JP6925421B2

JP6925421B2 - プログラム化された細胞死蛋白質リガンド−１（ｐｄ−ｌ１）に対する抗体及びその用途

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Publication number: JP6925421B2
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Description

本発明は、ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ１）に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法及びこれを含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物に関する。

抗原特異Ｔ−リンパ球細胞の免疫反応は非常に複雑で精巧に調節される過程である。まず、Ｔ−リンパ球の活性化は、Ｔ−リンパ球細胞表面に存在するＴ−リンパ球抗原受容体（Ｔ−ｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）が抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ，ＡＰＣ）のＭＨＣ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ、ヒトの場合ＨＬＡ（ｈｕｍａｎｌｅｕｃｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ）ＣｌａｓｓＩＩ分子に結合した抗原を認知することから始まる。この時、Ｔ−リンパ球が十分に活性化するためには抗原の認知と同時に刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）信号が必要であるが、抗原提示細胞で発現するＣＤ８０、ＣＤ４０などがＴ−リンパ球細胞表面のリガンドに該当するＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌなどと同時に結合することによってなり、これによってサイトカインの分泌が活性化される。ＴＣＲ−ＭＨＣ／エピトープの結合による抗原の認知がされても、同時刺激信号の信号伝達がない場合、Ｔ−リンパ球の活性を達成されない。。

しかし、活性化されたＴ−リンパ球は一定時間後に非活性化されるように同時に抑制（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）信号も活性化される。これによって、過度な免疫刺激による組織損傷などを予防することができる。様々な同時抑制信号があり、代表的にＴ−リンパ球のＣＴＬＡ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ）−４とＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ−１）、これに相応する抗原提示細胞リガンドはＣＤ８０及びＣＤ８６とＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ１）が関与する。ＣＴＬＡ−４の場合、リガンドであるＣＤ８０とＣＤ８６と結合を通じてｎａｉｖｅ又はｍｅｍｏｒｙＴ−リンパ球の非活性化機能を主に有しており、ＰＤ−１の場合、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２を通じて末梢組織でＴ−リンパ球機能を調節する。

人体の免疫機能は抗原認知と同時にこのような同時刺激信号及び同時抑制信号の調節を通じて全体的なＴリンパ球機能を調節する。このような調節機転を免疫検問（ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）という。人体の免疫機能は、腫瘍細胞で起きる突然変異などの変化によって発現する腫瘍特異抗原（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）を感知し、これによって腫瘍細胞又はウイルス感染源などを除去する。

ただし、一部の腫瘍細胞は逆にこのような免疫攻撃を回避するために腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏ−ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を変化させて免疫機能を抑制したり、Ｔ細胞免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）又は免疫編集（ｉｍｍｕｎｏ−ｅｄｉｔｉｎｇ）などを通じて免疫回避（ｉｍｍｕｎｅｅｓｃａｐｅ）をする。

このような回避戦略の一つとして、免疫検問（ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）機能の変化を用いて腫瘍特異Ｔリンパ球細胞の機能を抑制する。すなわち、腫瘍細胞でこのような抑制免疫検問を活性化させることによって腫瘍特異Ｔ−リンパ球細胞の攻撃を回避する。これと関連して、ＰＤ−１又はリガンドＰＤ−Ｌ１に対する単クローン抗体を用いてその機能を抑制することによって、抑制された腫瘍特異Ｔ−リンパ球細胞活性及び効果を増強させ、抗腫瘍効果を得ることができる。

このような技術的背景の下で、本出願の発明者等はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者等はＰＤ−Ｌ１に高い親和力で結合する抗−ＰＤ−Ｌ１抗体を開発し、このような抗−ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を阻害することによって、目的する免疫抗癌剤又は感染疾患治療剤の役割を担うことができることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、ＰＤ−Ｌ１に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜配列番号７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８〜配列番号１５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６〜配列番号２５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８８〜配列番号１０２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３〜配列番号１１９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０〜配列番号１４４で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。

本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

本発明はまた、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

ＰＤ−Ｌ１発現ベクターに対する模式図である。ＰＤ−Ｌ１蛋白質精製結果を示す図である：図２Ａは、ＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥｇｅｌ．ＲＥ（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）とＮＲ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件における蛋白質確認結果を示す図である；図２Ｂは、Ｇ−３０００ＳＷＸＬＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示す図である。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、展開溶媒はＰＢＳである；図２Ｃは、ＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥｇｅｌ．ＲＥ（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）とＮＲ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件における蛋白質確認結果を示す図である；図２Ｄは、Ｇ−３０００ＳＷＸＬＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示す図である。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、展開溶媒はＰＢＳである。パンニング回数によるＰＤ−Ｌ１抗原に対する結合力増加結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓにのみ結合能が強いモノファージの結合能測定のためのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。選別されたＰＤ−Ｌ１抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎｖｉｔｒｏ効能評価結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１抗体の濃度依存的なｉｎｖｉｔｒｏ効能評価結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１過発現細胞でＰＤ−Ｌ１抗体の結合力測定結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃとＰＤ−Ｌ１−１６Ｅ１２とのキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）測定結果を示す図である。最適化単一クローンを選別した結果を示す図である。本発明に係るＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎｖｉｔｒｏ効能を評価した結果を示す図である。本発明に係るＰＤ−Ｌ１抗体の濃度依存的なｉｎｖｉｔｒｏ効能を評価した結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１過発現細胞で抗体の結合力を測定した結果を示す図である。選別された抗体で酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を防ぐ抗体の阻害効果を確認した結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃとＰＤ−Ｌ１−１６Ｅ１２−４Ｆ５とのキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）測定結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１変異体蛋白質及び単一クローン抗体の結合測定結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体によって異種ＭＬＲ（ＭｉｘｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＲｅａｃｔｉｏｎ）で活性増加を示すことを確認した結果である。選択されたＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）癌動物モデルにおける効能評価結果を示す図である。本発明に係る抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ２との結合有無を確認した結果を示す図である。

特別に定義されない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は本技術分野において周知であり、通常使われるものである。

本発明は一観点において、配列番号１〜配列番号７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８〜配列番号１５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６〜配列番号２５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８８〜配列番号１０２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３〜配列番号１１９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０〜配列番号１４４で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

本明細書の“ＰＤ−Ｌ１”は、活性化されたＴ及びＢ細胞上で主に発現する免疫抑制受容体“プログラムされた死受容体１（ＰＤ−１）”に対するリガンドであり、ＰＤ−１とリガンドであるＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２とが結合する場合、抗原受容体シグナリングを否定的に調節することがある。ＰＤ−１に対するリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）は構成的に発現するか、又は非−造血細胞組織及び様々な腫瘍型を含む多数の細胞型に誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１はＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞（ＤＣｓ）上で発現するが、さらに末梢細胞、類似微細血管内皮細胞及び心臓、肺などのような非−リンパ器官上でも発現する。これに対し、ＰＤ−Ｌ２は単に大食細胞及び樹状細胞上でのみ発見される。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、末梢耐性を維持するにおいてＰＤ−１の役割を提示し、末梢で自己−反応性Ｔ−細胞及びＢ−細胞反応を調節することに寄与し得る。両方のリガンドとも細胞外領域でＩｇＶ−及びＩｇＣ−類似ドメインの両方を含む第Ｉ型膜貫通受容体である。両方のリガンドとも、公知でないシグナリングモチーフを持つ短い細胞質領域を含む。

多数の研究は、ＰＤ−１とそのリガンドの相互作用が試験管内及び生体内でリンパ球増殖を抑制することを明らかにした。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の混乱はＴ細胞増殖及びサイトカイン生産を増加させ、細胞周期の進行を遮断することが知られている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、増強された腫瘍−特異的Ｔ−細胞免疫を誘導し得るので、免疫システムによって腫瘍細胞を掃除するのに役立ち得る。また、慢性ＨＩＶ感染時に、ＨＩＶ−特異的ＣＤ^８＋Ｔ細胞は機能的に損傷され、サイトカイン及びエフェクタ分子を生産する能力の減少及び増殖する能力の減少を示し、ＰＤ−１はＨＩＶ感染された個体のＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に高発現するが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断によってＨＩＶペプチド刺激に反応し、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞が増殖してサイトカインを生産する能力を向上させることによって、Ｔ細胞活性又は抗ウイルス免疫反応を増大させることができる。

本明細書で使われる用語、“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗−ＰＤ−Ｌ１抗体を意味する。本発明の範囲にはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

完全な抗体は２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はキャパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを持っている最小の抗体片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術はＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎＦｖ）は非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎＦｖ，ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ−末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。

一実施例において、本発明に係る抗体はＦｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選択され得る。例えば、不変領域はガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域はキャパ又はラムダ型であり得る。

本明細書で使われる用語、“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語、“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。

本発明の抗体は単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、又はこれら抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては同じものを指す。単一クローン抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に個別の決定因子（エピトープ）に対して指示された個別の抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤とは違い、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。

“エピトープ”は、抗体が特異的に結合し得る蛋白質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは通常、化学的に活性である表面分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般的に、特定の３次元の構造的特徴だけでなく特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しないという点で区別される。

前記“ヒト化”形態の非−ヒト（例：ｍｕｒｉｎｅ）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的する特異性、親和性及び能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

前記“ヒト抗体”とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含んだ抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるかそれと相同性である反面、残りの鎖は、他の種から由来したり、他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるかそれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）だけでなく、目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。

本願に使われたような“抗体可変ドメイン”とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインのことを指す。

“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。本発明は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

本発明において、前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号７で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、配列番号８〜配列番号１５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６〜配列番号２５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８８〜配列番号１０２で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３〜配列番号１１９で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０〜配列番号１４４で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

具体的に、本発明において、前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。

また、前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１００の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

本発明に係る一実施例において、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は次のものを含むことができる：
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

本発明の一実施例によって、最適化過程によって抗体を追加選別し、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができる：
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１００の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

具体的に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

本発明の一実施例によれば、配列番号２６〜配列番号３４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号３５〜配列番号４１で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号４２〜配列番号４９で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号５０〜配列番号５４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ４を含むことができる。

また、配列番号１４５〜配列番号１６３で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号１６４〜配列番号１８４で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号１８５〜配列番号２１０で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号２１１〜配列番号２１６で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ４を含むことができる。

“Ｆｖ”断片は完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインとが、例えばｓｃＦｖで強固に事実上共有的に連合した二量体からなる。

“Ｆａｂ”断片は軽鎖の可変及び不変ドメインと、重鎖の可変及び第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一般的にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端の近傍に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。

“単一鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、それらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。ＦｖポリペプチドはｓｃＦｖが抗原結合のために目的する構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。

ＰＤ−Ｌ１抗体は一価又は二価であり、単鎖又は二重鎖を含む。機能的に、ＰＤ−Ｌ１抗体の結合親和性は１０^−５Ｍ〜１０^−１２Ｍの範囲内にある。例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体の結合親和性は１０^−６Ｍ〜１０^−１２Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−１２Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−１２Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−１２Ｍ、１０^−５Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−６Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−１１Ｍ、１０^−５Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−６Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−５Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−６Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−５Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−６Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−７Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−５Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−６Ｍ〜１０^−７Ｍ、又は１０^−５Ｍ〜１０^−６Ｍである。

前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５７〜配列番号８７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５７〜配列番号８７で構成された群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。本発明の一実施例によれば、配列番号５８、６８、７１、７６、８０、８３又は８５の重鎖可変領域を含むことができる。

また、前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１７〜配列番号２４７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。前記ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１７〜配列番号２４７で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。本発明の一実施例によれば、配列番号２１８、２２８、２３１、２３６、２４０、２４３又は２４５の軽鎖可変領域を含むことができる。

本発明に係る具体的実施例において、配列番号５８の重鎖可変領域、並びに配列番号２１８の軽鎖可変領域、
配列番号６８の重鎖可変領域及び配列番号２２８の軽鎖可変領域、
配列番号７１の重鎖可変領域及び配列番号２３１の軽鎖可変領域、
配列番号７６の重鎖可変領域及びに配列番号２３６の軽鎖可変領域、
配列番号８０の重鎖可変領域及びに配列番号２４０の軽鎖可変領域、
配列番号８３の重鎖可変領域及びに配列番号２４３の軽鎖可変領域、又は
配列番号８５の重鎖可変領域及び配列番号２４５の軽鎖可変領域を含むことができる。

“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮蛋白質の少なくとも一部との融合蛋白質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化蛋白質変異体の大きなライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチド及び蛋白質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を持つポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。

ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規蛋白質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、蛋白質変異体の大きなライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を速かに分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮蛋白質、例えば遺伝子ＩＩＩ蛋白質又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白質を暗号化する核酸配列と融合させる。蛋白質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子ＩＩＩ蛋白質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた一価ファージディスプレイシステムが開発された。一価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩ蛋白質もまた発現して粒子感染性が維持される。

繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、数多くの方式、例えば無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的する特徴を伴う抗体又は抗原結合性蛋白質の発現に関してスクリーニングすることができる。

ファージディスプレイ技術は目的する特徴を持つ抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べていくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短い時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は数カ月の製造期間を必要とすることがある。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは毒性又は低抗原性の抗原に対しても抗体を生成させることができる。ファージ抗体ライブラリーをさらに用いて新規の治療的抗体を生成及び確認することができる。

ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。

ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離し得る技術は治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは抗体又は抗原結合性蛋白質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基での残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。

高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性蛋白質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域はこれらがしばしば抗原結合に参加することが明らかになった。重鎖上のＣＤＲ３領域は大きさ、配列及び構造的立体形態面において非常に多様であるので、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。

また、各位置において２０個アミノ酸全てを用いて可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。

本発明の抗体又は抗体断片は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識し得る範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより一層改善させるために抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異はアミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、模様及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の模様を有することがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むと解釈される。前記の実質的な同一性は、前述した本発明の配列と任意の他の配列をできるだけ対応するようにアラインし、当業界において通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小９０％の相同性、最も好ましくは最小で９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知である。ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）はＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＳＡＴはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／から接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。

これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体に比べて９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有し得る。このような相同性は、当業界に公知である方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又は蛋白質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、それを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明はさらに他の観点において前記核酸を含むベクターに関するものである。

“核酸”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形はヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に次の一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターで抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

“作動的に連結”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合座及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）を利用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは選択標識として当業界において通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明はさらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使われた細胞は原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。

エスケリチアコライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用することができる。

ただし、動物細胞への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。

本発明はさらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用の培地はいずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知であるその他全ての必須補充物が適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明らかであろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果を例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。

本発明はさらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

本発明は例えば、（ａ）本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌又は感染疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。本発明はまた、患者に必要な有効量で本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌又は感染疾患の予防又は治療方法に関する。

前記組成物は、上述した本発明の抗−ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として利用するので、この両者に共通する内容は記載を省略する。

ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、自己免疫及び免疫病理の寛容及び予防に重要なＴ細胞抗原特異的反応を陰性的に調節する。しかし、慢性抗原刺激によって誘発され得る過度なＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用は、Ｔ細胞枯渇の特徴とされる、Ｔ細胞抗原特異的反応の抑制及びＴ細胞の消失をもたらし得る。Ｔ細胞枯渇は慢性感染及び癌で生じ得るＴ細胞機能障害の状態である。これは、不良なエフェクタ機能、抑制性受容体の持続的発現、及び機能的エフェクタ又は記憶Ｔ細胞とは異なる転写状態として定義される。枯渇は感染及び腫瘍進行の管理を妨害する。

下記の実施例で立証するように、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−Ｌ１に高い親和度で結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１複合体形成を阻害することによって、抗−腫瘍Ｔ細胞活性を回避するＴ細胞枯渇を誘導する癌を治療するのに有用であり得る。

場合によって、前記抗体以外に他の坑癌治療剤を併用することによって、ＰＤ−Ｌ１を過発現する腫瘍細胞を効果的に標的化し、抗−腫瘍Ｔ細胞活性を増加させて、腫瘍細胞を標的化する免疫反応を増大させることができる。その他抗−新生物剤又は免疫原性製剤［（例えば、弱化した癌細胞、腫瘍抗原（組換え蛋白質、ペプチド及び炭水化物分子を含む。）、抗原伝達細胞、例えば、腫瘍由来の抗原又は核酸でパルスされた枝細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、及び免疫刺激サイトカインを暗号化する遺伝子で形質感染された細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを含むが、これに制限されない）］；標準癌治療法（例えば、化学治療法、放射線治療法又は手術）；又はその他抗体（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、その他成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢ、及びＩＣＯＳを含むが、これに制限されない）と共に使用することができる。

抗ＰＤ−Ｌ１抗体は細胞死を誘導し得る。細胞死は直接的又は間接的機転によって誘導される。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１結合は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を起こすことがある。場合によって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１発現標的細胞を死滅させる２次細胞類型の動員を引き起こす。抗ＰＤ−Ｌ１抗体が２次細胞類型の動員によって細胞死を媒介する代表的な機転は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞食菌作用（ＡＤＣＰ）を含むが、これに制限されない。標的ＰＤ−Ｌ１発現細胞類型は腫瘍及びＴ細胞、例えば活性化されたＴ細胞を含む。

また、本発明の抗体又は抗体断片は、感染及び感染疾患を予防又は治療するために使用することがてきる。

”予防”は、本発明に係る組成物の投与によって癌又は感染疾患を抑制させたり進行を遅延させる全ての行為を意味し、”治療”は、癌の発展の抑制、癌の軽減又は癌の除去、又は感染疾患の抑制、感染疾患の軽減又は感染疾患の除去を意味する。

前記組成物に適用される疾患である癌は典型的に、免疫治療法に反応する癌、及び今まで免疫療法に関連してない癌を含む。治療用に好適な癌の非−制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺腺癌腫）、膵臓腺癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非−小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を用いて成長を抑制し得る不応又は再発癌を含む。

抗体又は抗体断片は単独、又はワクチンと共に使用されて、病源体、毒素、及び自己−抗原に対する免疫反応を刺激させることができる。抗体又はその抗原−結合断片は、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス、肝炎ウイルス部類Ａ、Ｂ及びＣ、エプスタインバールウイルス（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマ（ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウイルス、ヘルペスウイルスを含むが、これに制限されないヒトを伝染させるウイルスに対する免疫反応を刺激させるのに使用され得る。抗体又はその抗原−結合断片は、細菌又は真菌寄生体、及びその他病源体の感染に対する免疫反応を刺激させるのに使用され得る。

本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。

経口投与時に、蛋白質又はペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃での分解から保護されるように剤形化しなければならない。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動し得る任意の装置によって投与することができる。

本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排せつ速度及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練し医師は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で用語“薬剤学的有効量”は、癌を予防又は治療するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造したり、又は多用量容器内に内入させて製造することができる。このとき、剤形はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与することができる。

さらに他の観点において、本発明は、本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体を含む癌診断用組成物である。本発明はまた、本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片を処理して癌を診断する方法に関する。

本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体を通じてサンプルにおけるＰＤ−Ｌ１発現レベルを測定することによって癌を診断することができる。発現レベルは、通常の免疫分析方法によって測定でき、前記ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を用いた放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔａｓｓａｙ）、キャプチャー−ＥＬＩＳＡ、抑制又は競合分析、サンドイッチ分析、流細胞分析（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製によって測定できるが、これに限定されるものではない。

前記免疫分析過程による最終的なシグナルの強度を分析することによって癌を診断することができる。すなわち、生物学的試料で本発明のマーカーの蛋白質が高発現され、シグナルが正常生物学的試料（例えば、正常胃組織、血液、血漿又は血清）に比べて強く表れる場合には癌と診断される。

さらに他の観点において、本発明は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。本発明に係るキットは、本発明に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体を含み、試料と抗体が反応することによって表れるシグナルを分析して、癌を診断することができる。このとき、前記シグナルは、抗体に結合した酵素、例えばアルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はシトクロムＰ４５０を含むことができるが、これに制限されるものではなく、このとき、酵素に対する基質は、酵素としてアルカリンフォスファターゼが利用される場合には、基質としてブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が利用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合にはクロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩）、レセルピンベンジルエーテル、ルミノール、アムプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌａｎｄｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ−ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が利用され得るが、これに制限されるものではない。

また、本発明に係るキットは、検出可能なシグナルを発生させるラベルを含むことができ、該ラベルは化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。

癌診断のために用いられる酵素の活性測定又はシグナルの測定は、当業界に公知の様々な方法によって実施することができる。これによってＰＤ−Ｌ１発現を定常的又は定量的に分析することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がそれら実施例に制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１：ＰＤ−Ｌ１抗原の発現及び精製
１．ＰＤ−Ｌ１蛋白質発現ベクターの作製
ＰＤ−Ｌ１のクローニングはＪｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて、細胞外ドメインだけを得るために５’と３’に制限酵素ＳｆｉＩサイトが含まれたＰＤ−Ｌ１に対するプライマ（表１）を用いて重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）によって増幅させた。増幅されたＰＣＲ産物はＮ２９３Ｆベクターを用いてカルボキシ−末端にヒトＦｃ（配列番号２４８）、マウスＦｃ（配列番号
２４９）を融合させて作製した（図１）。

２．ＰＤ−Ｌ１抗原の発現及び精製
抗原を動物細胞で発現させるために、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞にプラスミドＤＮＡを形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質感染を行うためのポリプレクス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）反応液は、フリースタイル２９３発現培地３ｍｌにプラスミドＤＮＡを２５μｇ入れて混ぜた後、さらに２ｍｇ／ｍｌＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ｐｏｌｙｐｌＵＳＡ−形質感染、ＵＳＡ）５０μｌを入れて再び混ぜた。ポリプレクス反応液は１５分間常温で反応させた後、１Ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに培養された４０ｍｌの培養液に入れ、１２０ｒｐｍで３７℃、８％ＣＯ_２で２４時間培養した。形質感染２４時間後に補強剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）のＳｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ，ＵＳＡ）を最終濃度が１０ｇ／Ｌになるように添加する。７日間ＨＥＫ−２９３Ｆを用いた臨時発現システムを用いて抗体を生産した。培養液から抗原を得るために親和度クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。７日目に回収した培養液から細胞と細胞残余物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。上澄み液をＤＰＢＳで洗浄した組換え蛋白質Ａアガロースレジンと４℃で１６時間反応させた。

組換え蛋白質Ａアガロースレジンを使用した場合、０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）で蛋白質を溶出させ、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ５００μｌで中和させて１次精製し、１次精製された蛋白質はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１．５ｃｍ＊１００ｃｍ）ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて２次精製した。

精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥｇｅｌとサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ＧＥＬＧ−３０００ＳＷＸＬＳｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）（Ｔｏｓｏｈ））を用いて純度を確認した。

その結果、図２Ａ〜図２Ｄに示すように、精製されたＰＤ−Ｌ１蛋白質は９５％以上の純度を有することが確認できた。

実施例２：ＰＤ−Ｌ１ヒト抗体の選別
１．抗原準備
実施例１で作製したＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ、ＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ及びＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．から購入したＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓ（ＣａｔａｌｏｇＮｕｍｂｅｒ，１０３７７−Ｈ０８Ｈ）蛋白質抗原５０ｕｇを免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ）チューブにコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。

２．バイオパンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは２．７×１０^１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃で１６時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をＰＥＧで濃縮した後、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で２時間反応させた後、１ＸＰＢＳ／Ｔと１ＸＰＢＳで洗浄後、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけを溶出した。溶出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程によって陽性ファージのプールを得、最初ラウンドのパンニングで増幅されたファージを用いて、ＰＢＳＴ洗浄段階で回数を増やす以外は同一の方法で２ラウンド及び３ラウンドパンニングを行った。その結果、表２のように、３ラウンドパンニングにおいて抗原に結合したファージ数が、インプット対アウトプットが多少増加したことを確認した。

３．ポリファージＥＬＩＳＡ
各１次から３次までパンニングして凍らせておいた細胞ストック（ｓｔｏｃｋ）を、５ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭＭｇＣｌ_２培地にＯＤ_６００で０．１となるように入れた後、３７℃で２〜３時間（ＯＤ_６００＝０．５〜０．７）培養後にＭ１ヘルパーファージを感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭＭｇＣｌ_２１ｍＭＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃）後に上澄み液を新しいチューブに移した（１次〜３次パンニングｐｏｌｙｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）。９６ウェル免疫−プレート（ＮＵＮＣ４３９４５４）に２種類の抗原のそれぞれをウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間程度コーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）でコーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｉｌｋ）を用いて各ウェルをブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。

各ウェルごとにＰＢＳ／Ｔ０．２ｍｌを使って洗った後、１次〜３次パンニングポリｓｃＦｖ−ファージを各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとにＰＢＳ／Ｔ０．２ｍｌを使って４回洗った後、二次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ２７−９４２１−０１）を１：２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ／Ｔで洗った後にＯＰＤｔａｂｌｅｔ（ｓｉｇｍａ．８７８７−ＴＡＢ）を、ＰＣバッファーを作って１００ｕｌ／ｗｅｌｌずつ入れて１０分間発色させた後、吸光度４９０ｎｍで分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）で測定した。

その結果を図３に示した。図３によれば、抗原に対する結合能が２種類のＰＤ−Ｌ１抗原に対して３次ポリｓｃＦｖ−ファージで増強（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することをＥＬＩＳＡから確認した。

４．陽性ファージ選別
結合能の大きい多クローンファージ抗体群（３次パンニング）から得たコロニーを２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭＭｇＣｌ_２培地に入れた後、１ｍｌ９６−深ウェルプレート（パイオニア９００３０）に３７℃で１６時間培養した。このように育てた細胞からＯＤ_６００で値が０．１となるように１００〜２００ｕｌを取って１ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭＭｇＣｌ_２培地に入れた後、９６−深ウェルプレートに３７℃でＯＤ_６００でその値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージをＭＯＩ値が１：２０となるように感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭＭｇＣｌ_２１ｍＭＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。

９６ウェル免疫プレートに抗原ＰＤ−Ｌ１をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルをブロッキングした。各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って洗った１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（それぞれ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。

その結果、図４に示すように、各抗原に対する結合能が強い単一ファージクローンは、ＰＤ−Ｌ１に対して総数十個の単一ファージクローンを得た。

５．陽性ファージ抗体の塩基配列分析
前記選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行ってＤＮＡを得、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。配列分析結果から、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認し、それらの抗体とジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体群の類似性をＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のＩｇＢＬＡＳＴプログラムを用いて調査した。その結果、１０種のＰＤ−Ｌ１に特異的なファージ抗体を得た。これを下記表３に整理して提示する。

選別された抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、ＦＲ配列及びこれを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は次の表４及び表５の通りである。

実施例３：ＰＤ−Ｌ１ヒト抗体の生産
１．ｓｃＦｖ形態をＩｇＧ形態に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
選別された１０種のＰＤ−Ｌ１に対する単一クローンファージ抗体をファージからＩｇＧ全体ベクター（ｗｈｏｌｅｖｅｃｔｏｒ）に転換するために重鎖と軽鎖に対してＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒｉＱ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれＤＮＡ−ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを溶出した。ライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）はｖｅｃｔｏｒ１ｕｌ（１０ｎｇ）重鎖（１００〜２００ｎｇ）１５ｕｌ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ２ｕｌ、ｌｉｇａｓｅ（１Ｕ／ｕｌ）１ｕｌ、蒸溜水を混合して室温で１〜２時間放置後、形質転換細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）に入れて氷に５分間置き、４２℃で９０秒間熱衝撃（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ）を与えた。

熱衝撃後に培地１ｍｌを入れて１時間３７℃で育てた後、ＬＢＡｍｐプレートにスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）して３７℃で１６時間培養した。こうして得たコロニーを取ってＬＢＡｍｐ培地５ｍｌを接種し、３７℃で１６時間培養後にＤＮＡ−ｐｒｅｐｋｉｔ（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）でＤＮＡ−ｐｒｅｐを行った。得られたＤＮＡは、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。

その結果、全体ＩｇＧに転換したＰＤ−Ｌ１に対する１１個のクローンの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と一致することを確認した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質感染するために、全体ＩｇＧに転換した各クローンの重鎖と軽鎖はＬＢＡｍｐ１００ｍｌ培地で育て、ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用いてＤＮＡを得た。

２．ヒト抗体の生産
クローニングされたｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬベクターは６：４の割合でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時形質感染（ｃｏ−形質感染）して７日目の上澄み液を回収し、遠心分離と０．２２μｍＴｏｐ−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質Ａ親和度クロマトグラフィーを行ってＩｇＧ抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー（ｇｌｙｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒ）を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）はＰＢＳとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をＢＣＡ及びナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量し、１５種の抗体を還元、非還元条件で各５ｕｇずつローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析して精製蛋白質の純度及び移動度（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）状態を確認した（図５）。

その結果、図５によれば、１０種の抗体とも非還元条件では１５０ｋＤａ以上の大きさで検出された。

実施例４：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の特性
１．抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキット（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｊ１２５０）を用いて進行した。ＰＤ−Ｌ１が高発現しているＣＨＯ細胞株を９６−ウェルプレートに塗抹し、１６時間以上培養後に、一定濃度に連続希釈された各抗体を処理して、ヒトＰＤ−１が高発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を６時間一緒に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、米国）で測定した。１０種のＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値から抗体の活性を確認し、１６Ｅ１２が対照抗体と類似した活性度を示した（図６）。

ＰＤ−Ｌ１抗体１６Ｅ１２の活性評価を濃度依存的に測定するために段階希釈をしてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイを再び進行した結果、減少していたシグナルを濃度勾配依存的に回復させた。その回復程度はＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍＡｂａｔ５０％ｌｅｖｅｌｏｆＲｅｃｏｖｅｒｙｓｉｇｎａｌ）で表すことができ、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６を用いて分析した。ＥＣ５０のｉｎｖｉｔｒｏｅｆｆｉｃａｃｙ阻害回復能力は図７の通りである。

２．過発現細胞に対するＰＤ−Ｌ１抗体の親和度
ＰＤ−Ｌ１を高発現させる形質転換細胞プールは、ヒトＰＤ−Ｌ１を含んでいるｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｅに形質転換させ、１５０ｕｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎ（＃Ｒ２５００１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールは各ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を用いたＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）分析で確認されて選択され、ＦＡＣＳ結合アッセイやＦＡＣＳ競合アッセイのような機能評価法に使用された。

ヒトＰＤ−Ｌ１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５〜１×１０^６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。その結果、ＰＤ−Ｌ１抗体１６Ｅ１２が特異的に結合したし、その結合力は、平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｄ）をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６の分析関数を用いて求めた。

その結果、図８によれば、細胞表面に過発現したヒトＰＤ−Ｌ１に対して濃度依存的に結合した抗体の結合力がＭＦＩ（ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から分かる。

３．ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６を用いたＰＤ−Ｌ１抗体の親和度
ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）機器で行った。ＧＬＣセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ）を機器に装着し、ＰＢＳＴ緩衝溶液で洗浄をした後、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｕｇ／ｍｌ濃度で溶かしたＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃを注入してＧＬＣセンサーチップに固定化させた。

ＰＤ−Ｌ１蛋白質と反応しないで残っている活性化されたカルボキシグループを非活性化させるために１Ｍエタノールアミンを流し、センサーチップに結合していない蛋白質を洗浄するために１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を注入した。その後、ＰＢＳＴ緩衝液を用いて抗体を濃度別（３０ｎＭ〜０．１２３ｎＭ）に３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で１０分間流しつつ、時間による結合と解離過程中のセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データを収集した。

平衡状態におけるセンソグラムデータを濃度によってプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）及びフィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）して平衡解離定数（ＫＤ）計算した結果、０．０４５ｎＭとＰＤ−Ｌ１抗原に対して高い親和度を示した（図９）。

実施例５：ＰＤ−Ｌ１抗体１６Ｅ１２に対する抗体最適化
１．ＰＤ−Ｌ１−１６Ｅ１２抗体の最適化のためのライブラリーの作製
抗体最適化は、重鎖は固定し、ワイバイオロジックスで保有している１０^５〜１０^６軽鎖（ＬＣ）プール（ｐｏｏｌ）を入れて新しいＬＣシャフリングライブラリー（ＬＣｓｈｕｆｆｌｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ）を作製し、ＬＣシャフリング、重鎖の疎水性コア（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｏｒｅ）、露出残基（ｅｘｐｏｓｅｄｒｅｓｉｄｕｅ）、電荷クラスター（ｃｈａｒｇｅｃｌｕｓｔｅｒ）、塩ブリッジ（ｓａｌｔｂｒｉｄｇｅ）などのように構造的に重要な部位の残基と比較分析をして保存された残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｓｉｄｕｅ）に変異させた後にＬＣシャフリングを進行するコアパッキング（ｃｏｒｅｐａｃｋｉｎｇ）＋ＬＣシャフリング、抗体可変領域（ａｎｔｉｂｏｄｙｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）のＤＮＡはｉｎｖｉｖｏ親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程で頻繁に変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）され得る変異ホットスポット（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｈｏｔｓｐｏｔ）をランダムに変異させた後にＬＣシャフリングを進行するＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリングなどの３つの方法で進行した。

ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために１６Ｅ１２抗体のＬＣ遺伝子をＢｓｔＸＩで切断した後にベクターとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＢｓｔＸＩで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約１．５×１０^７の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣの配列はいずれも同じであり、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。

コアパッキング＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、１６Ｅ１２抗体のｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ）部分を保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後にＬＣ遺伝子をＢｓｔＸＩで切断してベクターとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＢｓｔＸＩで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約８．４×１０^６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。

ＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、１６Ｅ１２抗体のｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ）部分を保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後にＣＤＲ１のホットスポットライブラリーをＳｆｉＩで切断してインサートとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＳｆｉＩで切断してベクターとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約５．６×１０^６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、ＣＤＲ１のホットスポット配列のアミノ酸がランダムに変異され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。

実施例６：ＰＤ−Ｌ１ヒト抗体の選別
１．抗原準備
ワイバイオロジックスで生産したＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ、ＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃとＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．から購入したＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓ（ＣａｔａｌｏｇＮｕｍｂｅｒ，１０３７７−Ｈ０８Ｈ）蛋白質抗原５０ｕｇを免疫吸着チューブでコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。

２．バイオ−パンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは、２．７×１０^１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃で１６時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をＰＥＧで濃縮した後、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で２時間反応させた後、１ＸＰＢＳ／Ｔと１ＸＰＢＳで洗浄後に抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけを溶出した。

溶出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程によって陽性ファージのプール（ｐｏｏｌ）を得、抗体最適化のためのパンニングは最初ラウンドだけ進行した。その結果、表６に示すように、１ラウンドパンニングで抗原に結合したファージ数が、流入（ｉｎｐｕｔ）対結合（ｏｕｔｐｕｔ）が多少増加したことを確認した。

３．陽性ファージ選別
パンニングから得たコロニーを２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭＭｇＣｌ_２培地に入れた後、１ｍｌ９６−深ウェルプレート（９６−ｄｅｅｐｗｅｌｌｐｌａｔｅ：パイオニア９００３０）に３７℃で１６時間培養した。このように育てた細胞からＯＤ_６００で値が０．１となるように１００〜２００ｕｌを取って１ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭＭｇＣｌ_２培地に入れた後、９６−深ウェルプレートに３７℃でＯＤ_６００でその値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージをＭＯＩ値が１：２０となるように感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭＭｇＣｌ_２１ｍＭＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。

９６ウェル免疫プレートに抗原ＰＤ−Ｌ１をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルをブロッキングした。各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って洗った１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（それぞれ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体であるａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。

その結果、親抗体（１６Ｅ１２、赤表示−６Ｄ）に比べて、各抗原に対する結合能が強い数十個の単一ファージクローンを得た。それは図１０の通りである。

４．陽性ファージ抗体の塩基配列分析
選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行ってＤＮＡを得、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。配列分析結果から、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲｒｅｇｉｏｎを確認し、それら抗体とジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体群の類似性をＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のＩｇＢＬＡＳＴプログラムを用いて調査し、その結果、２１種の親抗体よりも結合力の高い特異的なファージ抗体を得た。これを次表７に整理して提示する。

選別された抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、ＦＲ配列及びこれを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は、次の表８及び表９の通りである。

実施例７：ＰＤ−Ｌ１ヒト抗体の生産
１．ｓｃＦｖ形態をＩｇＧ形態に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
選別された２１種のＰＤ−Ｌ１に対する単一クローンファージ抗体をファージからＩｇＧ全体ベクターに転換するために重鎖と軽鎖に対してＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒｉＱ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれＤＮＡ−ゲル抽出キット（ＤＮＡ−ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ：Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡ溶出した。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）はベクター１ｕｌ（１０ｎｇ）重鎖１５ｕｌ（１００〜２００ｎｇ）、１０ｘバッファー２ｕｌ、リガーゼ（１Ｕ／ｕｌ）１ｕｌ、蒸溜水を混合して室温で１〜２時間放置後、形質転換細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ：ＸＬ１−ｂｌｕｅ）に入れて氷に５分間置き、４２℃で９０秒間熱衝撃（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ）を与えた。

熱衝撃後に培地１ｍｌを入れて１時間３７℃で育てた後、ＬＢＡｍｐプレートにスプレッドして３７℃で１６時間培養した。こうして得たコロニーを取ってＬＢＡｍｐ培地５ｍｌを接種し、３７℃で１６時間培養後にＤＮＡ−ｐｒｅｐｋｉｔ（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行った。得られたＤＮＡは、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。

その結果、全体ＩｇＧに転換したＰＤ−Ｌ１に対する２１個のクローンの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と一致することを確認した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質感染するために、全体ＩｇＧに転換した各クローンの重鎖と軽鎖はＬＢＡｍｐ１００ｍｌ培地で育て、ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用いてＤＮＡを得た。

２．ヒト抗体の生産
クローニングされたｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬベクターは６：４の割合でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時形質感染（ｃｏ−形質感染）して７日目の上澄み液を回収し、遠心分離と０．２２μｍＴｏｐ−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質Ａ親和度クロマトグラフィーを行ってＩｇＧ抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー（ｇｌｙｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒ）を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）はＰＢＳとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をＢＣＡ及びナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量し、２１種の抗体を還元、非−還元条件で各５ｕｇずつローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析して精製蛋白質の純度及び移動度（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）状態を確認した。また、上澄み液の一部は親抗体との発現率を比較するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングしたし、大部分の抗体が親抗体に比べて発現率が増加した。

実施例８：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の特性
１．抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅｂｉｏａｓｓａｙｋｉｔ：ｐｒｏｍｅｇａ，Ｊ１２５０）を用いて進行した。ＰＤ−Ｌ１が高発現しているＣＨＯ細胞株を９６−ウェルプレートに塗抹し、１６時間以上培養後、一定濃度で連続希釈された各抗体を処理して、ヒトＰＤ−１が高発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を６時間共に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼが基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、米国）で測定した。２１種のＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値で抗体の活性を確認した。その結果、４Ａ７、４Ａ１１、４Ｃ９、４Ｆ５、４Ｈ５、４Ｈ８が親抗体に比べて活性が増加したし、対照抗体と類似した活性度を示した（図１１及び表１０）。

ＰＤ−Ｌ１抗体６種（４Ａ７、４Ａ１１、４Ｃ９、４Ｆ５、４Ｈ５、４Ｈ８）に対してさらに活性評価を濃度依存的に測定するために段階希釈をしてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイを再び進行した結果、減少していたシグナルを濃度勾配依存的に回復させた。その回復程度はＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍＡｂａｔ５０％ｌｅｖｅｌｏｆＲｅｃｏｖｅｒｙｓｉｇｎａｌ）で表すことができ、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６を用いて分析した。ＥＣ５０のＩｎｖｉｔｒｏｅｆｆｉｃａｃｙ阻害回復能力は４Ｆ５において最も高かった（図１２）。

２．過発現細胞に対するＰＤ−Ｌ１抗体の親和度
ヒトＰＤ−１を高発現させる形質転換細胞プールはヒトＰＤ−１（ＮＭ＿００５０１８．２）或いはヒトＰＤ−Ｌ１（ＮＭ＿０１４１４３．２）を含んでいるｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｅに形質転換させ、４００ｕｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎ（＃Ｒ２５００１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールはそれぞれａｎｔｉ−ＰＤ−１（＃５５７８６０，ＢＤ）を用いたＦＡＣｓ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）分析によって確認されて選択され、ＦＡＣｓ結合アッセイやＦＡＣｓ競合アッセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎａｓｓａｙ）のような機能評価法に使用された。ヒトＰＤ−Ｌ１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５〜１×１０^６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した（表１１）。

ヒトのＰＤ−Ｌ１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５×１０^６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣｓＣａｎｔｏＩＩｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。（図１３）
３．酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を防ぐ抗体の阻害能力
ヒトＰＤ−１−Ｆｃ（Ｓ１４２０，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を９６−ウェル免疫マイクロプレート（９６−ｗｅｌｌｉｍｍｕｎｏｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ：＃４３９４５４，Ｔｈｅｒｍｏ）のウェルに４℃で１６時間固定させ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０（＃Ｐ９４１６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の入っているＰＢＳで３回洗浄後、４％スキムミルク（＃２３２１２０，Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）の含まれた洗浄液で常温に１時間放置することによって非特異的結合を遮断した。その間に一定希釈倍数で連続希釈された各抗体とヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｓ１４７９，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を常温に１時間反応させた後、準備したマイクロプレートに入れて常温に１時間放置する。同じ洗浄方法を適用した後、ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｉｓ抗体（＃ＭＡ１−２１３１５−ＢＴＩＮ，Ｔｈｅｒｍｏ）を１：２０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に１時間反応させ、同じ方法で洗浄した後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｐｏｌｙ−ＨＲＰ抗体（＃２１１４０、Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に１時間反応させた後、同じ方法で洗浄した。１００ｕｌＴＭＢ基質溶液（＃Ｔ０４４０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた後、光を遮断して常温で３分間放置後に５０ｕｌ２．５Ｍ硫酸（＃Ｓ１４７８，Ｓａｍｃｈｕｎ）を入れて反応を中断させ、分光光度計（＃ＧＭ３０００、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）ＤｉｓｃｏｖｅｒＳｙｓｔｅｍＰｒｏｍｅｇａ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図１４に示した。

４．ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６を用いたＰＤ−Ｌ１抗体の親和度
ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）機器で行った。ＧＬＣセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ）を機器に装着し、ＰＢＳＴ緩衝溶液で洗浄した後、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｕｇ／ｍｌ濃度で溶かしたＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃを注入してＧＬＣセンサーチップに固定化させた。

ＰＤ−Ｌ１蛋白質と反応しないで残っている活性化されたカルボキシグループを非活性化させるために１Ｍエタノールアミンを流し、センサーチップに結合していない蛋白質を洗浄するために１０ｍＭグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、ｐＨ２．０を注入した。その後、ＰＢＳＴ緩衝液を用いて抗体を濃度別（３０ｎＭ〜０．１２３ｎＭ）に３０ｕｌ／ｍｉｎ流速で１０分間流しつつ、時間による結合と解離過程中のセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データを収集した。

平衡状態におけるセンソグラムデータを濃度によってプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）及びフィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）をして平衡解離定数（ＫＤ）を計算した結果、１６Ｅ１２（４Ｆ５）は０．００１ｎＭであって、ＰＤ−Ｌ１抗原に対して高い親和度を示した（図１５）。

ＰＤＬ１−１６Ｅ１２、ＬＳ、４Ｆ５のヒト、サル、マウスのＰＤ−Ｌ１蛋白質の結合能比較結果は、表１２に記載した通りである。

実施例９：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）決定
９６−ウェル免疫−プレートに抗原ＰＤ−Ｌ１野生型（ＰＤ１ｗｉｌｄｔｙｐｅ：ＷＴ）又は多数の変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コードした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルを遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って洗った後、１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ（ｅａｃｈ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ）であるａｎｔｉ−Ｆａｂを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。

その結果、対照抗体とＰＤ−Ｌ１変異体に対して異なる結合態様を示し、個別のエピトープを有するということが確認できた（図１６）。

実施例１０：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の異種ＭＬＲ（ａｌｌｏｇｅｎｉｃＭＬＲ）反応での活性増加
別個のヒトから分離された単球由来樹状細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）にＴ細胞を１：１０の割合で混ぜ、５日培養後に培養液のインターフェロンガンマの量を測定すると、１６Ｅ１２の親抗体を入れたものにおいて濃度に依存してインターフェロンガンマの量が増加することを確認した（図１７）。

実施例１１：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）癌動物モデルでの効能評価
１６Ｅ１２−２Ｂ９ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の生体内効能を確認するためにＢＡｌｂ／Ｃマウスに脇腹の皮下に大腸癌細胞であるＣＴ−２６細胞を８×１０^６個投与し、腫瘍の大きさが粟粒ほどの時から３週にわたって週２回ずつ５ｍｇ／ｋｇの容量で投与しながら腫瘍の成長を観察した場合、ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体投与群で顕著な腫瘍大きさの増減が観察された（図１８）。

実施例１２：ＰＤ−Ｌ１単一クローン抗体の熱安定性テスト
抗体蛋白質をＤＰＢＳに希釈して３ｕＭ、４５ｕｌを作り、２００ｘｓｙｐｒｏｏｒａｎｇｅｄｙｅ（＃Ｓ６６５０，Ｔｈｅｒｍｏ）５ｕｌと混ぜてｑＰＣＲＴｕｂｅ（＃Ｂ７７００９，Ｂ５７６５１，ｂｉｏｐｌａｓｔｉｃｓ）に５０ｕｌずつ分注する。ＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ機器を用いてｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲ条件は次のように２５℃で３０秒間反応後、９９℃まで１度ずつ増加させるが、各温度で１分間反応させ、最後の２５℃で１０秒反応をさせて終えた。抗体構造が解かれる速度定数としてはＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、溶融温度）を使用した。その結果は次表１３の通りである。

実施例１３：ＰＤ−Ｌ２との結合力確認
抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ２との結合有無を確認するためにヒトＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ（＃１０２９２−Ｈ０２Ｈ，Ｓｉｎｏ）を９６−ウェル免疫マイクロプレート（９６−ｗｅｌｌｉｍｍｕｎｏｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ：＃４３９４５４，Ｔｈｅｒｍｏ）のウェルに４℃で１６時間固定させ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０（＃Ｐ９４１６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の入っているＰＢＳで３回洗浄後、４％スキムミルク（＃２３２１２０，Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）の含まれた洗浄液で常温に１時間放置することによって非特異的結合を遮断した。その間に一定希釈倍数で連続希釈された各抗体或いは陽性対照として使用されたヒトＰＤ−１−Ｈｉｓ（Ｓ１３５２，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を常温に１時間反応させた後、準備したマイクロプレートに入れて常温に１時間放置する。同じ洗浄方法を適用した後、ａｎｔｉ・Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｉｓ抗体（＃ＭＡ１−２１３１５−ＢＴＩＮ，Ｔｈｅｒｍｏ）を１：２０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に１時間反応させた後、同じ方法で洗浄した後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｐｏｌｙ−ＨＲＰ抗体（＃２１１４０、Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れ、常温に１時間反応させた後に、同じ方法で洗浄した。１００ｕｌＴＭＢ基質溶液（＃Ｔ０４４０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた後、光を遮断して常温で３分間放置後に５０ｕｌ２．５Ｍ硫酸（＃Ｓ１４７８，Ｓａｍｃｈｕｎ）を入れて反応を中断させ、分光光度計（＃ＧＭ３０００、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）ＤｉｓｃｏｖｅｒＳｙｓｔｅｍＰｒｏｍｅｇａ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図１９に示した。

本発明に係るＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−Ｌ１に高い親和力で結合しながらも、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を阻害することによって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１媒介Ｔ細胞活性を回避するＴ細胞枯渇を抑制することができる。これによって、本発明に係るＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は目的する癌又は感染疾患の予防又は治療に有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界において通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好適な実施態様に過ぎず、それらによって本発明の範囲が制限されるわけでないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
本発明は一態様において以下を提供する。
[項目１]
配列番号１〜配列番号７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号８〜配列番号１５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１６〜配列番号２５で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号８８〜配列番号１０２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０３〜配列番号１１９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２０〜配列番号１４４で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
[項目２]
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目３]
配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１００の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目４]
配列番号２６〜配列番号３４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号３５〜配列番号４１で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号４２〜配列番号４９で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号５０〜配列番号５４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ４を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目５]
配列番号１４５〜配列番号１６３で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号１６４〜配列番号１８４で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号１８５〜配列番号２１０で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号２１１〜配列番号２１６で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ４を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目６]
配列番号５７〜配列番号８７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目７]
配列番号２１７〜配列番号２４７で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項目８]
項目１〜７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
[項目９]
項目８の核酸を含む発現ベクター。
[項目１０]
項目９の発現ベクターで形質転換された細胞。
[項目１１]
次の段階を含むＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）項目１０の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
[項目１２]
項目１〜７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物。

Claims

配列番号８０の配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４０の配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
請求項２の核酸を含む発現ベクター。
請求項３の発現ベクターで形質転換された細胞。
次の段階を含むＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項４の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養によって得られた培養液から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物。