CN117916263A - 抗tigit抗体及其用途 - Google Patents

抗tigit抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117916263A
CN117916263A CN202280046083.0A CN202280046083A CN117916263A CN 117916263 A CN117916263 A CN 117916263A CN 202280046083 A CN202280046083 A CN 202280046083A CN 117916263 A CN117916263 A CN 117916263A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tigit
cells
antibody
seq
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280046083.0A
Other languages
English (en)
Inventor
姜柳会
赵烘奭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meidi Mabu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Meidi Mabu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meidi Mabu Biotechnology Co ltd filed Critical Meidi Mabu Biotechnology Co ltd
Publication of CN117916263A publication Critical patent/CN117916263A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及：新型抗TIGIT抗体；以及其用于增强免疫力、抗癌治疗和预防和/或治疗免疫性疾病的用途。

Description

抗TIGIT抗体及其用途
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年5月10日向韩国知识产权局提交的KR 10-2021-0060014的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
公开了新型抗TIGIT抗体及其用于免疫增强和用于预防和/或治疗癌症和免疫相关疾病的用途。
背景技术
癌症免疫疗法是利用机体免疫反应治疗癌症的方法，被称为继化学疗法、手术治疗和放射疗法之后的第四种癌症治疗方法。癌症免疫疗法需要激活免疫系统的机制，以增加对肿瘤细胞的识别和反应。免疫系统的激活涉及复杂的机制，包括各种细胞的功能，如抗原呈递细胞，其对于启动抗原特异性反应至关重要，以及效应细胞，其负责破坏肿瘤细胞。
效应细胞的代表是细胞毒性T细胞。
同时，T细胞免疫球蛋白和ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)结构域(TIGIT)，也称为WUCAM、VSIG9或Vstm3，是共抑制受体，不仅优先在NK、CD8+和CD4+T细胞上表达，而且在调节性T细胞(Treg)上表达。TIGIT是跨膜蛋白，包含细胞内ITIM结构域、跨膜结构域和免疫球蛋白可变结构域。
在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和疾病状态如感染中，TIGIT表达升高。TIGIT表达可以作为与TIGIT阴性细胞相比效应功能较低的衰竭T细胞的标志。此外，与TIGIT阴性Treg群体相比，表达TIGIT的Treg细胞显示出增强的免疫抑制活性。
基于这些发现，抵消TIGIT的药物(例如，拮抗性抗TIGIT抗体)有望诱导免疫系统活化并增强疾病状态如癌症中的免疫反应，从而呈现有利的治疗效果。
发明内容
技术问题
提供了与TIGIT结合的抗TIGIT抗体及其药物用途。
一方面提供了与TIGIT结合的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)组成的重链互补决定区，或包含该重链互补决定区的重链可变区；和
由包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)组成的轻链互补决定区，或包含该轻链互补决定区的轻链可变区。
在实施方案中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和
包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区。
另一方面提供了免疫增强剂或免疫增强药物组合物，各自包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的抗癌剂或药物组合物，各自包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了免疫增强方法，该方法包括向需要免疫增强的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的方法，该方法包括向需要免疫相关疾病预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要癌症预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于免疫增强或用于制备免疫增强剂的用途。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗免疫相关疾病或用于制备预防和/或治疗免疫相关疾病的药物的用途。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗癌症或用于制备预防和/或治疗癌症的药物的用途。
根据实施方案，在本文提供的药物组合物、方法和用途中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以与免疫检查点蛋白联合使用，例如靶向PD-1和PD-L1之一或两者的药物(拮抗剂)联合使用。可联合施用的药物可以是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或两者，但不限于此。
另一方面提供了编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子。
另一方面提供了编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。
另一方面提供了重组载体，其携带编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子的组合，或者分离的重组载体，其分别携带编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。重组载体可以是用于表达核酸分子的表达载体。
另一方面提供了锚定重组载体的重组细胞。
另一方面提供了生产抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。表达核酸分子的步骤可以是培养锚定核酸分子的细胞或携带核酸分子的重组载体的步骤。该方法还可以包括在表达步骤之后从培养基中分离和/或纯化抗体的步骤。
技术方案
本文提供了与TIGIT结合的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段及其药物用途。抗TIGIT抗体或其抗原结合片段通过阻断TIGIT的作用来起到激活免疫的功能(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)，从而应用于各种免疫激活剂和/或免疫疗法。
下面，将给出本公开的详细描述。
抗体或抗原结合片段
一方面提供了与TIGIT结合的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
包含SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽(CDR-L1)可以包含SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8的氨基酸序列。
本文中互补决定区(CDR)通常是根据kabat系统定义的。
在实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段中可能包含的六个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)总结于下表1中。
表1
(在表1中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3各自代表重链互补决定区，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3各自代表轻链互补决定区)
在实施方案中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的CDR-H1、SEQ ID NO：2的CDR-H2和SEQ ID NO：3的CDR-H3，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：4(即SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)的CDR-L1、SEQID NO：5的CDR-L2和SEQ ID NO：6的CDR-L3。
更具体地，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和
包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施方案中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的轻链可变区；或者
包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区。
根据情况(例如，当重组产生时)，重链可变区和/或轻链可变区还可以在N-端包含适当的信号序列。
本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段中可能包含的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在下表2中给出：
表2
(在表2中，下划线区域依次代表重链和轻链中的CDR1、CDR2和CDR3)
在实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与TIGIT蛋白结合，例如，选自人TIGIT蛋白(NCBI参考序列NP_776160.2；UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)的氨基酸残基51至70的区域(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN；SEQ ID NO：31)，但不限于此。
[人TIGIT蛋白(SEQ ID NO：30)]
如本文所述，术语“抗体”可以指特异性结合特定抗原的蛋白质，并且可以是通过刺激免疫系统中的抗原产生的蛋白质，或者是通过化学合成或重组生产产生的蛋白质，没有具体限制。抗体可以是非天然存在的，例如，通过重组或合成产生。抗体可以是动物抗体(例如，小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
在本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段中，除上述定义的重链CDR和轻链CDR部分或重链可变区和轻链可变区之外的部分可以衍生自免疫球蛋白的任何亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)，以及例如衍生自框架部分、和/或轻链恒定区和/或重链恒定区。在实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体可以是人IgG形式的抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，但不限于此。
完整的抗体(例如IgG型)具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，其中每个轻链通过二硫键与相应的重链相连。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)型，并具有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)或alpha2(α2)作为其亚类。轻链恒定区是kappa(κ)或lambda(λ)型。
在实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体可以包含作为重链恒定区的IgG恒定区和作为轻链恒定区的κ恒定区，但不限于此。
在实施方案中，IgG(例如，人IgG1)的恒定区可以是野生型。在另一个实施方案中，IgG的恒定区可以是在人IgG1上具有至少一个突变的变体，所述突变选自S240D(第240位的S被D取代，下文中氨基酸突变以相同方式表达)、A331L、I333E、N298A、S299A、E334A、K335A、L235A、L236A和P330G。例如，恒定区可以是具有以下突变的变体：
(1)S240D、A331L和I333E；
(2)N298A；
(3)S299A、E334A和K335A；或
(4)L235A、L236A和P330G。
如本文所用，术语“重链”可包括全长重链及其片段，其中全长重链包含包括足以提供抗原特异性的氨基酸序列的可变区VH、三个恒定区CH1、CH2和CH3以及铰链。术语“轻链”旨在包括全长轻链及其片段，其中全长轻链包含包括足以提供抗原特异性的氨基酸序列的可变区VL和恒定区CL。
术语“互补决定区”(CDR)指抗体可变区中赋予抗原结合特异性的部分，指免疫球蛋白重链或轻链高变区中发现的氨基酸序列。重链和轻链可以各自包含三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3以及CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR可以提供在抗体与其抗原或抗原表位的结合中起重要作用的接触残基。如本文所用，术语“特异性结合”和“特异性识别”可具有与本领域普通技术人员已知的相同的一般含义，并表示抗体和抗原彼此特异性相互作用导致免疫反应。
本文所述的互补决定区(CDR)是根据kabat系统确定的。
在本公开中，除非特别说明，术语“抗体”可以理解为包括具有抗原结合能力的抗体的抗原结合片段。
本文使用的术语“抗原结合片段”可以指任何类型的多肽，其包含能够结合抗原的部分(例如，本文定义的6个CDR)，并且例如可以是scFv、scFv-Fc、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2，但不限于此。
在抗原结合片段中，Fab具有由轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)组成的结构，保留一个抗原结合位点。
Fab′不同于Fab之处在于Fab′在重链CH1结构域的C-端包含具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
F(ab′)2抗体是通过Fab′铰链区半胱氨酸残基的二硫键桥接形成的。Fv是仅由重链可变区和轻链可变区组成的最小抗体片段。产生Fv片段的重组技术是本领域众所周知的。
双链Fv包含通过非共价键相互连接的重链可变区和轻链可变区。单链Fv通常包含重链可变区和轻链可变区，它们通过肽接头以共价键相互连接，或者直接在C-端连接，以具有类似双链Fv的二聚体结构。
抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，F(ab′)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，或者可以通过使用基因重组技术制备。
术语“铰链区”指抗体重链中CH1和CH2结构域之间的区域，其功能是为抗体中的抗原结合位点提供柔性。
本文提供的抗体可以是单克隆抗体。可以使用本领域公知的方法制备单克隆抗体，例如使用噬菌体展示技术。或者，可以通过常规方法以动物(例如小鼠)来源的单克隆抗体的形式构建抗体。
同时，基于针对TIGIT受体结合结构域的结合潜力，可以使用典型的ELISA(酶联免疫吸附检测)方式筛选单个单克隆抗体。抑制活性可以通过功能分析来验证，例如用于验证结合组件的分子相互作用的竞争性ELISA，或者功能分析，例如基于细胞的分析。然后，对于基于其强抑制活性选择的单克隆抗体成员，可以分别验证它们与TIGIT的受体结合结构域的亲和力(Kd值)。
最终选择的抗体可以制备并用作人源化抗体以及人免疫球蛋白抗体，其中除了抗原结合部分之外的其余部分是人源化的。生产人源化抗体的方法是本领域众所周知的。
本文提供的抗TIGIT抗体的抗原结合片段可以指源自抗TIGIT抗体并保留抗TIGIT抗体的抗原(TIGIT)结合亲和力的片段。在实施方案中，抗原结合片段可以是包含如上所述的抗TIGIT抗体的6个CDR的多肽，并且例如可以是scFv、scFv-Fc、scFv-Ck(κ恒定区)、scFv-Cλ(λ恒定区)、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2，但不限于此。在实施方案中，抗原结合片段可以是融合多肽，其中scFv或scFv融合到免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)的Fc区(scFv-Fc)或轻链恒定区(例如κ或λ)(scFv-Ck或scFv-Cλ)，但不限于此。
在本公开中，抗体(例如，CDR、可变区、或重链/轻链、抗原结合片段等)“包括(包含)特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成”是指氨基酸序列基本上被包括在内，和/或不影响抗体活性(例如抗原结合亲和力、药理学活性)的不显著突变(例如氨基酸残基的取代、缺失和/或添加)被引入到氨基酸序列中的所有情况。
本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段对TIGIT(例如，人TIGIT)的结合亲和力(KD)可为10mM或小于10mM、5mM或小于5mM、1mM或小于1mM、0.5mM或小于0.5mM、0.2mM或小于0.2mM、0.1mM或小于0.1mM、0.05mM或小于0.05mM、0.01mM或小于0.01mM、0.005mM或小于0.005mM、或0.001mM或小于0.001mM，例如0.0001nM至10mM、0.0005nM至10mM、0.001nM至10mM、0.005nM至10mM、0.01nM至10mM、0.05nM至10mM、0.1nM至10mM、0.5nM至10mM、1nM至10mM、0.0001nM至5mM、0.0005nM至5mM、0.001nM至5mM、0.005nM至5mM、0.01nM至5mM、0.05nM至5mM、0.1nM至5mM、0.5nM至5mM、1nM至5mM、0.0001nM至1mM、0.0005nM至1mM、0.001nM至1mM、0.005nM至1mM、0.01nM至1mM、0.05nM至1mM、0.1nM至1mM、0.5nM至1mM、1nM至1mM、0.0001nM至0.5mM、0.0005nM至0.5mM、0.001nM至0.5mM、0.005nM至0.5mM、0.01nM至0.5mM、0.05nM至0.5mM、0.1nM至0.5mM、0.5nM至0.5mM、1nM至0.5mM、0.0001nM至0.2mM、0.0005nM至0.2mM、0.001nM至0.2mM、0.005nM至0.2mM、0.01nM至0.2mM、0.05nM至0.2mM、0.1nM至0.2mM、0.5nM至0.2mM、1nM至0.2mM、0.0001nM至0.1mM、0.0005nM至0.1mM、0.001nM至0.1mM、0.005nM至0.1mM、0.01nM至0.1mM、0.05nM至0.1mM、0.1nM至0.1mM、0.5nM至0.1mM、1nM至0.1mM、0.0001nM至0.05mM、0.0005nM至0.05mM、0.001nM至0.05mM、0.005nM至0.05mM、0.01nM至0.05mM、0.05nM至0.05mM、0.1nM至0.05mM、0.5nM至0.05mM、1nM至0.05mM、0.0001nM至0.01mM、0.0005nM至0.01mM、0.001nM至0.01mM、0.005nM至0.01mM、0.01nM至0.01mM、0.05nM至0.01mM、0.1nM至0.01mM、0.5nM至0.01mM或1nM至0.01mM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，但不限于此。
另一方面提供了多肽分子，其包括重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3或其组合)、轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3或其组合)、其组合；或前述抗TIGIT抗体中的重链可变区、轻链可变区或其组合。
多肽分子可作为抗体前体用于制备抗体，或包含在具有抗体样结构的蛋白质支架(例如，肽抗体、纳米抗体)、双特异性抗体或多特异性抗体中作为其组分(例如，CDR或可变区)。
如本文所用，术语“肽抗体”(肽+抗体)指具有与抗体相似的框架和功能的融合蛋白，其中肽与抗体的整个或部分恒定区如Fc区融合，并充当抗原结合位点(重链和/或轻链CDR或可变区)。
本文所用术语“纳米抗体”被称为单结构域抗体，是指包含单体形式抗体的单个可变结构域的抗体片段，其表现出与具有完整结构的抗体类似的选择性结合特定抗原的特征。纳米抗体的分子量通常为约12kDa至约15kDa，这与完整抗体(包括两条重链和两条轻链)的正常分子量(约150kDa或约160kDa)相比非常小，并且在某些情况下小于Fab片段或scFv片段。
如本文所用，术语“多特异性抗体”(包括双特异性抗体)指识别和/或结合两种或多于两种不同抗原，或识别和/或结合相同抗原的不同位点的抗体，多特异性抗体的一个抗原结合位点可包括上述多肽、抗体或抗原结合片段以结合TIGIT。
本文提供的与TIGIT结合的多肽、抗体或抗原结合片段可以以与选自有用的聚合物、标记等的至少一种的缀合物的形式使用。
有用的聚合物可以是例如增加多肽、抗体和/或抗原结合片段的体内半衰期的非蛋白质聚合物，并且可以是选自聚乙二醇(PEG)(例如，2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa PEG)、葡聚糖、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)等的至少一种亲水聚合物，但不限于此。
标记可以是至少一种放射性核苷酸或荧光或化学发光的小化学物质，选自稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸盐、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰、伞形酮、虫荧光素、鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2，3-二氢二氮杂萘二酮、生物素/亲和素、自旋标记和稳定自由基，但不限于此。
医药用途
本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段通过阻断TIGIT的作用(例如，TIGIT与其配体CD155(PVR)之间的相互作用)来起到激活免疫的功能(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)。因此，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可用于免疫增强，并可在免疫相关疾病，特别是癌症的预防和/或治疗中找到有利的应用。
另一方面提供了免疫增强剂或免疫增强药物组合物，各自包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的抗癌剂或药物组合物，各自包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了免疫增强方法，该方法包括向需要免疫增强的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。免疫增强方法还可以包括在施用步骤之前确定需要免疫增强的对象的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的方法，该方法包括向需要免疫相关疾病预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。预防和/或治疗免疫相关疾病的方法还可以包括在施用步骤之前确定需要免疫相关疾病预防和/或治疗的对象的步骤。
另一方面提供了预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要癌症预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的步骤。用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括在施用步骤之前确定需要癌症预防和/或治疗的对象的步骤。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于免疫增强或用于制备免疫增强剂的用途。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗免疫相关疾病或用于制备预防和/或治疗免疫相关疾病的药物的用途。
另一方面提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗癌症或用于制备预防和/或治疗癌症的药物的用途。
在本文提供的药物组合物、方法和用途中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以与免疫检查点蛋白联合使用，例如靶向PD-1和PD-L1之一或两者的药物(拮抗剂)联合使用。具体而言，除了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段之外，药物组合物还可以包括靶向PD-1和PD-L1中的一种或两种的药物。除了施用抗TIGIT抗体或抗原结合片段的步骤之外，方法还可以包括施用靶向PD-1和PD-L1之一或两者的药物的步骤。
可联合施用的药物可以是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或两者，但不限于此。在实施方案中，抗PD-1抗体可以是选自彭布罗利珠单抗(Pembrolizumab)和纳武单抗(Nivolumab)的至少一种，但不限于此。
如本文所用，术语“免疫增强”(或增强免疫力)是指诱导对抗原的初始免疫应答或增强现有的免疫应答，并且可以与术语免疫刺激、免疫增加、免疫活化等互换使用。在实施方案中，免疫增强可以通过选自免疫细胞(效应T细胞，如细胞毒性T细胞；CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等)、调节性T(Treg)细胞的失活和/或耗竭、免疫蛋白(例如细胞因子等)的产生和/或分泌增加来实现，但不限于此。
如本文所用，术语“免疫相关疾病”包括由免疫系统的损伤和/或活性不足引起的所有疾病。免疫相关疾病的实例包括癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病等，但不限于此。
癌症可以是实体癌或血液癌，但不限于此，并且可以是选自鳞状细胞癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌等)、腹膜癌、皮肤癌、黑色素瘤(例如皮肤或眼内黑色素瘤等)、直肠癌、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌(例如结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌等)、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、头颈癌、脑癌和骨肉瘤中的至少一种。
对癌症的预防和/或治疗效果包括去除(杀死)癌细胞、抑制癌细胞的产生和/或生长、以及抑制由于迁移、侵袭、转移等导致的癌症恶化的所有效果。
传染性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病可选自可以通过前述免疫增强(例如，免疫细胞(效应T细胞，如细胞毒性T细胞；CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等)、调节性T(Treg)细胞的活性抑制和/或耗竭、免疫蛋白(例如，细胞因子(IL-2、IFN-γ等)的产生和/或分泌增加等)。例如，传染性疾病是当病原体，例如病毒、细菌、真菌和寄生虫，扩散并侵入活体(例如包括人类在内的动物)时产生的疾病的通称。它们可以是由选自病毒、细菌、真菌、寄生虫等的一种或多于一种病原体引起的感染或疾病。自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎、1型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、白塞氏病综合征、狼疮、干燥综合征、重症肌无力、硬皮病、甲状腺功能减退、甲状腺机能亢进、银屑病、白癜风、多发性硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性肾炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性脑炎、细胞因子风暴等，但不限于此。术语“炎症性疾病”指炎症(例如，慢性炎症或急性炎症)或由炎症引起的疾病。炎症性疾病的实例包括心脏炎症(例如，冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心包炎、心肌炎等)、血管炎症(例如，动脉粥样硬化、血管炎、弥散性血管内凝血(DIC)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、贫血等)、上呼吸道炎症(例如，急性鼻咽炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎等)、下呼吸道和/或肺部炎症(例如，支气管炎、支气管扩张、哮喘、慢性肺活性疾病(COPD)、肺炎、间质性肺疾病、结核病等)、上胃肠道炎症(例如胃炎、食管炎等)、下胃肠道炎症(例如肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻、憩室炎、肠易激综合征、阑尾炎、肛周瘘等)、肝脏、胆道和/或胰腺炎症(例如肝炎、脂肪肝、胆管炎、胆囊炎、胰腺炎、1型糖尿病等)、肾脏(上尿路)炎症(例如肾盂肾炎、肾小球肾炎、尿路感染等)、下尿路炎症(例如尿路感染、输尿管炎、尿道炎、膀胱炎、前列腺炎/慢性盆腔痛综合征等)、甲状腺和/或甲状旁腺炎症(如甲状腺炎、甲状旁腺炎等)、肾上腺炎症(如肾上腺炎等)、生殖器炎症(例如，盆腔炎、卵巢炎、睾丸炎、附睾炎等)、骨和/或关节炎症(例如，骨关节炎、类风湿性关节炎、骨髓炎、滑膜炎等)、皮肤炎症(例如，皮肤蜂窝织炎、丹毒、花斑癣、足癣、痤疮等)、肌肉炎症(例如，肌炎等)、脑部炎症(例如，脑炎、重度抑郁症等)、神经炎症(例如，眼睛、耳朵等各部分的神经炎、复杂性局部疼痛综合征、格林-巴利综合征等)、眼部炎症(例如，麦粒肿、葡萄膜炎、结膜炎等)、耳部炎症(例如，中耳炎、乳突炎等)、口腔炎症(例如，口腔炎、牙周炎、牙龈炎等)、全身性炎症(例如，全身性炎症反应综合征(脓毒症)、代谢综合征相关疾病等)、腹膜炎、再灌注损伤、移植排斥反应和超敏反应，但不限于此。
本文提供的抗TIGIT抗体、其抗原结合片段和/或包含其的药物组合物可施用于任何动物或细胞，例如选自哺乳动物的动物，包括灵长类动物如人和猴、啮齿类动物如大鼠、小鼠等，或来源于(分离自)动物的细胞、组织、体液(如血清)，或其培养物，例如分离自人的细胞、组织、体液(血清)。
除了作为活性成分的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于蛋白质药物的制剂中，并且可以是选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种，但不限于此。该药物组合物还可以包括选自稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等中的至少一种，它们通常用于药物组合物的制备。
抗TIGIT抗体、其抗原结合片段和/或药物组合物可以通过口服或肠胃外途径施用。对于肠胃外施用，可以采用静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。由于口服施用时蛋白质或肽被消化，所以口服用组合物中的活性成分可以被包衣或配制以防止在胃中消化。
此外，抗TIGIT抗体、其抗原结合片段和/或药物组合物可以是在油或水介质中的溶液、混悬剂、糖浆剂或乳剂的形式，或者可以配制成提取物、粉剂、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊、注射剂等。该组合物还可以包含分散剂或制剂稳定剂。
药物组合物中抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的含量或其剂量可以根据各种因素来确定，例如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理、膳食和施用时间、施用间隔、施用途径、排泄率、反应敏感性等。所述药物组合物可以基于活性成分(抗TIGIT抗体或抗原结合片段)以0.00001mg/kg至1000mg/kg、0.00001mg/kg至500mg/kg、0.00001mg/kg至100mg/kg、0.00001mg/kg至50mg/kg、0.0001mg/kg至1000mg/kg、0.0001mg/kg至500mg/kg、0.0001mg/kg至100mg/kg、0.0001mg/kg至50mg/kg、0.001mg/kg至1000mg/kg、0.001mg/kg至500mg/kg、0.001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至50mg/kg、0.01mg/kg至1000mg/kg、0.01mg/kg至500mg/kg、0.01mg/kg至100mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至1000mg/kg、0.1mg/kg至500mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg或0.1mg/kg至50mg/kg的日剂量施用，但不限于此。日剂量可以配制成单位剂量形式的一种制剂，配制成适当的部分，或通过将其置于多剂量容器中来制备。此外，在本说明书中，药物有效量是指能够显示活性成分的期望药理活性的活性成分的量，并且可以在上述剂量范围内。
多核苷酸和表达载体的构建及抗体的生产
另一方面提供了编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子。
另一方面提供了编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。
另一方面提供了重组载体，其携带编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子的组合，或者分离的重组载体，其分别携带编码抗TIGIT抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗TIGIT抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。重组载体可以是用于表达核酸分子的表达载体。
另一方面提供了锚定重组载体的重组细胞。
如本文所用，术语“载体”指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体，如噬菌体载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可通过操作本领域常用的质粒(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-Charon、λδZ1、M13等)或病毒载体(例如，SV40等)来构建。
在重组载体中，核酸分子可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”指感兴趣的核苷酸序列和表达调控序列(例如，启动子序列)之间的功能性连接。当被“可操作地连接”时，调节元件可以控制感兴趣的多核苷酸的转录和/或翻译。
重组载体通常可以构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，可以使用相关领域中通常可获得的用于在植物、动物或微生物细胞中表达外源蛋白的载体。本领域众所周知的各种方法可用于构建重组载体。
为了在宿主如原核或真核细胞中使用，可以相应地构建重组载体。例如，当载体被构建为用于原核宿主的表达载体时，该载体通常包括用于转录的强启动子(例如，pLλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。另一方面，用于真核宿主的表达载体包括在真核细胞中可操作的复制起点，例如f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点，但不限于此。此外，表达载体通常包括来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、HSV的tk启动子等)，以及作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。
可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞来制备重组细胞。只要它允许重组载体以稳定的方式顺序克隆和表达，本领域已知的任何宿主细胞都可以用于本公开。可用于本发明的原核宿主细胞的实例可选自大肠杆菌，例如大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110，芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、以及肠杆菌科菌株如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和各种假单胞菌。可用于转化的真核宿主细胞可选自但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、CHO S、CHO DXB11、CHO GS-KO、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK等。
可以使用相关领域公知的方法将核酸分子或携带该核酸分子的重组载体递送(导入)到宿主细胞中。例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以使用CaCl2或电穿孔方法进行这种递送。对于真核宿主细胞，可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或粒子轰击来实现基因导入。
根据本领域众所周知的方法，为了选择转化的宿主细胞，可以利用与选择标记相关的表型。例如，当选择标记是赋予对某种抗生素抗性的基因时，宿主细胞可以在抗生素存在的培养基中生长，以选择感兴趣的转化体。
另一方面提供了生产抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。在宿主细胞中表达核酸分子的步骤可以是培养锚定核酸分子的细胞或携带核酸分子的重组载体的步骤。该方法还可以包括在培养步骤后从培养基中分离和/或纯化抗体或抗原结合片段的步骤。
有益效果
本文提供的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段具有阻断TIGIT的作用以激活免疫的功能(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)，因此可发现作为各种免疫激活剂和/或免疫治疗剂的有利应用。
附图说明
图1是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体(7A6)的流式细胞术结果的图表。
图2显示了根据实施方案的嵌合和人源化抗体的序列比对。
图3a显示了根据实施方案的抗TIGIT抗体的表位作图结果，图3b显示了TIGIT蛋白三级结构上的表位位置。
图4是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对人原代T细胞中的TIGIT的结合亲和力的图表。
图5是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体的TIGIT-PVR阻断作用的图表。
图6是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对人外周血单核细胞(PBMC)中细胞因子(IL-2和IFN-γ)产生/分泌的影响的图表。
图7a和7b是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体在T细胞中的细胞因子产生/分泌效果的图表，对CD4+T细胞(7a)和CD8+T细胞(7b)进行了分析。
图8a至8d是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体在T细胞中的细胞因子产生/分泌效果的图表，对CD4+T细胞中的IL-2浓度(8a)、CD4+T细胞中的IFN-γ浓度(8b)、CD8+T细胞中的IL-2浓度(8c)和CD8+T细胞中的IFN-γ浓度(8d)进行了分析。
图9a至9d是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体在T细胞中根据其浓度的细胞因子产生/分泌效果的图表，对CD4+T细胞中的IL-2浓度(9a)、CD4+T细胞中的IFN-γ浓度(9b)、CD8+T细胞中的IL-2浓度(9c)和CD8+T细胞中的IFN-γ浓度(9d)进行分析。
图10a和10b是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对人PBMC中T细胞增殖的影响的图表，通过CFSE试验(10a)和通过Ki67试验(10b)分析。
图11是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体在Treg细胞存在下对T细胞增殖的影响的图表。
图12是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体和抗PD1抗体的组合对TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1的复合阻断作用的图表，通过基于细胞的NFAT报道反应生物测定分析。
图13a和13b是显示在与抗PD1抗体彭布罗利珠单抗(13a)和纳武单抗(13b)联合使用时，根据实施方案的抗TIGIT抗体和参考抗体之间针对TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1的阻断作用的比较的图表。
图14a和14b是显示当根据实施方案的抗TIGIT抗体单独使用或与抗PD1抗体组合使用时，人T细胞的细胞因子产生结果的图表，对CD4+细胞(14a)和CD8+细胞(14b)进行了分析。
图15是显示在A375和SK-OV3肿瘤细胞系中TIGIT配体CD155的表达水平的图表。
图16是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对A375肿瘤(黑素瘤)细胞系的细胞毒性(细胞死亡率)的图表。
图17a和17b是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对SKOV-3肿瘤(卵巢癌)细胞系的细胞毒性(细胞死亡率)的图表。
图18是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对SKOV-3肿瘤(卵巢癌)细胞系的细胞毒性(细胞死亡率)的图表。
图19是显示当与NK细胞共培养时，根据实施方案的抗TIGIT抗体对SKOV-3肿瘤(卵巢癌)细胞系的细胞毒性(细胞死亡率)的图表。
图20是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对结肠癌的体内抗肿瘤效果的图表。
图21是显示当根据实施方案的抗TIGIT抗体单独使用以及与抗PD1抗体组合使用时对结肠癌的体内抗肿瘤效果的图表。
图22显示了当根据实施方案的抗TIGIT抗体与抗PD1抗体联合使用时，测定对肿瘤微环境(TME)中免疫细胞的影响的结果。
图23是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对来源于肝癌患者的异种移植肿瘤的体内抗肿瘤效果的图表。
图24是显示肿瘤微环境(TME)中T细胞亚群上TIGIT表达水平的图表。
图25是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对来源于肝癌患者的T细胞中细胞因子产生的影响的图表。
图26是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对源自肺癌患者的T细胞中细胞因子产生的影响的图表。
图27是显示根据实施方案的抗TIGIT抗体对来自结肠癌患者的T细胞中细胞因子产生的影响的图表。
图28a和28b是显示根据实施方案的抗TIGIT-Fab片段在中枢记忆T细胞(28a)和效应记忆T细胞(28b)中的激活(细胞因子产生)效应的图表。
图29是显示根据实施方案的抗TIGIT-Fab片段对A375肿瘤细胞的细胞毒性(细胞死亡率)的图表。
图30是显示T细胞亚群中TIGIT表达水平的图表。
图31a至31d是显示用根据实施方案的抗TIGIT抗体处理后Treg、CD4+T细胞和CD8+T细胞的剩余细胞计数。
图32是显示用根据实施方案的抗TIGIT抗体处理后Treg和NK细胞的细胞计数的图表。
图33是显示在NK存在下用根据实施方案的抗TIGIT抗体处理后Treg细胞的残余细胞计数的图表。
图34a和34b是说明取决于根据实施方案的抗TIGIT抗体是否阻断FcgRIIIA(34a：CD4+T细胞，34b：CD8+T细胞)的T细胞中细胞因子产生影响的图表。
发明的实施方式
通过以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。对于本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本发明主旨的情况下修改以下实施例。
实施例1：抗TIGIT抗体的构建
1.1.抗TIGIT单克隆抗体的制备
通过交叉注射MMB设计的免疫原(Ag1585_IMM)和人TIGIT蛋白(aa22-138；SinoBiologics，UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)，在19天内连续交叉注射五次，免疫五只BALB/c小鼠。从五只小鼠中收集淋巴细胞，合并，纯化，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合的细胞在HAT选择性单步克隆培养基中繁殖，将所得的1896个杂交瘤克隆转移并培养在96孔板中。
用作免疫原的肽Ag1585_IMM被建模，以反映亲本蛋白内基于折叠和邻近的关系，并且通过最大化免疫原性蛋白的潜力，预期其可用于产生针对整个蛋白内相应表位具有完全活性的抗体。合成的肽Ag1585_IMM包括从人TIGIT的第51个氨基酸残基(T)到第70个氨基酸残基(N)的20个氨基酸。下表3总结了关于肽Ag1585_IMM的信息：
表3
上面的表3说明了建模的Ag1585_IMM的结构特征及其与TIGIT结构(PDB：5V52)的比对。低RMSD分数表示良好的对齐。基于相应的免疫原序列合成肽。
使用间接ELISA，筛选杂交瘤组织培养物上清液对免疫抗原Ag1585_IMM和重组人TIGIT(His)的作用。对于有效克隆(阳性克隆)，对筛选抗原(重组人TIGIT Fc嵌合体蛋白(R&D systems，9464-TG))和细胞进行进一步的间接ELISA试验，以证实Ig分泌和特异性。CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞系用作阴性对照。
ELISA在以下条件下进行：
-在4℃下，用100μL/孔的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)O/N包被ELISA板，所述缓冲液含有浓度为0.1μg/孔的重组人TIGIT(rhTIGIT)蛋白。
-室温下，用3％脱脂奶粉的PBS溶液封闭平板1小时。
-将PBS-Tween(1∶10000)中的山羊抗小鼠二抗IgG/M(H+L)-HRP在37℃下振荡孵育1小时(100uL/孔)。
-所有洗涤步骤都用PBS-Tween进行3分钟。
-以50uL/孔的浓度加入TMB底物，并在黑暗中孵育5分钟至10分钟，然后用等体积的1MHCl终止反应。
通过同种分型，识别并去除表达IgM的克隆，并收集表达IgG的克隆。
收集的阳性克隆被亚克隆以识别稳定表达的克隆。将含有所选克隆的培养上清液通过蛋白A柱进行洗脱，并将缓冲液换成PBS。通过间接ELISA法检测纯化抗体对筛选抗原(重组人TIGIT(T103)Fc嵌合蛋白；R&D Systems)和阴性对照抗原(His肽)。
通过流式细胞术分析测量所选先导抗体克隆(7A6)的结合。将CHO-K1(ATCC，CCL-61)和表达人TIGIT的CHO-K1(CHO-K1TIGIT)(Genscript，M00542)细胞用胰蛋白酶消化，计数，以2x106细胞/ml的浓度重悬，并与Fc block(BD Bioscience 564220)一起培养30分钟。培养后，将细胞加入到96孔板中，并将加入的抗体(单点)连续稀释(8点，从5μg/ml开始，稀释3倍)。对于CHO-K1细胞(阴性对照)，它们在5μg/ml的单一浓度下进行测试，相当于在CHO-K1 TIGIT细胞上进行滴定的最高浓度。培养30分钟后，使用4μg/ml(避光)的抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 647抗体(Sigma A21236)测量抗体结合。使用AccuriC6流式细胞仪进行流式细胞术，并使用FlowJo分析数据。获得的结果如图1所示。
溶解对应于稳定表达克隆的杂交瘤细胞沉淀，提取mRNA，并将重链和轻链的可变区DNA克隆到测序载体中。分析了重链和轻链的DNA序列。小鼠抗TIGIT克隆(7A6)的序列分析结果列于下表4中。
表4
(在表4中，下划线区域依次代表重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3)
1.2.小鼠抗TIGIT克隆的人源化
为了证实对抗体结构和结合至关重要的氨基酸残基，分析了单克隆抗体可变区(mAb V区)的蛋白质结构模型。该信息与人类抗体结构的计算机设计结合使用。筛选了可能用于7A6人源化的大量初步序列片段，并检测了它们与人MHC II类等位基因的肽结合。在可能的情况下，被识别为人MHC II类的重要非人类种系结合物的序列片段被丢弃。这减少了片段集，使用上述方法重新分析这些组合，以确保片段之间的连接不包括潜在的T细胞表位。为了产生含有无重要T细胞表位或减少的重要T细胞表位的完整可变区(V区)，序列片段被组装以设计人源化可变区，该可变区可以避开潜在的T细胞表位识别或包含最小化的T细胞表位(去免疫)。
为了在哺乳动物细胞中进行基因合成和表达，选择了五个重链(VH1至VH5)序列和五个轻链(Vκ1至Vκ5)序列。
通过瞬时转染产生的稳定IgG抗体的总结，包括一个嵌合体(VH0/Vκ0)和25个人源化变体(标记为‘○’)，如下表5所示：
表5
(在表5中，给定值(％)表示人源化百分比(确定为与最接近的匹配人类种系的同源性百分比))。
通过将表4中7A6克隆的组合应用于表5中的组合而衍生的嵌合抗体(VH0xVκ0)和人源化抗体序列在表6和表7以及图2中给出。在表6和表7以及图2中，根据Kabat定义确定了氨基酸序列编号和CDR区域，并且在图2中用阴影标出了与上面确定的CDR和亲本序列(VH0或Vκ0)不同的氨基酸残基。
表6
重链(恒定区：人IgG1)
表7
轻链(恒定区：κ(表示为K、k或κ))
在所产生的抗体中，7A6 VH3/Vk5 hIgG1抗体在其重链的Fc区经历了以下点突变，以产生Fc工程化的变体：
(1)S240D、A331L和I333E(DLE变体)：7A6 VH3/Vk5-DLE；
(2)N298A：7A6 VH3/Vk5 N298A；
(3)S299A、E3334A和K335A(AAA变体)：7A6 VH3/Vk5 AAA；或
(4)L235A、L236A和P330G(LALAPG变体)：7A6 VH3/Vk5 LALAPG
表8中列出了含有上述Fc工程化的变体的抗体的重链和轻链的序列。
表8
/>
(在表8中，可变区用下划线标出，Fc区的突变氨基酸残基用粗体标出)
1.3.嵌合和人源化IgG1抗体的瞬时表达
使用PEI转染方法，将VH0/Vκ0嵌合抗体的编码DNA和人源化重链和轻链组合的编码DNA(总共25个人源化配对)瞬时转染到6孔板中的HEK293 EBNA贴壁细胞(LGCStandards，Teddington，UK)中。转染后，细胞培养7天。收集样品，基于人IgG1抗体标准，使用蛋白A生物传感器(MolecuLar Devices，Wokingham，Berkshire，UK)在Octet QK384上测量抗体浓度。
获得的结果列于下表9中：
表9
表9显示了嵌合抗体(VH0/Vκ0)和人源化抗体的各种组合在HEK细胞中表达后上清液中的IgG浓度(μg/ml)。
如表9所示，所有测试的抗体都被良好表达，特别是，除了VH5Vκ1和VH5Vκ5之外，所有人源化变体都比VH0/Vk0嵌合抗体表达得更好。
1.4.嵌合和人源化变体的单循环动力学分析
为了评估所有变体与人TIGIT抗原的结合并选择亲和力最接近嵌合抗体(VH0Vκ0)的人源化IgG抗体，在来自转染细胞培养物的上清液中进行单循环动力学分析(cartoon)。使用Biacore T200运行Biacore T200控制软件V2.0.1和评估软件V3.0(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)在25℃下进行动力学测试。
为了减少与参考表面的非特异性结合，补充有1％BSA w/v(Sigma，Dorset，UK)的HBS-P+(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)被用作流动缓冲液，并且也被用于配体和分析物的稀释。将含有IgG的上清液在运行缓冲液中稀释至1μg/ml。在每个周期开始时，将抗体加载到抗人传感器芯片(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)上的Fc2、Fc3和Fc4上。以10μL/分钟的流速捕获IgG抗体，以实现约208RU的固定化水平(RL)。然后，让表面稳定下来。
为了使潜在的传质效应最小化，使用重组人TIGIT(来自Sino Biological)作为分析物，并以40μL/分钟的流速注射，以获得单循环动力学数据。将抗原在流动缓冲液中稀释至1.25nM至10nM的浓度范围，稀释2倍(在4点)，并在各个浓度之间不再生的情况下使用。对于四种递增的抗原浓度中的每一种，监测结合相210秒，在最后一次抗原注射后，测量单个解离相900秒。传感器芯片表面通过单次注入3M MgCl2而再生。
用Langmuir(1∶1)结合模型拟合双参考传感图，并且使用卡方值评估数据与模型的拟合，卡方值描述了实验获得的曲线和拟合曲线(观察到的与预测的)之间的偏差。拟合算法旨在最小化卡方值。由1∶1模型拟合曲线确定的动力学常数如表10所示。
表10
表10显示了使用Biacore T200测量的嵌合抗体(VH0/Vκ0)和人源化变体与人TIGIT抗原结合的单循环动力学参数。通过将人源化变体的KD除以在同一实验中分析的VH0/Vκ0嵌合抗体的KD来计算相对KD。
如表10所示，发现所有测试的人源化变体(抗体)与人TIGIT结合的KD值比VH0/Vk0高2.55倍。考虑到相对表达水平、人源化百分比和相对KD值(从对上清液的Biacore单循环动力学分析中获得)，选择六种人源化变体(VH2/Vκ5、VH3/Vκ4、VH3/Vκ5、VH4/Vκ4、VH4/Vκ5和VH5/Vκ5)用于随后的热稳定性分析。
1.5.热稳定性评估
为了从抗体从其天然状态转变为变性状态(解折叠)的温度获得关于抗体热稳定性的信息，进行了热斜坡稳定性实验(Tm和Tagg)。这种解折叠过程发生在一个狭窄的温度范围内，这种转变的中点被称为“解链温度”或“Tm”。因为蛋白质在这一点上经历了构象变化，所以测量Sypro Range(其结合到蛋白质的暴露疏水区域)的荧光以确定蛋白质的解链温度。
样品在PBS中稀释至最终测试浓度0.5mg/ml，SyproTM Orange(160×储备溶液；Sigma-Aldrich)加入到最终浓度为20×的溶液中。将每种样品混合物装入UNi微量比色皿两次，每次9μL。对样品进行从15℃到95℃的热升温(升温速率为0.3℃/分钟，激发波长为473nm)。测量从250nm至720nm的完整发射光谱，并使用510nm至680nm的曲线下面积来计算过渡曲线的拐点(Tonset和Tm)。监测473nm处的静态光散射(SLS)以检测蛋白质聚集，并从所得SLS曲线计算Tagg(聚集开始)。使用4.0版的UNcleTM软件(ABZENA)进行数据分析。
获得的结果总结在下表11中：
表11
表11显示了使用UNcle生物稳定性平台获得的热稳定性值。如表11所示，所有测试的人源化抗体都表现出与嵌合抗体相似的热稳定性水平。
1.6.使用多循环动力学分析的人源化变体的亲和力测量
为了测量嵌合抗体和六种主要人源化变体(VH2/Vκ5、VH3/Vκ4、VH3/Vκ5、VH4/Vκ4、VH4/Vκ5和VH5/Vκ5)对人TIGIT抗原的结合亲和力，对纯化的蛋白质(抗体)进行了多循环动力学分析。使用Biacore T200在25℃下进行动力学实验，该Biacore T200使用控制软件V2.0.1和评估软件V3.0(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)操作。
补充有1％BSA w/v(Sigma，Dorset，UK)的HBS-P+(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)用作流动缓冲液，也用于配体和分析物的稀释。将纯化的先导抗体在流动缓冲液中稀释至1μg/ml的最终浓度，并在每个循环开始时，加载到抗人IgG CM5传感器芯片(GEHealthcare，Little Chalfont，UK)上的Fc2、Fc3和Fc4位点。抗体以10μL/分钟的流速被捕获，直到达到约150RU的响应水平(RL)，然后是稳定期。
为了最大限度地减少潜在的传质效应，以50μL/分钟的流速引入重组人TIGIT(Acrobiosystems，中国)作为分析物，以获得多循环动力学数据。将抗原(TIGIT)在流动缓冲液中稀释两倍，从0.406nM到30nM(7点)，并且在循环之间不再生的情况下应用每个浓度。对于每个浓度，监测结合相240秒，然后监测解离相900秒。通过注射3M MgCl2两次，传感器芯片表面在动力学循环之间再生。为了确保表面和分析物在动力学循环中的稳定性，将空白和单一浓度分析物的重复注射编入动力学运行中。
从上述实验中获得的结果，特别是嵌合抗体(VH0/Vκ0)和VH3/Vκ5抗体的结果，总结并呈现在表12中：
表12
抗体 分析物 ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) RMAX Chi2(RU2)
VH0/Vk0 hTIGIT 2.28E+06 1.76E-04 7.70E-11 28.2 0.425
VH3/Vk5 hTIGIT 2.04E+06 1.77E-04 8.67E-11 26 0.246
表12显示了由1∶1模型拟合曲线确定的动力学常数。如表12所示，人TIGIT蛋白的结合亲和力(KD)对于抗体7A6 VH0Vk0为77pM，对于抗体VH3/Vk5为86.7pM，两者相似。
1.7.表位作图
通过肽质量指纹(PMF)和H/D交换(氢/氘交换)识别抗体的表位。
为了检测TIGIT和TIGIT与抗体7A6 Vh3/Vk5的混合物中氘原子的掺入，对样品的肽质量指纹(PMF)进行了优化。蛋白质样品的蛋白水解消化在淬灭条件下进行，以限制在蛋白质消化和色谱过程中可能发生的氘原子的逆向交换。
制备TIGIT溶液(SEQ ID NO：30；NCBI参考序列NP_776160.2；UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)(15μM，150μL)和TIGIT与Vh3Vk5的混合物，TIGIT∶Vh3Vk5的比例为＝(15μm∶30μm，150μL)。将4μL上述蛋白质样品与56μL标记缓冲液(5mM K2HPO4；5mM KH2PO4，D2OpH 6.6)和56μL平衡缓冲液(5mM K2HPO4；5mM KH2PO4，pH7.0)进行对照实验。15×稀释溶液(60μL，TIGIT∶Vh3Vk5；1μM∶2μM)分别孵育15秒、60秒、180秒、600秒、1800秒和7200秒，之后将50μL猝灭溶液(50mM K2HPO4；50mM KH2PO4；GuCl 2.0M，TCEP 200mM，pH 2.3，0℃)加入到蛋白质样品中，并再孵育20秒。孵育后，立即将80μL淬灭的蛋白质溶液注射到蛋白水解胃蛋白酶柱中，并在15℃下保持5分钟。蛋白质消化后，在MSe Xevo-G2-XS分析之前，使用带有C18色谱的液相色谱(HDX ManagerWaters)分析产生的胃蛋白酶肽。这些测试进行了三次。
使用DynamX3.0软件分析H/D交换肽。氘水平通过考虑具有高和中等置信度的所有结果的平均值来确定。氘化水平是根据实验同位素簇的质心计算的。
从HDX-MS分析结果来看，当单独或与7A6 VH3/Vk5一起孵育时，观察到TIGIT内氘掺入的显著差异。氘掺入的主要差异在氨基酸残基51至70(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN；SEQ IDNO：31)中观察到，它们负责7A6 Vh3Vk5的表位区。
结果显示在图3a和图3b中。图3a显示了HDX-MS分析结果(在TIGIT的位点51至70(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN；SEQ ID NO：31)具有高水平的氘掺入)。图3b示意性地表示了TIGIT的带状结构；上部是顶视图，下部是侧视图，表位位点用箭头表示。
1.8.暂时性抗体表达和先导人源化抗体的纯化
合成7A6 VH3/Vk5的重链和轻链可变区序列以及用于克隆载体构建的限制性酶切位点。用合适的限制性内切酶处理重链和轻链的合成序列(重链：Mlu I和Sal I(新英格兰生物实验室)；轻链：BssH II和BamH I(新英格兰生物实验室))，并连接到含有用相同限制性内切酶处理的人IgG1恒定区的表达载体中。对重链和轻链cDNA构建体进行测序。进行Giga prep以制备用于CHO细胞中瞬时转染的DNA。使用PureLinkTM HiPure Expi PlasmidGigaprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific，K210009XP)进行Giga prep。这种Gigaprep试剂盒设计用于在大肠杆菌中扩增质粒DNA，然后使用阴离子交换色谱将其纯化。使用无动物成分和无血清的培养基(CD CHO培养基，Thermofisher)培养CHO细胞(Evitria)。使用MabSelectTMSuReTM通过蛋白A纯化方法从培养上清液中纯化产生的抗体。使用尺寸排阻色谱法(SEC)进行连续纯化，以获得大于95％的纯度。通过测量280nm处的吸光度和通过SDS-PAGE来表征纯化的抗体。
1.9.人原代T细胞中TIGIT的特异性和结合亲和力
根据制造商的说明，使用APEXTM抗体标记试剂盒(Invitrogen)将抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体与Alexa(AF488)缀合。使用微珠(EasySepTM)从人PBMC中分离T细胞，并用不同浓度的标记的抗TIGIT抗体(抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体；50ng/ml、250ng/ml、750ng/ml、1250ng/ml和2500ng/ml)。使用流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman CouLter)测量结合，并使用FlowJo软件(TreeStar，Inc)分析获得的数据。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞上证实了抗TIGIT抗体的结合。
获得的结果如图4所示。如图4所示，测试的抗TIGIT抗体与原代T细胞结合，并且与TIGIT分子的结合(每个细胞)随着抗TIGIT抗体浓度的增加而增加。
参考实施例：参考抗体的制备
在以下实施例中用作参考的参考抗体是基于相应专利中公开的序列信息或从制造商处购买的序列信息构建的。每种抗体的相应专利或制造商总结如下：
22G2(BMS)：US2016/0176963 A1，
31C6(Merck)：WO2016/028656 A1，
4.1D3(Genentech)：WO2017/053748 A2，
TIG1(Arcus)：WO2017/152088 A1，
313M32(Mereo)：US2016/0376365 A1，
替瑞利尤单抗(Roche)：购自CrownBio，
10A7(Genentech)：购自Creative Biolabs，
MBSA43：购自eBioscience，
彭布罗利珠单抗和纳武单抗：购自InvivoGen。
实施例2：通过基于细胞的报道试验测量抗TIGIT抗体的生物活性
使用基于细胞的NFAT报道反应生物测定法(Promega)分析了抗TIGIT抗体对TIGIT与其受体，即脊髓灰质炎病毒受体(PVR)之间相互作用的阻断作用(TIGIT-PVR阻断作用)。将TIGIT效应细胞(Promega)加入到细胞分析缓冲液(90％RPMI 1640/10％FBS)中，将含有TIGIT效应细胞的细胞悬液在37℃孵育16小时。在PBS缓冲液中制备抗TIGIT抗体(7A6VH3/Vk5)或参考抗体，并加入预孵育的细胞悬浮液中。将CD155 aAPC/CHO-K1细胞(Promega)加入到含有细胞和抗体的混合物中，并在37℃培养6小时。使用PromegaTM 板读数器测量发光。使用曲线拟合软件(GraphPad/>software)测量抗体反应的EC50值。
获得的结果如图5所示。如图5所示，由于抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体的TIGIT-PVR阻断，T细胞的激活信号增加。与参考抗体如BMS(22G2)、Arcus(TIG1)、Genentech(4.1D3)和Mereo(313M32)相比，本申请的抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体显示出显著更高的效果(显著更低的EC50值)。
实施例3：抗TIGIT抗体的细胞因子产生效应
3.1.人外周血单核细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的制备
外周血单核细胞(PBMC)获自成人(whole blood leukocyte cones，NHS Bloodand Transplant，英国)或购自STEMCELL Technologies。在经过适当的伦理审查并获得“英国伯明翰大学肝脏和胃肠研究中心”的事先同意后，对肝细胞癌(HCC)患者和健康的正常供体进行了该工作实施例的试验。PBMC和肝源性淋巴细胞从HCC患者的肝组织中制备。从0.5cm至1cm肝穿刺活检中分离肝浸润淋巴细胞。随后，使用Dounce组织研磨机将组织在2mL至3mL Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(GIBCO)中匀浆。从Cureline，Inc.获得黑素瘤、卵巢癌、CRC(结肠直肠癌)、HCC、NSCLC(非小细胞肺癌)和胰腺癌患者的PBMC。然后对从癌症患者获得的肝浸润淋巴细胞和PBMC进行如下分析。
3.2.人PBMC中细胞因子产生的测定
3.2.1.抗TIGIT抗体增加人PBMC中细胞因子分泌
在存在抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体(2μg/ml和10μg/ml)的情况下，用抗CD3抗体培养PBMC。未用抗TIGIT抗体处理的组用作对照。培养后，样品以400xg离心10分钟，上清液用于多重免疫测定。使用Bio-Plex细胞因子测定法(人细胞因子测定法，包括IFN-γ、IL-2)测量细胞因子浓度。根据制造商的说明进行所有分析，并在Bio-Plex 200阵列阅读器(Bio-Rad)上读取结果。
获得的结果(IFN-γ和IL-2浓度)显示在图6中。如图6所示，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体显著诱导人PBMC中Th1/Tc1细胞因子的分泌。除非在说明书和附图中另有说明，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5-IgG1被称为抗TIGIT 7A6抗体或抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体。
3.2.2.抗TIGIT抗体增加人T细胞中细胞因子产生
在人T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)中测量细胞因子产生。用抗CD3单克隆抗体(BD Biosciences，目录号555336；0.2μg/ml)和抗CD28单克隆抗体(BD Biosciences，目录号555725；1μg/ml)培养细胞(500000细胞/反应)，在抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体的存在下。培养后，细胞在4℃下以400xg离心10分钟，并测量T细胞内的细胞因子浓度。在这方面，细胞内细胞因子如下染色：细胞用Zombie Aqua可固定死细胞染料溶液(Biolegend)染色，并用CD4+和CD8+T细胞表面标记的荧光团缀合抗体在冰上标记30分钟。所用的抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体(均用于CD4+和CD8+T细胞表面染色)、抗IL-2、抗IFNg和抗TNFa抗体均购自Biolegend。
使用eBioscienceTM Foxp3/转录因子固定/透化浓缩和稀释试剂盒(eBiosciences)，根据制造商的说明固定和透化细胞。然后用细胞内IL-2、IFNγ和TNFα的荧光团缀合抗体对细胞进行染色。用流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman CouLter)分析细胞，用FlowJo软件(BD Biosciences)分析数据。
结果如图7a(CD4+T细胞)和7b(CD8+T细胞)所示。如图7a和图7b所示，本申请的抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体增加了T细胞内Th1/Tc1细胞因子(IL-2，IFN-γ)的产生，证明了其增强免疫反应的效果。获得的结果表明，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体具有以剂量依赖性方式增强效应T细胞功能的有效作用。
3.3.抗TIGIT抗体和参考抗体的效力比较
3.3.1.与抗PD1药物相比，抗TIGIT抗体的免疫增强作用增强
使用实施例3.2.2中描述的方法测量抗TIGIT抗体对细胞因子产生的免疫效果。为了比较，抗PD1抗体，彭布罗利珠单抗(表示为“Pem类似物”)和纳武单抗(表示为“Niv类似物”)被用作参考抗体。在用抗TIGIT抗体或抗PD1抗体处理后，通过进行流式细胞术进行分析。抗PD-1抗体和抗TIGIT抗体均以10μg/ml的浓度使用。
获得的结果描绘在图8a(CD4+T细胞中的IL-2浓度)、8b(CD4+T细胞中的IFN-γ浓度)、8c(CD8+T细胞中的IL-2浓度)和8d(CD8+T细胞中的IFN-γ浓度)中。如图8a至图8d所示，与彭布罗利珠单抗或纳武单抗相比，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体诱导了更高水平的CD4+和CD8+T细胞活化。
3.3.2.与参照抗TIGIT抗体相比，抗TIGIT 7A6抗体增强了Th1/Tc1细胞因子产生效果
在用不同浓度(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)的抗TIGIT抗体培养T细胞后，使用实施例3.2.2中描述的方法测量细胞因子产生。用于比较的参考抗TIGIT抗体如前所述。
获得的结果显示在图9a(CD4+T细胞中的IL-2浓度)、图9b(CD4+T细胞中的IFN-γ浓度)、图9c(CD8+T细胞中的IL-2浓度)和图9d(CD8+T细胞中的IFN-γ浓度)中。如图9a至图9d所示，观察到抗TIGIT 7A6V H3/Vk5抗体通过增加Th1/Tc1IFN-γ和IL-2细胞因子产生来增强免疫反应。与比较抗TIGIT抗体相比，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体在细胞因子产生方面表现出更强的增加。
实施例4：抗TIGIT抗体对T细胞增殖的影响
4.1.抗TIGIT抗体对人PBMC中T细胞增殖的影响
将10μg/ml的抗TIGIT抗体(7A6 VH3/Vk5-IgG1或7A6 VH3/Vk5-IgG4)与平板结合的抗CD3抗体(BD Biosciences)(0.2μg/ml)、PBMC(500000个细胞/反应)和Cytostim激活剂(Miltenyi Biotec)共培养。培养后，在Live-Cell分析系统(Satorius)上测量CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)，在流式细胞仪上测量Ki67。
获得的结果显示于图10a(CFSE测定结果)和图10b(Ki67测定结果)(无刺激：既无Cytostim激活剂也无抗体处理；对照：无抗体处理)。如图10a和图10b所示，本申请的抗TIGIT抗体7A6 VH3/Vk5-IgG1和7A6 VH3/Vk5-IgG4均诱导T细胞增殖，表明由抗TIGIT抗体诱导的免疫反应可以持续较长时间。
4.2.抗TIGIT抗体对调节性T细胞抑制CD8+T细胞增殖的阻断作用
使用人CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec 130-096-495)和CD4+CD25+CD127-dim reg T细胞分离试剂盒II(130-094-775)分离CD8+T细胞和Treg(调节性T细胞)。分离的CD8+T细胞用cell tracker violet增殖试剂盒(Thermo Fisher)染色并接种，使得CD8∶Treg比例为4∶1。用CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher)激活细胞，并将10μg/ml的抗TIGIT 7A6VH3/Vκ5抗体加入合适的孔中。在第3天，洗去微珠，加入50ng/ml的IL-2。在第7天，用live/dead(ThermoFisher LIVE/DEAD Fixable Near-IR DEAD Cell Stain Kit)、CD3、CD8和CD4(均获自Biolegend)的表面标记抗体对细胞进行染色，并在流式细胞仪(CytoFlex，Beckman CouLter)上进行分析。
获得的结果显示在图11中。如图11所示，CD8+T细胞的增殖随着Treg的加入而降低，但是这种对CD8+T细胞增殖的抑制被抗TIGIT抗体阻断。这意味着抗TIGIT抗体阻断了Treg介导的对CD8+T细胞增殖的抑制。
实施例5：抗TIGIT抗体和抗PD1药物组合的协同作用
5.1.通过基于细胞的报道试验对抗TIGIT/抗PD1抗体进行生物学表征
测试了抗TIGIT抗体和抗PD抗体(彭布罗利珠单抗或纳武单抗)的组合的协同作用。使用基于细胞的NFAT报道反应生物测定法(Promega)分析抗TIGIT抗体和抗PD抗体对TIGIT-PVR和PD-1-PD-L1的联合阻断作用。PD-1+TIGIT+效应细胞(Promega；1×105个细胞/反应)加入到细胞分析缓冲液(90％RPMI 1640/10％FBS)中，并将所得的含有PD-1+TIGIT+效应细胞的细胞悬液在37℃培养16小时。PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1细胞(Promega；4×104个细胞/反应)在细胞回收培养基(90％Ham’s F-12，10％FBS)中制备。将抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体和彭布罗利珠单抗或纳武单抗的混合物加入到含有PD-1+TIGIT+效应细胞(1×105/反应)和PD-L1+CD 155 aAPC/CHO-K1(4×104/反应)的细胞悬浮液中，并在37℃培养6小时。作为对照，单独施用抗TIGIT抗体或抗PD1抗体。当单独使用时，抗体以0.02048、0.512、1.28、3.2、8或20(μg/ml)的浓度施用。对于联合处理，抗TIGIT抗体以0.02048、0.512、1.28、3.2、8或20(μg/ml)的浓度使用，而抗PD-1抗体(彭布罗利珠单抗或纳武单抗)的浓度也是0.02048、0.512、1.28、3.2、8或20(μg/ml)。
培养后，加入Bio-Glo试剂并在环境温度下培养10分钟。使用PromegaTM 板读数器测量发光度。使用曲线拟合软件(GraphPad/>software)确定抗体反应的EC50值。
获得的结果显示在图12中。如图12所示，观察到抗TIGIT抗体与彭布罗利珠单抗或纳武单抗的组合表现出协同效应。
5.2.抗PD1/参考抗体和抗TIGIT/抗PD1抗体之间生物活性的比较
使用基于细胞的NFAT报道反应生物测定法(Promega)分析了抗TIGIT抗体和抗PD1抗体阻断TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1的联合作用。参照实施例5.1，将抗TIGIT抗体(7A6)或参照抗TIGIT抗体与彭布罗利珠单抗或纳武单抗共培养。为了比较，将参考抗体与细胞混合物一起培养，并以相同的方式处理。
当单独使用时，抗体以0.013、0.032、0.082、0.204、0.512、1.28、3.2、8或20(μg/ml的浓度使用。对于联合处理，抗TIGIT抗体的浓度为0.013、0.032、0.082、0.204、0.512、1.28、3.2、8、20(μg/ml)，而抗PD-1抗体(彭布罗利珠单抗或纳武单抗)的浓度也为0.013、0.032、0.082、0.204、0.512、1.28、3.2、8、20(μg/ml)。
获得的结果显示在图13a(与彭布罗利珠单抗组合)和图13b(与纳武单抗组合)中。如图13a和图13b所示，与抗PD1抗体和参考抗TIGIT抗体的组合相比，与彭布罗利珠单抗和纳武单抗组合的抗TIGIT抗体表现出更高的增强效果。
5.3.抗TIGIT/抗PD1抗体对免疫T细胞的免疫效应
测量用抗TIGIT/抗PD1抗体联合或单独处理期间人T细胞的细胞因子产生。将抗TIGIT抗体7A6 VH3/Vk5(2μg/ml)与彭布罗利珠单抗(2μg/ml或纳武单抗(2μg/ml)预混合，并加入到细胞培养物中。参考实施例3.2.2，细胞内细胞因子被染色。
获得的结果显示在图14a(CD4+细胞)和图14b(CD8+细胞)中。从结果可以看出，当联合使用抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体和抗PD1抗体时，基于人原代T细胞中Tc1/Th1细胞因子产生的抗肿瘤活性增强。
实施例6：抗TIGIT抗体对肿瘤细胞的细胞毒性分析
6.1.肿瘤细胞中TIGIT配体PVR(CD155)的表达水平
用1∶25稀释的抗CD155PE-Cy7(Biolegend)对靶肿瘤细胞(A375和SK-OV3细胞)(ATCC)进行染色，以评估CD155(PVR)的表达，并使用流式细胞仪进行分析。
获得的结果显示在图15中。如图15所示，A375和SK-OV3肿瘤细胞表现出TIGIT配体CD155的显著表达水平。
6.2.抗TIGIT抗体对A375黑色素瘤细胞的细胞毒性
将浓度为10μg/ml的抗TIGIT抗体(7A6 VH3/Vk5和7A6 VH3/Vk5-DLE)与A375细胞系(黑素瘤)(2.5×10e4个细胞/反应)在PBMC(250000个细胞/反应)和Cytostim(MilteniBiotec)存在下共培养72小时，以测试对A375肿瘤细胞的细胞毒性。为了比较，使用了抗TIGIT10A7参考抗体(Genentech)。此外，还测试了经修饰的抗TIGIT抗体(7A6 VH3/Vk5-DLE)对肿瘤细胞的细胞毒性能力。使用Live-Cell分析系统(Satorius)对肿瘤细胞进行计数。
获得的结果显示在图16中。如图16所示，本申请的抗TIGIT抗体7A6 VH3/Vk5和7A6VH3/Vk5-DLE都显示出增强的肿瘤细胞杀伤效果。
6.3.抗TIGIT抗体对卵巢癌细胞1的细胞毒性能力
为了验证抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体对SKOV-3肿瘤(卵巢癌)细胞系的细胞毒性能力，在存在或不存在抗TIGIT抗体(10μg/ml)或参考抗体(10μg/ml)的情况下，将SKOV-3细胞(35k细胞/孔)与PBMC和CytoStim(1/50)共培养。效应细胞与靶细胞的比例(E∶T)设定为6∶1。使用的参考抗体是抗TIGIT抗体Mereo/313M32、BMS/22G2、Genentech/4.1D3和Arcus/TIG1(参考参考实施例)。使用Live-Cell分析系统(Sartorius)和IncuCyte原生软件分析获得的数据。
结果显示在图17a(培养时间内的细胞死亡率)和图17b(培养84天后的细胞死亡率)中。如图17a和图17b所示，观察到抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体对肿瘤细胞的细胞毒性增加，并且这种细胞毒性能力与参考抗体相比显著更高。
6.4.抗TIGIT抗体对卵巢癌细胞2的细胞毒性能力
为了测试抗TIGIT抗体(抗TIGIT 7A6VH3/Vk5和7A6VH4/Vk4，各为10μg/ml)对SKOV-3卵巢癌细胞的细胞毒性，在存在或不存在抗TIGIT抗体的情况下，将SKOV-3细胞(35k个细胞/孔)与分离的CD8+T细胞和Cytostim共培养108天。效应细胞与靶细胞的比例(E∶T)设定为3∶1。以相同方式用彭布罗利珠单抗处理的组作为对照。使用IncuCyte原生软件分析数据。
结果如图18所示。从结果可以看出，抗TIGIT 7A6VH3/Vk4抗体表现出增强的针对肿瘤细胞的细胞毒性，并且这种细胞毒性能力显著高于彭布罗利珠单抗。
6.5.通过TIGIT-CD 155(PVR)阻断增强NK细胞对SKOV3肿瘤细胞的细胞毒性
用或不用IL-15(5ng/ml)预刺激NK细胞48小时。根据制造商的说明，使用NK分离试剂盒(NK Cell Isolation Kit，来自Miltenyi Biotec(目录编号130-092-657))从人PBMC中分离这些NK细胞。培养后，在抗TIGIT抗体(7A6 VH3/Vk5、7A6 VH4/Vk4、7A6 VH3/Vk5-DLE)存在下，将NK细胞(250000个细胞/反应)与SKOV3细胞(2.5×10e4个细胞/反应)共培养48小时，每种抗体的浓度为10μg/ml，E∶T比例设定为10∶1。使用Live-Cell分析系统(Sartorius)对肿瘤细胞进行计数。/>
结果如图19所示。如图所示，所有测试的抗TIGIT抗体显著增加了NK细胞对SKOV3肿瘤细胞的细胞毒性能力。
实施例7：体内抗癌效力的分析
7.1.MC38结肠癌模型中抗TIGIT抗体体内效力的测定
表达人PVR(MC38-hPVR)的MC38结肠癌细胞(CrownBio)体外储存在补充有10％FBS(胎牛血清)和4μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基中，37℃，5％CO2气氛。在接种肿瘤之前，收获指数生长期的细胞并用细胞计数器进行定量。
将制备的肿瘤细胞溶液(在0.1mL PBS溶液中的2×105个肿瘤细胞)皮下注射到C57BL6hTIGIT敲入小鼠(来自GemPharmatech有限公司)的右侧以诱导肿瘤生长。当平均肿瘤大小(体积)达到80mm3至100mm3时进行随机化。在该实验中总共使用15只小鼠，并将它们随机分成三组(5只小鼠/组)。
接种肿瘤细胞后，每天检查动物的病理状态和死亡率，随机化后，每周测量三次体重的增加/减少。每天记录每只动物的死亡率和观察到的临床症状。随机化后，每周三次使用测径器对肿瘤大小(体积)进行二维测量，并使用以下公式进行计算：
V(mm3)＝(L×W×W)/2
[其中V是肿瘤体积(mm3)，L是肿瘤的长度(肿瘤的最长轴)，W是宽度(垂直于L的最长长度)]。
接种、肿瘤大小和重量测量在层流柜中进行。使用StudyDirectorTM软件(版本3.1.399.19)测量重量和肿瘤大小。
分组后，立即用抗体或载体进行处理。PBS溶液用作载体(对照；组1)，分别以20mg/kg的剂量用由CHO细胞产生的7A6 VH3/Vk5和替瑞利尤单抗处理(分别为组2和组3)(见表13)。
表13
BIW：Bi-每周(每周两次)
i.p.：腹膜内注射
在测试期间，在注射了抗体的组中没有观察到体重减轻(组2和组3；剂量为20mg/kg，腹膜内注射)。
如上测量的小鼠肿瘤大小显示在图20中。
如图20所示，在抗体处理后的第21天，与PBS对照组相比，7A6 VH3/Vk5抗体显示出对肿瘤生长的显著抑制作用。当使用非配对t-检验分析匹配日测试组之间的MC38肿瘤的大小时，与对照组相比，7A6 VH3/Vk5抗体的肿瘤生长抑制作用在第9天(p值，0.029)和第21天(p值，0.007)特别明显。7A6 VH3/Vk5抗体(第2组)也显示出比对照抗体替瑞利尤单抗(第1组)更好的抗肿瘤效力(例如，在第21天，p值为0.013)。
肿瘤生长抑制(ΔTGI)计算为平均％Δ抑制：
ΔTGI(平均％Δ抑制)＝((平均(C)-平均(C0))-(平均(T)-平均(T0)))/(平均(C)-平均(C0))*100％
[T：测试组在测量点的肿瘤大小，
T0：测试组的初始肿瘤大小，
C：对照组在测量点的肿瘤大小，和
C0：对照组的初始肿瘤大小]
7A6 VH3/Vk5抗体的肿瘤生长抑制(TGI)为67.9％，显示出与替瑞利尤单抗相比增强的抑制作用(TGI＝55.2％)。
7.2.在CT26结肠癌模型中通过用抗TIGIT抗体和抗PD1抗体联合处理来增强抗肿瘤效力的体内试验
将CT-26肿瘤细胞(CrownBio)体外维持在补充有10％FBS的RPMI1640培养基中，37℃，5％CO2气氛。在接种肿瘤细胞之前，收获处于指数生长期的细胞，并使用细胞计数器进行定量。
将制备的肿瘤细胞溶液(0.1mL PBS溶液中的5×105个肿瘤细胞)皮下注射到BALB/c hPD-1/hTIGIT双敲入小鼠(GemPharmatech Co.，Ltd.)的右后侧，并允许肿瘤生长。肿瘤接种的当天被指定为“第0天”。当平均肿瘤大小(体积)达到70mm3至100mm3时进行随机化。在该试验中总共使用30只小鼠，并将它们随机分成5组(6只小鼠/组)。
接种肿瘤细胞后，测量动物的体重。
使用PBS溶液作为载体(对照组；第1组)，分别以20mg/kg的剂量用7A6 VH3/Vk5和7A6 VH3/Vk5-DLE处理(分别为第3组和第4组)，以5mg/kg的剂量用抗PD1抗体可瑞达(彭布罗利珠单抗；Merck)处理(第4组)，并以20mg/kg和5mg/kg的剂量组合施用7A6 VH3/Vk5和可瑞达5mg/kg(第5组)。
当载体处理组(对照组)的平均肿瘤负荷在第25天达到3000mm3时，实验终止(参见表14)。
表14
BIW：Bi-每周(每周两次)
根据以下等式计算TGI％：
TGI(％)＝100×(1-T/C)
(T和C分别代表试验组(T)和对照组(C)的平均肿瘤体积(或重量)。
结果总结在表15中，并描绘在图21中。
表15
如表15和图21所示，在第25天，7A6 VH3/Vk5处理组(第3组)和可瑞达处理组(第2组)均表现出肿瘤生长减少，TGI(肿瘤生长抑制)值分别为51.43％和55.91％。可瑞达和7A6VH3/Vk5的组合(第5组)显示出最显著的肿瘤形成延迟和抑制作用，TGI为78.98％。在第25天，所有7A6 VH3/Vk5-、可瑞达-和可瑞达+7A6 VH3/Vk5-处理组的肿瘤生长抑制效果在统计学上显著高于对照组(p值＜0.05)。在7A6 VH3/Vk5处理组(1只小鼠)和可瑞达+7A6VH3/Vk5处理组(2只小鼠)中观察到肿瘤完全去除。在任何抗体处理组中没有观察到显著的体重差异。
此外，检测了对肿瘤微环境(TME)中免疫细胞的影响，结果如图22所示。
对于FACS分析，从安乐死小鼠中解剖肿瘤，并使用gentleMACS(带加热器的GentleMACSTM Octo解离仪)和多组织解离试剂盒1(Miltenyi Biotech)解离成单细胞。用以下针对表面标记的荧光标记抗体对细胞进行染色，所述表面标记例如抗小鼠CD45 FITC(Biolegend)、抗小鼠CD3-BUV395(BD)、抗小鼠CD4-BV421(Biolegend)、抗小鼠CD8-PE-eFluor610(eBiosciences)、抗小鼠CD335(eBiosciences)和live/dead-APC-eF780(eBiosciences)。此外，使用固定/透化浓缩和稀释试剂盒(ThermoFisher)固定和透化细胞，然后用抗小鼠Foxp3(eBiosciences)染色。通过流式细胞仪(LSRFortessa X-20，BD)分析细胞，并使用FlowJo数据分析软件分析数据。
如图22所示，联合施用抗TIGIT抗体和抗PD1抗体降低了肿瘤中Treg的频率，结果CD3、CD4和CD8+T细胞增加(图22)。
7.3.抗TIGIT抗体在具有患者来源肿瘤异种移植物(PDX)的人源化肝癌小鼠模型中的效力的体内测定
将来自三个供体(Jackson Laboratory，美国)的脐带血的人CD34+造血干细胞(HSC)移植到免疫缺陷的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)(JacksonLaboratory，美国)用于体内分析。肝胆管癌LIXFC 2479(Charles river)肿瘤细胞获自癌症患者切除后的手术样本。在第1代将肿瘤片段移植到免疫缺陷小鼠中，并作为肿瘤异种移植物进行培养(传代)，直到建立稳定的生长模式。通过连续传代从裸鼠异种移植物中获得肿瘤碎片。从供体小鼠身上解剖后，将肿瘤切成切片(周长为3mm至4mm)，并置于含有10％青霉素/链霉素的PBS中。然后将切片皮下移植到受体小鼠的一侧，这被称为患者来源的肿瘤异种移植物(PDX)模型。
这些动物被分成两组，每组由六只小鼠组成。来自每组的两只小鼠用来自三个供体的每一个的HSC重建，确保开始时相似的中值肿瘤体积(50mm3至150mm3)和重量。随机化日被设定为“第0天”。PBS用作对照(第1组)。第2组中的小鼠用剂量为20mg/kg的7A6VH3/Vk5处理。试验物质通过腹膜内注射每周施用两次，持续四周，监测肿瘤大小，直到第28天实验结束。详细信息如下表16所示：
表16
*基于最近一次体重测量
**供体1+供体2+供体3
BIW：Bi-每周(每周两次)，ROA：施用途径
肿瘤生长抑制(ΔTGI)计算为平均％Δ抑制：
ΔTGI(平均％Δ抑制)＝((平均(C)-平均(C0))-(平均(T)-平均(T0)))/(平均(C)-平均(C0))*100％
[T：测试组测量时肿瘤的大小，
T0：测试组的初始肿瘤大小，
C：对照组测量时肿瘤的大小，
C0：对照组的初始肿瘤大小]
获得的结果(肿瘤大小)显示在图23中。如图23所示，与对照组相比，抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体显著抑制了肿瘤生长。为了评估TGI，在第28天比较抗TIGIT抗体处理组和对照组之间的肿瘤大小。7A6 VH3/Vk5抗体的肿瘤生长抑制(ΔTGI)为76.6％，表明该抗体在肝癌PDX肿瘤模型中具有显著的抗癌作用，该模型被认为比合成的小鼠模型与人类癌症具有更大的生理相关性。
实施例8：抗TIGIT抗体在人PBMC和肿瘤浸润性T细胞中的抗肿瘤效力
8.1.肿瘤微环境中T细胞亚群上的TIGIT表达(TME)
为了测量抗TIGIT抗体在人类肿瘤微环境中的潜在作用，检测了HCC(肝细胞癌)患者和HFE(血色沉着病)供体肝脏中TIGIT的表达。HFE(血色沉着病)被认为是一种肝功能正常且免疫健康的疾病。为了研究T细胞亚群中TIGIT的表达，制备了来自正常供体和HCC癌症患者的肿瘤浸润性淋巴细胞(参见实施例3.1)。对这些细胞进行细胞表面标记(CD3、CD4、CD8、CD127、CD25、TIGIT)染色(CD3、CD4、CD8、CD127和CD25的抗体从Biolegend获得，TIGIT抗体从R&D Systems获得)，并通过流式细胞仪和FlowJo软件进行分析。使用FlowJo软件(BDBiosciences)测量每个T细胞亚群中TIGIT的平均荧光强度(MFI)。
获得的结果显示在图24中。如图24所示，HCC患者肿瘤浸润性T细胞上的TIGIT表达高于正常供体。在HCC患者的肿瘤浸润性T细胞中，与CD4+和CD8+T细胞相比，Treg细胞表达TIGIT的水平最高。这些发现表明Treg细胞可能是抗TIGIT抗体抑制活性的理想靶点。
8.2.肝癌患者T细胞中细胞因子产生
表达TIGIT的免疫细胞会导致癌症患者的功能障碍。测试了抗TIGIT抗体处理恢复或增强HCC患者免疫反应的能力。
为了测量来自T细胞的抗TIGIT抗体介导的细胞因子产生，在存在抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体(10μg/ml)或相同量的参考抗体(抗TIGIT 10A7，22G2)的情况下，将从肝细胞癌(HCC)患者或健康供体获得的人PBMC与抗CD3和抗CD28抗体一起培养。测量细胞内细胞因子产生(参见实施例3.2.2)。
获得的结果显示在图25中。与参考抗体、抗TIGIT抗体10A7(Genentech)和22G2(BMS)相比，用抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体处理增加了来自HCC患者PBMC的CD4+和CD8+T细胞中的细胞因子产生。由于IL-2和IFN-γ是在免疫系统中具有核心功能的细胞因子，增强NK和T细胞的增殖和死亡活性，获得的数据显示了抗TIGIT 7A6抗体处理在HCC患者中的效力。
8.3.抗TIGIT抗体对肺癌患者T细胞的效力
在用抗TIGIT抗体(每种10μg/ml)处理后，测试了来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的人PBMC的免疫细胞中的细胞因子产生(参见实施例3.2.2)。
获得的结果显示在图26中。与参考抗体、抗TIGIT抗体10A7(Genentech)和22G2(BMS)相比，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体将非小细胞肺癌患者PBMC中CD4+和CD8+T细胞的细胞因子产生增加至更高水平。这些结果证实了抗TIGIT 7A6抗体在非小细胞肺癌患者中的效力。
8.4.抗TIGIT抗体对大肠癌患者T细胞的效力
表达TIGIT的免疫细胞在癌症患者中诱导功能损伤，进行了检查以研究用抗TIGIT抗体的处理是否可以恢复或增强结肠直肠癌患者的免疫反应。在用抗TIGIT抗体(每种10μg/ml)处理后，测试了来自结肠直肠癌(CRC)患者的人PBMC的免疫细胞中的细胞因子产生(参见实施例3.2.2)。
获得的结果显示在图27中。与参考抗体、抗TIGIT抗体10A7(Genentech)和22G2(BMS)相比，抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体将结肠直肠癌患者PBMC中CD4+和CD8+T细胞的细胞因子产生增加至更高水平。这些结果表明抗TIGIT 7A6抗体在结肠直肠癌患者中的效力。
实施例9：通过用抗TIGIT Fab片段抑制TIGIT-PVR相互作用来测定T细胞活化
9.1.抗TIGIT Fab对中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞的免疫效应
为了验证抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体对TIGIT/PVR途径的特异性阻断作用，在HEK293细胞中产生抗体的抗TIGIT-Fab片段(7A6_VH3可变区和7A6_VK5可变区之间的二硫键)，并使用固定化金属亲和层析纯化。抗TIGIT Fab片段用于仅展示特异性阻断功能，而没有Fc诱导的效应。
通过抗TIGIT Fab片段与TIGIT蛋白的特异性结合，检测了中枢记忆性T细胞[Tcm](图28a)和效应记忆性T细胞[Tem](图28b)的，这提供了长期有效的抗癌细胞毒性保护。具体地，用抗CD3(0.2μg/ml)(BD Biosciences)和抗CD28抗体(1μg/ml)(BD Biosciences)激活500000个PBMC细胞，然后用抗TIGIT Fab片段(10μg/ml)处理48小时。将Brefeldin A(Sigma)和Monensin(Sigma)加入到每个孔中，达到1/1000的最终浓度，并再孵育4小时。对中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞进行染色。在这方面，用以下抗体在室温下洗涤细胞并染色10分钟：Alive/Dead(ThermoFisher LIVE/DEADTM Fixable Near-IR Dead CellStain Kit，用于633nm或635nm激发)、抗CD3-APC(Biolegend)、抗CD8-PerCP(Biolegend)、抗CD45-RA-Brillant Violet 421(Biolegend)、抗CCR 7-Brilliant Violet 510(Biolegend)。染色后，如下测量中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞中的细胞因子水平。根据制造商的说明，使用Foxp 3/转录因子固定/透化浓缩物和稀释剂试剂盒(ThermoFisher)固定和透化细胞。用针对细胞内IL-2、IFNγ和TNFa(均来自Biolegend)的荧光团缀合抗体对细胞进行染色。通过流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman CouLter)分析细胞，并使用FlowJo软件(BD Biosciences)分析数据。
获得的结果显示在图28a(中枢记忆性T细胞)和图28b(效应记忆性T细胞)中。从结果中可以看出，抗TIGIT-Fab片段诱导Tcm和Tem的活化水平增强，证明抗TIGIT(7A6 VH3/Vk5)抗体介导特异性阻断活性，促进针对癌症的长期免疫反应。
9.2.抗TIGIT Fab片段介导的对A375肿瘤细胞的细胞毒性刺激
A375肿瘤细胞(35k个细胞/孔)用Syto-9染料染色，并在人源化抗TIGIT抗体产生的Fab片段(Fab 7A6 VH0/Vk0，3VH3/Vk5，VH4/Vk4)(各10μg/ml)存在下，与PBMC和CytoStim(1/50)共培养。使用Live-Cell分析系统(Sartorius)对肿瘤细胞进行计数。
结果如图29所示。所有测试的抗TIGIT Fab片段VH0/Vk0、VH3/Vk5和VH4/Vk4阻断了TIGIT-CD155(PVR)相互作用并增加了对A375肿瘤细胞的细胞毒性。这些结果证实了人源化抗TIGIT 7A6抗体有效阻断了TIGIT-CD155(PVR)途径并诱导了增强的免疫功能。
实施例10：抗TIGIT抗体对调节性T细胞和NK细胞的免疫调节作用
10.1.TIGIT在调节性T细胞(Treg)上的高水平表达
对来自健康供体的PBMC的T细胞亚群和TIGIT蛋白的标记进行染色(抗CD3-APC(Biolegend)、Alive/Dead(ThermoFisher LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell StainKit)、抗CD8-PerCP(Biolegend)、抗CD4-Alexa Fluor700(Biolegend)、抗CD127-PE(Biolegend)、抗CD25-亮紫421(Biolegend)和抗TIGIT-PeCy7(Biolegend))。染色后，将细胞离心并通过流式细胞仪进行分析。
结果如图30所示。与非Treg CD4+和CD8+T细胞相比，TIGIT在调节性T细胞(Treg)中表达水平更高。
10.2.抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体的Treg耗竭活性
在存在抗CD3抗体(BD Biosciences)和抗CD28抗体(BD Biosciences)的情况下，将抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体(10μg/ml)与人PBMC共培养。抗TIGIT 10A7(Genentech)用作对照。通过流式细胞仪评估Treg、CD4+T和CD8+T细胞的频率。
获得的结果描绘在图31a(Treg)、31b(CD4+T细胞)、31c(CD8+T细胞)和31d中。抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体特异性靶向Treg细胞，而不改变CD4+和CD8+T细胞的比例。此外，与对照抗TIGIT抗体(10A7)相比，该抗TIGIT抗体在更高水平上耗竭了Treg(图31d)。
10.3.抗TIGIT 7A6 VH3/Vk5抗体的NK细胞介导的Treg耗竭活性
Treg和NK细胞在存在或不存在抗TIGIT抗体7A6 VH3/Vk5或VH3/Vk5-DLE(各10μg/ml)的情况下共培养过夜。第二天，通过流式细胞仪对剩余的Treg和NK细胞进行计数。根据制造商的说明，分别使用Miltenyi试剂盒(CD4+CD25+CD127-dim reg T细胞分离试剂盒II，目录号130-094-775)和Miltenyi试剂盒(NK细胞分离试剂盒，目录号130-092-657)从人PBMC中分离Treg细胞和NK细胞。
获得的结果显示在图32中。用抗TIGIT 7A6VH3/Vk5抗体和VH3/Vk5-DLE抗体处理后，Treg细胞的数量减少，而NK细胞的数量保持不变。这些结果表明，测试的抗TIGIT抗体通过抗体依赖性细胞毒性和NK细胞有效地耗竭Treg。
此外，还进行了检查，以了解Fc受体结合是否是抗TIGIT抗体消除NK细胞介导的Treg所必需的。
Treg和NK细胞在抗TIGIT抗体7A6 VH3/Vk5-DLE(10μg/ml)存在下共培养过夜。根据制造商的说明，分别使用Miltenyi试剂盒(CD4+CD25+CD127-dim reg T细胞分离试剂盒II，目录号130-094-775)和Miltenyi试剂盒(NK细胞分离试剂盒，目录号130-092-657)从人PBMC中分离Treg细胞和NK细胞。使用Fc封闭抗体CD16和Human TruStain FcXTM(BioLegend)封闭Fc受体。第二天，通过流式细胞仪对剩余的Treg和NK细胞进行计数。
获得的结果显示在图33中。抗TIGIT抗体显著减少Treg，当FcR被封闭抗体封闭时，这种减少被抑制。这些结果表明Fc受体结合是抗TIGIT抗体耗竭NK细胞介导的Treg所必需的。
10.4.Fc依赖性T细胞活化
在有或没有预先封闭FcgRIIIA的情况下，测量人T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)中的细胞因子产生。将50万PBMC细胞与FcgRIIIA抗体(Biolegend目录号422302)在室温下预孵育5分钟。然后在存在抗TIGIT 7A6VH3/Vk5(10μg/ml)或同型对照抗体(10μg/ml)的情况下，用0.2μg/ml抗CD3(BD Biosciences)和1μg/ml抗CD28(BD Biosciences)单克隆抗体培养PBMC细胞。培养后，细胞在4℃下以400xg离心10分钟，并测量T细胞中的细胞内细胞因子浓度。在这方面，用ZombieAqua可固定死细胞染料溶液(Biolegend)对细胞进行染色，并用针对CD4+和CD8+T细胞的CD3、CD4和CD8+细胞表面标记的荧光团缀合抗体(Biolegend)在冰上标记30分钟。根据制造商的说明，使用eBioscienceTM Foxp3/转录因子固定/透化浓缩和稀释试剂盒(ThermoFisher)固定和透化细胞。用针对细胞内IL-2(Biolegend)和IFNγ(Biolegend)的荧光团缀合抗体对细胞进行染色。然后使用流式细胞仪(CytoFLEX，BeckmanCouLter)分析细胞，并使用FlowJo软件(BD Biosciences)分析数据。
获得的结果描绘在图34a(CD4+T细胞)和34b(CD8+T细胞)中。FcgRIIIA的封闭显著减少了CD4+和CD8+T细胞中的细胞因子产生，这表明抗TIGIT抗体需要FcgR相互作用来激活T细胞和耗竭Treg。抗TIGIT抗体通过FcgR的参与增强了T细胞反应。
统计
使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software，美国)通过普通的单向ANOVA、配对和非配对t检验来评估统计显著性。数据以平均值±SEM表示。****p＜0.0001、***p＜0.001、**p＜0.01、*p＜0.05、ns＝不显著，如图示所述。

Claims (14)

1.一种抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗TIGIT抗体包含：
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
2.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗TIGIT抗体包含：
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
3.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗TIGIT抗体包含：
包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQID NO：14的氨基酸序列的重链可变区，和
包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗TIGIT抗体或其抗原结合片段结合选自TIGIT蛋白氨基酸序列中51位至70位氨基酸的至少一个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗TIGIT抗体是动物抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
6.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段是抗TIGIT抗体的scFv、scFv-Fc、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2。
7.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中癌症是实体癌或血液癌。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含靶向PD-1、PD-L1或两者的药物。
10.一种用于免疫增强的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中组合物还包含靶向PD-1、PD-L1或两者的药物。
12.一种用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中免疫相关疾病是传染性疾病、炎症性疾病或自身免疫性疾病。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其还包含靶向PD-1、PD-L1或两者的药物。
CN202280046083.0A 2021-05-10 2022-05-10 抗tigit抗体及其用途 Pending CN117916263A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0060014 2021-05-10
KR20210060014 2021-05-10
PCT/KR2022/006695 WO2022240159A1 (ko) 2021-05-10 2022-05-10 항-tigit 항체 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117916263A true CN117916263A (zh) 2024-04-19

Family

ID=84028654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280046083.0A Pending CN117916263A (zh) 2021-05-10 2022-05-10 抗tigit抗体及其用途

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4339208A1 (zh)
KR (2) KR102500845B1 (zh)
CN (1) CN117916263A (zh)
AU (1) AU2022272586A1 (zh)
BR (1) BR112023023453A8 (zh)
CA (1) CA3219603A1 (zh)
WO (1) WO2022240159A1 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3664B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة لـ tigit
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
TWI715587B (zh) * 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
KR20200087283A (ko) 2015-09-25 2020-07-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 이의 이용 방법
MX2018010485A (es) 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).
CA3082280A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
TW202400654A (zh) * 2017-12-30 2024-01-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗tigit抗體及其作為治療和診斷的用途
JP2021532058A (ja) * 2018-07-25 2021-11-25 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及びその使用
KR102332847B1 (ko) * 2019-06-13 2021-12-01 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220153515A (ko) 2022-11-18
BR112023023453A8 (pt) 2024-02-15
AU2022272586A1 (en) 2024-01-04
EP4339208A1 (en) 2024-03-20
KR20230024323A (ko) 2023-02-20
KR102500845B1 (ko) 2023-02-17
WO2022240159A1 (ko) 2022-11-17
CA3219603A1 (en) 2022-11-17
BR112023023453A2 (pt) 2024-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2012011234A (es) Anticuerpos contra csf-1r.
CN111051344B (zh) Cd38调节抗体
KR20190099254A (ko) 항-뉴로필린 항원-결합 단백질 및 그의 사용 방법
CN113226367A (zh) 包括抗nrp2抗体的组合物和方法
CN110856446A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
CN114746120A (zh) 包含抗nrp2抗体的组合物和方法
WO2021219048A1 (zh) 一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用
JP7237950B2 (ja) Ｃｄ３８調節抗体
KR20190095298A (ko) 항-gitr 항원-결합 단백질 및 그의 사용 방법
TW201920282A (zh) 抗egfr和pd-1的雙特異性抗體
US20230287146A1 (en) BISPECIFIC GPC3xCD28 AND GPC3xCD3 ANTIBODIES AND THEIR COMBINATION FOR TARGETED KILLING OF GPC3 POSITIVE MALIGNANT CELLS
CN114667296B (zh) 一种双特异性抗体及其用途
CN117751143A (zh) 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用
WO2021052465A1 (zh) 抗人cd38抗体及其应用
CA3186256A1 (en) Anti-lilrb1 antibody and uses thereof
CN117916263A (zh) 抗tigit抗体及其用途
KR102475255B1 (ko) 항-gitr 항체 및 이의 용도
WO2024078558A1 (zh) 抗cd100抗体及其用途
JP2024519331A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ抗体およびその用途
WO2023020507A1 (zh) 一种抗b7-h4抗体及其制备方法和应用
KR20230168598A (ko) 항-tigit 항체 및 이의 용도
CN114341170A (zh) 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用
KR20200019669A (ko) Cd38 조정 항체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination