JP2013544756A - ４−１ｂｂ結合分子 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ヒト４−ＢＢに結合する単離結合分子、該結合分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、該結合分子を作製する方法、該結合分子を含有する薬学的組成物、および該結合分子または組成物を用いる方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、抗体、および特にヒト４−１ＢＢに結合する抗体に関する。
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９等とも称される）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳ）の膜貫通タンパク質である。４−１ＢＢの現在の理解によって、発現が一般的に活性化依存性であり、そして活性化されたＮＫおよびＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、刺激されたマスト細胞、分化中の骨髄細胞、単球、好中球、および好酸球を含む免疫細胞の広いサブセットに存在することが示されている（Ｗａｎｇ， ２００９， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２９：１９２−２１５）。４−１ＢＢ発現はまた、腫瘍血管系上に（Ｂｒｏｌｌ， ２００１， Ａｍｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． １１５（４）：５４３−５４９； Ｓｅａｍａｎ， ２００７， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １１：５３９−５５４）、そして炎症または動脈硬化内皮の部位に（Ｄｒｅｎｋａｒｄ， ２００７ ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２１：４５６−４６３； Ｏｌｏｆｓｓｏｎ， ２００８， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７：１２９２−１３０１）存在する。４−１ＢＢを刺激するリガンド、すなわち４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）は、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、骨髄前駆体細胞、および造血幹細胞上で発現される。
ヒト４−１ＢＢは、２５５アミノ酸タンパク質である（寄託番号ＮＭ＿００１５６１； ＮＰ＿００１５５２）。完全ヒト４−１ＢＢアミノ酸配列を、配列番号６８に提供する。該タンパク質は、シグナル配列（アミノ酸残基１〜１７）の後に、細胞外ドメイン（１６９アミノ酸）、膜貫通領域（２７アミノ酸）、および細胞内ドメイン（４２アミノ酸）を含む（Ｃｈｅｕｋ ＡＴＣら ２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１： ２１５−２２６）。受容体は、単量体および二量体型で、細胞表面上に発現され、そして４−１ＢＢリガンドと三量体化して、シグナルを伝達するようである。
ネズミおよびヒトＴ細胞の多くの研究によって、４−１ＢＢが、細胞増殖、生存、およびサイトカイン産生増進を促進することが示されている（Ｃｒｏｆｔ， ２００９， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２７１−２８５）。研究によって、いくつかの４−１ＢＢアゴニストｍＡｂが、共刺激分子発現を増加させ、そして細胞溶解性Ｔリンパ球反応を顕著に増進し、多様なモデルにおいて抗腫瘍有効性を生じることが示されてきている。４−１ＢＢアゴニストｍＡｂは、予防および療法的セッティングにおいて、有効性を立証されてきている。さらに、４−１ＢＢ単独療法および併用療法腫瘍モデルは、耐久性がある抗腫瘍防御Ｔ細胞メモリー反応を確立している（Ｌｙｎｃｈ， ２００８， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２２：２７７−２８６）。４−１ＢＢアゴニストはまた、当該技術分野に認められる多様な自己免疫モデルにおいて、自己免疫反応を阻害することも示されてきている（Ｖｉｎａｙ， ２００６， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８４：７２６−７３６）。４−１ＢＢのこの二重活性によって、免疫寛容を破る免疫療法アプローチと関連しうる自己免疫副作用を弱める一方で、抗腫瘍活性を提供する潜在能力が提供される。
ヒト４−１ＢＢに結合し、４−１ＢＢが仲介する反応を増加させ、そしてそれによって、癌を含む多様な疾患および状態の治療のための潜在的な療法剤を提供する抗体に関して、長く求められながら、いまだ対処されていない必要性がある。
Ｗａｎｇ， ２００９， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２９：１９２−２１５ Ｂｒｏｌｌ， ２００１， Ａｍｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． １１５（４）：５４３−５４９ Ｓｅａｍａｎ， ２００７， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １１：５３９−５５４ Ｄｒｅｎｋａｒｄ， ２００７ ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２１：４５６−４６３ Ｏｌｏｆｓｓｏｎ， ２００８， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７：１２９２−１３０１ Ｃｈｅｕｋ ＡＴＣら ２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２１５−２２６ Ｃｒｏｆｔ， ２００９， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２７１−２８５ Ｌｙｎｃｈ， ２００８， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２２：２７７−２８６ Ｖｉｎａｙ， ２００６， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８４：７２６−７３６
本開示の目的は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離結合分子、例えば抗体またはその結合断片、あるいはその誘導体を提供することである。４−１ＢＢに結合する結合分子を含む組成物を提供することが本開示の別の目的である。本開示の１またはそれより多い結合分子を用いることによって、４−１ＢＢシグナル伝達と関連するかまたは該シグナル伝達によって仲介される疾患および／または状態を治療するための方法を提供することもまた、本開示の目的である。本開示のこれらのおよび他の目的が、本明細書にさらに詳細に記載される。
いくつかの側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供する。
１つの特定の側面において、単離抗体は、配列番号６８のアミノ酸残基１１５〜１５６を含むエピトープで、ヒト４−１ＢＢに結合する。いくつかの特定の態様において、該抗体は、配列番号２９のＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３０のＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３１のＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。他の特定の態様において、該抗体は、配列番号３４のＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３５のＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
別の特定の側面において、単離抗体は、本開示に記載するＢＩＡＣｏｒｅアッセイで測定した際、ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインに対して、６００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、あるいは１ｎＭまたはそれ未満のＫＤで、ヒト４−１ＢＢに結合する。
別の特定の側面において、単離抗体は：（ａ）配列番号１、配列番号１５、または配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２、配列番号１６、または配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号３、配列番号１７、または配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む。
別の特定の側面において、単離抗体は：（ａ）配列番号６、配列番号２０、または配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７、配列番号２１、または配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８、配列番号２２、配列番号３６、または配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む。
さらなる側面において、単離抗体は：（ａ）配列番号１、配列番号１５、または配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２、配列番号１６、または配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号３、配列番号１７、または配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含み；そして：（ｄ）配列番号６、配列番号２０、または配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７、配列番号２１、または配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号８、配列番号２２、配列番号３６、または配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかのさらなる特定の側面において、単離抗体は：
（ａ）配列番号１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号２に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号３に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；
（ｂ）配列番号１５に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号１７に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；ならびに
（ｃ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分
からなる群より選択される。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分であって：
（ａ）配列番号６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号７に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号８に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；
（ｂ）配列番号２０に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号２１に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号２２に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；
（ｃ）配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号３６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；ならびに
（ｄ）配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分
からなる群より選択される、前記抗体またはその抗原結合部分を提供する。
いくつかのさらなる特定の側面において、単離抗体は：
（ａ）配列番号１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号２に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号７に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号８に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；
（ｂ）配列番号１５に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号１７に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号２０に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号２１に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号２２に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；
（ｃ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号３６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分；ならびに
（ｄ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合部分
からなる群より選択される。
さらなる特定の側面において、単離抗体は、配列番号４、配列番号１８、配列番号３２、および配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列を含む。
さらなる特定の側面において、単離抗体は、配列番号９、配列番号２３、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む。
さらなる特定の側面において、単離抗体は、配列番号４、１８、３２、および４３のいずれか１つに示すとおりのＶＨドメインアミノ酸配列を含み、そしてさらに、配列番号９、配列番号２３、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６０、および配列番号６４のいずれか１つに示すとおりのＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
さらなる特定の側面において、単離抗体は：
（ａ）配列番号４に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号９に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ｂ）配列番号１８に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号２３に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ｃ）配列番号３２に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号３７または配列番号５６に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；ならびに
（ｄ）配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号４５、配列番号５１、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体
からなる群より選択される。
さらにさらなる特定の側面において、本開示が提供する単離抗体は、（ｉ）配列番号１１、配列番号２５、配列番号３９、配列番号４７を含む核酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１１、配列番号２５、配列番号３９、または配列番号４７の相補鎖に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるＶＨ鎖を含む。
さらにさらなる特定の側面において、単離抗体は、（ｉ）配列番号１２、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６２、または配列番号６６を含む核酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１２、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６２、または配列番号６６の相補鎖に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるＶＬ鎖を含む。
さらなる特定の側面において、ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ ７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、またはＭＯＲ−７４８３．２より選択される例示的抗体と、ヒト４−１ＢＢへの結合に関して競合し、そして／または交差競合する、単離抗体を提供する。
さらなる特定の側面において、ヒト４−１ＢＢ上の、本明細書に開示する抗体いずれかと同じエピトープに結合する、単離抗体を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ ７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、またはＭＯＲ−７４８３．２より選択される例示的抗体と、ヒト４−１ＢＢ上の同じエピトープに結合する、単離抗体を提供する。
さらなる特定の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合し、ヒトＶＨ ３−２３遺伝子、ＶＨ １−６９遺伝子、またはＶＨ ５の産物であるかまたはこれらに由来する、重鎖可変領域を含む、単離抗体を提供する。別の特定の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合し、ヒトＶＬ λ３またはλ１−１３遺伝子の産物であるかまたはこれらに由来する、軽鎖可変領域を含む、単離抗体を提供する。
いくつかの態様において、本明細書記載の単離抗体は、以下の特性または特徴：
ａ）ヒト４−１ＢＢに結合する；
ｂ）ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）４−１ＢＢに結合する；
ｃ）ヒト４−１ＢＢまたはカニクイザル４−１ＢＢに結合するが、ラットまたはマウス４−１ＢＢには結合しない；
ｄ）ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である；および
ｅ）ヒト抗体またはヒト化抗体である
の１またはそれより多くを有する。
いくつかの他の側面において、本開示は、本開示が提供する任意の抗体の抗原結合部分を提供する。いくつかの態様において、抗原結合部分は、ＦａｂまたはｓｃＦｖ断片である。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、本開示が提供する任意の抗体の誘導体を提供する。
いくつかの他の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する抗体またはその抗原結合部分のＶＨ鎖をコードする単離核酸であって：
（ｉ）配列番号４、配列番号１８、配列番号３２、または配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１１、配列番号２５、配列番号３９、または配列番号４７に示すとおりの核酸配列；あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１１、配列番号２５、配列番号３９、または配列番号４７に示すとおりの核酸配列の相補鎖に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列
からなる群より選択される、前記核酸を提供する。
いくつかの他の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する抗体またはその抗原結合部分のＶＬ鎖をコードする単離核酸であって：
（ｉ）配列番号９、配列番号２３、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６２、または配列番号６６に示すとおりの核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６２、または配列番号６６に示すとおりの核酸配列の相補鎖に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列
からなる群より選択される、前記核酸を提供する。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、本明細書記載の任意の核酸を含むベクターを提供する。さらにさらなる側面において、本開示は、本明細書記載の任意のベクターを含む宿主細胞を提供する。こうした宿主細胞は、細菌または哺乳動物であってもよい。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、任意の抗体、その抗原結合部分、またはその誘導体、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。
本開示はさらに、必要がある被験体において、異常な細胞増殖を治療するための方法であって、有効量の本開示の結合分子または本明細書記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。本開示は、被験体において、腫瘍細胞転移を減少させる方法であって、前記被験体に、有効量の本明細書記載の結合分子または薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
さらなる側面において、本開示は、必要がある被験体における異常な細胞増殖治療用の薬剤製造のための、本明細書記載の任意の結合分子または薬学的組成物の使用を提供する。さらなる側面において、本開示は、必要がある被験体における異常な細胞増殖の治療において使用するための、本明細書記載の結合分子または薬学的組成物を提供する。さらにさらなる側面において、本開示は、必要がある被験体における腫瘍細胞転移の治療において使用するための、本明細書記載の結合分子または薬学的組成物を提供する。さらにさらなる側面において、本開示は、必要がある被験体における腫瘍細胞転移治療用の薬剤製造のための、本明細書記載の任意の結合分子または薬学的組成物の使用を提供する。
図１は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７にコンジュゲート化された示す４−１ＢＢ抗体または対照抗体とインキュベーションした、未刺激（黒）およびＰＨＡ刺激（薄い灰色）のヒト（上段左）、カニクイザル（上段右）、イヌ（下段左）、およびラット（下段右）由来初代ＰＢＭＣの平均蛍光強度を示す４つの棒グラフである。パネルは、ＰＨＡで刺激したヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣへの結合を立証する。 図２は、いくつかの濃度の４−１ＢＢ特異的ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂで刺激しておいた、４−１ＢＢ発現２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性を示す２つの線グラフである。左パネルは、カニクイザル４−１ＢＢを発現する細胞におけるレポーター活性を立証する。右パネルは、ヒト４−１ＢＢを発現する細胞における活性を立証する。アイソタイプ対照を超える倍刺激としてデータを表す。 図３（３Ａおよび３Ｂ）は、抗ＣＤ３およびいくつかの濃度の４−１ＢＢ抗体でのヒトＴ細胞の刺激７２時間後の、細胞培地に存在するヒトＩＬ−２濃度を示す線グラフである。各パネル（ＡおよびＢ）は個々のドナーを示す。 図４は、４−１ＢＢ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂで治療されているマウスにおけるヒト末梢血単核細胞の拡大を示す散布図である。第０日に６００万のヒト末梢血単核細胞を注射され、そして第９日に１ｍｇ／ｋｇの４−１ＢＢ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを注射された、研究日第２４〜２８日の個々のＮＳＧマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５を発現する細胞の割合として、データを表す。両側マン・ホイットニー検定を用いて、統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。ＨＢＰＴなしは、ヒト細胞を注射されなかった動物を指す。 図５は、カニクイザルにおける４−１ＢＢ ｍＡｂ投与後のいくつかの時点で、増殖中のＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞における変化を示す２つの棒グラフである。（用量レベル−動物番号）として個々の動物に相当する棒としてデータを示し、そして研究前の数に対するＫｉ−６７＋細胞数の動物内変化として表す｛［（示す研究日のＫｉ−６７＋細胞数−投薬前のＫｉ−６７＋細胞数）／投薬前のＫｉ−６７＋細胞数］＊１００｝。ＣＤ８セントラルメモリー細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２８＋およびＣＤ９５＋として同定された。 図６は、研究第０日に、腫瘍細胞（ＰＣ３、左パネル； ＬＯＶＯ、右パネル）およびヒト末梢血単核細胞を皮下注射した腫瘍の増殖を示す線グラフである。第０日に、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの示す４−１ＢＢ ｍＡｂを注射した。 左パネルは、４−１ＢＢ ｍＡｂまたはビヒクル対照での４−１ＢＢノックインマウスの治療後に、Ｔ細胞表面マーカーＣＤ８＋に関して陽性であり、そしてまたＢｒｄＵヌクレオシド類似体を取り込んでいる、ＰＢＭＣの割合を示す散布図である。右パネルは、４−１ＢＢノックインマウス内に皮下注射され、そして示す濃度の４−１ＢＢ ｍＡｂで治療されたネズミ黒色腫腫瘍の増殖を示す線グラフである。 図８は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＣＤＲを下線で示す）と、対応する生殖系列配列のアミノ酸配列の整列を示す。
Ａ．定義
本明細書に別に定義しない限り、本開示と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、背景によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いられる用語、ならびにこれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。
本明細書において、以下の用語は各々、このセクションで関連づけられる意味を有する。
用語「４−１ＢＢ抗体」は、本明細書に定義するとおりの、ヒト４−１ＢＢ受容体に結合可能な抗体を指す。
用語「４−１ＢＢ」および「４−１ＢＢ受容体」は、本出願において、交換可能に用いられ、そしてヒト４−１ＢＢ受容体、ならびにその変異体、アイソフォーム、および種相同体を含む。したがって、結合分子は、本明細書に定義し、そして開示するように、ヒト以外の種由来の４−１ＢＢに結合してもよい。他の場合、結合分子は、ヒト４−１ＢＢに完全に特異的であり、そして種または他のタイプの交差反応性を示してはならない。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、該冠詞の文法的対象の１または１より多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例えば、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素または１より多い要素を意味する。
用語「アゴニスト」は、本明細書に定義するように、４−１ＢＢに結合した際、（１）４−１ＢＢを刺激するかまたは活性化するか、（２）４−１ＢＢの活性、機能、または存在を増進するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、または延長させるか、あるいは（３）４−１ＢＢの発現を増進するか、増加させるか、促進するか、または誘導する、結合分子を指す。
用語「アミノ酸」は、天然存在および合成アミノ酸、ならびに天然存在アミノ酸と同様に機能する、アミノ酸類似体およびアミノ酸擬似体を指す。天然存在アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾されているアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。用語「アミノ酸類似体」は、天然存在アミノ酸と同じ基本的化学構造を有するが、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、または側鎖官能基が別の官能基に化学的に修飾されている、化合物を指す。用語「アミノ酸擬似体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然存在アミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
用語「抗体」は、当該技術分野に認識される用語であり、そして２つの同一の重（Ｈ）鎖および２つの同一の軽（Ｌ）鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有する抗原結合タンパク質（すなわち免疫グロブリン）を指す。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて、１またはそれより多いジスルフィド結合によって互いに連結される。各重鎖は、Ｎ末端に、可変領域（本明細書において、ＶＨと略する）を、その後に定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、Ｎ末端に、可変領域（本明細書において、ＶＬと略する）を、その後、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＬは、ＶＨと整列し、そしてＣＬは、重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。ＶＨおよびＶＬは一緒に対形成して、単一の抗原結合部位を形成する。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的ヘテロ四量体単位とともに、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドからなり、そしてしたがって、１０の抗原結合部位を含有する一方、分泌ＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖とともに２〜５の基本的４鎖単位を含む、多価集合体を形成することも可能である。
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに分けられうる。どちらも当業者に周知であるＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付け系を用いて、ＣＤＲ領域を決定してもよい。例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２； ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい。ＶＨおよびＶＬは各々、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順で配置される： ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示全体で、重鎖の３つのＣＤＲは、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３と称される。同様に、軽鎖の３つのＣＤＲは、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３と称される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一の構成要素（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介しうる。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２またはそれより多いアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０またはそれより多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ， Ｗ．監修， 第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州（１９８９））を参照されたい。
いかなる脊椎動物種由来のＬ鎖も、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと称される、２つの明らかに別個のタイプの一方に割り当て可能である。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、抗体は、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当て可能である。それぞれ、α（アルファ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、γ（ガンマ）、およびμ（ミュー）と称される重鎖を有する、５つのクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがある。抗体のＩｇＧクラスは、それぞれ、ガンマ重鎖、Ｙ１〜Ｙ４によって、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４にさらに分類可能である。
用語「抗体誘導体」または抗体の「誘導体」は、抗体が結合するのと同じ抗原（例えば４−１ＢＢ）に結合可能であり、そしてさらなる分子実体に連結された抗体のアミノ酸配列を含む、分子を指す。抗体誘導体中に含有される抗体のアミノ酸配列は、抗体の全長重鎖、全長軽鎖、全長重鎖の任意の単数または複数の部分、全長軽鎖の任意の単数または複数の部分、抗体の任意の他の断片（単数または複数）、あるいは完全抗体であってもよい。さらなる分子実体は、化学的または生物学的分子であってもよい。さらなる分子実体の例には、化学基、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば酵素、抗体）、および化学的化合物が含まれる。さらなる分子実体は、任意の有用性、例えば検出剤、標識、マーカー、薬学的剤または療法剤として使用するための有用性を有してもよい。抗体のアミノ酸配列は、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合、またはその他のものによってさらなる分子実体に付着しているかまたは連結されていてもよい。用語「抗体誘導体」はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびに４−１ＢＢ抗体のアミノ酸配列の修飾、例えば保存的アミノ酸置換、付加、および挿入に由来する分子も含む。
用語、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」は、抗体が結合する抗原（例えば４−１ＢＢ）に結合する能力を保持する、抗体の１またはそれより多い部分を指す。抗体の「抗原結合断片」の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９））；ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
用語「結合分子」は、各々、本明細書に定義するとおりの、（１）抗体、（２）抗体の抗原結合断片、および（３）抗体誘導体を含む。
用語「４−１ＢＢに結合」、「４−１ＢＢと結合する」、「４−１ＢＢへの結合」、または「４−１ＢＢに結合する」は、５００ｎＭまたはそれ未満のアフィニティ（ＫＤ）での、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば実施例６に記載するようなＢＩＡｃｏｒｅにおける、本明細書に定義するとおりの結合分子のヒト４−１ＢＢへの結合を指す。
用語「キメラ抗体」は、異なる動物種由来のアミノ酸配列を含む抗体、例えばヒト抗体由来の可変領域およびネズミ免疫グロブリン定常領域を有するものを指す。
用語「結合に関して競合する」は、結合ターゲットへの結合における２つの抗体の相互作用を指す。第一の抗体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）エピトープとの結合が、第二の抗体の非存在下での第一の抗体の結合に比較して、第二の抗体の存在下で検出可能に減少している場合、第一の抗体は、第二の抗体と、結合に関して競合する。反対に、エピトープへの第二の抗体の結合もまた、第一の抗体の存在下で検出可能に減少することもまたあってもよいが、そうである必要はない。すなわち、第二の抗体が第一の抗体のそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第一の抗体が、第二の抗体のそのエピトープへの結合を阻害してもよい。しかし、各抗体が、その同族エピトープと他の抗体の結合を、同じ度合いに、より高いまたは低い度合いでのいずれかで、検出可能に阻害する場合、抗体は、それぞれのエピトープ（単数または複数）の結合に関して、互いと「交差競合する」と言われる。
用語「エピトープ」は、抗体（またはその抗原結合断片）が結合する抗原の部分を指す。エピトープは、隣接アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非隣接アミノ酸の両方から形成可能である。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に際して保持される一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理に際して失われる。エピトープには、ユニークな空間コンホメーションの多様な数のアミノ酸が含まれうる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ監修， Ｖｏｌ． ６６， Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９６）を参照されたい。ひとたび、抗原上の望ましいエピトープが決定されたら、そのエピトープに対する抗体を、例えば本明細書記載の技術を用いて、生成してもよい。抗体の生成および性質決定はまた、望ましいエピトープに関する情報を解明しうる。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合に関して、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体、すなわち抗原への結合に関して競合する抗体を発見する交差競合研究を実行することである。交差競合に基づいて、抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスが、ＰＣＴ公報第ＷＯ ０３/４８７３１号に記載される。
用語「生殖系列」は、生殖細胞を通じて、親から子孫へ引き継がれるような抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を指す。生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟経過中の組換えおよび高頻度変異事象によって改変されている、成熟Ｂ細胞中の抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別される。
用語「グリコシル化部位」は、糖残基の付着のための位置として、真核細胞によって認識されるアミノ酸残基を指す。炭水化物、例えばオリゴ糖が付着しているアミノ酸は、典型的にはアスパラギン（Ｎ連結）、セリン（Ｏ連結）、およびスレオニン（Ｏ連結）残基である。付着の特定の部位は、典型的には、「グリコシル化部位配列」と本明細書に称されるアミノ酸配列によって示される。Ｎ連結グリコシル化のためのグリコシル化部位配列は：−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−または−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−であり、式中、Ｘは、プロリン以外の任意の慣用的アミノ酸であってもよい。用語「Ｎ連結」および「Ｏ連結」は、糖分子およびアミノ酸残基間の付着部位として働く化学基を指す。Ｎ連結糖は、アミノ基を通じて付着し；Ｏ連結糖は、ヒドロキシル基を通じて付着する。用語「グリカン占有」は、グリコシル化部位に連結された炭水化物部分の存在を指す（すなわちグリカン部位が占有されている）。ポリペプチド上の少なくとも２つの潜在的なグリコシル化部位がある場合、部位のいずれも占有されないか（０グリカン部位占有）、１つ（１グリカン部位占有）または両方（２グリカン部位占有）の部位が炭水化物部分によって占有されてもよい。
用語「宿主細胞」は、関心対象のタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを生成するよう操作可能な細胞系を指す。宿主細胞には、限定なしに、培養細胞、例えばげっ歯類（ラット、マウス、モルモット、またはハムスター）由来の哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０；あるいはヒト組織またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞、ならびにトランスジェニック動物または培養組織内に含まれる細胞が含まれる。該用語は、特定の対象細胞だけでなく、こうした細胞の子孫もまた含む。突然変異または環境の影響のいずれかのために、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は親細胞と同一でない可能性もあるが、なお用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
用語「ヒト抗体」は、軽鎖および重鎖の全アミノ酸配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子由来である抗体を指す。ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される場合、ネズミ炭水化物鎖を含有してもよい。ヒト抗体は、当該技術分野に知られる多様な方法で調製可能である。
用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体配列由来のアミノ酸残基を含有するキメラ抗体を指す。ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体由来のいくつかまたはすべてのＣＤＲを含有してもよい一方、抗体のフレームワークおよび定常領域は、ヒト抗体配列由来のアミノ酸残基を含有する。
用語「例示的抗体」は、本開示中に記載され、そしてＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ ７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、およびＭＯＲ−７４８３．２と称される抗体の任意の１つを指す。これらの抗体は、いかなるクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）であってもよい。したがって、上に同定する各抗体は、ＶＬおよびＶＨ領域に関して同じアミノ酸配列を有する、すべての５つのクラスの抗体を含む。さらに、ＩｇＧクラスの抗体は、いかなるサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）であってもよい。したがって、上で同定するＩｇＧサブクラスの各抗体は、ＶＬおよびＶＨ領域に関して同じアミノ酸配列を有する、すべての４つのサブクラスの抗体を含む。５つのクラス、ならびに４つのＩｇＧサブクラスのヒト抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、当該技術分野に知られる。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６９および７１に提供される。例示的抗体各々のＩｇＧ２サブクラスに関する全長重鎖のアミノ酸配列を本開示中に提供する。
用語「単離抗体」または「単離結合分子」は：（１）天然状態で付随する天然会合構成要素と会合していないか；（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まないか；（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか；または（４）天然に存在しない、本明細書に定義するような抗体または結合分子を指す。単離抗体の例には、４−１ＢＢを用いてアフィニティ精製されている４−１ＢＢ抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されている４−１ＢＢ抗体、およびトランスジェニック動物由来の４−１ＢＢ抗体が含まれる。
用語「単離核酸」は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されている、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源の核酸分子、あるいはその組み合わせを指す。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、用語「単離」には、ゲノムＤＮＡが天然に会合している染色体から分離されている核酸分子が含まれる。好ましくは、「単離」核酸は、核酸に天然に隣接している配列（すなわち、関心対象の核酸の５’および３’端に位置する配列）を含まない。
用語「ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指し、一方、用語「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。
用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。これは、ｋｄ対ｋａの比（すなわちｋｄ／ｋａ）から得られ、そしてモル濃度（Ｍ）で表される。ＫＤは、結合パートナーへの抗体の結合のアフィニティに関する測定値として用いられる。ＫＤがより小さければ、抗体がより緊密に結合しているか、または抗体および抗原の間のアフィニティがより高い。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）解離定数を持つ抗体は、マイクロモル濃度（μＭ）解離定数を持つ抗体よりも、特定の抗原により緊密に結合する。抗体に関するＫＤ値は、当該技術分野においてよく確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）系などのバイオセンサー系を用いて、表面プラズモン共鳴を用いることによる。ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ系を用いたアッセイ法（ＢＩＡｃｏｒｅ）を、本開示の実施例セクションに記載する。
用語「哺乳動物」は、哺乳綱（Ｍａｍｍａｌｉａ）の任意の動物種を指す。哺乳類の例には：ヒト；実験動物、例えばラット、マウス、サル（ｓｉｍｉａｎ）およびモルモット；家畜、例えばネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびブタ；ならびに捕獲野生動物、例えばライオン、トラ、ゾウ等が含まれる。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち少量で存在しうるありうる天然存在突然変異以外は、集団を構成する個々の抗体が同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。この特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずに合成可能である点で好適である。修飾語句「モノクローナル」は、いかなる特定の方法による抗体産生を必要とするとも見なされないものとする。例えば、ハイブリドーマ方法論によってモノクローナル抗体を調製してもよいし、あるいは、細菌、真核動物または植物細胞において、組換えＤＮＡ法を用いて作製してもよい（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからモノクローナル抗体を単離してもよい。
哺乳動物における特定の疾患状態に関して、用語「防止（予防）する」または「防止（予防）すること」は、疾患の開始を防止するかまたは遅延させ、あるいはその臨床的または無症候性症状の顕在化を防止することを指す。
用語「組換え抗体」は、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離される抗体、例えば別の種の免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物から単離される抗体、宿主細胞内にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、あるいは他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離される抗体を指す。
本明細書において、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。既知のコンピュータプログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴを用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列同一性を慣用的に決定することも可能である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６３−９８（１９９０）； Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３２：１８５−２１９（２０００）； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照されたい）。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が参照アミノ酸配列に、例えば９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一性パーセントが参照アミノ酸配列の全長に渡って計算され、そして参照配列中のアミノ酸残基の総数の最大５％までの相同性におけるギャップが許されるように、パラメータを設定する。ポリペプチド間で同一性パーセントを決定する際のこの前述の方法は、本明細書に開示するすべてのタンパク質、その断片、または変異体に適用可能である。
本明細書に定義するとおりの結合分子（例えば抗体）とその結合パートナー（例えば抗原）の相互作用に関して、用語「と特異的に結合する」または「に特異的に結合する」は、結合分子が、所定の条件セット下で、動物種由来の関心対象の抗原および異なる動物種由来の抗原オルソログの間を区別する能力を指す。４−１ＢＢ結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定される、ラットまたはマウスの４−１ＢＢに結合するＥＣ５０の５０パーセント未満であるＥＣ５０で、ヒト４−１ＢＢに結合する場合、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合すると言われる。当該技術分野に知られる方法を用いて、抗体の結合特異性を決定することも可能である。こうした方法の例には、ＰＨＡ刺激初代細胞を用いるＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンが含まれる。
本明細書に定義するとおりの結合分子（例えば抗体）とその結合パートナー（例えば抗原）の相互作用に関して、用語「と選択的に結合する」または「に選択的に結合する」は、結合分子が、所定の条件セット下で、動物種由来の関心対象の抗原（例えばヒト４−１ＢＢ）および同じ動物種由来の異なる抗原（例えばヒトＣＤ４０）の間を区別する能力を指す。４−１ＢＢ結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定されるような、ヒトＣＤ４０またはヒトＣＤ１３４に結合するＥＣ５０の１０パーセント未満であるＥＣ５０で、ヒト４−１ＢＢに結合する場合、ヒト４−１ＢＢに選択的に結合すると言われる。
用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、哺乳動物における特定の疾患状態に関して、疾患状態を有する哺乳動物における望ましいまたは有益な影響を引き起こすことを指す。望ましいまたは有益な影響には、疾患の１またはそれより多い症状（すなわち腫瘍増殖および／または転移、あるいは免疫細胞の数および／または活性によって仲介される他の影響等）の頻度または重症度の減少、あるいは疾患、状態、または障害のさらなる発展の抑止または阻害が含まれうる。哺乳動物において癌を治療する背景において、望ましいまたは有益な影響には、癌細胞のさらなる増殖または蔓延の阻害、癌細胞の死、癌の再発の阻害、癌と関連する疼痛の減少、または哺乳動物の生存改善が含まれうる。影響は、主観的であってもまたは客観的であってもいずれでもよい。例えば、哺乳動物がヒトである場合、ヒトは、改善または療法に対する反応の主観的な症状として、気力または活力の改善、あるいは疼痛の減少に気付きうる。あるいは、臨床医は、健康診断、臨床検査値、腫瘍マーカーまたはＸ線写真所見に基づいて、腫瘍サイズまたは腫瘍負荷の減少に気付きうる。治療への反応に関して、臨床医が観察しうるいくつかの実験室徴候には、試験の標準化、例えば白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度、および多様な酵素レベルが含まれる。さらに、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察しうる。あるいは、他の試験、例えば超音波画像、核磁気共鳴試験および陽電子放出試験を用いて、客観的な改善を評価してもよい。
用語「ベクター」は、外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）核酸分子を輸送可能な核酸分子を指す。外来の核酸分子は、組換え技術、例えば連結または組換えによって、ベクター核酸分子に連結される。これによって、外来核酸分子が、増加し、選択され、さらに操作され、あるいは宿主細胞または生物において発現されることが可能になる。ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、またはビリオンであってもよい。１つのタイプのベクターは、宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そしてそれによって、宿主ゲノムと一緒に複製される（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。別のタイプのベクターは、導入された宿主細胞において、自律的複製が可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。機能可能であるように連結されている、発現可能外来核酸の発現を指示可能なベクターの別の特定のタイプは、一般的に、「発現ベクター」と称される。発現ベクターは、一般的に、発現可能外来核酸の発現を駆動する対照配列を有する。「転写ベクター」として知られる、より単純なベクターは、転写のみが可能であり、翻訳は可能ではない：これらは、ターゲット細胞において複製可能であるが、発現はされない。用語「ベクター」は、その機能に関わらず、すべてのタイプのベクターを含む。機能可能であるように連結された発現可能核酸の発現を指示可能なベクターは、一般的に、「発現ベクター」と称される。
本開示の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の方法にしたがって、そして多様な一般的な、およびより特異的な、本明細書全体で引用され、そして論じられる参考文献に記載されるように、実行される。こうした参考文献には、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（２００２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）が含まれる。製造者の規格にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、酵素反応および精製技術を行う。本明細書記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いられる専門用語、ならびにこうした化学の実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いる。
本明細書において、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は、慣用的な用法にしたがう。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版， Ｅ．Ｓ． ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ． Ｇｒｅｎ監修， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１））を参照されたい。
Ｂ．ヒト４−１ＢＢに結合する結合分子
本開示は、４−１ＢＢ抗体、４−１ＢＢ抗体の抗原結合断片、および４−１ＢＢ抗体の誘導体を含む、ヒト４−１ＢＢに結合する単離結合分子を提供する。
Ｂ−１． ４−１ＢＢ抗体
いくつかの側面において、本開示は、配列番号６８のアミノ酸残基１１５〜１５６内のエピトープで、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供する。いくつかの態様において、単離抗体は、配列番号２９のＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３０のＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３１のＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。いくつかの他の態様において、単離抗体は、配列番号３４のＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３５のＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。いくつかの他の態様において、上記の本明細書記載の抗体は、本明細書の以下に記載する１またはそれより多い生物学的特性を有する。
他の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：（ａ）配列番号１、配列番号１５、または配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２、配列番号１６、または配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号３、配列番号１７、または配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む。
別の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：（ａ）配列番号６、配列番号２０、または配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７、配列番号２１、または配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８、配列番号２２、配列番号３６、または配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む。
さらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：（ａ）配列番号１、配列番号１５、または配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２、配列番号１６、または配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３、配列番号１７、または配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含み；そして：（ｄ）配列番号６、配列番号２０、または配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７、配列番号２１、または配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号８、配列番号２２、配列番号３６、または配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：
（ａ）配列番号１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号２に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号３に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む抗体；
（ｂ）配列番号１５に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号１７に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む抗体；ならびに
（ｃ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、および配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３を含む抗体
からなる群より選択される。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：
（ａ）配列番号６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号７に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号８に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；
（ｂ）配列番号２０に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号２１に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号２２に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；
（ｃ）配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号３６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；ならびに
（ｄ）配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体
からなる群より選択される。
いくつかのさらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：
（ａ）配列番号１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号２に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号７に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号８に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；
（ｂ）配列番号１５に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号１７に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号２０に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号２１に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号２２に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；
（ｃ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号３６に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体；ならびに
（ｄ）配列番号２９に示すとおりのＨ−ＣＤＲ１、配列番号３０に示すとおりのＨ−ＣＤＲ２、配列番号３１に示すとおりのＨ−ＣＤＲ３；配列番号３４に示すとおりのＬ−ＣＤＲ１、配列番号３５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ２、および配列番号５５に示すとおりのＬ−ＣＤＲ３を含む抗体
からなる群より選択される。
さらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は、配列番号４、配列番号１８、配列番号３２、または配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列を含む。
さらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は、配列番号９、配列番号２３、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ領域アミノ酸配列を含む。
さらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は、（１）配列番号４、配列番号１８、配列番号３２、または配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列、ならびに（２）配列番号９、配列番号２３、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む。
さらなる側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに結合する単離抗体を提供し、前記抗体は：
（ａ）配列番号４に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号９に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ｂ）配列番号１８に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号２３に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ｃ）配列番号３２に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号３７または配列番号５６に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体；ならびに
（ｄ）配列番号４３に示すとおりのＶＨ鎖アミノ酸配列および配列番号４５、配列番号５１、配列番号６０、または配列番号６４に示すとおりのＶＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体
からなる群より選択される。
いくつかの態様において、本明細書において上に記載する抗体は、エピトープ結合に関連して記載する抗体およびＣＤＲまたは可変領域の特定のアミノ酸配列に関連して記載する抗体を含めて、以下の機能特性の少なくとも１つを有する：（ａ）ヒト４−１ＢＢに、５００ｎＭまたはそれ未満のＫＤで結合する；（ｂ）ヒト４−１ＢＢに対してアゴニスト活性を有する；（ｃ）ヒトＣＤ４０受容体に、１０００ｎＭまでの濃度で結合しない；（ｄ）ヒトＣＤ１３４受容体に、１０００ｎＭまでの濃度で結合しない；（ｅ）ラットまたはマウス４−１ＢＢに１００ｎＭまでの濃度で結合しない；（ｈ）腫瘍細胞増殖を阻害可能である；および（ｉ）癌に対して療法的効果を有する。いくつかのさらなる態様において、該抗体は、本開示に記載するＢＩＡＣｏｒｅアッセイで測定した際、ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインに対して、５００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、あるいは１ｎＭまたはそれ未満のＫＤで、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する。さらにさらなる態様において、該抗体は、本開示に記載するＢＩＡＣｏｒｅアッセイで測定した際、ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインに対して、５００ｎＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、５ｎＭまたはそれ未満、あるいは１ｎＭまたはそれ未満のＫＤで、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、ヒト抗体またはヒト化抗体である。いくつかのさらなる態様において、該抗体は、ヒト４−１ＢＢに特異的にそして選択的に結合するヒト抗体である。
他の態様において、本明細書において上に記載する抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含み、例えば、ヒトＶＨ １−６９遺伝子、ＶＨ ３−２３遺伝子、またはＶＨ ５遺伝子の産物であるか、またはこれらに由来する重鎖可変領域を含む。例示的な抗体には、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ−７４８３．１、およびＭＯＲ−７４８３．２が含まれ、各々は、ヒト生殖系列ＶＨ５遺伝子由来のアミノ酸を含有する。
さらに他の態様において、本明細書において上に記載する抗体は、ヒトＶＬ λ３遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。さらに他の態様において、本明細書において上に記載する抗体は、ヒトＶＨ １−６９遺伝子、ＶＨ ３−２３遺伝子、またはＶＨ ５遺伝子の産物であるか、またはこれらに由来する重鎖可変領域を含み、そしてさらに、ヒトＶＬ λ３遺伝子の産物であるか、またはこれに由来する軽鎖可変領域を含み、抗体またはその部分は、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する。例示的な抗体には、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ−７４８３．１、およびＭＯＲ−７４８３．２が含まれ、各々は、ヒト生殖系列ＶＨ５遺伝子およびＶＬ λ３遺伝子由来のアミノ酸を含有する。
本明細書において、ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られるならば、特定の生殖系列配列に「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。こうした系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を所持するトランスジェニックマウスを、関心対象の抗原で免疫するか、またはファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを関心対象の抗原でスクリーニングする工程を含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列に比較し、そして配列がヒト抗体の配列に最も近い（すなわち最大％同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、こうしたものとして同定可能である。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、例えば天然存在体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入によって、生殖系列配列と比較した際、アミノ酸相違を含有してもよい。しかし、選択されるヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、そして他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばネズミ生殖系列配列）と比較した際に、ヒト抗体をヒトと同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。特定の場合、ヒト抗体は、生殖系列Ｉｇ遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が同一である。典型的には、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、１０アミノ酸より多い相違を示さないであろう。特定の場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、５アミノ酸より多い相違、あるいはさらに４、３、２、または１アミノ酸より多い相違は示さないであろう。例示的抗体の可変領域のアミノ酸配列および相当する生殖系列の整列を、図６に提供する。
別の側面において、本開示は、ヒト４−１ＢＢへの結合に関して、本開示の任意の例示的抗体、例えばＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ ７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、またはＭＯＲ−７４８３．２と、競合するかまたは交差競合する単離抗体を提供する。特定の態様において、本開示は、本開示の任意の例示的抗体と、ヒト４−１ＢＢ上の同じエピトープへの結合に関して、競合するかまたは交差競合する単離抗体を提供する。抗体が、別の抗体との結合に関して競合するかまたは交差競合する能力は、当該技術分野に知られる標準的結合アッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを用いて、決定可能である。例えば、本開示の例示的抗体が、飽和条件下でヒト４−１ＢＢに結合することを可能にし、そして次いで、試験抗体が４−１ＢＢに結合する能力を測定することも可能である。試験抗体が、例示的抗体と同時に４−１ＢＢに結合可能であれば、試験抗体は、例示抗体と異なるエピトープに結合する。しかし、試験抗体が、同時に４−１ＢＢに結合することが不可能であれば、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または例示抗体が結合するエピトープに非常に近接したエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳまたは表面プラズモン共鳴などの多様な方法を用いて実行可能である。
本明細書記載の４−１ＢＢ抗体は、任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤであってもよい。４−１ＢＢ抗体が、ＩｇＧクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、より好ましくはＩｇＧ２サブクラスである。４−１ＢＢ抗体は、当該技術分野に知られる方法を用いて、１つのクラスまたはサブクラスから、別のクラスまたはサブクラスに変換可能である。望ましいクラスまたはサブクラスの抗体を産生するための例示的な方法は、４−１ＢＢ抗体の重鎖をコードする核酸および４−１ＢＢ抗体の軽鎖をコードする核酸を単離し、ＶＨ領域をコードする配列を単離し、ＶＨ配列を、望ましいクラスまたはサブクラスの重鎖定常領域をコードする配列に連結し、軽鎖遺伝子および重鎖構築物を細胞において発現させ、そして４−１ＢＢ抗体を収集する工程を含む。
さらに、本開示が提供する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることも可能であるが、好ましくはモノクローナルである。
本開示が提供する特定の単離抗体の例には、以下の例示的抗体が含まれる：ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ−７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、およびＭＯＲ−７４８３．２。重鎖可変領域、ＩｇＧ２サブクラスの全長重鎖、軽鎖可変領域、およびこれらの抗体の全長軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を本開示に提供する；これらの配列の配列番号のインデックスを表１に提供する。これらの例示的抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を表２に示す。
表１．配列番号のインデックス
Figure 2013544756
表２．ＣＤＲのアミノ酸配列
Figure 2013544756
本開示の抗体は、慣用的なモノクローナル抗体方法論、例えば、本明細書に以下に詳細に記載する、標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）を参照されたい）、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、あるいは組換え抗体技術を含む、当該技術分野に知られる技術によって産生可能である。
ハイブリドーマ産生は、非常によく確立された方法である。ハイブリドーマを調製するための一般的な動物系は、ネズミ系である。免疫プロトコル、および融合のために免疫脾臓細胞を単離するための技術は、当該技術分野に知られる。融合パートナー（例えばネズミ骨髄腫細胞）および融合法もまた知られる。本開示が提供するヒト４−１ＢＢ抗体を作製するために使用可能な１つの周知の方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ動物系の使用を伴う。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の巨大断片を含み、そしてマウス抗体産生ができない、操作されたマウス株である。例えば、Ｇｒｅｅｎら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）およびＷＯ２００３／０４０１７０を参照されたい。該動物を４−１ＢＢ抗原で免疫する。４−１ＢＢ抗原は単離され、そして／または精製された４−１ＢＢ、好ましくは４−１ＢＢである。該抗原は、４−１ＢＢの断片、例えば４−１ＢＢの細胞外ドメイン、特に配列番号６８のアミノ酸残基１１５〜１５６を含む４−１ＢＢ細胞外ドメイン断片であってもよい。当該技術分野に知られる任意の方法によって、動物の免疫を行ってもよい。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９９０を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、およびウマなどの非ヒト動物を免疫するための方法が、当該技術分野に周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、および米国特許第５，９９４，６１９号を参照されたい。４−１ＢＢ抗原をアジュバントとともに投与して、免疫反応を刺激してもよい。例示的なアジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。４−１ＢＢ抗原で動物を免疫した後、免疫動物から単離した細胞より、抗体を産生する不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を屠殺し、そしてリンパ節および／または脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法には、限定されるわけではないが、癌遺伝子でトランスフェクションする（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）方法、腫瘍ウイルスにこれらを感染させ（ｉｎｆｌｅｃｔｉｎｇ）、不死化細胞を選択する条件下で培養する方法、発癌性または突然変異誘発化合物にこれらを供する方法、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合させる方法、および腫瘍抑制遺伝子を不活性化する方法が含まれる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。骨髄腫細胞との融合を用いる場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。４−１ＢＢ、その一部、または４−１ＢＢを発現している細胞を用いて、不死化細胞をスクリーニングする。以下にさらに論じるように、４−１ＢＢ抗体産生細胞、例えばハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして頑強な増殖、高い抗体産生および望ましい特性を含む、望ましい抗体特性に関してさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｖｏで同系動物において、免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスにおいて、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養において、拡大可能である。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして拡大する方法は、一般の当業者に周知である。
また、ファージディスプレイ法を用いて、本開示の抗体を調製してもよい。ヒト抗体を単離するためのこうしたファージディスプレイ法、例えば実施例１にさらに記載するようなＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリーが、当該技術分野において確立されている。また、例えば：Ａｃｈｉｍ Ｋｎａｐｐｉｋら： Ｆｕｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ） Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ａｎｄ ＣＤＲｓ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０００）２９６， ５７−８６を参照されたい。
Ｂ−２．抗原結合断片
いくつかの他の側面において、本開示は、本開示が提供する任意の４−１ＢＢ抗体の抗原結合断片を提供する。
抗原結合断片は、抗体の任意の配列を含んでもよい。いくつかの態様において、抗原結合断片は：（１）４−１ＢＢ抗体の軽鎖；（２）４−１ＢＢ抗体の重鎖；（３）４−１ＢＢ抗体の軽鎖由来の可変領域；（４）４−１ＢＢ抗体の重鎖由来の可変領域；（５）４−１ＢＢ抗体の１またはそれより多いＣＤＲ（２、３、４、５、または６のＣＤＲ）；あるいは（６）４−１ＢＢ抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
いくつかの特定の態様において、本開示は：ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ ７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１、またはＭＯＲ−７４８３．２より選択される抗体の抗原結合断片を提供する。
いくつかの他の特定の態様において、４−１ＢＢ抗体の抗原結合断片には：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら， （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離ＣＤＲ；および（ｖｉｉ）抗体のＶＨ領域に連結された抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドである、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。Ｂｉｒｄら， （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら， （１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３。
いくつかの特定の態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ−６０３２、Ｆａｂ−７３６１、Ｆａｂ−７４８０、およびＦａｂ−７４８３からなる群より選択されるＦａｂ断片である。
Ｂ−３．抗体誘導体
いくつかのさらなる側面において、本開示は、本開示が提供する任意の４−１ＢＢ抗体の誘導体を提供する。
１つの側面において、抗体誘導体は、親抗体アミノ酸配列の全体の分子構造を保存しつつ、本開示の例示的抗体（「親抗体」）のアミノ酸配列の修飾から得られる。親抗体鎖の任意の領域、例えばフレームワーク領域、ＣＤＲ領域、または定常領域のアミノ酸配列を修飾してもよい。修飾のタイプには、親抗体の１またはそれより多いアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはその組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、抗体誘導体は、配列番号４、１８、３２、または４３のいずれかに示すとおりのアミノ酸配列に、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＶＨ領域を含む。いくつかの他の態様において、抗体誘導体は、配列番号９、２３、３７、４５、５１、５６、６０、または６４のいずれかに示すとおりのアミノ酸配列に、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＶＬ領域を含む。いくつかの特定の態様において、該誘導体は、配列番号４、１８、３２、４３、９、２３、３７、４５、５１、５６、６０、または６４のいずれかに示すとおりのアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の保存的または非保存的置換、ならびに／あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の付加および／または欠失を含む。
アミノ酸置換は、保存的置換および非保存的置換の両方を含む。用語「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸の別のアミノ酸での置換を意味し、ここで、２つのアミノ酸は、関与する残基の特定の物理化学特性、例えば極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性において、類似性を有する。例えば、置換は、典型的には、以下の群の各々の中で実行可能である：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニン；（ｂ）極性中性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、およびヒスチジン；ならびに（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸。
修飾は、ＣＤＲ、フレームワーク領域、または定常領域を含む、抗体のアミノ酸配列の任意の位置で作製可能である。１つの態様において、本開示は、本開示の例示的抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含有する抗体誘導体を提供するが、なお、例示的抗体のものとは異なるフレームワーク配列を含有する。こうしたフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む、公的ＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に、または「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに見出されうる（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２（１９９１）； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ｍ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６−７９８（１９９２）；およびＣｏｘ， Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７−８３６（１９９４））。抗体誘導体を構築する際に使用可能なフレームワーク配列には、本開示の例示的抗体によって用いられるフレームワーク配列と構造的に類似の、例えば本開示の例示的抗体によって用いられるＶＨ ３−２３フレームワーク配列および／またはＶＬ λ３またはλ１−１３フレームワーク配列に類似のものが含まれる。例えば、例示的抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３配列、ならびにＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中で見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域内に移植してもよいし、あるいはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較した際、１またはそれより多い突然変異を含有するフレームワーク領域上に移植してもよい。
特定の態様において、抗体誘導体は、本開示の例示的抗体のアミノ酸配列を含む、キメラ抗体である。１つの例において、１またはそれより多い例示的ヒト抗体由来の１またはそれより多いＣＤＲを、非ヒト動物、例えばマウスまたはラット由来の抗体由来のＣＤＲと組み合わせる。別の例において、キメラ抗体のすべてのＣＤＲは、１またはそれより多い例示的抗体に由来する。いくつかの特定の態様において、キメラ抗体は、例示的抗体の重鎖可変領域由来の、または軽鎖可変領域由来の、１、２、または３のＣＤＲを含む。当該技術分野に知られる慣用法を用いて、キメラ抗体を生成してもよい。
別のタイプの修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発を行って、突然変異（単数または複数）を導入し、そして抗体結合に対する影響、または関心対象の他の機能特性を、当該技術分野に知られるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価してもよい。典型的には、保存的置換を導入する。突然変異は、アミノ酸付加および／または欠失であってもよい。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基を超えない残基が改変される。いくつかの態様において、抗体誘導体は、Ｈ−ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲ中の１、２、３、または４アミノ酸置換を含む。別の態様において、アミノ酸置換は、抗体において、１またはそれより多いシステインを、別の残基、例えば限定なしにアラニンまたはセリンに変化させる。システインは、標準的または非標準的システインであってもよい。１つの態様において、抗体誘導体は、例示的抗体のアミノ酸配列に比較して、Ｈ−ＣＤＲ領域において、１、２、３、または４つの保存的アミノ酸置換を有する。
また、ＶＨおよび／またはＶＬ領域内のフレームワーク残基に対して修飾を行ってもよい。典型的には、こうしたフレームワーク変異体を作製して、抗体の免疫原性を減少させる。１つのアプローチは、１またはそれより多いフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「バック突然変異させる（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。抗体が由来する生殖系列配列に、抗体フレームワーク配列を比較することによって、こうした残基を同定してもよい。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すため、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「バック突然変異させ」てもよい。本開示の例示的抗体のいくつかは、実施例６にさらに記載するように、特定の生殖系列配列へのこうした「バック突然変異」を経た。
さらに、例示的抗体のＦｃ領域内で、典型的には抗体の１またはそれより多い機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害性を改変する、修飾を行ってもよい。１つの例において、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変する、例えば増加させるかまたは減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するか、あるいは抗体の安定性を増加させるかまたは減少させるように改変される。別の場合において、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。
さらに、本開示の抗体を修飾して、潜在的なグリコシル化部位またはパターンを改変してもよい。例示的抗体ＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３の両方、ならびにその任意の生殖系列変異体、ならびにＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体は、重鎖可変ドメインのアスパラギン５９に、潜在的なＮ連結グリコシル化部位（ＮＹＳ）を含む。これらの抗体のＩｇＧ型は、さらに、重鎖Ｆｃドメインに第二のＮ連結グリコシル化部位を含む。より具体的には、これらの抗体のＩｇＧ２型に関して、Ｆｃ Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＳＴ）は、重鎖ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９２に存在する。したがって、各重鎖は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体が０グリカン占有（すなわち４つの潜在的なグリコシル化部位のいずれでもグリコシル化されない）〜４グリカン占有（すなわち各鎖のＦａｂおよびＦｃ部位両方でグリコシル化される）の範囲の任意の組み合わせを含むことが可能であるように、０、１（ＦａｂまたはＦｃのいずれか）または２つのグリカン占有を含んでもよい。別の側面において、本開示は、可変領域のグリコシル化パターンを変化させる軽鎖または重鎖の可変領域に、少なくとも１つの突然変異を含有する、本開示の４−１ＢＢ抗体の誘導体を提供する。こうした抗体誘導体は、抗原結合に関して、増加したアフィニティおよび／または修飾された特異性を有しうる。突然変異は、Ｖ領域に新規グリコシル化部位を付加してもよいし、１またはそれより多いＶ領域グリコシル化部位の位置を変化させてもよいし、またはあらかじめ存在するＶ領域グリコシル化部位を除去してもよい。１つの態様において、本開示は、重鎖可変領域におけるアスパラギン５９に潜在的なＮ連結グリコシル化部位を有する４−１ＢＢ抗体の誘導体であって、１つの重鎖可変領域における潜在的なＮ連結グリコシル化部位が除去されている、前記誘導体を提供する。別の態様において、本開示は、重鎖可変領域におけるアスパラギン５９に潜在的なＮ連結グリコシル化部位を有する４−１ＢＢ抗体の誘導体であって、両方の重鎖可変領域における潜在的なＮ連結グリコシル化部位が除去されている、前記誘導体を提供する。抗体のグリコシル化パターンを改変する方法は、当該技術分野に知られ、例えば、本明細書にその開示が援用される、米国特許第６，９３３，３６８号に記載されるものがある。
別の側面において、本開示は、さらなる分子実体に連結された、本明細書に記載される４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体誘導体を提供する。さらなる分子実体の例には、薬学的剤、ペプチドまたはタンパク質、検出剤または標識、および抗体が含まれる。
いくつかの態様において、抗体誘導体は、薬学的剤に連結された本開示の抗体を含む。薬学的剤の例には、細胞傷害性剤または他の癌療法剤、および放射性同位体が含まれる。細胞傷害性剤の特定の例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体が含まれる。療法剤にはまた、例えば代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。診断的または療法的に使用するために、抗体にコンジュゲート化可能な放射性同位体の例には、限定されるわけではないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が含まれる。薬学的剤に抗体を連結するための方法、例えば多様なリンカー技術を用いる方法が当該技術分野に知られる。リンカータイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが含まれる。リンカー、および抗体に療法剤を連結するための方法のさらなる議論に関しては、例えばＳａｉｔｏら， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５：１９９−２１５（２００３）； Ｔｒａｉｌら， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５２：３２８−３３７（２００３）； Ｐａｙｎｅ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２（２００３）； Ａｌｌｅｎ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０−７６３（２００２）； Ｐａｓｔａｎ， Ｉ．およびＫｒｅｉｔｍａｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９−１０９１（２００２）； Ｓｅｎｔｅｒ， Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ， Ｃ．Ｊ．（２００１）Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５３：２４７−２６４を参照されたい。
特定の態様において、抗体誘導体は、４−１ＢＢ抗体の多量体型である、４−１ＢＢ抗体多量体であり、例えば抗体二量体、三量体、またはより単量体抗体のより高次の多量体である。抗体多量体内の個々の単量体は、同一であってもまたは異なっていてもよい。さらに、多量体内の個々の抗体は、同じまたは異なる結合特性を有してもよい。抗体の天然凝集を通じて、抗体の多量体化を達成してもよい。例えば、精製抗体調製物（例えば精製ＩｇＧ１分子）のある程度の割合は、抗体ホモ二量体、および他のより高次の抗体多量体を含有するタンパク質凝集体を自発的に形成する。あるいは、抗体ホモ二量体は、当該技術分野に知られる化学的連結技術を通じて、例えば、架橋剤を用いることを通じて、形成可能である。適切な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離される２つの別個に反応性である基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、およびＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセテート）、またはホモ二官能性であるもの（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）が含まれる。こうしたリンカーは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州ロックフォードから商業的に入手可能である。当該技術分野に知られる組換えＤＮＡ技術を通じて、抗体を多量体化することもまた可能である。
本開示によって提供される他の抗体誘導体の例には、一本鎖抗体、ディアボディ、ドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディが含まれる。「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを含む一本鎖ポリペプチドからなり、ここでＶＬドメインおよびＶＨドメインは対形成して、一価分子を形成する。当該技術分野に知られる方法にしたがって、一本鎖抗体を調製してもよい。（例えば、Ｂｉｒｄら， （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら， （１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。「ディアボディ」は、２つの鎖からなり、各鎖は、同じポリペプチド鎖上に、短いペプチドリンカーによって連結された、軽鎖可変領域に連結された重鎖可変領域を含み、ここで、同じ鎖上の２つの領域は、互いには対形成せず、他の鎖上の相補ドメインと対形成して、二重特異性分子を形成する。ディアボディを調製する方法は、当該技術分野に知られる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら， （１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、およびＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら， （１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の小さい機能結合単位であり、抗体の重鎖または軽鎖いずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は、細菌、酵母、および哺乳動物細胞系においてよく発現される。ドメイン抗体およびその産生法のさらなる詳細が当該技術分野に知られる（例えば、米国特許第６，２９１，１５８号；第６，５８２，９１５号；第６，５９３，０８１号；第６，１７２，１９７号；第６，６９６，２４５号；欧州特許０３６８６８４および０６１６６４０； ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０３／００２６０９を参照されたい）。ナノボディは、抗体の重鎖に由来する。ナノボディは、典型的には、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、そして元来の抗体の抗原結合能を保持する。当該技術分野に知られる方法によって、ナノボディを調製してもよい（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号、米国特許第６，８３８，２５４号、ＷＯ ０６／０７９３７２を参照されたい）。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１つの軽鎖および１つの重鎖からなる。ユニボディをＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去によって作製してもよい。ユニボディのさらなる詳細およびこれらを調製する方法が、ＷＯ２００７／０５９７８２に見られうる。
Ｃ．４−１ＢＢ抗体を産生する核酸、ベクター、宿主細胞、および組換え法
本開示の別の側面は、本開示が提供する結合分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列は、抗体の任意の部分、例えばＣＤＲ、１、２または３のＣＤＲを含む配列、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域であってもよいし、あるいは全長重鎖または全長軽鎖であってもよい。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、そしてイントロン配列を含有してもまたはしなくてもよい。典型的には、核酸はｃＤＮＡ分子である。
いくつかの態様において、本開示は：（１）例示的抗体のＨ−ＣＤＲ３またはＬ−ＣＲＤ３のアミノ酸配列；（２）例示的抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域；あるいは（３）例示的抗体の全長重鎖または全長軽鎖からなる群より選択される、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこうした配列からなる単離核酸分子を提供する。
他の態様において、核酸分子は、配列番号１〜１０、１５〜２４、２９〜３８、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５５〜５７、６０、６１、６４、および６５のいずれか１つに示すとおりのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこうした配列からなる。
さらに他の態様において、核酸分子は、配列番号１１〜１４、２５〜２８、３９〜４２、４７〜５０、５３、５４、５８、５９、６２、６３、６６、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはこうした配列からなる。
任意の適切な分子生物学技術を用いて、本開示の核酸を得てもよい。ハイブリドーマによって発現される抗体に関しては、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることも可能である。（例えばファージディスプレイ技術を用いて）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体に関しては、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収することも可能である。
ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能であるように連結することによって、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することも可能である。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が当該技術分野に知られ（例えばＫａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２を参照されたい）、そしてこれらの領域を含むＤＮＡ断片を標準的ＰＣＲ増幅によって得ることも可能である。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であることも可能であるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、異なる個体の間で存在することが知られる、多様なアレルまたはアロタイプのいずれであってもよく、例えばＧｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）であってもよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域における天然存在アミノ酸置換に相当する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能であるように連結してもよい。
ＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に、機能可能であるように連結することによって、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することも可能である。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が当該技術分野に知られ（例えばＫａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２を参照されたい）、そしてこれらの領域を含むＤＮＡ断片を標準的ＰＣＲ増幅によって得ることも可能である。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であることも可能である。
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するため、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟なリンカーによって連結された連続一本鎖タンパク質として発現されうるように、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする、別の断片に、機能可能であるように連結してもよい（例えばＢｉｒｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）； Ｈｕｓｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）。
本開示は、本開示が提供する核酸分子を含むベクターをさらに提供する。核酸分子は、軽鎖または重鎖の一部（例えばＣＤＲまたは可変領域）、全長軽鎖または重鎖、重鎖または軽鎖の一部または全長を含むポリペプチド、あるいは抗体誘導体または抗原結合断片のアミノ酸配列をコードすることも可能である。いくつかの態様において、ベクターは、結合分子の発現に有用な発現ベクター、例えば抗体またはその抗原結合断片である。
本開示の結合分子を発現するため、ＤＮＡ分子が転写および翻訳制御配列に機能可能であるように連結されるように、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター内に挿入する。これに関連して、用語「機能可能であるように連結される」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、ＤＮＡ分子の転写および翻訳を制御する意図される機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター内に連結されていることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター内に挿入可能であり、またはより典型的には、どちらの遺伝子も同じ発現ベクター内に挿入される。抗体遺伝子は、任意の適切な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補性制限部位の連結、あるいは制限部位が存在しない場合、平滑端連結）によって発現ベクター内に挿入される。本明細書記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）に機能可能であるように連結され、そしてＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能可能であるように連結されるように、所望のアイソタイプおよびサブクラスの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター内に挿入することによって、任意の抗体アイソタイプおよびサブクラスの全長抗体遺伝子を生成することも可能である。さらにまたはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の発現ベクターは、典型的には、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を所持する。用語「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー、ならびに抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節する他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。こうした制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０））に記載される。当業者には、制御配列の選択を含む、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に応じてもよいことを認識するであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための制御配列の例には、哺乳動物細胞の高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素が含まれ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列を用いてもよい。さらに、異なる供給源由来の配列で構成される制御要素、例えばＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列由来の配列を含有する、ＳＲプロモーター系（Ｔａｋｅｂｅ， Ｙ．ら（１９８８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６−４７２）。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、発現ベクターは、さらなる配列を所持してもよく、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）および選択可能マーカーを所持してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。。例えば典型的には選択可能マーカー遺伝子は、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に対して与える。選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において用いるため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を任意の適切な技術によって、宿主細胞内にトランスフェクションする。用語「トランスフェクション」の多様な型が、原核または真核宿主細胞内に外因性ＤＮＡを導入するために一般的に用いられる非常に多様な技術、例えばエレクトロポレーション、カルシウムリン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等を含むよう意図される。原核または真核宿主細胞いずれかにおいて、本開示の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞、および典型的には哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も典型的である。
本開示はさらに、本開示が提供する核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、実質的に、発現ベクターが入手可能な任意の細胞であってもよい。例えば、より高次の真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、より低次の真核宿主細胞、例えば酵母細胞であってもよいし、そして原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。組換え核酸構築物の宿主細胞内への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはファージ感染によって達成可能である。
形質転換に適した原核宿主には、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な種が含まれる。
本開示の結合分子を発現するための哺乳動物宿主細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１−６２１（１９８２）に記載されるような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０）に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳｐ２細胞が含まれる。特に、ＮＳ０骨髄腫またはＣＨＯ細胞で使用するための別の発現系は、ＷＯ ８７／０４４６２、ＷＯ ８９／０１０３６およびＥＰ ３３８，８４１に開示されるようなＧＳ（グルタミン・シンテターゼ）遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する際、宿主細胞における抗体の発現、または宿主細胞を増殖させる培地内への抗体の分泌が可能になるのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。任意の適切なタンパク質精製法を用いて、培地から抗体を回収することも可能である。
Ｄ．組成物
他の側面において、本開示は、本開示が提供する結合分子を含有する組成物を提供する。１つの側面において、組成物は、結合分子および薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的組成物である。当該技術分野に知られる慣用法によって、組成物を調製してもよい。
用語「薬学的組成物」および「薬学的配合物」は、本明細書に記載するような任意の結合分子、任意の抗体、その任意の抗原結合部分、またはその誘導体を、結合分子の有効な送達のために投薬型を調製するのに必要であるように、１またはそれより多い薬学的に許容されうる賦形剤、希釈剤、またはキャリアーと一緒に含む組成物を指す。
いくつかの態様において、本開示は、本開示が提供する抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む組成物であって、前記抗体または抗原結合部分が、配列番号３０に示すＣＤＲアミノ酸配列を含む可変ドメインを含み、そして前記組成物が、前記組成物中に存在する抗体またはその抗原結合部分の総量と比較して、前記アミノ酸配列のアスパラギンがグリコシル化された前記抗体または抗原結合部分を、約１１％、１０％、８％、５％、３％、または２％より多く含まない、前記組成物を提供する。別の態様において、該組成物は、前記組成物中に存在する抗体またはその抗原結合部分の総量と比較して、配列番号３０の前記アミノ酸配列のアスパラギンがグリコシル化された前記抗体または抗原結合部分を、少なくとも約２％含む。
本明細書において、用語「賦形剤」は、薬学的配合物内に、活性薬学的成分を配合するために用いられる物質を意味し；好ましい態様において、賦形剤は、活性薬学的成分の主な療法効果を低下させないかまたはこれに干渉しない。好ましくは、賦形剤は、療法的に不活性である。用語「賦形剤」は、キャリアー、希釈剤、ビヒクル、可溶化剤、安定化剤、充填剤、酸性または塩基性ｐＨ調整剤、および結合剤を含む。賦形剤はまた、製造プロセスの間接的または意図されない結果として薬学的配合物中に存在する物質であってもよい。好ましくは、賦形剤は、ヒトおよび動物投与に安全であると認可されるかまたは見なされ、すなわちＧＲＡＳ物質（一般的に安全と見なされる（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ））である。ＧＲＡＳ物質は、本明細書に援用される、連邦規制基準（ＣＦＲ）の２１ ＣＦＲ １８２および２１ ＣＦＲ １８４に、食品医薬品局によって列挙される。
用語「薬学的に許容されうるキャリアー」は、結合分子の送達のための配合物における使用に適した、任意の不活性物質を指す。キャリアーは、抗接着剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤または希釈剤、保存剤（例えば酸化防止剤、抗細菌剤、または抗真菌剤）、甘味剤、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等であってもよい。適切な薬学的に許容されうるキャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、デキストロース、植物油（例えばオリーブ油）、生理食塩水、緩衝剤、緩衝生理食塩水、ならびに等張剤、例えば糖、多価アルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウムが含まれる。
用語「緩衝剤」は、薬学的調製物のｐＨを安定化させる、薬学的に許容されうる賦形剤を指す。適切な緩衝剤は当該技術分野に周知であり、そして文献中に見出されうる。例えば、ヒスチジン緩衝剤、グリシン緩衝剤、ｔｒｉｓまたは酢酸緩衝剤、ならびに／あるいはそれぞれの遊離酸または遊離塩基、ならびにその多様な塩および／または酸および塩基の混合物を使用してもよい。特定の態様において、緩衝液はヒスチジン緩衝液、すなわち緩衝剤としてヒスチジン、一般的にはＬ−ヒスチジンを有する緩衝液である。特定の緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩、またはＬ−ヒスチジンおよびＬ−ヒスチジン一塩酸塩の混合物を含む、Ｌ−ヒスチジン／ＨＣｌ緩衝液である。Ｌ−ヒスチジン緩衝剤は、一般的には、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩緩衝剤は、一般的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。
用いる緩衝液に関わらず、当該技術分野に知られる酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、硫酸およびクエン酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムで、ｐＨを約４．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０の範囲の値に調整してもよい。
１つの側面において、本発明は：０．１〜１ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン；１〜５ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン一塩酸塩；５０〜１００ｍｇ／ｍｌの無水トレハロース；０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの無水ＥＤＴＡ二ナトリウム；および０．０５〜１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含み；４．０〜７．０の範囲のｐＨである、薬学的組成物に関する。
特定の態様において、本発明記載の組成物中に含まれる結合分子の濃度は、約１０〜約２２ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
別の特定の態様において、本発明記載の組成物中に含まれる緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤、例えば、Ｌ−ヒスチジン／ＨＣｌ緩衝剤、または酢酸緩衝剤または酢酸ナトリウム緩衝剤である。特定の態様において、緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン／ＨＣｌである。
特定の態様において、緩衝剤は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、または１ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度である。
本発明の組成物のｐＨは、以下の範囲：３〜１０または４〜９より選択可能である。特定の態様において、緩衝剤は、５．０〜６．０または５．５±０．３のｐＨを提供する。これらの範囲の内部または外部のルーチンのｐＨ調整は、ポリペプチドまたは組成物の他の構成要素の可溶性または安定性を改善するために必要でありうる。
１つの態様において、組成物は、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含む。特定の態様において、ポリソルベート８０は、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜５ｍｇ／ｍｌまたは０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
１つの態様において、本発明にしたがって組成物中に含まれる少なくとも１つの安定化剤は、塩、例えば塩化ナトリウム、糖、トレハロース二水和物またはスクロース、およびアミノ酸、例えば塩酸アルギニンの群より選択される。特定の態様において、少なくとも１つの安定化剤は、１０〜２００ｍｇ／ｍｌ、２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、または５０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度である。
本明細書において、用語「キレート剤」は、一般的に、金属イオンに対して少なくとも１つの結合（例えば共有、イオン性、またはその他）を形成可能な賦形剤を指す。キレート剤は、典型的には、不安定性を促進しうる種と複合体形成する安定化剤として、選択された液体組成物中で使用可能な多座リガンドである。しばしば、キレート剤として作用しうる化合物は、電子が豊富な官能基を有する。電子が豊富な適切な官能基には、カルボン酸基、ヒドロキシ基、およびアミノ基が含まれる。アミノポリカルボン酸、ヒドロキシポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸等におけるこれらの基の配置は、金属に結合する能力を有する部分を生じる。
しかし、本発明は、主に、金属イオンとの結合を形成するキレート剤の能力によって、抗体安定性を増進させるキレート剤に限定されることを意図されない。したがって、本発明は、キレート剤が本発明の組成物を安定化する特定の機構によって限定されることを意図されず、そして本明細書においてキレート剤と称する賦形剤は、主に、金属イオンと結合を形成するキレート剤の能力とまったく関連しない機構を通じて、抗体安定性増進特性を達成してもよい。
本発明において使用するのに適したキレート剤には、限定されるわけではないが、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、デフェロキサミン（ＤＥＦ）、クエン酸、ナイアシンアミド、およびデスオキシコール酸塩（ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅｓ）が含まれる。適切なアミノポリカルボン酸の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸５（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸、およびアスパラギン酸が含まれる。適切なヒドロキシアミノカルボン酸の例には、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン（ビシン）およびＮ−（ｔｒｉｓヒドロキシメチルメチル）１０グリシン（トリシン）が含まれる。適切なＮ置換グリシンの例は、グリシルグリシンである。適切なデスオキシコール酸塩の例はデスオキシコール酸ナトリウムである。
本発明で用いるキレート剤は、可能な場合、化合物の遊離酸または遊離塩基型（例えば本明細書において交換可能に「ＥＤＴＡ」または「エデト酸塩」と称される）として、あるいは対応する塩型（例えば対応する酸付加塩または塩基付加塩、例えばエデト酸二ナトリウム）として存在してもよい。適切な酸付加塩には、例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム）が含まれ、そして他の弱く結合した金属イオンを用いて、塩を調製することも可能である。当該技術分野に知られるように、塩の性質および中和されるべき電荷の数は、存在するカルボキシル基の数、および安定化キレート剤を供給するｐＨに応じるであろう。やはり当該技術分野に知られるように、キレート剤は、特定のターゲットイオンが結合する多様な強度を有する。さらに例示するため、ＥＤＴＡの適切な塩には、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、およびエデト酸カリウムが含まれ；そしてデフェロキサミン（ＤＥＦ）の適切な塩は、メシル酸デフェロキサミン（ＤＦＭ）である。
本発明で用いるキレート剤は、化合物または対応する塩の無水、溶媒和または水和型で存在することも可能である。キレート剤が溶媒和型または水和型で存在する場合、溶媒和または水和の多様な状態で存在可能である（例えば無水、水和、二水和、および三水和型を含む）。さらなる例示のため、ＥＤＴＡの適切な水和物は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。１つの態様において、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物は、０．００１〜５ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌ、および０．０２〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の態様において、キレート剤は、本明細書記載の組成物中の抗体の凝集を減少させるかまたは防止することも可能である。こうしたキレート剤は、キレート剤の保護を伴わずに配合された抗体の分解を減少させるかまたは防止することも可能である。
薬学的組成物は、一般的に、特定の意図される投与経路に合わせることも可能である。当該技術分野には、限定されるわけではないが、経口、エアロゾル、非経口、および局所投与を含む、化合物を投与する多数の技術が存在する。組成物は、任意の適切な型、例えば液体、半固体、および固体投薬型であってもよい。液体投薬型の例には、溶液（例えば注射可能および注入可能溶液）、マイクロエマルジョン、リポソーム、分散、または懸濁剤が含まれる。固体投薬型の例には、錠剤、丸剤、カプセル、マイクロカプセル、および粉末が含まれる。結合分子を送達するのに適した組成物の特定の型は、注射または注入のための無菌液体、例えば溶液、懸濁物、または分散物である。無菌溶液は、必要な量の適切なキャリアー中に抗体を取り込み、その後、滅菌マイクロろ過することによって、無菌溶液を調製することも可能である。一般的に、塩基性分散媒体および他のキャリアーを含有する無菌ビヒクル内に抗体を取り込むことによって、分散物を調製する。無菌液体の調製のための無菌粉末の場合、調製法には、活性成分に、先に滅菌ろ過した溶液からの任意のさらなる望ましい成分が加わった粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）が含まれる。当該技術分野に知られる慣用技術によって、組成物の多様な投薬型を調製することも可能である。
組成物中に含まれる結合分子の相対量は、いくつかの要因、例えば用いる特定の結合分子およびキャリアー、ならびに望ましい放出および薬理学的特性に応じて多様であろう。１つの態様において、組成物は、結合分子を含み、ここで前記結合分子濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの間、５〜５０ｍｇ／ｍｌの間、または１０〜２２ｍｇ／ｍｌの間である。単回投薬型での結合分子の量は、一般的に、療法効果を生じる量であろうが、それより少ない量であってもよい。一般的に、この量は、投薬型総量に比較して、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの範囲、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。
結合分子に加えて、１またはそれより多いさらなる療法剤が組成物中に含まれていてもよい。さらなる療法剤の例を本明細書において以下に記載する。組成物中に含まれるべきさらなる療法剤の適切な量は、当業者によって容易に選択可能であり、そしていくつかの要因、例えば用いる特定の剤およびキャリアー、投薬型、ならびに望ましい放出および薬力学特性に応じて多様であろう。単回投薬型に含まれるさらなる療法剤の量は、一般的に、療法効果を生じる剤の量であろうが、また、より少ない量であってもよい。
Ｅ．結合分子および薬学的組成物の使用
本開示が提供する結合分子および薬学的組成物は、療法、診断、または他の目的のために、例えば免疫反応の増進、癌の治療、他の癌療法の有効性の増進、ワクチン有効性の増進、または自己免疫疾患の治療に有用である。したがって、他の側面において、本開示は、結合分子または薬学的組成物を用いる方法を提供する。１つの側面において、本開示は、哺乳動物において障害を治療する方法であって、治療が必要な哺乳動物に、本開示が提供する結合分子の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。結合分子は、４−１ＢＢアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。いくつかの態様において、結合分子は４−１ＢＢアゴニストである。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
いくつかの態様において、障害は癌である。悪性であってもまたは良性であっても、そして原発性であってもまたは続発性であっても、４−１ＢＢが関与する多様な癌を、本開示に提供する方法で治療するかまたは予防することも可能である。こうした癌の例には、肺癌、例えば気管支原性肺癌（例えば扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、および腺癌）、肺胞細胞癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫（非癌性）、および肉腫（癌性）；心臓癌、例えば粘液腫、線維腫、および横紋筋腫；骨癌、例えば骨軟骨腫、軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、巨細胞腫瘍、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、および細網肉腫；脳癌、例えば神経膠腫（例えば多形神経膠芽腫）、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、脊索腫、シュワン腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、軟骨腫、胚細胞腫、奇形腫、類皮嚢胞、および血管腫；消化系の癌、例えば平滑筋腫、類表皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、胃腺癌、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸ポリープ、および結腸直腸癌；肝臓癌、例えば肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞癌、線維層板型癌、胆管細胞癌、肝芽腫、および血管肉腫：腎癌、例えば腎腺癌、腎細胞癌、副腎腫、および腎盂移行細胞癌；膀胱癌；血液癌、例えば急性リンパ球性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性（骨髄細胞性、骨髄性、骨髄芽球性、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ球性白血病（例えばセザリー症候群および毛様細胞白血病）、慢性骨髄球性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ、ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、および骨髄増殖性障害（真性多血症、骨髄線維症、血小板血症、および慢性骨髄球性白血病などの骨髄増殖性障害を含む）；皮膚癌、例えば基底細胞癌、扁平細胞癌、黒色腫、カポジ肉腫、およびパジェット病；頭部および頸部の癌；目に関連する癌、例えば網膜芽腫および眼内悪性黒色腫；男性生殖系癌、例えば良性前立腺肥大、前立腺癌、および精巣癌（例えばセミノーマ、奇形腫、胚性癌、および絨毛癌）；乳癌；女性生殖系癌、例えば子宮癌（子宮内膜癌）、子宮頸癌（子宮系癌腫）、卵巣の癌（卵巣癌）、外陰癌、膣癌、卵管癌、および胞状奇胎；甲状腺癌（乳頭状、濾胞、未分化、または髄様癌）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非癌性増殖；膵臓癌；ならびに血液学的癌、例えば白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫が含まれる。
いくつかの他の態様において、障害は自己免疫疾患である。結合分子で治療してもよい自己免疫疾患の例には、自己免疫脳脊髄炎、エリテマトーデス、および関節リウマチが含まれる。結合分子はまた、炎症（例えばアレルギー性喘息）および慢性移植片対宿主病を治療するのにも使用可能である。
別の側面において、本開示は、哺乳動物において免疫反応を増進する方法であって、哺乳動物に、本開示が提供する療法的有効量の結合分子を投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、結合分子は４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片であり、そして哺乳動物はヒトである。さらなる態様において、結合分子は４−１ＢＢアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。用語「免疫反応を増進する」またはその文法的変形は、哺乳動物の免疫系の反応いずれかを刺激するか、誘起するか、増加させるか、改善するか、または増大させることを意味する。免疫反応は、細胞性反応（すなわち細胞仲介性、例ば細胞傷害性Ｔリンパ球仲介性）または体液性反応（すなわち抗体仲介性反応）であってもよく、そして原発性または続発性免疫反応であってもよい。免疫反応の増進例には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性増加および細胞溶解性Ｔ細胞の生成が含まれる。限定されるわけではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカイン放出（例えばＩＬ−２産生）、腫瘍退行、腫瘍所持動物の生存、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞傷害性を含む、当業者に知られるいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ測定を用いて、免疫反応増進を評価してもよい。典型的には、本開示の方法は、未治療哺乳動物または請求する方法を用いては治療されていない哺乳動物による免疫反応に比較した際、哺乳動物による免疫反応を増進させる。１つの態様において、結合分子を用いて、微生物病原体（例えばウイルス）に対するヒトの免疫反応を増進させる。別の態様において、結合分子を用いて、ワクチンに対するヒトの免疫反応を増進させる。結合分子は、４−１ＢＢアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。いくつかの態様において、結合分子は４−１ＢＢアゴニストである。１つの態様において、方法は、細胞性免疫反応、特に細胞傷害性Ｔ細胞反応を増進させる。別の態様において、細胞性免疫反応は、Ｔヘルパー細胞反応である。さらに別の態様において、免疫反応はサイトカイン産生、特にＩＬ−２産生である。結合分子を用いて、微生物病原体（例えばウイルス）に対する、またはワクチンに対する、ヒトの免疫反応を増進させてもよい。結合分子は４−１ＢＢアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。いくつかの態様において、結合分子は４−１ＢＢアゴニストである。
療法的方法を実施する際、結合分子を単剤療法として単独で投与してもよいし、あるいは１またはそれより多いさらなる療法剤または療法と組み合わせて投与してもよい。したがって、別の側面において、本開示は、１またはそれより多いさらなる療法または療法剤を、別個の、連続したまたは同時投与のために、結合分子と組み合わせて含む、併用療法を提供する。用語「さらなる療法」は、療法剤として、本開示が提供する結合分子を使用しない療法を指す。用語「さらなる療法剤」は、本開示が提供する結合分子以外の任意の療法剤を指す。１つの特定の側面において、本開示は、哺乳動物において癌を治療するための併用療法であって、哺乳動物に、本開示が提供する結合分子の療法的有効量を、１またはそれより多いさらなる療法剤と組み合わせて投与する工程を含む、前記方法を提供する。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
非常に多様な癌療法剤を、本開示が提供する結合分子と組み合わせて用いてもよい。一般の当業者は、本開示の方法および結合分子と組み合わせて使用可能であり、そして本明細書に示す療法のこれらの型に限定されない、他の癌療法の存在および発展を認識するであろう。癌を治療するための併用療法において使用可能である、さらなる療法剤のカテゴリーの例には、（１）化学療法剤、（２）免疫療法剤、および（３）ホルモン療法剤が含まれる。
用語「化学療法剤」は、癌細胞の死を引き起こすか、あるいは癌細胞の増殖、分裂、修復、および／または機能に干渉しうる、化学的または生物学的物質を指す。化学療法剤の例には、本明細書に援用される、ＷＯ ２００６／０８８６３９、ＷＯ ２００６／１２９１６３、およびＵＳ ２００６０１５３８０８に開示されるものが含まれる。特定の化学療法剤の例には：（１）アルキル化剤、例えばクロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、メクロレタミン塩酸塩（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ）、チオテパ（ＴＨＩＯＰＬＥＸ）、ストレプトゾトシン（ＺＡＮＯＳＡＲ）、カルムスチン（ＢＩＣＮＵ、ＧＬＩＡＤＥＬ ＷＡＦＥＲ）、ロムスチン（ＣＥＥＮＵ）、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ）；（２）細胞傷害性抗生物質を含む、アルカロイドまたは植物ビンカアルカロイド、例えばドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ、ＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ）、ダウノルビシン（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ）、ネモルビシン、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ ＰＦＳ、ＺＡＶＥＤＯＳ）、ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、ＣＯＳＭＥＧＥＮ）、プリカマイシン（ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ）、マイトマイシン（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ）、およびブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）、酒石酸ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ））、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ）、およびビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ）；（３）代謝拮抗剤、例えばカペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＡ）、メトトレキセート（ＦＯＬＥＸ、ＭＥＸＡＴＥ、ＴＲＥＸＡＬＬ）、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ）、トリメトレキセート（ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ）、およびペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ）；（４）ピリミジンアンタゴニスト、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、ラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸ）、テガファー−ウラシル（ＵＦＴＯＲＡＬ）、およびゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）；（５）タキサン、例えばドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）；（６）白金薬剤、例えばシスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ）およびカルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ）、およびオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）；（７）トポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、エトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）、およびテニポシド（ＶＵＭＯＮ）；（８）エピポドフィロトキシン（ポドフィロトキシン誘導体）、例えばエトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）；（９）葉酸誘導体、例えばロイコボリン（ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ）；（１０）ニトロソ尿素、例えばカルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）；（１１）上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を含む、受容体チロシンキナーゼの阻害剤、例えばゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）、ゲネフィチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、サリドマイド、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、アキシチニブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、ｌｙｍ−１（ＯＮＣＯＬＹＭ）、ＷＯ２００２／０５３５９６に開示される、インスリン様増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体；（１２）血管形成阻害剤、例えばベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、スラミン（ＧＥＲＭＡＮＩＮ）、アンジオスタチン、ＳＵ５４１６、サリドマイド、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えばバチマスタットおよびマリマスタット）、およびＷＯ２００２０５５１０６に開示されるもの；ならびに（１３）プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）が含まれる。
用語「免疫療法剤」は、哺乳動物の免疫反応を増進しうる化学的または生物学的物質を指す。免疫療法剤の例には：カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）；インターフェロンのようなサイトカイン；ワクチン、例えばＭｙＶａｘ個別化免疫療法、Ｏｎｙｖａｘ−Ｐ、Ｏｎｃｏｐｈａｇｅ、ＧＲＮＶＡＣ１、ＦａｖＩｄ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、ＧＶＡＸ、Ｌｏｖａｘｉｎ Ｃ、ＢｉｏｖａｘＩＤ、ＧＭＸＸ、およびＮｅｕＶａｘ；ならびに抗体、例えばアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ゲムツズナブ（ｇｅｍｔｕｚｕｎａｂ）・オゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）、イブリツモマブ・チウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ）、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）トレメリムマブ、ＣＡＴ−３８８８、ＯＸ４０受容体に対するアゴニスト抗体（例えばＷＯ２００９／０７９３３５に開示されるもの）、ＣＤ４０受容体に対するアゴニスト抗体（例えばＷＯ２００３／０４０１７０に開示されるもの）、およびＴＬＲ−９アゴニスト（例えば、ＷＯ２００３／０１５７１１、ＷＯ２００４／０１６８０５、およびＷＯ２００９／０２２２１５に開示されるもの）が含まれる。
用語「ホルモン療法剤」は、ホルモン産生を阻害するかまたは排除し、あるいは癌性細胞の増殖および／または生存に対するホルモンの影響を阻害するかまたは弱める、化学的または生物学的物質を指す。本明細書の方法に適したこうした剤の例には、ＵＳ２００７０１１７８０９に開示されるものが含まれる。特定のホルモン療法剤の例には、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ）、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ）、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＣＥ）、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ）、およびリュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ）が含まれる。本開示の結合分子をまた、非薬剤ホルモン療法、例えば（１）ホルモン産生に関与する臓器または腺、例えば卵巣、精巣、副腎、および脳下垂体のすべてまたは一部を除去する手術法、および（２）ターゲットとされるホルモンの産生を阻害するかまたは排除するのに十分な時間、患者の臓器または腺を放射線に供する放射線治療と組み合わせて用いてもよい。
癌を治療するための併用療法はまた、腫瘍を除去するための手術と、結合分子の組み合わせも含む。結合分子を、手術の前に、手術中に、または手術後に哺乳動物に投与してもよい。
癌を治療するための併用療法はまた、放射線療法、例えばイオン化（電磁）放射線療法（例えばＸ線またはガンマ線）および粒子ビーム放射線療法（例えば高線形エネルギー照射）と結合分子の組み合わせも含む。放射線源は、哺乳動物の外部であってもまたは内部であってもよい。結合分子を、放射線療法の前に、放射線療法中に、または放射線療法後に投与してもよい。
本開示が提供する結合分子および組成物を、任意の適切な経腸経路または非経口経路の投与を通じて、投与してもよい。投与の用語「経腸経路」は、胃腸管の任意の部分を通じた投与を指す。経腸経路の例には、経口、粘膜、頬側、および結腸経路、あるいは胃内経路が含まれる。投与の「非経口経路」は、経腸経路以外の投与経路を指す。投与の非経口経路の例には、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、クモ膜下腔内、、嚢内、眼窩内、心内、経気管、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内、皮下、または局所投与が含まれる。任意の適切な方法を用いて、例えば経口摂取によって、経鼻管、胃瘻管、注射、注入、移植可能注入ポンプ、および浸透圧ポンプによって、本開示の抗体および組成物を投与してもよい。投与の適切な経路および方法は、用いる特定の抗体、望ましい吸収速度、用いる特定の配合物または投薬型、治療しようとする障害のタイプまたは重症度、作用の特異的部位、および患者の状態などの多くの要因に応じて多様である可能性もあり、そして当業者によって容易に選択されうる。
用語、結合分子の「療法的有効量」は、意図される療法的目的のために有効である量を指す。例えば、免疫反応を増進する背景において、「療法的有効量」は、哺乳動物免疫系の反応いずれかを、刺激し、誘発し、増加させ、改善するか、または増大させるのに有効な量いずれかである。疾患を治療する背景において、「療法的有効量」は、治療しようとする哺乳動物において、任意の望ましいまたは有益な効果を引き起こすのに十分な任意の量である。特に、癌治療において、望ましいまたは有益な効果の例には、癌細胞のさらなる増殖または蔓延の阻害、癌細胞死、癌の再発の阻害、癌と関連する疼痛の減少、または哺乳動物生存の改善が含まれる。４−１ＢＢ抗体の療法的に有効な量は、通常、約０．００１〜約５００ｍｇ／哺乳動物体重ｋｇ、そしてより一般的には、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、量は、約０．３ｍｇ／哺乳動物体重ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。いくつかの態様において、４−１ＢＢ抗体の療法的有効量は、約０．０１〜３０ｍｇ／哺乳動物体重ｋｇの範囲内である。いくつかの他の態様において、４−１ＢＢ抗体の療法的有効量は、約０．０５〜１５ｍｇ／哺乳動物体重ｋｇの範囲内である。投与すべき正確な投薬レベルは、当業者によって容易に決定可能であり、そしていくつかの要因、例えば治療しようとする障害のタイプ、および重症度、使用する特定の結合分子、投与経路、投与時間、治療期間、使用する特定のさらなる療法、治療しようとする患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および以前の病歴、ならびに医学業に知られる同様の要因に応じるであろう。
結合分子または組成物は、通常、何度も投与される。単一の用量の間の間隔は、例えば毎週、毎月、３ヶ月ごと、または毎年であってもよい。例示的な治療措置は、週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を含む。４−１ＢＢ抗体のための典型的な投薬措置には、以下の投薬スケジュールの１つ：（ｉ）４週ごとに６回の投薬、次いで３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重ｋｇを１回、その後、３週ごとに１ｍｇ／体重ｋｇを用いて、静脈内投与を通じた、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。
本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これらはさらなる限定と見なされてはならない。本開示全体で引用される、すべての図およびすべての参考文献、特許および公表される特許出願の内容は、その全体が本明細書に完全に援用される。
実施例１：４−１ＢＢに結合するＦａｂ断片の生成
本発明が提供する特定の抗体は、元来、ヒト４−１ＢＢに結合するＦａｂから生成された。Ｆａｂは、ファージディスプレイライブラリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリー、以下の４−１ＢＢ ＦＣに対する交互パニング、およびヒト４−１ＢＢを発現する細胞より選択された。これらのＦａｂには、「Ｆａｂ−６０３２」、「Ｆａｂ−７３６１」、「Ｆａｂ−７４８０」、および「Ｆａｂ−７４８３」と称されるものが含まれる。本出願に開示する４−１ＢＢ抗体、ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３は、それぞれ「Ｆａｂ−６０３２」、「Ｆａｂ−７３６１」、「Ｆａｂ−７４８０」、および「Ｆａｂ−７４８３」から生成された。所定のＦａｂの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、Ｆａｂの名称と同じ数字を共有する名称の例示的抗体の、それぞれ軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列と同一である。例えば、Ｆａｂ−７４８０および抗体ＭＯＲ−７４８０は、それぞれ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域に関して、同一のアミノ酸配列を有する。
ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋら， ２０００， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６（１）：５７−８６）に基づき、そしてファージ表面上にＦａｂをディスプレイするためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術（Ｌｏｅｈｎｉｎｇ、ＷＯ ０１／０５９５０）を使用する。ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）は、各々、７つのＶＬマスター遺伝子と組み合わせた１つのＶＨ（ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６）マスター遺伝子を含む６つの単一のサブライブラリーで選択を行うか、または合わせたファージプールを用いて選択を行う、オプションを提供する。第一周期のパニングのためのファージは、Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Ｐｒｏｇｅｎ、ドイツ・ハイデルベルグより得られる、Ｍ１３ＫＯ７ΔｐＩＩＩ）によって調製された。ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）は、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｒｏｔｈｅら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２００８） ３７６， １１８２−１２００に詳細に記載される。
組換えヒト４−１ＢＢ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８３８−４Ｂ；ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、固相パニングを行った。
実施例２． Ｆａｂの性質決定
Ｆｌａｇ／Ｈｉｓ−Ｔａｇを有するＦａｂを含む一価Ｆａｂ形式を用いて、以下に記載するアッセイにおいて、実施例１に記載する４つのＦａｂの性質決定を行った。
２Ａ．溶液平衡力価決定（ＳＥＴ）法で決定したアフィニティ
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）の装置を用い、ＳＥＴ法を用いて、４つのＦａｂのアフィニティ（ＫＤとして表す）を決定した。抗体タンパク質の単量体分画を用いた（少なくとも９０％の単量体含量、分析ＳＥＣによって分析；それぞれ、Ｆａｂに関して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＩｇＧに関して、Ｔｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。
溶液中のアフィニティ決定を、基本的に、文献に記載されるように行った（Ｆｒｉｇｕｅｔら、１９８５）。ＳＥＴ法の感度および正確さを改善するため、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術（Ｈａｅｎｅｌら、２００５）に移行した。
製造者の指示にしたがって、１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２断片特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧＴＭ ＮＨＳ−エステル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国メリーランド州ガイザーズバーグ）で標識した。
ポリプロピレン・マイクロタイタープレート、ならびにアッセイ緩衝液として、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ ｐＨ ７．４中で実験を行った。非標識ヒト４−１ＢＢを、予期されるＫＤより少なくとも１０倍高い濃度で出発して、一連の２ｎで希釈した。抗原を含まないウェルを用いて、Ｂｍａｘ値を決定した；アッセイ緩衝液を含むウェルを用いて、バックグラウンドを決定した。例えば、３０ｐＭ Ｆａｂ（６０μＬ最終体積中の最終濃度）を添加した後、混合物を室温で一晩インキュベーションした。適用したＦａｂ濃度は、予期されるＫＤと類似であるかまたはそれより低かった。
標準的ＭＳＤプレートを、ＰＢＳ中の０．０５μｇ／ｍｌのヒト４−１ＢＢ（３０μＬ／ウェル）でコーティングし、一晩インキュベーションし、そしてＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。プレートをアッセイ緩衝液で洗浄した後、平衡化した試料をこのプレートにトランスファーし（ウェルあたり３０μＬ）、そして２０分間インキュベーションした。洗浄後、１：１５００の最終希釈中のＭＳＤ Ｓｕｌｆｏタグ標識検出抗体（ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２）をＭＳＤプレートに添加し、そしてエッペンドルフ振盪装置（７００ｒｐｍ）上で３０分間インキュベーションした。
プレートを洗浄し、そして界面活性剤を含む３０μＬ／ウェルのＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、電気化学発光シグナルを検出した。
ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを適用するカスタマイズした適合モデルで、データを評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ決定のため、以下の適合モデルを用い（Ｈａｅｎｅｌら、２００５）、そしてＡｂｒａｈａｍら（１９９６， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｒｅｃｏｇ． ９（５−６）：４５６−４６１）にしたがって修飾した：
Figure 2013544756
［Ｆａｂ］ｔ：適用総Ｆａｂ濃度
ｘ：適用総可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を含まないＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：アフィニティ
結果を表３に示す。
２Ｂ． 直接コーティングされた抗原に対するＢｉａｃｏｒｅ Ｋ Ｄ 決定
ＫＤ決定のため、単量体Ｆａｂ分画（少なくとも９０％単量体含量、分析用ＳＥＣによって分析；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を分析物として用いた。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン）を用いて、固定抗原への結合を分析した。
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン・ウプサラ）を用い、共有固定抗原ＣＤ１３７／ヒト４−１ＢＢへのそれぞれのＦａｂの連続希釈の結合を用いて、動力学速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定した。抗原共有固定のため、標準的ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学反応を用いた。約１６〜５００ｎＭの範囲のＦａｂ濃度を用いて、２０μｌ／分の流速で、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ； ｐＨ ７．４； １５０ｍＭ ＮａＣｌ； ３ｍＭ ＥＤＴＡ； Ｔｗｅｅｎ２０ ０．００５％）中、動力学測定を行った。各濃度での注入時間は１分間、その後、少なくとも３分間の解離期が続いた。再生のため、１回またはそれより多い５μｌのグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２の注入を用いた。
全ＩｇＧ分子のＫＤ評価のため、１６〜５００ｎＭの範囲の濃度で、２ｎ連続希釈を用いて、共有固定ヒト４−１ＢＢ（およそ１３０ＲＵ）の低密度で、Ｆ１センサーチップ上、試料としてＩｇＧを注入した。二価適合モデルを用いて、センサーグラムを評価して、そして定性的に比較して、対応するＫＤ値をランク付けした。
ＢＩＡ評価ソフトウェア３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、すべてのセンサーグラムを適合させた。結果を表３に提示する。
２Ｃ． ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＦａｂの結合
直接コーティングされたヒト４−１ＢＢ／Ｆｃに対して、標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて、４つのＦａｂの結合を決定した。結果を表３に示す。
２Ｄ． ＦＡＣＳアッセイにおけるＦａｂの結合
ヒト４−１ＢＢを安定トランスフェクションされ、そして発現しているＨＥＫ２９３細胞ならびに３００．１９（ネズミＢ細胞株）陰性対照細胞に対して、標準的ＦＡＣＳアッセイ技術を用いて、４つのＦａｂの結合を決定した。結果を表３に示す。
表３．Ｆａｂの結合特性
Figure 2013544756
実施例３： ＩｇＧの性質決定
Ｆａｂ−６０３２、Ｆａｂ−７３６１、Ｆａｂ−７４８０、およびＦａｂ−７４８３を含む、本明細書に記載するようなパニングから得たいくつかのＦａｂを、本実施例に記載するようなさらなる性質決定のため、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４形式の全長抗体に変換するために選択した。本実施例に同定する４つの例示的抗体、すなわちＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３は、それぞれ、Ｆａｂ−６０３２、Ｆａｂ−７３６１、Ｆａｂ−７４８０、およびＦａｂ−７４８３から変換された。ＩｇＧ形式の抗体を発現し、そして精製し、そして次いで、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて性質決定した。
３Ａ． ＩｇＧへの変換
全長ＩｇＧを発現するため、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片をＦａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４用の適切なｐＭｏｒｐｈ（登録商標）＿ｈＩｇＧベクター内にサブクローニングした。
３Ｂ． ヒトＩｇＧの一過性発現および精製
１：１の比のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクションしたＨＫＢ１１細胞において、全長ヒトＩｇＧの一過性発現を行った。トランスフェクション後、細胞培養上清を採取し、そしてそれぞれ３倍トランスフェクション体積にアップスケールした。遠心分離およびろ過によって上清を清澄にし、そして次いで、標準的プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。タンパク質を溶出させ、そして中和した。さらなる下流プロセシングは、緩衝液交換および無菌ろ過を伴った。ＵＶ分光光度計によって、タンパク質濃度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、変性、還元および変性、非変性条件下で、あるいはＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いることによって、ＩｇＧの純度を分析した。ＨＰ−ＳＥＣを行って、天然状態でのＩｇＧ調製を分析した。
３Ｃ． ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＩｇＧの性質決定
直接コーティング設定で、ヒト４−１ＢＢ／Ｆｃおよびマウス４−１ＢＢ／ＦｃのＥＬＩＳＡ結合特性に関してＩｇＧを用いた。以下の表４は、すべてＩｇＧ１形式の抗体ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３に関するＥＬＩＳＡ結合結果を示す。
表４． ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＩｇＧ１の結合
Figure 2013544756
３Ｄ． 抗体の結合選択性（ＦＡＣＳアッセイ）
４−１ＢＢに対する抗体の選択性を、４−１ＢＢおよびＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーの細胞外ドメインタンパク質に対して評価した。これらの受容体には、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）およびＯＸ−４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４）が含まれた。陰性対照ＨＥＫ２９３細胞、ならびにヒト４−１ＢＢを安定トランスフェクションされ、そして発現しているＨＥＫ２９３Ｔ−ｈ４−１ＢＢ、およびＯＸ−４０を発現している３００．１９安定トランスフェクション細胞、およびＣＤ４０を安定トランスフェクションされそして発現している３００．１９に対するＦＡＣＳ結合性質決定のために、ＩｇＧを用いた。すべてＩｇＧ１形式である抗体ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３に対するＦＡＣＳ結合結果を表５に示す。最大１０００ｎＭの濃度で、ＯＸ−４０またはＣＤ４０への有意な結合は観察されず、該抗体が、試験した他の関連ファミリーメンバーに対して、４−１ＢＢに対して少なくとも１００倍より選択的であることが立証された。
表５． ＦＡＣＳアッセイにおける抗体（ＩｇＧ１）の結合選択性
Figure 2013544756
３Ｅ． ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＩｇＧの性質決定
プレート結合アッセイ、可溶性結合アッセイ、および架橋結合アッセイにおいて、ＨＥＫ２９３Ｔ−ｈ４−１ＢＢ細胞を用いたルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける結合に関してもまた、ＩｇＧを性質決定した。表６は、すべてＩｇＧ１形式である抗体ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３に関するルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。
表６． ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＩｇＧ１の性質決定
Figure 2013544756
実施例４． 抗体ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３の構造的性質決定
実施例１〜３に上述する方法を用いて、「ＭＯＲ−６０３２」、「ＭＯＲ−７３６１」、「ＭＯＲ−７４８０」、および「ＭＯＲ−７４８３」と称される抗体を含む、いくつかの全長ヒト抗４−１ＢＢ ＩｇＧ２抗体を産生した。標準的ＰＣＲ技術を用いて、ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、およびＭＯＲ−７４８３モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を得て、そして標準的ＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。
抗体ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ−７４８３、ＭＯＲ−７４８３．１およびＭＯＲ−７４８３．２の重鎖可変領域、ＩｇＧ２サブクラスの全長重鎖、軽鎖可変領域、および全長軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を本開示に提供し；これらの配列の配列番号のインデックスを表１に提供する。
ＭＯＲ−６０３２重鎖免疫グロブリン配列を、既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列に比較すると、ＭＯＲ−６０３２重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ １−６９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖系列４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ａ由来のＪＨセグメントを利用していることが立証された。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−６０３２ ＶＨ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号１、２および３に示されるとおりの、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＭＯＲ−７３６１重鎖免疫グロブリン配列を、既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列に比較すると、７３６１重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ３−２３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖系列２−８由来のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ａ由来のＪＨセグメントを利用していることが立証された。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−７３６１ ＶＨ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号１５、１６および１７に示されるとおりの、重鎖Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３重鎖免疫グロブリン配列を、既知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列に比較すると、７４８０および７４８３重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ５由来のＶＨセグメント、ヒト生殖系列５−１８由来のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ａ由来のＪＨセグメントを利用していることが立証された。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、７４８０および７４８３ ＶＨ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号２９、３０および３１に示されるとおりの、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＭＯＲ−６０３２、ＭＯＲ−７３６１、ＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３軽鎖免疫グロブリン配列を、既知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列に比較すると、６０３２、７３６１、７４８０および７４８３軽鎖が、すべて、ヒト生殖系列λ３−ｒ由来のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＬ３ｂ由来のＪＬセグメントを利用していることが立証された。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−６０３２ ＶＬ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号６、７、および８に示されるとおりの、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−７３６１ ＶＬ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号２０、２１、および２２に示されるとおりの、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−７４８０ ＶＬ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６に示されるとおりの、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
ＣＤＲ領域決定にＫａｂａｔ系を用いた、ＭＯＲ−７４８３ ＶＬ配列のさらなる分析によって、それぞれ、配列番号３４、３５、および５５に示されるとおりの、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３領域の描写が導かれた。
実施例５： 抗体ＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３の生殖系列化バージョン
ＭＯＲ−７４８０およびＭＯＲ−７４８３抗体の免疫原性を最小限にするため、以下のように、いくつかのアミノ酸残基を生殖系列配列にバック突然変異させた。重鎖可変鎖のＦＲ１領域における２つのアミノ酸を生殖系列配列に戻すことによって、ＭＯＲ−７４８０．１と称されるＭＯＲ−７４８０の生殖系列化バージョンを調製した。より具体的には、アミノ酸残基番号１のＱを生殖系列のＥに、そしてアミノ酸残基番号１９のＫをＲに戻した。重鎖可変領域において変化させた２つのアミノ酸残基は、ＭＯＲ−７４８０．１（配列番号４３）とＭＯＲ−７４８０（配列番号３２）のアミノ酸配列を比較することによってわかる。ＭＯＲ−７４８０の軽鎖可変領域において、ＦＲ１領域中の５つのアミノ酸（Ｄ１Ｓ、Ｉ２Ｙ、Ａ１３Ｓ、Ｒ１９Ｓ、Ｓ２１Ｔ）、ＦＲ２領域中の２つのアミノ酸（Ａ４２Ｓ、Ｖ４５Ｌ）、およびＦＲ３領域中の１つのアミノ酸（Ｅ８０Ｍ）を生殖系列配列に戻した。軽鎖可変領域において変化させた８つのアミノ酸は、ＭＯＲ−７４８０．１のもの（配列番号４５）とＭＯＲ−７４８０のアミノ酸配列（配列番号３７）を比較することによってわかる。
さらに、ＭＯＲ−７４８０．１（配列番号４５）の軽鎖可変領域配列から出発して、そしてＬ４５をＶに戻して、ＭＯＲ−７４８０．２（配列番号５１）を産生することによって、ＭＯＲ−７４８０の第三のバージョンを調製した。
重鎖可変鎖のＦＲ１領域中の２つのアミノ酸を生殖系列配列にバック突然変異させることによって、ＭＯＲ−７４８３．１と称されるＭＯＲ−７４８３の「生殖系列化」バージョンを調製した。抗体鎖の生殖系列バージョンから出発して、そして次いで、ＣＤＲ中の所望のアミノ酸を変化させるか、または任意のバージョンから出発した突然変異の任意の組み合わせによって、生殖系列化バージョンを調製してもよい。ＭＯＲ−７４８３．１を産生するため、アミノ酸残基番号１のＱを生殖系列Ｅに戻し、そしてアミノ酸残基番号１９のＫをＲに戻した。重鎖可変領域中で変化させた２つのアミノ酸残基は、ＭＯＲ−７４８３．１（配列番号４３）とＭＯＲ−７４８３（配列番号３２）の配列を比較することによってわかる。ＭＯＲ−７４８３の軽鎖可変領域において、ＦＲ１領域中の５つのアミノ酸（Ｄ１Ｓ、Ｉ２Ｙ、Ａ１３Ｓ，Ｒ１９Ｓ、Ｓ２１Ｔ）、ＦＲ２領域中の２つのアミノ酸（Ａ４２Ｓ、Ｖ４５Ｌ）、およびＦＲ３領域中の１つのアミノ酸（Ｅ８０Ｍ）を生殖系列配列に戻した。軽鎖可変領域において変化させた８つのアミノ酸は、ＭＯＲ−７４８３．１のもの（配列番号６０）とＭＯＲ−７４８３のアミノ酸配列（配列番号５６）を比較することによってわかる。
さらに、ＭＯＲ−７４８３．１（配列番号６０）の軽鎖可変領域配列のＬ４５を生殖系列Ｖ４５にバック突然変異させて、ＭＯＲ−７４８３．２（配列番号６４）を産生することによって、ＭＯＲ−７４８３の第三のバージョンを調製した。
実施例６： 生殖系列化バージョンを含む抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
抗体の結合アフィニティ（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって、ヒト４−１ＢＢに結合する特定の抗体の結合動力学を測定した。配列番号６８のアミノ酸２４〜１８６を含む組換えヒト４−１ＢＢ／Ｆｃキメラタンパク質を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．より購入した（＃８３８−４Ｂ）。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって提供される、予測された分子量（４４．８ｋＤａ）に基づいて、８０ｎＭの最終濃度まで、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ポリソルベート２０、および０．５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に、凍結乾燥タンパク質を溶解した。３％因子Ｘａ（１００μｇ ４−１ＢＢキメラあたり、３μｇの因子Ｘａ）との２２℃で２０時間のインキュベーションを用いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ポリソルベート２０、０．５ｍＭアジ化ナトリウム中、ウシ因子Ｘａ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３２５２１）で処理することによって、分子のＦｃ部分を切断した。分子の４−１ＢＢ部分は、ヒト４−１ＢＢタンパク質のアミノ酸残基２４から１８６を含む。１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ポリソルベート２０、および０．５ｍＭアジ化ナトリウムを含む泳動緩衝液中、２５℃で結合実験を行った。標準的アミンカップリングによって、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中、抗体の０．１ｍｇ／ｍＬ溶液を用いて、抗体をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置のＫｉｎｊｅｃｔ機能を用いて、４−１ＢＢを８０ｎＭ〜０．１６ｎＭの濃度範囲で、５０μＬ／分の流速で３．６分間注入し、その後、２６分間の解離期間が続いた。水中の１０ｍＭリン酸の１分間のパルスによって、結合した複合体を再生した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、データ分析を行った。センサーグラムを単純１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。抗体は、可逆的に組換えヒト４−１ＢＢに結合することが示された。結果（平均値）を表７に示す。
４−１ＢＢの細胞外ドメインへの結合（ＥＬＩＳＡアッセイ）
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に、ヒト４−１ＢＢ ＩｇＧ１Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を０．２ｍｇ／ｍｌまで再懸濁し、そしてＤＰＢＳで０．０３μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートをウェルあたり０．１ｍｌの組換え４−１ＢＢキメラでコーティングし、非特異的結合対照のため、空のウェルを残して、そして４℃で一晩インキュベーションした。４−１ＢＢ溶液を取り除き、そしてプレートを０．２ｍｌ洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。０．２ｍｌブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ中、５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）をすべてのウェルに添加し、そして混合しながら４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を取り除き、そしてプレートを０．２ｍｌ洗浄緩衝液で３回洗浄した。４−１ＢＢ試験抗体の連続希釈をＤＰＢＳ中で調製し、そしてウェルあたり０．１ｍｌの希釈Ａｂを添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベーションした。抗体溶液を取り除き、そしてプレートをウェルあたり０．２ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０３６−０９７、ペンシルバニア州ウェストグローブ）を、ＤＰＢＳで１：５０００に希釈し、そしてウェルあたり０．１ｍｌ添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、そしてウェルあたり０．２ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。０．１ｍｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を添加し、そして室温で２０分間インキュベーションした。等体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）上、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。結果を表８に提示する。
リガンド競合結合（ＥＬＩＳＡアッセイ）
プレートに結合した組換え４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）へのヒト４−１ＢＢ＿ＩｇＧ１Ｆｃキメラの結合を遮断する能力に関して、抗体を試験した。ＤＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミン中、組換えヒト４−１ＢＢリガンド（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を０．２ｍｇ／ｍｌまで再懸濁し、そして次いでＤＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌまで希釈した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ表面９６ウェルプレートを０．１ｍｌ／ウェルの４−１ＢＢＬ溶液で、４℃で一晩コーティングした。翌日、４−１ＢＢＬ溶液を取り除き、そして０．２ｍＬブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ中、１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、そして室温で２時間インキュベーションした。ブロッキング工程中、抗体ストックを、ＤＰＢＳ中、８ｎｇ／ｍＬ〜６μｇ／ｍＬの範囲で希釈した。組換えヒト４−１ＢＢ＿ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を、ＤＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミン中、０．２ｍｇ／ｍＬに再懸濁し、そして次いで、ＤＰＢＳ中、０．０２μｇ／ｍＬに希釈した。ブロッキングした４−１ＢＢＬコーティングプレートを、０．２ｍＬ洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。６０μＬの抗体希釈を６０μＬ ４−１ＢＢ＿ＩｇＧ１Ｆｃキメラと一緒に添加し、そして室温で１．５時間インキュベーションした。プレートを先に記載するように洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ抗６ｘヒスチジンタグ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス ＃ＭＡＢ０５０Ｈ）を、ＤＰＢＳ中、１：１０００に希釈し、生じた溶液の５０μＬを洗浄したプレートのウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベーションした。プレートを先に記載するように洗浄し、各ウェルに５０μＬ ＴＭＢ基質溶液を添加し、そして室温で２０分間インキュベーションした。５０μＬの０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレート読み取り装置を用いて、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。結果を表８に提示する。
抗体の種交差反応性
植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で刺激したヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（ｃｙｎｏ）、イヌ、およびラットの初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、例示的抗体の種交差反応性を測定した。以下に記載する方法にしたがって細胞を単離した。細胞（〜５．０ｘ１０５細胞／試験管）を冷たい洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム）中で洗浄し、そして１００μｌ／試験管のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート化対照または４−１ＢＢ反応性抗体１５．５μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）を、標識種特異的Ｔ細胞マーカー抗体とともに各試料に添加した。利用したＴ細胞マーカー抗体は以下の通りである。ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５５３３２）、ＦＩＴＣ抗ラットＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５９９７５）、ＦＩＴＣ抗ウサギＣＤ４＋ＦＩＴＣ抗ウサギＣＤ８（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、＃ＭＣＡ７９９Ｆおよび＃ＭＣＡ １５７６Ｆ）、ＦＩＴＣ抗イヌＣＤ３ｅ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、＃ＭＣＡ１７７４Ｆ）、およびＰｅｒＣＰ抗ヒト／ｃｙｎｏ ＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５２８５１）。細胞を暗所中、蛍光色素抗体とともに、氷上で３０分間インキュベーションし、３回洗浄し、そして分析のため、０．３ｍｌ洗浄緩衝液中に再懸濁した。抗体染色を測定し、そしてＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒおよびＦｌｏｗＪｏ８．８．２ソフトウェアを用いて分析した。
ヒトＴリンパ球の単離。 ヒト全血を、１ｍＬ ０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有するシリンジ内に収集し、そして次いで、製造者に記載されるように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離のため、Ｓｉｇｍａ Ａｃｃｕｓｐｉｎ試験管（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）にトランスファーした。５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳでＰＢＭＣを２回洗浄し、そして製造者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に記載されるように、Ｔ細胞精製カラムを用いて、Ｔリンパ球を単離した。簡潔には、ＰＢＭＣを２ｍＬのカラム緩衝液中に再懸濁し、そしてあらかじめ洗浄したＴ細胞単離カラム内に装填した。ＰＢＭＣを室温で１０分間インキュベーションし、そしてＴ細胞をカラム緩衝液で溶出し、１回洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）からなるＴＣＭに２ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。
カニクイザルＰＢＭＣの単離。 カニクイザル全血（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ；ニューヨーク州ヒックスビル）をクエン酸ナトリウムＣＰＴバキュテナー試験管（ＢＤ；ニュージャージー州フランクリンレークス）中に収集し、そして次いで、１５００ｘｇ、室温で２０分間回転させた。試験管を４℃で一晩輸送した。ＰＢＭＣ分画をＣＰＴ試験管から収集し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。洗浄工程後、ＰＢＭＣを計数し、そして組織培地（ＴＣＭ）中、２ｘ１０６細胞／ｍＬに再調整した。ＴＣＭは、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）およびＧｉｂｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入したＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）からなった。細胞を１０μｇ／ｍＬ ＰＨＡで２〜３日間刺激して、４−１ＢＢの発現を誘導した。
イヌＰＢＭＣの単離。 イヌ全血をヘパリン処理バキュテナー試験管（ＢＤ；ニュージャージー州フランクリンレークス）中に抜き取り、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで１：２に希釈した。混合後、４ｍＬの希釈血液を３ｍＬ Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−哺乳動物（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州ウェストベリー）上に注意深く重層し、そして８００ｘｇで２０分間、２５℃で遠心分離した。ＰＢＭＣ界面を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＨＡを１０μｇ／ｍＬで含有するＴＣＭ（Ｒｅｍｅｌ、カンザス州レネクサ）中、２ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。フローサイトメトリーによって抗体結合に関して試験する前に、細胞を４８〜７２時間培養した。
ラットＰＢＭＣの単離。 ラット全血をヘパリン処理バキュテナー試験管（ＢＤ；ニュージャージー州フランクリンレークス）中に抜き取り、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで１：３に希釈した。混合後、６ｍＬの希釈血液を４．５ｍＬ Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−哺乳動物（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州ウェストベリー）上に注意深く重層し、そして８００ｘｇで２０分間、２５℃で遠心分離した。ＰＢＭＣ界面を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＨＡを１０μｇ／ｍＬで含有するＴＣＭ（Ｒｅｍｅｌ、カンザス州レネクサ）中、２ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。フローサイトメトリーによって抗体結合に関して試験する前に、細胞を４８〜７２時間培養した。
結合結果を図１に提供する。抗体は、ヒトおよびカニクイザル４−１ＢＢに高アフィニティで結合することが見出された一方、イヌおよびラット４−１ＢＢへの結合は、試験した最高濃度の１００ｎＭの濃度で観察されなかった。
表７：ＩｇＧ抗体の結合アフィニティ（Ｂｉａｃｏｒｅ）
Figure 2013544756
表８：ＥＬＩＳＡ結合およびリガンド競合値
Figure 2013544756
エピトープマッピング
４−１ＢＢアゴニスト抗体のエピトープ結合領域を決定するため、ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインに対して、公表されたイヌ４−１ＢＢ配列（参照配列番号ＸＭ＿８４５２４３）への一連の突然変異（表９）を作製した。
表９． ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインの突然変異体
Figure 2013544756
すべてのヒトからイヌへの突然変異は、レトロウイルス発現ベクターｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）中、Ｇｅｎｅ Ｄｙｍａｎｉｃｓ ＬＬＣ（オレゴン州ポートランド）によって調製された。さらに、全長イヌｃＤＮＡ配列は、参照配列番号ＸＭ＿８４５２４３に対応する遺伝子合成を通じて調製された。
Ｔ−７５フラスコ中、ほぼ４０〜５０％集密２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ウイルス調製を確立した。培養後、次いで、ウイルス上清を滅菌ろ過し、そして濃縮に供した。濃縮ウイルスを収集し、そして−８０℃で保存した。
完全ＤＭＥＭ中、８μｇ／ｍｌポリブレンを加えた１：２５０希釈の濃縮ウイルスを用いて、対数的に増殖している３００−１９細胞にレトロウイルスを形質導入した。２４時間インキュベーションした後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを培養に添加し、そして研究経過中、維持した。
１：２００希釈ＰＥ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を加えた１μｇ／ｍｌポリクローナルヤギ抗ヒト４−１ＢＢ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）で染色することによって、ピューロマイシン選択プールによる４−１ＢＢ受容体の陽性発現を確認した。試験抗体による突然変異体４−１ＢＢ受容体の認識を決定するため、ピューロマイシン選択プールを非標識一次抗体の１００ｎＭ希釈で染色し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして１：２００希釈した種特異的ＰＥ標識ロバ抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２を添加した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒおよびＦｌｏｗＪｏ８．８．６ソフトウェアを用いて細胞を分析した。
各細胞プールの相対的染色を表１０に要約する。
表１０． 各細胞プールの相対的染色
Figure 2013544756
類似の配列を有する抗体（ＭＯＲ−７４８０、ＭＯＲ−７４８０．１、ＭＯＲ−７４８０．２、ＭＯＲ−７４８３、およびＭＯＲ−７４８３．１）間の結合の相違が、クローンＮ＆Ｅ．５の突然変異内で発見され、これによって、抗体認識に関する決定要因は該突然変異領域内にあることが示唆された。
ヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインおよびヒト４−１ＢＢ細胞外ドメインの突然変異体、突然変異体Ｎ＆Ｅ．５に対するこれらの抗体の相対的アフィニティを決定するため、各抗体に関して、用量反応ＦＡＣＳ曲線を決定した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識したＭＯＲ＿７４８０、ＭＯＲ＿７４８０．１、およびＭＯＲ＿７４８０．２を、ＦＡＣＳ緩衝液中、１μＭから１：５希釈シリーズで８点、希釈し、そしてこれを用いて親３００−１９、ｈｕ４−１ＢＢ、ｈｕ４−１ＢＢ Ｎ＆Ｅ．５、およびイヌ４−１ＢＢ細胞プールを染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒおよびＦｌｏｗＪｏ８．８．６ソフトウェアを用いて細胞を分析した。各受容体を発現しているプールの蛍光幾何平均を親細胞の染色に対して規準化し、そして倍染色として表し、そして用量反応に関するＥＣ５０を決定した。ＥＣ５０要約を表１１に示す。ヒト４−１ＢＢ突然変異体Ｎ＆Ｅ．５に対するＭＯＲ＿７４８０．２およびＭＯＲ＿７４８０両方に対する結合の５倍より大きい減少が注目された。
表１１． 抗体の結合ＥＣ５０（ｎＭ）
Figure 2013544756
抗体のアゴニスト活性（ルシフェラーゼ活性アッセイ）
安定に組み込まれたＮＦκＢルシフェラーゼレポーターと一緒にヒト４−１ＢＢを発現している２９３Ｔ細胞を調製した。細胞を採取し、洗浄し、そして０．６ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で、フェノールレッド不含完全培地（１０％ウシ胎児血清、ＨＥＰＥＳ緩衝液、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ）内に再懸濁した。５０μｌの細胞を、白色９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）の各アッセイウェル内にプレーティングした。２．５：１の比の架橋抗体Ｆａｂ’ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）の存在下で、試験抗体を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で５時間インキュベーションした。７５μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を添加し、そしてＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴシンチレーションカウンターを用いて、ルシフェラーゼ活性の量を測定した。
ウイルス形質導入および２μｇ／ｍｌピューロマイシンでの安定プールの選択によって、カニクイザル４−１ＢＢを発現している２９３Ｔ細胞を調製した。ｃｙｎｏ ４−１ＢＢを発現している２９３Ｔ細胞を、ほぼ６０〜７０％集密度まで、Ｔ−７５フラスコ中にプレーティングし、次いで１０μｇ ｐＬｕｃ＿６ｘＮＦκＢとトランスフェクション対照としての０．１μｇ ｐＲＬ−ＣＭＶでトランスフェクションした。製造者の指示にしたがって、６μｌ Ｆｕｇｅｎｅ対１μｇプラスミドＤＮＡの比で、Ｆｕｇｅｎｅ ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｄｈｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）を用いて、トランスフェクションを行った。翌日、細胞を採取し、洗浄し、そして０．６ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でフェノールレッド不含完全培地（１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ）内に再懸濁した。５０μｌの細胞を、白色９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）の各アッセイウェル内にプレーティングした。２．５：１の比の架橋Ｆａｂ’ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）の存在下で、試験抗体を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で５時間インキュベーションした。７５μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、そしてＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴシンチレーションカウンターを用いて、ルシフェラーゼ活性の量を測定した。さらに、７５μｌのＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ試薬を添加して、レニラ属（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性を評価した。Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴシンチレーションカウンターを用いて、レニラ属ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。
抗体のアゴニスト活性（初代Ｔ細胞ＩＬ−２放出アッセイ）
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートをプレートコーティングの前にＵＶ滅菌した。試験抗体をＰＢＳ中で６０μｇ／ｍｌに希釈した。０．２ｍｌの希釈Ａｂをポリプロピレン９６ウェルプレートの２つのウェルに分け、そして１：３で連続希釈した。５０μｌの希釈したＡｂを滅菌Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルアッセイプレートに添加し、そして直ちに５０μｌの２０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ３εクローンＵＣＨＴ１を添加した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）。次いで、すべてのプレートを４℃で一晩インキュベーションした。翌日、Ａｂコーティングしたプレートを、ＰＢＳで１回洗浄し、そして０．１５ｍｌ ＲＰＭＩ完全培地をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに添加した。先に本明細書の別の箇所に記載したようにヒトＴ細胞を単離し、そして５０μｌの精製Ｔ細胞を２ｘ１０６細胞／ｍｌ（１００，０００細胞／ウェル）で各ウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベーションした。各ウェルからの上清を収集し、そして直接アッセイするかまたはアッセイ前に−２０℃で保存した。ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）前に、完全培地で上清を希釈した。結果を図３に提示する。
実施例７： ４−１ＢＢ抗体によってｉｎ ｖｉｖｏで誘導されるヒト白血球拡大
ネズミ４−１ＢＢと４−１ＢＢ抗体の検出可能な交差反応性がなく、そしてヒト免疫細胞の存在が必要であったため、４−１ＢＢ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ機能評価のためのモデルを開発する必要があった。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）突然変異およびＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（一般的にＮＳＧと称される）不全を所持するＮＯＤ遺伝子バックグラウンドのマウスは、多数のヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）の移植を支持し、そして少なくとも３０日間移植を維持することが可能である（Ｋｉｎｇ， ２００８， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２６：３０３−３１４）。ｈｕＰＢＬ−ＮＳＧモデルとしても知られるこのマウスモデルを用いて、ヒト免疫細胞に対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ全身投与の機能的影響を評価した。具体的には、６００万の新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣを、静脈内注射を介して、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）宿主マウスに養子移入した。ＰＢＭＣ注射の９日後、動物に単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＭＯＲ７４８０、ＭＯＲ７４８０．１またはＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体を、腹腔内注射によって投与した。ＰＢＭＣ移植の２４〜２８日後、ＰＢＭＣをヒトおよびネズミＣＤ４５に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーを通じて評価した。前方および側方散乱プロファイルを用いて、リンパ球ゲートを決定した。図４に示すように、ＭＯＲ７４８０およびＭＯＲ７４８０．１は、移植マウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の比率が増加していることによって明らかであるように、ヒト白血球の拡大を増進可能であった。各群に関して、ｎ≧６マウスであった。
さらに、カニクイザルをＭＯＲ７４８０．１で治療すると、ＰＢＭＣ試料中のセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８ ＴＣＭ）の増殖が増加した。カニクイザル（用量レベルあたり２匹の動物）に、示す用量で、ＭＯＲ７４８０．１の単回静脈内注射を投与した。抗体投与の７日前（投与前）およびＭＯＲ７４８０．１投与（研究第１日）に対して示す研究日に、ＰＢＭＣを採取した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ９５、およびＫｉ−６７に対する抗体でＰＢＭＣを染色し、そしてフローサイトメトリーを通じて分析した。データをＣａｎｔｏ ＩＩ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で収集し、そしてＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ＣＤ８セントラルメモリー細胞を、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２８＋およびＣＤ９５＋として同定した。（用量レベル−動物数）として指定された個々の動物に対してデータを示し、そして研究前の数に比較した、Ｋｉ−６７＋細胞数の動物内変化として表す｛［（示す研究日のＫｉ−６７＋細胞数−投与前のＫｉ−６７＋細胞数）／投与前のＫｉ−６７＋細胞数］＊１００｝。図５に示すように、研究の最初の７〜１３日の間の増殖しているセントラルメモリーＴ細胞の１．５倍またはそれより多い増加が、０．３ｍｇ／ｋｇまたはそれより多い用量で治療したすべての群の少なくとも１匹の動物で注目された。
実施例８：４−１ＢＢ抗体の抗腫瘍活性（ｉｎ ｖｉｖｏモデル）
ＰＣ３ヒト前立腺癌モデル
４−１ＢＢ抗体のげっ歯類交差反応性が欠けているため、抗体の抗ヒト腫瘍有効性の評価のために標準的ネズミ同系またはヒト異種移植片腫瘍モデルを使用することが出来なかった。したがって、ベージュ（Ｂｇ）突然変異を宿し、ネズミＴおよびＢリンパ球および機能するＮＫ細胞を欠く、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（ＣＢ．１７／ｌｃｒ．Ｃｇ ＰｋｒｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ／Ｃｒｌ）を用いて、新規ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ−Ｂｇ異種腫瘍マウスモデルを生成した。このモデルを用い、以下に記載するように、４−１ＢＢ抗体の抗ヒト腫瘍有効性を評価した。
ＰＣ３ヒト前立腺またはＬＯＶＯヒト結腸細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得て、そして以下のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ補充物：Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ、および１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；カタログ番号Ｆ２４４２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で強化したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞をＴ−２２５ Ｆａｌｃｏｎフラスコ中、集密まで増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理し（トリプシン０．２５％−ＥＤＴＡ；カタログ番号２５００−０５６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そしてＨｙｐｅｒｆｌａｓｋｓ（カタログ番号３３１９、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３日間スケールアップした。トリプシンを用いて、細胞株を採取し、１０％ＦＢＳを補充した氷冷ＰＲＭＩ中で、これを３回洗浄した。３００ｍｌを超えない末梢血を、健康な志願者から収集した。製造者のプロトコルにしたがって、Ａｃｃｕｓｐｉｎ試験管（カタログ番号Ａ０５６１−１００ｘ １５ ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ヘパリン処理血から末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離した。各マウスが、ＰＢＳ中、０．２ｍＬの単回ボーラス注射中で、１．５ｘ１０６ ＰＢＭＣおよび３ｘ１０６腫瘍細胞の注射を受けるように、計数した細胞懸濁物を合わせた。合わせた細胞懸濁物を冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上に置き、そして準備したマウスに直ちに注射した。
各マウスに関して、０．２ｍＬ体積の合わせた細胞懸濁物を動物の右脇腹に皮下注射し、そして左脇腹への皮下注射によって、４−１ＢＢ抗体または対照抗体の単回用量（０．２ｍＬ）を投与した。Ｐｒｅｓｓｉｅｒノギスで、実験期間中、週２回、腫瘍測定を行い、そして体重もまた記録した。以下の計算を用いて、腫瘍体積を計算した：長さｘ幅２ｘ０．４４＝体積（ｍｍ３）。実験終了前に、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達するか、または動物が体重の２０％を失った場合、マウスを研究から除いた。第２３日、ＩＡＣＵＣに概略される方法にしたがってすべての群のマウスを安楽死させた（図６）。研究最終日に腫瘍増殖阻害パーセントを測定し、そして１００−｛１−（治療最終日／対照最終日）｝として計算した。注射６日後に腫瘍を測定した際、同様の結果が観察され、そして腫瘍体積にしたがって動物をランダム化し、そして移植７日後に単回の４−１ＢＢ ｍＡｂ用量を投与した。大部分の研究に関して、各群は８匹のマウスを含有した。
実施例９：ヒト４−１ＢＢノックインマウスにおける、４−１ＢＢ抗体活性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ヒト４−１ＢＢノックインマウスの生成
ネズミ４−１ＢＢと交差反応しない抗ヒト４−１ＢＢモノクローナル抗体の免疫調節活性によりよく取り組むため、マウス４−１ＢＢ遺伝子をヒト４−１ＢＢ遺伝子で置換したマウスモデルを生成した。ヒトまたはネズミ４−１ＢＢゲノム断片を所持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から注文し、そしてＲｅｄ／ＥＴ組換え技術（Ｚｈａｎｇ， １９９８， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０：１２３−１２８）に基づいて、４−１ＢＢターゲティングベクターを構築した。まず、Ｘｂａ１消化によって開いた際、２つのネズミ／ヒトキメラ相同性アーム（各４００ｂｐ）が、エクソン２に位置する翻訳開始コドンＡＴＧで始まり、そしてエクソン８の停止コドンＴＧＡで終わるヒト４−１ＢＢゲノム配列の１９，９９４ｂｐを、ヒト４−１ＢＢ ＢＡＣクローンから回収するように、ｐＢＲ３２２バックボーン上で回収ベクターを組立てた。次に、ＰＧＫ／ＥＭ７プロモーター調節下にあるネオマイシン発現カセットを組立て、そしてヒト４−１ＢＢ遺伝子のイントロン２配列に相同な配列の１００塩基対（ｂｐ）を隣接させた。次いで、このネオマイシン発現カセットを、工程１で得た回収ヒト４−１ＢＢゲノム断片内にターゲティングした。最後に、ネオマイシン発現カセットを所持する、回収されたヒト４−１ＢＢゲノム断片を、ネズミＢＡＣクローン内にターゲティングして、ネズミ４−１ＢＢ遺伝子を、ＡＴＧ開始コドンからＴＧＡ停止コドンまでの修飾ヒト４−１ＢＢゲノム断片で置き換えた。
標準的プロトコルにしたがって、このＢＡＣターゲティングベクターをＣ５７ＢＬ／６ＮＴＡＣバックグラウンドのマウス胚性幹細胞株（ＰＲＸ−ＢＬ６Ｎ ＃１、Ｐｒｉｍｏｇｅｎｉｘ、ミズーリ州ローリー）にエレクトロポレーションし、そしてＧ４１８（ジェネティシンとしても知られる）選択を生き延びたクローンを、ネズミ４−１ＢＢ遺伝子のイントロン２およびエクソン８に対する２つのＴａｑｍａｎアッセイによってスクリーニングして、相同組換え機構によってネズミ４−１ＢＢ遺伝子座で修飾されているクローンを同定した。スクリーニングした１１６のＥＳクローンのうち、７つのクローンがネズミ４−１ＢＢ遺伝子座の１つのアレルを失っていることが見出された（ターゲティング効率６％）。核型分析およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ニュージャージー州カムデン）によって行った。クローンＬＨ１５に関しては、２０のうち１９が４０ ＸＹであり、そしてＬＨ８０に関しては、２０細胞のうち２０が４０ＸＹであった。どちらのクローンにおいても、プローブとして４−１ＢＢ遺伝子を所持するネズミＢＡＣクローンを用いたＦＩＳＨによって、バンドＥ２領域において、第４染色体対の各々に対して、４−１ＢＢハイブリダイゼーションの１つのシグナルが示された。他のいかなる位置にもシグナルは見られなかった。
両クローンＬＨ１５およびＬＨ８０をＢＡＬＢ／ｃ株の胚盤胞内に注入し、そして胚をＣＤ１偽妊娠雌マウス内に移植して、出産させた。雄キメラをＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＥｌｌａ−ｃｒｅマウスに交配させて、ネオマイシン耐性カセットを除去し、そしてヒト４−１ＢＢ遺伝子に関してホモ接合性であるマウスを研究に用いた。
４−１ＢＢアゴニストｍＡｂが仲介するリンパ球増殖
４−１ＢＢアゴニストｍＡｂがリンパ球増殖を誘導する能力を４−１ＢＢノックインマウスで評価した。研究第０日、４−１ＢＢノックインマウスに、腹腔内注射によって、３０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ７４８０．１を投与した（毎週の投薬に関しては、第０日および第７日に、動物に４−１ＢＢ ｍＡｂを注射した）。試料収集の２４時間前、２ｍｇ ＢｒｄＵを腹腔内注射した。投薬後の示す日に、心臓内穿刺によって末梢血試料を収集した。ＰＢＭＣを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＢｒｄＵに対する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって評価した。結果を図７パネルＡに提示する。
４−１ＢＢアゴニストｍＡｂが仲介する抗腫瘍有効性
オボアルブミン（ＯＶＡ）モデル抗原およびルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を発現するように操作されている黒色腫株Ｂ１６−ＯＶＡ／ｌｕｃを用いて、４−１ＢＢノックインマウスにおけるＭＯＲ７４８０．１の抗腫瘍有効性を評価した。１００万の腫瘍細胞を４−１ＢＢノックインマウスの脇腹に移植した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３に達した際（一般的に、腫瘍接種から７〜１０日後）、腫瘍サイズに基づいて動物をランダム化し、そして４−１ＢＢ ｍＡｂの示す用量の単回注射を投与した。研究終了まで、週３回、ノギス測定を用いて腫瘍サイズを評価した。結果を図７パネルＢに提示する。
配列表
配列番号1: MOR-6032抗体のH-CDR1
NSYAIS

配列番号2: MOR-6032抗体のH-CDR2
GIIPGFGTANYAQKFQG

配列番号3: MOR-6032抗体のH-CDR3
RKNEEDGGFDH

配列番号4: MOR-6032抗体のVHのアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPGFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKNEEDGGFDHWGQGTLVTVSS

配列番号5: MOR-6032抗体の全長重鎖(IgG2)のアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPGFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKNEEDGGFDHWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号6: MOR-6032抗体のL-CDR1
SGDNLGDYYAS

配列番号7: MOR-6032抗体のL-CDR2
DDSNRPS

配列番号8: MOR-6032抗体のL-CDR3
QTWDGTLHFV

配列番号9: MOR-6032抗体のVLのアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLGDYYASWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTWDGTLHFVFGGGTKLTVL

配列番号10: MOR-6032抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLGDYYASWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTWDGTLHFVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号11: MOR-6032抗体のVHの核酸配列
Caggtgcaattggttcagtctggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcctccggaggcacttttaattcttatgctatttcttgggtgcgccaagcccctgggcagggtctcgagtggatgggcggtatcattccgggttttggcactgcgaattacgcgcagaagtttcagggccgggtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtaagaatgaggaggatggtggttttgatcattggggccaaggcaccctggtgacggttagctca

配列番号12: MOR-6032抗体のVLの核酸配列
Gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatcttggtgattattatgcttcttggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttcttgtgatttatgatgattctaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgccagacttgggatggtactcttcattttgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgttctt

配列番号13: MOR-6032抗体の全長重鎖の核酸配列
caggtgcaattggttcagtctggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcctccggaggcacttttaattcttatgctatttcttgggtgcgccaagcccctgggcagggtctcgagtggatgggcggtatcattccgggttttggcactgcgaattacgcgcagaagtttcagggccgggtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtaagaatgaggaggatggtggttttgatcattggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号14: MOR-6032抗体の全長軽鎖の核酸配列
Gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatcttggtgattattatgcttcttggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttcttgtgatttatgatgattctaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgccagacttgggatggtactcttcattttgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgttcttggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号15: MOR-7361抗体のH-CDR1
SDYYMH

配列番号16: MOR-7361抗体のH-CDR2
VISGSGSNTYYADSVKG

配列番号17: MOR-7361抗体のH-CDR3
RLYAQFEGDF

配列番号18: MOR-7361抗体のVHのアミノ酸配列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMHWVRQAPGKGLEWVSVISGSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYAQFEGDFWGQGTLVTVSS

配列番号19: MOR-7361抗体の全長重鎖 (IgG2)のアミノ酸配列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMHWVRQAPGKGLEWVSVISGSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYAQFEGDFWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号20: MOR-7361抗体のL-CDR1
SGDNIGSKYVS

配列番号21: MOR-7361抗体のL-CDR2
SDSERPS

配列番号22: MOR-7361抗体のL-CDR3
QSWDGSISRV

配列番号23: MOR-7361抗体のVLのアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSKYVSWYQQKPGQAPVLVIYSDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSWDGSISRVFGGGTKLTVL

配列番号24: MOR-7361抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSKYVSWYQQKPGQAPVLVIYSDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSWDGSISRVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号25: MOR-7361抗体のVHの核酸配列
caggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttaccttttctgattattatatgcattgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgttatctctggttctggtagcaatacctattatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtctttatgctcagtttgagggtgatttttggggccaaggcaccctggtgacggttagctca

配列番号26: MOR-7361抗体のVLの核酸配列
gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggttctaagtatgtttcttggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttcttgtgatttattctgattctgagcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgccagtcttgggatggttctatttctcgtgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag

配列番号27: MOR-7361抗体の全長重鎖の核酸配列
caggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttaccttttctgattattatatgcattgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgttatctctggttctggtagcaatacctattatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtctttatgctcagtttgagggtgatttttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号28: MOR-7361抗体の全長軽鎖の核酸配列
gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggttctaagtatgtttcttggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttcttgtgatttattctgattctgagcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgccagtcttgggatggttctatttctcgtgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag

配列番号29: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2; MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のH-CDR1
STYWIS

配列番号30: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2; MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のH-CDR2
KIYPGDSYTNYSPSFQG

配列番号31: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2; MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のH-CDR3
RGYGIFDY

配列番号32: MOR-7480; MOR 7483抗体のVHのアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS

配列番号33: MOR-7480; MOR 7483抗体の全長重鎖 (IgG2)アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号34: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2; MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のL-CDR1
SGDNIGDQYAH

配列番号35: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2; MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のL-CDR2
QDKNRPS

配列番号36: MOR-7480; MOR-7480.1; MOR 7480.2抗体のL-CDR3
ATYTGFGSLAV

配列番号37: MOR-7480抗体のVLのアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQAPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL

配列番号38: MOR-7480抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQAPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号39: MOR-7480; MOR-7483抗体のVHの核酸配列
caggtgcaattggttcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgaaagcctgaaaattagctgcaaaggttccggatattccttttctacttattggatttcttgggtgcgccagatgcctgggaagggtctcgagtggatgggcaagatctatccgggtgatagctataccaattattctccgagctttcagggccaggtgactattagcgcggataaaagcattagcaccgcgtatcttcaatggagcagcctgaaagcgagcgatacggccatgtattattgtgcgcgtggttatggtatttttgattattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcctca

配列番号40: MOR-7480抗体のVLの核酸配列
Gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggtgatcagtatgctcattggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttgttgtgatttatcaggataagaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgcgctacttatactggttttggttctcttgctgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtccta

配列番号41: MOR-7480; MOR-7483抗体の全長重鎖 (IgG2)の核酸配列
caggtgcaattggttcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgaaagcctgaaaattagctgcaaaggttccggatattccttttctacttattggatttcttgggtgcgccagatgcctgggaagggtctcgagtggatgggcaagatctatccgggtgatagctataccaattattctccgagctttcagggccaggtgactattagcgcggataaaagcattagcaccgcgtatcttcaatggagcagcctgaaagcgagcgatacggccatgtattattgtgcgcgtggttatggtatttttgattattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号42: MOR-7480抗体の全長軽鎖の核酸配列
gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggtgatcagtatgctcattggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttgttgtgatttatcaggataagaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgcgctacttatactggttttggttctcttgctgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtccta

配列番号43: MOR-7480.1; MOR-7480.2; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のVHのアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS

配列番号44: MOR-7480.1; MOR-7480.2; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体の全長重鎖 (IgG2)のアミノ酸配列
evqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgysfstywiswvrqmpgkglewmgkiypgdsytnyspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycargygifdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号45: MOR-7480.1抗体のVLのアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL

配列番号46: MOR-7480.1抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号47: MOR-7480.1; MOR-7480.2; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のVHの核酸配列
gaggtgcaattggttcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgaaagcctgaggattagctgcaaaggttccggatattccttttctacttattggatttcttgggtgcgccagatgcctgggaagggtctcgagtggatgggcaagatctatccgggtgatagctataccaattattctccgagctttcagggccaggtgactattagcgcggataaaagcattagcaccgcgtatcttcaatggagcagcctgaaagcgagcgatacggccatgtattattgtgcgcgtggttatggtatttttgattattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcctca

配列番号48: MOR-7480.1抗体のVLの核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtgctggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgcgccacctacaccggcttcggcagcctggccgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta

配列番号49: MOR-7480.1; MOR-7480.2; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体の全長重鎖 (IgG2)の核酸配列
gaggtgcaattggttcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgaaagcctgaggattagctgcaaaggttccggatattccttttctacttattggatttcttgggtgcgccagatgcctgggaagggtctcgagtggatgggcaagatctatccgggtgatagctataccaattattctccgagctttcagggccaggtgactattagcgcggataaaagcattagcaccgcgtatcttcaatggagcagcctgaaagcgagcgatacggccatgtattattgtgcgcgtggttatggtatttttgattattggggccaaggcaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号50: MOR-7480.1抗体の全長軽鎖の核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtgctggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgcgccacctacaccggcttcggcagcctggccgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号51: MOR-7480.2抗体のVLのアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL

配列番号52: MOR-7480.2抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号53: MOR-7480.2抗体のVLの核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtggtggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgcgccacctacaccggcttcggcagcctggccgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta

配列番号54: MOR-7480.2抗体の全長軽鎖の核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtggtggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgcgccacctacaccggcttcggcagcctggccgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号55: MOR-7483; MOR-7483.1; MOR-7483.2抗体のL-CDR3
STYTFVGFTTV

配列番号56: MOR-7483抗体のVLのアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQAPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVL

配列番号57: MOR-7483抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQAPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号58: MOR-7483抗体のVLの核酸配列
Gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggtgatcagtatgctcattggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttgttgtgatttatcaggataagaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgctctacttatacttttgttggttttactactgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtccta

配列番号59: MOR-7483抗体の全長軽鎖の核酸配列
Gatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcagaccgcgcgtatctcgtgtagcggcgataatattggtgatcagtatgctcattggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttgttgtgatttatcaggataagaatcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgctctacttatacttttgttggttttactactgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号60: MOR-7483.1抗体のVLのアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVL

配列番号61: MOR-7483.1抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号62: MOR-7483.1抗体のVLの核酸配列
Agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtgctggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgctctacttatacttttgttggttttactactgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta

配列番号63: MOR-7483.1抗体の全長軽鎖の核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtgctggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgctctacttatacttttgttggttttactactgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号64: MOR-7483.2抗体のVLのアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVL

配列番号65: MOR-7483.2抗体の全長軽鎖のアミノ酸配列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVVVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCSTYTFVGFTTVFGGGTKLTVLgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号66: MOR-7483.2抗体のVＬの核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtggtggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgctctacttatacttttgttggttttactactgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta

配列番号67: MOR-7483.2抗体の全長軽鎖の核酸配列
agctacgagctgacccagccccccagcgtgtccgtgagccctggccagaccgccagcatcacctgcagcggcgacaacatcggcgaccagtacgcccactggtatcagcagaagcccggccagagccccgtggtggtgatctaccaggacaagaaccggcccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccgccaccctgaccatcagcggcacccaggccatggacgaggccgactactactgctctacttatacttttgttggttttactactgtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

配列番号68: ヒト4-1BBのアミノ酸配列
mgnscynivatlllvlnfertrslqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel

配列番号69: ヒトIgG1定常領域のアミノ酸配列
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号70: ヒトIgG1定常領域の核酸配列
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

配列番号71: ヒトIgG2定常領域のアミノ酸配列
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

配列番号72: ヒトIgG2定常領域の核酸配列
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

配列番号73: ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs

配列番号74: ヒトラムダ軽鎖定常領域の核酸配列
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA

Claims (7)

  1. 単離抗体またはその抗原結合部分であって：
    （ａ）配列番号２９に示すＨ−ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号３０に示すＨ−ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号３１に示すＨ−ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号３４に示すＬ−ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号３５に示すＬ−ＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号３６に示すＬ−ＣＤＲ３
    を含む、前記抗体または抗原結合部分。
  2. 配列番号４３に示すＶＨ領域アミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  3. 配列番号４５に示すＶＬ領域アミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  4. 配列番号４３に示すＶＨ領域アミノ酸配列および配列番号４５に示すＶＬ領域アミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  5. 配列番号４４に示す重鎖アミノ酸配列を含み、そして配列番号４６に示す軽鎖アミノ酸配列をさらに含み、但し配列番号４４のＣ末端リジン残基が場合によって存在しない、単離抗体。
  6. ＩｇＧ２である、請求項１〜５のいずれか記載の単離抗体。
  7. 請求項１〜６記載の抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
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