JP2022510253A - 抗－４－１ｂｂ抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片およびその用途が提供される。【選択図】図６

Description

本発明は、抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片およびその用途に関する。

４－１ＢＢは、ＴＮＦ－受容体スーパーファミリー（ＴＮＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ＴＮＦＲＳＦ）のうちの１つであり、先天性および適応性免疫細胞全ての免疫細胞の活性化により発現する共刺激分子である。４－１ＢＢは、多様な免疫細胞の活性化を調節するのに重要な役割を果たす。４－１ＢＢアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）は、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌およびＣＤ８ Ｔ細胞溶解活性を促進させる。他の多くの研究は、４－１ＢＢの活性化はマウス腫瘍を除去するために免疫反応を増進させることを示す。したがって、４－１ＢＢは癌免疫学で有望な標的分子であることを意味する。抗腫瘍効果にもかかわらず、抗－４－１ＢＢ抗体は臨床適用で深刻な肝毒性を誘発した。

本発明の一実施形態は、哺乳動物の免疫反応および／または腫瘍（癌）治療を促進させる抗－４－１ＢＢ抗体または抗原－結合断片を提供する。前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片は腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）のみで局所化および／または活性化しおよび／または免疫反応促進および／または腫瘍治療を促進させる効果を維持しながら、既存の抗－４－１ＢＢ抗体に比べて肝毒性をかなり減少させることを特徴とする。

本発明の他の実施形態は、以下を含む抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片を提供する：
配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）－Ｈ１；
配列番号４、５または６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
配列番号７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；
配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；

本発明の一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片は以下を含むことができる；
Ｈ－ＦＲ１に配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ２に配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ３に配列番号４２、４３、４４または４５のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ４に配列番号４６のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ１に配列番号４７、４８または４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ２に配列番号５０または５１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ３に配列番号５２または５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
Ｌ－ＦＲ４に配列番号５４または５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。

本発明の他の実施形態は、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４、５または６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２および配列番号７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；および配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片を提供する。

本発明の他の実施形態は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、３９、５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列を含むか、必須で含む重鎖可変領域；および配列番号２４、２５、２６、６１または６２のアミノ酸配列を含むか、必須で含む軽鎖可変領域を含む抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片を提供する。
本発明の他の実施形態は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１または３２のアミノ酸配列を含むか、必須で含む重鎖；および配列番号３３、３４または３５のアミノ酸配列を含むか、必須で含む軽鎖を含む抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片を提供する。

本発明の一実施形態において、上記記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原－結合断片は、４－１ＢＢ以外の生物活性物質をターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する少なくとも１つのポリペプチドをさらに含むことができる。

本発明の他の実施形態は、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を提供する。前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）をさらに含むことができる。前記薬学的組成物は、免疫反応を増進させおよび／または癌を治療および／または予防するために用いられる。前記強化免疫反応は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ細胞活性化、またはその両方とも含む。

本発明の他の実施形態は、薬学的有効量の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片または前記薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、これを必要とする対象の癌を治療および／または予防する方法を提供する。前記方法は、投与段階前に癌を治療および／または予防する必要がある対象を確認する追加段階であり得る。

本発明の他の実施形態は、薬学的有効量の前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片または前記薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、これを必要とする対象の免疫反応を増進させる方法を提供する。前記方法は、投与段階前に免疫反応を増進させる必要がある対象を確認する追加段階であり得る。前記免疫反応を増進させる方法は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ細胞活性化、またはその両方とも含む。

本発明の他の実施形態は、癌を治療および／または予防するための抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片または薬学的組成物の用途を提供する。他の実施形態は、癌治療および／または予防において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の用途を提供する。

本発明の他の実施形態は、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片または免疫反応を促進させる薬学的組成物の用途を提供する。本発明の他の実施形態は、免疫反応を促進させるための薬学的組成物の製造において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の用途を提供する。前記免疫反応促進は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ－細胞活性化、またはその両方とも含む。

本発明の一実施形態は、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明の一実施形態は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のうちの少なくとも１つの重鎖可変領域または上述した抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードする第１ポリヌクレオチドを提供する。本発明の他の実施形態は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のうちの少なくとも１つの軽鎖可変領域または上述した抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドを提供する。

本発明の一実施形態は、前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む組換えベクターを提供する。本発明の他の実施形態は、前記組換えベクターで形質感染した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）組換え細胞を提供する。

本発明の他の実施形態は、細胞で前記第１ヌクレオチドおよび第２ヌクレオチドを発現する段階を含む、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供する。前記ポリヌクレオチドを発現する段階は、前記ポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、組換えベクターで）を前記ポリヌクレオチドが発現できる条件下で培養して行うことができる。前記方法は、前記発現または培養段階後に、前記細胞培養物から抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を分離および／または精製する段階をさらに含むことができる。

本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単一鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ）Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ）Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片および抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ、ａｎｔｉ－Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されたＬＩＧＨＴ抗体に対する抗－Ｉｄ抗体を含む）。前記開示された内容の免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（例えば、ヒト免疫グロブリン）または抗体分子は開示された任意の類型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹなど）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子の下位クラスであり得る。

本明細書で使用される用語「抗体」は、生化学的に区別可能な多様なポリペプチドの広範囲なクラスを含むことができる。当業者は重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、そのうちの一部の下位クラス（例えば、γｌ－γ４）があり、軽鎖がカッパまたはラムダ（Κ、λ）に分類されることは理解できる。それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥなどの抗体の「クラス」を決めるのはこの鎖の特性である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などの免疫グロブリンの下位クラス（アイソタイプ、ｉｓｏｔｙｐｅ）はよく特性化され、機能的専門化を付与することが知られている。

本明細書の抗体および抗原結合断片は、多クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）または単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）；単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多重特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）；および／またはヒト、ヒト化、動物（例えば、マウス、ウサギなど）またはキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含むことができ、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用される用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、診断、予後または治療が要求される任意の対象、特に哺乳類を指すことができる。前記哺乳類はヒト、家畜、農場動物、愛玩動物、スポーツ動物、および動物園動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、乳牛（ｃｏｗ）など）を含むことができる。

一側面において、抗体またはその断片は化学的または組換えで合成される（自然発生しない）。

それぞれの抗体がヒト４－１ＢＢなどの４－１ＢＢに結合できることを考慮する時、本明細書に開示された前記ＣＤＲ配列またはＶ_Ｌ（重鎖可変領域）およびＶ_Ｌ（軽鎖可変領域）配列は、他の抗－４－１ＢＢ結合分子を作るために「混合およびマッチング」される。

定義
本明細書において、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）」は、単一または二重鎖のヌクレオチドポリマーを含む。このようなポリヌクレオチドを含む前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）またはデオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、またはこれらの変形した形態であってもよい。

本明細書において、特に断らなければ、前記ポリヌクレオチドの左側末端は５’末端であり、右側末端は３’末端を意味する。

本明細書において、「分離された核酸分子（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ゲノム起源のＤＮＡまたはＲＮＡまたはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこれらの組み合わせを意味し、これは、その全部または一部が自然に存在するか、または自然から発見されないポリヌクレオチドと関連しない前記ポリヌクレオチドに連結されている。本発明の目的上、特定の核酸配列を含む前記核酸分子は完全な染色体を含まない。代わりに、特定の核酸配列を含む前記分離された核酸分子は、その特定の配列に付加して、少なくとも数個の付加的なタンパク質コード配列を含むか、または特定の核酸配列の発現のための調節配列および／またはベクターをさらに含むことができる。

本明細書において、「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、作動可能に連結されてコード配列の発現および処理に影響を与え得るポリヌクレオチド配列を意味する。調節配列の特徴は宿主の種類によって影響を受けられる。例えば、原核細胞に作用できる調節配列はプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、場合によって、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、リボソーム結合部位および転写終結配列を含むことができる。真核細胞において、前記調節配列は多重認識部位、転写エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列および転写終結配列を含むプロモート（ｐｒｏｍｏｔｅ）を含むことができる。前記調節配列は、リーダー（ｒｅａｄｅｒ）配列および／または融合パートナー配列をさらに含むことができる。

本明細書において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞に伝達するのに使用される、例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）またはウイルスを含む。

本明細書において、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）または組換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞の形質転換に好適なベクターを意味し、発現ベクターに作動可能に連結されてターゲットタンパク質をコードする異種配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の発現を調節する核酸配列を含む。この発現ベクターはまた、コード配列に作動可能に連結され、転写、翻訳およびイントロンが存在する場合、ＲＮＡスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）または影響を及ぼす配列を含むことができる。

本明細書において、「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙまたはｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）」は、連結される核酸配列が適切な条件でターゲティング機能を行うことができるように位置することを意味する。例えば、コード配列および調節配列を含むベクターで適切な条件下でコード配列の転写が調節配列により影響を受ける場合、作動可能に連結される。

本明細書において、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、ターゲット核酸配列により形質転換されるか、または形質転換される標的遺伝子を発現させる細胞を意味する。前記用語は、宿主細胞のアイデンティティーと形態および遺伝的構成に関係なくターゲット遺伝子を発現する限り、宿主細胞の子孫を含む。

本明細書において、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、通常、バクテリオファージによってある細菌から他の細菌への核酸の移動を意味する。例えば、複製できないレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を用いて核酸から真核細胞へ移動することを含む。

本明細書において、「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、細胞が外来または外因性ＤＮＡを得ることを意味し、この場合、ＤＮＡは細胞膜を通して細胞内に導入される。これは当業界で公知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２），Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓを参照することができる。

本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、細胞が新たなＤＮＡまたはＲＮＡを含むように変形された細胞の遺伝的特性の変化を意味する。例えば、形質導入、形質感染またはその他の技術により新しい遺伝物質を導入して細胞の遺伝的特性が変わることにより細胞が変形される。形質導入または形質感染などの方法で形質転換されたＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に統合されて存在することがあり、複製せず一時的にエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）形態として存在するか、または複製可能なプラスミドとして存在することがある。形質転換されたＤＮＡが宿主細胞の分裂で複製されると安定に形質転換されたものとみなされる。

本明細書において、「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」は、当業界で理解される通常の意味を含む。２０個の自然生成のアミノ酸および該略語は当業界で通常使用されるものと同様である（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．１９９１）。前記アミノ酸は、典型的なアミノ酸、典型的な２０個のアミノ酸の立体異性体（Ｄ－アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα－、α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、およびその他非典型アミノ酸を含む。非典型アミノ酸の例としては、４－ヒドロキシプロリン（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、γ－カルボキシグルタメート（ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ）、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ）、ε－Ｎ－アセチルリシン（ａｃｅｔｙｌｌｙｓｉｎｅ）、Ｏ－ホスホセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）、Ｎ－アセチルセリン（ａｃｅｔｙｌｓｅｒｉｎｅ）、Ｎ－ホルミルメチオニン（ｆｏｒｍｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、３－メチルヒスチジン（ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、５－ヒドロキシリシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、σ－Ｎ－メチルアルギニン（ｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ）、およびその他類似したアミノ酸とイミノ酸（ｉｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記（ｍａｒｋ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）において、当業界で通常使用されるように、配列の左側はアミノ末端であり、配列の右側はカルボキシ末端を示す。

本明細書において、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）または「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、アミノ酸残基の重合体を意味し、本明細書において相互交換的に使用される。これはまた、自然発生するアミノ酸残基の重合体のみならず、これらの類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）または模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）の重合体も含む。また、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、リン酸化またはグリコシル化のための炭水化物の追加などの変形を含むことができる。さらに、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えまたは自然的に発見される細胞から生成される。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、野生型配列または前記アミノ酸配列の一部が欠失、添加および／または置換されたものを含む。また、ポリペプチドまたはタンパク質は抗体、例えば、抗－４－１ＢＢ抗体（または４－１ＢＢ抗体と称する）、４－１ＢＢ結合タンパク質、または抗原結合断片、または配列で１つ以上のアミノ酸が欠失、付加および／または置換される。さらに、「ポリペプチド断片（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、全長タンパク質と比較してアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失を有するポリペプチドを意味する。この断片はまた、全長タンパク質と比較して変形したアミノ酸を含むことができる。一実施形態において、前記断片は、約５～５００個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。本発明の目的を考慮すれば、有用なポリペプチド断片は、抗原－結合ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を含む抗体の免疫学的機能性断片を含む。４－１ＢＢ結合抗体の場合、このような有用な断片は１個、２個または３個の重鎖または軽鎖を含むＣＤＲ配列、または重鎖または軽鎖の可変領域または不変領域を含む抗体鎖の全部または一部を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書において、「分離されたポリペプチド、抗体またはタンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、通常これらと共に発見される他のタンパク質が存在せず、自然的にこれらと結合している脂質、炭水化物およびポリヌクレオチドの少なくとも約５０％以上が除去されることを意味する。通常、前記分離されたタンパク質、ポリペプチドまたは抗体は、特定の組成物において約５％以上、約１０％以上、約２５％以上または約５０％以上を含む。このポリペプチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または合成起源の他のＲＮＡまたはこれらの任意の組み合わせによってコードされる。特に、前記分離されたタンパク質、ポリペプチドまたは抗体は治療、診断および予防研究またはその他の用途への適用を妨げる他のタンパク質または他のポリペプチドの汚染物質が実質的に存在しない。

本明細書において、前記抗体および／またはその抗原結合断片は「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」を含むことができ、前記変異体は、前記ポリペプチド配列から１つ以上のアミノ酸残基が挿入、欠失、付加および／または置換されたポリペプチドを称することができるので、前記抗体および／または抗原結合断片の所望の生物学的活性および／または構造を維持する限り、他のポリペプチドに連結して融合ポリペプチドを含むことができる。さらに、前記変異体は、タンパク質酵素切断、リン酸化および／または他の翻訳後変形によって変形したものの、本明細書に開示された前記抗体および／または抗原結合断片の生物学的活性、例えば４－１ＢＢに対する結合および特異性を維持する変形を含む。前記変異体は、本明細書に開示された抗体またはその抗原結合断片の配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有し得、例えば、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。前記パーセント同一性（％）または相同性は、以下の説明を参照して計算することができる。

本発明の一実施形態において、パーセント相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、１００×［（同じ位置）／分（ｍｉｎ；ＴＧＡ、ＴＧＢ）］で計算することができ、上記式中のＴＧＡおよびＴＧＢは、比較される配列ＡとＢの残基数の合計および内部ギャップの位置である（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２４４：３３２－３５０（１９９４）。

本明細書において、前記保存的アミノ酸の置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）とは、ポリペプチドの活性または抗原性に実質的に影響を与えない置換を意味する。前記ポリペプチドは、１つ以上の保存的置換を含む。非制限的な例は下記表３に示す。

本明細書において、ポリペプチドの「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）との接合により１つ以上の残基から化学的に変形したポリペプチドを意味する。

本明細書において、抗体または抗原結合断片によって認識される４－１ＢＢ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ－Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＲＴＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ、受容体型チロシンキナーゼ）ファミリーの膜貫通タンパク質を称する。一実施形態では、これは特に細胞外ドメインを認識する。前記抗体が認識する４－１ＢＢは、細胞膜に存在するか、または細胞膜に存在しない状態の細胞外ドメインである。４－１ＢＢのヒトタンパク質は９３７個のアミノ酸で構成され、アミノ酸配列はＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ_００５００３．２、核酸配列はＮＭ_００５０１２．３である。本発明に使用される文脈から明らかでない限り、前記４－１ＢＢはヒトｈ４－１ＢＢを称するが、抗体はマウス４－１ＢＢに特異的に結合能を有する。前記マウス４－１ＢＢアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ７５４８０．１で示される。

本明細書において、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチドを配列し比較して決定される２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチドの配列の類似性を意味する。このような配列間の同一性は通常「同一性パーセント」で表示され、これは、比較する分子間の同一のアミノ酸またはヌクレオチドの比率を意味し、比較する分子のうち最も小さい分子の大きさを基準として計算される。

前記同一性パーセントの計算に際して、比較される配列は、配列間の最大マッチングを提供する方式で整列され、整列された配列にはギャップ、マッチングおよびミス－マッチが存在し、これは特定の数学的モデルまたはコンピュータアルゴリズムで処理される。一実施形態において、この同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、比較される配列間のマッチを最大化し、ギャップ数は最小化する方式で２つの配列を整列するＧＡＰプログラムを含むＧＣＧプログラムパッケージを用いて決定可能である。前記コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、２つの配列間のマッチを最大化し、比較される２個のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間隔数を最小化する方式で２つの配列を整列して「マッチング区間（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｓｐａｎ）」を決定する。前記アルゴリズムはまた、ギャップ開放ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）を用い［これは３×平均対角線で計算されるが、ここで、「平均対角線（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、使用される比較マトリクス（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）の対角線平均である；そして、「対角線（ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、特定の比較マトリクスによるそれぞれの完全なアミノ酸のマッチに割り当てられたスコアまたは数字である］、ギャップ拡張ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）（通常、ギャップ開放ペナルティの１／１０倍である）、および、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２とともに比較マトリクスを使用する。特定の実施形態において、標準比較マトリクス（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）（ＰＡＭ２５０比較マトリクスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２参照；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９ ｆｏｒ ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ参照）が使用される。一実施形態において、ＧＡＰプログラムが使用されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）は以下の通りである：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａ）；ギャップペナルティ：１２（ｎｏ ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｇａｐ）；ギャップ長さペナルティ：４；類似性閾値：０である。
特定のパラメータを用いて２つの配列を整列する場合、２つの配列間に有意な関連性がないにもかかわらず、短い配列領域で高い同一性でマッチングされる結果が導かれる。この場合、２つの配列が最小５０個の連続的アミノ酸にわたって整列されるように、ＧＡＰプログラムに使用されるアルゴリズムのパラメータを修正することができる。
本明細書で使用される「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」は、ターゲット分子が優勢な種として存在することである。すなわち、モルを基準にして、濃度が同一の混合物の他の個別の種よりさらに高いことを意味する。一実施形態において、実質的に純粋な分子は、組成物に含まれているすべての重合体中で約５０％以上（モル基準）、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９９％以上で構成される。他の実施形態において、前記ターゲット分子は、通常の方法を用いて汚染物がそれ以上検出されないまで実質的に均質に精製され、したがって、組成物は１種類の均質な重合体物質を含む。

一態様において、本発明は、４－１ＢＢタンパク質またはその抗原結合断片に特異的に結合する組換え抗体を提供する。このような側面において、「組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、組換え技術を用いて、すなわち、本発明において説明する組換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための方法および技術は当該技術分野で公知である。

ここで「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」は、抗体またはその抗原結合断片と抗原との間の相互作用の強度を意味し、抗原の大きさ、形状および／または電荷などの抗原の特性および抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列によって決定される。前記親和性を決定する方法は当該技術分野で公知であり、下記を参照する。

前記抗体またはその抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が１０^－６Ｍ以下の時、抗原などのターゲットに「特異的に結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）する」と言われる。抗体は、ＫＤが１×１０^－８Ｍ以下の場合、「高親和性（ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」でターゲットに特異的に結合する。

ここで「抗原結合領域または部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｒ ｓｉｔｅ）」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用して抗原に対する特異性および親和性のある抗体を提供するアミノ酸残基を含む抗体の一部であり、この抗原結合領域は、通常１つ以上の「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）」を含む。特定の抗原結合領域はまた、１つ以上の「フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、ＦＲ）」領域を含む。前記フレームワーク領域は、このようなＣＤＲの適切な形態を維持するのに役立てて、抗原結合領域および抗原間の結合を容易にする。

本明細書において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、完全な免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の任意のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）またはターゲット抗原に結合するために完全な抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えば、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、完全なヒトおよび二重特異性抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。前記抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種である。完全な抗体は、通常少なくとも２個の全長重鎖および２個の全長軽鎖を含むが、一部の場合にはラクダ科動物で自然的に発見される抗体は重鎖のみを含む。前記抗体またはその抗原結合断片は、単に単一源またはキメラに由来する。前記キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下により詳しく説明する。前記抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生成される。別途に言及しない限り、本明細書に使用される抗体は、２個の全長重鎖および２個の全長軽鎖を含む抗体およびその誘導体、変異体、断片および突然変異体を含み、これらの例は後述する。

本明細書において、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原またはエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）およびその断片に対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長軽鎖を含む。前記全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む。前記軽鎖可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。前記軽鎖の種類にはカッパ（ｋａｐｐａ）およびラムダ（ｌａｍｂｄａ）鎖が含まれる。

本明細書において、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原またはエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）およびその断片に対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖を含む。前記全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。前記ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシル末端に存在し、ＣＨ３はカルボキシル末端に最も近く位置する。前記重鎖はＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）およびＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。

本明細書で使用される抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、全長鎖と比較して一部のアミノ酸が不足するものの、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含む。この断片はターゲット抗原に特異的に結合できるか、または特定のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合するために他の抗体または抗原結合断片と競争できるという側面から、生物学的活性を有するとみなされる。一態様において、この断片は、全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含み、一部の実施形態において、単鎖重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。この生物学的活性断片は組換えＤＮＡ技術によって生成され、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的に切断して生成される。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ－Ｆｃ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＡｂおよびｄＡｂを含むが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類またはウサギを含む任意の哺乳動物に由来する。本発明において１つ以上のＣＤＲなどの抗体の機能的な部分は共有結合によって第２のタンパク質または低分子化合物と連結され、これにより、特定のターゲットに対するターゲット治療剤として使用できる。

本明細書において、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２個の重鎖断片を含む。この２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ）およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合する。

本明細書において、「Ｆａｂ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、可変領域およびＣＨ１のみを含む１個の軽鎖と１個の重鎖とで構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。ｓｃＦａｂは、Ｆａｂの２分子が柔軟なリンカーによって連結されたものである。

本明細書において、「Ｆａｂ’断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、Ｆａｂ断片以外に重鎖のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の領域を含み、Ｆ（ａｂ’）２分子を生成するＦａｂ’断片の２分子の２個の重鎖間にジスルフィド結合を形成することができる。

本明細書において、「Ｆ（ａｂ’）２’’断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、２個の軽鎖および上述のような可変領域、ＣＨ１およびＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の不変領域の一部を含む２個の重鎖を含み、これにより、２個の鎖間ジスルフィド結合を含む。したがって、前記Ｆ（ａｂ’）２断片は２個のＦａｂ’断片で構成され、２個のＦａｂ’断片はこれらのジスルフィド結合によって互いに結合している。

本明細書において、「Ｆｖ領域（ｒｅｇｉｏｎ）」は、重鎖および軽鎖それぞれの可変領域を含むが、不変領域を含まない抗体の断片である。ｓｄＦＶは、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によって連結されたものである。ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｖａｒｉａｂｌｅｒｅ ｇｉｏｎｓ、Ｆｖ）が柔軟なリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されたものである。ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ｓｃＦＶにＦｃが連結されたものである。ミニボディは、ｓｃＦＶにＣＨ３が連結されたものである。ダイアボディは、２分子のｓｃＦＶを含む。

本明細書において、「単鎖抗体（ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｃＡｂ）」は、柔軟なリンカーによって重鎖および軽鎖可変領域が連結された重鎖または軽鎖不変領域の１つの可変領域を含む単一ポリペプチド鎖である。前記単鎖抗体は、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができ、これは参照によって本明細書に開示されている。

本明細書において、「ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｄＡｂ）」は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態において、２価ドメイン抗体を形成するために２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによって共有結合で連結される。このような２価ドメイン抗体の２個のＶＨ領域は同一または異なる抗原をターゲットとすることができる。

本明細書において、「２価抗原結合タンパク質（ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「２価抗体（ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、２個の抗原結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同じ抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異性抗体である。

本明細書において、「多重特異的抗原結合タンパク質（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「多重特異的抗体（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、２以上の抗原またはエピトープをターゲットとする。

本明細書において、「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二重特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種で、公知の多様な方法、例えばハイブリドーマ融合またはＦａｂ’断片の連結などの方法によって生成される。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３などを参照する。前記二重特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは同一または異なるタンパク質ターゲットに位置する。

本明細書において、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」または「免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」は、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な抗原結合断片）が結合でき、動物で抗原に結合できる抗体の生成に使用できる分子または分子の一部を意味する。抗原は、異なる抗体またはその断片と相互作用できる１以上のエピトープを含むことができる。一実施形態において、抗原は４－１ＢＢタンパク質の細胞外ドメインである。

本明細書において、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗原結合タンパク質または抗体によって結合するか、またはこれによって認識される分子の一部であり、例えば、抗体またはＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは連続的または非連続的であってもよく、例えば、ポリペプチド配列では互いに連続的ではないが、立体構造エピトープのような分子側面においては１つの抗原結合タンパク質によって結合したアミノ酸残基であってもよいが、互いに離れていてもよい。一実施形態において、前記エピトープは、抗体生成に使用される

エピトープと類似の３次元的構造を含むが、エピトープで発見される残基を含まないか、または一部の残基のみを含み得るという側面から、模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）であってもよい。通常、前記エピトープはタンパク質であるが、核酸などの他の種類の物質であってもよい。前記エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖（ｓｕｇａｒ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）、ホスホリル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）基またはスルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ）基などの分子によって表面に形成された化学的活性化基であるか、または特定の３次元的構造特徴および／または特定の電荷特徴を有する。通常、特定のターゲット抗原に特異的抗体は、タンパク質および／または高分子（ｐｏｌｙｍｅｒ）複合体内に存在するターゲット抗原のエピトープを認識する。

本明細書において、「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は、ターゲット治療効果のために対象体に投与される分子を意味する。前記対象体は、ヒトではない哺乳類、例えば霊長類またはヒトを含む。治療剤の例としてはペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体または低分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）化合物を含む。他の側面において、前記治療剤は抗体または抗体と結合して、癌などの関連疾病の治療剤として使用可能である。

本明細書に使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、負傷、疾患または疾患の症状、任意の客観的または主観的なパラメータを含む病的状態の緩和または治療を意味し、負傷、疾患または病的な状態や症状の減少、軽減、緩和、または患者が負傷、疾患または疾患の症状または病的な状態に良く耐えられるようになること、負傷、疾患または疾患の症状または病的な状態の悪化を遅らせること、または患者の精神的または肉体的な生活の質を向上させることを含むことができる。このような負傷、疾患、または疾患の症状または病的な状態の治療または改善は、身体検査の結果、疾患と関連する各種の指標検査および映像学的検査に基づいて判断することができる。

本明細書において、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ（ｄｏｓｅ））」は疾患、特に、４－１ＢＢと関連する疾患による症状の深刻性および／または発生頻度の減少、疾患、特に４－１ＢＢと関連する疾患による症状および／または疾患発生の根本的な原因の除去、または疾患、特に４－１ＢＢと関連する疾患による症状および／または根本的な原因発生の予防および／または疾患、特に４－１ＢＢと関連する疾患による損傷を改善または矯正するのに十分な量を意味する。一実施形態において、前記有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。前記「治療的または薬学的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」は、疾患、特に４－１ＢＢと関連する症状または状態を治療、予防、遅延またはその進行を逆転させるほどの十分な量である。「予防的有効量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」は、疾患、特に４－１ＢＢと関連する疾患または症状、特に４－１ＢＢと関連する疾患の症状の発生または再発を予防または遅延させ、これを減少させるための量である。完全な治療的または予防的効果は、単回投与よりは反復投与によって生じる。したがって、治療的または予防的有効量は、１回以上の投与によって伝達することが可能である。

４－１ＢＢ
ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９（ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ９）ともいわれる４－１ＢＢは、ＴＮＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＴＮＦＲＳＦ）のｍｅｍｂｅｒであり、先天免疫と後天免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化後に発現する共刺激分子である。４－１ＢＢは、多様な免疫細胞の活動を調節するのに重要な役割を果たす。本明細書において使用されるように、４－１ＢＢは哺乳動物、例えばホモサピエンス（ヒト）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２）に由来する。

例えば、前記ヒト４－１ＢＢタンパク質（ＮＰ_００１５５２．２）は下記のようにアミノ酸配列（配列番号６７）で示される：
１ ｍｇｎｓｃｙｎｉｖａ ｔｌｌｌｖｌｎｆｅｒ ｔｒｓｌｑｄｐｃｓｎ ｃｐａｇｔｆｃｄｎｎ ｒｎｑｉｃｓｐｃｐｐ ｎｓｆｓｓａｇｇｑｒ
６１ ｔｃｄｉｃｒｑｃｋｇ ｖｆｒｔｒｋｅｃｓｓ ｔｓｎａｅｃｄｃｔｐ ｇｆｈｃｌｇａｇｃｓ ｍｃｅｑｄｃｋｑｇｑ ｅｌｔｋｋｇｃｋｄｃ
１２１ ｃｆｇｔｆｎｄｑｋｒ ｇｉｃｒｐｗｔｎｃｓ ｌｄｇｋｓｖｌｖｎｇ ｔｋｅｒｄｖｖｃｇｐ ｓｐａｄｌｓｐｇａｓ ｓｖｔｐｐａｐａｒｅ
１８１ ｐｇｈｓｐｑｉｉｓｆ ｆｌａｌｔｓｔａｌｌ ｆｌｌｆｆｌｔｌｒｆ ｓｖｖｋｒｇｒｋｋｌ ｌｙｉｆｋｑｐｆｍｒ ｐｖｑｔｔｑｅｅｄｇ
２４１ ｃｓｃｒｆｐｅｅｅｅ ｇｇｃｅｌ
本明細書に記載の通り、前記用語「４－１ＢＢ」は、変異体、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）およびパラログ（ｐａｒａｌｏｇ）を含む。例えば、ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、特定の場合、非ヒト種４－１ＢＢタンパク質と交差反応することができる。他の実施形態において、ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して完全に特異的であり、種または他の類型の交差反応を示すことができるか、またはすべての種ではない特定の他種４－１ＢＢと交差反応することができる（例えば：サル４－１ＢＢと交差反応するが、マウス４－１ＢＢは除外）。前記用語「ヒト４－１ＢＢ（ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ）」は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２を有するヒト４－１ＢＢの完全なアミノ酸配列のようなヒト配列４－１ＢＢを意味する。前記用語「マウス４－１ＢＢ（ｍｏｕｓｅ ４－１ＢＢ）」は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ ０３３４３０．１を有するマウス４－１ＢＢの完全なアミノ酸配列のようなマウス配列４－１ＢＢを意味する。４－１ＢＢはまた、例えばＣＤ１３７として当業界で知られている。本発明のヒト４－１ＢＢ配列は、例えば、保存された突然変異または非保存領域の突然変異を有することで、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２のヒト４－１ＢＢと異なり、本発明の４－１ＢＢは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２の前記ヒト４－１ＢＢと実質的に同一の生物学的機能を有する。

抗－４－１ＢＢ抗体
実施例により立証されるように、本明細書に開示された前記抗－４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢ結合能力、細胞表面で発現する４－１ＢＢに対する結合能力および高い４－１ＢＢ結合親和性を示す。また、実験実施例により立証されるように、本明細書に開示された抗４－１ＢＢは、例えば、本明細書に開示された抗－ＰＤ－Ｌ１抗体と結合される時、Ｔ細胞を活性化することができる。さらに、実施例により立証されるように、本明細書に開示された抗－４－１ＢＢ抗体は生体内抗腫瘍効果を増加させる。

このような抗－４－１ＢＢ抗体は、多様な種類の癌などの多様な種類の治療のために有用であり、診断および予後のためにも使用することができる。

本発明は、４－１ＢＢタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を開示している。本発明に係る抗体は、開示されているように、１以上の相補的決定領域または部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｒ ｓｉｔｅｓ、ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。

一実施形態において、ＣＤＲは「フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）」領域に含まれ、前記フレームワークはＣＤＲが適切な抗原結合特性を有するようにＣＤＲを指向する。

前記抗体は、ヒトおよびマウス由来４－１ＢＢ細胞外ドメインに特異的に結合し、分離された形態の細胞外ドメインまたは細胞表面に発現した４－１ＢＢの細胞外ドメインに特異的に結合することができる。

本明細書に開示された前記抗体は４－１ＢＢ、特に、ヒト４－１ＢＢおよびマウス４－１ＢＢに結合する。本明細書に開示された前記抗体は、ヒトまたはマウス由来の細胞表面に発現した４－１ＢＢ細胞外ドメインまたは細胞表面に発現した４－１ＢＢに特異的に結合でき、４－１ＢＢをターゲットとする癌のターゲット治療に有用に用いられる。例えば、抗体および抗ガン剤と結合して特定癌の治療に用いられる。また、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｔｏｘはマウス４－１ＢＢに結合するため、マウス実験により確認することができ、マウス４－１ＢＢを過剰発現するマウス癌細胞株を用いた同一遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）モデルを通して生体内効果を確認することができ、４－１ＢＢと関連する多様な薬物開発に有用に使用することができる。

一実施形態において、前記抗体は単クローン抗体、二重特異的抗体、二重抗体、多重特異的抗体、多重抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または同一遺伝子抗体）、キメラ抗体、または抗体融合体（または抗体接合体）およびその断片を含むが、これらに限定されず、本明細書に開示された多様な形態の抗体を含む。

一実施形態において、本明細書に開示された前記抗体の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ－Ｆｃ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＡｂまたはｄＡｂであり得る。

他の実施形態において、本明細書に開示された抗体は、表２ａおよび表２ｂに示す可変領域を含む軽鎖または重鎖のみのポリペプチドで構成される。

本明細書に開示された１つの抗体は、本明細書に開示された他の抗体と特定領域または配列を共有する。一実施形態において、これは抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態において、これはＦｃ領域を共有することができる。他の実施形態において、可変領域のフレームを共有することができる。

一実施形態において、前記抗体は、自然で発見される抗体の典型的な構造を有する。ラクダ科動物は単一重鎖からなる抗体を生成するが、この抗体の構造単位は、通常４量体ポリペプチドを含み、前記４量体は、互いに異なる２個のポリペプチド鎖からなる一対のポリペプチド鎖本体中の２個を含む。典型的な抗体において、前記一対のポリペプチド鎖本体は、１つの全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および１つの全長重鎖（約５０～７０ｋＤａ）を含む。各鎖は、特徴的な折り畳みパターンを示し、約９０～１１０個のアミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインで構成される。このようなドメインは、抗体ポリペプチドで構成される基本単位である。各鎖のアミノ末端部分は、通常抗原を認識する部位である可変領域またはＶ領域と称する部分を含む。カルボキシ末端部分は、アミノ末端より進化的により多く保存され、不変領域またはＣ領域と称する部分を含む。前記ヒト軽鎖は、通常カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類され、これらはそれぞれ１つの可変領域および１つの不変領域を含む。前記重鎖は通常、ミュー（ｍｕ、μ）、デルタ（ｄｅｌｔａ、δ）、ガンマ（ｇａｍｍａ、γ）、アルファ（ａｌｐｈａ、α）またはイプシロン（ｅｐｓｉｌｏｎ、ε）鎖に分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）で定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、数多くのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭおよびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４個の重鎖および４個の軽鎖を含み；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２個の重鎖および２個の軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは５個の重鎖および５個の軽鎖を含む。前記重鎖不変領域は、通常エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能を示すが、１つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数は、アイソタイプに応じて異なる。例えば、ＩｇＧ重鎖は、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で公知の３つのＣ領域ドメインを含む。本発明に係る抗体は、これらアイソタイプおよびサブタイプのうちのいずれか１つである。一実施形態において、前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプである。さらに他の一実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１－またはＩｇＧ２－型である。さらに他の一実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１－型である。

前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト不変領域の少なくとも一部に連結される。不変領域の選択は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／または補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）依存性細胞毒性が部分的に必要があるかどうかによって決定される。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体依存性細胞毒性を持ち、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はこのような細胞毒性を持たない。また、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりさらに強い細胞媒介エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能を誘導する。前記軽鎖不変領域はラムダまたはカッパである。

一実施形態において、前記抗体はヒト化またはヒト抗体であり、前記重鎖不変領域は、ＩｇＧ１－、ＩｇＧ２－、ＩｇＧ３－またはＩｇＧ４－型である。他の実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１－またはＩｇＧ２－型である。

他の実施形態において、前記抗体はヒト化またはヒト抗体であり、マウス４－１ＢＢを特異的に認識する。

全長軽鎖および重鎖において、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、前記重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。典型的に、抗体の重鎖／軽鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。

免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に全体的な構造が同一であり、「相補的決定部位または領域またはドメイン（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｒ ｄｏｍａｉｎ）」またはＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、相補的決定領域）と称される３個の超可変領域によって連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）を含む。前記重鎖／軽鎖対からなる各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって配列され、ターゲットタンパク質（４－１ＢＢ）の特定のエピトープに特異的に結合する構造を形成する。自然的に発生する軽鎖および重鎖領域のこのような因子は、通常以下の順にＮ－末端からＣ－末端で構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域でこれらそれぞれに相当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））またはａ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＯＰＡＬ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｈｙｅ Ｙｏｕｎｇ Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，２００９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２７：２２５）によって決定される。それぞれの定義によって決定された前記ＣＤＲは互いに比較するとき、重なるか、または１つが他の１つを含むサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）であってもよい。しかし、本明細書において、各方法によって定義されるすべてのＣＤＲは本発明の範囲に含まれる。当業者であれば、抗体の可変領域の配列が提供される場合、これらのうち、それぞれの定義により容易にＣＤＲ配列を選択することができる。

一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片はヒト４－１ＢＢタンパク質に特異性を有する。前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１、２および３で構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｉｉ）配列番号４、５および６で構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｉｉｉ）配列番号７、８、９、１０および１１で構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｉｖ）配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；（ｖｉ）配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３。

特定の一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片は、以下を含むことができる：（ａ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号７のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；または
（ｅ）配列番号３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１７のＶＬ ＣＤＲ３。

非制限的な一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片は以下を含むことができる；
Ｈ－ＦＲ１に配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ２に配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ３に配列番号４２、４３、４４または４５のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｈ－ＦＲ４に配列番号４６のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ１に配列番号４７、４８または４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ２に配列番号５０または５１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
Ｌ－ＦＲ３に配列番号５２または５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
Ｌ－ＦＲ４に配列番号５４または５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
非制限的な一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片は以下を含む：
（１）配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、３９、５７、５８、５９および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、必須で含む重鎖可変領域、または前記開示されたアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド；および／または
（２）配列番号２４、２５、２６、６１および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、必須で含む軽鎖可変領域、または前記開示されたアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド。

非制限的な一実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体は以下を含む：
（１）配列番号２７、２８、２９、３０、３１および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、必須で含む重鎖、または前記開示されたアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド；および／または
（２）配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、必須で含む軽鎖、または前記開示されたアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド。
本明細書に開示された前記抗体は、前記抗体の特定機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、前記抗体は、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合し、特定の他種、例えばサル４－１ＢＢ、例えばカニクイ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ザル、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）に結合できるが、異なる特定種例えば、マウス４－１ＢＢには実質的に結合しない。好ましくは、本明細書に開示された抗体はヒト４－１ＢＢに対して高い親和性で結合する。

４－１ＢＢに対する本明細書に開示された抗体またはその抗原結合断片の結合は、当業界でよく確立された１つ以上の技術を使用して評価される。例えば、好ましい一実施形態において、抗体はヒト４－１ＢＢを発現する細胞株、例えば、ヒト４－１ＢＢ、またはサル４－１ＢＢ、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）４－１ＢＢまたはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）４－１ＢＢまたはマウス４－１ＢＢなどの４－１ＢＢを各細胞表面に発現するように形質感染したＣＨＯ細胞と反応するフローサイトメトリーアッセイ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）によって試験される。フローサイトメトリーアッセイに使用するのに適した他の細胞には天然４－１ＢＢを発現する抗－ＣＤ３－刺激ＣＤ４^＋活性化Ｔ細胞が含まれる。また、他の適した結合分析は、例えば組換え４－１ＢＢタンパク質を使用するＥＬＩＳＡ分析を含む。追加的に、または代案として、結合キネティクス（ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（例えば、ＫＤ値）を含む抗体の結合はオクテット（Ｏｃｔｅｔ）分析でテストすることができる。本明細書に開示された抗体の好ましい結合親和性は１×１０^－６Ｍ以下、１×１０^－７Ｍ以下、または１×１０^－８Ｍ以下、例えば、１．０１×１０^－９Ｍ以下の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）またはＫＤを含む。

追加的に、本明細書に開示された前記抗体、特に二重特異的抗体形態に構築される時、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌および細胞溶解活性のＣＤ８ Ｔ細胞を向上させる能力を有する。特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体を含む二重特異的抗体はヒト４－１ＢＢに結合し、Ｔ細胞を活性化する能力を示す。

免疫反応を刺激する抗体の他の能力を生体内腫瘍移植モデル（ｔｕｍｏｒ ｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）のように腫瘍成長を抑制する抗体の能力を含む。

一部の実施形態において、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片は、重鎖不変領域（例えば配列番号３６）、軽鎖不変領域（例えば配列番号３７または３８）、Ｆｃ領域、またはこれらの組み合わせをさらに含む。一部の実施形態において、前記軽鎖不変領域はカッパまたはラムダ鎖不変領域である。一部の実施形態において、前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤである。一部の実施形態において、前記アイソタイプはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧである。一部の実施形態において、前記断片（前記抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合断片）は、前記抗体の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含む任意の断片であり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ（重鎖可変領域およびＣＨ１ドメインを含む）、Ｆｖ（重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域）、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；任意の順に重鎖可変領域および軽鎖可変領域、および重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間のペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含むか、必須で含む）、単一鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびこれらのものからなる群より選択される。

これらに限定されず、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその断片は、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体または完全ヒト抗体である。一側面において、抗体またはその断片は自然発生しないか、化学的にまたは組換えにより合成されない。

これらそれぞれの抗体がヒト４－１ＢＢなどの４－１ＢＢに結合できることを考慮すると、前記ＣＤＲ配列または前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列は、本明細書に開示された他の抗－４－１ＢＢ結合分子を生成するために「混合およびマッチング（ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ）」される。好ましくは、前記ＣＤＲ配列またはＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖が混合およびミックスされるとき、例えば、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対からのＶ_Ｈ配列は構造的に類似なＶ_Ｈ配列に代替される。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対からのＶ_Ｌ配列は構造的に類似なＶ_Ｌ配列に代替される。

一実施形態において、二重特異的抗体において前記４－１ＢＢ抗体をコードするポリヌクレオチドであり得る。一実施形態において、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドであり得る。他の実施形態において、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり得る。

前記ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態は、２個の抗原のうちの１つをターゲットとする（結合する）全長ＩｇＧ抗体およびもう１つをターゲットとする（結合する）ｓｃＦｖ断片を含む二重特異的抗体の一種を指し、前記ｓｃＦｖは、直接的に（ペプチドリンカーなしに）またはペプチドリンカーを介して全長ＩｇＧ抗体のＣ－末端および／またはＮ－末端に連結される。

一実施形態において、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の前記二重特異的抗体がＸという特定の抗体に対する全長ＩｇＧ抗体および４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ断片を含む場合、前記二重特異的抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは直接的にまたはペプチドリンカーを介して全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に連結されたＸに対する全長ＩｇＧ抗体の重鎖および４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ断片をコードすることができ；二重特異的抗体の軽鎖をコードする前記ポリヌクレオチドはＸに対する前記全長ＩｇＧ抗体の軽鎖をコードすることができる。

他の一実施形態において、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の前記二重特異的抗体が４－１ＢＢに対する全長ＩｇＧ抗体および特定の抗原（「Ｘ」）に対するｓｃＦｖ断片を含む場合、前記二重特異的抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、直接的にまたはペプチドリンカーを介して全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に連結された４－１ＢＢに対する前記全長ＩｇＧ抗体の重鎖およびＸに対するｓｃＦｖ断片をコードすることができ；二重特異的抗体の軽鎖をコードする前記ポリヌクレオチドは４－１ＢＢに対する前記全長ＩｇＧ抗体の軽鎖をコードすることができる。代表的な実施形態（例：抗－ＰＤ－Ｌ１／抗－４－１ＢＢの二重特異的抗体）を図７に示す。

前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片は、癌治療および／または予防および／または免疫反応促進に適用される。前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片による免疫反応促進は、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を治療（または投与）した時の免疫反応水準を意味し、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片が治療（または投与）しない場合よりその程度が高い。前記免疫反応促進は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ－細胞活性化またはその両方ともである。

一実施形態において、癌の例として血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）、肺ガン（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、すい臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、悪性黒色腫（ｓｋｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣ガン（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮肉腫（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）、卵管癌（ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頚癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膣ガン（ｖａｇｉｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、外陰部癌（ｖｕｌｖａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、小腸癌（ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、副甲状腺癌（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａ）、尿道癌（ｕｒｅｔｈｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｌｅ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、慢性または急性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、若年性固形腫瘍（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｓｔａｇｅ）、分化型リンパ腫（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎盂癌（ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、中枢神経原発リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脊髄腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒｓ）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、脳幹部神経膠腫（ｂｒａｉｎｓｔｅｍ ｇｌｉｏｍａ）および下垂体腺腫（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｏｍａ）を含むことができ、これらに限定されるものではない。

前記抗－４－１ＢＢ抗体、その抗原結合断片などのような有効成分または薬学的組成物は経口または非経口で投与される。非経口投与の場合、静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、内皮投与（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、鼻腔内投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、肺内投与（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）および直腸内投与（ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が可能である。経口投与は、タンパク質またはペプチドの消化につながるので、経口投与用組成物の活性成分は胃腸での消化を防止するためにコーティングまたは剤形化される。また、前記組成物は、活性成分がターゲット細胞に伝達されるようにする選択的装置を用いて投与される。

前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量は製剤（剤形）方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病的状態および献立、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応敏感度などの要因により多様な量で処方される。例えば、前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これらに限定されるものではない。前記１日投与量を単位投与形態で単一製剤で製剤化するか、または適切に分割された投与形態で製剤化するか、多重投与容器に含まれるように製造することができる。前記薬学的組成物は他の薬物と併用して投与することができ、患者の状態により容量、投与方法およびその他の薬物の種類によって適切な処方を行うことができる。

前記薬学的組成物は、オイル（ｏｉｌ）または水性媒質（ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉｕｍ）、懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）、粉末（ｐｏｗｄｅｒ）、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）またはカプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）形態の溶液形態で剤形化され、製剤のために分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）または安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をさらに含むことができる。

特に、前記抗－４－１ＢＢまたはその抗原結合断片を含む薬学的組成物は抗体またはその抗原結合断片を含むので、免疫リポソームで剤形化することができる。抗体含有リポソームは当業界に公知の任意の方法を使用して製造することができる。前記免疫リポゾームは、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびポリエチレングリコール由来ホスファチジルエタノールアミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を含む脂質組成物であり、逆相蒸発法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で製造することができる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりリポソームに接合される。

前記抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、または薬学的組成物は、診断、予後または治療が要求される任意の対象、特に哺乳動物個体に投与することができる。哺乳類個体にはヒト、家畜、農場動物および動物園、スポーツ動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などの愛玩動物が含まれる。

他の実施形態は下記を提供する：
重鎖相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）結晶領域をコードするポリヌクレオチド、軽鎖相補性決定領域をコードするポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせ；重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせ；重鎖をコードするポリヌクレオチド、軽鎖をコードするポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせ、前記相補性決定領域、重鎖および軽鎖可変領域および重鎖および軽鎖は、下記抗－４－１ＢＢ抗体に対して記載された通りである；
前記ポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを運ぶ組換えベクター；および／または
組換えベクターを保有する組換え細胞。

一実施形態において、前記記載された組換えベクターは、重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域；重鎖可変領域および軽鎖可変領域；または重鎖および軽鎖を前記それぞれのポリヌクレオチドを運ぶ抗－４－１ＢＢ抗体、単一ベクターまたは分離ベクターでそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

前記用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、プラスミドベクター（ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）、コスミドベクター（ｃｏｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）およびバクテリオファージベクター（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）などのウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）に例示されるように、宿主細胞でターゲット遺伝子を発現するための手段を意味する。前記組換えベクターは、当業界でよく使用されるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄｓ）（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．４、ｐＣＨＯ１．０、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９、ファージ（ｐｈａｇｅｓ）（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３）またはウイルス操作（例えば、ＳＶ４０など）から製造されることができる。

前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結されている。前記用語「作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、関心のあるヌクレオチド配列および発現の調節配列（例えば、プロモーター配列）の間の機能的連結に関連することが意図される。「作動可能に連結」されるとき、調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、前記関心のあるヌクレオチドの転写および／または翻訳を制御することができる。

前記組換えベクターは、典型的にクローニングベクターまたは発現ベクターで構築される。組換えベクターの場合、植物、動物または微生物細胞で外来タンパク質を発現するために当業界で通常使用可能なベクターを使用することができる。当業界でよく知られている多様な方法を組換えベクターの構築に用いることができる。

原核または真核細胞などの宿主で使用するために、組換えベクターはそれに基づいて構成される。例えば、ベクターが原核宿主で用いるための発現ベクターで構成される場合、前記ベクターは、一般に転写のための強力なプロモーター（例：ｐＬκλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結配列を含む。他の側面において、真核宿主で用いるための発現ベクターはｆ１複製起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ（ａｄｅｎｏ）複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などの真核細胞で作動可能な複製起点を含み、これらに限定されるものではない。また、前記発現ベクターは、典型的に哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）ウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）、および転写終結配列としてのポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列に由来するプロモーターを含む。

前記組換え細胞は適した宿主細胞に組換えベクターを導入して製造される。安定した方式で組換えベクターの順次クローニングおよび発現を許容する限り、当業界で公知の任意の宿主細胞が本明細書に開示された内容に用いられる。本明細書に開示された利用可能な原核宿主細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および多様なシュードモナス腫（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）がある。形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に用いられる真核宿主細胞は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞およびＳｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｓ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫなどの動物細胞を含むことができ、これらに限定されるものではない。

前記核酸分子またはこれを運ぶ組換えベクターは、当業界でよく知られている方法を使用して宿主細胞に導入（形質感染）される。この形質感染は、宿主細胞が原核細胞の場合ＣａＣｌ_２または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して行うことができる。真核宿主細胞の場合、遺伝的導入はマイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈澱（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム媒介トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用して達成できるが、これらに限定されるものではない。

形質転換された宿主細胞を選択するために、当業界でよく知られている方法により選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）と関連する表現型を利用することができる。例えば、選別マーカが特定の抗生剤に対する耐性を付与する遺伝子の場合、前記宿主細胞は関心形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を選別するための培地で抗生剤の存在下で成長される。

他の側面は、適切な宿主細胞でポリヌクレオチドまたは組換えベクターを発現する段階を含む抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。一実施形態において、前記製造方法は、ポリヌクレオチドまたはその中の組換えベクターを含む組換え細胞を培養し、任意に培養培地から抗体を分離および／または精製することを含むことができる。

本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体の４－１ＢＢ抗原に対する結合能分析（ＥＬＩＳＡ）結果を示す図である。それぞれの抗－４－１ＢＢ単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体が細胞外ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）４－１ＢＢ抗原に特異的に結合することを示す。 本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体の４－１ＢＢ抗原に対する結合能を測定（ＦＡＣＳ）した結果である。それぞれの抗－４－１ＢＢ単クローン抗体が細胞表面に発現した４－１ＢＢに特異的に結合することを示す。 本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体による４－１ＢＢ信号活性化を示すグラフである。 本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体によるＴ－細胞活性化を示すグラフである。 本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体による４－１ＢＢ信号活性化を二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体形態で示すグラフである。 本発明の一実施形態により製造された抗－４－１ＢＢ抗体のマウス腫瘍共通遺伝子モデルで癌抑制効能を示すグラフである。それぞれの抗－４－１ＢＢ抗体はヒト４－１ＢＢ ｋｎｏｃｋ－ｉｎマウスで癌の成長を抑制することが示された。これは、本発明の４－１ＢＢ抗体がヒト４－１ＢＢを発現する免疫細胞に結合して癌の成長を抑制して癌の治療剤として有用に使用されることを意味する。 抗－ＰＤ－Ｌ１／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の模式図である。 ４－１ＢＢ上の抗－４－１ＢＢ抗体（４１Ｂ０１）の結合部位を示す模式図である。 ４－１ＢＢ上の抗－４－１ＢＢ抗体（４１Ｂ０２）の結合部位を示す模式図である。 Ｕｒｅｌｕｍａｂおよび候補（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の交差競争を示す。 Ｕｒｅｌｕｍａｂおよび候補（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の交差競争を示す。 ４１Ｂ０１および４１Ｂ０２の間の交差競争を示す。 組換えヒト４１ＢＢ－リガンド（ｌｉｇａｎｄ）および４１Ｂ０１の間の交差競争を示す。

以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。下記の実施例は単に本発明を例示したものに過ぎず、本発明を限定するとは解釈されない。

実施例１．抗－４－１ＢＢ単クローン抗体の用意
実施例１．１．４－１ＢＢに対する完全なヒト単クローン抗体スクリーニング
ターゲット分子に対するそれぞれのファージライブラリー（ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＫＢｉｏ ＨｅａｌｔｈおよびＣＵＲＥＢＩＯで入手）のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）のために、４－１ＢＢ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２．２；配列番号６７）コーティングされた免疫チューブを利用して総４回のパンニングを行った。

３回のパンニング出力からのバクテリアコロニー（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を９６ディープウェル（ｄｅｅｐｗｅｌｌ）プレートのＳＢ－カルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）で濁るまで成長させ、この時、１０^１１ ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）が各ウェルに添加された。３７℃で弱い震盪（８０ｒｐｍ）で１時間感染後、７０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、細胞を２００ｒｐｍで震盪しながら３０℃で一晩培養した。

翌日、前記プレートを遠心分離し、ファージを含む上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を３％ＢＳＡ（ｉｎ ＰＢＳＴ）で遮断された４－１ＢＢ抗原コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温で１時間培養した後、前記プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｍ１３抗体を添加した。前記プレートを１時間培養し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）を使用して結合活性を測定した。

前記４－１ＢＢ特異的結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）は、プラスミドＤＮＡシーケンシングのために増幅された。ｌｇ軽鎖Ｖ遺伝子（Ｉｇ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｖ ｇｅｎｅｓ；ＶＬ）およびＶＨ配列を分析して固有の配列を確認し、配列多様性を決定した。

すべての類型のＩｇＧ形態が用意されるが、得られたＩｇＧ４形態の４－１ＢＢ特異的抗体の配列は表２～表９に示す。

実施例１．２．４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ抗体の製造
（Ｎ’）－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－（Ｃ’）構造を有する抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体は、前記実施例１．１の表に提示された４－１ＢＢに対する完全なヒト単クローン抗体の可変領域を使用して用意し、ここで重鎖可変領域４４位のアミノ酸残基「Ｇ」は「Ｃ」に置換され、軽鎖可変領域１０３位のアミノ酸残基「Ｇ」は「Ｃ」に置換された。ｓｃＦｖで「Ｇ」から「Ｃ」へのこのようなアミノ酸置換は１つのターゲット－特異的モイアティ（ｍｏｉｅｔｙ）であって、ｓｃＦｖを含む二重特異的抗体の安定性増加に寄与できる。前記製造されたアミノ酸配列は下記表に示し、当業者は（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＳ）９などの多様な種類のペプチドリンカーに適用することを含んで特定目的を満たすために、下記の実施例でアミノ酸配列の変更または変形を適用することができる。ｓｃＦｖ形態で得られた４－１ＢＢ特異的抗体の配列は下記表１０～表１５に示す。

実施例１．４．二重特異的抗体形態として４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ抗体用意
二重特異的抗体の代表的な例として、下記のように重い構成および軽い構成で構成されるＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体を用意した：
（１）重い構成（Ｎ’→Ｃ’）
１）抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖：配列番号６３または６５、
２）リンカー：配列番号６６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、および
３）前記実施例１．２で用意した抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、４１Ｂ０１（ｓｃＦｖ）（表１０）、４１Ｂ０１．０１（ｓｃＦｖ）（表１１）、４１Ｂ０１．０２（ｓｃＦｖ）、４１Ｂ０１．０３（ｓｃＦｖ）（表１２）、または４１Ｂ０１．０４（ｓｃＦｖ）（表１３）；および
（２）軽い構成（Ｎ’→Ｃ’）
抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖：配列番号６４
実施例１．５．ヒト４－１ＢＢに対する抗－４－１ＢＢ抗体の抗原結合能力
（１）ＥＬＩＳＡによって測定された抗原結合
前記抗原結合活性を評価するために、前記抗体候補のＥＬＩＳＡテストを行った。要約すると、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）を０．１μｇ／ｍｌ（ｉｎ ＰＢＳ）のヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質１００μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングし、５％ＢＳＡ １００μｌ／ウェルで遮断した。前記実施例１．１で得られた抗体の連続希釈液（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を各ウェルに添加し、室温で１～２時間培養した。前記プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）と結合した塩素－抗－ヒトＩｇＧ抗体とともに室温（ＲＴ）で１時間培養した。洗浄後、前記プレートをＴＭＢ基板で現像し、ＯＤ４５０－６３０ｎｍで分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）により分析した。前記分析結果は図１ａ～図１ｃに示す。図１ａ、図１ｂおよび図１ｃに示すように、前記抗－４－１ＢＢ抗体は高い４－１ＢＢ結合能力を示した。

（２）ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）によって測定された細胞結合力
前記抗原結合特性を評価するために、前記抗体候補をＦＡＣＳを利用して４－１ＢＢに発現した哺乳類に対する結合を分析した。簡単に言えば、４－１ＢＢ－Ｊｕｒｋｅｔ細胞を抗体（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）とともに培養した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）で洗浄した後、前記ＦＩＴＣ－抗－ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で１時間培養した。ＦＩＴＣのＭＦＩは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒによって評価された。図２に示すように、前記評価された抗－４－１ＢＢ抗体は細胞表面に発現し、哺乳動物細胞で発現した４－１ＢＢに効率的に結合できる４－１ＢＢに対する結合能力を示す。
図２に示すように、前記評価された抗－４－１ＢＢ抗体は、細胞表面に発現した４－１ＢＢに対する結合能力を示す。

（３）４－１ＢＢに対するタンパク質ｋｉｎｅｔｉｃ
前記ヒト化抗体の結合ｋｉｎｅｔｉｃを調べるために、本実施例はＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６を使用して親和性順位を定めた。下記表１６に示すように、前記評価された抗－４－１ＢＢ抗体は高い４－１ＢＢ結合親和性を示す。

（４）エピトープマッピング（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ）
前記４－１ＢＢ抗体の固有のエピトープを確認するために、エピトープマッピングを行った。４－１ＢＢ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１５５２．２）のほとんどすべての表面残留物をＲａｎｏｍｉｃｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＣＡ）によるエピトープマッピングを行うために、高処理量流動細胞計測法（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて突然変異スクリーニングを行った。ＧＦＰタグは４－１ＢＢのＣ－末端に融合され、４－１ＢＢの細胞外ドメイン（２４－１８６）の各表面残基はアルギニン（Ａｒｇ）に突然変異した。残留物がアルギニンであれば、グルタミン酸（Ｇｌｕ）に突然変異した。前記突然変異プラスミドをライブラリーに集めてＨＥＫ２９３細胞株で形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）させた。前記生成された細胞株は、ＧＦＰおよび／または４１Ｂ０１／４１Ｂ０２結合に対して分類された。前記分類された細胞プール（ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ）にある各突然変異集団はＲＮＡｓｅｑで分析された。突然変異がＧＦＰ／抗－４－１ＢＢプールよりＧＦＰプールでより多く見える場合、突然変異した部位はエピトープとみなされた。前記エピトープ残基は表１７に示す。

図８ａおよび図８ｂは、前記４１Ｂ０１クローンおよび４１Ｂ０２クローンのエピトープを示す。前記図において、４－１ＢＢタンパク質を分子表面の表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＰＤＢＩＤ：６ＭＧＰ）で４－１ＢＢリガンドと結合したリボンで表した。抗－４－１ＢＢ抗体に対して４－１ＢＢ内で確認された前記エピトープ残基は球体で表される。前記図に示すように、４１Ｂ０１および４１Ｂ０２は、４－１ＢＢ内の４－１ＢＢＬの結合部位から遠く離れた４－１ＢＢのＣＤＲ４内のエピトープに結合する。したがって、４１Ｂ０１および４１Ｂ０２は４－１ＢＢＬと競争しない。
このような観察は、４１Ｂ０１および４１Ｂ０２が４－１ＢＢＬと競争しない反面、ｕｔｏｍｉｌｕｌｕｍａｂは４－１ＢＢＬと競争するという実施例１．５（５）の競争分析の結果と一致する。Ｕｔｏｍｉｌｕｌｕｍａｂはまた、４１Ｂ０１および４１Ｂ０２と競争する。Ｕｔｏｍｉｌｕｌｕｍａｂが４－１ＢＢのＣＲＤ３～４（８７－１１８）内のエピトープに結合するため、４－１ＢＢ内のｕｔｏｍｉｌｕｌｕｍａｂの結合部位は４－１ＢＢＬ、４１Ｂ０１または４１Ｂ０２の結合部位に近く、重なる。

（５）競争分析
４－１ＢＢ抗体が固有のエピトープを持つかどうかをテストするために競争分析を行った。
９６ウェルブラックマイクロプレート（９６ ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ ｏｎｅ）をバイオセンサートレイケースに設けた後、２００μｌの１Ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｘ ＫＢ）をそれぞれ８ウェルに追加した。８個のＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を１０分間緩衝液でウェルに浸して水和させた。分析物（ａｎａｌｙｔｅｓ）（４１Ｂ０１、４１Ｂ０２、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、組換えヒト４１ＢＢリガンド（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ４１ＢＢ Ｌｉｇａｎｄ））を１Ｘ ＫＢを使用して１００ｎＭの濃度に希釈した。組換えヒト４１ＢＢ－Ｈｉｓタグタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１００４１－Ｈ０８Ｈ）を１Ｘ ＫＢ緩衝液で２μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、バイオセンサーで抗原固定に使用した。

上記実験は、下記表１８に基づいた２つの分析物（ａｎａｌｙｔｅｓ）の連続的な結合段階によって行われた。前記オクテットプログラムテンプレートにより新たな９６ウェルブラックマイクロプレートに１Ｘ ＫＢを追加した。バイオセンサーを１Ｘ ＫＢ２００μＬに浸してベースライン１（ｂａｓｅｌｉｎｅ１）を生成した後、バイオセンサーを２００μＬの抗原、組換えヒト４１ＢＢ Ｈｉｓタグ（ｔａｇ）タンパク質（２μｇ／ｍＬ）に配置して抗原をバイオセンサーに固定した。１Ｘ ＫＢ ２００μＬ（ｂａｓｅｌｉｎｅ２）でバイオセンサーを再水和した後、最初の分析物（２００μＬ）がバイオセンサーの抗原と関連した。その後、２番目の分析物（２００μＬ）がバイオセンサーの分子と関連した。前記実験板の温度は３０℃に調節した。実験が終わった後、Ｏｃｔｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ９．０ソフトウェアを用いて、最初および２番目の分析物間の交差競争（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）を評価した。

前記結果は図９ａ～図１２ｃに示す。
図９ａ～図９ｅは、Ｕｒｅｌｕｍａｂと候補者（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の交差競争を示す。Ｕｒｅｌｕｍａｂと２つの候補者（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の競争分析を行った。組換えヒト４１ＢＢ－Ｈｉｓタグタンパク質は、まず、バイオセンサーに固定された。その後、１次および２次抗体をバイオセンサーと順次に連結して２つの抗体間の結合競争を感知した。全般的に、Ｕｒｅｌｕｍａｂおよび２つの候補者の間に結合競争が観察されず、これは、各抗体が固有のエピトープを有していることを意味する。図９ａは、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（対照群）の自己結合の結果を示し、図９ｂは、第１抗体としてＵｒｅｌｕｍａｂ、第２抗体として４１Ｂ０１の結果を示し、図９ｃは、第１抗体として４１Ｂ０１、第２抗体としてＵｒｅｌｕｍａｂの結果を示し、図９ｄは、第１抗体としてＵｒｅｌｕｍａｂ、第２抗体として４１Ｂ０２の結果を示し、図９ｅは、第１抗体として４１Ｂ０２、第２抗体としてＵｒｅｌｕｍａｂの結果を示す。

図１０ａ～図１０ｅは、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂおよび候補者（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の交差競争を示す。Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂおよび２つの候補者（４１Ｂ０１および４１Ｂ０２）の間の競争分析を行った。組換えヒト４１ＢＢ－Ｈｉｓタグタンパク質は、まず、バイオセンサーに固定された。その後、１次抗体および２次抗体をバイオセンサーと順次に連結して２つの抗体間の結合競争を感知した。全般的に、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂおよび２つの候補者の間に結合競争が観察されず、これは、各抗体が固有のエピトープを有していることを意味する。図１０ａは、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（対照群）の自己結合の結果を示し、図１０ｂは、第１抗体としてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、第２抗体として４１Ｂ０１の結果を示し、図１０ｃは、第１抗体として４１Ｂ０１、第２抗体としてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの結果を示し、図１０ｄは、第１抗体としてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、第２抗体として４１Ｂ０２の結果を示し、図１０ｅは、第１抗体として４１Ｂ０２、第２抗体としてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの結果を示す。

図１１ａ～図１１ｄは、４１Ｂ０１と４１Ｂ０２間の交差競争を示す。２つの候補者（４１Ｂ０１と４１Ｂ０２）間の競争分析を行った。組換えヒト４１ＢＢ－Ｈｉｓタグタンパク質は、まず、バイオセンサーに固定された。その後、１次抗体および２次抗体をバイオセンサーと順次に連結して２つの抗体間の結合競争を感知した。全般的に、４１Ｂ０１と４１Ｂ０２間に結合競争が観察され、これは、２つの候補者が４１ＢＢに対して同じエピトープを有していることを意味する。図１１ａは、４１Ｂ０１の自己結合の結果を示し、図１１ｂは、第１抗体として４１Ｂ０１、第２抗体として４１Ｂ０２の結果を示し、図１１ｃは、第１抗体として４１Ｂ０２、第２抗体として４１Ｂ０１の結果を示し、図１１ｄは、４１Ｂ０２の自己結合の結果を示す。

図１２ａ～図１２ｃは、組換えヒト４１ＢＢ－リガンドおよび４１Ｂ０１の間の交差競争を示す。組換えヒト４１ＢＢ－リガンドと４１Ｂ０１の間の競争分析を行った。組換えヒト４１ＢＢ－Ｈｉｓタグタンパク質は、まず、バイオセンサーに固定された。その後、組換えヒト４１ＢＢ－リガンドおよび４１Ｂ０１をバイオセンサーと順次に連結してこれらの間の結合競争を感知した。全般的に、組換えヒト４１ＢＢ－リガンドと４１Ｂ０１の間に結合競争が観察されず、これは、４１Ｂ０１が組換えヒト４１ＢＢ－リガンドに比べて４１ＢＢに対する固有の結合部位を有していることを意味する。図１２ａは、組換えヒト４１ＢＢ－リガンドの自己結合の結果を示し、図１２ｂは、第１抗体として組換えヒト４１ＢＢ－リガンド、第２抗体として４１Ｂ０１の結果を示し、図１２ｃは、第１抗体として４１Ｂ０１、第２抗体として組換えヒト４１ＢＢ－リガンドの結果を示す。

実施例２．抗－４－１ＢＢ抗体の活性
（１）４－１ＢＢ信号を促進する抗－４－１ＢＢ抗体の活性
４－１ＢＢ信号を促進する抗－４－１ＢＢ抗体の能力をテストするために細胞基盤４－１ＢＢ分析を用いた。この分析では、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃ ＣＳ１９６００４）を使用した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株は遺伝的に変形して反応要素の４－１ＢＢ受容体およびルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍを安定的に発現する。ルシフェラーゼ発現は、抗体が前記４－１ＢＢ受容体に結合する時に誘導される。簡単に言うと、抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ２次抗体（５００ｎＭから始まり５倍に希釈）と架橋された２５μＬの抗体をプレートに添加した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を収穫し、ウェル当たり５０μＬのＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を分配してプレートにウェル当たり５×１０^４個の細胞を作った。３７℃＋５％ＣＯ_２の加湿培養器で６時間培養した。培養時間の間製造業者の指針に従い、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬を再構成した。６時間培養後、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬ウェル当たり７５個を分析プレートに追加した。５分間待ち、マイクロプレートリーダーを使用して発光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで４パラメータロジスティック曲線分析（Ｆｏｕｒ－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。

前記分析結果を図３に示す。図３に示すように、前記テストされた抗－４－１ＢＢ抗体は４－１ＢＢ作用活性を示した。

（２）ヒトＴ細胞免疫反応を促進する抗－４－１ＢＢ抗体の活性
刺激されたヒトＰＢＭＣ反応に対する抗－４－１ＢＢ抗体の能力をテストするためにサイトカイン生産分析（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）が使用された。ヒト抗－ＣＤ３抗体で刺激したヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）として用いた。４－１ＢＢが発現されないＨＣＣ－１９５４細胞をターゲット細胞として使用した。このシステムにおいて、ＰＢＭＣ（３×１０^４）はヒト抗－ＣＤ３抗体の存在下でＨＣＣ－１９５４（１×１０^４）と共同培養された。抗－４－１ＢＢ抗体（１００ｎＭ（＝１５μｇ／ｍＬ）から始まり１０回容量に希釈）およびＦｃ架橋抗体（５００ｎＭ（＝７５μｇ／ｍＬ）から始まり１０回容量に希釈）を混合培養に添加した。前記分析結果を図４に示す。図４に示すように、抗－４－１ＢＢ抗体はサイトカイン放出を誘導した。

（３）４－１ＢＢ信号を促進するＰＤ－ＬＸ４－１ＢＢ抗体の活性
二重特異的抗体形態の前記４－１ＢＢ抗体による４－１ＢＢ信号促進は、細胞基盤４－１ＢＢ分析を用いて測定された。

前記二重特異的抗体であるＰＤ－Ｌ１Ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体は、下記のように重い構成および軽い構成で構成された。
（１）重い構成（Ｎ’→Ｃ’）
１）抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖：配列番号６３
２）リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）：配列番号６６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、および
３）前記実施例１－２で用意した抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、４１Ｂ０１（ｓｃＦｖ）（表１０）、または４１Ｂ０２（ｓｃＦｖ）（表１４）；並びに
（２）軽い構成（Ｎ’→Ｃ’）
抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖：配列番号６４。

前記分析において、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃ ＣＳ１９６００４）をエフェクター細胞として使用し、ＰＤ－Ｌ１を発現するか、または発現しない癌細胞株をターゲット細胞として使用した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株は遺伝的に変形して反応要素の４－１ＢＢおよびルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍを安定的に発現する。ルシフェラーゼ発現は、抗体が４－ＢＢ受容体に結合する時に誘導される。略述すると、ＨＣＣ１９５４（ＰＤ－Ｌ１発現；ウェル当たり２．５×１０^４個の細胞）を培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）１００μＬを含むｗｈｉｔｅ ９６－ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅにおいて、３７℃＋５％ＣＯ_２の条件の加湿培養器で一晩培養した。一晩培養し、１００μＬの培養培地を除去し、２５μＬのＡｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）を予めメッキされたターゲット細胞に分配した。二重特異的抗体（１５ｎＭから始まり８倍希釈、または１．５ｎＭから始まり４倍希釈）それぞれ２５μＬをプレートに添加した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を収穫し、Ａｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍで再懸濁した。ウェル当たり２５μＬのＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ^ＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を分配してプレートにウェル当たり２．５×１０^４個の細胞が存在するように作った。３７℃＋５％ＣＯ_２の加湿培養器で６時間培養した。培養時間の間製造業者の指針に従い、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭ試薬を再構成した。６時間培養後、ウェル当たりＢｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭ試薬７５個を分析プレートに追加した。５分間待った後、マイクロプレートリーダーを用いて発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで４パラメータロジスティック曲線分析（Ｆｏｕｒ－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。

前記分析結果を図５に示し、前記結果から４１Ｂ０１は、４１Ｂ０１（ｓｃＦｖ）を含むＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体を示し、４１Ｂ０２は、４１Ｂ０２（ｓｃＦｖ）を含むＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体を示す。図５に示すように、前記４－１ＢＢ抗体が二重特異的抗体（ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体）形態に構築された時、テストされたＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体は、腫瘍抗原（ＰＤ－Ｌ１）の存在下で抗ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体と比較した時、さらに強い４－１ＢＢ信号活性化を示した。

（４）抗－４－１ＢＢ抗体の生体内効能
ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインを発現するヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）マウスを使用した。マウス結腸腺癌細胞（ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ、ＭＣ３８）はヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように操作された。ヒト化マウス（ｈ４－１ＢＢ）にＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を皮下移植した。マウスにＱ３Ｄを５回（３日ごとに５回の抗体注射）下記抗体とともに腹腔内投与した：ヒトＩｇＧタイプ対照群（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗－４－１ＢＢ抗体（４１Ｂ０１、１０ｍｇ／ｋｇ）。

腫瘍体積を実験期間の間週に２回、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定でモニターし、前記分析結果を図６に示す。４１Ｂ０１を使用して前記抗－４－１ＢＢ抗体によって誘導された腫瘍成長抑制は、それぞれのターゲットの単クローン抗体の組み合わせで観察されたものより顕著にさらに大きかった（図６参照）。

図６に示すように、前記抗－４－１ＢＢ抗体はｈｌｇＧ（対照群）に比べて生体内抗腫瘍効果が増加した。

本明細書に開示された内容は、本開示の個別側面の単一の例示によって意図された特定の実施形態により範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の任意の組成物または方法は本明細書に開示された内容の範囲内である。本明細書内容の思想または範囲から離れることなく本明細書の開示された方法および組成物において様々な変形および変形を行い得ることは当業者に明らかである。したがって、本明細書に開示された内容は、添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲内である限り、本明細書の開示内容の修正および変形を含むことが意図される。

本明細書に開示されたすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個別刊行物または特許出願が参照として含まれることを具体的かつ個別に表示されたのと同じ程度まで本明細書に参照として含まれる。

Claims (14)

1. 以下を含む、抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片：
   配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）－Ｈ１；
   配列番号４、５または６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
   配列番号７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
   配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
   配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
   配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３。
2. 以下を含む、請求項１に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片：
   （ａ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号７のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
   （ｂ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
   （ｃ）配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３；または
   （ｅ）配列番号３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１７のＶＬ ＣＤＲ３。
3. 以下を含む、請求項１または２に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片：
   （１）配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、３９、５７、５８、５９および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む重鎖可変領域；および
   （２）配列番号２４、２５、２６、６１および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む軽鎖可変領域。
4. 以下を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片：
   （１）配列番号２７、２８、２９、３０、３１および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む重鎖；および
   （２）配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む軽鎖。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体およびその抗原結合断片を含む、癌治療または予防用薬学的組成物。
6. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体およびその抗原結合断片を含む、免疫反応促進用薬学的組成物。
7. 前記免疫反応促進は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ－細胞活性化、またはその両方とも含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
8. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
10. 請求項８に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換え細胞。
11. 請求項１０に記載の前記組換え細胞を培養する段階を含む、抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
12. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を対象に投与する段階を含む、癌治療または予防方法。
13. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を対象に投与する段階を含む、免疫反応促進方法。
14. 前記免疫反応促進は４－１ＢＢ信号活性化、Ｔ－細胞活性化、またはその両方とも含む、請求項１３に記載の方法。
    

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