CN111465617B

CN111465617B - 抗vista抗体及其用途

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Publication number: CN111465617B
Application number: CN201880080656.5A
Authority: CN
Inventors: 李英爱; 卞相顺; 河政旼; 安成皓; 吴槿禧; 李元燮; 朴美珠; 李恩姬; 金度玧; 柳珍山
Original assignee: Pharmabcine Inc
Current assignee: Pharmabcine Inc
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2038-10-22
Also published as: CN111465617A; AU2018351418A1; MX2020005495A; WO2019078699A2; KR20190044563A; BR112020007755A2; US11407833B2; RU2750723C1; EP3699193A2; WO2019078699A3; KR102281405B1; AU2018351418B2; CA3079652C; JP7009642B2; SG11202003585VA; JP2021500068A; EP3699193A4; CA3079652A1; US20200407449A1

Abstract

本发明涉及一种抗VISTA抗体或其抗原结合片段、一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、一种携带所述核酸的载体、一种用所述载体转化的细胞、一种用于制备所述抗体或其抗原结合片段的方法、一种包含所述抗体的用于预防或治疗自身免疫疾病的组合物、以及一种用于与PD‑1抗体或PD‑L1抗体组合并行给予的组合物。

Description

抗VISTA抗体及其用途

【技术领域】

本发明涉及一种抗VISTA抗体或其抗原结合片段、一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种用所述载体转化的细胞、一种用于制备所述抗体或其抗原结合片段的方法、一种包含所述抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗自身免疫疾病的组合物、以及一种包含所述抗体或其抗原结合片段的与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予的组合物。

【背景技术】

免疫系统是一种涉及细胞和组织对外来病原体作出应答的网络系统。对于对反复遇到的非自身抗原作出应答的免疫系统，大致分为使用抗体的B细胞应答和由细胞介导的T细胞应答。除此之外，还有可以立即对病原体做出应答的免疫系统，并且诸如巨噬细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞等细胞直接参与清除抗原。对于免疫系统，克隆选择等在个体发育初期起作用，以防免疫系统作用于自身抗原。然而，免疫系统可经常作用于自身抗原，这可导致疾病。

类风湿性关节炎是一种典型的自身免疫疾病。各类研究表明，这种免疫逃逸机制甚至在肿瘤中起作用。免疫逃逸机制可以通过抑制或促进免疫细胞的活性，抑制或增强对抗原的免疫力。这一因子涉及的物质被称为“免疫检查点”。近来，人们为了治疗肿瘤，通过干扰对这些肿瘤的免疫抑制功能或者进一步增强免疫活性所涉及的因子，已经作出了各种尝试。

2010年，自从首次将阻断免疫检查点CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)的抗体应用于恶性黑色素瘤患者并明确证明了其对约20％患者的治疗效果之后，出现了一种新的癌症治疗方法，其中通过使用靶向免疫检查点(起到负向免疫调节因子的作用)的治疗性抗体抑制所述免疫检查点的作用，从而增强抗癌免疫应答。

随后，开发出的抗PD-1或抗PD-L1抗体显示出比抗CTLA-4抗体更好的效果，特别是显著减轻了在接受CTLA-4抗体治疗的患者中出现的严重副作用，因此可以非常有效地用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌。

特别是，迄今为止，对于常规癌症治疗方法(诸如，手术、抗癌药物和放射治疗)均失败的患者，偶尔会选择抗癌免疫疗法，但是，由于开发出了副作用降低的抗PD-1/PD-L1抗体，抗癌免疫疗法被越来越多地选作主要治疗方式，并被积极地用于扩展至对常规治疗剂无应答的各种癌症(如胃癌和肝癌)的治疗范围内的临床试验。

PD-1靶向治疗剂具有激活T细胞免疫监视的机制，并且PD-L1是PD-1的配体并与肿瘤细胞中表达的PD-L1结合，以干扰T细胞的免疫抑制，从而提供抗癌活性。为了进一步使这种活性最大化，需要一种免疫抑制机制不与PD-1/PD-L1重叠的组合物。将这些物质与常规治疗剂一起使用的组合疗法被预期是改善肿瘤患者治疗功效的非常有用的工具。

VISTA(T细胞活化的含V结构域Ig抑制剂)是最近鉴定的一种免疫检查点物质，已知可以直接抑制T细胞的活性。VISTA始终在造血区室中进行表达，在髓样家族细胞中以最高水平表达，而在CD4⁺、CD8⁺T细胞和Foxp3⁺CD4⁺调节性T细胞中的表达水平相对较低。VISTA在大多数免疫细胞(包括T细胞)中表达，但已知在髓样细胞中以最高水平表达。因此，抑制VISTA的分子具有与PD-1或PD-L1不同的靶点，预期可以增强与PD-1/PD-L1治疗剂进行组合治疗时的功效。

VISTA在结构上与TIM家族相似，因为它具有细胞外免疫球蛋白V(IgV)结构域，并且发现人和小鼠VISTA氨基酸序列之间的同源性约为90％。一些实验表明，基于作为配体的抗体呈递细胞(APC)表达VISTA整个氨基酸序列、或具有VISTA的细胞外结构域(其与抗体重链的Fc部分结合)的VISTA-Fc，VISTA抑制T细胞增殖和细胞因子的表达。另外，已知VISTA特异性抗体在自身免疫脑脊髓炎模型中增加了疾病的严重程度，并且还增加了抗肿瘤免疫活性(Le Mercier I等人，2014)。

还可以使用VISTA的免疫抑制活性开发肿瘤抑制治疗剂，但是还可以通过进一步提高VISTA的免疫抑制活性，开发用于GvHD(移植物抗宿主病)和自身免疫疾病的治疗剂。例如，发现抗小鼠VISTA的抗体可抑制野生型T细胞诱导的GvHD(Files,DB等人,2011)。这表明，根据表位，抗体活性可以起到激动剂或拮抗剂的作用。因此，可以选择具有两种功能的抗体作为抗VISTA的抗体。

在此技术背景下，诸位发明人尝试开发抗VISTA抗体。结果是，诸位发明人开发了具有所需的与VISTA结合的能力的抗VISTA抗体，并且发现所述抗VISTA抗体可以用作靶向抗癌剂或自身免疫疾病治疗剂。基于此发现，完成了本发明。

【发明内容】

【技术问题】

因此，本发明的一个目的是提供一种新型抗VISTA抗体或其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

本发明的另一个目的是提供一种包含所述核酸的载体、一种用所述载体转化的细胞及其产生方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗肿瘤、癌症或自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供一种用于与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。

【技术方案】

根据本发明的一方面，上述和其他目的可以通过提供与T细胞活化V结构域Ig抑制剂(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段来实现，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含：选自SEQ ID NO:1、7、13和19的重链CDR1；

选自SEQ ID NO:2、8、14和20的重链CDR2；和

选自SEQ ID NO:3、9、15和21的重链CDR3；和

轻链可变区，其包含：选自SEQ ID NO:4、10、16和22的轻链CDR1；

选自SEQ ID NO:5、11、17至23的轻链CDR2；和

选自SEQ ID NO:6、12、18、24、和34至40的轻链CDR3。

在本发明的另一方面，提供了一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

在本发明的另一方面，提供了一种包含所述核酸的载体。

在本发明的另一方面，提供了一种用所述载体转化的细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。

在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗肿瘤、癌症或自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗肿瘤、癌症或自身免疫疾病的方法，所述方法包括：向患有肿瘤、癌症或自身免疫疾病的患者给予所述抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一方面，提供了所述抗体或其抗原结合片段在抑制VISTA的免疫抑制机制中的用途，以及所述抗体或其抗原结合片段在预防或治疗肿瘤、癌症中的用途，或所述抗体或其抗原结合片段在提高VISTA免疫抑制能力中的用途，以及所述抗体或其抗原结合片段在预防或治疗自身免疫疾病中的用途。

在本发明的另一方面，提供了一种用于与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括：向患者组合给予所述抗体或其抗原结合片段与PD-1抗体或PD-L1抗体。在本发明的另一方面，提供了所述抗体或其抗原结合片段与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予以治疗肿瘤或癌症的用途。

【有益效果】

根据本发明的抗VISTA抗体或其抗原结合片段展现出所需的与VISTA的结合能力，并且能够用于预防或治疗靶标癌症/肿瘤或自身免疫疾病。本发明实现了靶点与靶向免疫检查点的常规治疗剂的靶点不同的治疗剂的开发，从而提供了与常规治疗剂和单一疗法组合的用于肿瘤治疗的疗法，并且本发明可以增强检查点抑制免疫活性的活性，从而提供了一种新型免疫抑制疗法。

【附图说明】

图1示出了通过使单克隆scFv噬菌体与表达VISTA的CHO-K1细胞发生反应来确定表达VISTA的细胞是否与单克隆scFv噬菌体结合的结果。

图2示出了确定所选抗VISTA抗体与人和小鼠VISTA抗原之间是否存在交叉反应性的ELISA测量结果。

图3示出了确定所选抗VISTA抗体与表达人和小鼠VISTA的CHO-K1细胞的结合能力的结果。

图4示出了通过ELISA测量人外周血allo-MLR反应中产生的IFN-γ的结果。

图5示出了确定抗VISTA抗体给予组体重显著下降的结果。

图6示出了确定抗VISTA抗体给予组的肿瘤重量经历显著下降的结果。

图7示出了通过混合淋巴细胞反应(MLR)确定有效细胞增殖以评价经优化的抗VISTA抗体的功能的结果。

图8示出了通过混合淋巴细胞反应(MLR)确定细胞因子分泌上升以评价经优化的抗VISTA抗体的功能的结果。

图9示出了确定经优化的抗VISTA抗体给予组体重显著下降的结果。

图10示出了确定经优化的抗VISTA抗体给予组的肿瘤重量经历显著下降的结果。

【具体实施方式】

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义均具有与本发明所涉及领域的技术人员所理解的含义相同。通常，本文使用的命名法是本领域熟知的并且是常用的。

因此，一方面，本发明涉及与T细胞活化V结构域Ig抑制剂(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含：选自SEQ ID NO:1、7、13和19的重链CDR1；

选自SEQ ID NO:2、8、14和20的重链CDR2；和

选自SEQ ID NO:3、9、15和21的重链CDR3；和

轻链可变区，其包含：选自SEQ ID NO:4、10、16和22的轻链CDR1；

选自SEQ ID NO:5、11、17至23的轻链CDR2；和

选自SEQ ID NO:6、12、18、24、和34至40的轻链CDR3。

如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合至VISTA的抗VISTA抗体。本发明的范围不仅包括特异性结合至VISTA的完整抗体，还包括所述抗体分子的抗原结合片段。

术语“完整抗体”是指具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，其中每一轻链通过二硫键与相应重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(ε)型，并且分为以下亚类：伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)型。

所述抗体或抗体片段的抗原结合片段是指至少具有抗原结合能力的片段，并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。在这些抗体片段中，Fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定结构域(CH1)的结构，每个Fab具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，其进一步包含铰链区，所述铰链区包含重链CH1结构域C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2是由Fab'铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生Fv的重组技术披露于PCT国际公开案中，例如WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086和WO 88/09344。双链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，并且单链Fv(scFv)是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通常通过共价键经由其间的肽接头连接，或在C末端直接连接，形成像双链Fv一样的二聚体状结构。所述抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，Fab可通过用木瓜蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得，并且F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得)，并且可使用遗传重组技术来制备。

在一个实施方案中，本发明的抗体是Fv形式(例如，scFv)或完整抗体形式。另外，重链恒定区可选自伽马(γ)、缪(u)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)或伊普西隆(c)同种型。例如，恒定区可为γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。轻链恒定区可为κ或λ。

如本文所用，术语“重链”涵盖全长重链和其片段二者，所述全长重链包含：可变结构域(VH)，其含有氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。如本文所用，术语“轻链”涵盖全长轻链和其片段二者，所述全长轻链包含：可变结构域(VL)，其含有氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和恒定结构域(CL)。

本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fv(sdFV)、抗个体基因型(抗Id)抗体、此类抗体的表位结合片段等。

术语“单克隆抗体”是指相同抗体，不包含可能的天然存在的突变，其中可以少量存在从基本上同质的抗体群体获得的抗体(也就是，构成所述群体的每一抗体)。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性并因此被单一抗原位点诱导。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

术语“表位”是指抗体可特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由一组化学活性表面分子(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且一般不仅具有特定的三维结构特征，而且具有特定的电荷特征。三维表位与非三维表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的键会断裂，而与后者的键不会断裂。

“人源化”形式的非人类(例如，鼠类)抗体是嵌合抗体，含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区(供体抗体)的残基替代。

如本文所用，术语“人类抗体”是指源自人类免疫球蛋白的分子，其中包含互补决定区和结构区的构成所述抗体的所有氨基酸序列是由人类免疫球蛋白构成。

人类抗体不仅包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，还包含所述抗体的展现出所需生物活性的片段，在所述“嵌合”抗体中，重链和/或轻链部分衍生自某个物种或与属于某个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；而其余的一条或多条链衍生自另一物种或与属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。

如本文所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链区域，包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。

术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。

在本发明中，结合至VISTA的抗体或其抗原结合片段可以包含：重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:33的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:35的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:36的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:37的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:38的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:39的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ IDNO:3的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:4的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:40的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:7的重链CDR1，SEQ ID NO:8的重链CDR2和SEQ IDNO:9的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:10的轻链CDR1，SEQ ID NO:11的轻链CDR2和SEQ ID NO:12的轻链CDR3，

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:13的重链CDR1，SEQ ID NO:14的重链CDR2和SEQID NO:15的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:16的轻链CDR1，SEQ ID NO:17的轻链CDR2和SEQ ID NO:18的轻链CDR3；或者

重链可变区，其包含：SEQ ID NO:19的重链CDR1，SEQ ID NO:20的重链CDR2和SEQID NO:21的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含：SEQ ID NO:22的轻链CDR1，SEQ ID NO:23的轻链CDR2和SEQ ID NO:24的轻链CDR3。

术语“框架区”(FR)是指除了CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。

“Fv”片段是含有完整抗体识别和结合位点的抗体片段。这样的区域包含二聚体，例如scFv，所述二聚体由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，所述重链可变结构域与所述轻链可变结构域相互非常紧密地共价连接。

“Fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段通常包括一对Fab片段，所述Fab片段通过位于其之间的在其羧基端附近的铰链半胱氨酸共价连接。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。Fv多肽可进一步包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，以使scFv可形成用于抗原结合的所需结构。

VISTA抗体可以包含单链或双链。功能上，VISTA抗体的结合亲和力在10^-5M至10^-12M范围内。例如，VISTA抗体的结合亲和力为10^-6M至10^-12M、10^-7M至10^-12M、10^-8M至10^-12M、10^-9M至10^-12M、10^-5M至10^-11M、10^-6M至10^-11M、10^-7M至10^-11M、10^-8M至10^-11M、10^-9M至10^-11M、10^-10M至10^-11M、10^-5M至10^-10M、10^-6M至10^-10M、10^-7M至10^-10M、10^-8M至10^-10M、10^-9M至10^-10M、10^-5M至10^- ⁹M、10^-6M至10^-9M、10^-7M至10^-9M、10^-8M至10^-9M、10^-5M至10^-8M、10^-6M至10^-8M、10^-7M至10^-8M、10^-5M至10^-7M、10^-6M至10^-7M或10^-5M至10^-6M。

结合至VISTA的抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，所述重链可变区选自SEQ ID NO:25、27、29、31和49。另外，结合至VISTA的抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，所述重链可变区选自SEQ ID NO:26、28、30、32、41至48、和50。

在根据本发明的一个特定实施方案中，结合至VISTA的抗体或其抗原结合片段可以包含SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:26的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:41的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:42的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:43的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:44的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:45的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:46的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:47的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:48的轻链可变区；

SEQ ID NO:25的重链可变区和SEQ ID NO:50的轻链可变区；

SEQ ID NO:49的重链可变区和SEQ ID NO:48的轻链可变区；

SEQ ID NO:49的重链可变区和SEQ ID NO:50的轻链可变区；

SEQ ID NO:27的重链可变区和SEQ ID NO:28的轻链可变区；

SEQ ID NO:29的重链可变区和SEQ ID NO:30的轻链可变区；或

SEQ ID NO:31的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区。

“噬菌体展示”是用于展示突变体多肽的技术，所述突变体多肽作为与例如噬菌体(纤维状噬菌体)颗粒表面上的外壳蛋白的至少一部分的融合蛋白。噬菌体展示的有用性在于快速且有效地对大型随机化蛋白质突变体文库中以高亲和力结合至靶抗原的序列进行分类。已使用在噬菌体上展示肽和蛋白质文库来筛选数百万个多肽，以鉴定具有特异性结合性质的多肽。

噬菌体展示技术已提供用于产生和筛选结合至特异性配体(例如，抗原)的新颖蛋白质的有效工具。使用噬菌体展示技术，可生成大型蛋白质突变体文库，并且可对以高亲和力与靶抗原结合的序列进行快速分类。将编码突变多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如基因III或基因VIII蛋白)的核酸序列融合。已开发出单相噬菌体展示系统，其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白的一部分的核酸序列融合。在单相展示系统中，融合基因以低水平表达，还表达野生型基因III蛋白，并由此维持颗粒感染性。

对于抗体噬菌体展示文库的开发，重要的是证明肽在纤维状噬菌体表面上的表达以及功能性抗体片段在大肠杆菌(E.coli)的外周细胞质中的表达。通过多种方法产生抗体结合多肽或抗原结合多肽的文库，所述方法例如为通过插入随机DNA序列或克隆相关基因序列来修饰单一基因的方法。对于具有所需特征的抗体或抗原结合蛋白的表达，可以在文库中进行筛选。

对于产生具有所需特征的抗体，噬菌体展示技术相对于常规杂交瘤和重组方法具有若干优点。这种技术可在不使用动物的情况下，在短时间内生成具有多个序列的大型抗体文库。杂交瘤的产生和人源化抗体的产生可能需要数月的产生时间。另外，由于不需要免疫力，噬菌体抗体文库可生成针对具有毒性或具有低抗原性的抗原的抗体。噬菌体抗体文库还可用于产生和鉴定新颖治疗性抗体。

可使用从经免疫或未经免疫的人类、种系序列或使用噬菌体展示文库的天然B细胞Ig库生成人类抗体的技术。可以使用各种淋巴组织产生初始或非免疫原性抗原结合文库。

用于从噬菌体展示文库鉴定和分离高亲和力抗体的技术对于分离新的治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和力抗体取决于文库大小、细菌细胞中的生产效率和文库的多样性。文库的大小会因抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的不当折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。通过不当折叠抗体或抗原结合结构域，可以抑制在细菌细胞中的表达。可通过使可变/恒定界面表面上的残基或所选CDR残基交替突变来改善表达。在细菌细胞中生成抗体噬菌体文库时，框架区序列是实现适当折叠的元件。

在高亲和力抗体的分离中，重要的是生成抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的多个文库。发现CDR3区经常参与抗原结合。由于重链上的CDR3区根据大小、序列和结构/维度形态显著变化，可使用其来产生多个文库。

在根据本发明的特定实施方案中，优化抗体以增强抗VISTA抗体克隆1B8的亲和力，将随机突变导入1B8的轻链CDR3和重链CDR3中，并使用突变scFv噬菌体文库进行生物淘选。结果，获得了包含至少一种选自SEQ ID NO:33至40的轻链可变区CDR3的8种类型的优化克隆。

还可通过在每一位置使用所有20种氨基酸随机化可变重链和轻链的CDR区来产生多样性。使用所有20种氨基酸增加了所产生抗体序列的多样性，并提高了鉴定新抗体的可能。

本发明的抗体或抗体片段可以包含本文提及的抗体及其生物学等同物的序列，只要其可以特异性识别VISTA即可。例如，可对所述抗体的氨基酸序列进行额外变异，以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。此类变异包含例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，诸如其疏水性、亲水性、电荷和大小，对此类氨基酸进行变异。通过对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型进行分析，可以看出，所有精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似形状。因此，基于这些考虑，将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸视为生物学功能等效物。

在考虑具有生物学等效活性的变异时，根据本发明的抗体或其编码核苷酸分子解释为包含与序列号中所示序列具有实质同一性的序列。术语“实质同一性”意指，在将本发明的序列与任何其他序列比对以尽可能多地相互对应，并使用本领域中常用的算法分析经比对序列时，序列具有至少90％的同源性，最优选具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。用于序列对比的比对方法为本领域所熟知。NCBI基础局部比对搜索工具(BLAST)可从NCBI等获得，并且可与互联网上的序列分析程序(诸如BLASTP、BLASTM、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX)组合使用。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。使用此程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html找到。

基于此，与本文公开的序列或其整体相比，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性。这种同源性可以通过本领域已知的方法进行序列对比和/或比对来测定。例如，根据本发明的核酸或蛋白质的序列同源性百分比可以使用序列对比算法(即，BLAST或BLAST 2.0)、人工比对或目测检查来测定。

在另一方面，本发明涉及一种编码抗体或其抗原结合片段的核酸。

通过对编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸进行分离，可以以重组方式产生抗体或其抗原结合片段。将核酸分离并插入可复制载体中，接着进一步克隆(DNA扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面，本发明涉及一种包含所述核酸的载体。

术语“核酸”旨在涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA两种分子，以及核苷酸，所述核苷酸是核酸的基本构成单元，包含天然来源的核苷酸以及其中的糖或碱基部分经修饰的类似物。编码本发明的重链和轻链可变区的核酸的序列可以改变。此类变异包含核苷酸的添加、缺失、或非保守性或保守性取代。

编码所述抗体的DNA可使用常规程序(例如，使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。可获得多种载体。载体组分通常包含但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括质粒载体；粘粒载体；和病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码所述抗体的核酸与启动子可操作地连接。

术语“可操作地连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子的结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，并且使调节序列能够调节另一核酸序列的转录和/或翻译。

在使用原核细胞作为宿主时，其通常包含能实施转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。另外，例如，当将真核细胞用作宿主时，其包含源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且其通常具有作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。

任选地，所述载体可以与另一种序列融合，以便纯化由其表达的抗体。待融合序列包含例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6x His(六组氨酸；Qiagen，美国)等。

载体包含本领域中一般用作选择性标记物的抗生素抗性基因，并且其例子包含赋予对以下项的抗性的基因：氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。

在另一方面中，本发明涉及经上文所提到的载体转化的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞可为原核生物、酵母或高等真核细胞，但不限于此。

可以使用原核生物宿主细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；芽孢杆菌(Bacillus)属菌株，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)物种；假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；以及葡萄球菌属物种(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))。

对动物细胞的关注最多，并且有用宿主细胞系的例子包括但不限于：COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S和HT1080。

在另一方面，本发明涉及一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。

可以在各种培养基中培养细胞。可无限制地使用任何市售培养基作为培养基。可以适当浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必需补充物。对于本领域技术人员将清楚的是，诸如温度和pH之类的培养条件通常与被选择用于表达的宿主细胞一起使用。

对所述抗体或其抗原结合片段的回收可通过例如以下方式来实施：离心或超滤以去除杂质，且使用例如亲和色谱纯化所得产物。可以使用其他纯化技术，诸如阴离子或阳离子交换色谱、疏水作用色谱、和羟磷灰石(HA)色谱。

在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗肿瘤或癌症的组合物，所述组合物包含所述抗体作为活性成分。抗体可以是IgG或包含可变区的片段，即ScFv或Fab。另外，重链的可变区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

本发明可以提供例如一种用于预防或治疗肿瘤或癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：(a)药物有效量的根据本发明的抗VISTA的抗体或其抗原结合片段；以及(b)药学上可接受的载体。本发明还涉及一种用于预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括：向肿瘤或癌症患者给予根据本发明的抗体或其抗原结合片段。本发明可以提供所述抗体或其抗原结合片段在抑制VISTA的免疫抑制机制中的用途，以及在预防或治疗肿瘤或癌症中的用途。

肿瘤是可以应用所述组合物的疾病，其中包含对免疫疗法有反应的典型肿瘤或癌症，以及迄今为止尚未利用免疫疗法进行治疗的肿瘤或癌症。作为治疗靶标的肿瘤或癌症的非限制性例子包括：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他癌瘤。另外，根据本发明的肿瘤或癌症包含可以使用本发明的抗体治疗的难治性癌症或复发性癌症。

在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含所述抗体作为活性成分。抗体可以是IgG或包含可变区的片段，即ScFv或Fab。另外，重链的可变区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

本发明可以提供例如一种用于预防或治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含：(a)药学有效量的根据本发明的抗VISTA的抗体或其抗原结合片段；以及(b)药学上可接受的载体。本发明还涉及一种用于预防或治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括：向自身免疫疾病患者给予根据本发明的抗体或其抗原结合片段。本发明可以提供所述抗体或其抗原结合片段在改善VISTA的免疫抑制机制中的用途，以及在预防或治疗自身免疫疾病中的用途。

例如，自身免疫疾病可以例如包括：白血病；慢性疲劳综合征；移植物抗宿主病(GVHD)；痛觉过敏；炎性肠病；神经炎性疾病；缺血/再灌注损伤，包含脑缺血、外伤导致的脑损伤、癫痫、出血或可能导致神经变性的发作；糖尿病，例如1型易激性糖尿病；多发性硬化；眼睛疾病；疼痛；胰腺炎；肺纤维化；类风湿性疾病，诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年类风湿性关节炎、血清反应阳性多发性关节炎、强直性脊柱炎、赖特综合征和反应性关节炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、系统性硬皮病、血管炎、脑血管炎、舍格伦综合症、风湿热、多软骨炎和多发性肌痛、类风湿和巨细胞动脉炎；败血性休克；放射疗法引起的副作用；系统性红斑狼疮；颞下颌关节疾病；甲状腺炎等。

如本文所用，术语“预防”是指通过给予根据本发明的组合物引起抑制癌症或自身免疫疾病或延迟其进展的任何作用。术语“治疗”是指抑制、减轻或消除癌症的进展，或抑制、减轻或消除自身免疫疾病的进展。

在一些情况下，可以组合使用抗体与另一种抗癌治疗剂以有效地靶向肿瘤细胞，并且可以通过提高抗肿瘤T细胞活性，增强靶向肿瘤细胞的免疫应答。所述抗体可以和以下各项组合使用：其他抗肿瘤剂或免疫原性剂[例如，弱化癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原转移细胞(例如，经肿瘤源抗原或核酸脉冲处理的树突细胞)、免疫刺激性细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、和GM-CSF)、和经编码免疫刺激性细胞因子(包括例如但不限于GM-CSF)编码的基因转染的细胞]；标准癌症疗法(例如，化学疗法、放射疗法或手术)；或其他抗体(包含但不限于VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其他生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS)。

在另一方面，本发明涉及一种用于与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括：向肿瘤或癌症患者组合给予所述抗体或其抗原结合片段与PD-1抗体或PD-L1抗体。在本发明的另一方面，提供了所述抗体或其抗原结合片段与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予以治疗肿瘤或癌症的用途。

抗体或其抗原结合片段可以与PD-1抗体或PD-L1抗体一起同时给予，或者可以与其分开并以其间的时间间隔分开给予。PD-1抗体或PD-L1抗体的分开给予可以在抗体或其抗原结合片段的给予之前或之后进行。

由于所述组合物使用根据本发明的抗VISTA抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此省略了它们之间的共同描述。

所述药物组合物中含有的药学上可接受的载体可以包括制剂中常用的药学上可接受的载体，并且可包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除了上述成分之外，根据本发明的组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

根据本发明的药物组合物可以进行口服给予或肠胃外给予。肠胃外给予可以是静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺部给予、直肠给予等。

口服给予后，蛋白质或肽被消化，因此应使用活性药物包覆或配制口服组合物，以避免所述蛋白质或肽在胃中被降解。另外，可以使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置给予所述药物组合物。

根据本发明的药物组合物的适合剂量可以根据以下因素发生变化，诸如配制方法、给予方法、以及患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给予时间、给予途径、排泄率和反应性，并且具有普通技术的全科医生可以容易确定并开出对所需治疗或预防有效的剂量。例如，根据本发明的药物组合物的日剂量可以在0.001至100mg/kg的范围内。术语“药物有效量”可以指足以预防或治疗癌症或自身免疫疾病的量。

根据本发明所属领域的技术人员可易于实施的方法，可以将根据本发明的药物组合物制备成单位剂型，或者可以通过使用了药学上可接受的载体和/或赋形剂的配制，并入多剂量容器中。在这种情况下，配制品可以是在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液的形式，或者可以是提取物、粉末、颗粒剂、片剂或胶囊的形式。组合物可以进一步包含分散剂或稳定剂。

实施例

在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1.结合VISTA的抗体的筛选

在韩国专利特开第10-2008-0109417号中，披露了用于抗体文库的人类天然ScFv(scFv)文库，用于筛选与VISTA结合的抗体并制备文库。将100μl抗原(hVISTA-Fc，R&Dsystems目录号7126-B7)以2μl/ml铺板于96孔免疫板上，然后在4℃下孵育过夜。第二天，用PBS将抗原包被的板洗涤三次，然后在室温下与200μl 2％BSA封闭缓冲液反应2小时。将50μl XL1-Blue储备液添加到2ml 2x YT-TET(四环素，10μg/ml)生长培养基中，并在37℃下以200rpm孵育2小时；并进一步添加13ml的所述储备液，然后孵育直至OD₆₀₀达到0.5。封闭2小时后，用1XPBS将孔洗涤3次。将噬菌体文库组与每个洗涤后的孔合并，然后将噬菌体文库和4％BSA等量混合，之后向其中添加200μl混合物，接着在室温下摇动30分钟，并使反应进行2小时。噬菌体文库反应完成后，弃去上清液，用0.05％PBST将残余物洗涤5次，用PBS洗涤5次，向每个孔中添加100μl 100mM TEA(三甲胺)，并在室温下振荡所得混合物10分钟。10分钟后，向每个孔中添加50μl 1M Tris(pH 7.5)，然后混合。将上清液添加到OD₆₀₀为0.5的10ml XL1-blue中，以在37℃下进行感染30分钟。感染完成后，使用100μl作为输出滴度，并将残余物以7,000rpm离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物涂布在一块大的方形板(CM 34μg/ml+1％葡萄糖)上，并在30℃下孵育过夜。将剩下的作为输出滴度的100μl稀释至1/10、1/100和1/1000，涂布在CM板上，并在37℃下孵育过夜。第二天，向方形板上生长的菌落中添加50ml 2x YT培养基后使用环刮擦所述菌落，并以7,000rpm离心10分钟；弃去上清液，并使用沉淀物制备初级淘选储备液。将100ml 2x YT培养基(生长培养基：CM 34μg/ml+1％葡萄糖)放入500ml锥形瓶中，向其中添加细胞以将OD₆₀₀调节至0.2，并在200rpm和37℃下使细胞生长，以将OD₆₀₀调节为0.5。培养细胞直至OD₆₀₀达到0.5后，添加为细胞20倍量的辅助噬菌体(M13KO7突变体)。在37℃下使用辅助噬菌体感染30分钟后，以7,000rpm的速度离心10分钟。弃去上清液，在200rpm和30℃下，将细胞在100ml新鲜的2xYT培养基(CM 34μg/ml+Kan.70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl₂))中孵育过夜。第二天，将生长的细胞以7,000rpm离心10分钟，并以与上述相同的方式再次离心。在上清液的1/5(v/v)20％PEG/2.5m NaCl的存在下，使收集的上清液在冰上沉淀1小时。沉淀后，以7,000rpm离心1小时。弃去上清液，用3ml PBS释放沉淀物，通过0.45μm过滤器进行过滤，将其保存在4℃下，然后用于下一步淘选过程。重复此过程3至4次，并通过ELISA鉴定出与抗原结合的抗体。

实施例2.单克隆ScFv噬菌体ELISA

淘选过程完成后，稀释最终的圆形细胞储备液，以形成200-500个菌落，涂布在CM琼脂平板上，然后在37℃下孵育过夜。第二天，在菌落生长时，将200μl 2xYT培养基(CM 34μg/ml+1％葡萄糖)铺板到96孔深板上，将菌落逐个插入到每个孔中，然后使板在37℃和3,000rpm下孵育过夜。第二天，将200μl 2xYT培养基(CM 34μg/ml+1％葡萄糖)铺板到新的96孔深板中，并将前一天生长的20ml细胞注入每个孔中，并在37℃和3,000rpm下生长1小时10分钟。将剩余细胞在-70℃下保存在100μl 50％甘油中。在细胞生长时，将1μl辅助噬菌体与19μl 2xYT培养基混合，并将20μl所得混合物注入到每个孔中，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，以3,000rpm离心10分钟。弃去上清液，并向残余物中添加200μl 2xYT培养基(CM 34μg/ml+Kan.70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl₂)，然后在MegaGrow中在30℃和3,000rpm下孵育过夜。

将1μg/ml Ag(hVISTA-Fc，mVISTA-Fc)以100μl/孔铺板到96孔免疫板上，然后在4℃下孵育过夜。第二天，将前一天生长的细胞以3,000rpm离心10分钟，并保存在4℃下。用0.05％PBST将铺板的Ag洗涤3次，然后向其中添加200μl 2％BSA封闭缓冲液，接着在25℃下孵育2小时。封闭完成后，用0.05％PBST将所得物洗涤3次。将50μl 4％BSA与50μl在4℃下调温度下保存的噬菌体混合，并在振荡下，使二者之间的反应在室温下进行1小时。噬菌体结合完成后，用0.05％PBST将反应产物洗涤三次；向其中添加100μl HRP缀合的小鼠抗M13抗体(1:3000，#GE 27-9421-01)，然后使反应在25℃下进行1小时。反应完成后，用0.05％PBST将所得产物洗涤3次，向其中添加100μl TMB(#BD TMB底物试剂组555214)，显色3至5分钟，向其中添加50μl终止溶液，然后使用ELISA读取仪进行测定。

[表1]淘选过程后选择结合VISTA抗原的单克隆scFv噬菌体的ELISA测量结果

所选抗体在下表2中示出。

[表2]

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[表3]

实施例3.抗VISTA ScFV噬菌体与表达VISTA的CHO-K1细胞的结合

产生表达人类VISTA和小鼠VISTA的CHO-K1细胞，以确定所筛选的抗体是否结合表达VISTA的细胞。以4×10⁶个细胞/ml的密度，将50μl产生的细胞在FACS缓冲液(2％FBS，0.05％叠氮化钠于PBS中)中铺板到96孔深板中，向其中添加50μl经历噬菌体孵育的噬菌体上清液，并在室温下孵育1小时。孵育后，将400μl FACS缓冲液添加到每个孔中，接着以2,000rpm离心5分钟。弃去上清液，并向残余物中添加100μl抗M13抗体(1:1000)，接着在4℃下反应1小时。反应完成后，向每个孔添加400μl FACS缓冲液，然后以2,000rpm离心5分钟。弃去上清液，向其中添加100μl抗小鼠IgG-PE抗体(1:500)，接着在4℃下反应1小时。反应完成后，向每个孔添加400μl FACS缓冲液，然后以2,000rpm离心5分钟。弃去上清液，向其中添加200μl FACS缓冲液，接着使用FACS(Beckton Dickinson，FACSCalibur)进行测定。结果在图1中示出。

从图1中可以看出，所选的抗体全部与产生用于过表达人类VISTA的CHO-K1细胞结合。正如预期，用作阴性对照组的6A6不与其结合，并且用作阳性对照组的VISTA抗体(R&Dsystems#FAB71261A)与细胞良好结合。

实施例4.抗VISTA IgG表达

使用分子生物学技术将筛选的scFv噬菌体转化为IgG形式。从筛选的大肠杆菌(E.Coli)克隆中提取噬菌粒，使用限制酶Sfi I(R0123，New England Biolabs，美国)对噬菌粒进行双酶切，以获得重链可变区DNA片段，并且使用Sfi I处理包含重链恒定区的pIgGHD-6A6Hvy载体，然后插入可变区DNA片段。以与上述相同的方式，使用限制酶BstX I(R0113，New England Biolabs)对噬菌粒进行双酶切，以获得轻链可变区DNA片段，使用BstX I对包含轻链恒定区的pIgGLD-6A6Lgt载体进行双酶切，并插入可变区DNA片段以完成到IgG形式的DNA克隆。

使用Expi293F表达系统试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)进行IgG的瞬时表达。使用专用培养基，在37℃和5％CO₂下，在125rpm的轨道振荡器上对试剂盒中包含的Expi293细胞进行悬浮培养。每3天，将细胞传代培养至3×10⁵个细胞/ml，并且在导入表达载体时，在使用前将细胞数调节至3×10⁶个细胞/ml。使用ExpiFectamine作为专用试剂进行基因导入，并制备每1ml细胞悬浮液含有1μg表达载体DNA和2.7μl ExpiFectamine的脂质-DNA复合物，并添加到细胞悬浮液中。导入后16-18个小时，添加一半(1/2)增强子以诱导表达。然后，在与上述相同的条件下培养细胞3-4天，并离心以获得含有IgG的上清液。

实施例5.抗PD-L1抗体的纯化

将获得的上清液注入到蛋白质A柱(GE Healthcare)中，并通过亲和色谱纯化IgG。使用20mM Tris-HCl、50mM NaCl和5mM EDTA(pH7.0)平衡柱，注入上清液，用50mM Tris-HCl、500mM NaCl、5mM EDTA和0.2％聚山梨酯20(pH 7.0)溶液进行洗涤，用50mM NaCl、0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.5)进行洗脱，并用1M Tris进行中和。使用MWCO 10,000spectra/por透析膜(Spectrum Labs，美国)对洗脱的蛋白质进行透析，以用PBS置换溶剂。然后，使用Vivaspin(Sartorius，德国)将蛋白质浓缩至所需浓度，进行分装，并保存在-80℃下。

纯化后，使用非还原性和还原性LDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific)对每个抗体进行处理，并使用NuPAGE系统(Thermo Fisher Scientific)进行电泳处理。结果，获得了总分子量约为150kDa(含有50kDa重链和25kDa轻链)的IgG。

实施例6.抗VISTA抗体与抗原的结合能力

使用Octet(ForteBio)测量所筛选的抗体与抗原的结合能力。为此，将抗体固定到生物传感器上，将各种浓度的抗原添加到96孔板中，然后测量结合能力。

[表4]各种浓度的抗VISTA抗体与VISTA抗原的结合能力的测定结果(用于测量其间的结合能力)

实施例7.抗VISTA抗体对人类和小鼠VISTA的交叉反应性

ELISA测定：将1μg/ml Ag(人类VISTA-Fc或小鼠VISTA-Fc)以100μl/孔铺板到96孔板上，并在4℃下孵育过夜。第二天，用0.05％PBST将铺板的Ag洗涤3次，并向其中添加200μl2％BSA封闭缓冲液，接着在25℃下孵育2小时。封闭完成后，用0.05％PBST将所得产物洗涤3次。以100μl/孔注入1μg/ml每种抗体，并在25℃下孵育1小时。孵育完成后，用0.05％PBST将所得产物洗涤3次，并向其中添加100μl羊抗人IgG(κ)缀合的过氧化物酶(1:2000，BethylLab#A80-115P)，接着在25℃下孵育30分钟。孵育后，用0.05％PBST将所得产物洗涤3次，添加100μl TMB(BD TMB底物试剂组#555214)，显色3至5分钟，向其中添加50μl终止溶液，然后使用ELISA读取仪进行测定。结果在图2中示出。

如图2所示，所有筛选的抗体均与人类VISTA结合，特别是2C12抗体与小鼠VISTA以及人类VISTA均良好结合。

FACS测定：为了鉴定人类和小鼠VISTA在CHO-K1细胞中的过表达，制备在FACS缓冲液(2％FBS，0.05％叠氮化钠于PBS中)中浓度为5×10⁶/ml的细胞溶液(5×10⁵个细胞/100μl/FACS管)，制备2μg/ml的筛选抗体，并将100μl细胞溶液和100μl抗体放入FACS管中，然后在4℃下孵育30分钟。孵育完成后，向每个管中添加2ml FACS缓冲液，接着以1,500rpm离心5分钟。弃去上清液，将100μl羊抗人IgG-Fc缀合的PE(A80-248PE，1:500)添加到每个管中，并使反应在4℃下进行20分钟。在阳性对照组的情况下，将5μl APC缀合的抗hVISTA(R&D#71261A)添加到过表达hVISTA的细胞中(与样品量相同)；在小鼠的情况下，将1μl APC缀合的抗mVISTA(BioLegend#143710)添加到过表达mVISTA的细胞中(与样品量相同)，接着在4℃下反应20分钟。反应完成时，向每个孔中添加2ml FACS缓冲液，接着以1,500rpm离心5分钟。弃去上清液，并向其中添加200μl FACS缓冲液，接着使用BD FACSCalibur进行测定。结果在图3中示出。

如图3所示，在用筛选的抗VISTA对制备为过表达VISTA的CHO-K1细胞进行处理时，像ELISA中所示，所有筛选的抗体均与在其表面表达人类VISTA的CHO-K1结合，并且2C12抗体还与在其表面表达小鼠VISTA的CHO-K1结合。

实施例8.抗VISTA抗体的Allo-MLR测定

从供体收集50ml人外周血，用含有2mM EDTA的PBS稀释3倍。将15ml Ficoll-Paque(GE#17-1440-03)注入到新的50ml管中，并缓慢加载30ml稀释的血液，接着以2,000rpm离心40分钟。回收PBMC层，转移至50ml管中，并通过以1600rpm离心10分钟，用洗涤缓冲液(RPMI1640培养基，其含有2％FBS和10mM HEPES)洗涤。离心后，弃去上清液，重复洗涤。将离心后留下的细胞沉淀用50ml洗涤缓冲液释放为单个细胞中，然后使用细胞粗滤器(40um)去除死细胞团。用MLR培养基(RPMI1640培养基，其含有10％FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸、NEAA(100X)、2mM L-谷氨酰胺、1％抗生素、10^-5Mβ-ME)将有待用作Allo-MLR应答物的细胞(供体A或B)稀释至4×10⁶个细胞/ml的浓度。用丝裂霉素C(MMC)处理有待用作刺激物的细胞(供体B或A)，以抑制细胞增殖。将如下详细描述所述方法。在50ml管中，以4×10⁶个细胞/ml的浓度在MLR培养基中稀释有待用作刺激物的细胞，并添加MMC以达到25μg/ml的总体积，接着在37℃下反应30分。反应完成后，用洗涤缓冲液将50ml管完全充满，并以1200rpm离心10分钟，接着进行洗涤。将此过程进行4次，以完全去除MMC。最后，在MLR培养基中将残余物稀释至4×10⁶个细胞/ml的浓度。将制备的细胞以2×10⁵个细胞/孔(50μl)等分到96孔细胞培养板上。添加50μl待分析的抗体，实现30μg/ml和10μg/ml的最终浓度。对于每种浓度，使用3个孔进行测试。在CO₂培养箱中在37℃下孵育5天后，单独保存50μl细胞培养上清液，以测量IFN-γ产生，并将其余细胞用于细胞增殖分析。通过测量allo-MLR后剩余细胞中产生的ATP的量，对细胞增殖进行分析。所述方法详细描述如下。向培养的细胞中添加100μl(相当于细胞培养溶液)CellTiter-发光细胞活力测定(Promega)溶液，并在室温下反应10分钟，以诱导细胞裂解。使用发光计测量细胞活力。结果在图4中示出。

如图4所示，竞争物(阳性对照组)和1B8克隆诱导的干扰素-γ表达比与用非特异性抗体(全IgG)处理的组的表达更高，并且所有其他克隆诱导的干扰素-γ表达均低于全IgG情况下的表达。换言之，这些克隆是抑制了干扰素-γ表达的克隆。其中，2C12、1A12和3C5展现出优异的干扰素-γ表达抑制能力。

实施例9.抗VISTA抗体的抗肿瘤活性

使用NSG小鼠(包含移植有人源乳腺癌细胞系MDA-MB-231乳腺脂肪的垫)，测定人类PBMC和JNJ61610588、帕姆单抗和抗VISTA mAb 1B8治疗剂尾静脉给予的抗癌功效，以评价抗VISTA抗体的抗肿瘤活性。所述实验是与韩国生物科学与生物技术研究所实验动物资源中心组合进行的。

将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231解冻，并在CO₂培养箱(Forma，美国)中在37℃的温度和5％CO₂的浓度下进行培养。在培养的最后一天，收集所有癌细胞并进行计数，并使用无血清培养基将细胞浓度调节至3×10⁷个细胞/ml。将由此调节的细胞培养溶液以0.1ml(3×10⁶个细胞/小鼠)的量注射到小鼠乳腺脂肪垫的左右侧区域的每一个之中。

移植癌细胞后，当每组平均肿瘤大小达到46.9mm³时，将A型(每组1号小鼠)、B型(每组2号小鼠)、C型(每组3号小鼠)、D型(每组4号小鼠)、E型(每组5号小鼠)和F型(每组6号小鼠)的PBMC(4×10⁷个细胞/ml)通过尾静脉给予注射0.16ml(0.64×10⁷个细胞/小鼠)。

对于PBMC分离，从供体中收集50ml人外周血，并用含有2mM EDTA的PBS稀释3倍。将15ml Ficoll-Paque(GE#17-1440-03)注入新的50ml管中，并缓慢向其中加载30ml稀释的血液，接着以2,000rpm离心40分钟。回收PBMC层并转移至50ml管中，并通过以1600rpm离心10分钟，用洗涤缓冲液(RPMI1640培养基，其含有2％FBS和10mM HEPES)洗涤细胞。离心后，弃去上清液并洗涤四次。将离心后留下的细胞沉淀用50ml洗涤缓冲液释放到单个细胞中，然后在PBS培养基中稀释至2×10⁷个细胞/mL的浓度。

为了组织小鼠组并向小鼠组中给予药物，在注射PBMC后，开始给予药物。以5mg/kg通过尾静脉向每个组给予，其中，第1组：PBMC+人类全IgG(对照)；第2组：PBMC+竞争物(JNJ61610588)；第3组：PBMC+派姆单抗；第4组：PBMC+抗VISTA mAb(1B8)；以及第5组：PBMC+派姆单抗+抗VISTA mAb(1B8)。

注射PBMC后，对每只小鼠首先以0.2ml给予药物，每周两次，共7次。

在给予开始时以及实验期间紧接在每次给予之前，观察所有动物的一般临床症状以及体重和肿瘤大小的变化。

从每个癌细胞移植组的平均肿瘤大小达到46.9mm³开始，直到之后的第25天，使用游标卡尺在三个方向上测量12个受试者每个的左侧和右侧的肿瘤，然后使用公式“长×宽×高/2”表示肿瘤大小的变化。

在给予药物开始后第25天，每组选择3只健康小鼠，从其眼眶静脉采血(EDTA管)，用CO₂气体处死小鼠，取出脾，将其固定在PBS中，并将肿瘤分为左右两部分。使用化学天平对肿瘤称重，然后成像并固定在液氮和福尔马林中。

结果是，给予组均未在测试期间展现出特定的一般症状，但是溶剂对照组(PBMC+PBS)2号小鼠和PBMC+抗VISTA mAb 1B8给予组5小鼠显示分别从第17天和第21天到最后一天发生体重减轻(与其初始重量相比)(表5和图5)。

[表5]小鼠每日重量变化(％)

在开始给予药物后的第25天，切除MDA-MB-231肿瘤并称重。结果是，与溶剂对照组(PBMC+人类全IgG)相比，PBMC+JNJ61610588(5mg/kg)、PBMC+派姆单抗(5mg/kg)、PBMC+抗VISTA mAb 1B8(5mg/kg)、和PBMC+派姆单抗+抗VISTA mAb(5+5mg/kg)给予组的肿瘤重量分别减少了18.9％(p<0.05)、32.9％(p<0.001)、37.8％(p<0.001)、和60.6％(p<0.001)(表6，图6)，具有统计学意义。

[表6]最后一天肿瘤大小和重量的变化

有效数字(t检验)：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(相比于PBMC+PBS)

Vt(肿瘤体积的测量值)，Vo(初始肿瘤体积)

抑制率(相比于PBMC+PBS)

实施例10.增强亲和力的变体的产生和筛选

进行抗体优化，以增强抗VISTA抗体克隆1B8的亲和力。使用软随机化方法产生将随机突变导入至1B8的轻链CDR3和重链CDR3中的引物，所述方法保留80％的1B8原始DNA序列并对其进行随机化处理。通过使用引物的PCR，获得导入了突变的对1B8的轻链可变区和ME4的重链可变区编码的DNA片段。用DNA片段对1B8 scFv噬菌体噬菌粒的轻链可变区和重链可变区中的每一个进行替代，以分别产生1B8轻链CDR3变体scFv噬菌体文库和重链CDR3变体scFv噬菌体DNA文库。

使用酚-氯仿纯化变体scFv噬菌体DNA文库，然后使用电穿孔将其转化到大肠杆菌(E.coli)菌株XL-1Blue中。通过转化效率分析和DNA序列分析鉴定多样性的获取情况，通过以500ml的规模进行培养来诱导噬菌体表达，并使用PEG沉淀方法产生1B8轻链CDR3变体scFv噬菌体文库。

使用每个变体scFv噬菌体文库，以与实施例1相同的方式进行生物淘选。然后，在筛选过程中，测量scFv的解离速率常数(kdis)作为用于评价结合保留能力的定量指标。结果显示，7个筛选的经优化的克隆保留了1B8的重链可变区。示出了7个筛选的经优化的克隆的解离速率常数(表7)和氨基酸序列(表8和表9)的测量结果。

七个经优化的抗VISTA抗体的解离速率常数的测量结果显示，通过用Y(Tyr)取代最佳抗VISTA.H2的CDR3部分的N(Aps)，获得了PMC-309.3.3序列。使用IMGT软件(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)对PMC-309.3.3序列和人种系碱基序列的进行比较和分析，结果表明，重链可变区衍生自IGHV1-69*06。与种系组的IGHV1-69*06的氨基酸序列的比较结果表明，框架区(FR)的4个氨基酸残基被取代。为了在保持抗原结合能力的同时提高折叠效率，产生了通过取代FR部分而提高效率的PMC 309.3.4。PMC 309.3.4的具体序列如表10所示。

[表7]

[表8]

[表9]

[表10]

实施例11.经优化抗VISTA抗体的理化特性分析

将每个经优化的scFv噬菌体克隆转化为IgG形式。使用与实施例4和5中所述方法相同的方法，进行特异性DNA克隆、生产和纯化方法，以进行形式转化。

使用Octet评价经优化的抗VISTA抗体的结合强度，同时从中排除低产率的克隆，并以与实施例6中所述方法相同的方式进行实验(表11)。从表11可以看出，通过优化，显著提高了与人类VISTA的结合力。

[表11]

实施例12.经优化抗VISTA抗体的Allo-MLR测定

为了评价经优化抗体的功能，以与实施例8相同的方式进行混合淋巴细胞反应(MLR)，以在体外测量外周血中所含免疫细胞的反应性。由此证实，实现了对细胞增殖和细胞因子(IFN-γ)产生的诱导。

结果在图7和图8中示出。从图7和图8可以看出，PMC-309.3.3药物非常优于对照组，并且浓度依赖性细胞增殖和细胞因子分泌增加。

实施例13.经优化抗VISTA抗体的抗肿瘤活性

为了评价抗VISTA抗体的抗肿瘤活性，使用NSG小鼠(包含移植有人乳腺癌细胞系MDA-MB-231乳腺脂肪的垫)，以与实施例7相同的方式，对轻链可变区(包含人类PBMC和JNJ61610588、PMC-309.3.3和抗VISTA 3.4)发生改变的经尾静脉给予的药物(PMC-309.3.4W，PMC-309.3.4SA)的抗癌功效进行评价。

从表12、表13和图9和图10中可以看出，结果表明PMC-309.3.3显示出最佳抗癌活性，这与混合淋巴反应的结果相对应。

[表12]

[表13]

有效数字(t检验)：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(相比于PBMC+全IgG)

Vt(肿瘤体积的测量值)，Vo(初始肿瘤体积)

抑制率(相比于PBMC+全IgG)

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求和其等同物限定。

【序列表文本文件】

附有电子文件。

序列表

<110> 药物抗体公司

<120> 抗VISTA抗体及其用途

<130> PP-B2107

<150> KR 17/136632

<151> 2017-10-20

<160> 50

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的重链CDR1

<400> 1

Gly Gly Ser Ser Ser Asn Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的重链CDR2

<400> 2

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的重链CDR3

<400> 3

Ala Lys Gly Ala Ile Glu Pro Trp Pro Phe Tyr Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的轻链CDR1

<400> 4

Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的轻链CDR2

<400> 5

Asp Val Asn

1

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的轻链CDR3

<400> 6

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的重链CDR1

<400> 7

Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的重链CDR2

<400> 8

Ile Asn Pro Tyr Asp Gly Arg Thr

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的重链CDR3

<400> 9

Ala Lys Gln Met Gly Ile Trp Asp Tyr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的轻链CDR1

<400> 10

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的轻链CDR2

<400> 11

Gly Asn Ser

1

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的轻链CDR3

<400> 12

Val Ala Trp Asp Asp Ser Leu Lys Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的重链CDR1

<400> 13

Gly Phe Ser Phe His Asp Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的重链CDR2

<400> 14

Ile Ser Trp Asp Gly Thr Ile Thr

1 5

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的重链CDR3

<400> 15

Ala Lys Glu Asp Arg Tyr Asp Tyr Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的轻链CDR1

<400> 16

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的轻链CDR2

<400> 17

Asp Val Asn

1

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的轻链CDR3

<400> 18

Ser Ser Phe Ala Gly Ser Asn Thr Leu Arg Val

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的重链CDR1

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的重链CDR2

<400> 20

Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的重链CDR3

<400> 21

Ala Lys Asp Ile Ala Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Asp Ala Phe Asp

1 5 10 15

Leu

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的轻链CDR1

<400> 22

Lys Leu Gly Asn Lys Tyr

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的轻链CDR2

<400> 23

Gln Asp Asn

1

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的轻链CDR3

<400> 24

Gln Thr Trp Asp Arg Ser Thr Gly Val

1 5

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的VH

<400> 25

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Ser Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gly Ser Met Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ala Ile Glu Pro Trp Pro Phe Tyr Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B8的VL

<400> 26

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 27

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的VH

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asp Gly Arg Thr Ser Phe Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gln Met Gly Ile Trp Asp Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C12的VL

<400> 28

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Lys Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 29

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的VH

<400> 29

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Ser Phe His Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Tyr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Thr Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Asp Arg Tyr Asp Tyr Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1A12的VL

<400> 30

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Leu Asn Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Ala Gly Ser

85 90 95

Asn Thr Leu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 31

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Ala Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C5的VL

<400> 32

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Thr

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Ser Thr Gly Val

85 90 95

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 33

Ala Ala Trp Asp Asp Asp Leu Asn Gly Leu Val

1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 34

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly His Val

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 35

Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Leu Val

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 36

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Gly Leu Val

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 37

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Asp Leu Val

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 38

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Val Leu Val

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 39

Ala Ala Trp Asp Asp Asn Ser Asp Phe His Val

1 5 10

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 40

Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Tyr Gly Leu Val

1 5 10

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 41

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asp

85 90 95

Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 42

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ile Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 43

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 43

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn

85 90 95

Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 44

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 44

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 45

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 45

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Asn Asp Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 46

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 46

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Asn Val Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 47

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 47

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn

85 90 95

Ser Asp Phe His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 48

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 48

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn

85 90 95

Leu Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 49

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Ser Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ala Ile Glu Pro Trp Pro Phe Tyr Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 50

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Lys Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn

85 90 95

Leu Tyr Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.一种与T细胞活化V结构域Ig抑制剂（VISTA）结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 1的重链CDR1、SEQ IDNO: 2的重链CDR2和SEQ ID NO: 3的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 4的轻链CDR1、SEQ ID NO: 5的轻链CDR2和SEQ ID NO: 6的轻链CDR3，或

重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 1的重链CDR1、SEQ IDNO: 2的重链CDR2和SEQ ID NO: 3的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 4的轻链CDR1、SEQ ID NO: 5的轻链CDR2和SEQ ID NO: 40的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO: 25的重链可变区。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO: 26或48的轻链可变区。

4.一种编码根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。

5.一种表达载体，其包含根据权利要求4所述的核酸。

6.一种用根据权利要求5所述的表达载体转化的细胞。

7.一种产生与VISTA结合的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：

(a) 培养根据权利要求6所述的细胞；以及

(b) 从所培养的细胞中回收抗体或其抗原结合片段。

8.一种组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途。

10.一种用于与PD-1抗体或PD-L1抗体组合给予的组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。