JP2019526279A - プログラム化された細胞死蛋白質リガンド−1(pd−l1)に対する抗体及びその用途 - Google Patents
プログラム化された細胞死蛋白質リガンド−1(pd−l1)に対する抗体及びその用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号18の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号3の重鎖CDR1、配列番号10の重鎖CDR2、及び配列番号19の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号11の重鎖CDR2、及び配列番号20の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号12の重鎖CDR2、及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号6の重鎖CDR1、配列番号13の重鎖CDR2、及び配列番号22の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号23の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2、及び配列番号24の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号25の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、又は
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含むことができる。
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号90の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号91の軽鎖CDR1、配列番号106の軽鎖CDR2、及び配列番号123の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号107の軽鎖CDR2、及び配列番号124の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号93の軽鎖CDR1、配列番号109の軽鎖CDR2、及び配列番号125の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号94の軽鎖CDR1、配列番号110の軽鎖CDR2、及び配列番号126の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号95の軽鎖CDR1、配列番号111の軽鎖CDR2、及び配列番号127の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号96の軽鎖CDR1、配列番号112の軽鎖CDR2、及び配列番号128の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号129の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号113の軽鎖CDR2、及び配列番号131の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号132の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号114の軽鎖CDR2、及び配列番号134の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号115の軽鎖CDR2、及び配列番号135の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号98の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号116の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号136の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号99の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号137の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号117の軽鎖CDR2、及び配列番号138の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号118の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号119の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号100の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号140の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号142の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号143の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号101の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号102の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号144の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2、及び配列番号16の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号88の軽鎖CDR1、配列番号103の軽鎖CDR2、及び配列番号120の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号18の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号90の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号3の重鎖CDR1、配列番号10の重鎖CDR2、及び配列番号19の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号91の軽鎖CDR1、配列番号106の軽鎖CDR2、及び配列番号123の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号11の重鎖CDR2、及び配列番号20の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号107の軽鎖CDR2、及び配列番号124の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号12の重鎖CDR2、及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号6の重鎖CDR1、配列番号13の重鎖CDR2、及び配列番号22の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号93の軽鎖CDR1、配列番号109の軽鎖CDR2、及び配列番号125の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号23の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号94の軽鎖CDR1、配列番号110の軽鎖CDR2、及び配列番号126の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2、及び配列番号24の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号95の軽鎖CDR1、配列番号111の軽鎖CDR2、及び配列番号127の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;又は
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号25の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号96の軽鎖CDR1、配列番号112の軽鎖CDR2、及び配列番号128の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域。
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号129の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号113の軽鎖CDR2、及び配列番号131の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号132の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号114の軽鎖CDR2、及び配列番号134の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号115の軽鎖CDR2、及び配列番号135の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号98の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号116の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号136の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号99の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号137の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号117の軽鎖CDR2、及び配列番号138の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号118の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号119の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号100の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号140の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号142の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号143の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号101の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;又は
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号102の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号144の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域。
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号136の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号119の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号143の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
配列番号35〜配列番号41で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR2、
配列番号42〜配列番号49で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR3、又は
配列番号50〜配列番号54で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR4を含むことができる。
配列番号164〜配列番号184で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR2、
配列番号185〜配列番号210で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR3、又は
配列番号211〜配列番号216で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR4を含むことができる。
配列番号68の重鎖可変領域及び配列番号228の軽鎖可変領域、
配列番号71の重鎖可変領域及び配列番号231の軽鎖可変領域、
配列番号76の重鎖可変領域及びに配列番号236の軽鎖可変領域、
配列番号80の重鎖可変領域及びに配列番号240の軽鎖可変領域、
配列番号83の重鎖可変領域及びに配列番号243の軽鎖可変領域、又は
配列番号85の重鎖可変領域及び配列番号245の軽鎖可変領域を含むことができる。
1.PD−L1蛋白質発現ベクターの作製
PD−L1のクローニングはJurkat細胞cDNAライブラリー(Stratagene、米国)を用いて、細胞外ドメインだけを得るために5’と3’に制限酵素SfiIサイトが含まれたPD−L1に対するプライマ(表1)を用いて重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction,PCR)によって増幅させた。増幅されたPCR産物はN293Fベクターを用いてカルボキシ−末端にヒトFc(配列番号248)、マウスFc(配列番号
249)を融合させて作製した(図1)。
抗原を動物細胞で発現させるために、HEK−293F細胞にプラスミドDNAを形質感染(transfection)させた。形質感染を行うためのポリプレクス(polyplex)反応液は、フリースタイル293発現培地3mlにプラスミドDNAを25μg入れて混ぜた後、さらに2mg/ml PEI(Polyethylenimine)(polyplUSA−形質感染、USA)50μlを入れて再び混ぜた。ポリプレクス反応液は15分間常温で反応させた後、1X106cells/mlに培養された40mlの培養液に入れ、120rpmで37℃、8% CO2で24時間培養した。形質感染24時間後に補強剤(supplement)のSoytone(BD,USA)を最終濃度が10g/Lになるように添加する。7日間HEK−293Fを用いた臨時発現システムを用いて抗体を生産した。培養液から抗原を得るために親和度クロマトグラフィー(affinity chromatography)を行った。7日目に回収した培養液から細胞と細胞残余物(debris)を除去するために5000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液を得た。上澄み液をDPBSで洗浄した組換え蛋白質Aアガロースレジンと4℃で16時間反応させた。
1.抗原準備
実施例1で作製したPD−L1−hFc、PD−L1−mFc及びSino Biological Inc.から購入したPD−L1−his(Catalog Number,10377−H08H)蛋白質抗原50ugを免疫吸着(immunosorb)チューブにコーティングした後、ブロッキング(blocking)を行った。
ヒト抗体ライブラリーファージは2.7×1010の多様性を持つヒトscFvライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを30℃で16時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をPEGで濃縮した後、これをPBS緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で2時間反応させた後、1XPBS/Tと1XPBSで洗浄後、抗原に特異的に結合したscFv−ファージだけを溶出した。溶出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程によって陽性ファージのプールを得、最初ラウンドのパンニングで増幅されたファージを用いて、PBST洗浄段階で回数を増やす以外は同一の方法で2ラウンド及び3ラウンドパンニングを行った。その結果、表2のように、3ラウンドパンニングにおいて抗原に結合したファージ数が、インプット対アウトプットが多少増加したことを確認した。
各1次から3次までパンニングして凍らせておいた細胞ストック(stock)を、5mlの2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地にOD600で0.1となるように入れた後、37℃で2〜3時間(OD600=0.5〜0.7)培養後にM1ヘルパーファージを感染し、2xYTCMK、5mM MgCl2 1mM IPTG培地に30℃で16時間培養した。培養した細胞を遠心分離(4500rpm,15min,4℃)後に上澄み液を新しいチューブに移した(1次〜3次パンニングpoly scFv−phage)。96ウェル免疫−プレート(NUNC439454)に2種類の抗原のそれぞれをウェル当たり100ngずつ4℃で16時間程度コーティングバッファー(coating buffer)でコーティングした後、PBSに溶かした4%スキムミルク(skim milk)を用いて各ウェルをブロッキング(blocking)した。
結合能の大きい多クローンファージ抗体群(3次パンニング)から得たコロニーを2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に入れた後、1ml 96−深ウェルプレート(パイオニア90030)に37℃で16時間培養した。このように育てた細胞からOD600で値が0.1となるように100〜200ulを取って1mlの2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に入れた後、96−深ウェルプレートに37℃でOD600でその値が0.5〜0.7となるように2〜3時間培養した。M1ヘルパーファージをMOI値が1:20となるように感染し、2xYTCMK、5mM MgCl2 1mM IPTG培地に30℃で16時間培養した。
前記選別された単一クローンに対してDNA精製キット(Qiagen、ドイツ)を用いてDNA−prepを行ってDNAを得、配列分析を依頼した(ソルジェント社)。配列分析結果から、選別された抗体のVHとVLのCDR部位を確認し、それらの抗体とジャームライン(germ line)抗体群の類似性をNCBIのウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/のIg BLASTプログラムを用いて調査した。その結果、10種のPD−L1に特異的なファージ抗体を得た。これを下記表3に整理して提示する。
1.scFv形態をIgG形態に転換(conversion)
選別された10種のPD−L1に対する単一クローンファージ抗体をファージからIgG全体ベクター(whole vector)に転換するために重鎖と軽鎖に対してPCR(iCycler iQ,BIO−RAD)を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれDNA−gel extraction kit(Qiagen)でDNAを溶出した。ライゲーション(Ligation)はvector 1ul(10ng)重鎖(100〜200ng)15ul、10x Buffer 2ul、ligase(1U/ul)1ul、蒸溜水を混合して室温で1〜2時間放置後、形質転換細胞(competent cell)(XL1−blue)に入れて氷に5分間置き、42℃で90秒間熱衝撃(heat shock)を与えた。
クローニングされたpNATVHとpNATVLベクターは6:4の割合でHEK293F細胞に同時形質感染(co−形質感染)して7日目の上澄み液を回収し、遠心分離と0.22μmTop−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質A親和度クロマトグラフィーを行ってIgG抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー(glycine buffer)を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー(resuspension buffer)はPBSとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をBCA及びナノドロップ(nano drop)を用いて定量し、15種の抗体を還元、非還元条件で各5ugずつローディングし、SDS−PAGE分析して精製蛋白質の純度及び移動度(mobility)状態を確認した(図5)。
1.抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はPD1/PD−L1遮断バイオアッセイキット(promega,J1250)を用いて進行した。PD−L1が高発現しているCHO細胞株を96−ウェルプレートに塗抹し、16時間以上培養後に、一定濃度に連続希釈された各抗体を処理して、ヒトPD−1が高発現するJurkat細胞株を6時間一緒に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼ(luciferase)が基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計(SpectraMax M5 spectraphotometer,Molecular Devices、米国)で測定した。10種のPD−L1抗体は、PD−1/PD−L1複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値から抗体の活性を確認し、16E12が対照抗体と類似した活性度を示した(図6)。
PD−L1を高発現させる形質転換細胞プールは、ヒトPD−L1を含んでいるpcDNA3.1プラスミドをHEK293Eに形質転換させ、150ug/ml Zeocin(#R25001,Thermo Fisher)の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールは各anti−PD−L1を用いたFACS(fluorescence activated cell sorting)分析で確認されて選択され、FACS結合アッセイやFACS競合アッセイのような機能評価法に使用された。
ProteOn XPR36(BioRad)機器で行った。GLCセンサーチップ(BioRad)を機器に装着し、PBST緩衝溶液で洗浄をした後、EDC/sulfo−NHS混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。10mM酢酸ナトリウム(sodium acetate)緩衝液(pH5.0)に5ug/ml濃度で溶かしたPD−L1−hFcを注入してGLCセンサーチップに固定化させた。
1.PD−L1−16E12抗体の最適化のためのライブラリーの作製
抗体最適化は、重鎖は固定し、ワイバイオロジックスで保有している105〜106軽鎖(LC)プール(pool)を入れて新しいLCシャフリングライブラリー(LC shuffling library)を作製し、LCシャフリング、重鎖の疎水性コア(hydrophobic core)、露出残基(exposed residue)、電荷クラスター(charge cluster)、塩ブリッジ(salt bridge)などのように構造的に重要な部位の残基と比較分析をして保存された残基(conserved residue)に変異させた後にLCシャフリングを進行するコアパッキング(core packing)+LCシャフリング、抗体可変領域(antibody variable region)のDNAはin vivo親和度成熟(affinity maturation)過程で頻繁に変異(mutation)され得る変異ホットスポット(mutational hot spot)をランダムに変異させた後にLCシャフリングを進行するCDRホットスポット+LCシャフリングなどの3つの方法で進行した。
1.抗原準備
ワイバイオロジックスで生産したPD−L1−hFc、PD−L1−mFcとSino Biological Inc.から購入したPD−L1−his(Catalog Number,10377−H08H)蛋白質抗原50ugを免疫吸着チューブでコーティングした後、ブロッキング(blocking)を行った。
ヒト抗体ライブラリーファージは、2.7×1010の多様性を持つヒトscFvライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを30℃で16時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をPEGで濃縮した後、これをPBS緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で2時間反応させた後、1XPBS/Tと1XPBSで洗浄後に抗原に特異的に結合したscFv−ファージだけを溶出した。
パンニングから得たコロニーを2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に入れた後、1ml 96−深ウェルプレート(96−deep well plate:パイオニア90030)に37℃で16時間培養した。このように育てた細胞からOD600で値が0.1となるように100〜200ulを取って1mlの2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に入れた後、96−深ウェルプレートに37℃でOD600でその値が0.5〜0.7となるように2〜3時間培養した。M1ヘルパーファージをMOI値が1:20となるように感染し、2xYTCMK、5mM MgCl2 1mM IPTG培地に30℃で16時間培養した。
選別された単一クローンに対してDNA精製キット(Qiagen、ドイツ)を用いてDNA−prepを行ってDNAを得、配列分析を依頼した(ソルジェント社)。配列分析結果から、選別された抗体のVHとVLのCDR regionを確認し、それら抗体とジャームライン(germ line)抗体群の類似性をNCBIのウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/のIg BLASTプログラムを用いて調査し、その結果、21種の親抗体よりも結合力の高い特異的なファージ抗体を得た。これを次表7に整理して提示する。
1.scFv形態をIgG形態に転換(conversion)
選別された21種のPD−L1に対する単一クローンファージ抗体をファージからIgG全体ベクターに転換するために重鎖と軽鎖に対してPCR(iCycler iQ,BIO−RAD)を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれDNA−ゲル抽出キット(DNA−gel extraction kit:Qiagen)でDNA溶出した。ライゲーション(ligation)はベクター1ul(10ng)重鎖15ul(100〜200ng)、10xバッファー2ul、リガーゼ(1U/ul)1ul、蒸溜水を混合して室温で1〜2時間放置後、形質転換細胞(competent cell:XL1−blue)に入れて氷に5分間置き、42℃で90秒間熱衝撃(heat shock)を与えた。
クローニングされたpNATVHとpNATVLベクターは6:4の割合でHEK293F細胞に同時形質感染(co−形質感染)して7日目の上澄み液を回収し、遠心分離と0.22μmTop−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質A親和度クロマトグラフィーを行ってIgG抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー(glycine buffer)を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー(resuspension buffer)はPBSとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をBCA及びナノドロップ(nano drop)を用いて定量し、21種の抗体を還元、非−還元条件で各5ugずつローディングし、SDS−PAGE分析して精製蛋白質の純度及び移動度(mobility)状態を確認した。また、上澄み液の一部は親抗体との発現率を比較するためにSDS−PAGEにローディングしたし、大部分の抗体が親抗体に比べて発現率が増加した。
1.抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はPD−1/PD−L1遮断バイオアッセイキット(blockade bioassay kit:promega,J1250)を用いて進行した。PD−L1が高発現しているCHO細胞株を96−ウェルプレートに塗抹し、16時間以上培養後、一定濃度で連続希釈された各抗体を処理して、ヒトPD−1が高発現するJurkat細胞株を6時間共に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼが基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計(SpectraMax M5 spectraphotometer,Molecular Devices、米国)で測定した。21種のPD−L1抗体は、PD−1/PD−L1複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値で抗体の活性を確認した。その結果、4A7、4A11、4C9、4F5、4H5、4H8が親抗体に比べて活性が増加したし、対照抗体と類似した活性度を示した(図11及び表10)。
ヒトPD−1を高発現させる形質転換細胞プールはヒトPD−1(NM_005018.2)或いはヒトPD−L1(NM_014143.2)を含んでいるpcDNA3.1プラスミドをHEK293Eに形質転換させ、400ug/ml Zeocin(#R25001,Thermo Fisher)の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールはそれぞれanti−PD−1(#557860,BD)を用いたFACs(fluorescence activated cell sorting)分析によって確認されて選択され、FACs結合アッセイやFACs競合アッセイ(Competition assay)のような機能評価法に使用された。ヒトPD−L1を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり0.5〜1×106の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と4℃で20分間反応させた。その後、細胞は2%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)の含まれたPBS(#LB001−02,welgene)で3回洗浄し、FITC(fluorescein isothiocyanate)蛍光物質が結合された抗−ヒトIgG抗体(#FI−3000、Vectorlabs)を用いて4℃で20分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に0.5mlの2% FBS(#26140−079,Thermo fisher)の入っているPBSで懸濁させた後、流細胞分析機であるFACSCanto II flow cytometer(BD Biosciences、米国)を用いて分析した(表11)。
3.酵素免疫吸着を用いたPD−1/PD−L1複合体の形成を防ぐ抗体の阻害能力
ヒトPD−1−Fc(S1420,Y−Biologics)を96−ウェル免疫マイクロプレート(96−well immuno microplate:#439454,Thermo)のウェルに4℃で16時間固定させ、0.05% tween−20(#P9416,Sigma−Aldrich)の入っているPBSで3回洗浄後、4%スキムミルク(#232120,Becton,Dickinson and Company)の含まれた洗浄液で常温に1時間放置することによって非特異的結合を遮断した。その間に一定希釈倍数で連続希釈された各抗体とヒトPD−L1−His(S1479,Y−Biologics)を常温に1時間反応させた後、準備したマイクロプレートに入れて常温に1時間放置する。同じ洗浄方法を適用した後、anti−Biotin−His抗体(#MA1−21315−BTIN,Thermo)を1:2000に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に1時間反応させ、同じ方法で洗浄した後にStreptavidin poly−HRP抗体(#21140、Pierce)を1:5000に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に1時間反応させた後、同じ方法で洗浄した。100ul TMB基質溶液(#T0440,Sigma−Aldrich)を入れた後、光を遮断して常温で3分間放置後に50ul 2.5M硫酸(#S1478,Samchun)を入れて反応を中断させ、分光光度計(#GM3000、Glomax(登録商標) Discover System Promega)を用いて450nmで吸光度を測定した。その結果を図14に示した。
ProteOn XPR36(BioRad)機器で行った。GLCセンサーチップ(BioRad)を機器に装着し、PBST緩衝溶液で洗浄した後、EDC/sulfo−NHS混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。10mM酢酸ナトリウム(sodium acetate)緩衝液(pH5.0)に5ug/ml濃度で溶かしたPD−L1−hFcを注入してGLCセンサーチップに固定化させた。
96−ウェル免疫−プレートに抗原PD−L1野生型(PD1 wild type:WT)又は多数の変異体(mutants)をウェル当たり100ngずつ4℃で16時間コードした後、PBSに溶かした4%スキムミルクを用いて各ウェルを遮断(blocking)した。各ウェルごとに0.2ml PBS/Tを使って洗った後、16時間培養した単一クローンscFv−phage(each100scFv−phage)を各ウェルに100μlずつ入れて常温で2時間反応させた。また、各ウェルごとに0.2ml PBS/Tを使って4回洗った後、2次抗体(second antibody)であるanti−Fabを1/2000に希釈し、室温で1時間反応させた。0.2ml PBS/Tで洗った後に発色して吸光度490nmで測定した。
別個のヒトから分離された単球由来樹状細胞(monocyte derived dendritic cell)にT細胞を1:10の割合で混ぜ、5日培養後に培養液のインターフェロンガンマの量を測定すると、16E12の親抗体を入れたものにおいて濃度に依存してインターフェロンガンマの量が増加することを確認した(図17)。
16E12−2B9PD−L1単一クローン抗体の生体内効能を確認するためにBAlb/Cマウスに脇腹の皮下に大腸癌細胞であるCT−26細胞を8×106個投与し、腫瘍の大きさが粟粒ほどの時から3週にわたって週2回ずつ5mg/kgの容量で投与しながら腫瘍の成長を観察した場合、PD−L1単一クローン抗体投与群で顕著な腫瘍大きさの増減が観察された(図18)。
抗体蛋白質をDPBSに希釈して3uM、45ulを作り、200x sypro orange dye(#S6650,Thermo)5ulと混ぜてqPCR Tube(#B77009,B57651,bioplastics)に50ulずつ分注する。Biorad CFX96 real time PCR機器を用いてqPCRを実施した。qPCR条件は次のように25℃で30秒間反応後、99℃まで1度ずつ増加させるが、各温度で1分間反応させ、最後の25℃で10秒反応をさせて終えた。抗体構造が解かれる速度定数としてはTm(Melting temperature、溶融温度)を使用した。その結果は次表13の通りである。
抗PD−L1抗体のPD−L2との結合有無を確認するためにヒトPD−L2−Fc(#10292−H02H,Sino)を96−ウェル免疫マイクロプレート(96−well immuno microplate:#439454,Thermo)のウェルに4℃で16時間固定させ、0.05% tween−20(#P9416,Sigma−Aldrich)の入っているPBSで3回洗浄後、4%スキムミルク(#232120,Becton,Dickinson and Company)の含まれた洗浄液で常温に1時間放置することによって非特異的結合を遮断した。その間に一定希釈倍数で連続希釈された各抗体或いは陽性対照として使用されたヒトPD−1−His(S1352,Y−Biologics)を常温に1時間反応させた後、準備したマイクロプレートに入れて常温に1時間放置する。同じ洗浄方法を適用した後、anti・Biotin−His抗体(#MA1−21315−BTIN,Thermo)を1:2000に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に1時間反応させた後、同じ方法で洗浄した後にStreptavidin poly−HRP抗体(#21140、Pierce)を1:5000に希釈してマイクロプレートのウェルに入れ、常温に1時間反応させた後に、同じ方法で洗浄した。100ul TMB基質溶液(#T0440,Sigma−Aldrich)を入れた後、光を遮断して常温で3分間放置後に50ul 2.5M硫酸(#S1478,Samchun)を入れて反応を中断させ、分光光度計(#GM3000、Glomax(登録商標) Discover System Promega)を用いて450nmで吸光度を測定した。その結果を図19に示した。
Claims (12)
- 配列番号1〜配列番号7で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖CDR1、
配列番号8〜配列番号15で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号16〜配列番号25で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号88〜配列番号102で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号103〜配列番号119で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号120〜配列番号144で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、PD−L1に結合する抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号1の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2、及び配列番号16の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号18の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号3の重鎖CDR1、配列番号10の重鎖CDR2、及び配列番号19の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号11の重鎖CDR2、及び配列番号20の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号12の重鎖CDR2、及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号6の重鎖CDR1、配列番号13の重鎖CDR2、及び配列番号22の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号23の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2、及び配列番号24の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号25の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、又は
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号9の重鎖CDR2、及び配列番号17の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号88の軽鎖CDR1、配列番号103の軽鎖CDR2、及び配列番号120の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号90の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号91の軽鎖CDR1、配列番号106の軽鎖CDR2、及び配列番号123の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号107の軽鎖CDR2、及び配列番号124の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号93の軽鎖CDR1、配列番号109の軽鎖CDR2、及び配列番号125の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号94の軽鎖CDR1、配列番号110の軽鎖CDR2、及び配列番号126の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号95の軽鎖CDR1、配列番号111の軽鎖CDR2、及び配列番号127の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号96の軽鎖CDR1、配列番号112の軽鎖CDR2、及び配列番号128の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号129の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号113の軽鎖CDR2、及び配列番号131の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号132の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号97の軽鎖CDR1、配列番号114の軽鎖CDR2、及び配列番号134の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号92の軽鎖CDR1、配列番号115の軽鎖CDR2、及び配列番号135の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号98の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号116の軽鎖CDR2、及び配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号136の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号99の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号137の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号117の軽鎖CDR2、及び配列番号138の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号118の軽鎖CDR2、及び配列番号133の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号119の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号100の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号140の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号139の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号142の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号89の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2、及び配列番号143の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号101の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号141の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号102の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2、及び配列番号144の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号26〜配列番号34で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR1、
配列番号35〜配列番号41で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR2、
配列番号42〜配列番号49で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR3、又は
配列番号50〜配列番号54で構成された群から選ばれる重鎖可変領域FR4を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号145〜配列番号163で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR1、
配列番号164〜配列番号184で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR2、
配列番号185〜配列番号210で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR3、又は
配列番号211〜配列番号216で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域FR4を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号57〜配列番号87で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号217〜配列番号247で構成された群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
- 請求項8の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項9の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 次の段階を含むPD−L1に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(a)請求項10の細胞を培養する段階;及び
(b)前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物。
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