонструвала суттєве порушення зв'язування С5 з 3051 05. Константи дисоціації при рН 5,8 мутантів С5 із заміщеним Ні та білка природного С5 (С5-мі) наведено у
Таблиці 6. Як показано у Таблиці 6, природний С5 демонстрував найшвидшу дисоціацію від 30505 при рн 5,8 серед антигенів С5, що тестувалися. Єдина мутація Ні5 на Н7о0 демонструвала майже у два рази нижчу швидкість дисоціації при рн 5,8, а єдина мутація Ні на
НІ10 спричинила незначно нижчу швидкість дисоціації при рН 5,8 порівняно з природним С5.
Подвійна мутація на обох Н7О та НІ110 зумовила більший вплив на залежне від рН зв'язування, при цьому швидкість дисоціації при рН 5,8 майже у три рази нижча, ніж у природного С5.
Таблиця 6
Значення констант дисоціації при рН 5,8 для мутантів Ні С5, що зв'язуються з ЗОМ О5
Антигени ка (1с)
С5-м 11Е-2
С5-НОУ 5.ЗЕ-3 б5-НІ110х 9 3-3
С5-Н?ОХ, НІ1оу З.9Е-3
Приклад 5
Інгібувальна активність антитіл проти С5 стосовно активації С5 5.1. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 випробовували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 95) (Віоргедісє, з«ЕКО18) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при 25 "С. Ліпосоми, сенсибілізовані антитілами проти динітрофенілу (АшіоКй СН5БО,
Ммако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 25 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшіоКкії СН5ЬО) додали до кожної комірки та
Зо змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 25 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин, після цього виміряли оптичну щільність (00) суміші при 340 нм.
Відсоток лізису ліпосом визначили як 100ХОО маь-ОЮ фон сироватки та ліпосом)ЙХОЮ без мАь-ОЮ фон сироватки та ліпосом)). Фігура УА демонструє, що МАБ проти С5: СЕАОЗ305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672 та 0675 - інгібували лізис ліпосом. Два не залежні від рН антитіла СЕАОЗ330 та 0341 також інгібували лізис (Фігура 9В). 5.2. Інгібування утворення С5а антитілами МАБ проти С5
МАВ проти С5 випробовували щодо утворення С5а під час лізису ліпосом, щоб підтвердити, що МАБ проти С5 інгібують розщеплення С5 на С5а та С5Б. Рівень С5а в надосадових рідинах з аналізу лізису ліпосом кількісно визначили, застосовуючи набір Сба ЕГІБА (НО зувієтв, рхуго37). Усі МАБ інгібували утворення С5а в надосадових рідинах залежним від дози чином (Фігури 10А та 108В). 5.3. Інгібування активованого комплементом гемолізу антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування класичної активності комплементу у гемолітичному аналізі. Еритроцити курчати (СКВС5) (Іппомаїїме гезеагсп, ІС0О5-0810) промили забуференим сольовим розчином з желатином/вероналом, який містив 0,5 мМ Масі» та 0,15 мМ
Сасі» (БМВ---) (Возюп ВіоРгодисів, ІВВ-300Х), а потім сенсибілізували антитілом проти КВС курчати (КосКІапа 1003-4139) у концентрації 1 мкг/мл протягом 15 хвилин при 4 "С. Клітини потім промили СУВа- та суспендували в такому ж самому буфері зі щільністю 5 х 107 клітин/мл. В окремому планшеті з 96 круглодонними комірками для мікротесту змішали 50 мкл сироватки здорової людини (20 95) (Віоргедісє, ЗЕКО19) з 50 мкл розведеного МАБ та інкубували на шейкері при 37 "С протягом 30 хвилин. 60 мкл суспензії сенсибілізованих СКВС потім додали до комірок, що містили сироватку, та суміш антитіла інкубували при 37 "С протягом 30 хвилин. Після інкубування планшет центрифугували при 1000 х уд протягом 2 хвилин при 4 "С. Надосадові рідини (100 мкл) перенесли до комірок на планшеті з 96 комірками з пласким дном для мікротесту для вимірювання ОО при 415 нм з посилальною довжиною хвилі 630 нм. Відсоток гемолізу визначили як 100 х (ФВ); мАь-ОО сироватка та спвс)|/ ФВ) без МАН-ОЮ фон сироватки та ство). Фігура 11 демонструє, що МАВ проти С5-СЕАОЗ05 та 3051 О5 - інгібували гемоліз СКВС. 5.4. Інгібування альтернативного шляху комплементу антитілами МАБ проти С5
Гемолітичний аналіз для альтернативного шляху виконували подібним до класичного шляху способом гемолітичного аналізу. Кров, узяту у новозеландського білого кроля (ІпмМімо5), змішали з таким самим об'ємом розчину АїЇбемег5 (бБідта, АЗ551) та цю суміш застосовували як еритроцити кроля (КВС). "гКВС промили ЗУВ з доданими 2 мМ МаосСіг та 10 мМ ЕСТА та суспендували у такому ж самому буфері зі щільністю 7 х 108 клітин/імл. У планшеті з 96 круглодонними комірками для мікротесту змішали 40 мкл сироватки здорової людини (25 95) (Віоргедісє, БЕКО19) з 40 мкл розведеного МАБ та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при 37 "С. Потім до комірок, що містили сироватку, додали 20 мкл суспензії "КВС та інкубували суміш з антитілами при 37 "С протягом 60 хвилин. Після інкубування планшет центрифугували при 1000 х 4 протягом 2 хвилин при 4 "С. Надосадові рідини (70 мкл) перенесли до комірок на планшеті з 96 комірками з пласким дном для мікротесту для вимірювання ОО при 415 нм з посилальною довжиною хвилі 630 нм. Фігура 12 демонструє, що МАБ проти С5-СЕАОЗО05 та
СЕАОб672 - інгібували гемоліз ГЕВС, що вказує на те, що ці антитіла інгібують альтернативні шляхи комплементу.
Приклад 6
Дослідження фармакокінетики моноклональних антитіл проти С5 з С5 людини у мишей 6.1. Тест іп мімо із застосуванням мишей С57ВІ /6
Кінетику іп мімо С5 людини (СаїІріоспет) та антитіла проти С5 людини оцінювали після введення тільки С5 людини або С5 людини та антитіла проти С5 людини мишам С57ВІ/6 (Іп
Зо Мімо5 ог Віоіодіса! Кезоцгсе Сепіге, Зіпдароге). Розчин С5 людини (0,01 мг/мл) або розчин суміші, що містить С5 людини та антитіло проти С5 людини (0,01 мг/мл та 2 мг/мл (СЕАОЗ305-
Е760с24, СЕРАОЗО7-Е760с04, СЕАОЗ66-Е760с4, СЕРАОБО1-Е760с4, СЕАО538-Р76004, СЕАОБ99-
Е760с24, СЕАОббб-Е76004, СЕАОб72-Е760054 та СЕАОб75-Е76004) або 0,2 мг/мл (СЕАОЗ330-
Е76004 та СЕАОЗ341-Е76004), відповідно), вводили один раз у дозі 10 мл/кг у хвостову вену. У цьому випадку антитіло проти С5 людини є присутнім у надмірній кількості порівняно з С5 людини, та, внаслідок цього, передбачається, що майже кожен С5 людини зв'язується з антитілом. Кров узяли через 5 хвилин, сім годин, один день, два дні, три дні та сім днів після введення. Узяту кров потім одразу центрифугували при 14000 обертах за хвилину та при 4 С протягом 10 хвилин, щоб відокремити плазму. Відокремлену плазму зберігали у морозильнику при -80 "С до аналізу. Антитіла проти С5 людини, що застосовувалися, - це вищеописані
СЕАОЗО5-Е760с24, СЕАОЗО7-Е760024, СЕАОЗЗ30-Е76004, СЕАОЗ41-Е760с24, СЕАОЗб66-Е760С4,
СЕАОБО1-Е760с24, СЕАО538-Е76004, СЕАОБ599-Е76004, СЕАОбб66-Е76004, СЕАОб72-Е76064 та
СЕАОб75-Е760С4. 6.2. Вимірювання концентрації у плазмі сумарного С5 людини за допомогою аналізу електрохемілюмінесценції (ЕСІ)
Концентрацію сумарного С5 людини у мишачій плазмі вимірювали за допомогою ЕСІ.
Наступний спосіб застосовували у присутності СЕАОЗ330-Е76004, СЕАОЗ41-Р760054 або тільки С5 людини у зразку плазми. Антитіло проти С5 людини (Запіа Сги7) розподілили. у незакритий планшет з 96 комірками МОЇ ТІ-АККАМ (Мезо Зсаїе Оізсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4 "С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом проти
С5 людини. Зразки для калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше, з 1 мкг/мл впорскнутого антитіла отримали та інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене БЦ РО-ТАС антитіло проти до людини (Мезо зсаїе Оізсомегу), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Вийег Т (х4) (Мезо Зсаіє Оібзсомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи Зесіог Ітадег 2400 (Мезо зсаїе Оізсомегу).
Наступний спосіб застосовували у присутності СЕАО305-Е760024, СЕАОЗО7-Е760С4, (510) СЕАОЗб66-Е760с4, СЕАОБО1-г760с24, СЕАО538-Р76004, СЕАОБ599-Е76004, СЕРАОбб6-Е760С4,
СЕАОб72-Е760054 або СЕАОбЄ75-Е760Сс14 у зразку плазми. Антитіло проти С5 людини (СЕАОЗ329-
Е93904; МН, 5ЕО ІЮО МО: 23 та МІ, 5ЕО ІО МО: 27) розподілили у незакритий планшет з 96 комірками МО ТІ-АККАМ (Мезо Зсаіе Оізсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4 "С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини.
Зразки для калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше кислотним розчином (рН 5,5), отримали та інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С. Після цього ці зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене
ЗИ РО-ТАС антитіло проти С5 людини (СЕАОЗ300-Е939054; МН, 5ЕО ІЮО МО: 24 та М, 5ЕО ІЮ
МО: 28), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Вийег Т (х4) (Мезо 5саїеє Оібсомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи з5есіог Ітадег 2400 (Мезо зсаїе Різсомегу).
Концентрацію С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїесшаг Ремісе5). Часову динаміку концентрації С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на Фігурі 13. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією С5 людини у плазмі через 5 хвилин. 6.3. Вимірювання концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі за допомогою аналізу
ЕС
Концентрацію антитіла проти С5 людини у мишачій плазмі вимірювали за допомогою ЕСІ.
Фрагмент антитіла Е(ар)2 проти (дсС людини (специфічний до гамма-ланцюга) (Зідта) або антитіло проти каппа-ланцюга ІдсС людини (Апібоду Зоїшщіоп5) розподілили у незакритий планшет з 96 комірками МОСТІ-АННАМ (Мезо зсаїе Оізсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4"С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом або фрагментом антитіла проти (390 людини. Приготували зразки калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом або фрагментом антитіла проти (ДС людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали біотиніловане антитіло проти дб людини (ЗоціПпегпріоїесп!) або мічене ЗОГЕРО-ТАС антитіло проти Ес дб людини
Зо (ЗошїПегпріоїесі)), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього тільки, коли застосовували біотиніловане антитіло проти ІДС людини, додали мічений ЗШ ЕО-ТАС стрептавідин (Мезо Зсаіе Оібзсомегу), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Випйег Т (х4) (Мезо ЗсаїІе Оіз5сомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи Бесіог Іптадег 2400 (Мезо зЗсаіє Оізсомегу). Концентрацію антитіла проти С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїесшаг Оемісе5). Часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на Фігурі 14. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією антитіла проти С5 людини у плазмі через 5 хвилин. 6.4. Вплив залежного від рН зв'язування антитіла проти С5 людини на кліренс С5 людини іп мімо
Залежні від рН антитіла проти С5 людини (СЕАОЗ305-Е760214, СЕАОЗО7-Е760с4, СЕАОЗбб-
Е760с24, СЕАОБО1-760024, СЕАО538-Е76004, СЕАОБ99-Е760с4, СЕАОббб-Е76004, СЕАОб72-
Е760с4 та СЕРАО675-Е760054) та не залежні від рН антитіла проти С5 людини (СЕАОЗ330-Е760с4. та СЕАОЗ341-Е76004) тестували іп мімо та порівняли отриману концентрацію у плазмі антитіла проти С5 людини та концентрацію у плазмі С5 людини. Як показано на Фігурі 14, вміст антитіла в плазмі був порівняним. Між тим, кліренс С5 людини, введеного одночасно з залежними від рН антитілами проти С5 людини, прискорився порівняно з кліренсом С5 людини, введеного з не залежними від рН антитілами проти С5 людини (Фігура 13).
Приклад 7
Оптимізація моноклональних антитіл проти С5 (варіанти 305)
Зробили ряд мутацій в оптимізованій варіабельній ділянці антитіла проти С5 305 05, щоб далі покращити його властивості, та отримали оптимізовані варіабельні ділянки 3051 015, 305 016, 305І 018, 305І 019, 3051 020, 3051 022 та 3051 023. Амінокислотні послідовності УН та
МІ. варіантів 305 наведено у Таблицях 7 та 8, відповідно. Гени, які кодують гуманізовану МН, поєднали з модифікованим варіантом СН ІдсС!1 людини - 505115 (ЗЕБО ІО МО: 114) та модифікованими варіантами СН Ід04 людини - 55422 (ЗЕО ІО МО: 115) або 565429 (ЗЕО ІЮ МО: 116). Гени, які кодують гуманізовану МІ, поєднали з Сі людини (5К1, 5ЕО ІО МО: 38). Окремо бо гени важкого та легкого ланцюгів, які кодують гуманізоване антитіло проти С5, ВМО441
(ВМО441Н, 5ЕО ІЮ МО: 149; ВМО4411, ЗЕО ІО МО: 150), синтезували та кожен ген клонували у вектор експресії.
Антитіла експресувалися у клітинах НЕК 293, трансфектованих спільно комбінацією векторів експресії важкого та легкого ланцюгів, та їх очистили Білком А.
Таблиця 7
Амінокислотні послідовності МН варіантів 305
БУКА АУТО5ОАТУКААУдКО ВОоОХОУРІНАМНУ
МА АТО АКТКАЄУАКО РАСУПУРТНАМНУ
З5УУМА АТОМА ЕТКАЕУММУКОИа ВАСЧУОУРТНАМНУ
УМА АНТ АЕУКАЕДАКО ПАСУВУРТНАМНУ
ЗИМА АІРТО5БОАЄЕУКАЕУАКИ ДАСУОУРТНАМНУ
З МА АТЕТВУЗАЕТКАЕМАКО рАЗУОХРТНАМНУ 55УИМА АІТО5ОАЕУКАЕ ТАКО ОАСУОУРТНАМНЄ
З5УУМА СІЕТОЗСАТУКАЕАКО РАСХОХУРТНАМНУ
Таблиця 8
Амінокиспотні послідовності Мі варіантів 305 аАМНОЗА БЗАЗКТНУ О5ТКкмазоМн
НАБОСІЗ5БІА САБЕТЕЄ амткусе5уєм
КАЗОСІЗ5МА ЗАБЕТЕЗ ОоМнТКкУсЗа МЕ
КАБЗОСІ55ІА САБЕТЕ5 амткУо55хаМ
КАВА ОСАБЕТЕ5 аМтКкУСБЗУСІЕ
ВАЗИ А сАБЕТЕ5 аМТкмсазЗа Ме
КАБОабІБ55ІА БА5ТТО аМмткУсоао МТ
КАЗОСИ55МА БАЗІТО5 ОоМмТКУсЗУсМ
Приклад 8
Характеристика зв'язування антитіл проти С5 (варіантів 305)
Кінетичні параметри антитіл проти С5 стосовно рекомбінантного С5 людини оцінювали при 37"С із застосуванням приладу 1200 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) (СЕ
Неакйсаге) при трьох різних умовах: (1) асоціацію і дисоціацію вимірювали при рн 7,4, (2) асоціацію і дисоціацію вимірювали при рН 5,8 та (3) асоціацію вимірювали при рН 7,4, а дисоціацію вимірювали при рН 5,8. РгоА/Зз (Ріегсе) іммобілізували на сенсорному чипі СМІ1, застосовуючи набір для амінного зчеплення (ЗЕ Неайсаге) згідно з рекомендованими СЕ
Неайсаге налаштуваннями. Антитіла та аналіти для умов (1) та (3) розвели у буфері АСЕ5 рН 7,4 (20 мМ АСЕЗ5, 150 мМ Масі, 1,2 мМ Сасі», 0,05 ую Гиееп 20, 0,005 9о Мам»), а для умови (2) їх розвели у буфері АСЕЗ рН 5,8 (20 мМ АСЕ5, 150 мМ Масі, 1,2 мм Сасі», 0,05 95 Тжмеєп 20, 0,005 956 Мам»). Кожне антитіло захопили на сенсорну поверхню за допомогою РгоА/5. Рівні захоплення антитіла становили зазвичай 60-90 резонансних одиниць (КИ). Після цього рекомбінантний С5 людини впорскували при від З нМ до 27 нМ або від 13,3 нМ до 129 нМ, отриманими внаслідок трикратного серійного розведення, а потім відбулася дисоціація.
Поверхню регенерували, застосовуючи 25 мМ Маон. Кінетичні параметри при умовах (1) та (2) визначили шляхом узгодження сенсограм з моделлю зв'язування 1:1, а константу дисоціації при умові (3) визначили шляхом узгодження сенсограм з дисоціацією 1:11 для моделі МСК, застосовуючи програмне забезпечення Т200 Емаїчайоп ВІАСОРЕ (зареєстрована торговельна марка), версія 2.0 (СЕ Неайксаге). Залежність від рН усіх антитіл показано як відношення констант дисоціації для умов (2) та (1).
Константу асоціації (Ка), константу дисоціації (Ка), афінність зв'язування (КО) та залежність від рН наведено у Таблиці 9. Усі антитіла демонстрували більшу швидкість дисоціації при рн 5,6, ніж при рН 7,4, та їх залежність від рН була приблизно 20-кратною.
Таблиця 9
Кінетичні параметри варіантів антитіла проти С5 за умов рН 7,4 та рн 5,8 окаєс/Мс) ка(1/сє КО(М) | кас/мМмс) ока(фс) КОМ) | Кка1/с) | залежність дОо1т5-55422 | 1А0ЕНОВ 4419-04 3.00Б-140| 1,34ЕО5 8,79Б-03 6.57Б-08 1.615-02)| 21.0
ІО15-5:5115 1.341506 3.54Б-04 2705-10 9.49Е04 8272-03 8.72Б-0О8 1,67Б-02) 234
І 016-55422 | 1.28ЕА0О6 4.12Е-04 3.21Е-40| 1.09Е-05 869Е-03 7.95Е-О08 161-029, 21.1
Ії О18-5658422 | 1.36Е0О6 4.26Е-04 3.14Е-10) 1.39Е05 865БЕ-03 6.24Е-08 1689-02, 29.3
СОо19-55422 41.87ЕчО6 4.76Е-04 3.46БЕ-19)| 1.38ЕО5 8.30Е-03 б.00БЕ-О8 І1.615-02. 174
МО20-501151.44Ез06 4,67Е-04 3245-10) 14105 8.18Б-03 5.816-08 |1.615-02. 17,5 1020-56422 13506 8470-04 349-100) 136205 8156-03 5.996Е-08 1556-02. 17.3
ГОо22-55115 /1.46Е 06 3.82Е-04 262-401 1.711605 9.30БЕ-03 5.45БЕ-08 |1.46Е-02. 274.3
ІО23-50115 153608 42304 2.77Е-10) 1.33Е05 8552-03 6.41Б-08 |1.73Е-02. 20.2
Афінність зв'язування антитіл проти С5 (ВМ.О441, екулізумаб та варіант 305) з рекомбінантним С5 людини при рН 7,4 та рН 5,8 визначили при 37 "С, застосовуючи прилад
Т200 ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) (СЕ Неайсаге), щоб оцінити вплив рН на зв'язування антигену. Поліклональне антитіло козла проти Ес дб людини (КРІ. 201-10-20) іммобілізували на сенсорному чипі СМ4, застосовуючи набір для амінного зчеплення (СЕ
Неапйсаге) згідно з рекомендованими виробником налаштуваннями. Антитіла та аналіти розвели буфером АСЕ5 рН 7,4 або буфером АСЕ5 рн 5,8, які містили 20 мМ АСЕ5, 150 мМ масі, 1,2 мМ Сасі», 0,0595 Тмжееп 20 та 0,00595 МаМз. Антитіла захопили на сенсорну поверхню, застосовуючи спосіб анти-ЕРс, рівні захоплення зазвичай становили 50-80 резонансних одиниць (КШ). Рекомбінантний С5 людини отримали внаслідок трикратного серійного розведення, починаючи з умов аналізу 27 НМ для рн 7,4 або з умов аналізу 135 нм для рН 5,68. Поверхню регенерували, застосовуючи 20 мМ НС, 0,01 95 Тмееп 20. Дані обробили та узгодили з моделлю зв'язування 1:1, застосовуючи програмне забезпечення ВіаЕЄма|Ічайоп 2.0 (БЕ Неайнсагє).
Афінність зв'язування (КО) ВМ.О441, екулізумабу та варіанта 305 з рекомбінантним С5 людини при рН 7,4 та рН 5,8 наведено у Таблиці 10. Варіант 305 демонстрував відношення (КО при рН 5,8) / (КОпри рН 7,4), яке становить майже 800, що у 8 разів перебільшує таке відношення для ВМО441, яке продемонструвало відношення (КО при рН 5,8) / (КО при рН 74),
Зо яке становило лише 93.
Таблиця 10 днтитіло ко (М) Відношення КО рн 4 рН58 при рН 5,9/рН 74
Баріант 305.05 1666-10 1,32Е-07 795
Екулізумаб 142-410 2,54Е-09 19
Приклад 9
Інгібувальна активність антитіл проти С5 (варіанти 305) на активацію С5 9.1. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5 бо
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 90) (Віоргедісє, зЗЕКО19) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Розчин ліпосом, сенсибілізований антитілами проти динітрофенілу (АшоКкії СН5О, УУако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшіоКії СН5О) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток лізису ліпосом визначили як поро» (Ф)в) мАь-ОО фон сироватки та ліпосом ЛОЮ без мА-ОЮ фон сироватки та ліпосом) |.
Фігура 15 демонструє, що МАБ проти С5: 305І 015-50422, 305І 016-52:422, 305І 018-5Ц2:3422, 305 019-523422, 3051 020-535422 та 3051 020-52(2:115 - інгібували лізис ліпосом. Антитіла з варіантами Ес, 3051 015-505115 та 305І 023-505429, також інгібували лізис ліпосом (Фігура 16).
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування рекомбінантного С5 людини (ЗЕО ІО МО: 39). 10 мкл сироватки людини з дефіцитом С5 (Зідта, С1163) змішали з 20 мкл розведеного МАБ та 20 мкл рекомбінантного С5 (0,1 мкг/мл) у планшеті з 96 комірками та планшет інкубували на шейкері протягом 1 години при 37 "С. Ліпосоми (АшоКії СН5О) перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшокКії
СН5О) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 180 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток лізису ліпосом визначили, як описано вище. Фігура 17 демонструє, що МАБ проти
С5: 305 022-504115, 305 022-512:422, 305 023-55115 та 305 023-52:422 - інгібували лізис ліпосом. 9.2. Інгібування утворення С5а антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо утворення С5а під час лізису ліпосом, щоб підтвердити, що
МАБ проти С5 інгібують розщеплення С5 на Сба та С5Б. Рівні Сба в надосадових рідинах кількісно визначили з аналізу лізису ліпосом, застосовуючи набір Сба ЕГІБА (КО 5узіетв5, рхуго37). Усі МАБ інгібували утворення С5а в надосадових рідинах залежним від дози чином (Фігури 18 та 19). 9.3. Вимірювання активності комплементу у плазмі яванської макаки
Зо МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу у плазмі яванської макаки. Мавпам ввели МАБ проти С5 (20 мг/кг) та зразки плазми брали періодично до 56 дня.
Еритроцити курчати (СЕВС) (Іппомаїїме гезеагсй, ІС0О5-0810) промили забуференим сольовим розчином з желатином/вероналом, який містив 0,5 мМ Масі» та 0,15 мМ Сасіг (СМВ---) (Вовіоп
ВіоРгодисіх, ІВВ-300Х), та після цього сенсибілізували антитілом проти еритроцитів курчати (НосКіапа 1003-4139) у концентрації 1 мкг/мл протягом 15 хвилин при 4 "С. Клітини потім промили
МВ та суспендували у такому ж самому буфері із щільністю 1 х 108 клітин/мл. В окремому планшеті для мікротесту з 96 круглодонними комірками плазму мавпи інкубували з сенсибілізованими сСКВС при 37 "С протягом 20 хвилин. Після інкубування планшет центрифугували при 1000 х уд протягом 2 хвилин при 4 "С. Надосадові рідини перенесли до комірок на планшетах для мікротесту з 96 комірками з пласким дном для вимірювання ОО при 415 нм з посилальною довжиною хвилі 630 нм. Відсоток гемолізу визначили як 100ХОЮ після введення - СОЮ) фон плазми та свВС) ЙО до введення - СОЮ фон плазми та сявс)|. Фігура 20 демонструє, що МАБ проти С5: 305 015-5205422, 3051 015-5Х1212115, 305І 016-52:422, 305І 018-5:22422, 305І 019-51(2422, 305 020-512:422, 3051 020-565115 та 305 023-52023115 - інгібували активність комплементу у плазмі. 9.4. Інгібування біологічної активності варіантів С5 антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування варіантів рекомбінантного С5 людини: М145І,
К4490, У802І, К885Н, К9280, 0966У, 51310М та Е14370. Повідомлялося, що пацієнти з РМН, які мають мутацію К885Н в С5, демонструють низьку реакцію на екулізумаб (дивись, наприклад,
МівПітигта еї аї., Мем/ Епаді. у. Мей. 370:632-639 (2014)) Кожен з варіантів С5 людини експресували у клітинах Е5293 та надосадові рідини застосовували для наступного дослідження. 10 мкл сироватки людини з дефіцитом С5 (Зідта, С1163) змішали з 20 мкл розведеного МАБ та 20 мкл культурального середовища клітин, яке містило варіант рекомбінантного С5 (2-3 мкг/мл), у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 0,5 години при 37 "С. Ліпосоми (АшіоКИй СН5ТО) перенесли у кожну комірку та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшіоКкіИї СН5БО) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "с.
Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 90 хвилин, а після цього виміряли ОО при 340 нм.
Відсоток лізису ліпосом визначили, як описано вище. Фігура 21 демонструє, що МАБ проти С5 60 (екулізумаб) не інгібував варіант С5 К885Н, проте інгібував інші варіанти С5, що тестувалися.
Фігура 22 демонструє, що МАБ проти С5 (варіант 305) інгібував усі варіанти С5, що тестувалися. 9.5. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 90) (Віоргедісє, з«ЗЕКО19) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Розчин ліпосом, сенсибілізований антитілами проти динітрофенілу (АшоКкії СН5О, УУако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 25 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшіоКії СН5О) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 25 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток інгібування лізису ліпосом визначили як 100хХ(О0 МАЬ-ОЮ фон сироватки та ліпосом МОЮ без МАБ-ОЮ фон сироватки та ліпосом)). Фігура 23 демонструє, що МАБ проти С5-8М.О)441 та варіант 305 - інгібували лізис ліпосом та що варіант 305 має сильнішу активність зв'язування, ніж ВМ.О441.
Приклад 10
Дослідження фармакокінетики моноклональних антитіл проти С5 (305 варіантів) у яванського макака 10.1. Тест іп мімо із застосовуванням яванського макака
Кінетику іп мімо антитіла проти С5 людини оцінювали після введення антитіла проти С5 людини яванському макаку (Зпіп Мірроп Віотеадіса! Гарогайогіє5, Ца., Японія). Розчин антитіла проти С5 людини (2,5 мг/мл) вводили один раз у дозі, яка становила приблизно 8 мл/кг, у головну вену передпліччя шляхом інфузії протягом 30 хвилин. Кров узяли перед введенням та через 5 хвилин, сім годин, один день, два дні, три дні, сім днів, чотирнадцять днів, двадцять один день, двадцять вісім днів, тридцять п'ять днів, сорок два дні, сорок дев'ять днів та п'ятдесят шість днів після введення. Узяту кров одразу піддали центрифугуванню при 1700 х д та 4"С протягом 10 хвилин, щоб відокремити плазму. Відокремлену плазму до аналізу зберігали у морозильнику при -70 "С або нижче. Антитіла проти С5 людини отримали, як описано у Прикладі 7. 10.2. Вимірювання концентрації сумарного С5 у плазмі яванського макака за допомогою аналізу ЕГІЗА
Зо Концентрацію сумарного С5 яванського макака у плазмі яванського макака вимірювали шляхом ЕГІЗА. Антитіло проти С5 людини (антитіло, отримане у лабораторних умовах із застосуванням способу, описаного у Прикладі 2) розподілили у планшет Мипс-ІттипоРіаїє
МахізЗогр (Маїде Мипс Іп(егпайопаї) та залишили стояти протягом ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізованим анти-С5 яванського макака. Зразки для калібрувальної кривої та зразки плазми яванського макака, розведені у 20000 разів 0,4 мкг/мл впорскнутого антитіла, приготували та інкубували протягом 60 хвилин при 37 "С. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим анти-С5 яванського макака та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене НРК антитіло проти ДО людини (ЗошїПпегпВіоїесп), та дозволили реагувати протягом тридцяти хвилин при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього додали субстрат для пероксидази хріну
АВТО ЕГІБА НКР Зибзігаїє (КРІ). Сигнал вимірювали за допомогою планшет-ридера при довжині хвилі 405 нм. Концентрацію С5 яванського макака розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення БОЕТттах РКО (МоІесшаг Оемісе5). Часову динаміку концентрації С5 яванського макака у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено у Фігурі 24. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією С5 яванського макака у плазмі перед введенням. Залежні від рН антитіла проти С5 людини (305І 015-523422, 305І 015- зЗа115, 305 016-512:422, 305 018-5041422, 305І 019-520:422, 305І 020-5102:422, 305І О20-5(01115, 305 022-513422, 305І О23-56422 та 305І 023-505115) демонстрували нижче акумулювання С5 у плазмі порівняно з не залежними від рН антитілами проти С5 людини. 10.3. Вимірювання концентрації у плазмі антитіла проти С5 людини за допомогою аналізу
ЕИПЗА
Концентрацію антитіла проти С5 людини у плазмі яванського макака вимірювали за допомогою ЕГІЗА. Антитіло проти каппа-ланцюга Ідс людини (Апіїбоду ЗоїІшіоп5) розподілили у планшет Мипо-ІттипоРіаїе Махізогр (Маде Мипс Іпегпайопа!) та залишили стояти протягом ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізованим антитілом проти Ід людини. Приготували зразки для калібрувальної кривої та зразки плазми яванського макака, розведені у 100 разів або більше. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти дб людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній бо температурі. Потім додали мічене НРК антитіло проти дб людини (ЗошПегпВіоїесі), та дозволили реагувати протягом тридцяти хвилин при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього додали субстрат для пероксидази хріну АВТ5 ЕГІЗА НКР Зибрзігаїе (КРІМ. Сигнал вимірювали за допомогою планшет-ридера при довжині хвилі 405 нм.
Концентрацію антитіла проти С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїіесшаг Ремісев).
Часову динаміку концентрації у плазмі антитіла проти С5 людини після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на фігурі 25. Залежні від рН антитіла проти С5 людини (305. 015-523422, 3051 015-5:12:115, 305І 016-50422, 305І 018-52:422, 305І 019-510422, 305і020-52:422, 3051020-5:12115, 3051022-52422, 3051023-565422 та 305 023-5(2115) демонстрували триваліше напівжиття порівняно з незалежними від рН антитілами проти С5 людини.
Приклад 11
Рентгенівський аналіз кристалічної структури комплексу Раб варіанта 305 та домену МО1 С5 людини 11.1. Експресія та очищення домену МОЇ (20-124) С5 людини
Домен МО1 (амінокислотні залишки 200-124 5ЕБО ІО МО: 39), злитий з міткою 5171 за допомогою лінкера, що розщеплюється тромбіном (55Т-МО1), експресували у штамі В 21 ОЕЗ ріуз5 Е. соїї (Рготеда), застосовуючи вектор рОЕгЕХ-4Т-1 (СЕ Пеаййсаге). Експресію білка індукували 0,1 мМ ізопропіл-бета-О-1-тіогалактопіранозидом (ІРТО) при 25 "С протягом 5 годин.
Дебрис бактеріальних клітин піддали лізису із застосуванням коктейлю Видривіег (МегсК) з доданими лізоназою (МегсК) та повним коктейлем інгібіторів протеаз ("сотрієїе ргоїєазе іппіріюг сосКіаї!") (Коспе), а потім 55Т1-МО1 очищували від розчинної фракції, застосовуючи колонку о5Тгар (СЕ Пеасаге) згідно з інструкцією виробника. Мітку О5Т відщепили тромбіном (Зідта) та отриманий домен МОЇ далі очищували за допомогою гель-фільтрації на колонці Зирегаех 75 (СЕ пеайсаге). Фракції, що містили домен МО, об'єднали та зберігали при -80 "С. 11.2. Отримання фрагмента Раб варіанта 305
Фрагменти Бар одного з оптимізованих варіантів, що походять від 305, отримали за традиційним способом, застосовуючи граничне перетравлення папаїном (Косне Оіадпозвіїсв, Саї
Мо. 1047825), а потім завантажили на колонку Білка А (Марзіесі ЗиКе, СЕ Неайсаге), щоб
Зо видалити фрагменти Ес, катіонообмінну колонку (Ніттар 5Р НР, СЕ Неайсаге) та гель- фільтраційну колонку (Зирегдех200 16/60, СЕ Неаксаге). Фракції, що містили фрагмент Раб, об'єднали та зберігали при -80 "С. 11.3. Отримання комплексу ЕРар варіанта 305 та домену МО1 С5 людини
Очищений домен МО1 рекомбінантного С5 людини змішали з очищеним фрагментом Бар варіанта 305 у молярному відношенні 1:11. Комплекс очистили шляхом гель-фільтраційної хроматографії (Зирегдех200, збільшення 10/300, СЕ Неайсаге), застосовуючи колонку, урівноважену 20 мМ НЕРЕЗ рН 7,5, 100 мм Масі. 11.4. Кристалізація
Очищені комплекси концентрували до приблизно 10 мг/мл та виконували кристалізацію за способом дифузії пари у сидячій краплі у комбінації зі способом посіву при 4 "С. Розчин резервуару складався з 0,2 М дегідрату форміату магнію, 15,0 95 мас./об. поліетиленгліколю 3350. За декілька днів це перетворилося у пласкі кристали. Кристал занурили у розчин 0,2 М дегідрату форміату магнію, 25,0 95 мас./об. поліетиленгліколю 3350 та 20 95 гліцерину. 11.5. Збір даних та визначення структури
Дані рентгенівської дифракції вимірювали на виводі опромінювання ВІ 32ХО з джерела
ЗРгіпд-8. Під час опромінювання кристал постійно знаходився у потоці азоту при -178 "С, щоб підтримувати заморожений стан, та загалом зібрали 180 рентгенівських дифракційних зображень, застосовуючи детектор МХ-225Н5 ССО (КАЖМОМІХ), приєднаний до виводу опромінювання, при цьому кристал обертався на 1,0 градус за один раз. Визначення параметрів комірки, індексування дифракційних плям та обробку дифракційних даних, отриманих з дифракційних зображень, виконували, застосовуючи програму Хіа2 (У. Аррі. Стгуві. 43:186-190 (2010), ХО5 РасКкаде (Аста. Стгуві. О66:125-132 (2010)) та Зсаіа (Асіа. Стгузі. О62:72-82 (2006)) та зрештою отримали дані інтенсивності дифракції аж до 2,11 ангстрема розрізнення. Статистичні кристалографічні дані наведено у Таблиці 11.
Таблиця 11
Сукупність даних рентітенівського аналізу та характеристики узгодження
Сукупність даних
Просторова група Рі
Елементарна комірка а, Б, (А) 39,79, 55,10, 127,76 о. Ву) 89,18, 86,24, 78,50
Розрізнення (А) 49,49-211
Загальна кількість рефлексів 112102
Кількість специфічних рефлексів 565154
Завершеність (обопонка найвищого розрізнення) (95) 92,1 (95,8)
Жлетеє 7 (оболонка найвищого розрізнення) (95) 7,3 81,7)
Узгодження
Розрізнення (4) 25,00-211
Кількість рефлексів ваза
К фактор? ( Аео 2) (05) 20,42 (26.44)
Середньоквадратичне відхилення від ідеального
Довжина зв'язків (А) 0.008585
Кути зв'язку (2) 1,3441 а) Куеюе У ЗЛАГУДИ (АК - (ВК УЖ РАГУЛИ(ЛКЇМ. де ДАК!) та С (БКЛЮ - це інтемсивність вимірювання / та середня інтенсивність для рефлексу зіндексами ЙКІі, відповідно. 90 А фактор- У ДАЛЕЕ са ЛЕДІ - ор (ВКДЛУ ЛКЙЕ ов (ПКТ, де о борота боро с це амплітуди структурного фактора, які спостерігаються та розраховані, відповідно, с) Касе є розрахованим 575 відхиланням випадково задано го рефлексу,
Структуру визначили шляхом молекулярного заміщення за допомогою програми РВавзег (.
Аррі. Стгузі. 40:658-674 (2007). Модель дослідження домену Бар отримали з опублікованої кристалічної структури Раб Ід04 людини (РОВ код:188у)), та модель дослідження домену МО1 походить від опублікованої кристалічної структури С5 людини (РОВ код: ЗСИ7, Майї Іттипої. 9:753-760 (2008)). Модель побудували за допомогою програми Соої (Асіа Стгузі. Ю66:486-501 (2010)) та узгодили за допомогою програми Кейпас5 (Асіа Сгузі. 067:355-367 (2011).
Кристалографічний фактор достовірності (В) для різних даних інтенсивності дифракції від 25- 2,11 ангстрема становив 20,42 9о зі значенням вільного К-фактора у 26,44 до. Характеристики узгодження структури наведено у Таблиці 11. 11.6. Загальна структура комплексу Раб варіанта 305 та домену С5-МОИ
Фрагмент Бар оптимізованого варіанта ("305 Рар") що походить від 305, зв'язаний з доменом С5-МОї1 людини ("МО1") у відношенні 1:1, та асиметрична одиниця кристалічної структури містила два комплекси, Молекули 1 та 2, як зображено на Фігурі 26А. Молекули 1 та 2 можна взаємно зорієнтувати належним чином при 0,717 ангстрема КМ50О, використовуючи позицію атома С-альфа в усіх залишках, як показано на Фігурі 268. Фігури, що обговорюються нижче, отримали із застосуванням Молекули 1.
На Фігурах 27А та 27В епітоп контактної ділянки Бар 305 картований в амінокислотній послідовності МО1 та кристалічній структурі, відповідно. Епітоп включає амінокислотні залишки
МС, які містять один або більше атомів, розташованих у межах відстані 4,5 ангстрема від частини Раб 305 у кристалічній структурі. Крім того, епітоп у межах 3,0 ангстрема виділено на
Фігурі 27А. 11.7. Взаємодії Е48, О51 та К109
Як описано у Прикладах 4.5 та 4.6, МАБ проти С5, які включають серію, що походить від антитіла 305, тестували щодо зв'язування з трьома точковими мутантами С5 людини - Е48А,
О51А та КІО9А - за допомогою аналізів зв'язування з використанням вестерн-блотингу та
ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка). У той час, коли варіанти 305 зв'язувалися сильно з природним С5, вони тільки слабо зв'язувалися з мутантом С5 Е48А та не зв'язувалися з мутантами 051А та КІО9А. Кристалічна структура комплексу Бар3зОо5 та МО1 дозволила виявити, що три амінокислоти: Е48, 051 та К109 - усі знаходяться у межах відстані 3,0 ангстрема від РГарз305, утворюючи ряд водневих зв'язків з Рар, як показано на Фігурі 28А. Після докладнішого дослідження залишок К109 МО1 заглиблюється у канавку, утворену на поверхні взаємодії важкого ланцюга Раб, та щільно взаємодіє з Раб за допомогою трьох водневих зв'язків з Н-СОВЗ (097, Н-СОКЗ М100 та Н-СОМКЗ Т1000 та за допомогою сольового містка з Н- сСОокзЗ 095 (Фігура 280). 051 розташований між МО1 та важким ланцюгом Барзо5 та утворює два водневі зв'язки з Н-СОКІ 5ег32 та Н-СОК2 5ег54, заповнюючи простір (Фігура 28С). Це вказує на те, що як К109, так і 051 С5 є вирішальними залишками для зв'язування антитіл серії 305. З іншого боку, Е48 розташований ближче до поверхні та утворює тільки один водневий зв'язок з Гар, що дозволяє припустити, що його внесок у зв'язування антитіла буде меншим, ніж внесок КІ09 та 051 (Фігура 288). Ці взаємозв'язки відповідають результатам аналізів зв'язування з використанням вестерн-блотингу та ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) мутантів С5 людини (Приклади 4.5 та 4.6). Додаткове зауваження: нумерація залишків для амінокислот Раб базується на схемі номенклатури Кебота. (Кабаї єї аІ.,, Зедцепсез ої Ргоїеїп5 ої
Ітітипо!одісаї! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неайй Зегуісе, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неайн, Веїпезаа, Ма., 1991). 11.8. Взаємодії Н7О, Н7?2 та НІ110 С5 людини та антитіл серії 305
Аналіз кристалічної структури дозволив виявити, що три залишки гістидину в С5 людини, а саме Н?7О, Н72 та НІ110, включені в епітоп Рар варіантів 305, як показано на Фігурі 27А та Фігурі 29А. Аналіз зв'язування ВІАСОКЕ (зареєстрована торговельна марка) виконували для того, щоб дослідити внесок цих залишків гістидину до залежної від рН взаємодії білок-білок між С5 людини та Раб варіантів 305, застосовуючи мутантів С5 людини: Н7ОМ, Н72У, НІ110У та
НОМ яНІТОМм (Приклад 4.7). Н72У зумовив повну втрату зв'язування Раб варіантів 305 з С5. Цей залишок С5 розташований у гаманці, утвореному петлею СОК2 важкого ланцюга Рар 305 та петлею МО (І 73, 574 та Е76), та щільно заповнює цей простір, як показано на Фігурі 29С. Крім того, залишок Н72 С5 утворює водневий зв'язок з Н-СОК2 У58. Не очікується, що мутація Н72У буде допускатися, оскільки немає достатнього простору для розташування більш громіздкого бічного ланцюга тирозину. Також не може підтримуватися водневий зв'язок з Н-СОН2 У58.
Щодо внеску Н7О та НІ10 у залежність від рН, то внаслідок мутацій Н7ОМ та НІ10У уповільнилася дисоціація Бар варіантів 305 від С5 при рН 5,8. Н70 утворює внутрішньомолекулярний водневий зв'язок з Т53 МО1, який, як вважають, обірветься при рн 5,8, коли протонування Н7О С5 спричиняє конформаційну зміну у відповідній частині поверхні взаємодії МО1 (Фігура 298). Очікується, що для Н1І10 протонування цього залишку С5 спричинить відштовхування заряду від Бар 305, що може бути підсиленим протонуванням сусіднього залишку гістидину Н-СОКЗ НІТООс (Фігура 290).
Незважаючи на те, що вищезазначений винахід було описано детально шляхом ілюстрацій та наведенням прикладів з метою сприяння розумінню, описи та приклади не слід розглядати як такі, що обмежують обсяг винаходу. Зміст усієї патентної та наукової літератури, процитованої у цьому описі винаходу, особливо включено у повному обсязі шляхом посилань.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ЧУГАІЇ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ (СНОСАІ 5ЕІУАКО КАВОЗНІКІ КАЇІБНА) «120» АНТИТІЛА ПРОТИ С5 ТА СПОСОБИ ЗАСТОСУВАННЯ «130» С1-А1517Р «1505 шР 2015-247069 «1515 2015-12-18 «160» 150 «1705» РабепьфІпПп уеквзіоп 3.5 «2105 1 «211» 121 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 1 біп бек теп біц біц бек біу б1у Авр теп Уа1ї Ппув Рго бі1у А1а бек 1 5 10 15
Зо Ттеч А1а Уаї1 ТБЕ Суз ТЬБкК А1а бек сі1іу Рібе бек бек Зек бек бек Тукг 20 25 зо
Тук Меєжє Суз Тер Уа1! Агуц біп А1ї1а Рко біу Ппуз бі1у теп бі Тер І1е 35 40 45 сіу Суз І1е Тукє ТБг біу бек б1у А1ї1а Тік Тук Тук А1а бегк Тер А1а 50 55 (219) пув б1у Акуд Рібе ТБг І1е бек Пуз ТіПг бек бек Тік Тіг Уа1 ТЕБЕ Іейцй 65 70 175 8о біп Меє ТБЕ бек теп ТіК Уа1 А1їа Авр Тіг Аза Тік Тук Ріе Суз А1а 85 90 95
Бек Авр б1і1у сі1у Тугк Ма1 ТБкЕ Рго ТЬБк Нів А1а Меє Тук Іец Тегр 01У 100 105 110
Рго бі1іу ТБЕ Кгец Уа1! ТіК Уа1ї бек бек 115 120 «210» 2 «2115» 117 (516) «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 2 біп бек теп біц біц бек біу сбіу с1у теп Уа1ї Ппув Рго бі1у А1а бек 1 5 10 15
Теп ТБг гей ТБЕ Суз Ппуз А1їа бек біу І1е Азр Рібе бек Авзп Ріе Туг 20 25 зо
Тук І1е Сув Тер Уа1 Аку біп А1а Рко сі1у цпцуз б1у Іецп Авр Іецп І1е 35 40 45
А1а Суз І1е Тук ТіК Уа1 бек біу Тук Тік Тук Тук А1а бек Тер А1а 50 55 (219) пув б1у АкЧд пецп ТіБг І1е бек Пуз ТіПг бек бек Тік Тіг Уа1 ТЕБЕ Іейцй 65 70 175 8о біп Меє ТБЕ бек теп Тіг А1їа Аза Авр Тіг Аза Тік Тук Ріе Суз А1а 85 90 95
Зо
АгЧ Авр теп Ніз А1їа бі1іу І1е ТБг Авзп теп Тер біу Рго біу ТібгЕ Іей 100 105 110
Уаї Тік Уа1ї1 бек бек 115 «210» З «2115» 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» З біп бек теп біц біц бек біу б1у Авр теп Уа1ї Ппув Рго бі1у А1а бек 1 5 10 15
Тецп бек гей ТБЕ Суз ТіК А1ї1а А1ї1а с1у теп Азр РіБе бек бет бек Тукг 20 25 зо
Тук Меєжє Суз Тер Уа1! Агуц біп А1ї1а Рко біу Ппуз бі1у теп бі Тер І1е 35 40 45 60
А1а Суз І1е Тукг А1їа сі1у бек бек біу І1е І1е Тук Туг А1а Азп Тгр
50 55 (219)
А1а Ппуз с1у Агуд Ріе ТПг І1е бек Агуд Рго бек бек Тіг Тіг Уа1 ТЕБЕ 65 70 175 8о
Тецп біп Меє ТБг бек теп Тіг Аза А1Зїа Авр ТіК Аза Тік Тук Ріе Сувз 85 90 95
А1а ТБЕ Тук Рго ТіК Тук бі1у Авр біу біу Нів А1а Рібе Азп Іец Тгр 100 105 110 сіу Рго сіу ТБЕ теп Уа1! Тік Уаі1ї бек бек 115 120 «210» 4 «2115» 117 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 4
Зо біп бЗек Уаї бі бі бек бі1у б1у Акд Іеп Уа1 ТБЕ Ркго б1у ТБкг Ркго 1 5 10 15
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК А1ї1а бек біу Ріе бек Іецп бек бек Тук Туг
З5 20 25 зо
Межє Авп Тер Уа1ї Агуд біп А1а Рго сі1іу Ппуз б1у Іїеп бі ТеЕр І1е 01Уу 40
Меє І1ї1е Тук біу бек бі1у А1ї1а ТБг Тук Тук А1ї1а бек Тер А1а Гуз 01У (219) 45
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек Ппувз ТіК бек бек ТіК Тік Уаі1ї АвБр Іец Ппуз Меє 65 70 175 8о 50 ТрЕ бек теп ТБЕ ТЬкЕ біц АвБр ТБг А1ї1а ТБг Тук Рре Суз А1а Акуд біп 85 90 95
І1е Тук бек біу АвБр Авп Авп Азр Авзп Ре Тгр біу Рго біу Тік Іец 55 100 105 110
Уаї Тік Уа1ї1 бек бек 115 60
«2105 5 «2115» 117 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 5 біп бек Уа1 бі біц бек бі1у с1у Акуд теп Уа1! ТіК Рго бі1у Тбкг Рго 1 5 10 15 теп ТіК теп ТБЕ Суз ТЬБк А1а бек сі1у Рібе бек Іец бетг бек Тук Тукг зо
Межє Авп Тер Уа1ї Агуд біп А1а Рго сі1іу Ппуз б1у Іїеп бі ТеЕр І1е 01Уу 20 35 40 45
Меє І1ї1е Тук біу бек бі1іу А1ї1а ТБг Тук Тук А1а бек Тер А1ї1а цуз 01У 50 55 (219) 25
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек Ппувз ТіК бек бек ТіК Тік Уаі1ї АвБр Іец Ппуз Меє 65 70 175 8о
Зо
ТЬПЕгЕ бек Гей ТБЕ ТБг біц Авзр ТБг А1ї1а Тібг Тук Рібе Суз А1ї1а Агуд біп 85 90 95
І1е Тук бек б1у АБр АБп Авп АвБр о Авзп Рбе Тер біу Ркго біу Тік Іецй 100 105 110
Уаї Тік Уа1ї1 бек бек 115 «2105» 6 «2115» 117 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 6 біп бек Уа1 бі біц бек бі1у с1у Акуд теп Уа1! ТіК Рго бі1у Тбкг Рго 1 5 10 15
Теп ТБЕг Гей ТБЕ Суз ТіК Уа1! бек бі1у ПГецп бек Гей бек Авр Авп ТЕ 20 25 зо 60
Меє ТБЕ Тер Уа1 Аг біп А1а Рго сі1іу Ппуз б1у Іїеп бі ТеЕр І1е 01Уу
35 40 45
І1е І1е бек Ріе біу с1у АвБр А1а Тугк Тук А1їа бек Тгр А1а цшуз О01Уу 50 55 (219)
АкЧ Ріпе Рго І1е бек Пув Тік бек ТіК Тіг Уаі1ї Авзр теп Агуд І1е ТЕБЕ 65 70 175 8о бек Ркего Тіг Тібг бі Авр ТБЕ А1а ТБг Тук Рбе Суз А1ї1а Агд Уаї О01Уу 85 90 95
А1а с1у Авп І1е Ріе Тер Тук Ріе Авр теп Тер біу Рго біу ТібгЕ Іей 100 105 110
Уаї Тік Уа1ї1 бек бек 115 «2105 7 «211» 116 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Штучно синтезована послідовність «4005 7 біп бек Уа1 біц біц бек біу б1у Агд теп Уаі1ї ТБкг Ррго бі1у Тік Рго
З5 1 5 10 15
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК Уа1! бек біу Ріе бек Іецп бек Тіг Туг А1а 20 25 зо 40
Меє сіу Тер Уа1! Агу біп А1а Рго бі1іу Ппуз бі1у теп бі Тер І1е 01Уу 45
ТЕ І1е Авр ТБЕ б1у Авр Азп бек Ріпе Туг А1їа Азп Тер А1а Кгуз 01У (219) 50 АкЧ Ріе ТБг І1е бек Ппувз Тік Зек Тік ТБЕ Уа1 АБр теп цпуз І1е Тік 65 70 175 8о бек Ркего Тік А1а бі Авр ТБг А1ї1а Тбг Тук Рібе Суз А1їа Агуд Авп Авр 55 в5 90 95 сі1у бек Уа1ї Тук Авп теп Ріе Абзп Гей Тер біу Рго біу Тібг Іец Уаї 100 105 110 60
ТрЕ Уа1ї бек бек «210» 8 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 8 біп бЗек Уаї бі бі бек бі1іу б1у Акд Іеп Уа1 ТБЕ Ркго б1у ТЬікг Ркго 1 5 10 15
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК А1ї1а бек біу Ріе бек Іецп бек б1у Авп А1а 20 25 зо
І1е Азп Тер Уаі1 Акуд біп А1їа Рго бі1іу Ппуз сіу теп бі Тер І1е О01Уу 35 40 45
Сув І1е Тук ТБЕ біу бек Авр ТБЕ ТБг Тук Тук А1їа Тіг Тер А1а Гуз 50 55 (219)
Зо сі1у Акд Рібе ТБЕ І1е бек ПпЦуз ТБЕ бек ТБг ТіК Уа1ї Авзр теп Ппувз І1е 65 70 175 8о
А1а бек Рко ТБЕ ТЬБкЕ бі АБр Тіг А1ї1а ТБкг Тук Ррбе Суз А1а Аку 01У 85 90 95 бек б1у теп Тер біу Рго сіу Тібг Іец Уа1 ТБЕ Уа1ї бек бек 100 105 110 «2105» 9 «211» 116 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 9 біп бек Уа1 бі біц бек сі1у с1іу Акд теп Уа1! ТіК Рго бі1у Тбкг Рго 1 5 10 15
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК Уа1! бек біу Ріе бек Іецп бек Тіг Туг А1а 20 25 зо 60
Меє сіу Тер Уа1 Аг біп А1а Рго сі1іу Ппуз б1у Іїеп бі ТеЕр І1е 01Уу
35 40 45
ТЕ І1е Авр ТБЕ б1у Авр Азп бек Ріпе Туг А1їа Азп Тер А1а Кгуз 01У 50 55 (219)
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек АгЧд Тік бек ТіК Тік Уаї Авр теп Ппуз І1е ТЕБЕ 65 70 175 8о бек Ркего Тік А1а бі Авр ТБг А1ї1а Тбг Тук Рібе Суз А1їа Агуд Авп Авр 85 90 95 сі1у бек Уа1ї Тук Авп теп Ріе Абвп Гей Тер біу Рго біу Тік Іец Уаї 100 105 110
ТрЕ Уа1ї бек бек 115 «210» 10 «211» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Штучно синтезована послідовність «400» 10 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у 01У
З5 1 5 10 15 бек Пец АгЧ Іейп бек Сувз А1а А1а бек біу Рібе ТБЕгЕ бек Нівз бек бек 20 25 зо 40
Тук Тук Уа1 А1ї1а Тер Уаі1 Аг біп А1ї1а Рго бі1у пувз б1у Іец бі Тер 45
Уаї с1у Аї1а І1е Тук Тік біу бек б1у А1їа Тік Тук Ппув А1а бек Тгр (219) 50 А1т1а пув с1у Агуд РбБе ТіК І1е бек Ппув Авр ТБкг бек Ппув АБп біп Уаї 65 70 175 8о
Уаї Ппеп ТБЕ Меє ТЬіг Азп Меї Авр Рго Уа1ї Азр Тік А11а Тіг Тук Туг 55 в5 90 95
Сув А1а бек Авр біу біу Тук Авр Тук Рго Тік Нів А1а Межє Ніз Туг 100 105 110 60
Тер бі1у біп сі1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 115 120 «210» 11 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 11
Авр Ма1 Уа1ї1 Меє ТЬкЕ біп ТБг Рего А1а бек Уа1ї бек А1а А1а Уа! 01У 1 5 10 15 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біп Азп І1е сбі1у бек Авр 20 25 зо
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппувз Ркго біу біп Рго Рго АгЧдЧ Іец Іец І1е 35 40 45
Тук бі1у А1ї1а бек Ппуз теп А1їа бек біу Уа1і! бек бек Агд Ріе бек 01Уу 50 55 (219)
Зо бек бі1у бек біу Ппув бі Рібе Тбг Іец ТБг І1е бек Авр Іец біц Сув 65 70 175 8о
А1а АБр Аза Уаі1ї ТЬк Тук Тук Сув біп Суз ТЬікЕ Рре Уа1ї сі1у бек бек 85 90 95
Тук б1у Авп Аї1а Ріе сі1іу біу б1іу ТБг біц Уа1ї Уаї Уаї Гуз 100 105 110 «210» 12 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 12
А1а І1е біц Меє ТЬіг біп Тік Рго Ріе бек Уаі1ї бек А1а А1а Уа1 01У 1 5 10 15 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біп Азп І1е Туг бек Авп 20 25 зо 60
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппуз Ркго біу біп Агуд Рго Пув теп Іец І1е
35 40 45
Тук бі1у А1ї1а бек Авзп Іец біц бек біу Уа1ї Рго бек Агд Ріе Кгуз 01У 50 55 (219) бек біу бек біу Тібг біц Тук Тіг Іец ТБг І1е бек Авр Іец біц Сув 65 70 175 8о
А1а Авр Азї1а А1їа Тік Тук Тук Суз теп біп біу Тук бек Туг бек Авп 85 90 95
Уа1 Авр Авр А1ї1а Ріе сбі1іу бі1у біу ТіК біц Уаї Уаї Уаї Гуз 100 105 110 «2105» 13 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 13
Зо А1а сіп Уаї Ппеп ТЬБкЕ біп ТБкг Ркго бек бек Уаі1ї бек А1а А1а Уа! 01У 1 5 10 15 сіу ТБг Уа1ї ТБЕ І1е Авзп Сув біп бек бек біп бек Уа1ї Туг бек бек
З5 20 25 зо
Авр Тук Ппецп бек Тер Тук біп біп Ппуз Рго біу біп Рго Рго Пуз Іей 40
Те І1е Тук біп А1їа бек Ппуз теп А1їа бек біу Уа1їії Рго Рго Агд Ріє (219) 45 бек бі1у бек біу бек біу ТБЕ біп Рібе ТБг Кей ТБг І1е бек бі1у Уа1ї 65 70 175 8о 50 біп Сув АБр АвБр Аза А11а Тік Тук Тук Суз біп бі1у Тік Тук Тук бек 85 90 95 бек бі1іу Тер Тук Ріе А1а Рбе біу біу біу ТБг бі Уаї Уа1ї Уа1ї цув 55 100 105 110 «210» 14 «211» 110 60 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 14
А1а Тук Авр Меє ТіК біп Тік Рго А1їа бек Уа1і бі Уа1 А1а Уа1 01У 1 5 10 15 сіу ТБкЕ Уа1ї ТБЕ І1їе Авзп Сув біп А1ї1а бек бі бек І1е бек Авзп Тгр 20 25 зо
Ттеч А1а Тер Тук біп біп Ппув Рего бі1у біп Агу Ркго Ппув Іеп Іецп І1е 35 40 45
Туг Ак А1їа бек Тібг Іец А1їа бек біу Уа1і! бек бек Агд Ріе Куз 01У 50 55 (219) бек біу бек біу ТЬбг біп Рібе Тбг Іецп ТЬбг І1е бек сіу Уаії бі Сув 65 70 175 8о
Авр АвБр Аза А1їа Тік Тук Тук Сувз біп біп Азр Тук бек бек бек Авп 85 90 95
Зо
Уа1 Авр Авп Тік Ріе бі1іу бі1іу бі1іу ТіК Ппув Уаі1 Уа1ї Уаї січ 100 105 110
З5 «210» 15 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 40 «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 15 45 А1т1а Тук АБр Меє ТЬБкг біп ТБг Рго А1а бек Уа1ї біц Уаї А1а Уаї 01У 1 5 10 15 сіу ТБкЕ Уа1ї ТБЕ І1їе Авзп Сув біп А1ї1а бек бі бек І1е бек Авзп Тгр 50 20 25 зо теп А1а Тер Тук біп біп Ппув Ркго біу біп АгЧд Рго Ппувз Іецп Гец І1е 55
Туг Ак А1їа бек Тібг Іец А1їа бек біу Уа1і! бек бек Агд Ріе Куз 01У (219) 60 бек біу бек біу ТЬбг біп Рібе Тбг Іецп ТЬбг І1е бек сі1іу Уа1ї біц Сув
65 70 175 8о
Авр АвБр Аза А1їа Тік Тук Тук Сувз біп біп Азр Тук бек бек бек Авп в5 90 95
Уа1 Авр Авп Тік Ріе бі1іу біу біу Тік Тік Уа1! Уа1ї Уаї січ 100 105 110 «210» 16 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 16
А1а Тук Авр Меє Тбіг біп Тік Рго А1ї1а бек Уа1! бі Уа1і бек Уа1 01У 1 5 10 15 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біц бек І1е Туг бек А1а 20 25 зо
Зо Ттеч А1а Тер Тук біп біп Ппув Рео бі1іу біп Рго Ркго Ппув Іецп Іец І1е
Туг бек А1їа бек Тібг Іец А1їа бек біу Уа1ії Рго бек Агд Ріе Кгуз 01У 35 50 55 (219) бек бі1іу бек біу Тібг біц Тук Тіг Іецп ТЬбг І1е бек Авзр еп бі Сув 65 70 175 8о 40
А1а Авр Азї1а А1їа Тік Тук Тук Сувз біп біп Тук Тук бек бек ТБг Авп 85 90 95 45
Уа1ї1 Нівз Авп бек Ріпе біу біу біу ТіК ТБг Уа1! Уа1ї Уаї січ 100 105 110 «210» 17 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 17 (516) Авр Ма1 Уа1ї1 Меє ТЬБкЕ біп ТБкг Рего А1а бек Уаї бек А1а А1а Уаї 01У 1 5 10 15 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек бі Азп І1е Туг бек А1а 20 25 зо
Ттецп бек Тер Тук біп біп Ппув Ркго біу теп АгЧд Рго Агд Іецй Іец І1е 35 40 45
Тук Тук А1їа бек Тібг Іец А1їа бек біу Уа1ії Рго бек Агд Ріе Кгуз 01У 50 55 (219)
Бек Агу бек б1у Тік бі Ріре ТБЕ Ппецп ТБкК І1е бек Авр Іеч біцп Сувз 65 70 175 8о
А1а Авр Азї1а А1їа Тік Тук Тук Сувз біп біп Тук Тук Авр І1е Авзп бек в5 90 95
Уа1 Авр Авп Тік Ріе бі1іу біу б1і1у ТіК Ппуз Уа1 Уа1ї Уаї січ 100 105 110 «210» 18 «211» 111 «2125 РЕТ 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
З5 «400» 18
Авр Уа1ї1 Уаї Меє ТЬг біп Тік Рго А1їа бек Уа1і бек А1а Рго Уа1ї 01У 1 5 10 15 40 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біп Азп І1е Туг бек Іей 20 25 зо 45 Ттеч А1а Тер Тук біп біп Ппув Рео бі1іу біп Рго Ркго Ппуз пейп Іец І1е
Тук Нів ТБбЕ бек Авр теп А1їа бек біу Уа1 Рго бек Акд Ріе Акуд 01Уу 50 55 (219) бек бі1іу бек біу Тібг бі Рібе Тібг Іецп ТБг І1е бек Авзр еп бі Сув 65 70 175 8о
А1а Авр Азї1а А1їа Тік Тук Тук Сув біп Сув Тік А1а Тук б1у бек бек 85 90 95 60
Авр Уа1ї1 сіу б1у Тіг Рре бі1у біу біу Тібг ТБбБг Уа1! Уа1ї Уаї січ
100 105 110 «210» 19 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 19
Авр Уа1ї1 Уаї Меє ТЬг біп Тік Рго А1їа бек Уа1! бек А1ї1а А1їа Ууаї 01У 1 5 10 15 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек бі Азп І1е Туг бек А1а зо 20
Ттецп бек Тер Тук біп біп Ппув Ркго біу ПГецп Агкуд Рго Агуд Гей Іец І1е 25
Тук Тук А1їа бек Тібг Іец А1їа бек біу Уа1ії Рго бек Агд Ріе Кгуз 01У (219)
Зо Бек Агу бек б1у Тік бі Ріре ТБкЕ Іецп ТБг І1е бек Авр Іеч біцп Сувз 65 70 175 8о
А1а Авр Аза А1їа бек Тук Тук Сув біп біп Тук Тук Авр І1е Авзп бек
З5 в5 90 95
Уа1 Авр Авп Тік Ріе біу біу біу Тібг Ппуз Уа1 Уа1ї Уаї січ 100 105 110 40 «210» 20 «211» 110 «2125 РЕТ 45 «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність 50 «4005» 20
Авр Уа1 Уаї Меє Трг біп бек Рго бек бек теп бек А1їа бек Уа1ї 01У 1 5 10 15 55
Авр Акд Уа1ї ТіБг І1е Тік Сув біп А1ї1а бек біп Азп І1е бі1у бек бек 20 25 зо (516) Ттеч А1а Тер Тук біп біп Ппув Рео бі1у біп А1а Ркго Аг ей Іец І1е 35 40 45
Тук бі1у А1ї1а бек ПпЦуз ТіК Нівз бек біу Уа1і Рго бек Агд Ріе бек 01Уу 50 55 (219) бек біу бек біу ТЬбг Авзр Рібе ТБЕ Гей ТБг І1е бек бек теп біп Рго 65 70 175 8о бі Авр Уа1ї А1їа ТБг Тук Тук Сувз біп бек Тік Ппувз Уа1 сбіу бек бек 85 90 95
Тук б1у АБп Ніз Ріе біу бі1іу сіу ТБЕ цпуз Уа1 біч І1е цуз 100 105 110 «210» 21 «2115» 117 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 21 біп бек теп біц біц бек біу сб1у Авр теп Уа1 бі Ркго с1у А1ї1а бег
Зо 1 5 10 15
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК А1ї1а бек біу Ріе бек Тер Авзп бек б1у Тукг 20 25 зо
З5
Авр Меє Суз Тер Уа1 Аг біп А1ї1а Рго бі1у Ппуз сі1у гей біц Тер І1е 40
А1а Суз І1е Туг ТіК біу бек бек АТїа Авзп Тік А1ї1а Туг А1а Азп Тгр (219) 45 А1а пув с1у Агкуд РрБе ТіБг І1е бег Ппувз ТіБкЕ бек бек ТБЕ ТБкЕ Уа1і! Тік 65 70 175 8о
Тецп біп Меє ТБг с1іу їгецп ТіК Аза А1Зїа Авр ТіК Аза Тік Тук Ріе Сувз 50 в5 90 95
А1а Акуд Ніз Авр Авр Тук Ріе Рібе Авр Іец Тер біу Рго біу Тібг Іей 100 105 110 55
Уаї Тік Уа1ї1 бек бек 115 60 «2105» 22
«211» 115 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 22 біп бЗек Уаї бі бі бек бі1у б1у Акд Іеп Уа1 ТБЕ Ркго б1у ТБкг Ркго 1 5 10 15
Теп ТБгЕ Гей ТБЕ Суз ТіК Уа1! бек б1у І1е Азр Іецп бек бек Тук ТЕБЕ зо
Меє сіу Тер Уа1 Аг біп А1а Рго сі1іу Ппуз б1у їеп бі Суз І1е Сс1У 20
Тук І1е Ніз бек Ріре біу бек ТБг Тук Тук А1їа бек Тер А1а Кгуз 01У (219) 25
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек Пувз Тік бек ТіК Тіг Уаії Авр теп бі І1е ТЕБЕ 65 70 175 8о
Зо бек Рго ТБкЕ Тік бі АвБр Тк Аза ТБкг Тук Рібе Суз Аза Агу Авр Уаї1ї 85 90 95 сіу бі1іу бек бек біу Тер Азр теп Тер біу біп біу Тбг Іец Уа1 ТЕБЕ 35 100 105 110
Уаї бек бек 115 40 «2105» 23 «211» 116 «2125 РЕТ 45 «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність 50 «4005» 23 біп бек теп біц біц бек біу сбіу с1у теп Уа1ї Ппув Рго бі1у А1а бек 1 5 10 15 55
Теп ТБг Гей ТБЕ Суз ТіК А1ї1а бек біу Ріе бек Ріе бек бек бі1у Туг 20 25 зо (516) Тук Меж Сув Тер Уа1! Аку біп А1а Рко сі1у цпуз б1у Іецп бі Ткгр І1е 35 40 45 сіу Суз І1е с1у ТБг І1е бек Авр бек Тік Тук Тукг А1їа бек Тгр А1а 50 55 (219) пув б1у Акуд Рібе Рго І1е бек Пуз АТїа бек бек Тік Тіг Уа1 ТЕБЕ Іейцй 65 70 175 8о біп Меє ТБЕгЕ бек теп ТіК А1їа Аза Авр Тібг А1а ТБг Тук Рібе Суз А1а 85 90 95
АкЧ АБр Рго Тук бек Тук с1у АБр теп Тер біу Ркго сі1у ТБг Іец Уаї 100 105 110
ТрЕ Уа1ї бек бек 115 «210» 24 «2115» 125 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
Зо «400» 24 біп біц біп гей бі біц бек сіу б1у Авр теп Уа1і Ппувз Рго бі 01УуУ 1 5 10 15
З5
Бек Пец Тіг Іецп Тібг Суз ТБЕ А1а бек сіу Рібе бек Ріе бек бек 01Уу 20 25 зо 40
Авп о Тер І1е Суз Тер Уа1 Аквд біп А1ї1а Рго бі1у Ппувз б1у Іец бі Тер 45 І1їе А1а Суз І1е Тук сі1у б1у бек Уа1 бі1у бі1у ТБг АБр Тук А1а бек (219)
Тер А1а Ппуз сіу Акуд Ріе Тік Уа1ї бек Ппуз Тіг бек бек Тік Тік Уаї 50 65 70 15 8о
ТЬПЕгЕ Гец біп Меє ТБг бек теп ТБЕ А1Зїа А1їа Авр Тік А1зї1а Тік Тук Ріє 85 90 95 55
Сузв А1а Акуд Меє біцш Авр с1і1у Тук сіу Тук б1у Тук Авр Тік Тук Ріє 100 105 110 60 пув Гецп Тер б1іу Рго біу Тік гец Уа1! ТіК Уа1ї бек бек
115 120 125 «2105» 25 «211» 114 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 25
Авр Уа1 Уаї Меє ТЬг біп ТрЕ Рго А1ї1а бек Уаі1ї бек бі бек Уа1 01У 1 5 10 15 сіу ТБкЕ Уа1ї ТБЕ І1їе Авзп Сув біп А1ї1а бек біп бек І1е б1у Авп Авп зо 20
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппувз Ркго біу біп Рго Рго Пув теп Іец І1е 25
Тукг Авр А1їа бек Авп Іец А1їа бек біу Уа1ї Рго бек Агд Ріе Кгуз 01У (219)
Зо Бек Агу бек б1у Тік біп Рго ТБЕ Ппецп ТБк Авп ТБг теп ТБЕ І1е бек 65 70 175 8о сіу Уаі1 біп Суз А1їа Авр Уа1 А1ї1а ТБіг Тук Тук Сув біп бек б1у Тер
З5 в5 90 95
Тук бі1у Авп бек Тук Уа1 А1а А1ї1а Рібе сі1іу с1і1у бі1іу Тік біц Уаї Уаї 100 105 110 40
Уа1 цув 45 «210» 26 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 50 «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 26 55
Авр Уа1 Уаї Меє ТЬг біп Тік Рго бек бек Уаі1ї бек А1а А1а Уа1 01У 1 5 10 15 (516) сбі1у Тік Уа1ї ТБЕ І1е пуз Сув біп А1а бек біп Авзп І1е Тукг бек Авп 20 25 зо
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппувз Ркго біу біп Рго Рго Пувз АгЧдЧ Іец І1е 35 40 45
Тукг Авр А1їа бек Авр Іецп А1їа бек біу Уа1 Рго бек Агд Ріе бек 01Уу 50 55 (219) бек біу Тук біу ТЬбг біп Рібе Тбг Іец ТБг І1е бек біу Уа1ї біп Сув 65 70 175 8о біч АвБр А1а Аза ТБкг Тук Тук Сув біп Аза Авзп Тук Авр бек ТБЕ бек 85 90 95 бек бек Рре бі1іу Азп Уа1і1 Рібе біу біу біу ТБг бі Уаї Уа1ї Уа1ї цув 100 105 110 «2105» 27 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
Зо «4005 27
Авр теп Уа1ї Меє ТЬіг біп Тік Рго А1їа бек Уаі1ї бек бі Рго Уа1 01У 1 5 10 15
З5 сіу ТЬіг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біп бек І1е сбі1у ТББг Туг 20 25 зо 40
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппувз Ркго біу біп Рго Рго Пув теп Іец І1е 45 тТук АкЧд А1а бек ТБг Іец А1а бек сі1у Уа1 Рго бек Акд Ріе цуз 6б1У (219) бек біу бек біу Тібг біп Рібе Тбг Іец ТБг І1е бек Авр Іец біц Сув 50 65 70 175 8о
А1а Авр А1зї1а А1їа Тік Тук Тук Суз їец біу біу Тук Тук бі1у Ріе бег 85 90 95 55
Тук б1у Авп Аї1а Ріе сі1іу біу б1іу ТБг біц Уа1ї Уаї Уаї Гуз 100 105 110 60 «210» 28
«211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 28
Авр І1е Уа1 Меє ТЬБкЕ біп ТБг Рего А1а бек Уа1ї біп А1а А1а Уа1ї 01У 1 5 10 15 сіу ТЬБг Уа1ї ТБЕ І1їе Ппуз Сув біп А1ї1а бек біп бек І11е ТЬбг бек Тгр зо
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппуз гей сіу біп Рго Рго Пув теп Іец І1е 20
Тук Ппув А1їа бек ТіБг Іец А1їа бек біу Уа1і бек бек АгЧдч Ріе Куз 01У (219) 25 бек біу бек біу Тібг бі Рібе Тбг Іец ТБг І1е бек Авр Іец біц Сув 65 70 175 8о
Зо А1а АБр Аза Аза ТБкг Тук Тук Сув біп с1у Тук Тук Авр бек бек Тік 85 90 95 бек бек Тук Уа1 Рібе сіу сіу бі1у ТбБг бі Уа1ї Уаї Уа1ї цув 35 100 105 110 «210» 29 «211» 448 40 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність 45 «400» 29 біп Уаі1 біп гецп Уаї1 біп бек б1у А1їа бі Уаї пув Ппув Рго б1у А1а 1 5 10 15 50 бек Уаї Ппув Уа1і бек Сузв Ппув А1а бек біу Тук І1е Рібе бек Авп Туг 20 25 зо 55
Тер І1е біп Тер Уа1! Агу біп А1ї1а Рго біу біп б1у Іеп бі Тер Меє 35 40 45 (516) сі1у бі І1їе теп Рго біу бек біу бек ТБкг біп Тук Тік бі Авп Ріє 50 55 (219)
пув Авр Агкуд Уа1ї ТБг Меї ТіК Агуд Авр ТБг бек Тбг бек Тіг Уа1ї1 Туг 65 70 175 8о
Меє біп Пец бек бек теп АгЧд бек біц Авзр Тік А1а Уа1ї Тук Тук Сув 85 90 95
А1а Акд Тук Ріе Ріе біу бек бек Рго Азп Тер Тук Ріе Авзр Уа1і Тгр 100 105 110 сбі1у біп сбі1іу ТБЕ Ппецп Уа1! Тік Уа1ї бек бек А11а бек ТБкЕ цпуз б1у Ркго 115 120 125 бек Уа1ї Рібе Рго Іец А1а Рго Сувз бек Агуд бектк ТБПЕгЕ бек бій бек ТЕГ 130 135 140
А1а А1ї1а теп сбіу Суз теп Уаї ПЦуз Авр Тук Рібе Рго біц Ркго Уа1! ТЕГ 145 150 155 160
Уаіїі бек Тер Авзп бек біу А1ї1а теп Тіг бек біу Уа1 Нів Тібг Рібе Рго 165 170 175
Зо
А1а Уаї Пец біп бек бек б1і1у Гецп Туг бетг Іецп бек бек Уа1і! Уа1ї Тік 180 185 190
Уа1ї Ркго бетк бек Авзп Ррбе біу Тік біп ТБкЕ Тук ТБк Сув Авп Уа1їі Азр 195 200 205
Нів Ппув Рго бек Авп Тік Кпув Уа1 Авр Ппув Тік Уа1 бі Агд Пуз Сув 210 215 220
Сув Уа1 бі Сув Рго Рго Сув Рго А1їа Рго Рго Уаі А1а біу Рго бек 225 230 235 240
Уа1 Рібе Пец Рібе Рго Рго Ппув Рго Ппуз Авр Тіг Іецп Меї І1е бек Аг4д 245 250 255
ТБЕ Рго біц Уа1 ТБЕ Суз Уа1 Уа1ї1 Уа1ї Авр Уа1і! бек біп бі Авр Рго 260 265 270 бі Уаї біп РБе Азп Тер Тук Уа1 АБр сбі1у Уа1ї біц Уаї Нів Авп А1а 275 280 285
Ппув ТбікЕ Ппув Рго Агд бі біц біп РібБе Азп бек Тіг Тук Авч Уа1ї Уаї (516) 290 295 00 бек Уаії Ппецп Тібг Уа1ї Іец Ніз біп Авр Тер теп Авп сіу ПпЦуз біц Туг 305 310 315 320
Ппув Сув Ппув Уа1ї бек Авп Ппув біу КГецп Рго бек бек І1е бі Ппув ТЕБЕ 325 ззо 335
І1їе бек пуз А1а пув бі1у біп Рго Агу біц Рко біп Уа1 Тук Тік Іецй 340 за5 350
Рго Рго бек біп біц біц Меє ТБЕ Пуз Авп біп Уа1! бек гей Тік Сув 355 зво 365 теп Уаі1 Ппуз с1у Ріе Тук Рго бек Авр І1е А1а Уа1ї бі Тер біц бек 370 375 380
Авп осіу біп Рго біц Авзп Азп Тук ПпЦувз ТіК Тк Ррго Рго Уа1і Іецп Авр 385 390 395 400 бек Азр біу бек Ріе Рібе Кей Туг бек Аг теп ТБЕ Уа1ї Авр Пуз бек 405 410 415
Зо АкЧ Тер біп біц б1у Авп Уа1ї Рібе бек Суз бек Уа1 Меє Ніз біп А1а 420 425 430
Те Нів Авп Ніз Тук Тбіг біп Пуз бек теп бек теп бек теп б1у Гуз 435 440 445 «210» 30 «211» 214 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 30
Авр І1е біп Меє Тбг біп бек Рго бек бек Іец бек А1а бек Уа1 01У 1 5 10 15
Авр Акд Уа1ї ТіБг І1е Тік Сув біу А1ї1а бек бі Авзп І1е Туг с1у А1а 20 25 зо
Те Авп Тер Тук біп біп Ппуз Ркго сіу Ппуз А1їа Рго Пув теп Іец І1е 35 40 45 (516) Тук б1у А1а ТБЕ Азп теп А1а Азр сі1у Уа1 Рго бек Акд Ріе бек 01У 50 55 (219)
бек біу бек біу ТЬбг Авр Рібе Тібг Іецп ТЬбг І1е бек бек теп біп Рго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Уаії гей Авп Тіг Рго Іей 85 90 95
ТіЕ Ріе сіу біп бі1іу ТіК Ппувз Уа1! бі І1е пувз АкБЧдЧ Тібг Уаі1ї А1а А1а 100 105 110
Ркго Зек Уа1 РібБе І1е РіБе Ркго Ркго бек АБр біцп біп Іеч Ппувз бек 01У 115 120 125
ТЬг А1а бек Уаї Уаї Сувз Кгецп Гей Авп Авзп Рпе Тук Рго Агкд біцп А1а 130 135 140
Ппув УМа1 біп Тер пуз Уа1ї Авр Авп А1ї1а Іец біп бек біу Авп бек біп 145 150 155 160 бі бек Уа1 ТБЕ біц біп Азр бек ПпЦуз Авр бек Тік Туг бет ГКецп бек 165 170 175
Зо бек ТіК Кгецп ТБг Іец бек Пуз А1а Авр Тук біцш ПпЦуз Нів Ппув Уа1їі Туг 180 185 190
А1т1а Сув бі Ма1ї ТЬкЕ Нів біп б1у Іепп бек бек Ркего Уа1і ТБг Ппуз бек 195 200 205
Рпе Азп Акуд б1у біц Сув 210 «210» 31 «2115» 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 31 біп Уаі1 біп гецп Уаї1 біп бек б1у А1їа бі Уаї пув Ппув Рго б1у А1а 1 5 10 15 бек Уаї Ппув Уа1і бек Сузв Ппув А1а бек біу Тук І1е Рібе бек Авп Туг 20 25 зо 60
Тер І1е біп Тер Уа1! Агу біп А1ї1а Рго біу біп б1у Іеп бі Тер Меє
35 40 45 сіу біц І1е Гей Ркго біу бек сіу бек ТБг біц Тук Тік бі Авзп Ріє 50 55 (219) пув Авр Агкуд Уа1ї ТБг Меї ТіК Агуд Авр ТБг бек Тбг бек Тіг Уа1ї1 Туг 65 70 175 8о
Меє біп Пец бек бек теп АгЧд бек біц Авзр Тік А11а Уа1 Тук Тук Сув 85 90 95
А1а Акд Тук Ріе Ріе біу бек бек Рго Азп Тер Тук Ріе Авзр Уа1і Тгр 100 105 110 сбі1іу біп сі1іу ТБЕ Ппецп Уа1! Тік Уа1ї бек бекг 115 120 «2105» 32 «2115» 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 32
Авр І1е біп Меє Трг біп бек Ррго бек бет Іецп бек А1їа бек Уа1ї 01У
З5 1 5 10 15
Авр Акд Уа1ї ТіБг І1е Тік Сув біу А1ї1а бек бі Авзп І1е Туг с1у А1а 20 25 зо 40
Те Авп Тер Тук біп біп Ппуз Рго біу Ппуз А1їа Рго Пув теп Іец І1е 45
Тук б1у А1ї1а ТБЕ Авзп теп А1їа Авр біу Уа1 Рго бек Агд Ріе бек 01Уу (219) 50 бек бі1у бек бі1у ТБкг АБр РіБе ТБЕ пецпп ТіБкК І1е бег бек пецп біп Ркго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Уаії гей Авп Тіг Рго Іей 55 в5 90 95
ТіЕ Ріе сіу біп бі1іу ТіК Ппуз Уа1! біц І1е Кцуз 100 105 60
«2105» 33 «2115» 325 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 33
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1а Рго Суз бек Ага 1 5 10 15
Бек ТЬЕ бек біц бек ТБкг Аза Аза пеп б1у Сув теп Уа1 цуз Авр Тук зо
Рпе Рго біп Ркго Уа1 ТіК Уа1ї бек Тер Авзп бек бі1у А1їа Гей ТБг бег 20 35 40 45 сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек 50 55 (219) 25
Тецп бек бек Уа1ї Уа1ї ТіК Уа1ї Ррго бек бек бек теп с1іу ТБЕ Пуз ТЕГ 65 70 175 8о
Зо
Тук ТБг Сув Авп Уа1ї Авр Нівз Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 85 90 95
АкЧч Ма1 бі бек пуз Тук біу Ркго Рго Суз Ркго Ркго Сувз Рго А1а РЕго 100 105 110 біц Рбе Акуд сіу б1у Рго Ппуз Уа1 Рібе теп Ріе Рго Рго Ппув Рго Гуз 115 120 125
Авр ТБПЕ пец Меє І1е бек АкЧдЧ Тік Рго біц Уаі1і Тібг Сувз Уа1 Уа1ї Уаї 130 135 140
Авр Уа1і1 бек біп біц Авр Рго біц Уа1! біп Ррбе Азп Тер Туг Уа1ї1 Авр 145 150 155 160 сіу Уаі1 біцп Уа1ї Нівз Авп А1їа Пуз ТБЕ ПЦуз Рго Агд4д бі бі біп Ріє 165 170 175
Авп бек ТБг Тук Аку Уа1 Уа1ї Зек Уаї теп ТЬкЕ Уаїії Іецп Нів біп Азр 180 185 190
Тер теп Авп біу Ппуз бі Тук Ппув Сув Ппув Маі1ї бек Авп Ппувз 61у Іейцй (516) 195 200 205
Рго бек бек І1е біц Ппуз ТіК І1е бек Ппуз А1ї1а цпувз біу біп Рго Аг4Фд 210 215 220 біц Рго біп Уа1ї Тук ТБг Кец Ркго Рго бек біп бі бі Меє Тбг Гуз 225 230 235 240
Авп обіп Уа1 бек теп ТіК Сув теп Уа1 Ппуз б1у Рбе Тук Ркго Бек Авзр 245 250 255
І1е А1а Уаї бі Тер бі бек Авп біу біп Рго біцп Авп Авп Тук Пув 260 265 270
ТБЕ ТБЕ Рго Рго Уа1ї теп Азр бек Авр біу бек Ріе Рібе Іецп Туг бек 275 280 285
АгЧ теп ТБЕ Уа1ї1ї Авр Ппуз бек Агуд Тер біп бі бі1у Авзп Уа1 Рібе бек 290 295 00
Сув бек Уаї1ї Меє Ніз біц А1їа Ггец Ніз Авп Нів Тук Тіг біп Ппуз бек 305 310 315 320
Зо теп Зек Кепп бек Іецй 325 «210» 34
З5 «211» 325 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 40 «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 34
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1ї1а Рго Суз бек Ага 45 1 5 10 15 бек ТіК бек бі бетк ТЬбг А1а А1а Іец сі1у Суз Гей Уа1ї цЦуз Авр Туг 20 25 зо 50
Рпе Рго біп Ркго Уа1! ТіК Уа1ї бек Тер Авзп бек бі1іу А1їа Гей ТБг бег 55 сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек (219) (516) теп Зек бек Уа1 Уа1 ТЬкК Уа1ї Ркго бек бетк бек Іецп б1у ТБЕ Ппуз Тік 65 70 175 8о
Тук ТБг Сув Авп Уа1ї Авр Нівз Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 85 90 95
Ак Уа1 біц бек Ппуз Тук біу Рго Рго Сув Рго Рго Суз Рго А1їа Рго 100 105 110 біц Рбе Акуд сіу б1у Рго Ппуз Уа1 Рібе теп Ріе Рго Рго Ппув Рго Гуз 115 120 125
Авр Тік Кеп Тук І1е бек Акд ТБЕ Рго біц Уаї ТБг Суз Уа1ї Уа1ї Уаї 130 135 140
Авр Уа1і1 бек біп біц Авр Рго біц Уа1! біп Ррбе Азп Тер Туг Уа1ї1 Авр 145 150 155 160 сіу Уаі1 біцп Уа1ї Нівз Авп А1їа Ппувз Тік Ппуз Рго Агд4д бі бі біп Ріє 165 170 175
Авп обек Тібг Тукг Агд Уа1 Уаї бек Уа1ії пгецп Тік Уаії Іец Нівз біп Авр 180 185 190
Зо
Тер теп Авп біу Ппуз бі Тук Ппувз Сув Ппув Маі1ї бек Авп Ппувз 61у Іейцй 195 200 205
Ркго Зек бек І1е біцп пуз Тік І1е бек Ппуз А1ї1а пуз б1у біп Рго АгФдФ 210 215 220 біц Рго біп Уа1ї Тук ТБг Кец Ркго Рго бек біп бі бі Меє Тбг Гуз 225 230 235 240
Авп обіп Уаї бек теп Тіг Сув теп Уа1! Ппувз біу Рібе Туг Рго бек Авр 245 250 255
І1е А1а Уаї бі Тер бі бек Авп біу біп Рго біцп Авп Авп Тук Пув 260 265 270
ТБЕ ТБЕ Рго Рго Уа1ї теп Азр бек Авр біу бек Ріе Рібе Іецп Туг бек 275 280 285
АкЧ Іеп ТБг Уа1ї1ї Авзр Ппуз бек Акд Тер біп біц б1у АвБп Уа1 Ррбе бек 290 295 00
Сув бек Уаї1ї Меє Ніз біц А1їа Ггецп Ніз Тук Нів Уа1і Тібг біп Пуз бек (516) 305 310 315 320
Те бек Ге бек Іецй «2105» 35 «2115» 325 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 35
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1а Рго Суз бек Аг4д 1 5 10 15
Бек ТЬЕ бек біц бек ТБкг Аза Аза пеп б1у Сув теп Уа1 цуз Авр Тук 20 25 зо
Рпе Рго біп Ркго Уа1 ТіК Уа1ї бек Тер Авзп бек біу А11а Іецпп ТБг бег сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек (219)
Зо
Тецп бек бек Уа1ї Уа1ї ТіК Уа1ї Ркго бек бек бек теп бі1у ТБЕ Пуз Тіг 65 70 175 8о
З5
Тук ТБг Сув Авп Уа1ї Авр Нівз Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 85 90 95 40 АкЧч Ма1 бі бек пуз Тук бі1у Ркго Рко Сув Рго Ркго Суз Рго А1а Ркго 100 105 110 біц Рбе Акуд сіу б1у Рго Ппуз Уа1 Рібе теп Ріе Рго Рго Ппув Рго Гуз 45 115 120 125
Авр ТЕ Пец Меє І1е бек АкЧдЧ ТіБг Рго біц Уа1 ТБЕ Суз Уа1! Уа1ї Уаї 130 135 140 50
Авр Уа1і1 бек біп біц Авр Рго біц Уа1! біп Ррбе Азп Тер Туг Уа1ї1 Авр 145 150 155 160 55 сіу Уаі1 біцп Уаї Нівз Авп А1їа Пув Тік ПГувз Рго Агуд бі бі біп Ріе 165 170 175 (516) Авп бек ТБг Тук Аку Уа1 Уа1ї Зек Уаї теп ТЬкЕ Уаїії Іецп Нів біп Азр 180 185 190
Тер теп Авп сіу Ппуз бі Тук Ппув Сув Ппув Уаі1і бек Авп Пуз б01у Іец 195 200 205
Рго бек бек І1е біц Ппуз ТіК І1е бек Ппуз А1ї1а цпувз біу біп Рго Аг4Фд 210 215 220 біц Рго біп Уа1ї Тук ТБг теп Рго Рго бек біп бі бі Меє Тбг Гуз 225 230 235 240
Авп обіп Уа1 бек теп ТіК Сув теп Уа1 Ппуз б1у Рбе Тук Ркго Бек Авзр 245 250 255
І1е А1а Уаї бі Тер бі бек Авп біу біп Рго біцп Авп Авп Тук Пув 260 265 270
ТБЕ ТБЕ Рго Рго Уа1ї теп Азр бек Авр біу бек Ріе Рібе Іецп Туг бек 275 280 285 пув геп ТБЕ Уа1ї Авр пПуз бек Акуд Тер біп біц бі1у Авзп Уа1 Рібе бек 290 295 00
Зо
Сув бек Уаї1ї Меє Ніз біц А1їа Ггец Ніз Авп Нів Тук Тіг біп Ппуз бек 305 310 315 320 теп Зек Ктеп бек Рго 325 «2105» 36 «2115» 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 36
Ага ТЕ Уа1 А1ї1а А1їа Рго бек Уа1 Ріе І1е Рібе Рго Рго бет Авр сб1ц 1 5 10 15 біп теп Ппуз бек біу ТЬБг А1їа бек Уаї Уаї Суз Кгецп теп Авзп Азп Ріє 20 25 зо
Тук Рго Акуд біц Аїа Ппуз Уа1! біп Тер Ппуз Уаї Авзр АвБп А1а Іец біп 35 40 45 60 бек бі1у Авп бек біп бі бек Уа1і ТЬбг біц біп Авр бек ПЦуз Авр Сувз
50 55 (219)
ТЬПг Туг бек ПГецй бек бек ТіК Гей Тібіг Іец бек Ппув А1а Авр Тук с1ц 65 70 175 8о
Ппув Нів Ппувз Уа1ї Тук А1їа Сувз біц Уа1! Тік Нів біп сіу Іецп бек бек 85 90 95
Рго Уа1і1 ТБЕ Пуз бек Ріе Азп Акуд біу біц Сув 100 105 «2105» 37 «2115» 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 37
Ага ТЕ Уа1 А1ї1а А1їа Рго бек Уа1 Ріе І1е Рібе Рго Рго бет Авр сб1ц 1 5 10 15
Зо біп теп Ппув бек біу ТЬБк А11а бек Уаї Уаї Суз Ппеп теп Авп АвБп Ріе 20 25 зо
Тук Рго Акуд біц Аїа Ппуз Уа1! біп Тер Ппуз Уаї Авзр АвБп А1а Іец біп 35 40 45 бек бі1у Авп бек біп бі бек Уа1і ТЬбг біц біп Авр бек ПЦуз Авр бег 50 55 (219)
ТЬПг Туг бек ПГецй бек бек ТіК Гей Тібіг Іец бек Ппув А1а Авр Тук с1ц 65 70 175 8о
Ппув Нів Ппувз Уа1ї Тук А1їа Сувз біц Уа1! Тік Нів біп сіу Іецп бек бек 85 90 95
РкЕо Уа1 Тік Ппуз бек РіБе Азп Аку б1у біп Сувз 100 105 «210» 38 «2115» 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 38
Ага ТЕ Уа1 А1ї1а А1їа Рго бек Уа1 Ріе І1е Рібе Рго Рго бет Авр сб1ц 1 5 10 15 біп теп Ппуз бек біу ТЬБг А1їа бек Уаї Уаї Суз Кгецп теп Авзп Азп Ріє 20 25 зо
Тук Рго Акуд біц Аїа Ппуз Уа1! біп Тер Ппуз Уаї Авзр АвБп А1а Іец біп 35 40 45 бек б1у Авп бек біп бі бек Уа1 ТЬкЕ біц біп АвБр бек цуз Авр бек 50 55 (219)
ТЬПг Туг бек ПГецй бек бек ТіК Гей Тібіг Іец бек Ппув А1а Авр Тук с1ц 65 70 175 8о
Ппув Нів Ппувз Уа1ї Тук А1їа Сувз біц Уа1! Тік Нів біп сіу Іецп бек бек 85 90 95
Рго Уа1і1 ТБЕ Пуз бек Ріе Азп Акуд біу біц Сув 100 105
Зо «210» 39 «211» 1676 «2125 РЕТ «213» Ното зарієпз
З5 «4005» 39
Меє сі1іу Пец теп бсі1іу І1е тец Суз Ріе Іїецп І1е Рібе Іец б1у Ппувз ТЕБЕ 1 5 10 15 40
Тер бі1у біп біц біп Тк Тук Уа1ї І1е бек А1їа Рго Ппуз І1е Ріе Аг4д 20 25 зо 45
Уаї с1у А1ї1а бек біц Азп І1е Уа1ї І1е біп Уа1ї Тук бі1у Туг ТіБг с1ц
А1а Ріе АБр А1їа ТБкЕ І1е бек І1е Ппувз бек Тук Рго АБр Пувз Ппувз Ріє 50 55 (219) бек Тук бек бек біу Нів Уа1і1 Нів Іецпп бектк бек бій Авп пПуз Ріе біп 65 70 175 8о
Авп бек А1їа І1е теп ТіК І1е біп Рго Ппуз біп теп Рго біу б1у біп 85 90 95 60
Авп оРго Уа1ї бек Тук Уа1 Тук теп біц Уа1! Уаї бек Ппув Нів Ріе бек 100 105 110 пуз бЗек Ппув Акуд Меє Ркго І1е ТБкг Тук АБр Авзп бі1іу Рібе пецпп Ріе І1е 115 120 125
Нів Тік Авр Ппув Рго Уаі1і Туг Тік Ррго Авр біп бек Уа1 Ппуз Уа1! Аг4а 130 135 140
Уа1ї Тук бек теп Авп Авр Азр теп Пуз Рго А1а Пуз Акуд бі Тік Уаї1ї 145 150 155 160
Те ТБЕ Рібе І1е Авр Рго біц біу бек біц Уа1ї Азр Меє Уа1 бі сіц 165 170 175
І1е Азр Нівз І1е бі1у І1е І1ї1е бек Рібе Рго Азр Рібе Ппуз І1е Рго бек 180 185 190
Авп о Рко Акд Тук біу Ме Тер ТіК І1е цпуз Аза пуз Тук Ппув біп Авр 195 200 205
Ріпе бек ТБбЕ ТБг біу Тік Аза Тук Рібе бі Уа1 Ппуз біп Тук Уа1ї Іец
Зо 210 215 220
Рго Ніз Ріе бек Уа1ї бек І1е біц Рго біц Тук Авзп Рібе І1е с1у Туг 225 230 235 240
З5
Кпув Авп Ріе Пуз Авп Рпе біц І1е ТБкг І1е пувз А1а АгЧдЧ Тук Рібе Туг 245 250 255
Авп оПпуз Уа1ї Уа1ї1ї ТіК бі А1а Авзр Уа1! Тук І1е Тік Рібе бі1у І1е Аг4д 260 265 270 біч АвБр теп пуз Авр Авр біп пуз бі Меє Меє біп ТЬг А1а Меє біп 275 280 285
Авп оТБЕ Меє теп І1е Азп бі1іу І1ї1е А1ї1а біп Уа1ї ТЬбг Рібе Авзр бек с1іц 290 295 00
ТЬг А1а Уаї1ї Ппуз біц теп бек Тук Тук бек теп бі Авр теп Авп Авп 305 310 315 320
Ппув Тук гей Тук І1е А1ї1а Уа1 ТБЕ Уа1ї І1е біц бек Тік бі1у б1у Ріє 325 ззо 335 60 бек бі бі А1а бі І1е Рго бі1іу І1е Ппуз Тук Уа1ї Гей бек Рго Туг
340 за5 350
Ппув теп Авп теп Уа1ї1ї А1їа ТіК Рго гей Рібе Іец Пуз Рго біу І11е Рго 355 зво 365
Тук Рго І1е Ппуз Уа1! біп Уа1 Пуз Авр бек теп Азр біп Іец Уа1 01УуУ 370 375 380 сіу Уа1 Ркго Уа1ї1 ТБг теп Азп Аїа біп ТіК І1е Азр Уа1 Азп біп с1іц 385 390 395 400
ТЬПЕ бек Авр гей Авр Рго бек Пуз бек Уа1! Тіг Авд Уа1 АБр Авхр 01Уу 405 410 415
Уаї А1а бек Ріе Уа1ї Іец АвБп теп Ркго бек біу Уа1 Тік Уаї Іеп біцй 420 425 430
Рпе Азп Уа1ї1ї Ппуз ТБг Авр А1їа Рго Авр теп Рго бі бі Азп біп А1а 435 440 445
Ак бі сб1у Тук АгЧд А1їа І1е А1їа Туг бек бек теп бек біп бек Туг 450 455 460
Зо
Те Тук І1е Авр Тер ТіК Авзр Авп Ніз Ппуз А1ї1а теп Іец Уа1 б1у с1іц 465 470 475 480
З5
Нівз пгецп Авзп І1е І1е Уа1 ТБг Ррго Ппувз бек Рго Тук І1е Авр муз І1е 485 490 495
ТрЕ Нів Тук АвБп Тук теп І1е Іец Зек Ппув б1у цпув І1е І1е Ніз РБе 500 505 510 сіу ТБг Акуд бі Ппуз Рібе бек Авр А1їа бек Тук біп бек І1е Азп І1е 515 520 525
Рго Уа1і1 ТБЕ біп Азп Меї Уа1 Рго бек бек АгЧ теп Іец Уа1 Тук Туг 530 535 540
І1е Уаї Тік сбіу біц біп ТБг А1а бі Іец Уа1 бек Авр бек Уа1і Тгр 545 550 555 560
Те Авп І1е біц біц Ппуз Сув бі1у Авп біп тец біп Уаї1ї Нівз Іецп бек 565 570 575 (516) РкЕо АБр А1а АБр А1їа Тук бек Рего бі1у біп ТЬБк Уа1ї бек Іецп Авп Меє 580 585 590
А1а ТБПЕ сіу Меє Авр бек Тер Уа1 А1ї1а теп А1а А1а Уа1ї Азр бек А1а 595 (2109) 605
Уа1ї1 Тук сі1у Уа1 біп Аку б1у Аї1а Ппуз Пув Рго теп бі Акуд Уа1! Ріе 610 615 620 біп Рбе теп біцш Ппуз бек Авр тей біу Суз бі1у А1а сі1іу сіу с1у Іейцй 625 630 635 640
Авп оАБп Аза Авп о Уа1! Рбе Ні Іецп А1а с1у Іецп Тібкг РбБе Ппецп ТЬБкКЕ Азп 645 650 655
А1а Авп А1ї1а Авр Авр бек біп біц Авзп Азр бі Рго Суз Ппуз бі І1е (31210) 665 670
Ітеп Агкуд Рго Акуд Агуд ТіК теп біп Ппувз Ппувз І1е біп бі І1е Аза А1а 675 680 685
Ппув Тук Ппув Нівз бек Уа1ї1ї Уаі1ї ПпЦуз Ппув Сув Сувз Тук Авр бі1у А11а Сувз 690 695 700
Зо
Уа1 Авп Авп Авр о біц Тік Сув бі біп Акуд А1а А1а Агку І1е бек Іец 705 710 715 720 б1у РегЕо Акд Суз І1е пуз А1а Рбе Тібкг бі Суз Суз Уаї Уа1 А1а бек 725 730 735 біп теп Акуд Аза Авзп І1е бек Нів Ппув АвБр Меї біп Іец бі1у Агд Іей 740 745 1750
Нів Мек Ппуз ТіК Кецп Іецп Рго Уаі1ї бек Пув Рго бі І1е Акуд бек Туг 155 760 765
Ріпе Рго біп бек Тер теп Тер біц Уа1ї Ніз Ітец Уа1! Рго АгЧд АгЧд Гуз 770 775 780 біп теп біп Ррбе А1їа теп Рго Авр бек теп Тіг Тіг Тер біц І1е біп 785 790 795 800 сі1у Уаї сбі1у І1їе бек Авзп Тік бі1у І1е Сув Уа1 А1а Авр Тік Уаї1ї цуз 805 810 815
А1а Ппуз Уа1 Ріе пуз Авр Уаі1і Рібе Іец біц Меї Авзп І1е Рго Туг бек 60 820 825 830
Уаї Уа1 Аку бі1у біц біп І1е біп їец Ппувз біу Тік Уа1 Тук Авп Туг 835 840 845
Ага ТБПЕ бек біу Меї біп Ррбе Суз Уа1! Ппуз Меїє бек А1а Уа1 бі С1Уу 850 855 8во
І1е Сув ТБкЕ Зек бі бек Рго Уа1 І1е Авр Нів біп б1у ТБЕ Ппуз бек 865 870 875 880 бек пув Сув Уаі1 Акуд біп Пуз Уа1 бі сбіу бек бек бек Нівз Іец Уаї1ї 885 890 895
ТЬпЕ Рібе ТБкЕ Уаї Пец Рго їецп бі І1е б1у теп Нівз Авзп І1е Авзп Ріє 900 905 910
Бек печп бі Тібг Тер Рбе сіу Пуз бі І1е гей Уа1ї ПпЦуз Тіг Іец АкФд 915 920 925
Уаї1 Уа1ї1 Рко біц б1у Уа1 Ппув Агуд біц бек Тук бек біу Уа1 ТіБг Іей 930 935 940
Зо Авр Ркго Акуд б1у І1е Тук сіу ТіК І1е бек Агу Аку пув бі Рібе Рго 945 950 955 960
Туг АкЧд І1е Рго гей Авр теп Уа1 Ркго Пуз ТіК біц І1е цпуз Агч І1еє
З5 965 970 975
Тецп бек Уаї1ї Ппуз сб1у їецп Ітец Уа1! б1у бі І1е Ггецп бек А1а Уаї1ї Іеєцй 980 985 990 бек біп бі бі1іу І1е Авп І1ї1е теп ТіК Нів теп Рго Ппуз біу бек А1а 995 1000 1005 бі А1а бі теп Межє бек Уа1ї Уа1ії Рго Уа1 Рре Тук Уа1ї Ріе Ніз 1010 1015 1020
Тук теп біцп ТЬкЕ б1у АвБп Нів Тер Азп І1е Рбе Ніз бек АБр Рго 1025 1030 1035
Теч І1е бі пув біп пуз теп Ппуз Ппувз Ппув теп пув бі б1у Меє 1040 1045 1050
Тецп бек І1е Меє бек Туг АкЧ Авп А1їа Азр Тук бек Тукг бек Уаї1ї 1055 1060 1065 60
Тер Ппуз біу біу бек А1а бек ТБЕ Тер їецп ТіК А1а РіБе А1а Іец 1070 1075 1080
АкЧч Маі1 Ппеп б1у біп Уа1 АвБп пуз Тук Уаі1 бі біп Авп біп Авп 1085 1090 1095 бек І1е Сув Авп бек теп Кей Тер теп Уа1і1 біп Авп о Туг біп Іец 1100 1105 1110
Авр Авп о біу бек Ріе Ппуз бі Авп бек біп Тук біп Рго І1е Муз 1115 1120 1125
Тецп біп біу Тік Іецп Рго Уаі біцш А1ї1а Агуу біц Азп бек Іеєц Туг 1130 1135 1140
Теп ТЬг А1Т1а Ррбе Тбг Уа1ї І1е сі1у І1ї1е Агч цпЦув А1а РіГБе Авр І1е 1145 1150 1155
Сув РеЕо Ппеп Уа1 Ппувз І1е АБр ТБкЕ А1ї1а Іеч І1е цпуз А1а АБр Авп 1160 1165 1170
Рре теп Ппеп біц Авп Тк теп Рго А1ї1а біп бек ТБкг Рібе Тік Іеєй
Зо 1175 1180 1185
А1а І1е бек А1а Туг А1а теп бек теп біу Азвр ПцПуз Тік Нів Рего 1190 1195 1200
З5 біп Ріе АгЧд бек І1е Уаі1 бек АТїа Іец Ппуз Акд бі АТа Іец Уа1ї 1205 1210 1215
Ппув бі1у Авп Рго Рго І1е Тук Агкуд Рбіе Тер Пуз Авр Авзп Іецч біп 1220 1225 1230
Нів пувз Авр бек бетк УМа1і1 Ркго Авп Тік бі1у ТЬкЕ А1а Акгкуд Меє Уаї 1235 1240 1245 біц Тк Тік Аза Тук А1а теп Ппецп ТБг бек теп Азп о Іецп Ппувз Авр 1250 1255 1260
І1е Азп Тук Уа1ї Авп Рго Уа1 І1е Ппуз Тер гей бек бі біц біп 1265 1270 1275
АкЧч Тук біу біу біу Рбе Туг бек Тіг біп Авр ТЕ І1е Авзп А1а 1280 1285 1290 60
І1е бі с1у Пец ТіК біц Туг бек теп теп Уа1 Ппуз біп Іец АгкФдФ
1295 1300 1305
Теп бек Меї Азр І1е Авр Уа1ї бек Тук Ппув Нів Ппув біу А1а Іецй 1310 1315 1320
Нів Авп о Тук Ппув Меє ТЬБг Авр о пув Авп Ріе Іец б1у АгрЧдч Рго Уаї1ї 1325 1330 1335 біц Уаі1 Кгецп гецп Авзп Авр Авр Іец І1е Уаі бек Тіг бі1у Ріе О01Уу 1340 1345 1350 бек бі1у Пгецп А1їа Тік Уа1ї Нівз Уа1 ТБг ТБкЕ Уа1ї Уа! Нів Ппув ТЕБЕБЕ 1355 1360 1365
Бек ТЬЕ Зек бі біцп Уаї1ї Сув Бек Рбе Тук Іецп пуз І1е АБр ТБг 1370 1375 1380 біп Азр І11е бі А1а бек Нів Тук Агу біу Тук бі1у Авп бек Авр 1385 1390 1395
Тук пув АкчЧч І1е Уа1 А1а Суз А1їа бек Тук Ппув Рго бек Акч б1іц 1400 1405 1410
Зо бі бегк бек бек біу бек бек Нівз Аїа Уа1 Меї Азр І1е бек Іец 1415 1420 1425
З5
Рго ТЬіг біу І1е бек А1а Азп бі бі Азр теп Ппувз АТа Іец Уа1ї 1430 1435 1440 бі бі1у Уа1ї Авр біп теп Рбе ТбБкЕ Азр Тук біп І1е Гуз АБр 01У 1445 1450 1455
Нівз Уа1 І11е теп біп теп Авзп о бетк І1е Рго бет бек Авр Ріе Іей 1460 1465 1470
Сув Уаі1 АкЧд Рібіе Агд І1е Рбе бі тей Рріе біц Уа1ї сі1у Ріе Іец 1475 1480 1485 бек Рго АТїа Тік Ріе Тік Уа1ї Тук бі Тук Ніз Аг Рго Авр Гуз 1490 1495 1500 біп Сузв Тік Меє Рібе Туг бек ТБг бек Авзп І1е Ппувз І1е біп Гцув 1505 1510 1515 (516) Ууаї Сув біп б1у А1а А1а Суз Ппузв Суз Уаі1і бі Аї1а Авр Суз О1У 1520 1525 1530 біп Меє біп бі бі теп Авр Гей ТБг І1е бек А1а бі ТБг Аг4д 1535 1540 1545
Ппув біп Тік А1а Суз Ппув Рго біцш І1їе А1їа Тук А1а Тук пцуз Уаї1ї 1550 1555 1560 бек І11е ТБг бек І1е Тік Уа1 біш Авп Уа1 Рібе Уа1 Ппуз Тук Пув 1565 1570 1575
А1т1а ТіК Ппеп теп Авр І1е Тук пуз Тік бі1у бі Аї1а Уаї А1а с1ц 1580 1585 1590 пув Авр бек бі І1е Тіп Рбіе І1е Ппуз Ппувз УМа1! ТіБг Сув ТБкг Авп 1595 1600 1605
А1а сіп ТІецп Уа1 Ппувз бі1у Акч біп Тук теп І1е Меє с1у цуз січ 1610 1615 1620
А1а теп біп І1е Ппуз Тук Авп Рібіе бек Ріе АгЧд Тук І1е Тук Рго 1625 1630 1635
Зо
Те Авр бек теп Тібг Тер І1е бі Туг Тер Рго АБЧ Авр ТБг ТЕГ 1640 1645 1650
Сувз бек бек Суз біп А1а Рбе Гей А1ї1а Азп теп АБр бі Ріе А1а 1655 1660 1665 бі Авр І1е Рібе тей Азп бі1у сСувз 1670 1675 «210» 40 «2115» 673 «2125 РЕТ «213» Ното зарієпз «400» 40
Ме сі1у теп пецп біу І1е Іецп Сув Рібе Іецп І1е Рбе Іец б1у цуз ТЕБЕ 1 5 10 15
Тер бі1у біп біц біп Тк Тук Уа1ї І1е бек А1їа Рго Ппуз І1е Ріе Аг4д 20 25 зо
Уаї с1у А1ї1а бек біц Азп І1е Уа1ї І1е біп Уа1ї Тук бі1у Туг ТіБг с1ц 35 40 45 60
А1а Рбіе Авр А1їа ТіПіг І1е бек І1е Ппуз бек Тук Ррго Авр Пуз Ппуз Ріе 50 55 (219) бек Тук бек Зек біу Ніз Уаї1ї Нівз Ппеп бек бек бі АБп цпуз Ріе біп 65 70 175 8о
Авп о бек А1їа І1е теп ТіК І1е біп Рго Ппуз біп теп Рго бі1у сб1у біп в5 90 95
Авп оРго Уа1ї бек Тук Уа1 Тук теп біц Уа1! Уаї бек Ппув Нів Ріе бек 100 105 110
Ппув бек Ппуз Акуд Меє Рго І1е ТБЕ Тук Авр Авзп біу Ріе теп Ріе І1е 115 120 125
Нів Тік Авр Ппув Рго Уаі1і Туг Тік Ррго Авр біп бек Уа1 Ппуз Уа1! Аг4а 130 135 140
Уаї Тук бек пецп Авзп Авр АБр теп Ппув Рго А1їа Кгуз Акд бі ТібкЕ Уаї 145 150 155 160
Те ТБЕ Рібе І1е Авр Рго біц біу бек біц Уа1ї Азр Меє Уа1 бі сіц
Зо 165 170 175
І1е Азр Нівз І1е сбіу І1е І1е бек Рібе Рго Авр Рбе Пуз І1е Рго бег 180 185 190
З5
Авп оРго Ак Тук біу Меї Тер ТБг І1ї1е Ппуз Аза Ппувз Тук Ппувз бі Авр 195 200 205
Ріпе бек ТБбЕ ТіБг бі1іу Тіг Аза Тук Ріе біц Уаї Ппувз бі Туг Уаї1ї Іецй 210 215 220
РкЕо Нів Ріе бек Уаі1і бек І1е бі Рко бі Тук Азп РібБе І1е б1у Тук 225 230 235 240
Кпув Авп Ріе Пуз Авп Рпе біц І1е ТБг І1е пувз А1а АгЧдЧ Тук Рібе Туг 245 250 255
Авп оПпуз Уа1ї Уа1ї1 ТЬг бі А1а Авр Уа1! Тук І1е ТБг Рібе с1у І1е Аг4а 260 265 270 біч Авр тей Пуз Авр Авр біп Ппуз біц Меї Меїє біп Тібг А1а Меє сіп 275 280 285 60
Авп оТБЕ Меє теп І1е Азп бі1іу І1ї1е А1а біп Уа1і1 ТБгЕ Рібе Авр бек біц
290 295 00
ТЬг А1а Уаї1ї Ппуз біц теп бек Тук Тук бек теп бі Авр теп Авп Авп 305 310 315 320
Ппув Тук гей Тук І1е Аза Уа1! Тік Уа1ї І1е бі бек ТБЕ б1у б1у Ріе 325 ззо 335 бек бі бі А1а бі І1е Рго бі1іу І1е Ппуз Тук Уа1ї Гей бек Рго Туг 340 за5 350
Ппув теп Авп теп Уа1ї1ї А1їа ТіК Рго теп Рібе Іец Пуз Рго біу І11е Рго 355 зво 365
Тук РеЕо І1е цпуз Уа1 біп Уаї пувз АБр бетк пецп Азр біп Іеп Уа1 01У 370 375 380 сіу Уа1 Ркго Уа1ї1 ТБг теп Азп А1а біп ТіК І1е Азр Уа1 Азп біп с1іц 385 390 395 400
ТЬПЕ бек Авр гей Авр Рго бек Пуз бек Уа1! Тіг Авд Уа1 АБр Авхр 01Уу 405 410 415
Зо
Уа1ї1 А1їа бек Ріе Уа1їії теп Азп теп Рго бек біу Уаі1і Тіг Уа1ї Іеєц с1ц 420 425 430
З5
Рпе Азп Уа1ї1ї Ппуз ТБг Авр А1їа Рго Авр теп Рго бі бі Азп біп А1а 435 440 445
Акч бі б1у Тук Аку А1а І1е А1а Туг бек бек Іец Зек біп бек Туг 450 455 460
Те Тук І1е Авр Тер ТіК Авзр Авп Ніз Ппуз А1ї1а теп Іец Уа1 б1у с1іц 465 470 475 480
Нівз пгецп Авзп І1е І1е Уа1 ТБг Ррго Ппувз бек Рго Тук І1е Авр муз І1е 485 490 495
ТЬБЕ Нів Тук Авп Тукг теп І1е гей бек Ппуз біу Ппувз І1е І1е Ніз Ріє 500 505 510 сіу ТБг Акуд бі Ппуз Рібе бек Авр А1їа бек Тук біп бек І1е Азп І1е 515 520 525 (516) РкЕо Уаї1ї ТБкг біп Азп Меї Уа1ї Ркго бек бетк Агуд Іецп Іеч Уа1! Тук Тукг 530 535 540
І1е Уаї Тік сбіу біц біп ТБг А1а бі Іец Уа1 бек Авр бек Уа1і Тгр 545 550 555 560
Те Авп І1е біц біц Ппуз Сув бі1у Авп біп тец біп Уаї1ї Нівз Іецп бек 565 570 575
Рго Авр Аза Авр А1їа Тук бек Ркго біу біп Тік Уаії бек Іецп Авзп Меє 580 585 590
А1а Тік сіу Меє Азр бек Тер Уа1 А1а Іеп А1ї1а А1а Уаї Авр бек А1а 595 бо 605
Уа1ї1 Тук сбі1у Уа1! біп Акучу б1у А1ї1а Ппуз Ппув Рго теп бі Акуд Уа1 Ріе 610 615 620 біп Рбе теп біцш Ппуз бек Авр тей біу Суз бі1у А1а сі1іу сіу с1у Іейцй 625 630 635 640
Авп о Авп Аза Авп о Уа1! Ріпе Нівз теп А1їа б1і1у гей Тік Рібе Іецп ТБг Авп 645 650 655
Зо
А1а Авп А1ї1а Авр Авр бек біп біц Авзп Азр бі Рго Суз Ппуз бі І1е (31519) 665 670
З5 їеч «210» 41 «211» 105 «2125 РЕТ «213» Ното зарієпз «400» 41 біц біп ТЕ Тук Уаї І1е бек А1їа Рго Ппуз І1е Рібе Агд Уаі1 с1у А1а 1 5 10 15
Бек біп Азп І1е Уаї І1їе біп Уа1 Тук бі1у Тук ТБг бі А1а Рібе Азр 20 25 зо
А1а ТБЕ І1е бек І1е Ппуз бек Тук Рго Авр Ппув Ппув Ріе бет Туг бек 35 40 45 бек біу Нів Уа1ї Нівз Іецп бек бек бі Авп пувз Рібе біп Авзп бек А1а 50 55 (219) 60
І1е пецп ТБбг І1е біп Рго Ппуз біп теп Рго сіу сіу біп Авп Рго Уаї1ї 65 70 175 8о бек Тук Уа1 Тук Іеп біцп Уа1ї Уаї бек Ппувз Нів Рібе бек Ппуз бек ув 85 90 95
Акач Меє Рго І1е Тік Тук Авр Авп 01Уу 100 105 «210» 42 «211» 101 «2125 РЕТ «213» Ното зарієпз «400» 42
Ррпе Іецп Рібе І1е Нівз ТЬБкК Авр Ппувз Рко Уа1 Тук ТБкЕ Рго АБр біп бек 1 5 10 15
Уаї Ппцув Уа1 Агу Уа1ї Тук бек теп Авзп Авзр Авзр теп Пувз Рго А1їа Гуз 20 25 зо
Акч бі ТЕ Уаї теп Тіг Рре І1е Авр Рго біц біу бек бі Уа1 Авр
Зо
Меє Уа1! біц біц І1е Азр Нів І1е б1у І1е І1е бек Рібе Рго Авр Ріє (219)
З5
Кпув І1е Рго бек Авп Рго АгЧд Тук біу Меє Тер Тіг І1е пуз А11а Гуз 65 70 175 8о 40 Тук Ппув бі АБр Рібе бек Тік ТБк бі1у ТБг А1їа Тук Рре біц Уа1ї Пцуз 85 90 95 біц Тук Уа1ї Іецп Ркго 45 100 «210» 43 «2115» 225 50 «2125 РЕТ «213» Ното зарієпз «400» 43 55 Ме сі1у теп пецп біу І1е Іецп Сув Рібе Іецп І1е Рбе Іец б1у цуз ТЕБЕ 1 5 10 15
Тер бі1у біп біц біп Тк Тук Уа1ї І1е бек А1їа Рго Ппуз І1е Ріе Аг4д 60 20 25 зо
Уаї с1у А1ї1а бек біц Азп І1е Уа1ї І1е біп Уа1ї Тук бі1у Туг ТіБг с1ц 35 40 45
А1а Рбіе Авр А1їа ТіПіг І1е бек І1е Ппуз бек Тук Ррго Авр Пуз Ппуз Ріе 50 55 (219) бек Тук бек Зек біу Нівз Уа1ї Нів Іец бек бек бі Азп Гуз Ріе біп 65 70 175 8о
Авп о бек А1їа І1е теп ТіК І1е біп Рго Ппуз біп теп Рго бі1у сб1у біп в5 90 95
Авп оРго Уа1ї бек Тук Уа1 Тук теп біц Уа1! Уаї бек Ппув Нів Ріе бег 100 105 110
Ппув бек Ппуз Акуд Меє Рго І1е ТБЕ Тук Авр Авзп біу Ріе теп Ріе І1е 115 120 125
Нів ТіК Авр Ппув Ркго Уаі1і Туг ТіК Ррго Азр біп бек Уа1ї Ппуз Уаі1ї Ак4Ч 130 135 140
Зо Уаї Тук бек пецп Авзп Авр АБр теп Ппув Рго А1їа Кгуз Акд бі ТібкЕ Уаї 145 150 155 160
Те ТЬБЕ Рібе І1е Авр Рго біц сіу бек бі Уаі1 Авзр Меє Уа1ї біц с1іц
З5 165 170 175
І1е Азр Нівз І1е сбіу І1е І1е бек Рібе Рго Авр Рбе Пуз І1е Рго бег 180 185 190
Авп оРго Ак Тук біу Меї Тер Тік І1е Кгуз А1а Ппуз Тук ПЦуз бі Авр 195 200 205
Ріпе бек ТБбЕ ТіБг бі1іу Тіг Аза Тук Ріе біц Уаї Ппувз бі Туг Уаї1ї Іецй 210 215 220
РЕо 225 «210» 44 «211» 1676 «2125 РЕТ «213» Масаса Бавсісціагківз «400» 44 60
Меє сі1іу Пец теп бсі1іу І1е тец Суз Ріе Іїецп І1е Рібе Іец б1у Ппувз ТЕБЕ
1 5 10 15
Тер бі1у біп біц біп Тк Тук Уа1ї1ї І1е бек А1їа Рго Ппувз І1е Ріе Аг4д 20 25 зо
Уаї с1у А1ї1а бек біц Азп І1е Уа1ї І1е біп Уа1ї Тук бі1у Туг ТіБг с1ц 35 40 45
А1а Рбіе Авр А1їа Тібіг І1е бек І1е Ппуз бек Тук Рго АвБр Пуз Ппуз Ріе 50 55 (219) бек Тук бек бек біу Нів Уа1і1 Нів Іецпп бектк бек бій Авп пПуз Ріе біп 65 70 175 8о
Авп о бек А1їа Уаї пецп ТБг І1е біп Рко пПуз біп Іецп Ркго бі1у б1у біп 85 90 95
Авп обіп Уа1ї1ї бек Тук Уа1 Тук теп біц Уа1! Уаї бек Ппув Нів Ріе бек 100 105 110 пув бек Ппув Ппув І1е Рго І1е ТБг Тук АвБр Азп бі1у Рібе гей Ріе І1е 115 120 125
Зо
Нів Тік Авр Ппув Рго Уаі1і Туг Тік Ррго Авр біп бек Уа1 Ппуз Уа1! Аг4а 130 135 140
З5
Уа1ї Тук бек теп Авп Азвр Азр теп КГувз Рго А1а Пуз Акуд бі Тік Уаї1ї 145 150 155 160 теп ТіК Рібе І1е Азр Рего біц бі1у бек бі І1їе Авзр Меє Уа1 біцп біцй 165 170 175
І1е Азр Нівз І1е бі1у І1е І1ї1е бек Рібе Рго Азр Рібе Ппуз І1е Рго бек 180 185 190
Авп оРго Ак Тук біу Меї Тер ТБг І1е біп А1а Ппуз Тук Ппувз бі Авр 195 200 205
Ріпе бек ТБбЕ ТіБг біу Тіг А1ї1а Рібе Рібіе біц Уаї Ппуз бі Туг Уаї1ї Іецй 210 215 220
Рго Нівз Ріе бек Уа1ї бек Уа1! біц Рго біц бек Азп Рібе І1е с1у Туг 225 230 235 240 (516) пув АБп Рбе Ппуз Авзп Рібе біп І1е ТБкг І1ї1е цпуз А1а Акд Тук Рібе Туг 245 250 255
Авп оПпуз Уа1ї Уа1ї1ї ТіК бі А1а Авзр Уа1! Тук І1е Тік Рібе бі1у І1е Аг4д 260 265 270 біч Авр тей Пуз Авр Авр біп Ппуз біц Меї Меїє біп Тібг А1а Меє сіп 275 280 285
Авп оТБЕ Меє теп І1е Азп бі1іу І1ї1е А1а біц Уа1ї ТЬбг Рібе Авзр бек с1іц 290 295 00
ТЬкЕ А1а Уаї1ї Ппуз бій Іец Зек Тук Тук бек Ппеп біш Авр Іейп Авп Авп 305 310 315 320
Ппув Тук гей Тук І1е А1ї1а Уа1 ТБЕ Уа1ї І1е біц бек Тік бі1у б1у Ріє 325 ззо 335 бек бі бі А1а бі І1е Рго бі1іу І1е Ппуз Тук Уа1ї Гей бек Рго Туг 340 за5 350
Ппув теп Авп теп Уа1ї1ї А1їа ТіК Рго гей Рібе Іец Пуз Рго біу І11е Рго 355 зво 365
Зо
Туг бек І1е Ппуз Уа1! біп Уа1 ПЦуз Авр А1ї1а теп Азр біп Іец Уа1 01УуУ 370 375 380 сбі1у Уаї Рко Уа1 ТЬкЕ Іец АБп А1а біп ТБЕг І1е Авзр Уаї1ї АвБп біп бій 385 390 395 400
ТЬПЕ бек Авр теп біц Рго АгЧд Пуз бек Уа1! Тіг Авд Уа1 АБр Авхр 01Уу 405 410 415
Уа1ї1 А1їа бек Ріе Уа1ї Уа1ї Азп теп Рго бек біу Уаі1і Тіг Уа1ї Іеєц с1ц 420 425 430
Рпе Азп Уа1ї Ппуз ТБг Авр А1їа Рго Авр теп Рго Азр бі АБп біп А1а 435 440 445
Ак бі сб1у Тук АгЧд А1їа І1е А1їа Туг бек бек теп бек біп бек Туг 450 455 460 теп Тук І1е АБр Тер ТБкК АБр Авп Нів Ппуз А1їа Іецп Іец Уа1 01у біцй 465 470 475 480
Тук теп Авп І1е І1е Уа1 ТіК Ркго Пуз бек Рго Тук І1е Азр Ппувз І1е 60 485 490 495
ТЬБЕ Нів Тук Авп Тукг теп І1е гей бек Ппуз біу Ппувз І1е І1е Ніз Ріє 500 505 510 сіу ТБг Акуд бі Ппуз теп бек Авр А1їа бек Тук біп бек І1е Азп І1е 515 520 525
РкЕо Уаї1ї ТБкг біп Азп Меї Уа1ї Ркго бек бетк Агуд Іецп Іеч Уа1! Тук Тукг 530 535 540
І1е Уаї Тік сбіу біц біп ТБЕ А1а біц теп Уа1ї бек Авр бек Уа1і Тгр 545 5БО 555 560
Те Авп І1е біц біц Ппуз Сув бі1у Авп біп тец біп Уаї1ї Нівз Іецп бек 565 570 575
Рго Авр Аза Ар Тібг Тук бек Ркго біу біп Тіг Уаї бек гей Авп Меє 580 585 590
Уа1ї1 ТБЕ сі1іу Меє Авр бек Тер Уа1! А1ї1а теп Тік А1а Уа1 Авзр бек А1а 595 (2109) 605
Зо Уаї Тук сі1у Уа1ї біп Акуд Акд А1а Ппувз Ппувз Ркго Іеп бі Агу Уа1 Ріє 610 615 620 біп Рбе теп біцш Ппуз бек Авр тей біу Суз бі1у А1а сі1іу сіу с1у Іейцй 625 630 635 640
Авп о Авп Аза Авп о Уа1! Ріпе Нівз теп А1ї1а сі1у теп ТБЕ Рібе Гей ТБг Авзп 645 650 655
А1а Авп А1ї1а Авр Авр бек біп біц Авзп Азр бі Рго Суз Ппуз бі І1е (31519) 665 670
І1е АкЧд Рго Агкд Акуд Меє теп біп бі пуз І1е бі бі І1е А1а А1а 675 680 685 пуз Тук Ппув Нів Ппеп Уа1 Уаї1ї пувз Ппув Сув Сув Тук Авр бі1у Уа1 Аг4дФ 690 695 700
І1е Азп Нів АБр бі ТБг Суз біц біп Агуд А1а А1Зїа Акуд І11е бек Уаї1ї 705 710 715 720 сбі1у Рго Акуд Суз Уа1! Ппуз А1їа Рібе ТБг біц Сув Сув Уа1 Уа1 А1а бек 725 730 735 60 біп теп Акуд АТЗїа Авп Авзп бек Нівз Пуз Авр теп біп Іец б1у Агд Іей 740 745 1750
Нів Меє пувз ТБКЕ Іец Іеп Ркго Уа1 бек пуз Рего бі І1е Агу бек Тук 155 760 765
Ріпе Рго біп бек Тер теп Тер бі Уа1ї1ї Ніз Ітец Уа1! Рго АгЧд АгЧд Гуз 770 775 780 біп теп біп Рре А1їа теп Рго Авр бек Уа1! Тік ТЬбг Тер біц І1е біп 785 790 795 800 сіу Уа1 сі1іу І1е бек Авзп бек сіу І1е Суз Уа1ї Аза Азр Тік І1е Гуз 805 810 815
А1а Ппуз Уа1 Ріе пуз Авр Уаі1і Рібе Іец біц Меї Авзп І1е Рго Туг бек 820 825 830
Уаї Уаї1 Аку сб1у бі біп Уаї1ї біп теп пПуз біу ТБк Уа1ї Тук Авп Тукг 835 840 845
Ага ТБПЕ бек біу Меї біп Ррбе Суз Уа1! Ппуз Меїє бек А1а Уа1 бі С1Уу
Зо в50 в55 8во
І1е Сув ТіК бек біц бек Рго Уаі І1е Авр Ніз біп сіу ТБЕ Пуз бек 865 870 875 880
З5 бек пув Сув Уаі1 Акуд біп Пуз Уа1 бі біу бек бек Авп Ніз Іец Уаї1ї в85 890 895
ТЬпЕ Рібе ТБкЕ Уаї Пец Рго їецп бі І1е б1у теп біп Азп І1е Авзп Ріє 900 905 910
Бек Ппеп біц Тік бек Рбе біу цпуз біц І1е теп Уа1ї Ппуз бек Іецп Аг4д 915 920 925
Уаї1 Уа1ї1 Рко біц б1у Уа1 Ппув Агуд біц бек Тук бек біу І1е ТіБг Іеєй 930 935 940
Авр Рго Акуд біу І1е Тук біу ТБг І1е бек АгЧд АгЧдЧ Куз бі Ріе Рго 945 950 955 960
Туг АкЧд І1е Рго гей Авр теп Уа1 Ркго Пуз ТіК біц І1е цпуз Агч І1еє 965 970 975 60
Тецп бек Уаї1ї Ппуз сб1у їецп Ітец Уа1! б1у бі І1е Ггецп бек А1а Уаї1ї Іеєцй
980 985 990 бек АкЧч бі біу І1е Авп І1ї1е теп ТіК Нів теп Рго Ппуз біу бек А1а 995 1000 1005 бі А1а бі теп Межє бек Уа1ї Уа1ії Рго Уа1 Рре Тук Уа1ї Ріе Ніз 1010 1015 1020
Тукг ге бі Тік бі1у Авп Нів Тер Авзп І1е Ррбе Ніз бек Авр Рго 1025 1030 1035
Теч І1е бі пув АгБд Авзп теп біш Ппуз Ппувз теп пЛувз бі б1у Меє 1040 1045 1050
Уаї бек І1е Меї бек Тут Акд Авп А1а Авзр Тут бек Тук бек Уаї 1055 1060 1065
Тер Ппуз біу біу бек А1а бек ТБЕ Тер їецп ТіК А1а РіГБе А1а Іецй 1070 1075 1080
Ак Уа1ї Іец біу біп Уаі1 Ніз Ппуз Тук Уаі1 бі біп Авп біп Авп 1085 1090 1095
Зо бек І1е Сув Авп бек теп Кей Тер теп Уа1і1 біп Авп о Тук біп Іец 1100 1105 1110
З5
Авр Авп о біу бек Ріе Ппуз бі Авп бек біп Тук біп Рго І1е Муз 1115 1120 1125
Ттеч біп б1у ТБкЕ Іецй Рко Уа1! біп А1а Акуд бі Азп о бек Іецй Туг 1130 1135 1140
Теп ТЬг А1Т1а Ррбе Тбг Уа1ї І1е сі1у І1ї1е Агч цпЦув А1а РіГБе Авр І1е 1145 1150 1155
Сув Рго Ппецп Уа1і Ппув І1е Авп ТБЕ А1їа Іец І1е пуз А1Та Авр Тіг 1160 1165 1170
Рре теп Ппеп біц Авп Тк теп Рго А1ї1а біп бек ТБкг Рібе Тік Іеєй 1175 1180 1185
А1а І1е бек А1а Туг А1а теп бек тец б1у Авр Пуз Тік Нів Рего 1190 1195 1200 (516) біп Рбе Акуд бек І1е Уаї бек АТїа пеп пуз Акд бі АтТа Іеч Уаї 1205 1210 1215
Ппув бі1у Авп Рго Рго І1е Тук Агкуд Рібе Тер Куз Авр бек Іец біп 1220 1225 1230
Нів пуз Авр бек бек Уа1ї Рго Авзп Тік біу ТЬіг А1а Агвч Меє Уаї 1235 1240 1245 біц Тк Тік Аза Тук А1а теп Пец Тбг бек теп Азп о Іецп Ппув Авр 1250 1255 1260
І1е Азп Тук Уа1 Авп Рко І1е І1е цпЦуз Тер Іецп Зек біп біц сбіп 1265 1270 1275
АкЧч Тук біу біу біу Рбе Туг бек Тібг біп Авр ТЕ І1е Авзп А1а 1280 1285 1290
І1е бі с1у Пец ТіК біц Туг бек теп теп Уа1 Ппуз біп Іец АгкФдФ 1295 1300 1305
ТтТецп Авп о Меї Азр І1е Авр Уаі1 А1тї1а Тук Ппув Нів Ппув біу Рго Іей 1310 1315 1320
Зо
Нів Авп о Тук Ппув Меє ТЬБг Авр о пув Авп Ріе Іец б1у АгрЧдч Рго Уаї1ї 1325 1330 1335 бі Уаї1ї Ппеп теп Авп АБр АБр Іец Уаі1і Уа1ї бек Тк біу Ріе 01У 1340 1345 1350 бек бі1у Пгецп А1їа Тік Уа1ї Нівз Уа1 ТБг ТБкЕ Уа1ї Уа! Нів Ппув ТЕБЕБЕ 1355 1360 1365 бек Тіг бек бі біц Уа1! Сув бек Ріе Тук гей Ппуз І1е Авр ТЕБЕ 1370 1375 1380 біп Азр І11е бі А1а бек Нів Тук Агу біу Тук бі1у Авп бек Авр 1385 1390 1395
Тук Ппув АкчЧч І1е Уа1 А1а Суз А1їа бек Тук Ппув Рго бек пуз січ 1400 1405 1410 біц Зек бек бек біу бек бек Нівз А1ї1а Уа1 Меє АБр І1е бек Іеєцй 1415 1420 1425
Рго ТЬіг біу І1е Авзп А1а Азп бі біц Авзр теп Ппувз АТа Іец Уа1ї (516) 1430 1435 1440 біц бі1іу Уаї Авзр біп теп Рібе ТібБЕ Авр Тук біп І1е Ппуз Авр 01Уу 1445 1450 1455
Нівз Уа1 І11е теп біп теп Азп о бек І1е Рго бет бек Авр Ріе Іей 1460 1465 1470
Суз Уаї1ї Агуд РібБе Акд І1е Рбе біп теп Рбе бі Уа1 бі1у Ріе Іей 1475 1480 1485 бек Рго АТїа ТіК Ріе Тік Уа1! Тук бі Тук Ніз Аг Рго Авр Гуз 1490 1495 1500 біп Сузв Тік Меє Рібе Туг бек ТБг бек Авзп І1е Ппувз І1е біп Гцув 1505 1510 1515
Уаї Суз бі бі1у А1ї1а ТБЕ Сузв Ппувз Сув І1е бі А1а Авзр Суз 01Уу 1520 1525 1530 біп Меє біп пувз бі теп Авр Гей ТБг І1е бек А1а бі ТБг Аг4д 1535 1540 1545
Зо пувз біп ТБЕ Аза Суз АБп Рго бі І1ї1е А1а Тук А1а Тук Ппуз Уаї 1550 1555 1560
І1е І1е ТБг бек І1е Тік ТБг біцш Авп Уа1 Ррбе Уа1 Ппуз Тук Пув 1565 1570 1575
А1а ТБЕ Іецп Іецп Авр І1е Тук Ппуз ТіК біу бі А1а Уаї А1а січ 1580 1585 1590 пув Авр бек бі І1е Тіп Рбіе І1е Ппуз Ппувз УМа1! ТіБг Сув ТБкг Авп 1595 1600 1605
А1а сіп ТІецп Уа1 Ппувз бі1у Акч біп Тук теп І1е Меє с1у цуз січ 1610 1615 1620
А1а теп біп І1е Ппувз Туг АБп Рібе ТБк Рібе Акд Тук І1е Тук Ркго 1625 1630 1635
Те Авр бек теп Тібг Тер І1е бі Туг Тер Рго АБЧ Авр ТБг ТЕГ 1640 1645 1650
Сув бек бек Сув біп А1а Рбе Гей А1їа Азп теп Азр бі Ріе А1а 1655 1660 1665 60 бі Авр І1е Рібе тей Азп бі1у сСувз 1670 1675 «210» 45 «211» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 45
Бек бек Тук Тук Меє Суз 1 5 «210» 46 «2115» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 46
Авп о Рпе Тук Тук І1е Суз 1 5 «210» 47 «211» 6 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 47 бек бек Тук Тук Меє Сувз 1 5 «210» 48 «211» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 48 бек бек Тук Тук Меє АБвБп 1 5
Гс10) «210» 49
«211» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 49
Бек бек Тук Тук Меє Авп 1 5 «210» 50 «211» 5 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 50
Авр Авп ТЕ Меє ТЕГ 1 5 «210» 51 «211» 5 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 51
Тіг Тук А1ї1а Меє 01У 1 5 «210» 52 «211» 5 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 52 сі1у Авп А1ї1а І1е Авзп 1 5 «210» 53 «211» 5 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
Гс10) «220»
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 53
ТЬкЕ Тук А1а Меє 01У 1 5 «210» 54 «2115» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 54 бек бек Тук Туг Уа1ї А1а 1 5 «210» 55 «211» 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 55
Сув І1е Тук ТБг біу бек б1у А1ї1а ТБг Туг Тук А1їа бек Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ву «210» 56 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 56
Сув І1е Тук ТБг Уа1ї бек біу Тук ТБг Тук Тук А1їа бек Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ву «210» 57
Гс10) «211» 18 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» Штучно синтезована послідовність «400» 57
Сув І1е Тук А1їа сі1у бек бек біу І1е І1е Тук Тук А1а Азп Тер А1а 1 5 10 15 пуз 01У «210» 58 «211» 16 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 58
Меє І1ї1е Тук біу бек бі1у А1ї1а ТБг Тук Тук А1ї1а бек Тер А1а Гуз 01У 1 5 10 15 «210» 59 «211» 16 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 59
Меї І1е Туг сб1у бек б1у А1а Тік Тук Тук А1їа бек Тер А1а цуз 01У 1 5 10 15 «210» 60 «211» 16 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 60
І1е І1е бек Ріе біу с1у АвБр А1а Тугк Тук А1їа бек Тгр А1а цшуз О01Уу 1 5 10 15 «210» 61 «211» 16
Гс10) «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 61
ТЕ І1е Авр ТБЕ б1у Авр Азп бек Ріпе Туг А1їа Азп Тер А1а Кгуз 01У 1 5 10 15 «210» 62 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 62
Сув І1е Тук ТБЕ біу бек Авр ТБЕ ТБг Тук Тук А1їа Тіг Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ов1уУ «210» 63 «211» 16 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 63
ТЕ І1е Авр ТБЕ б1у Авр Азп бек Ріпе Туг А1їа Азп Тер А1а Кгуз 01У 1 5 10 15 «210» 64 «211» 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 64
А1а І1е Тукє ТБіг біу бек бі1у А1їа Тік Тук Ппув А1а бетк Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ву
Гс10) «210» 65
«211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 65
Авр сі1у сбі1у Тук Уа1 Тік Ркго Тік Нів А1їа Меє Тук Іец 1 5 10 «210» 66 «211» 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 66
Авр теп Ніз А1їа сб1у І1е Тік Авзп Іецй 1 5 «210» 67 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 67
Тук Рго ТБЕ Тук б1у Авр біу біу Ніз А1їа Ріе Азп Іей 1 5 10 «210» 68 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 68 біп І1е Тук бек б1у Авр Авп Авп Авр Азп Ріє 1 5 10 «210» 69 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
Гс10) «220»
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 69 біп І1е Тук бек б1у Авр АвБп Авзп Авр АвБп Ре 1 5 10 «210» 70 «2115» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 70
Ууаї с1у А1їа б1у Авзп І1е Рібе Тер Тук Ріе Авзр Іей 1 5 10 «210» 71 «211» 11 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 71
Авп о Авр обіу бек Уа1ї Тук Авп теп Ріе Азп Іейцй 1 5 10 «210» 72 «211» 4 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 72 сі1у бек с01у Іейцй 1 «210» 73 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 73
Гс10)
Авп о Авр обіу бек Уа1ї Тук Авп теп Ріе Азп Іейцй
1 5 10 «210» 74 «2115 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 74
Авр сіу с1іу Тук Авр Тук Рго ТіБг Ніз А1їа Межє Ніз Туг 1 5 10 «210» 75 «211» 11 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 75 біп А1а бек біп Авзп І1е бі1у бек Авр Іец А1а 1 5 10 «210» 76 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 76 біп А1а бек біп Авзп І1е Тук бек Авп Іец А1а 1 5 10 «2105 77 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 77 біп бек бек біп бек Уа1ї Тук бек бек Авр Тукг Іец бек 1 5 10
Гс10) «210» 78 «211» 11
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 78 біп А1а бек біп бек І1е бек Авп Тер Іец А1а 1 5 10 «210» 79 «211» 11 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 79 біп А1а бек біп бек І1е бек Авп Тер Іец А1а 1 5 10 «210» 80 «211» 11 «212» РЕТ 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» во біп А1а бек біп бек І1е Туг бек А1їа Іец А1а 1 5 10 «210» 81 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 81 біп А1а бек бі Авзп І1е Туг бек А1їа Іец бег 1 5 10 «210» 82 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
Гс10) «220» «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 82 біп А1а бек біп Авзп І1е Тукг бек гей Іец А1а 1 5 10 «210» 83 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
«400» вЗ3 біп А1а бек бі Авзп І1е Туг бек А1їа Іец бег 1 5 10
«210» 84 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 84 біп А1а бек біп Авзп І1е с1у бек бек Іец А1а 1 5 10
«210» 85 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
«220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 85 сі1у А1а бек Пуз Кей А1їа бек 1 5 «210» 86 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 86 (516) сб1у А1а бек АБп Ппеп бі бек 1 5
«210» 87 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 87 бі А1а бек Пуз Кгеп А1їа бек 1 5 «210» 88 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 88
АкЧ А1їа бек ТіК Іец А1з1а бек 1 5 «210» 89 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» во
АкЧ А1їа бек ТіК Іец А1з1а бек 1 5 «210» 90 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 90 бек АТа бек Тік Іец А1а бек 1 5 «210» 91
Гс10) «2115 7 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» Штучно синтезована послідовність «400» 91
Туг А1а бек ТБЕ гец А1їа бег 1 5 «210» 92 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 92
Нівз Тіг бек Авзр теп А1а бек 1 5 «210» 93 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 93
Туг А1а бек ТБЕ гец А1їа бег 1 5 «210» 94 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 94 сб1у А1а бек пЦуз ТЬЕ Ніз бек 1 5 «210» 95 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 95 біп Сувз ТбіЕ Рібе Уаї сб1у бек бек Тук бі1у Авп А1а 1 5 10 «210» 96 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 96
ТтТецп біп сіу Тук бек Туг бек Авп Уа1 Авр Авр А1а 1 5 10 «210» 97 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 97 біп бі1іу ТБг Тук Туг бек бек сіу Тер Тукє Ріе А1а 1 5 10 «210» 98 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 98 біп біп Авр Туг бек бек бек Авп Уаі1ї АБр Авп ТЕ 1 5 10 «210» 99 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 99 біп біп Авр Туг бек бек бек Авп Уа1 Авр Авп ТЕГ
Гс10) 1 5 10
«210» 100 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 100 біп біп Тук Туг бек бек ТіК Авзп Уаі1і Нівз Авп бек 1 5 10 «210» 101 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 101 біп біп Тук Тук Авр І1е Авзп бек Уа1ї Авр Авп ТЕГ 1 5 10 «210» 102 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 102 біп Сув ТБкг А1їа Тук бі1у бек бек АБр Уа1 б1у б1у Тік 1 5 10 «210» 103 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 103 біп біп Тук Тук Авр І1е Авзп бек Уа1ї Авр Авп ТЕГ 1 5 10 «210» 104 «211» 12
Гс10) «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 104 біп бек ТБкЕ Пуз Уа1ї1 б1у бек бек Тук б1у Авп Нівз 1 5 10 «210» 105 «211» 1680 «2125 РЕТ «2135» Мив штазсчіиз «400» 105
Меє сі1іу Пец Тер с1у І1е їец Суз Кгецп Кгецп І1е Рбе Іецп Авр Пуз ТЕБЕ 1 5 10 15
Тер бі1у біп біц біп Тік Тук Уа1ї І1е бек А1їа Рго Ппуз І1е Іец АгФд 20 25 зо
Уаї сі1іу бек бек біц Азп Уа1ї Уаї І1е біп Уаї Нівз сбіу Туг ТіБг с1ц
Зо А1т1а Рібіе АБр А1їа ТБкКЕ Іец бек Іецп Ппув бек Тук Ркго АБр Пуз Ппуз Уаї (219)
ТЬПЕ Рібе бек бек біу Тук Уа1 Авп теп бек Рго бі Авзп Гуз Ріе біп 35 65 70 175 8о
Авп А1їа А1їа теп теп Тіг теп біп Рго Азп біп Уаі Рго Агкд бі с1іц 85 90 95 40 бек Ркего Уаі1і бек Нів Уа1 Тук теп бі Уа1 Уа1 бек ПпЦуз Нів Ріе бег 100 105 110 45
Ппув бек Ппув ПпПув І1е Рго І1е ТБЕ Тук Авп Авзп біу І1е теп Ріе І1е 115 120 125 50 Нів ТБЕ Авр пуз Ркго Уа1 Тук ТБг Рго Азр біп бек Уа1 цпуз І1ї1е Ак4д4 130 135 140
Уаї1ї Тук бек теп біу Авр Азр теп Пувз Рго А1а Ппуз Акуд бі ТібкЕ Уаї1ї 55 145 150 155 160
Те ТБЕ Рібе І1е Авр Рго біц біу бек біц Уа1ї Азр І1е Уа1 бі сіц 165 170 175 60
Авп о Авр оТук Тік бі1іу І1е І1е бек Ріе Рго Азр Рібе КГуз І1е Рго бек 180 185 190
Авп оРко Ппуз Тук біу Уа1 Тер Тік І1ї1е цпуз Аза Авп Тук Ппув пуз Авр 195 200 205
Рпе ТБг ТБЕ ТБЕ бі1іу Тіг Аза Тук Ріе біц І1е пуз біп Туг Уаї1ї Іеєцй 210 215 220
Рго Ак Ріе бек Уа1ї бек І1е біцш теп бі АгЧдЧ Тік Рібе І1е с1у Туг 225 230 235 240 пув Авп Ріе Пуз Авп Рпе біц І1е ТБіг Уа1 Ппуз А1а АгЧдЧ Тук Ріе Туг 245 250 255
Авп оПпуз Уа1ї Уа1ї Рго Азр А1а біц Уа1! Тук А1ї1а Ррбе Рібе сб1у Іецп Агд 260 265 270 біч АвБр І1е цпуз Авр бі бі пуз біп Меє Меє Ніз пуз А1а ТЬк біп 275 280 285
А1а А1ї1а Ппуз теп Уа1 Азр бі1іу Уа1 А1ї1а біп І1е бек Рібе Авзр бек с1ц
Зо 290 295 00
ТЬпгЕ А1а Уа1ї Ппуз біц теп бек Тук Авп бек Іец бі Авр Гей Авп Авп 305 310 315 320
З5
Ппув Тук гей Тук І1е А1ї1а Уа1 ТБЕ Уа1ї ТБг біц бек бек бі1іу б1у Ріє 325 ззо 335 бек бі біп А1а бі І1е Ркго бі1у Уа1ї1 Ппуз Тук Уаї тей бек Рго Туг 340 за5 350
ТрЕ теп АБп теп Уа1ї А1ї1а ТіК Ркго Іецп Рібе Уа1 цпуз Ркго б1у І1е Ркго 355 зво 365
Рпе бек І1е Ппуз Аїа біп Уа1 Ппув Авр бек Іецп біц біп А1ї1а Уаї 01Уу 370 375 380 сіу Уа1 Ркго Уа1ї1 ТБг Ітец Меї А1ї1а біп Тік Уаї Азр Уа1 Азп біп с1іц 385 390 395 400
ТЬПЕгЕ бек Авр теп біц ТіК Ппуз Агуд бек І1е ТіК Нів Авр Тіг Авр 01Уу 405 410 415 60
Уа1ї1 А1їа Уа1ї Рре Уаї теп Азп теп Рго бек Азп Уа1і Тіг Уа1їі Іец Пуз
420 425 430
Рпе біц І1е Акуд ТБг Авр Авзр Рго біц теп Рго бі бі Азп біп А1а 435 440 445 бек пув бі Тук бі А1ї1а Уа1 А1ї1а Туг бетг бектк Гей бек біп бек Туг 450 455 460
І1е Тук І1е А1а Тер ТБг бі Азп Тугк Ппув Рго Меє тей Уа1ї б1у січ 465 470 475 480
Тук гецп Авп І1е Меє Уа1ї ТіК Ркго Пуз бек Рго Тук І1е Азр Ппувз І1е 485 490 495
ТрЕ Нів Тук Авп Тук Іеч І1е Іец бек Ппуз бі1у пуз І1е Уа1 біп Туг 500 505 510 сіу ТБг Акуд бі Ппуз теп Рібе бек бек ТіБг Тук біп Азп І1е Азп І1е 515 520 525
Рго Уа1 ТБЕ біп Азп Меї Уа1 Рго бек А1їа АгЧд теп Іец Уа1 Тук Туг 530 535 540
Зо
І1е Уаї Тік сбіу біц біп ТБг А1а бі теп Уаі1 А1а Авр А1ї1а Уа1о Тгр 545 550 555 560
З5
І1е Азп І1е бі біц Ппуз Сув бі1у АвБп біп теп біп Уа1ї Нівз Іец бек 565 570 575
РкЕо АвБр бі Тук Уа1 Тук бек Рего бі1у біп ТЬк Уа1ї бек Іеп АБвр Меє 580 585 590
Уа1ї ТБЕ біц А1ї1а Авр бек Тер Уа1 А1ї1а теп бек А1а Уа1 Авзр Агуд А1а 5У5 (2109) 605
Уа1ї1 Тук пцувз Уа1 біп б1у Азп А1їа Ппуз АгЧд А1а Меє біп Акуд Уа1 Ріе 610 615 620 біп А1а теп Авр біц Ппуз бек Авр Іец біу Сувз б1у А1а сбі1у сб1у 01У 625 630 635 640
Нів Авр Азп А1ї1а Азр Уаі1 Рібе Нівз Іеп А1а сі1у Гей ТБЕ Рібе Іец ТЕГ 645 650 655 (516) Авп о А1а АБп Аза Авр о АБр бек Нів Тук Аку Авр Авр бек Сув пуз біцй (31519) 665 670
І1е теп АгЧд бек Пувз Аг АвБп теп Нів теп теп Акуд біп Пуз І1е січ 675 680 685 біц біп А1ї1а Аза Ппуз Тук Ппув Нівз бек Уа1ї Рго Ппув Ппув Сув Сув Тукг 690 695 700
Авр с1у А1ї1а Агуд Уа1і1 Азп Рібе Тук бі Тік Сузв бі бій Агкуд Уа1ї А1а 705 710 715 720
АкЧч Ма1і ТБкг І1їе б1у Ркго Іепп Сув І1е Акуд А1ї1а Рбе Авп біп Суз Сувз 725 730 735
ТЬЕ І1е Аза Авп Ппуз І1е Агч Пуз біц бек Рго Нів Ппув Рго Уа1і біп 740 745 1750
Те б1у Акуд І1е Ніз І1е Ппувз ТБЕ Іецп теп Рго Уаі1і Межє Кгуз А1а Авр 155 760 765
І1е АкЧд бек Тук Ріе Рго біц бек Тер теп Тер бі І1е Ніз Аг Уаї 770 775 780
Зо
Рго Ппувз Акд Ппуз біп їец біп Уа1! ТіБг теп Рго Азр бек Іецп ТБ ТЕБЕ 785 790 795 800
ТеЕр біч І1ї1е біп б1у І1е сі1у І1е бек АБр Авзп сі1іу І1ї1е Суз Уа1ї А1а 805 810 815
Авр ТЕ Кеш пуз А1їа Ппуз Уа1ї Ріе Ппуз бі Уаі1ї Рбе Іец бі Меє Авп 820 825 830
І1е Рго Тук бек Уа1 Уа1 Аку бі1у біц біп І1е біп теп Ппуз б1у ТЕБЕ 835 840 845
Уа1ї1 Тук Авп Тук Меї Тіг бек біу ТіК Ппувз Рібе Сув Уа1 Ппуз Меє бек 850 855 8во
А1а уа1ї біц с1у І1е Сувз ТіК бек біу бек бек А1їа А1їа бек Іец Нівз 865 870 875 880
ТрЕ бек Акд Рго бек Аку Сув Уа1 Рібе біп Агу І1е біц сі1у бек бек в85 890 895 бек Нів теп Уаі1 Тібг Рібе ТБгЕ Гей Гей Рго Іец біц І1е б1у Іец Нів 60 900 905 910 бек І1е Авзп Рібе бетг ІКецп біп Тібг бек Рібіе сі1іу Ппуз Авр І1е Іец Уа1ї 915 920 925
Ппув ТБг теп Акуд Уа1ї Уа1ї1ї Рго бі біу Уа1 цпувз АгБЧдЧ бі бек Туг А1а 930 935 940 сі1у Уаї І1їе теп Азвр Ркго пуз бі1у І1е Аку б1у І1е Уа1 Авп Агуд АгФдФ 945 950 955 960
Ппув бі Рібе Рго Тук Агуд І1е Рго гей Авр теп Уа1 Рго Ппув Тік Гуз 965 970 975
Уаї біп Акуд І1е Іец бек Уа1ї Ппуз с1у теп теп Уаі1і сі1у бі Рібе Іей 980 985 990 бек Тік Уаії Іецп бек Ппув біц бі1у І1е Авзп І1е теп Тк Нівз Іец Рго 995 1000 1005 пувз бі1у бек А1а бі А1а бі Гец Меб бек І1е А1а Ркго Уа1! Ріе 1010 1015 1020
Зо Тук Уаї1ї Ріре Ніз Тук Іеп бі АТїа б1у АвБп Нів Тер Авп І1е РіБе 1025 1030 1035
Тук Рго Авр Тібг Іецп бек Ппув Агуд біп бек теп бі Ппуз Ппуз І1е 1040 1045 1050
Ппув біп біу Уа1ї Уа1ї бек Уаї Меє бек Тук АгЧд Азп АТїа Авр Туг 1055 1060 1065 бек Тук бек Меє Тер пПуз біу А1Т1а бек А1їа бек ТБг ТеЕр Іецй ТЕБЕг 1070 1075 1080
А1а Ріе А1ї1а Іецпп Акуд Уаі теп біу біп Уа1 А1а Ппуз Тук Уа1ї цув 1085 1090 1095 біп Азр біп Азп бек І1е Сув Авп бек Іец Іецп Тктр Іеєч Уа1ї! сій 1100 1105 1110
Ппув Сув біп теп бі Азп біу бек Ріе Ппуз бі Азп бек біп Туг 1115 1120 1125
Ттецп Рго І1е Ппувз теп біп бі1іу ТБгЕ теп Рго А1ї1а бі АТа біп січ 1130 1135 1140 60 пув ТБг Ппецп Тук Іецп ТЬБг А1а Рібе бек Уа1! І1е б1у І1е Агдч Муз 1145 1150 1155
А1т1а Уаї1ї Авр І1е Сув Ркго ТБк Меє пуз І1е Нів ТБхж А1а еп АБр 1160 1165 1170 пув А1а Азр бек Рібе Іец теп біцш Авп Тібг теп Рго бек Ппуз бек 1175 1180 1185
ТЬпЕ Рбе Тіг теп А1а І1е Уа1і! АТїа Тукг А1їа теп бек Іец б1у Авр 1190 1195 1200
АкЧ ТЕ Нів Рго Акуд Рібе Агд Іецп І1е Уа! бек А1а Іецп Агчдч Муз 1205 1210 1215 бі А1а РПе Уаі1і Ппуз бі1у Авр Рго Рго І1е Туг Агч Туг Тер Ага 1220 1225 1230
Авр ТіК Ппеп пуз Акуд Рго АБр бек бек Уа1і Ркго бек Зек с1у ТЬБЕг 1235 1240 1245
А1а сіу Ме Уа1 бі ТБг ТБк АТїа Тук А1їа теп теп АТа бек Іец
Зо 1250 1255 1260
Ппув ге пув Авр Меєжє Авзп Тук АТїа Авзп Рго І1е І1е Пуз Тер Іец 1265 1270 1275
З5 бек бі біц біп Агуд Тук біу біу біу Рібе Туг бек Тіг біп Авр 1280 1285 1290
ТЕ І1е Азп А1а І1е бі бі1у ПГецп ТБг біц Тукг бек Гей Іец Іецй 1295 1300 1305 пувз біп І1їе Ніз Іец АвБр Меє АБр І1е Азп Уаі1і А1а Тук пуз Нів 1310 1315 1320 біц бі1у Авр Рбе Ніз Ппуз Тук Ппуз Уа1 ТіК біц пув Нівз Ріе Іец 1325 1330 1335 сі1у АкЧд Ркго Уаі бі Уаї1ї бек Кей Авп Авр Азр теп Уа1! Уа1і бек 1340 1345 1350
Тіг бі1іу Тук бек бек біу теп АТїа Тік Уа1ї Тук Уа1ії Ппув Тік Уаї1ї 1355 1360 1365 60
Уаї Ніз Ппув І1е бек Уаі1 бек біц бі Рре Сувз бек РБе Тукг Іец
1370 1375 1380 пув І1е Авзр Тік біп Азр І1е біцш А1їа бек бек Нів РіГБе Агд Іецй 1385 1390 1395 бек Азр бек біу Рпе Ппувз АкЧч І1е І1е Аза Суз А1їа бек Тук ПЦув 1400 1405 1410
Рго бек Ппув бі бі бетк Тібг бек біу бек бек Нів АТа Уа1ї! Меє 1415 1420 1425
Авр І1е бек теп Рго ТБЕ с1іу І1е б1у А1а Авзп бі біц Авр Іей 1430 1435 1440
АкЧ А1а Ппеп Уаі1 бі сбі1у Уаї Авр біп теп Іецп ТБЕ Авр Тук біп 1445 1450 1455
І1е цпЦув Авр біу Ніз Уа1! І1е І біп теп Абвп бек І1е Рго бег 1460 1465 1470
АкЧ Авр о Рібе Іец Суз Уаі Акдч Ріпіе Агуд І1е Рбе бі Іец Ріе біп 1475 1480 1485
Зо
Уаї с1у Ріе Іецп Азп Рго А1ї1а Тік Ріе Тік Уа1ї Тук бі Тук Нів 1490 1495 1500
З5
Акад Рго Авр Гуз біп Суз Тік Меє І1е Туг бек І1е бек Авр Тіг 1505 1510 1515
АкЧ теп біп пуз Уаї Сув біц б1у А1а А1а Сув ТБкЕ Сув Уа1 біцй 1520 1525 1530
А1а Авр Сув А1а біп теп б1іп А1їа біц Уа1ї Азр теп АТїа І1е бег 1535 1540 1545
А1а Авр бек Акд пуз біцп Ппув АТїа Сув Ппув Рго бі Тіг А1а Туг 1550 1555 1560
А1а Тук Ппув Уа1 Акуд І1е ТБг бек А1їа ТіК бі бі Авп Уа1! Ріе 1565 1570 1575
Уаї Ппув Тук ТЬбг А1їа ТБЕ теп Іец Уа! ТБг Тук Ппуз Тіг б1у с1ц 1580 1585 1590 (516) А1а А1а Авр біш АвБп бек бі УМа1і1 ТБкЕ Рбе І1ї1е пуз Ппувз Меє бекг 1595 1600 1605
Сув ТЕ Авзп А1а Авзп теп Уаі Ппуз б1у Ппув біп Туг Іец І1е Меє 1610 1615 1620 сіу пув бі Уаії теп біп І1е Ппуз Нів Авп Ррбе бек РПБе Ппуз Туг 1625 1630 1635
І1е Тук Ркго теп Авр бек бек Тіг Тер І1е бі Тук Тер Рго ТіБг 1640 1645 1650
Авр Тік ТБЕ Суз Ркго бек Сув біп А1а Рібе Уа1 біп Авп Іец Авп 1655 1660 1665
Авп о Ріе А1ї1а бі Авр теп Рібе Іецп Авзп бек Суз сбіц 1670 1675 1680 «210» 106 «211» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
Зо «400» 106 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу с1у теп Уа1ї біп Рго б1у Аг4да 1 5 10 15
З5 бек Пец АгЧ Іейп бек Сувз А1а А1а бек біу Рібе ТБЕ Уа1ї Нівз бек бек 20 25 зо 40
Тук Тук Меє А1їа Тер Уа1 Агд біп А1ї1а Рго бі1у цпув б1у теп біц Тгр 45 Ууаї сі1у Аза І1їе Рре Тібкг сіу Зек сбі1у А1ї1а біцп Тук пувз А1а біцп Тер (219)
А1а Ппуз с1у Агуд Уа1 ТіК І1е бек ПпЦув Авр Тібг бек ПЦуз Авп біп Уа1ї 50 65 70 175 8о
Уаї Ппеп ТБЕ Меє ТЬіг Азп Меї Авр Рго Уа1ї Азр Тік А11а Тіп Тук Туг 85 90 95 55
Сув А1а бек Авр А1їа сі1іу Тук Авр Тук Рго Тібг Ніз АТїа Меє Ніз Туг 100 105 110 60
Тер бі1у біп сі1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек
115 120 «210» 107 «2115» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 107 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у Аг4Фд 1 5 10 15 бек Пец АгЧ Іейп бек Сувз А1а А1а бек біу Рібе ТБЕ Уа1ї Нівз бек бек зо 20
Тук Тук Меє А1їа Тер Уа1 Агд біп А1ї1а Рго бі1у пувз б1у Іец бі Тер 25
Уаї с1у Аї1а І1їе Ріе Тік біу бек б1у А1а бі Тук Ппув А1а бі Тгр (219)
Зо Ууаї Ппув сб1у Агуд РрБе Тібіг І1е бек Акд АБр Авп бек пуб АБп о ТБЕ Іей 65 70 175 8о
Тук гецп біп Меє Азп бек теп Акуд А1їа біц Азр Тік А1а Уа1ї Тук Туг
З5 в5 90 95
Сув А1а бек Авр А1їа сі1іу Тук Авр Тук Рго Тік Нів А1а Межє Ніз Туг 100 105 110 40
Тер б1у Акуд с1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 115 120 45 «210» 108 «211» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 50 «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 108 55 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у Аг4Фд 1 5 10 15 (516) Бек Ппеп Акуд Іецп бек Суз А1ї1а А1їа бек бі1у Рібе ТБг Уа1ї Нівз бек бек 20 25 зо
Тук Тук Меє А1їа Тер Уа1 Агд біп А1ї1а Рго бі1у пувз б1у Іец бі Тер 35 40 45
Уаї с1у Аї1а І1їе Ріе Тік біу бек б1у А1а бі Тук Ппув А1а біц Тер 50 55 (219)
А1а Ппуз с1у Агуд Уа1 ТіК І1е бек ПпЦув Авр Тік бек Пув Авп біп Уаї 65 70 175 8о
Уаї теп ТБЕг Меє ТЬБкЕ Авзп Мебє Азр Рко Уа1 Авр ТБк А11а ТБг Тук Туг 85 90 95
Сув А1а бек Авр А1їа сі1іу Тук Авр Тук Рго Тік Нів А1а Межє Ніз Туг 100 105 110
Тер б1у Акуд с1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 115 120 «210» 109 «211» 123 «2125 РЕТ 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
З5 «400» 109 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у 01У 1 5 10 15 40 бек Пец АгЧ Іейп бек Сувз А1а А1а бек біу Рібе ТБЕ Уа1ї Нівз бек бек 20 25 зо 45 Тук Тук Меє Аза Тер Уаі1 Акуд біп А1а Рко б1у Ппуз б1у Іеп біц Тер
Уаї с1у Аї1а І1їе Ріе Тік біу бек б1у А1а бі Тук Ппув А1а біц Тер 50 55 (219)
А1а Ппуз с1у Агуд Уа1 ТіК І1е бек ПпЦув Авр Тік бек Пув Авп біп Уаї 65 70 175 8о
Уаї Ппеп ТБЕ Меє ТЬіг Азп Меї Авр Рго Уа1ї Азр Тік А11а Тіп Тук Туг 85 90 95 60
Сув А1а бек Авр А1їа сі1іу Тук Авр Тук Рго Тік Нів А1а Межє Ніз Туг
100 105 110
Тер бі1у біп сі1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 115 120 «210» 110 «211» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 110 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у 01У 1 5 10 15 бек Пец АгЧ Іейп бек Сувз А1а А1а бек біу Рібе ТБЕ Уа1ї Нівз бек бек 20 25 зо
Тук Тук Меє А1їа Тер Уа1 Агд біп А1ї1а Рго бі1у пувз б1у Іец бі Тер
Зо Уаї бек с1у І1їе Рре Тібкг сіу Зек сбі1у Аза ТБкг Тук пуз А1а біцп Тер (219)
А1а Ппуз с1у Агуд Уа1 ТіК І1е бек ПпЦув Авр Тік бек Пув Авп біп Уаї 35 65 70 175 8о
Уаї Ппеп ТБЕ Меє ТЬіг Азп Меї Авр Рго Уа1ї Азр Тік А11а Тіп Тук Туг 85 90 95 40
Сув А1а бек Авр А1їа сі1іу Тук Авр Тук Рго Тік Нів А1а Межє Ніз Туг 100 105 110 45
Тер бі1у біп сі1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 115 120 50 «210» 111 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 55 «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 111 (516) Авр І1е біп Меє ТЬкг біп бек Ркго бек бБетк Ппейп бек А11а бек Уа1 01У 1 5 10 15
Авр Акд Уа1ї ТБг І1е Тік Сув Агуд А1їа бек біп біу І11е бетг бек бек 20 25 зо
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппуз Ркго сіу Ппуз А1їа Рго Пув теп Іец І1е 35 40 45
Тук бі1у А1ї1а бек біц Тіг біц бек біу Уа1і! Рго бек Агд Ріе бек 01Уу 50 55 (219) бек бі1у бек бі1у ТБкг АБр РіБе ТБЕ пецпп ТіБкК І1е бег бек пецп біп Ркго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Тік Ппувз Уа1 сіу бек бек в5 90 95
Тук б1у Авп ТБЕ Ріе бсі1іу біу б1іу ТЬг Ппуз Уа! бі І1е Гуз 100 105 110 «210» 112 «211» 110 «2125 РЕТ 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
З5 «400» 112
Авр І1е біп Меє Тбг біп бек Рго бек бек Іец бек А1а бек Уа1 01У 1 5 10 15 40
Авр Акд Уа1ї ТБг І1е Тік Сув Агуд А1їа бек біп біу І11е бетг бек бек 20 25 зо 45 теп А1а Тер Тук біп біп Ппувз Рко бі1у біп А1їа Рго Акуд Іеч Іец І1е
Тук бі1у А1ї1а бек біц Тіг біц бек біу Уа1і! Рго бек Агд Ріе бек 01Уу 50 55 (219) бек біу бек біу ТЬбг Авр Рібе Тібг Іецп ТЬбг І1е бек бек теп біп Рго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Тік Ппувз Уа1 сіу бек бек 85 90 95 60
Тук б1у Авп ТБЕ Ріе бсі1іу біу б1іу ТЬг Ппуз Уа! бі І1е Гуз
100 105 110 «210» 113 «211» 110 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 113
Авр І1е біп Меє Тбг біп бек Рго бек бек Іец бек А1а бек Уа1 01У 1 5 10 15
Авр Акд Уа1ї ТБг І1е Тік Сув Агуд А1їа бек біп біу І11е бетг бек бек іс19) 20
ТтІеп А1а Тер Тук біп біп Ппуз Ркго біу біп А1ї1а Рго АгЧд Іец Іец І1е 25
Тук бі1у А1ї1а бек ТБг ТіК біп бек біу Уа1і! Рго бек Агд Ріе бек 01Уу 6о
Зо бек бі1у бек бі1у ТБкг АБр РіБе ТБЕ пецпп ТіБкК І1е бег бек пецп біп Ркго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Тік Ппувз Уа1 сіу бек бек
З5 в5 90 95
Тук б1у Авп ТБЕ Ріе бсі1іу біу б1іу ТЬг Ппуз Уа! бі І1е Гуз 100 105 110 40 «210» 114 «2115» 328 «2125 РЕТ 45 «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність 50 «400» 114
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1а Рго бекгк бек Гуз 1 5 10 15 55 бек Тіг бек біу біу ТЬбг А1а А1а Іец сі1у Суз Гей Уа1ї цЦуз Авр Туг 20 25 зо (516) Рпе Ркго бій Ркго Уа1 ТЬБкК Уа1ї бек Тер АБп бек бі1у А11а Іеп ТБЕ бек 35 40 45 сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек 50 55 (219)
Тецп бек бек Уа1ї Уа1ї ТіК Уа1 Ркго бек бек бек теп біу ТЬбг біп ТЕБЕ 65 70 175 8о
Тук І1е Сузв Авп Уа1ї1ї Авп Нів Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 85 90 95 пуз Маї1ї бій Рко пувз бек Сув Авр пуб Тік Нівз ТБЕ Сувз Ркго Ркго Сувз 100 105 110
Рго А1а Рго біп теп Агуд Агуд біу Ркго Пуз Уа1 Ріе теп Рібе Рго Рго 115 120 125
Ппув Рго Ппуз Авр ТБЕг Іец Меї І1е бек Агуд ТіК Рго бі Уаі1ї Тік Сув 130 135 140
Уаї1 Уаї Уаї Авр Уа1ії бек Нів біц Авр Рго бі Уа1і Ппувз Ріе Азп Тгр 145 150 155 160
Зо
Тук Уа1 Авр сі1у Уа1! біц Уа1 Нів Авп А1їа Ппув Тік Ппув Рго Агкуд сб1ц 165 170 175 біц біп Тук АвБп бек Тік Тук Акуд Уа1ї Уаї бек Уаї Іецп ТБг Уаї1ї Іецй 180 185 190
Нів біп Авр Тер теп Авзп бі1у Ппув бі Тук Ппув Сув Ппув Уа1! бек Авп 195 200 205
Ппув бі1у Ппеп Рго бек бек І1е біцш Ппуз ТіК І1е бек Ппувз А1а Кгуз 01У 210 215 220 біп Рго Акуд бі Рго біп Уа1! Тук ТіБг теп Рго Рго бек Агкд бі с1іц 225 230 235 240
Меє ТЕ Пуз Авп біп Уа1! бек теп ТіК Сувз теп Уа1і Ппувз бі1у Ріе Туг 245 250 255
Ркго бек АБр І1їе А1а Уа1 бі Тер бі бек Авп біу біп Ркго бій Авзп 260 265 270
Авп оТук ПпПув ТіБг ТіК Рго Рго Уа1їії Іец Азр бек Азр біу бек Ріе Ріє 60 275 280 285
Тецп Тук бек Ппуз пгецп ТіК Уа1! Авр пПуз бек АгЧд Тер біп біп б1у Авп 290 295 00
Уа1і1 Рібе бек Суз бек Уа1! теп Ніз біц А1їа пГецп Ніз АТїа Ніз Тук ТЕГ 305 310 315 320
Акч Ппув бій Ппецп бек Іец бек РЕго 325 «210» 115 «2115» 325 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 115
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1а Рго Суз бек Аг4д 1 5 10 15 бек Тіг бек біу біу ТЬбг А1а А1а Іец сі1у Суз Гей Уа1ї цЦуз Авр Туг 20 25 зо
Зо
Рпе Рго біп Ркго Уа1 ТіК Уа1 бек Тер Азп бек біу А11а Іецп ТББг бек
З5 сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек (219) 40 теп Зек бек Уа1 Уа1 ТЬБкК Уа1ї Ркго бек бБектк бек Іецп б1у ТБкг Ппуз ТЕ 65 70 175 8о
Тук ТБг Сув Авп Уа1ї Авр Нівз Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 45 в5 90 95
Ак Уа1ї біц бек Ппуз Тук біу Рго Рго Сув Ркго Рго Сув Рго А1а Рго 100 105 110 50 біц Рбе Агкуд Акуд біу Рго Ппуз Уа1 Рібе теп Ріе Рго Рго Ппув Рго Гуз 115 120 125 55
Авр ТБПЕ пец Меє І1е бек АкЧдЧ ТіБіг Рго біц Уаі1і Тібг Сувз Уа1 Уа1ї Уаї 130 135 140 (516) Авр Ма1 бек Нівз біп Авр Рко бі Уа1 Ппцуз РіБе Авзп Тер Туг Уа1 Азр 145 150 155 160 сіу Уаі1 біцп Уаї Нівз Авп А1їа Ппуз ТЬіг Ппуз Рго АБд бі бі біп Туг 165 170 175
Авп обек Тібг Тукг Агд Уа1 Уаї бек Уа1ії Кгецп Тік Уаії Іец Нівз біп Авр 180 185 190
Тер теп Авп біу Ппуз бі Тук Ппув Сув Ппув Маі1ї бек Авп Ппувз 61у Іейцй 195 200 205
Ркго Зек бек І1ї1е біцп Ппуз Тік І1е бек пПуз Аза пуз б1у біп Рго Ак4д4 210 215 220 біц Рго біп Уа1ї Тук ТБг Кец Ркго Рго бек Аг4д бі бі Меє Тбг Гуз 225 230 235 240
Авп обіп Уа1ї бек теп Тіг Сув теп Уа1! Ппуз бі1іу Рібе Тук Рго бек Авр 245 250 255
І1е А1а Уаї бі Тер бі бек Авп біу біп Рго біцп Авп Авп Тук Пув 260 265 270
Зо
ТБЕ ТБЕ Рго Ркго Уа1ї Іец Авзр бек Авр біу бек Ріе Рібе Гей Туг бег 275 280 285 пувз теп ТБг Уа1 Авзр пуз бек Акд Тер біп біп б1у Авзп Уа1 РрБе бек 290 295 00
Сув бек Уа1ї пгецп Ніз біц А1їа тец Нів А1а Нівз Тук ТБЕ Акд Пуз січ 305 310 315 320
Ітес бек Ге бек РЕо 325 «210» 116 «2115» 325 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 116
А1а бек ТБЕ Ппуз біу Рго бек Уа1 Ріе Рго теп А1а Рго Суз бек Аг4д 1 5 10 15 60 бек Тіг бек біу біу ТЬбг А1а А1а Іец сі1у Суз Гей Уа1ї цЦуз Авр Туг
20 25 зо
Рпе Рго біп Ркго Уа1 ТіК Уа1 бек Тер Азп бек біу А11а Іецп ТББг бек 35 40 45 сіу Уа1 Ніз ТБЕ Ріе Рго А1їа Уаї Іец біп бек бек бі1у Іецп Туг бек 50 55 (219)
Тецп бек бек Уа1ї Уа1ї ТіК Уа1 Ркго бек бек бек теп біу Тібг Пув ТЕБЕ 65 70 175 8о
Тук ТБг Сув Авп Уа1ї Авр Нівз Пувз Рго бек Авп Тіг Ппув Уаі1ї Авр Гуз 85 90 95
Акч Ма1ї бі бек пуз Тук бі1іу Ркго Рко Сув Рго Ркго Сув Рго А1а Рго 100 105 110 біц Рбе Агкуд Акуд біу Рго Ппуз Уа1 Рібе теп Ріе Рго Рго Ппув Рго Гуз 115 120 125
Авр ТБПЕ пец Меє І1е бек АкЧдЧ ТіБіг Рго біц Уаі1і Тібг Сувз Уа1 Уа1ї Уаї 130 135 140
Зо
Авр Уа1і бек Ніз біц Авр Рго біц Уа1! Пув Ріе Азп Тер Туг Уа1ї1 Авр 145 150 155 160
З5 сіу Уаі1 біцп Уаї Нівз Авп А1їа Ппуз ТЬіг Ппуз Рго АБд бі бі біп Туг 165 170 175
Авп бек ТБг Тук Аку Уа1 Уа1ї Зек Уаї теп ТЬкЕ Уаїії Іецп Нів біп Азр 180 185 190
Тер теп Авп біу Ппуз бі Тук Ппув Сув Ппув Маі1ї бек Авп Ппувз 61у Іейцй 195 200 205
Рго бек бек І1е біц Ппуз ТіК І1е бек Ппуз А1ї1а цпувз біу біп Рго Аг4Фд 210 215 220 біц Рго біп Уа1ї Тук ТБг Кец Ркго Рго бек Аг4д бі бі Меє Тбг Гуз 225 230 235 240
Авп обіп Уа1ї бек теп Тіг Сув теп Уа1! Ппуз біу Рібе Тук Рго бек Авр 245 250 255 (516) І1їе А1а Уа1 бі Тер бі бек Авп біу біп Ркго бій Авп Азп Тук Гувг 260 265 270
ТЕ ТБЕ Рго Ркго Уа1ї Іец Авзр бек Авр біу бек Ріе Рібе Гей Туг бег 275 280 285
АгЧ теп ТБЕ Уа1ї1ї Авр Ппуз бек Агуд Тер біп біп бі1у Авзп Уа1 Рібе бек 290 295 оо
Сув бек Уа1 пгецп Ніз біц А1їа Гецп Ніз А1їа Нівз Тук ТБЕ Акд Пуз січ 305 310 315 320 теп бек Кей бек РЕо 325 «210» 117 «211» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 117 бек бек Тук Туг Меє А1а 1 5 «210» 118 «211» 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 118
А1а І1е Рбе Тібіг біу бек бі1у А1їа біц Тук Ппув А1а бі Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ву «210» 119 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 119
Гс10)
А1а І1е Рбе Тібіг біу бек бі1у А1їа біц Тук Ппув А1а бі Тер Уа1 Гуз
1 5 10 15 ву «210» 120 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 120 сі1у І1е Рбе ТБг біу бек б1у Аїа ТБг Тук Ппуз А1ї1а бі Тер А1а Гуз 1 5 10 15 ву «210» 121 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 121
Авр А1зїа с1іу Тук Авр Тук Рго ТіБг Ніз А1їа Межє Ніз Туг 1 5 10 «210» 122 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 122
АкЧ А1а бек біп біу І1е бек Зек бек Іецп А1а 1 5 10 «210» 123 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 123 сі1у А1а бек бі ТБг біц бек 1 5 «210» 124 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 124 сі1у А1а бек ТБЕ ТБг біп бек 1 5 «210» 125 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 125 біп Азп ТЕ Ппуз Уа1 б1у бек бек Тук б1у Авп ТБЕг 1 5 10 «210» 126 «211» 6 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (5)..(5) «223» Хаа є Меї або Уаї «220» «221» інша ознака «222» (6)..(6) «223» Хаа є Суз або А1а «400» 126 бек бек Тук Тук Хаа Хаа 1 5
Гс10) «210» 127 «211» 17
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (1)..(1) «223» Хаа є Суз, А1а або 01У «220» «221» інша ознака «222» (3)..(3) «223» Хаа є Тук або Ріє «220» «221» інша ознака «222» (9)..(9) «223» Хаа є ТЬг, Авр або сб1іц «220» «221» інша ознака «222» (11)..(11) «223» Хаа є Тук, ПпЦув або біп «220» «221» інша ознака «222» (13)..(13) «223» Хаа є бек, Авр або сб1іц «220» «221» інша ознака «222» (15)..(15) «223» Хаа є А1їа або Уаї «400» 127
Хаа І1е Хаа Тік сі1у бек б1у А1а Хаа Тук Хаа А1ї1а Хаа Тер Хаа цуз 1 5 10 15 ву «210» 128 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (2)..(2) (516) «223» Хаа є б1у або А1а
«221» інша ознака «222» (5)..(5) «223» Хаа є Уа1, біп або Агвр «220» «221» інша ознака «222» (6)..(6) «223» Хаа є ТЬкг або Тук «220» «221» інша ознака «222» (12)..(12) «223» Хаа є Туг або Нів «220» «221» інша ознака «222» (13)..(13) «223» Хаа є Іеч або Тук «400» 128
Авр Хаа сіу Тук Хаа Хаа Рго ТЬг Ніз А1їа Меє Хаа Хаа 1 5 10 «210» 129 «211» 11 «212» РЕТ 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (1)..(1) «223» Хаа є біп або Агк4д «220» «221» інша ознака «222» (5)..(5) «223» Хаа є Азп, біп або 01У «220» «221» інша ознака «222» (7)..(7) «223» Хаа є бі1у або бек «220» «221» інша ознака «222» (9)..(89) «223» Хаа є Азр, ПпЦув або бек «400» 129
Хаа А1а бек біп Хаа І1е Хаа бек Хаа Іеєцп А1а 1 5 10
Гс10)
«210» 130 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (4)..(4) «223» Хаа є Ппуз, бі або ТЕБЕ «220» «221» інша ознака «222» (5)..(5) «223» Хаа є Іеч або Тік «220» «221» інша ознака «222» (6)..(6) «223» Хаа є А1ї1а, Ніз, біц або сбіп «400» 130 сі1у А1а бек Хаа Хаа Хаа бек 1 5 «210» 131 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «220» «221» інша ознака «222» (2)..(2) «223» Хаа є бек, Сув, Авп або Тік «220» «221» інша ознака «222» (4)..(4) «223» Хаа є Ріе або Гувг «220» «221» інша ознака «222» (12)..(12) «223» Хаа є А1а, ТЬкг або Ніз «400» 131 біп Хаа ТБЕ Хаа Уаї с1у бек бек Тук бі1у Авп Хаа 1 5 10
Гс10) «210» 132
«211» 30 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 132 біп Уаї1ї біп теп Уа1! біц бЗек бі1у сі1у с1у Ппеп Уа1 біп Рко б01у 01У 1 5 10 15 бек песп АгЧд Іеп бек Суз А1їа А1а бек сіу Рібе ТБг бек Нівз зо «210» 133 «211» 30 20 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність 25 «400» 133 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек сіу бі1іу б1у теп Уа1ї біп Рго б1у Аг4Фд 1 5 10 15 бек пецп АгЧд Іеп бек Суз А1їа А1а бек сіу Рібе ТіБг Уа1ї Ніз 20 25 зо «210» 134 «211» 30 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 134 біп Уаі1 біп гецп Уа1! біц бек бі1іу біу сбіу теп Уа1ї біп Рго б1у 01У 1 5 10 15
Бек Ппеп Акуд Іецп бек Суз А1ї1а А1ї1а бек бі1у Рібе ТБг Уа1ї Ніз 20 25 зо «210» 135 «211» 14 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 135
Тер Уаі1 Акуд біп Аза Рго біу Ппуз бі1у теп бі ТеЕр Уаї О01У 1 5 10 «210» 136 «211» 14 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 136
Тер Уаі1 Акуд біп Аза Рго біу Ппуз бі1у теп бі ТеЕр Уаї бек 1 5 10 «210» 137 «2115» 32 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 137
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек Пув Авр ТіБг бек ПпЦув Авзп біп Уа1 Уа1їі Іецп ТЕБЕ 1 5 10 15
Ме Тік Авп Меє Азр Ркго Уаі1і Авр ТБг А1їа ТБг Тук Тук Сув А1з1а бек 20 25 зо «210» 138 «2115» 32 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 138
Ак Уа1і1 ТБЕ І1е бек ПпЦув Авр ТіБіг бек ПпЦув Авзп біп Уа1 Уа1їі Іецп ТЕБЕ 1 5 10 15
Меє ТБЕ Авзп Меє Авр Рго Уаії Авр ТіК Аза Тік Тук Тугк Сув А1а бек 20 25 зо «210» 139 «2115» 32 «212» РЕТ 10) «213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 139
АкЧ Ріпе ТБЕ І1е бек Аг Авзр Авп бек Пув Авзп Тік Іецп Туг Іец біп 1 5 10 15
Ме Ап бетг пецп Агу А1а бі АвБр ТБг Аза Уа1ї Тук Тук Сув А1з1а бек 20 25 зо «210» 140 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 140
Тер бі1у біп сі1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 1 5 10 «210» 141 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 141
Тер б1у Акуд с1іу ТБг Іец Уа1 ТБЕ Уа1і бек бек 1 5 10 «210» 142 «211»? 23 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 142
Авр Уа1 Уаї Меє Трг біп бек Рго бек бек теп бек А1а бек Уа1 01У 1 5 10 15
Авр Акд Уа1і ТБг І11е Тік Сувз 20
Гс10) «210» 143 «211»? 23
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 143
Авр І1е біп Меє Тбг біп бек Рго бек бек Іец бек А1а бек Уа1 01У 1 5 10 15
Авр Акд Уа1і ТБг І11е Тік Сувз 20 «210» 144 «211» 15 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 144
Тер Тук біп біп Ппуз Рго біу біп А1їа Рго Агуд Іецп Іец І1е Туг 1 5 10 15 «210» 145 «211» 15 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 145
Тер Тук біп біп Ппуз Рго біу Ппуз А1їа Рго Ппуз теп теп І1е Туг 1 5 10 15 «210» 146 «2115» 32 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 146 сбі1у Уаї Рко бек Агу РіБе бек бі1у бек бі1у бек бі1у Тік АБр Рбе ТЕБЕ 1 5 10 15
Тецп ТЬБг І1е бек бек теп біп Ркго біцш Авр Уа1 А1ї1а Тік Тук Тук Сув
Гс10) 20 25 зо
«210» 147 «2115» 32 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 147 сіу Уа1 Рго бек Агу Ріе бек біу бек біу бек біу Тібг Авр Рібе ТЕБЕ 1 5 10 15
Тецп ТЬБг І1е бек бек теп біп Ркго біцш Авр Ріе А1їа Тік Тук Тук Сув зо 20 «210» 148 «211» 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 25 «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 148
Зо Рпе бі1у сіу б1у ТЬкг Ппуз Уа1 біч І1е цуз 1 5 10 «210» 149 «211» 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 149 біп Уаі1 біп гецп Уаї1 біп бек б1у А1їа бі Уаї пув Ппув Рго б1у А1а 1 5 10 15 бек Уаї Ппув Уа1і бек Сув Ппув А1а бек біу Нівз І1е Рібе бек Авп Туг 20 25 зо
Тер І1е біп Тер Уа1! Агу біп А1ї1а Рго біу біп б1у Іеп бі Тер Меє 35 40 45 сіу біц І1е Гей Ркго біу бек сіу Нівз ТБг біц Тук Тік бі Авзп Ріє 50 55 (219) (516) пув АБр Акд Уаі1і ТЬкг Меї ТЬікг Аку АБр о ТБЕ бек ТБк бек Тік Уа1 Тукг 65 70 175 8о
Меє біп Пец бек бек теп АгЧд бек біц Авзр Тік А11а Уа1 Тук Тук Сув 85 90 95
А1а Акд Тук Ріе Ріе біу бек бек Рго Азп Тер Тук Ріе Авзр Уа1і Тгр 100 105 110 сіу біп сі1іу ТБЕ пгец Уа1! ТіК Уа1ї бек бек А1їа бек Тік Ппувз б1у Рго 115 120 125
Бек Ма1 Ріре Ркго Іеп А1їа Рго Суз бек Аку бек Тік бек бій бек Тік 130 135 140
А1а А1ї1а теп сбіу Суз теп Уа1ї Пцуз Авр Тук Ріе Рго бі Рго Уа1 ТЕБЕ 145 150 155 160
Уаіїі бек Тер Авзп бек біу А1ї1а теп Тіг бек біу Уа1 Нів Тібг Рібе Рго 165 170 175
А1а Уа1ї Пец біп бек бек біу Ктецп Тукг бек теп бек бек Уа1і Уа1 ТЕБЕ 180 185 190
Зо
Уа1і Ркго бек бек Авп Рпе біу ТБг біп Тік Тук ТЬбкг Сув Авп Уа1 Авр 195 200 205
Нів Ппув Рго бек Авп Тік ПпПуз Уа1 АвБр пуз ТЬБк Уа1! бій Акд цуз Суз 210 215 220
Сув Уа1 бі Сув Рго Рго Сув Рго А1їа Рго Рго Уаі А1а біу Рго бек 225 230 235 240
Уа1 Рібе Пец Рібе Рго Рго Ппув Рго Пуз Авр Тіг Іецп Меї І1е бек Аг4д 245 250 255
ТЕ Рго біц Уа1 ТБг Суз Уа1 Уа1ї Уа1ї Авр Уаї1ї бек біп бі Авр Рго 260 265 270 біц Уаі1 біп Рбе Азп Тер Тук Уа1 Авр біу Уа1ї біц Уаї Ніз Авп А1а 275 280 285 пувз Тк Ппув Рго Агуд бі біц біп Рібе Авп бБет Тбіг Тук Аку Уа1 Уаї 290 295 00 бек Уаії Ппецп Тібг Уа1ї Іец Ніз біп Авр Тер теп Авп сіу ПпЦуз біц Туг (516) 305 310 315 320
Ппув Сув Ппув Уа1ії бек Авп Ппувз біу теп Рго бек бек І1е біцш Пувз Тіг 325 ззо 335
І1е бек пув А1а Ппуз біу біп Рго Агд бі Рго біп Уа1ї Тук Тік Іец 340 за5 350
РЕо Рего бек біп біцп біц Меж ТБкЕ гпувз Авп біп Уа! бек пеп ТЬкЕ Суз 355 зво 365 теп Уаі1 Ппуз с1у Ріе Тук Рго бек Авр І1е А1а Уа1ї бі Тер біц бек 370 375 380
Авп осіу біп Рго біц Авзп Азп Тук Ппув ТЬбг ТБг Рго Ркго Уа1і Іец Авр 385 390 395 400 бек Азр біу бек Ріе Рібе Кей Туг бек Аг теп ТБЕ Уа1ї Авр Пуз бек 405 410 415
Ага Тер біп біц б1у Азп Уа1ї РіБе бек Сувз бек Уа1і теп Ніз біц А1а 420 425 430
Зо Ттечп Нів бек Ніз Тук ТБк біп Ппуз бек КІеп бек Ппейп бек Іец с1у цуз 435 440 445 «210» 150
З5 «211» 214 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 40 «223» Штучно синтезована послідовність «400» 150
Авр І1е біп Меє Тбг біп бек Рго бек бек Іец бек А1а бек Уа1 01У 45 1 5 10 15
Авр Акд Уа1ї ТіБг І1е Тік Сув біу А1а бек бі Авзп І1е Туг с1у А1а 20 25 зо 50
Те Авп Тер Тук біп біп Ппуз Ркго сіу Ппуз А1їа Рго Пув теп Іец І1е 55
Тук б1у А1ї1а ТБЕ Авзп теп А1їа Авр біу Уа1 Рго бек Агд Ріе бек 01Уу (219) (516) бек бі1у бек бі1у ТБкг АБр РіБе ТБЕ пецпп ТіБкК І1е бег бек пецп біп Ркго 65 70 175 8о бі Авр Рбе АТїа ТіБг Тук Тук Сув біп Авзп Уаії гей Авп Тіг Рго Іей 85 90 95
ТіЕ Ріе сіу біп бі1іу ТіК Ппувз Уа1! бі І1е пувз АкБЧдЧ Тібг Уаі1ї А1а А1а 100 105 110
Рго бек Уа1 Рібе І1е Ріе Рго Рго бек Авр біц біп теп Кгуз бек 01Уу 115 120 125
ТркЕ А1а бек Уаї1ї Уа1ї Суз Іецп теп АБп АвБп Ріе Тук Рго Акд біцп А1а 130 135 140 пув УМа1 біп Тер Ппуз Уа1ї Авр Авп А1ї1а Іец біп бек біу Авзп бек біп 145 150 155 160 бі бек Уа1 ТБЕ біц біп Азр бек ПпЦуз Авр бек Тік Туг бет ГКецп бек 165 170 175 бек ТіК Кгецп Тіг Іецп бек Ппуз А1а Авр Туг біц Ппувз Нівз Ппуз Уа1! Тукг 180 185 190
Зо
А1а Суз біц Уа1 Тік Нів біп б1іу теп бек бек Рго Уа1 Тібг Ппуз бек 195 200 205
Рпе Азп Акд б1у біц Суз

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Антитіло проти С5, яке включає послідовність МН за 5ЕО ІО МО: 106 та послідовність МІ. за ЗЕО ІО МО: 111.
    2. Антитіло за п. 1, яке включає константну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 114, і константну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 38.
    3. Антитіло за будь-яким з пп. 1-2, яке є повнорозмірним антитілом дО або да.
    4. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-3.
    5. Клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту за п. 4.
    6. Спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 5, так щоб вироблялося антитіло.
    7. Фармацевтичний склад, який містить антитіло за будь-яким з пп. 1-3 та фармацевтично прийнятний носій.
    Детекторне антитіло З совопваововоовоорововововово вБевбеооБ:зовоБоБооБОБЕВВВоЕ ви в вв де в а в я заворот «ВАЗОН ХЕ ТЕТЕЕЕТЕЕЕТЕЕТЕ седовве-етвоваї ТЕЗЕ ее ее нан ее ее ее ее скдозія-ктвова! БІВ вк ніс: ре вія ЕЕ в ви це Свапватетвовя! ЧЕ Барне вк ее ве ре свдовао-ктвоса БЕБІ енер я у че седозатжтвова! ПЕЦЕЗ ут Бере норея те ря еп в ев ее вве, селоєюєтося 5 ЗЕ Не ВУ СКАОВУВЕТвОВЯІ ЕЕІЗІБН І ек вк ЕЕ б СеАоЗаОєтвОСа| есе сх вне вк як не БЕК Ба ех еру ее І, до СкАОЗТВЕТВОСЯ: Серію в ря: свв вн Я нн вв Б свдовзвятвося, НЕ ее З ек кеВ в сСЕАОБОТЕТВОВЯ. ЕІ вени в ве я т ех ся як ех ВЕ ОЦЕ ВЕ, ФО СтАОБоветвовя. еВ ех ве еще ВИетея еев вНв еЄ ків, ел нене ее ее З скАОЗОЄ-ЕТВОСЯ. БЕН я БО ВЕ вів ва ее еВ ЕВ 8 свдовтеєтвова! ев енер ЕЕ хе: ЦЕ, Сеаобве-к?вося: ЕІ ж с Ен я Ер вне Бер не КЕІЖІ У, седовтактвося, Пед ЕЕ ще я рев БЕН БК Екулізумаб-ятвося еко Ерні ж кон в у СЕАОЗ2ОЖТВОСЯ: 15 Бе Бе Кс век вх вх як же все ес ве Бен вк Би НАЦ СЕдОЗЯ ТВОЯ Есе со уже Ск все с КН Кн ев Ен: о ВЕНЕЛ Б СЕАОЗЯОТВОСЯ: Ле нев ее ее в ее ее веж СКАО2ІТКТвОВЯ. ее ера я ле я Бе св в вен рев шгрне БЕН ЕК р5 ве|Я свловтоєтвоса ГТ ев ее З СкАОЗавтвовя І ГЕТЕ сов; Бе не о в ее ее с БеНЮ СедОзтактвося аа Нв НЕ ЕУ Я - і в
    Фіг. 1
    БУЧІ ' ЕХ: ! ш- Е ' . Код ши Еш ше ві ' и зі і Еш що і о НЕ Н 5 | НІ. Н Щй | в і г ' З з Й і Гея ши ' ях т ' Б я , Бе Н г 2 , -к і ХУ І В ев ве 5 12 Ге Н зЕ в ' к В. Н з ш Н в ж : З я і Й 8 Н - З , - 8 и і Ж 7 о Ж 7 5 Ж є а ше г В В гу 1 з ; в 5 ' 1 Фф ' Я 5 ' - 5 ' я ї В - ! о ' о З ' ее а і 5 їв в . 5 ж 5 ї » ; ЗЕ ' рт ж яр ж дж жжютльжжлжлжжльяютжяфр тя Й і ал "чани я ЩО о суудднннтятвиляжнтвтнт, -- зе 5 8 5 є в ЗВ 8 В й є З БВ В 8 й о 8 Реакція (0 « початк. знач.) Редакція (0: початк. змач.) Реакція (0 х початк. знач.) чо » бо -ко : о КА і йо ше бор - 5 ' щі, : - вл бо ЖЯ ' З ВЕ : х ; б Б |; о Яв р; 8 і ; т з ' 5 рі , в У 1 Ку і і ж В Н Ех в ; й5 Ф ' 85 Ф Н 85 5 в ВЕ ше 2 Н - "б 8 Н ї п в. ' ЕІ о з 5. в у о : З о Є х- б , щш- : Ф ' 25 х Ні 5 - о е8 х Н у о и мае: ' 5 В ' ' Ф з Ф ф В х : я кх ; я Ж Й ок ' "о ' - с й 5 5 і х З ' 1 8 В 8 8 г 8 в Я 5 о 9 в з б р 2» з - (2 Фе з 58 8 В 8 с З 88 8 8 8 є З ЗВ 8 8 8 не 5 Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 г початк. знач.)
    Фіг. 2А їі 2 ; її Зв, бо. ве . Н Брі Кк І ' Ві ше ' В ПІ НН 8 Й ' і з ; не я- ' - а - в : г і бе 8, ве Ка - е Ж ! ЖОФФ а я м. : я Фф, ее їх. г аб. , З г Ж - і ще - , р Го а нн о і є ре р) з тв! 5 і ВУ о , 5 Ж! 5 щі 5 х ; я ві як | Ве ' тя о ьо "в І І Ф с ' КН оф в Ее Н о 5 в Бі Зо Ф Й КК а НУ ї НАХ Н рож ж « род 5 і їх й в Н в с і 8 03 Кк Ів А Ов я БО, х У 000та т щас 2 НУ пукететепеттетттннтттретт нд тя тн деюнння | Й й 5 Ж Я 8 8» й 8 5 Я й о В 855 8 8 8 о 8 Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 х початк. знач.) що ЕВ Бех ше: ше Ве Не іно в ' як Е Ех : Ї г І | ї і | : ! 5 рр з (І і ра і і ' - що і щ-- Ма Н - Ф : 55 з ! ях в ; 85 5 ! ПЗ ! 5 Н 5 в ; 5 в . 5 з 5 Геоі й їх ї- , Їж г ; їх ре і Б | : Бо , т 5 К га Е | / о / 5 Ф : 8е2 5 ; Зе 5 ; 8 5) Н в г в , н Ф ' Ф, є х 2, в , - х ї Зо і о Ж « що Ф х Ка Фф , "в в і і й я т Де Е Т хе у У Х шк х ет (Я ; й з 88 МА з в У 5 м 5 х яв ву - в т ; чі й - яв 8 8 8 2 8 В Я В 8 ее 7 В З В я ен Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 х початк. знач.) Реакція (0 х початк. змач.)
    Фіг. 28 з ща ВІ п я Рок є Фе и ВІ ну ния І ее КЕ Бон ще й голи, ші: ї 5 Кай 7 на со ве ЗНЕШННННН біо в, 00 а а Я. не шк и Ми НИ аз з а та т я є з, ддвках пяв з ЗАЯВКА Б КН роя; Ко ПА дію Ду ШИ ТМ Ж Зоо ПМ Кт т оч ши ще с, ММ и о ся нн ВШ а оон и її я ей шо у Ка НН МО бо ВЕУ сш Бе Яке Я «ЖЕ пр, Шк Я їй інн й заній Би в - з : з аа лях ї ве як МАЯ о бат ок с С в дур. ше Сх я ув Се а с а НН АН - м нас - чук ен НН ета Ффия Ся Те пу М, сх га Ше пи Же пня КОХ се ше В в я МНН змо МОЖЖМИТЕЩИЙХ Ск: КИ тт. рать їла ГИ Зк З ВИ МОМ: ПЕ хо й ! заяв Ав з ЗИЯВАйК НЯ а буяння В ре и и Я фо я НА ОК в ки нон сис ЕрЙ рин Не КН щоки щ- її шк У ет «ща гою ві їі ті ли р. ! п вк а Бад сю Ге Й ща ак як кА Р вк йв яя Со «Х СУДАН : ям вто Жю о був. яю і дж Де я м А та в и й Шон КО о пк и ОН в а Е фе не нн Б му В ВО, Ушн ОВК «Бо В сш пи З и раза ва юка ово ом паю Звавк ах яз звався: пз
    Фіг. З
    Узгоджена сенсограма - СЕАбЗОВ ! в -- СЕАОЗОЇ - зо "т СЕдДОоЗОв і ро шко пяеняе Екулізумаб ЕТО0О04А г) оправа р У І "з щей х, вчи - В й їх тля фо лю т ан х Шо КУ ше нн ПИ ет З х юю у й т Ж 20 080 1 180 2400300. 380 420 -- Час (0 з початкове значення) й з ку Узгоджена сенсограма п ДЕКВЕОі й | - и СЕАОБОЗ В зо; ш и СЕДО5ОВ 8 | ; а - ІЛЛІ щі чну Екулізумаб 750038. в щі га Хоч, ше М | и тож ол о їй есвкаю г жк 5 ба Кін - 5 х е 0 с щ осзмеезнконх певмкФуккхкови. чачає х в 10 Ж Н Фо х по ДО о ж 7705 бо 420 480 940 300 360 420 то Мас (0 х початкове значення) Й о Во. узгоджена сенсограма п СЕАОБЕИ В - СЕАОВТ2
    8. зо; там ОКА З і рн ни м "7 Єкупізумаб Е76008 и - звали вро, шо | ,
    й к. ВАТИ и ФО ІЗ У Ж -9 ж 20080420 480 мо 300 360 420 Ко Час (0 х початкове значення) с
    Фіг. 4
    Анти-057Т пи щ й ХУ їх ді» ді лк б Али о: з юки кун ої Обом ка у д Фо о а На ВИ а КУ нн 250 т З ля її ШЕ 5 - В ен ш юн. 37 -- де КВ В НН З В мини АВ о В В КК В ЖК -о вн юю шен Б
    Фіг. 5А Ка З М ді ді іх лу я Є: ж Кк ве: се я щої - мя ау бу - « хо да ЖЖ ою 250 - о и и НН 25 ж, па шк но й Її ВН пп шк на НН
    Фіг. 58
    1 Бета-панцюг С5 людини бо МИНЕ ЕНН оь-1 ІЕІеЕННННО 150 511-161 БУ вв 551-481 5БО домен МО1-МО2 1 225 5133 124 сета5 0 СО 124 5571-52 СО 124 с5І-33 Со 1 5-33 СО 108 сета5 ОС 111
    Фіг. 50 Екулізумаб СЕДОЗО5 жо ож Ж жи КОДИ УДК ее о
    ЕФ. ЕФ 250кдв. я Е
    75. М з
    Ко. Є ОКУ ОХ 0 - бе ве» за зе ж. шо і
    25 . Щй ї- .
    Фіг. 6 є Узгоджена сенсограма -- с Фо! 0 Єкулізумаб ша ж САВА Бін мен нн СЬОМА я о. шен тен чен зе поні дл СВКЮВА; ри 1 4 рак лосі вк о и 51401 й о Кс Кок я 13 й і ! щ 120 ак хюю | ДИ я пово Ї; д ї ї Ф 59 / : х і ! І ж 1
    ЗИ. ку а о б що 129 180 око З зво 420 Час (0 «х початкове значення) с - Узгоджена сенсограма питовм ФО 305405 шен СЬ-ЕЯВА Ф уяві пен нн ОМА Б т СУКА З зві Фі й 1201 Ворді х Мк офрокнннкктжконя З до: в що пін чи шт; т нн ИН 2 40. -7 ; Би воб я - в о 120 180 го Зою ЗВО 429 Час(0 х початкове значення) є
    Фіг. 7 то В оп : - Ф »ю Узгоджена сенсограма ен лоно СЕТ ду Го я теожноже СВ - НІ Є Не звалася Й жавкожкижя г А ні з с- 380 са осо ная вм 1 СБ: НААНУ їв, ка і пив но 440 «8 ! З 120 й ех КИ й ен Е 180 й че с КУ що у, м, вч р що і Я о 2 40 І: мине т З і и І ЕЗ ? ча фреоемо же ча нки ню ою сь ою зн р щу зкожкоюе ме ме ве ото че ЕЗ Ко » кю яка жк ї з о Во що 243003 4030 4806020 Час (0 2 початкове значення) с
    Фіг. 8
    ---- СЕАОЗО5 120 ко СЕАОЗО? т 100 -к- СЕАОЗВВ З Вефрефе зх я СЕАОВОЇ ЕЕ ВО 0 що і -е. СЕАОБЗВ Є, во «ВК. шо СЕАОБОЯ. о зна -в. СЕАОВОВ ДоО- ЩЕ за СЕАОВТ? 520 жи 019 СБАОвТВ. 0,01 би А 10 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. ЗА 120 са СЕАОЗЗО х 100 їх і я СЕАОЗА! З ЖК що ВО ох с Ке У БО Е ї т ї вк 20 і о ' Я 0001 001 0 1 19 100 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 98 во «а. СЕАОЗОБ га о жо СЕАОЗОЇ Е Во ре СЕАОЗОВ ко ЕК , я СЕАОБОЇ З шо ж СЕДОБЗВ Емі -Ф. СЕАОБОЗ а 500 ; -В. СЕАОБВЄ
    Е й. -в СЕАОВІ2 с жосяо | у СЕАОВТВ 2 о . 0 би ' 10 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 10А - 2000 м СЕАОЗЗО З а СЕАОЗАІ --
    є. 1500 і І м мк че В ОО фо. жк 1000 тс, в с т ж 500 Ж зв. . хх сок хх о | 7 0001 о 0 1 10 100 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 108 150 зе. СЕАОЗОБ 100 в чек яд дум а --. зов п 80 а НЕ ЧК гЯ 2 во , « ех «о 40 х т їх 5 М хе її рохМ ше
    0 і. 0,01 01 1 10 100 1000 Концентрація антитіла ( мкг/мл )
    Фіг. 11
    2 нини юини: - «ее СЕРА, їв я СЕАОВТО. (чо К. ле ї що, «о. пи с ія ким ме ж ех що ін Ї. ща 1,0 х З т х Х. нео | " су а й -е її о. - «я в» и о 001 0 і 10 100 1000 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 12 Е сс ке екон: ; Гени САД ТОВОЯ їх ОО ее овивевк й "нн не» ОБАЦБІВРТВООЯ т Я не СЕМОЮЮЕТВЮЮІ З ун СЕАОВВЄЕТВОВИ х І рен СЕМЕРО во І нене ОЕАОБТЕКІВОВХ о Го чяае СЕОЗМЕТВОВІ зе | не» СЕАОНЕТОВИ 0 уектільни СБ людини) о 1 2 З 4 5 6 7 час (дні)
    Фіг. 13 1009е У чн Е че СЕАООВВ-Р ТВО 5 нано СЕАОБОТЕТВОСІ во наве СЕАОБЗВ-РТВОСА З ннан СЕАОБОВ-ЕТВОСЯ, к вес» СЕАОВОВ-ЕТВОСА ві чно СЕАОВТО ЕТВОСЯ еде СЕАОБТЕ-ЕТВОЮИ се зна» СРАОЗЗО-РТВОВІ
    4. нако СЕАОЗАИ-РТВОСА 1 2 3 4 5 в 7 час (дні)
    Фіг. 14
    120 се 3051. 015-90422 чек 305 О016-55429 100 піде лк ав сляяя е у як. 3051,018-56422 е 80 Ше і -Ф. 305,019-50422 Е А аа 3051 020-55422. во М ік во дво42 з жо 3051 020-56115 - 40 ви Кд с зе 20 0 0001 0,0 01 Ї то 100 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 15 120 зо ЗОБІ О15-50115 8 100 ту «а 305 023-55429 - 80 шк ік з 60 У цен "в к 40 Е: 5 Е о 20 х 5 у і і ч КН 01 З 10 100 Концентрація антитіла( мкг/мл )
    Фіг. 16
    1204 -ае 30 022-505115
    Є... ча. 305 022-50422 100 Ме Й й й 4 як З05,О23-50115 о 803 я 3051023-80422 не г. пк. попит т- 8504 ь й ь х 40 ! У ін 20. і ч ще ч кума й 0 ї десни ! фо ск Й і 00001 0,001 Що 01 1 10 Концентрація антитіла ( мкг/мл )
    Фіг. 17 т яко 3051 018-56422 Е В001 ж... же 305Ц018-50422 - 6004 5 «Ку ся 305,019-50422 Одді «р» я 305 020-50422 8 | я -е- 3051 020-505115 р 200 . Кент т т. 5 001 о 1 1000 200 Концентрація антитіла (мкг/мл)
    Фіг. 18
    1500 ширину у чи ою ЗО О 15115, кт тя Гі ав КУ 08 ОЯи ! З ! КО ддннннннннтннннтчтттттттттттттттнттттттннктннткннно З вл0004 фо щ Ї Ше не З я З ' не Ме їх г. 500 | І з ї - ! У... Й 5 | Ше п . 0001 001 0 1 10 100 Концентрація антитіла смемлі
    Фіг. 19 ів. ново яв наве З О16-55422 1 збе сне СВ В обаІІ І «ефеЗоМм ої 5дя23 - 80 | чне 301 02050422 е 50. як 3051015-50115 жо. чен 3051023-56115 с За | Пеня 5 З Я БЕ а ЕВ; дв сало нн на дрооснн ВВ т оеовеов свя о мк зо? 20 40 БО Дні після введниня
    Фіг. 20 че пк ! ' нім 2:53 | ой У 145 - 100 фак фх» о ік. Ван в ж жо УВО 80 В жк: НЯВЯН Е З ж. К928О - во і -а- робву Ка їх В. 5БІНМННІМ о І: е. ЕЯ3ТВ Емі 40 Й ї ЗИ НИНОН І І В ; . ат У 6001 Фо 0 а то 100 Концентрація антитіла мкг/мл у
    Фіг. 21 Її ші | за УК я УМ 5 т ведені: жо ВНС о зІхІх: з со УВІ в Во Ее --. К885Н Е х ож- К9280 о з ІЗЮМ юю ї -е. Е1437) -о З Фе З
    20. у 0,004 б ой 1 10 100 Концентрація антитіла( мкг/мл
    Фіг. 22
    1204 че ВМО4А 1004 й г. -жш- варіант 305 Я во. ЕЕ. мя Кк ж 804 хе Є 40 ге є а хх до ка НІ -. й 28 НЯ 0 З 10 00 Концентрація антитіла( мкг/мл у
    Фіг. 23 ую нини шишшшш тур т І яз ефе 1015-56115 о Р ше в Вофи їй вк в о М лах ою си, й Бо дис Зо "Во, ом, зобов Ей оа-е ад тен 1018-56422 5 2 ех ме -«МОО нн | з х. й | ль сови 0 ефе Ц020-56422 ча Н - с 5о Ден внфна Ц020-96115 Ше коню |023-56115 е ! фо б пеню тен ЩО22-56422 5 00070 210025 35 82 49 56 3-95 5и» час (дні)
    Фіг. 24 10340 пок о о у и о т р р р РУ р рве НУМЬЗВЯКІ Є - 5 софвюе НОТУ 5 ЕВ от вен пйрн 16-56 ве фоскя Ф вв сен 039-55822 а Ше ВИНЕ АТ Кея щік ще плядени СУМНО що вит ка ххх ДОЗУ ол пи п в о п теку У о 7 14 раї 725, «35 2 49 за час (дні) нн КюЗ-нсвоХ
    Фіг. 25
    А) молпекула-? важкий ланцює лів В батам семи. С5-Мо1 иа ЧИНА ж мир о Ве пегкий ланцюг у ска й. ек й й Коса АВК са о чу ч ва зе, р ДИ ж Е я зе: Я по5-мМо1 чем хо ЕК 1» ро и о У НЕ: й ; х 8 Се ко г ж ав Н іч жи ! ; а лора ах | Мати ; Пи З ДИКУ, пеня тннахх СВ - й (г їй важкий панцюг Розрізняльна здатність. 2,31 А
    І В. ее (5): 20,42, 25,44 мопекула-ї В) т-щ пС5-МО1 Шо А, сь важкий у Ж. й; 5 З. ія латпий ланцюг й у зу Я ланцюг Ь, щи і і ; й цу Року й зтемночярий: молекула-і , і світло-сірий: молекула-? хх (глп.вй. 0717 А, Со)
    Фіг. 26 плини вовни пи пи ня пн пол МИ Ноя пи Мис порно пол ТОВ Мія Млин пи ПН: домен (20-124) МОЗ БОБ Ї Го ШЕ І Щі і | ши ши 181 МК МО НО ПН КТ ОЛОК НО ЗАОЕНХ ПОЛН НМА ПИВ ННОЄ НАХ ПАН АЛАНА ОНКО: поли пиши пами пом пн пр ни по пов рано мно; зором воля рові вилов тич пови зарни вич мин порох ау пен фін зії вів а в о пе гг че ТЕТ ХІМІ АСК НІМ ОАЕ СУ, МОЇМ У о МТ Е А у і | Е г | В М МО 5 ОДНИНИ МА МАК ши ш ЕНН ВО ТВО МИНА ШО НОВО, МАО ЗОВ НО ПОЛ ММ МА Ів НЕ МАН ЦЕ ЗНИК ДІ МИМО МА А ОА ВИМЕНІ ОВ ВО ВООВООВОВА МИ ПДМ АААВ МАЕ - нини по а а а а п ни а В с Гентфрен фентіентрння ся пік 213 45 БІ) 8 5112 34 56 7 В 5 о) АТ 1 51 КІВ У РІВІК КЕ. зІу|вів в сини чги ши ОТ ?',!,юпоух п, м пи А а і пк п ОО ПО ПА А ПП А А ДОА АД МО ПО ОО ПО А ОД НІ ПА ПО ПА А УА ів 11 11, НДІ НИ ИНА НИК ВИКО НК ЕКС ВАВОВ ПАННА ПИ ПА НИНН зоое ми поло мо зов пон по пами пови ооо нин зором порох мовни зай зона мови зи: пи коні на З но: под он пов нн м ев АБ ТВ 5 о ІЕЕ Б. вве ті 4 БЕ т ВВ яю ВІВІК в. вів а нів У КМ КЕ М м БК Ї с МЕ МЕ Ши ШК Б! НН ПОД і 4-4 рі р ши 144 іа ввів ів во ін к|5ІКІ5 КА ІМіР піт рів б) ДИНИ ШИ ВИ М А МЕ ххх ЗВ ши пив ин нн вима ми зам нн тт речами о: Ве мом н мирян ш ТТ ТТ | ех ех
    Фіг. 27А з ГЕ йо і БК с- ВС5-М1 з Ж г т ник су меч ав. йо й х їй ва ко а Ух Кб? ко зо ей ше КУ х і - вч що зби, ви, ди ИН но ли пу да щЩ у о Ша стос КК ДИ ДЕЕВОУ вимови дж й : ї ОК й у р р ее
    В.О А Кт Кола е7 жа ( А У й й о. Кв о с. - : Нв ; «4 5 щьа . чь: У «4. жа важкий че ек й 6 датжий данкцюг яь и в ж де Вами 0/лапюг х 2 сс Кава ТЕ х тях Шк и но Ей с Є ДСН ний ШИЯ ч м в с -Ме / шіку ка вс5-мМо1 в Мою он Тл : хо шт 90
    НО. ів щі й 5 ї пк их Ен ЗО 4 ПОВ ----- ВИМ ПЕВ я вх мч щи со Й, С «а Се ц -й зо, В и Ех МО с Її ие фе ШВА щу ди а легкий 5 ЗЕ М МЕ в Я що Здай и ШИ ОН ЩІ ж важкий ланцюг а б ь. і ланцюг
    Фіг. 2785 ри є ж Х в Ка і як
    Кк. КЕ ай СМ б1 і Що з З я Ж вве ух ІВ Шо нс в А ; Хе т лає В дл ч Ф ПИТНІ ПИЛИ КИ Не й ша щих нку о вс Її а КЗ с вий чи 0-Х ей а дені М ет». ой ин ЇЇ 1 ш-иуі зе пиши ПОПИ ДИЛИ ИТИЦИТУ ШИПИ ДИТ ПИ ЛЕТИ у ПИ УИИИ ТЯ ОО В нн і в леж А Ен важкий Ор З ОО й Пн НЯ ла ла Ум: НО НИ дон як Пд он з ОМ а ланцюг я
    Фіг. 28А ші два ек. ; че Бль. б Її Гедв | (ду н-срАЗ й а. Нібос Її 5 - ь ши що я ду ее дос» ЗК і Шин: ОХ, ЛЬ й і и у А СЯ ! і фе й ча ща: Не СОНЯ, че и ши 0 Ше НИ чере м г ще, ! і ь х Й У а сх чу 1 х ву Й Є й й ші я ва І
    Фіг. 2885 у 5- с Бе о Зк че Соні й и шк В 532 в . до НИЙ че і Я их. т ОО - й Ка) ь і М ше. ; ль ШО он-сряг і и З я ще ЖВа
    Фіг. 280 й ж я шо й ве ; і й я . Й | а ше 7 за шо ай ші Як : ри // Я і й У Н ії т басося й Мк КУ -4 у ; ха уми и Щи о ; М Ко шк у: : й що со х і н-еряз «а а НЕ: оо і со: - че ЩЕ ь ши ух Й ! В У й І чок сонна 4 де щі н-сряз є «й УЮ що і ДО. пддддллдцадтидотахдкилима дитин отчет
    Фіг. 280
    І Фу пф Е ня СЯ до й ХХ Я Й ше р-н М ВС5-МІ є" Зно з М й ж денні ВЕ я денне КЗ ох тк А По є з, че, вів и хх щ-й ьо ІМ Внвь п а и ВН і. КК одосованвсвя ! й м СІ». У з з ша о в, в и ОН т А о я Ес ск ЖИ ИЕ ин гі с НІ? ПЕЖО ОВ У оевоох ще ЗК Ки ПИ ШИ ППИЄ Й ЛОЛИН ДОе ше ов ме Ви Шостняя НО М С З Ле хх 5 Шо 5 важкий іч то ОВ З кн сн ники НИКИ х анцює:» Б Вами пит о Ве
    За. к З ПРО М 8 Її ї ЖЕ : що пи 7 В З - песхеновині у сн З З « « « с. 29А ї а я кину сн нн "ле «Б ви ММ -56О-МЕ 0080-56 ! г в 5 ОО с і 5 мн ж 5 5 НН А 8 5 НН и Ой в М ПИШЕТЕ, Ж КУ ОО сх ооо на в НН ше Х МОЯ пн. зя ПЕК і ОО В ше В ни я о рак п Ан и Ко в чі ОМ и о. ОККО НВ вен з с й х р с о КК КВ шт га НН й ЗИ см КК ОВ ОПО у сли М нн и.
    є а. - м -- ше нн паї У важкий е вс лан юю 00000000
    Фіг. 2985 с всО-АДЕг Ба Ти ВО По емо про яка о в Бк но и о и Я її п ах ОО оо нн Я Є Бо Брошки я ще: кс а в Бо Є ОБ с» с не ВЕ са о ОН: ох й ше ; оо прин пи не Вико мен, МО ШО МА В Н Ж ВН ЕК ОК. ни ЕН НН КЕН, о вв У и. В я
    «У. Ніс й и 5 55 м й в НО а Ін о що ши ов м сон п пн, ше ши Н Со а о по ШЕ ШНННЮ Я І і а, Кол ре дннк К ЕН, важкий
    Фіг. 290 и НН Я КУ ра щ ЇЇ З З Як ЕЕ ОО в во з : «МБО и а ня В ше па я. З Бо й - пошя і Я п. Пк ЕЕ : Ха о ВВ ДВ вн ЧІ БАН а ! й х - ОО. НІХ й ке й КЕ. о: пон вв ре а КН Ма КУ а Та ОХ В НИ я и ши ВЕ. Н тре их зе Ка мода ори ОБУ ПКЕЕ ШЕ ДЕ ТИ НПВ ву кс й Би т В о НН я М аве у Я кн її ння сн во 000 важкий а. и НН І ЯН ШЮ ВВ с М вно Пе ОО ОО МНН зас ам У я. й хх Цмин
    Фіг. 290
UAA201805269A 2015-12-18 2016-12-16 Антитіла проти c5 та способи застосування UA123774C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015247069 2015-12-18
PCT/JP2016/087481 WO2017104779A1 (en) 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123774C2 true UA123774C2 (uk) 2021-06-02

Family

ID=58186002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201805269A UA123774C2 (uk) 2015-12-18 2016-12-16 Антитіла проти c5 та способи застосування

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP3390442B1 (uk)
JP (4) JP6088703B1 (uk)
KR (2) KR102467124B1 (uk)
CN (2) CN108401431B (uk)
AR (1) AR107077A1 (uk)
AU (1) AU2016372930B2 (uk)
BR (1) BR112018009067A8 (uk)
CA (1) CA3005592C (uk)
CL (1) CL2018001577A1 (uk)
CO (1) CO2018007374A2 (uk)
CR (1) CR20180364A (uk)
DK (1) DK3390442T3 (uk)
EA (1) EA036756B1 (uk)
FI (1) FI3390442T3 (uk)
HK (1) HK1251942A1 (uk)
HR (1) HRP20231456T1 (uk)
IL (1) IL259256B2 (uk)
LT (1) LT3390442T (uk)
MA (1) MA44081B1 (uk)
MX (2) MX2018007144A (uk)
MY (1) MY186948A (uk)
PE (2) PE20240365A1 (uk)
PH (1) PH12018501282A1 (uk)
PL (1) PL3390442T3 (uk)
PT (1) PT3390442T (uk)
RS (1) RS64998B1 (uk)
RU (1) RU2742606C2 (uk)
SA (1) SA518391704B1 (uk)
SG (2) SG11201610782YA (uk)
SI (1) SI3390442T1 (uk)
TW (4) TW202344514A (uk)
UA (1) UA123774C2 (uk)
WO (1) WO2017104779A1 (uk)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3056568T3 (da) 2006-03-31 2021-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåder til kontrollering af antistoffers blodfarmakokinetik
CN106519025B (zh) 2007-09-26 2021-04-23 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
KR102469853B1 (ko) 2008-04-11 2022-11-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
RU2746356C2 (ru) 2014-12-19 2021-04-12 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к с5 и способы их применения
PL3390442T3 (pl) * 2015-12-18 2024-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
US10633434B2 (en) 2016-06-14 2020-04-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibodies
MY187848A (en) * 2016-06-17 2021-10-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN116251182A (zh) 2016-08-05 2023-06-13 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
AU2018383751A1 (en) 2017-12-13 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibody combinations and uses thereof
MX2021012997A (es) * 2019-04-24 2022-03-04 Univ Pennsylvania Anticuerpos anti-c5 humanizados bifuncionales y proteínas de fusión del factor h y usos de los mismos.
MX2022001153A (es) 2019-07-31 2022-02-22 Hoffmann La Roche Regimen de dosificacion y administracion para el tratamiento o prevencion de enfermedades relacionadas con c5 mediante el uso del anticuerpo anti-c5 crovalimab.
US20220275070A1 (en) 2019-07-31 2022-09-01 Hoffmann-La Roche Inc. Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of c5-related diseases by the use of the anti-c5 antibody crovalimab
WO2022179970A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Regeneration and multiple use of depth filters

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CN100391537C (zh) 2001-08-17 2008-06-04 建南德克公司 结合至c5和c5a但不阻止c5b形成的补体途径抑制剂
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RU2399381C2 (ru) * 2003-02-28 2010-09-20 Антидженикс Инк. Использование лектинов для активации олигомеризации гликопротеидов и антигенных молекул
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
RU2445975C2 (ru) * 2006-03-02 2012-03-27 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Продление срока выживаемости аллотрансплантата путем ингибирования активности комплемента
PL2596807T3 (pl) * 2006-03-08 2016-06-30 Archemix Llc Aptamery wiążące dopełniacza i środki anty-C5 użyteczne w leczeniu zaburzeń ocznych
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP2010521194A (ja) * 2007-03-22 2010-06-24 ノバルティス アーゲー Ｃ５抗原およびその使用
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
KR102469853B1 (ko) 2008-04-11 2022-11-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EA027575B1 (ru) * 2008-08-05 2017-08-31 Новартис Аг Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающий человеческий белок с5, содержащая их композиция, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие эту кислоту вектор и клетка-хозяин и применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента
AU2011223866B2 (en) 2010-03-01 2015-05-21 Alexion Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating Degos' disease
WO2011111007A2 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Rinat Neuroscience Corporation ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
CN107827979A (zh) * 2012-03-16 2018-03-23 瑞泽恩制药公司 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物
TWI619729B (zh) * 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
WO2014028354A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
CA2899589C (en) * 2013-01-31 2022-02-22 Seoul National University R & Db Foundation C5 antibody and method for preventing and treating complement-related diseases
US20160184391A1 (en) 2013-08-16 2016-06-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of graft rejection by administering a complement inhibitor to an organ prior to transplant
US9701743B2 (en) * 2014-02-20 2017-07-11 Allergan, Inc. Complement component C5 antibodies
NZ711451A (en) * 2014-03-07 2016-05-27 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
RU2746356C2 (ru) * 2014-12-19 2021-04-12 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к с5 и способы их применения
PL3390442T3 (pl) * 2015-12-18 2024-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania

Also Published As

Publication number Publication date
IL259256A (en) 2018-07-31
DK3390442T3 (da) 2023-11-13
PL3390442T3 (pl) 2024-03-18
EP3390442A1 (en) 2018-10-24
KR102467124B1 (ko) 2022-11-15
JP7208299B2 (ja) 2023-01-18
PE20240365A1 (es) 2024-03-04
IL259256B (en) 2022-10-01
TW202344514A (zh) 2023-11-16
CN114478760A (zh) 2022-05-13
CL2018001577A1 (es) 2018-09-28
TW202140545A (zh) 2021-11-01
BR112018009067A8 (pt) 2019-02-26
KR20170107422A (ko) 2017-09-25
RU2018125624A3 (uk) 2020-03-27
CO2018007374A2 (es) 2018-07-19
JP2021121197A (ja) 2021-08-26
MA44081B1 (fr) 2023-11-30
CR20180364A (es) 2018-08-22
KR20180085678A (ko) 2018-07-27
CN108401431B (zh) 2022-01-25
JP2017112996A (ja) 2017-06-29
JP2023030197A (ja) 2023-03-07
AR107077A1 (es) 2018-03-21
EP3390442A4 (en) 2021-01-06
KR101789973B1 (ko) 2017-10-26
FI3390442T3 (fi) 2023-11-10
RU2742606C2 (ru) 2021-02-09
SI3390442T1 (sl) 2024-01-31
SG10201709415WA (en) 2017-12-28
EA201891410A1 (ru) 2019-01-31
PT3390442T (pt) 2024-01-08
MY186948A (en) 2021-08-26
JP6088703B1 (ja) 2017-03-01
MX2022014885A (es) 2023-01-04
JP6879751B2 (ja) 2021-06-02
AU2016372930B2 (en) 2020-10-08
SG11201610782YA (en) 2017-07-28
CN108401431A (zh) 2018-08-14
TW201741336A (zh) 2017-12-01
BR112018009067A2 (pt) 2018-10-30
AU2016372930A1 (en) 2018-06-21
HK1251942A1 (zh) 2019-05-03
MX2018007144A (es) 2018-11-29
LT3390442T (lt) 2023-12-11
CA3005592A1 (en) 2017-06-22
TWI747936B (zh) 2021-12-01
SA518391704B1 (ar) 2021-12-23
EA036756B1 (ru) 2020-12-16
PH12018501282A1 (en) 2019-01-28
CA3005592C (en) 2024-01-23
WO2017104779A1 (en) 2017-06-22
HRP20231456T1 (hr) 2024-03-01
IL259256B2 (en) 2023-02-01
TWI597292B (zh) 2017-09-01
EP4342529A2 (en) 2024-03-27
TWI812979B (zh) 2023-08-21
TW201726728A (zh) 2017-08-01
RU2018125624A (ru) 2020-01-20
MA44081A (fr) 2018-10-24
EP3390442B1 (en) 2023-11-08
PE20181402A1 (es) 2018-09-07
JP2017113013A (ja) 2017-06-29
RS64998B1 (sr) 2024-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123774C2 (uk) Антитіла проти c5 та способи застосування
JP6621447B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体
RU2746356C2 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
KR101852739B1 (ko) 항-c5 항체 및 사용 방법
UA127888C2 (uk) Композиція, що містить антитіло проти lag3 людини
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
CN109689690B (zh) 用于评估对于成浆细胞和浆细胞耗竭性疗法的应答的方法和材料
RU2789788C2 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
RU2787629C2 (ru) Способы и материалы для оценки ответа на терапию против плазмобластов и плазматических клеток
EA041632B1 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
UA97484C2 (uk) Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен prlr