WO2022240159A1 - 항-tigit 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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tigit
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antigen
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강유회
조홍석
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Cancer immunotherapy is a method of treating cancer using the immune system in the body, and is called the fourth treatment for cancer following chemotherapy, surgery, and radiation therapy. Cancer immunotherapy requires mechanisms that activate the immune system to increase recognition and response to tumor cells. Activation of the immune system is a complex mechanism involving the functions of various cells, such as antigen-presenting cells important for initiation of antigen-specific responses and effector cells responsible for destroying tumor cells.
  • effector cells include cytotoxic T cells.
  • TIGIT T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain
  • WUCAM WUCAM
  • VSIG9 Vstm3
  • NK CD8+
  • CD4+ regulatory T cells
  • Reg regulatory T cells
  • TIGIT is a transmembrane protein comprising an intracellular ITIM domain, a transmembrane domain, and an immunoglobulin variable domain.
  • TIGIT expression is increased in disease environments such as tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and infection.
  • TIGIT expression can be a marker for exhausted T cells with lower effector functions compared to TIGIT-negative cells.
  • Treg cells expressing "TIGIT” show enhanced immunosuppressive activity compared to the "TIGIT” negative Treg population.
  • drugs that antagonize TIGIT e.g., antagonistic anti-TIGIT antibodies, etc.
  • TIGIT induce activation of the immune system and enhance immune responses in disease states such as cancer, thereby having beneficial effects in disease treatment.
  • Anti-TIGIT antibodies that bind to TIGIT and their medicinal uses are provided.
  • One example provides an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIGIT.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • Heavy chain complementarity determining regions Complementarity Determining Regions; CDRs
  • heavy chain variable regions comprising the heavy chain complementarity determining regions
  • Light chain complementarity-determining region comprising a light chain or light chain variable region comprising the light chain complementarity-determining region
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof in one embodiment, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, or 14, and
  • Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, or 20
  • Another embodiment provides an immune enhancer or a pharmaceutical composition for immunity enhancement comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating immune-related diseases comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides an anti-cancer agent or a pharmaceutical composition for preventing and/or treating cancer comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides an immune enhancement method comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of immunity enhancement.
  • Another example is a method for preventing and/or treating immune-related diseases comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of immune-related diseases. to provide.
  • Another embodiment provides a method for preventing and/or treating cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of cancer.
  • Another embodiment provides use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for enhancing immunity or preparing an immune enhancer.
  • Another embodiment provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for preventing and/or treating immune-related diseases or preparing a drug for preventing and/or treating immune-related diseases.
  • Another embodiment provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of cancer or the manufacture of a drug for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof targets another immune checkpoint protein, such as PD-1, PD-L1, or both. It can be used in combination with drugs (antagonists).
  • the drug that can be used in combination may be an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or both, but is not limited thereto.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of an anti-TIGIT antibody.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of an anti-TIGIT antibody.
  • nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-TIGIT antibody and a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-TIGIT antibody together in one vector.
  • the recombinant vector may be an expression vector for expressing the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell containing the recombinant vector.
  • Another embodiment provides a method for producing an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof comprising expressing the nucleic acid molecule in a host cell.
  • Expressing the nucleic acid molecule in a host cell may include culturing a cell containing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same. The method may further include isolating and/or purifying the antibody from the medium after the step of expressing.
  • anti-TIGIT antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to TIGIT and their medicinal uses are provided.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof has a function of activating immunity by blocking the action of TIGIT (e.g., enhancing effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.), and has various immune activating agents and/or or as an immunotherapeutic agent.
  • One example provides an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIGIT.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR-H1);
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR-H2);
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR-H3);
  • a polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR-L2), and
  • the polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • the complementarity determining region is determined based on the CDR definition according to the kabat system.
  • CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 six CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3) that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein ) are summarized in Table 1 below:
  • CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 refer to heavy chain complementarity determining regions, and CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 refer to light chain complementarity determining regions
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof in embodiments, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 1, CDR-H2 of SEQ ID NO: 2, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 3, and
  • a light chain variable region comprising CDR-L1 of SEQ ID NO: 4 (eg, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8), CDR-L2 of SEQ ID NO: 5, and CDR-L3 of SEQ ID NO: 6
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof More specifically, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, or 14, and
  • Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, or 20
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof in one example, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the heavy chain variable region and/or light chain variable region may further include an appropriate signal sequence at the N-terminus.
  • amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein are exemplified in Table 2 below:
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein is a TIGIT protein, such as a human TIGIT protein (NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB / SwissProt Q495A1-1) amino acid residues 51-70 region ( TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 31), but is not limited thereto.
  • TIGIT protein such as a human TIGIT protein (NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB / SwissProt Q495A1-1) amino acid residues 51-70 region ( TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 31), but is not limited thereto.
  • the term "antibody” refers to a protein that specifically binds to a specific antigen, and may be a protein produced by stimulation of an antigen in the immune system or a protein produced chemically or recombinantly, The kind is not particularly limited.
  • the antibody may be non-naturally occurring, such as recombinantly or synthetically produced.
  • the antibody may be an animal antibody (eg, a mouse antibody, etc.), a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • all regions other than the heavy chain CDR and light chain CDR regions, or the heavy chain variable region and light chain variable region defined above are immunoglobulins of all subtypes (eg, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4), IgM, etc.), e.g., the framework regions of immunoglobulins of any of the above subtypes, and/or the light chain constant region and/or the heavy chain constant region. It may be from the realm.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may be a human IgG type antibody, such as an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 type antibody, but is not limited thereto.
  • a complete antibody (eg, IgG type) has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the antibody constant region is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, subclasses It has gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain is of the kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) type.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may include an IgG constant region as a heavy chain constant region and a kappa constant region as a light chain constant region, but is not limited thereto.
  • the constant region of the IgG may be wild type.
  • the constant region of the IgG, based on human IgG1, is S240D (the 240th amino acid S is substituted with D, the following amino acid mutations are expressed in the same way)
  • A331L, I333E, N298A, S299A, E334A , K335A, L235A, L236A and P330G may be a variant including one or more mutations selected from the group consisting of, for example, may be a variant including the following mutations:
  • variable chain refers to a variable region domain V H comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a hinge with three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 ( It is interpreted as meaning including both a full-length heavy chain and fragments thereof including a hinge.
  • light chain refers to both a full-length light chain comprising a variable region domain V L and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen, and fragments thereof. be interpreted in a sense that includes
  • CDR complementarity determining region
  • CDRs complementarity determining regions
  • an antibody may be understood to include an antigen-binding fragment of an antibody having antigen-binding ability, unless otherwise specified.
  • antigen-binding fragment refers to any type of polypeptide that contains a portion to which an antigen can bind (eg, the six CDRs defined herein).
  • an antigen eg, the six CDRs defined herein.
  • it may be an antibody scFv, scFv-Fc, (scFv) 2 , Fab, Fab' or F(ab') 2 , but is not limited thereto.
  • Fab has a structure having light and heavy chain variable regions, light chain constant region, and heavy chain first constant region (C H1 ) and has one antigen binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • F(ab') 2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombination technique for producing an Fv fragment is widely known in the art.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond
  • the heavy chain variable region and the short chain variable region are generally shared through a peptide linker. They are linked by bonds or directly linked at the C-terminus, so that they can form a dimer-like structure like double-chain Fv.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (eg, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.
  • a proteolytic enzyme eg, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin
  • flankinge region is a region included in the heavy chain of an antibody, and is present between the CH1 and CH2 regions, and refers to a region that functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody.
  • An antibody provided herein may be a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods well known in the art. For example, it can be manufactured using a phage display technique. Alternatively, the antibody may be prepared as a monoclonal antibody derived from an animal (eg, mouse) by a conventional method.
  • individual monoclonal antibodies may be screened based on their ability to bind to the receptor-binding domain of TIGIT using a typical enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) format.
  • Inhibitory activity can be assayed through functional assays such as competitive ELISA (competitive ELISA) or cell-based assays for assaying molecular interactions of the conjugates.
  • each affinity (Kd values) for the receptor-binding domain of TIGIT can be assayed for monoclonal antibody members selected based on strong inhibitory activity.
  • the final selected antibodies may be prepared and used as humanized antibodies as well as antibodies in which the remaining parts except for the antigen-binding site are made into human immunoglobulin antibodies.
  • Methods for preparing humanized antibodies are well known in the art.
  • the antigen-binding fragment of the anti-TIGIT antibody refers to a fragment derived from the anti-TIGIT antibody and retaining binding ability to the antigen (TIGIT), including six CDRs of the anti-TIGIT antibody.
  • Any polypeptide that does, for example scFv, scFv-Fc, scFv-Ck (kappa constant region), scFv-C ⁇ (lambda constant region), (scFv) 2 , Fab, Fab' or F (ab') 2 days It may, but is not limited thereto.
  • the antigen-binding fragment is a scFv, or a fusion polypeptide (scFv-Fc) in which an scFv is fused to the Fc region of an immunoglobulin (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.) or a constant region of a light chain (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.) kappa or lambda) and fused polypeptides (scFv-Ck or scFv-C ⁇ ), but are not limited thereto.
  • an immunoglobulin eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.
  • a constant region of a light chain eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.
  • fused polypeptides scFv-Ck or scFv-C ⁇
  • an antibody e.g., CDR, variable region, or heavy/light chain, antigen-binding fragment, etc.
  • “comprises, consists of, or includes a specific amino acid sequence” means that the amino acid sequence is essentially If included, and insignificant mutations (eg, substitution, deletion, and/or addition of amino acid residues) that do not significantly affect antibody activity (eg, antigen affinity, pharmacological activity, etc.) are introduced into the amino acid sequence. It could mean anything.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has a binding affinity (K D ) for TIGIT (eg, human TIGIT), for example, measured by surface plasmon resonance (SPR) Based on the case, it may be 10 mM or less, 5 mM or less, 1 mM or less, 0.5 mM or less, 0.2 mM or less, 0.1 mM or less, 0.05 mM or less, 0.01 mM or less, 0.005 mM or less, or 0.001 mM or less, for example , 0.0001nM to 10mM, 0.0005nM to 10mM, 0.001nM to 10mM, 0.005nM to 10mM, 0.01nM to 10mM, 0.05nM to 10mM, 0.1nM to 10mM, 0.5nM to 10mM, 0.5nM to 10mM, 1M0.
  • K D binding affinity for TIGIT
  • SPR surface plasmon
  • a heavy chain complementarity determining region (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, or a combination thereof), a light chain complementarity determining region (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3) of the anti-TIGIT antibody described above , or combinations thereof), or combinations thereof;
  • a polypeptide molecule comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof is provided.
  • the polypeptide molecule can be used as a precursor of an antibody to produce an antibody, as well as a protein scaffold having a structure similar to that of an antibody (e.g., peptibody, nanobody, etc.), a component of a bispecific antibody, or a multispecific antibody. (eg, CDRs or variable regions).
  • peptide + antibody is a fusion protein in which all or part of a constant region such as the Fc portion of a peptide and an antibody is fused, and refers to a protein having a skeleton and function similar to that of an antibody.
  • a constant region such as the Fc portion of a peptide and an antibody is fused
  • One or more of the peptides previously described herein may serve as antigen binding sites (heavy and/or light chain CDRs or variable regions).
  • nanobody also called a single-domain antibody, refers to an antibody fragment comprising a single variable domain of an antibody in the form of a monomer, and, similar to a fully structured antibody, selectively binds to a specific antigen.
  • the molecular weight of nanobodies is usually about 12 kDa to about 15 kDa, which is very small compared to the typical molecular weight of a complete antibody (containing two heavy chains and two light chains) (about 150 kDa to about 160 kDa), and in some cases is smaller than the Fab fragment or the scFv fragment.
  • multibinding antibody (which includes double binding antibodies) is intended to refer to an antibody that recognizes and/or binds two or more different antigens, or recognizes and/or binds to different sites on the same antigen.
  • the antigen-binding site of one of the multi-binding antibodies may include a polypeptide, antibody, or antigen-binding fragment that binds to TIGIT described above.
  • a polypeptide, antibody, or antigen-binding fragment that binds to TIGIT provided herein may be used in the form of a conjugate conjugated with at least one selected from the group consisting of useful polymers and markers.
  • Such useful polymers may be polymers other than proteins, for example, that increase the half-life of polypeptides, antibodies, and/or antigen-binding fragments in vivo, and include polyethylene glycol (PEG) (e.g., 2 kDa, 5 PEG having a molecular weight of kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa or 40 kDa), dextran, and at least one hydrophilic polymer selected from the group consisting of monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), etc. , but not limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • mPEG monomethoxypolyethylene glycol
  • the labeling substance is a rare earth chelating agent, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, isothiocyanate, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanine, o-phthalaldehyde, fluorescamine, 152Eu , dansyl, umbelliferon, luciferin, luminal label, isoluminal label, aromatic acridinium ester label, imidazole label, acridinium salt label, oxalate ester label, aequorin label, 2,3- It may be at least one fluorescent or chemiluminescent small molecule compound (chemical) selected from the group consisting of dihydrophthalazinedione, biotin/avidin, spin label, stable free radical, etc., radioactive isotope, etc., but is not limited thereto.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof blocks the action of TIGIT (e.g., interaction between TIGIT and its ligand, CD155 (PVR), etc.) to activate immunity (e.g., enhance effector T cell function, It has the function of controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.). Therefore, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof can be usefully applied to immunity enhancement, prevention and/or treatment of immune-related diseases, and particularly prevention and/or treatment of cancer.
  • TIGIT e.g., interaction between TIGIT and its ligand, CD155 (PVR), etc.
  • Another embodiment provides an immune enhancer or a pharmaceutical composition for immunity enhancement comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating immune-related diseases comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides an anti-cancer agent or a pharmaceutical composition for preventing and/or treating cancer comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment provides an immune enhancement method comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of immunity enhancement.
  • the method for enhancing immunity may further include, prior to the administering step, a step of identifying a subject in need of immune enhancement.
  • Another example is a method for preventing and/or treating immune-related diseases comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of immune-related diseases. to provide.
  • the method for preventing and/or treating an immune-related disease may further include identifying a subject in need of preventing and/or treating an immune-related disease prior to the administering.
  • Another embodiment provides a method for preventing and/or treating cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of cancer.
  • the method for preventing and/or treating cancer may further include identifying a subject in need of preventing and/or treating cancer before the administering step.
  • Another embodiment provides use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for enhancing immunity or preparing an immune enhancer.
  • Another embodiment provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for preventing and/or treating immune-related diseases or preparing a drug for preventing and/or treating immune-related diseases.
  • Another embodiment provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of cancer or the manufacture of a drug for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is a drug (antagonist) that targets another immune checkpoint protein, such as PD-1, PD-L1, or both.
  • the pharmaceutical composition may further include a drug targeting PD-1, PD-L1, or both, in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the method may further include administering a drug targeting PD-1, PD-L1, or both, in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the drug that can be used in combination may be an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or both, but is not limited thereto.
  • the anti-PD-1 antibody may be one or more selected from the group consisting of pembrolizumab, nivolumab, etc., but is not limited thereto.
  • immune enhancement may mean inducing an initial immune response to an antigen or increasing an existing immune response, and is equivalent to terms such as immunostimulation, immune enhancement, and immune activation. compatible in meaning.
  • immunity enhancement is to enhance (activation) and/or proliferation of immune cell (effector T cells, such as cytotoxic T cells; CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.) function, regulatory T cell (Treg) activity It may mean one or more selected from the group consisting of suppression and/or depletion, increased production and/or secretion of immune proteins (eg, cytokines, etc.), but is not limited thereto.
  • immune-related disease encompasses all diseases caused by disorders and/or insufficient activity of the immune system, and includes, for example, cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, and the like. It may be one or more selected from, but is not limited thereto.
  • the cancer may be solid cancer or hematological cancer, but is not limited to, squamous cell carcinoma, lung cancer (e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, etc.), peritoneal cancer, skin cancer, melanoma (e.g.
  • rectal cancer esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, liver cancer, cholangiocarcinoma, gastric cancer, pancreatic cancer , glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer (eg, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), endometrial cancer, uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, head and neck cancer, brain cancer, It may be one or more selected from the group consisting of osteosarcoma and the like.
  • the preventive and/or therapeutic effect of cancer is the effect of removing (killing) cancer cells, inhibiting the occurrence and/or growth of cancer cells, and preventing cancer due to migration, invasion, metastasis, and the like. Including the effect of suppressing deterioration, etc.
  • infectious disease autoimmune disease, and inflammatory disease are the above-described immune enhancement (e.g., immune cell (effector T cell, e.g., cytotoxic T cell; CD3+ T cell, CD4+ T cell, CD8+ T cell, etc.) function enhancement (activation) and/or proliferation, suppression and/or depletion of regulatory T cells (Treg), and increased production and/or secretion of immune proteins (e.g., cytokines (IL-2, IFN-gamma, etc.)) It may be selected from all infectious diseases, autoimmune diseases, and inflammatory diseases that can be treated, alleviated, and/or prevented.
  • immune cell effector T cell, e.g., cytotoxic T cell; CD3+ T cell, CD4+ T cell, CD8+ T cell, etc.
  • function enhancement activation
  • proliferation suppression and/or depletion of regulatory T cells (Treg)
  • Reg regulatory T cells
  • immune proteins e.g., cytokines (IL-2, IFN-
  • infectious disease is a generic term for diseases caused by pathogens such as viruses, bacteria, fungi, and parasites propagating and invading an organism (eg, animals including humans), and viruses, bacteria, and fungi. It may be an infection of one or more pathogens selected from the group consisting of , parasites, etc., or a disease (infectious disease) caused by the infection.
  • pathogens such as viruses, bacteria, fungi, and parasites propagating and invading an organism (eg, animals including humans), and viruses, bacteria, and fungi. It may be an infection of one or more pathogens selected from the group consisting of , parasites, etc., or a disease (infectious disease) caused by the infection.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, Crohn's disease, ulcerative colitis, Behçet's syndrome, lupus, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, scleroderma, hypothyroidism, hyperthyroidism, psoriasis, vitiligo, multiple sclerosis, autoimmune It may be selected from the group consisting of hepatitis, autoimmune nephritis, autoimmune pancreatitis, autoimmune encephalitis, cytokine storm, etc., but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease refers to inflammation (eg, chronic inflammation or acute inflammation) or diseases caused by inflammation, for example, heart inflammation (eg, coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, pericarditis, myocarditis, etc.), blood vessels Inflammation (e.g. atherosclerosis, vasculitis, disseminated intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), anemia, etc.), upper respiratory tract inflammation (e.g.
  • heart inflammation eg, coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, pericarditis, myocarditis, etc.
  • blood vessels Inflammation e.g. atherosclerosis, vasculitis, disseminated intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP
  • bronchitis bronchiectasis
  • asthma chronic pulmonary active pulmonary disease
  • COPD chronic pulmonary active pulmonary disease
  • pneumonia interstitial lung disease
  • tuberculosis etc.
  • upper gastrointestinal tract inflammation e.g.
  • Inflammation of the lower gastrointestinal tract eg, enteritis, ulcerative colitis, Crohn's disease, celiac disease, diverticulitis, irritable bowel syndrome, appendicitis, perianal fistula, etc.
  • inflammation of the liver, biliary tract and/or pancreas eg, enteritis, ulcerative colitis, etc.
  • kidney (upper urinary tract) inflammation eg, pyelonephritis, glomerulonephritis, urinary tract infection, etc.
  • lower urinary tract inflammation eg, urinary tract infection, ureteritis, urethritis
  • cystitis eg, prostatitis/chronic pelvic pain syndrome, etc.
  • thyroid and/or parathyroid gland inflammation eg, thyroiditis, parathyroiditis, etc.
  • neuritis complex regional pain syndrome, Guillain-Barré syndrome, etc.
  • eye inflammation e.g., stye, uveitis, conjunctivitis, etc.
  • ear inflammation e.g., otitis media, mastoiditis, etc.
  • oral inflammation e.g., stomatitis, periodontitis, gingivitis, etc.
  • systemic inflammation e.g., systemic inflammatory response syndrome (sepsis, etc.)
  • metabolic syndrome-related diseases etc.
  • peritonitis reperfusion injury, transplant rejection, hypersensitivity reactions, etc. It may be more than one, but is not limited thereto.
  • Anti-TIGIT antibodies, antigen-binding fragments thereof, and/or pharmaceutical compositions provided herein may be administered to any animal or cell, for example, primates such as humans and monkeys, rodents such as rats, mice, and the like. It may be an animal selected from mammals, including the like, or a cell, tissue, body fluid (eg, serum) derived from (isolated) the animal, or a culture thereof, for example, a human or a cell, tissue isolated from a human, It may be a bodily fluid (eg serum).
  • body fluid eg, serum
  • the pharmaceutical composition in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, may further include a pharmaceutically acceptable carrier, which is commonly used in the formulation of protein drugs, such as lactose , Dextrose, Sucrose, Sorbitol, Mannitol, Starch, Gum Acacia, Calcium Phosphate, Alginate, Gelatin, Calcium Silicate, Microcrystalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidone, Cellulose, Water, Syrup, Methyl Cellulose, Methylhydroxy It may be at least one selected from the group consisting of benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutically acceptable carrier which is commonly used in the formulation of protein drugs, such as lactose , Dextrose, Sucrose, Sorbitol, Mannitol, Starch, Gum Acacia, Calcium Phosphate, Alginate
  • the pharmaceutical composition may further include at least one selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, which are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • Administration of the anti-TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof and/or pharmaceutical composition may be via an oral or parenteral route.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. may be administered.
  • oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the anti-TIGIT antibody, its antigen-binding fragment and/or pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, injections, etc. It may be formulated in a form, and may additionally include a dispersing agent or a stabilizer for formulation.
  • the content of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, which is an active ingredient in the pharmaceutical composition, depends on the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, diet, administration time, administration interval, administration route, excretion rate, and the like. It can be variously prescribed by factors such as response sensitivity.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition is 0.00001 to 1000 mg/kg, 0.00001 to 500 mg/kg, 0.00001 to 100 mg/kg, 0.00001 to 50 mg based on the active ingredient (anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof).
  • the daily dose may be formulated as one formulation in unit dose form, formulated in appropriate portions, or prepared by placing it in a multi-dose container.
  • a pharmaceutically effective amount refers to an amount of an active ingredient capable of exhibiting a desired pharmacological activity of an active ingredient, and may be within the above-described dosage range.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of an anti-TIGIT antibody.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of an anti-TIGIT antibody.
  • nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-TIGIT antibody and a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-TIGIT antibody together in one vector.
  • the recombinant vector may be an expression vector for expressing the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell containing the recombinant vector.
  • vector refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14 , pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phages (eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).
  • the nucleic acid molecule may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • Such regulatory sequences may be "operably linked” to regulate the transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector conventional ones used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms may be used.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host.
  • a prokaryotic cell when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.), a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence.
  • the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication and the BBV origin of replication, etc. It is not limited.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallotionine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV can be used, and usually have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell any host cell known in the art can be used as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector stably, and prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109 and E. coli.
  • Bacillus strains such as BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Sera Enterobacteriaceae and strains such as Tia marcessons and various Pseudomonas species, etc., in the case of transformation into eukaryotic cells, as host cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2/0 , CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO S, CHO DXB11, CHO GS-KO, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines, etc. It may be, but is not limited thereto.
  • a transfer method widely known in the art may be used.
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a microinjection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, Liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto.
  • the method for selecting the transformed host cell can be easily performed according to a method widely known in the art using a phenotype expressed by a selection marker.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another embodiment provides a method for producing an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof comprising expressing the nucleic acid molecule in a host cell.
  • Expressing the nucleic acid molecule in a host cell may include culturing a cell containing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same.
  • the preparation method may further include isolating and/or purifying the antibody or antigen-binding fragment from the culture medium.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has a function of activating immunity by blocking the action of TIGIT (e.g., enhancing effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.), and has various It can be applied as an immune activator and/or immunotherapeutic agent.
  • 1 is a graph showing the results of flow cytometry analysis of an anti-TIGIT antibody (7A6) according to an embodiment.
  • Figure 2 shows the results of sequence alignment of chimeric and humanized antibodies according to one embodiment.
  • Figure 3a shows the epitope mapping results of the anti-TIGIT antibody according to an embodiment
  • Figure 3b shows the epitope position on the tertiary structure of the TIGIT protein.
  • FIG. 4 is a graph showing the degree of binding of anti-TIGIT antibodies to TIGIT in human primary T cells according to one embodiment.
  • FIG. 5 is a graph showing the TIGIT-PVR blocking effect of an anti-TIGIT antibody according to an embodiment.
  • FIG. 6 is a graph showing the effects of anti-TIGIT antibodies on cytokine (IL-2 and IFN-gamma) production/secretion in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) according to one embodiment.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Figures 7a and 7b are graphs showing the cytokine production/secretion effect of anti-TIGIT antibodies in T cells according to one embodiment, 7a shows the results in CD4+ T cells and 7b shows the results in CD8+ T cells, respectively. show
  • 8a to 8d are graphs showing the cytokine production/secretion effect of anti-TIGIT antibodies in T cells according to one embodiment, 8a is IL-2 concentration in CD4+ T cells, 8b is IFN in CD4+ T cells -gamma concentration, 8c shows IL-2 concentration in CD8+ T cells, and 8d shows IFN-gamma concentration in CD8+ T cells, respectively.
  • 9a to 9d are graphs showing the effect of cytokine production/secretion in T cells according to the concentration of anti-TIGIT antibody according to one embodiment, 9a is IL-2 concentration in CD4+ T cells, 9b is CD4+ T cells IFN-gamma concentration in , 9c shows IL-2 concentration in CD8+ T cells, and 9d shows IFN-gamma concentration in CD8+ T cells, respectively.
  • Figures 10a and 10b are graphs showing T cell proliferation effects of anti-TIGIT antibodies in human PBMC according to one embodiment, 10a shows CFSE assay results and 10b shows Ki67 assay results, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the T cell proliferation effect of an anti-TIGIT antibody according to an embodiment in the presence of Treg cells.
  • Figure 12 is a graph showing the results of analyzing the TIGIT-PVR / PD-1-PD-L1 complex blocking effect according to the combined use of an anti-TIGIT antibody and an anti-PD1 antibody according to one embodiment by cell-based NFAT reporter response bioassay to be.
  • 13a and 13b are graphs showing the combined blocking effect of TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 according to the combined use of an anti-TIGIT antibody and an anti-PD1 antibody according to one embodiment compared to the case of combined use with a comparative antibody.
  • 13a is the result of combination with pembrolizumab as an anti-PD1 antibody
  • 13b is the result of combination with nivolumab.
  • 14a and 14b are graphs showing the cytokine production results of human T cells when an anti-TIGIT antibody is used alone or in combination with an anti-PD1 antibody according to one embodiment, 14a is a result in CD4+ cells, 14b is a CD8+ Results in cells are shown respectively.
  • 15 is a graph showing the expression level of CD155, a ligand of TIGIT, in A375 and SK-OV3 tumor cell lines.
  • 16 is a graph showing cytotoxicity (cell death rate) of an anti-TIGIT antibody against A375 tumor (melanoma) cell line according to one embodiment.
  • 17a and 17b are graphs showing cytotoxicity (cell death rate) of anti-TIGIT antibodies against SKOV-3 tumor (ovarian cancer) cell lines according to one embodiment.
  • FIG. 18 is a graph showing cytotoxicity (cell death rate) of an anti-TIGIT antibody against SKOV-3 tumor (ovarian cancer) cell line according to one embodiment.
  • 19 is a graph showing cytotoxicity (cell death rate) to the SKOV-3 tumor (ovarian cancer) cell line when an anti-TIGIT antibody was co-cultured with NK cells according to an embodiment.
  • 20 is a graph showing the in vivo antitumor effect of an anti-TIGIT antibody on colon cancer according to an embodiment.
  • 21 is a graph showing the in vivo anti-tumor effect on colon cancer when an anti-TIGIT antibody and an anti-PD1 antibody are used in combination according to one embodiment, compared to when treated alone.
  • TEE 22 shows the results of testing the effect on immune cells in a tumor microenvironment (TME) according to the combined use of an anti-TIGIT antibody and an anti-PD1 antibody according to an embodiment.
  • FIG. 23 is a graph showing the in vivo antitumor effect of an anti-TIGIT antibody on liver cancer patient-derived xenograft tumors according to one embodiment.
  • TEM 24 is a graph showing TIGIT expression levels on T cell subsets in the tumor microenvironment (TME).
  • 25 is a graph showing the effect of anti-TIGIT antibodies on cytokine production in liver cancer patient-derived T cells according to one embodiment.
  • 26 is a graph showing the effect of an anti-TIGIT antibody on cytokine production in lung cancer patient-derived T cells according to one embodiment.
  • 27 is a graph showing the effect of anti-TIGIT antibodies on cytokine production in colon cancer patient-derived T cells according to one embodiment.
  • FIG. 28A and 28B are graphs showing activation (cytokine production) of central memory T cells (FIG. 28A) and effector memory T cells (FIG. 28B) of anti-TIGIT-Fab fragments according to one embodiment.
  • 29 is a graph showing cytotoxicity (cell death rate) of an anti-TIGIT-Fab fragment against A375 tumor cells according to an embodiment.
  • 30 is a graph showing TIGIT expression levels in T cell subsets.
  • 31a to 31d are graphs showing the remaining cell numbers of Tregs, CD4+ T cells, and CD8+ T cells upon treatment with an anti-TIGIT antibody according to an embodiment.
  • FIG. 32 is a graph showing cell numbers of Tregs and NK cells upon treatment with an anti-TIGIT antibody according to one embodiment.
  • FIG 33 is a graph showing the number of remaining Tregs cells upon treatment with an anti-TIGIT antibody according to an embodiment in the presence of NK cells.
  • 34a and 34b are graphs showing the effect of cytokine production in T cells according to whether an anti-TIGIT antibody blocks FcgRIIIA according to an embodiment (34a: CD4+ T cells, 34b: CD8+ T cells).
  • mice Five BALB/c mice were immunized with MMB designed immunogen (Ag1585_IMM) and human TIGIT protein (aa22-138; sino biologics, UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) by cross-injection five consecutive times for 19 days. Lymphocytes were collected from 5 mice, pooled, purified, and then fused with SP2/0 myeloma cells. The fused cells were grown in HAT selective single-step cloning media, and the resulting 1896 hybridoma clones were transferred to a 96-well plate and cultured.
  • the peptide Ag1585_IMM used as the immunogen is modeled to reflect the folding and proximity-based relationships within the parent protein, and maximizes the potential of the immunogenic protein to be useful for creating antibodies with complete activity against the corresponding epitope in the full-length protein. It is expected.
  • the peptide Ag1585_IMM was synthesized to include 20 amino acids from the 51st amino acid residue (T) to the 70th amino acid residue (N) of human TIGIT.
  • T 51st amino acid residue
  • N 70th amino acid residue
  • Table 3 shows the structural characteristics of the modeled Ag1585_IMM and the results aligned with the TIGIT structure (PDB: 5V52). A low RMSD score indicates good alignment.
  • the peptides were synthesized based on the corresponding immunogen sequences.
  • Supernatants of hybridoma tissue cultures having an effect against Ag1585_IMM and recombinant human TIGIT(His) (sino biologics), which are immunizing antigens, were screened using indirect ELISA. Ig secretion and specificity were confirmed by further performing indirect ELISA for screening antigens (recombinant human TIGIT Fc chimeric protein (R&D systems, 9464-TG)) and cells for positive clones.
  • CHO-K1 ATCC, CCL-61 cell line was used as a negative control.
  • - ELISA plates are coated at 4°C with a coating solution containing 0.1 ⁇ g/well of recombinant human TIGIT (rhTIGIT) protein in Carbonate Coating Buffer (pH 9.6) O/N at a concentration of 100 ⁇ L/well.
  • rhTIGIT recombinant human TIGIT
  • TMB substrate at a concentration of 50uL/well, place under dark conditions (5-10 mins), and terminate with the same amount of 1M HCl.
  • IgM expressing clones were isolated and removed, and IgG expressing clones were collected.
  • the collected positive clones were subcloned to identify stable expressing clones.
  • the culture supernatant containing the selected clones was eluted by flowing through a Protein A column, and the buffer was replaced with PBS.
  • Purified antibodies were tested by indirect ELISA for the screening antigen (Recombinant Human TIGIT (T103) Fc Chimera Protein; R&D systems) and negative control antigen (His peptide).
  • CHO-K1 ATCC, CCL-61
  • human TIGIT expressing CHO-K1 CHO-K1 TIGIT
  • Fc Block BD Bioscience 564220
  • CHO-K1 cells negative control
  • a single concentration of 5 ⁇ g/mL which corresponds to the highest concentration in the titration performed on CHO-K1 TIGIT cells, was tested.
  • antibody binding was measured using anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 antibody (Sigma A21236) at 4 ⁇ g/mL (protected from light).
  • Flow cytometry was performed using an AccuriC6 Flow Cytometer, and data were analyzed with FlowJo. The obtained results are shown in FIG. 1 .
  • Hybridoma cell pellets corresponding to the stable expression clones were lysed, mRNA was extracted, and heavy and light chain variable region DNAs were cloned into sequencing vectors to analyze heavy and light chain DNA sequences.
  • the results of analyzing the sequence of the mouse anti-TIGIT clone (7A6) are shown in Table 4 below.
  • variable region Amino acid sequence (N ⁇ C) or nucleic acid sequence (5′ ⁇ 3′) sequence number heavy chain variable region DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 9 GATGTGCAGC TTCAGGAGTC GGGACCTGGC CTGGTGAAAC CTTCTCAGTC TCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCACTGGCTA CTCAATCACC AGT GATTATG CCTGGAAC TG GATCCGGCAG TTTCCAGGAA ACAAACTGGA GTGGATGGGC TACATAAGCT ACAGTGGTAG CGCTAC AACCCATCTC TCAAAAGT CG AATCTCTATC ACTCGAGACA CATCCATGAA CCAGTTCTTC CTGCAGTTGA ATTCTGTGAC TGCTGAGG
  • VH1 to VH5 Five heavy chain (VH1 to VH5) and five light chain (VK1 to VK5) sequences were selected for use in gene synthesis and expression in mammalian cells.
  • Stable IgG antibodies (marked ' ⁇ ') produced by transient transfection, including one chimeric (VH0/V ⁇ 0) and 25 humanized variants, are summarized in Table 5 below:
  • the sequences of the chimeric antibody (VH0xV ⁇ 0) obtained by applying the combination of Table 5 to the 7A6 clone of the combination of Table 4 and the humanized antibody are shown in Table 6, Table 7, and FIG. 2 .
  • Table 6, Table 7, and FIG. 2 the amino acid sequence numbering and CDR regions were determined according to the Kabat definition, and in FIG. 2, the amino acid residues changed in the CDR and parent sequence (VH0 or V ⁇ 0) determined as above were shaded. .
  • Heavy chain (constant region: human IgG1) Amino acid sequence (N ⁇ C) sequence number 7A6_VH0 variable area DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 9 7A6_VH1 variable area DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSMNQFSLKLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 10 7A6_VH2 variable area DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARK
  • Fc-engineered variants were prepared by introducing the following point mutations into the Fc region of the heavy chain of the 7A6 VH3/Vk5 hIgG1 antibody:
  • S240D, A331L, and I333E (DLE variants): 7A6 VH3/Vk5-DLE;
  • N298A 7A6 VH3/Vk5 N298A;
  • L235A, L236A and P330G LALAPG variants: 7A6 VH3/Vk5 LALAPG
  • VH0/V ⁇ 0 chimeric antibody coding DNA and humanized heavy and light chain coding DNA were transiently transfected into HEK293 EBNA adherent cells (LGC Standards, Teddington, UK) by PEI transfection method in 6-well plates. After speciation, it was cultured for 7 days. Samples were collected and antibody concentrations measured on an Octet QK384 using Protein A biosensors (Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK), based on human IgG1 antibodies.
  • Table 9 above shows the IgG concentration ( ⁇ g/mL) in the supernatant after expression in HEK cells of chimeric antibodies (VH0/V ⁇ 0) and various combinations of humanized antibodies.
  • HBS-P+ GE Healthcare, Uppsala, Sweden
  • BSA w/v Sigma, Dorset, UK
  • the supernatant containing IgG was diluted to 1 ⁇ g/mL in running buffer.
  • antibodies were loaded onto Fc2, Fc3 and Fc4 on an anti-human sensor chip (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
  • the IgG antibody was captured at a flow rate of 10 ⁇ l/min to achieve an immobilization level (RL) of ⁇ 208 RU. The surface was then allowed to stabilize.
  • single cycle kinetic data were obtained using recombinant human TIGIT (Sino Biological) injected at a flow rate of 40 ⁇ l/min as an analyte.
  • the antigen was diluted 2-fold (4 points) in a running buffer in the concentration range of 1.25 nM to 10 nM and used without regeneration between each concentration.
  • Association phases were monitored for 210 seconds for each injection at four points of increasing antigen concentration, and a single dissociation phase was measured for 900 seconds after the last antigen injection.
  • the surface of the sensor chip was regenerated by a single injection of 3 M MgCl 2 .
  • Table 10 shows Single cycle kinetic parameters of chimeric antibodies (VH0/V ⁇ 0) and humanized variants (tested in cell culture supernatant) binding to human TIGIT antigen measured using a Biacore T200.
  • the relative K D was calculated by dividing the K D of the humanized variant by the K D of the VH0/V ⁇ 0 chimeric antibody analyzed in the same experiment.
  • the K D values associated with human TIGIT binding of all tested humanized variants were within 2.55 times higher than VH0/Vk0.
  • the relative expression level, percentage of humanness, and relative KD values obtained by Biacore single cycle kinetics analysis on the supernatant .
  • six humanized variants VH2/V ⁇ 5, VH3/V ⁇ 4, VH3/V ⁇ 5, VH4/V ⁇ 4 , VH4/V ⁇ 5 and VH5/V ⁇ 5 were selected and used for subsequent thermal stability analysis.
  • Tm and Tagg Thermal ramp stability experiments were performed to obtain information on the thermal stability of the antibody from the temperature at which it unfolds from its original state to its denatured state. This unfolding process occurs in a narrow temperature range, and the midpoint of this transition is called the 'melting temperature' or 'Tm'. Since the protein undergoes a conformational change at this time, the melting temperature of the protein was determined by measuring the fluorescence of the Sypro Range (binding to the exposed hydrophobic region of the protein).
  • Table 11 shows the thermal stability values obtained using the UNcle biostability platform. As shown in Table 11, all humanized antibodies tested showed similar levels of thermostability to chimeric antibodies.
  • HBS-P+ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) supplemented with 1% BSA w/v (Sigma, Dorset, UK) was used as a running buffer and was also used for ligand and analyte dilution.
  • Purified lead antibodies were diluted to 1 ⁇ g/mL in running buffer and loaded onto Fc2, Fc3 and Fc4 on an anti-human IgG CM5 sensor chip (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) at the start of each cycle.
  • Antibodies were captured at a flow rate of 10 ⁇ l/min to achieve an immobilization level (RL) of -150 RU. The surface was then allowed to stabilize.
  • Multi-cycle kinetic data were obtained using recombinant human TIGIT (acrobiosystems, China) as an analyte injected at a flow rate of 50 ⁇ l/min to minimize potential mass transfer effect.
  • Antigen (TIGIT) was diluted 2-fold (7 points) in the concentration range of 0.406 nM to 30 nM in running buffer. It was used without regeneration between each concentration. At each concentration, association phases were monitored for 240 seconds and dissociation phases were measured for 900 seconds. The surface of the sensor chip was regenerated between cycles by injecting 3 M MgCl 2 twice. To confirm the stability of both the surface and the analyte over kinetic cycles, multiple repetitions of blanks and repetitions of a single concentration of analyte were programmed as kinetic runs.
  • Table 12 above shows the kinetic constants determined from 1:1 model fitted curves.
  • binding affinity (KD) for human TIGIT protein was 77 pM for antibody 7A6 VH0Vk0 and 86.7 pM for antibody VH3/Vk5, showing similar levels to each other.
  • the epitope of the antibody was confirmed through peptide mass fingerprint and H/D exchange (hydrogen/deuterium exchange).
  • the peptide mass fingerprint (PMF) of the samples was optimized. Pepsin proteolysis of protein samples was performed under quenched conditions to limit back exchange of deuterium atoms that may occur during proteolysis and chromatography.
  • 4 ⁇ l of the above protein sample was mixed with 56 ⁇ l of labeling buffer (5mM K 2 HPO 4 ; 5mM KH 2 PO 4 , D 2 O pH 6.6) for exchange experiments, and equilibration buffer (5mM K2HPO4; 5 mM KH2PO4 for control experiments). , pH7.0) was mixed with 56 ⁇ l.
  • 15X diluted solution 60 ⁇ l, TIGIT: Vh3Vk5; 1 ⁇ M:2 ⁇ M was incubated for 15 sec, 60 sec, 180 sec, 600 sec, 1800 sec, and 7200 sec, and quench solution (50 mM K 2 HPO 4 ; 50 mM KH 2 PO 4 ; GuCl 2.0 M, TCEP 200 mM, pH 2.3, 0°C) was added to the protein sample for a 20 second incubation time. After incubation, 80 ⁇ l of the quenched protein solution was immediately injected onto a proteolytic pepsin column at 15 °C for 5 minutes. After proteolysis and before MSe Xevo-G2-XS analysis, pepsin peptides produced using C18 chromatography (HDX Manager Waters) were analyzed by liquid chromatography. These tests were performed in triplicate.
  • H/D exchanged peptides were analyzed using DynamX3.0 software. Deuterium levels were determined by considering the average of all results with high and medium confidence. The deuteration level was calculated based on the centroid of the experimental isotope cluster.
  • HDX-MS analysis revealed significant differences between deuterium incorporation in TIGIT when TIGIT protein was incubated with or alone with 7A6 VH3/Vk5. A major difference in deuterium incorporation was observed in the epitope region of 7A6 Vh3Vk5, amino acid residues 51-70 (TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 31).
  • Figure 3a shows the obtained HDX-MS analysis result (the level of deuterium incorporation at 51-70 (TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 31) of TIGIT is high), and Figure 3b schematically shows the structure of the TIGIT ribbon. is a top view, bottom is a side view, epitope regions are indicated by arrows.
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of 7A6 VH3/Vk5 were synthesized together with flanking restriction sites for cloning vector construction.
  • the heavy and light chains of the synthetic sequence were treated with appropriate restriction enzymes (heavy chain: Mlu I and Sal I (New England Biolabs); light chain: BssH II and BamH I (New England Biolabs)), and human IgG1 treated with the same restriction enzymes. It was ligated into an expression vector containing the constant region. Both heavy and light chain cDNA constructs were sequenced. Giga prep was performed to prepare DNA for transient transfection in CHO cells.
  • the Giga prep was performed using the PureLinkTM HiPure Expi Plasmid Gigaprep Kit (Thermo Fisher Scientific, K210009XP).
  • the Gigaprep Kit is a kit for amplifying plasmid DNA from E.coli and then purifying it using anion exchange chromatography.
  • CHO cells (Evitria) were cultured using an animal component-free and serum-free medium (CD CHO Medium, Thermofisher), and the produced antibody was purified from the culture supernatant by Protein A purification using MabSelectTMSuReTM. A purity of 95% or more was achieved by sequentially performing size exclusion chromatography (SEC) purification.
  • the purified antibody was characterized by absorbance measurement at 280 nm and SDS-PAGE.
  • the anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody was conjugated with Alexa Fluor® 488 (AF488) using the APEXTM antibody labeling kit (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • T cells were isolated from human PBMCs using magnetic beads (EasySepTM) and labeled anti-TIGIT antibody at various concentrations (anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody; 50, 250, 750, 1250 and 2500 ng/ml) incubated with. Binding was measured by flow cytometry (CytoFLEX, Beckman Coulter) and the obtained data was analyzed using Flowjo software (TreeStar, Inc). Binding of the anti-TIGIT antibody was confirmed on CD3 + , CD4 + and CD8 + T cells.
  • the tested anti-TIGIT antibodies bind to primary T cells, and the binding to TIGIT molecules (per cell) increases as the anti-TIGIT antibody concentration increases.
  • TIG1 (Arcus): WO2017/152088 A1;
  • MBSA43 obtained from eBioscience
  • Pembrolizumab and Nivolumab obtained from InvivoGen.
  • TIGIT-PVR blocking effect of the anti-TIGIT antibody on the interaction between TIGIT and its receptor, poliovirus receptor (PVR), was analyzed by cell-based NFAT reporter response bioassay (Promega).
  • TIGIT effector cells (Promega) were added to cell assay buffer (90% RPMI 1640/10% FBS), and the cell suspension containing the TIGIT effector cells was cultured at 37°C for 16 hours.
  • Anti-TIGIT antibody (7A6 VH3/Vk5) or comparative antibody was prepared in PBS buffer and added to the pre-cultured cell suspension.
  • CD155 aAPC/CHO-K1 cells were added to the cell and antibody-containing mixture and incubated at 37°C for 6 hours. The degree of luminescence was measured with a PromegaTM GloMax® Plate Reader. EC 50 values of antibody responses were measured using curve fitting software (GraphPad Prism® software).
  • the T cell activation signal was increased by blocking TIGIT-PVR with the anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody.
  • the anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody herein showed significantly higher efficacy (significantly lower EC50 values) than comparable antibodies such as BMS (22G2), Arcus (TIG1), Genentech (4.1D3), and Mereo (313M32).
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • HCC Hepatocellular carcinoma
  • PBMCs and liver-derived lymphocytes were prepared from liver tissue obtained from HCC patients. Liver-infiltrating lymphocytes were isolated from 0.5-1 cm hepatic needle biopsy. Then, the tissue was homogenized in 2-3 ml of Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (GIBCO) using a Dounce tissue grinder.
  • GEBCO Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline
  • PBMCs from patients with melanoma, ovarian cancer, colorectal cancer (CRC), HCC, non-small cell lung cancer (NSCLC), and pancreatic cancer were obtained from Cureline, Inc. The following analysis was performed on the liver-infiltrating lymphocytes and PBMCs of cancer patients obtained as described above.
  • PBMCs were cultured with anti-CD3 antibody in the presence of anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody (2ug/ml and 10ug/ml). A group not treated with anti-TIGIT antibody was used as a control group. After incubation, the samples were centrifuged at 400xg for 10 minutes, and the supernatant was taken and used for multiplex immunoassay. Cytokine concentration was measured by Bio-Plex cytokine assay (Human cytokine assay including IFN-gamma, IL-2). All analyzes were performed according to the manufacturer's instructions, and the results were read using a Bio-Plex 200 array reader (Bio-Rad).
  • anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody induced Th1/Tc1 cytokine secretion in human PBMCs at a significant level.
  • anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5-IgG1 is designated as anti-TIGIT 7A6 antibody or anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody.
  • Cytokine production in human T cells was measured.
  • Cells (500,000 cells/reaction) were incubated with anti-CD3 monoclonal antibody (BD Biosciences, cat no. 555336; 0.2ug/ml) and anti-CD28 monoclonal antibody (BD Biosciences, cat no 555725) in the presence of anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody. ; 1ug/ml). After incubation, cells were spun down at 400xg for 10 minutes at 4° C., and cytokine concentrations in T cells were measured.
  • intracellular cytokines were stained by the following method: Cells were stained with Zombie Aqua fixable dead cell dye solution (Biolegend) and fluorophore for CD4+ and CD8+ T cell surface markers on ice for 30 min. -labeled with a conjugated antibody.
  • the anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody (above, used for surface staining of CD4+ and CD8+ T cells), anti-IL-2 antibody, anti-IFNg antibody, and anti-TNFa antibody used at this time All were obtained from Biolegend.
  • Cells were fixed and permeabilized using the eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit (eBiosciences) according to the manufacturer's instructions. The cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies (Biolegend) against intracellular IL-2, IFN ⁇ and TNF ⁇ . The cells were analyzed with a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter) and data were analyzed with Flowjo software (BD Biosciences).
  • eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit eBiosciences
  • the cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies (Biolegend) against intracellular IL-2, IFN ⁇ and TNF ⁇ .
  • the cells were analyzed with a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter) and data were analyzed with Flowjo software (BD Biosciences).
  • anti-TIGIT antibodies The immunological effect of anti-TIGIT antibodies on cytokine production was measured by the method described in Example 3.2.2.
  • anti-PD1 antibodies pembrolizumab (denoted as 'Pem analog') and nivolumab (denoted as 'Niv analog') were used as comparative antibodies.
  • the analysis was performed by flow cytometry after treatment with anti-TIGIT antibody or anti-PD1 antibody.
  • Anti-PD-1 antibody and anti-TIGIT antibody were used at 10 ⁇ g/ml each.
  • 8a IL-2 concentration in CD4+ T cells
  • 8b IFN-gamma concentration in CD4+ T cells
  • 8c IL-2 concentration in CD8+ T cells
  • 8d CD8+ T cells
  • cytokine production was measured by the method described in Example 3.2.2.
  • the anti-TIGIT comparison antibodies used for comparison are as described above.
  • 9a IL-2 concentration in CD4+ T cells
  • 9b IFN-gamma concentration in CD4+ T cells
  • 9c IL-2 concentration in CD8+ T cells
  • 9d CD8+ T cells
  • Anti-TIGIT antibody (7A6 VH3/Vk5-IgG1 or 7A6 VH3/Vk5-IgG4) 10ug/ml was plate-bound anti-CD3 antibody (BD Biosciences) (0.2ug/ml), PBMCs (500,000 cells/reaction) and Cytostim It was co-cultured with an activator (Miltenyi Biotec). After culturing, CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) measurement and Ki67 measurement were performed on an Incucyte® Live-Cell analysis system (Satorius) and a flow cytometer, respectively.
  • CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • FIGS. 10a and 10b The obtained results are shown in FIGS. 10a (CFSE assay result) and 10b (Ki67 assay result) (No Stim: cytostim activator and antibody untreated; Control: antibody untreated).
  • FIGS. 10A and 10B both 7A6 VH3/Vk5-IgG1 and 7A6 VH3/Vk5-IgG4, the anti-TIGIT antibodies of the present application, induced the proliferation of T cells, indicating that the anti-TIGIT antibodies induced immunity. suggesting that the reaction may be long-lasting.
  • CD8+ T cells and Tregs were isolated using the human CD8+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec 130-096-495) and CD4+ CD25+ CD127- dim reg T cell isolation kit II (130-094-775) .
  • Isolated CD8+ T cells were stained with a cell tracker violet proliferation kit (Thermo Fisher), and cells were seeded at a CD8:Treg ratio of 4:1.
  • Cells were activated with CD3/CD28 Dynabeads (ThermoFisher) and 10ug/ml anti-TIGIT 7A6 VH3/V ⁇ 5 antibody was added to appropriate wells. On day 3, the beads were washed and IL-2 (50 ng/ml) was added.
  • FIG. 11 The obtained results are shown in FIG. 11 .
  • addition of Tregs reduced CD8+ T cell proliferation, but this inhibition of CD8+ T cell proliferation was blocked by anti-TIGIT antibody. This indicates that the anti-TIGIT antibody blocks Tregs-mediated inhibition of CD8+ T cell proliferation.
  • the synergistic effect of the combined use of an anti-TIGIT antibody and an anti-PD antibody was tested.
  • the TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 complex blocking effect of anti-TIGIT antibody and anti-PD antibody was analyzed by cell-based NFAT reporter response bioassay (Promega).
  • PD-1+TIGIT+ effector cells (Promega; 1X10 5 cells/reaction) were added to cell assay buffer (90% RPMI 1640/10% FBS), and the cell suspension containing PD-1+TIGIT+ effector cells was incubated at 37°C. incubated for 16 hours.
  • PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1 cells (Promega; 4X10 4 cells/reaction) were prepared by adding them to cell recovery medium (90% Ham's F-12, 10% FBS).
  • An antibody mixture of anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody and pembrolizumab or nivolumab was added to the cell suspension containing the PD-1+TIGIT+ effector cells (1X10 5 /reaction) and PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1 (4X10 4 /reaction). and incubated at 37°C for 6 hours. The case where only one of the anti-TIGIT antibody or the anti-PD1 antibody was treated was used as a control group.
  • the amount of antibody used was 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)
  • the amount of anti-TIGIT antibody was 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml).
  • the amount of anti-PD-1 antibody was 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml).
  • FIG. 12 The obtained results are shown in FIG. 12 .
  • a synergistic effect was shown by the combined use of an anti-TIGIT antibody and pembrolizumab or nivolumab.
  • the combined effect of anti-TIGIT antibody and anti-PD1 antibody for TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 blocking was analyzed by cell-based NFAT reporter response bioassay (Promega).
  • An anti-TIGIT antibody (7A6) or an anti-TIGIT comparative antibody was co-cultured with pembrolizumab or nivolumab with reference to Example 5.1.
  • the comparative antibody was incubated with the cell mixture and treated in the same way.
  • the amount of antibody used was 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)
  • the amount of anti-TIGIT antibody was 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)
  • the amount of anti-PD-1 antibody was 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)
  • FIGS. 13a and 13B The obtained results are shown in FIGS. 13a (combined use with pembrolizumab) and 13b (combined use with nivolumab).
  • both the anti-TIGIT antibody combined with pembrolizumab and nivolumab showed a high synergistic effect compared to the combined use of the anti-PD1 antibody and the anti-TIGIT comparative antibody.
  • Cytokine production of human T cells upon treatment with anti-TIGIT/anti-PD1 antibody alone or in combination was measured.
  • Anti-TIGIT antibody 7A6 VH3/Vk5 (2ug/ml) was pre-mixed with either pembrolizumab (2ug/ml) or nivolumab (2ug/ml) and added to the cell culture. Intracellular cytokine staining was performed with reference to Example 3.2.2.
  • CD155 (PVR) staining was performed using 1:25 diluted anti-CD155 PE-Cy7 (Biolegend) and analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 15 A375 and SK-OV3 tumor cells expressed CD155, a ligand of TIGIT, at a significant level.
  • anti-TIGIT antibodies 7A6 VH3/Vk5 and 7A6 VH3/Vk5-DLE 10ug/ml of anti-TIGIT antibodies (7A6 VH3/Vk5 and 7A6 VH3/Vk5-DLE) were administered in A375 cell line (melanoma) (2.5x10e4 cells) in the presence of PBMC (250,000 cells/reaction) and Cytostim (Milteni Biotec) for 72 hours. /reaction) and the antibody were co-cultured to test cytotoxicity against A375 tumor cells.
  • An anti-TIGIT10A7 comparative antibody Genentech
  • FIGS. 17a and 17b show the obtained results in FIGS. 17a (cell death rate according to culture time) and 17b (cell death rate after 84 days culture).
  • FIGS. 17a and 17b an increase in tumor cell killing ability of the anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody was observed, and this tumor cell killing ability was significantly higher than that of the comparative antibodies.
  • SKOV-3 cells 35k cells/well were cultured in the presence or absence of anti-TIGIT antibodies (anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 and 7A6VH4/Vk4) (10ug/ml each) for 108 days with isolated CD8+ T cells and Cytostim.
  • anti-TIGIT antibodies anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 and 7A6VH4/Vk4
  • the ratio (E:T) of effector cells and target cells was analyzed at 3:1.
  • the group treated with pembrolizumab in the same way was used as a control group. Data were analyzed using IncuCyte native software.
  • Isolated NK cells were pre-stimulated with or without IL-15 (5ng/ml) for 48 hours.
  • the NK cells were isolated from human PBMCs using an NK isolation kit (NK Cell Isolation Kit, from Miltenyi Biotec (cat. No. 130-092-657) according to the manufacturer's instructions.
  • the NK cells (250,000 cells/ reaction) in SKOV3 cells (2.5x10e4 cells/reaction) by E:T 10:1 in the presence of anti-TIGIT antibodies (7A6 VH3/Vk5, 7A6 VH4/Vk4, 7A6 VH3/Vk5-DLE) (10 ⁇ g/ml each) ) for 48 hours, and the number of tumor cells was measured using the Incucyte® Live-Cell analysis system (Satorius).
  • Example 7 In vivo anti-cancer effect test
  • MC38-hPVR Human PVR-expressing MC38 tumor cells
  • the prepared tumor cell solution (2x10 5 tumor cells in 0.1 mL of PBS solution) was subcutaneously inoculated into the right back flank of C57BL6 hTIGIT knock-in mouse (GemPharmatech Co., Ltd), and the tumor was grown. Randomization was performed when the average tumor size (volume) reached 80-100 mm 3 . A total of 15 mice were used in this test, and they were randomly divided into 3 groups (5 mice/group).
  • Tumor size volume was measured in two dimensions using a caliper three times a week after randomization, and was calculated by the following formula:
  • V(mm 3 ) (L x W x W)/2
  • V is the tumor volume (mm 3 )
  • L is the tumor length (the length of the major axis of the tumor)
  • W is the tumor area (the longest perpendicular of L)].
  • Antibody or vehicle treatment was performed immediately after grouping.
  • a PBS solution was used as a vehicle (control group; group 1), and 7A6 VH3/Vk5 and Tiragolumab produced in CHO cells were treated at a dose of 20 mg/kg (groups 2 and 3, respectively) (see Table 13).
  • Dose Level mg/kg
  • Dosing Solution mg/mL
  • Dosing Volume ⁇ L/g
  • ROA Dosing Frequency & Duration
  • BIW Bi-weekly (twice a week)
  • mice The tumor sizes of the mice measured as described above are shown in FIG. 20 .
  • the 7A6 VH3/Vk5 antibody exhibited a significant tumor growth inhibitory effect compared to the control group (PBS).
  • the tumor growth inhibition effect by the 7A6 VH3/Vk5 antibody compared to the control group was 9 days (p-value, 0.029) and 21 days (p-value, 0.007). ) was particularly marked.
  • the 7A6 VH3/Vk5 antibody (group 2) also showed superior antitumor effect compared to the comparative antibody, Tiragolumab (group 1) (eg, day 21, p-value, 0.013).
  • Tumor growth inhibition was calculated as Mean % ⁇ Inhibition:
  • T0 initial tumor size of the test group
  • TGI tumor growth inhibition
  • CT-26 tumor cells (CrownBio) were stored in vitro in RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS at 37°C and 5% CO2 atmosphere. Cells in the exponential growth phase were harvested and quantified with a cell counter before inoculation with tumor cells.
  • the prepared tumor cell solution (5x10 5 tumor cells in 0.1 mL of PBS solution) was subcutaneously inoculated into the right back flank of BALB/c hPD-1/hTIGIT double knock-in mouse (GemPharmatech Co., Ltd), and the tumor grew made it The day of tumor inoculation was designated "Day 0". Randomization was performed when the average tumor size (volume) reached 70-100 mm 3 . A total of 30 mice were used in this test, and they were randomly divided into 5 groups (6 mice/group).
  • a PBS solution was used as a vehicle (control group; group 1), 7A6 VH3/Vk5 and 7A6 VH3/Vk5-DLE were treated at 20 mg/kg doses (groups 3 and 4, respectively), and anti-PD1 antibody Keytruda (Pembrolizumab; Merck) at a dose of 5 mg/kg (Group 4), and 7A6 VH3/Vk5 20 mg/kg and Keytruda 5 mg/kg in combination (Group 5).
  • the test was terminated when the mean tumor burden of the vehicle-treated group (control group) reached 3000 mm 3 on day 25 (see Table 14).
  • Dose level (mg/kg) Dosing Solution (mg/mL) Dosing Volume ( ⁇ L/g) ROA Dosing Frequency & Duration
  • Dose level (mg/kg) Dosing Solution (mg/mL) Dosing Volume ( ⁇ L/g) ROA Dosing Frequency & Duration
  • BIW Bi-weekly (twice a week)
  • TGI% was calculated with the formula:
  • TGI (%) 100 x (1-T/C)
  • T and C are the average tumor volume (or weight) of the test group (T) and control group (C) on a specific day, respectively.
  • tumor growth reductions of 51.43% and 55.91% in TGI were observed in both the 7A6 VH3/Vk5-treated group (Group 3) and Keytruda-treated group (Group 2), respectively.
  • the TGI was 78.98%, and tumor formation delay and tumor growth inhibition effects were the most remarkable.
  • the tumor growth inhibitory effect of the 7A6 VH3/Vk5 treatment group, the Keytruda treatment group, and the Keytruda + 7A6 VH3/Vk5 combination treatment group was statistically significantly higher than that of the control group (p-value ⁇ 0.05).
  • Complete tumor removal was observed in the 7A6 VH3/Vk5 treatment group (1 mouse) and the Keytruda+7A6 VH3/Vk5 combination treatment group (2 mice). There was no significant difference in body weight in all test groups treated with the antibody.
  • TEE tumor microenvironment
  • Immunodeficient NSG mice (NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (Jackson Laboratory, USA) were transplanted with human CD34 + hematopoietic stem cells (HSC) obtained from cord blood from three donors (Jackson Laboratory, USA). It was used for in vivo analysis.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • Hepatic cholangiocarcinoma LIXFC 2479 (Charles river) tumor cells were obtained from surgical specimens after resection of cancer patients.
  • Immunodeficient mice at passage 1 were transplanted with tumor fragments, and tumor xenografts were passaged until a stable growth pattern was established. Tumor fragments were obtained from xenografts by serial passage in nude mice.
  • PDX patient-derived tumor xenograft
  • mice Animals were distributed into two groups of 6 mice each, two mice in each group were reconstituted with HSCs from 3 each donor, and similar group tumor volume median 50-150 mm 3 at initiation simultaneously and Weight guaranteed. The day of randomization was set as “Day 0”. PBS was used as a control (group 1). Mice in group 2 were treated with 7A6 VH3/Vk5 at a dose of 20 mg/kg. The test substances were administered via intraperitoneal injection twice a week for 4 weeks, and the tumor size was monitored until the experiment was terminated on the 28th day. Details are as shown in Table 16 below:
  • BIW Bi-weekly (twice a week)
  • ROA Route of administration
  • Tumor growth inhibition was calculated as Mean % ⁇ Inhibition:
  • ⁇ TGI(Mean % ⁇ Inhibition) ((mean(C)-mean(C0)) -(mean(T)-mean(T0))) /(mean(C)-mean(C0)) * 100%
  • T0 initial tumor size of the test group
  • tumor size The obtained results (tumor size) are shown in FIG. 23 .
  • the anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody significantly inhibited tumor growth compared to the control group.
  • tumor size was compared between anti-TIGIT antibody treated and control groups on day 28.
  • the tumor growth inhibition ( ⁇ TGI) of the 7A6 VH3/Vk5 antibody was 76.6%, which indicates that the antibody has a significant anticancer effect in a liver cancer PDX tumor model, which is considered to have greater physiological relevance to human cancer than a synthetic mouse model. shows
  • Example 8 Anti-tumor efficacy of anti-TIGIT antibodies in human PBMCs and tumor-infiltrating T cells
  • TIGIT expression on T cell subsets in the tumor microenvironment (TME)
  • TIGIT expression was confirmed in the livers of hepatocellular carcinoma (HCC) patients and hemochromatosis (HFE) donors. Hemochromatosis (HFE) is considered an immunologically healthy condition with normal liver function.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • HFE hemochromatosis
  • TIGIT expression in T cell subsets tumor infiltrating lymphocytes from normal donors and HCC cancer patients were prepared (see Example 3.1). The cells were stained with cell surface markers (CD3, CD4, CD8, CD127, CD25, TIGIT) (CD3, CD4, CD8, CD127, and CD25 antibodies from Biolegend, TIGIT antibodies from R&D Systems), Analyzed with flow cytometry and Flowjo software. Mean Fluorescence Intensity (MFI) of TIGIT in each T cell subset was measured using Flowjo software (BD Biosciences).
  • MFI Mean Fluorescence Intensity
  • TIGIT expression on tumor-infiltrating T cells in HCC patients was higher than that in normal donors.
  • Immune cells expressing TIGIT cause dysfunction in cancer patients, and it was tested whether the immune response of HCC patients could be restored or improved by anti-TIGIT antibody treatment.
  • human PBMCs obtained from hepatocellular carcinoma (HCC) patients or healthy donors were incubated with anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody (anti-TIGIT 7A6) (10ug /ml) or incubated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies in the presence of the same dose of comparative antibody (anti-TIGIT 10A7, 22G2). Intracellular cytokine production was measured (see Example 3.2.2).
  • anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody treatment significantly increased CD4+ and CD8+ T cell cytokine production in PBMC of HCC patients. It was confirmed that Since IL-2 and IFN- ⁇ are cytokines that have a key function of the immune system by increasing the proliferation and killing activities of NK and T cells, the data obtained above show the efficacy of anti-TIGIT 7A6 antibody treatment in HCC patients.
  • TIGIT-expressing immune cells cause dysfunction in cancer patients, and it was tested whether the immune response of colorectal cancer patients can be restored or improved by treatment with anti-TIGIT antibodies.
  • Cytokine production according to anti-TIGIT antibody treatment (each 10 ⁇ g/ml) in immune cells of human PBMCs derived from colorectal cancer (CRC) patients was tested (see Example 3.2.2).
  • the obtained results are shown in FIG. 27 .
  • the anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody produced higher levels of cytokine production from CD4+ and CD8+ T cells in PBMCs of colorectal cancer patients. This result suggests the efficacy of the anti-TIGIT 7A6 antibody for colorectal cancer patients.
  • Example 9 T cell activation test by blocking the TIGIT-PVR interaction of anti-TIGIT Fab fragments
  • the anti-TIGIT-Fab fragment (7A6_VH3 variable region and 7A6_VK5 variable region linked by a disulfate bond) of the antibody was HEK293 It was produced in cells and purified by Immobilized metal affinity chromatography. An anti-TIGIT Fab fragment was used to show only specific blocking function without Fc-inducing effect.
  • central memory T cells [Tcm] FIG. 28a
  • effector memory T cells [Tem] Activation of Fig. 28b
  • anti-TIGIT Fab fragment 10ug/ml was applied to 48 time treated. After adding Brefeldin A (Sigma) and Monensin (Sigma) to a final concentration of 1/1000 to each well, the mixture was further treated for 4 hours.
  • central memory T cells and effector memory T cells were washed and stained with the following antibodies for 10 minutes at room temperature: Alive/Dead (ThermoFisher LIVE/DEADTM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation), Anti-CD3-APC (Biolegend), Anti-CD8-PerCP (Biolegend), Anti-CD45RA- Brilliant Violet 421 (Biolegend), Anti-CCR7-Brilliant Violet 510 (Biolegend). After staining, cytokine levels in central memory and effector memory T cells were measured as follows.
  • Cells were fixed and permeabilized using the Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit (ThermoFisher) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies against intracellular IL-2, IFN ⁇ , and TNFa (all from Biolegend).
  • the cells were analyzed with a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter), and data were analyzed with Flowjo software (BD Biosciences).
  • FIGS. 28a central memory T cells
  • 28b effector memory T cells
  • A375 tumor cells 35k cells/well were stained with Syto-9 dye, and Fab fragments (Fab 7A6 VH0/Vk0, 3VH3/Vk5, VH4/Vk4) generated from anti-TIGIT humanized antibodies (10ug/ml each) were co-cultured with PBMC and CytoStim (1/50) in the presence of Tumor cell numbers were measured using the Incucyte® Live-Cell analysis system (Satorius).
  • Example 10 Immunomodulatory effect of anti-TIGIT antibodies on regulatory T cells and NK cells
  • T cell subsets and TIGIT protein were stained in PBMCs from healthy donors (Anti-CD3-APC (Biolegend), Alive/Dead (ThermoFisher LIVE/DEADTM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit), Anti-CD8- PerCP (Biolegend), Anti-CD4-Alexa Fluor700 (Biolegend), Anti-CD127-PE (Biolegend), Anti-CD25-Brilliant Violet 421 (Biolegend), Anti-TIGIT-PeCy7 (Biolegend)). After staining, cells were spun down and analyzed by flow cytometry.
  • TIGIT was expressed at higher levels in regulatory T cells (Tregs) compared to non-Tregs CD4+ and CD8+ T cells.
  • Anti-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 antibody (10 ug/ml) was co-cultured with human PBMCs in the presence of anti-CD3 antibody (BD Biosciences) and anti-CD28 antibody (BD Biosciences). As a control, anti-TIGIT 10A7 (Genentech) was used. Frequencies of Tregs, CD4+ T and CD8+ T cells were assessed by flow cytometry.
  • FIGS. 31a Tegs
  • 31b CD4+ T cells
  • 31c CD8+ T cells
  • 31d The anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody specifically targeted Treg cells without altering the CD4+ and CD8+ T cell ratios.
  • the anti-TIGIT antibody depleted Tregs to a higher level than the control anti-TIGIT antibody (10A7) (FIG. 31D).
  • Treg and NK cells were co-cultured together overnight in the presence or absence of anti-TIGIT antibody 7A6 VH3/Vk5 or VH3/Vk5-DLE (10 ug/ml each). The next day, the remaining cell numbers of Treg and NK cells were measured by flow cytometry. For Treg cells, Miltenyi kits (CD4+ CD25+ CD127-dim reg T cell isolation kit II, cat no. 130-094-775) were used, and for NK cells, Milteny kits (NK Cell Isolation Kit, cat no. 130-092-657 ) was used and isolated from human PBMCs according to the manufacturer's instructions.
  • Miltenyi kits CD4+ CD25+ CD127-dim reg T cell isolation kit II, cat no. 130-094-775
  • NK Cell Isolation Kit cat no. 130-092-657
  • Treg cell numbers were reduced by anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 antibody and VH3/Vk5-DLE antibody treatment, whereas NK cell numbers were unchanged. These results show that the tested anti-TIGIT antibodies efficiently deplete Tregs by antibody dependent cellular cytotoxicity with NK cells.
  • Treg and NK cells were co-cultured together overnight in the presence of anti-TIGIT antibody 7A6 VH3/Vk5-DLE (10ug/ml).
  • Miltenyi kits CD4+ CD25+ CD127-dim reg T cell isolation kit II, cat no. 130-094-775) were used, and for NK cells, Milteny kits (NK Cell Isolation Kit, cat no. 130-092-657 ) was used and isolated from human PBMCs according to the manufacturer's instructions.
  • the Fc receptor was blocked by treatment with the Fc blocking antibody CD16 and Human TruStain FcXTM (BioLegend). The next day, the remaining cell numbers of Treg and NK cells were measured by flow cytometry.
  • Cytokine production in human T cells was measured with or without prior blocking of FcgRIIIA.
  • 500,000 PBMC cells were pre-incubated with FcgRIIIA (Biolegend cat no. 422302) antibody for 5 minutes at room temperature.
  • FcgRIIIA Biolegend cat no. 422302
  • PBMC cells were cultured in the presence of anti-TIGIT 7A6VH3/Vk5 (10ug/ml) or isotype control antibody (10ug/ml) at 0.2ug/ml anti-CD3 (BD Biosciences) and 1ug/ml anti-CD28 (BD Biosciences). ) and incubated with monoclonal antibodies.
  • cytokine concentrations in T cells were measured.
  • intracellular cytokines were stained by the following method: Cells were stained with Zombie Aqua fixable dead cell dye solution (Biolegend) and placed on ice for 30 min for CD4+ and CD8+ T cell surface markers CD3, CD4, and CD8+ Labeled with a fluorophore-conjugated antibody (Biolgend). Cells were fixed and permeabilized using the eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit (ThermoFisher) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies against intracellular IL-2 (Biolegend) and IFN ⁇ (Biolegend). The cells were analyzed with a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter) and data were analyzed with Flowjo software (BD Biosciences).

Abstract

신규한 항-TIGIT 항체 및 이의 면역증강, 항암 및 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

항-TIGIT 항체 및 이의 용도
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2021년 5월 10일자 대한민국 특허출원 제10-2021-0060014호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
신규한 항-TIGIT 항체 및 이의 면역증강, 항암 및 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.
암 면역요법은 체내 면역작용을 이용해서 암을 치료하는 방법으로, 화학요법, 외과요법, 방사선 요법에 이어 암의 제4 치료법으로 불린다. 암 면역요법은 면역계를 활성화시켜 종양 세포에 대한 인식 및 반응을 증가시키는 메커니즘을 필요로 한다. 면역계 활성화는 항원-특이적 반응의 개시에 중요한 항원-제시 세포 및 종양 세포 파괴를 담당하는 이펙터(effector) 세포 등과 같은 다양한 세포의 기능을 수반하는 복잡한 메카니즘이다.
상기 이펙터 세포의 대표적인 예로서 세포독성 T 세포를 들 수 있다.
한편, TIGIT (T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain)은 WUCAM, VSIG9 또는 Vstm3로도 지칭되며, NK, CD8+ 및 CD4+ T 세포뿐만 아니라 조절 T 세포 (regulatory T　cell; "Treg")에서도 우선적으로 발현되는 공동-억제 수용체이다.　TIGIT는 세포 내의 ITIM 도메인, 막관통 도메인, 및 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 막관통 단백질이다.
TIGIT　발현은 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL) 및 감염과 같은 질병 환경에서 증가된다.　TIGIT　발현은　TIGIT　음성 세포와 비교하여 낮은 이펙터 기능을 갖는 exhausted T 세포의 표지가 될 수 있다. 또한,　TIGIT를 발현하는 Treg 세포는　TIGIT　음성 Treg 집단과 비교하여 향상된 면역억제 활성을 나타낸다.
이러한 점에 기초할 때, TIGIT에 대하여 길항작용을 하는 약물 (예컨대, 길항성 항-TIGIT　항체 등)은 면역계 활성화를 유도하고 암 등의 질병상태에서의 면역 반응을 증진시켜 질병 치료에 유리한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
TIGIT에 결합하는 항-TIGIT　항체 및 이의 의약 용도가 제공된다.
일 예는 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining　Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약학 조성물, 방법, 및 용도에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 다른 면역관문 단백질, 예컨대, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물(길항제)와 함께 병용될 수 있다. 상기 병용 가능한 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이들 모두일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 발현시키는 단계 이후에 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 및 이들의 의약 용도가 제공된다. 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
항체 또는 항원결합단편
일 예는 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1)는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 6개 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)을 아래의 표 1에 정리하였다:
서열 서열번호
CDR-H1 SDYAWN 1
CDR-H2 YISYSGSARYNPSLKS 2
CDR-H3 KGYPAYFAY 3
CDR-L1 XASQDVSTAVA (X=K or R) 4
CDR-L1 KASQDVSTAVA 7
CDR-L1 RASQDVSTAVA 8
CDR-L2 SASYRYT 5
CDR-L3 QHHYSTPYT 6
(상기 표 1에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)
구체예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 4(예컨대, 서열번호 7 또는 서열번호 8)의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
경우에 따라서(예컨대, 재조합적으로 제작시), 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역은 N 말단에 적절한 신호서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 예시하였다:
가변영역 아미노산 서열(N→C) 서열번호
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 9
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RITISRDTSMNQFSLKLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 10
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RITISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 11
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 12
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 13
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 14
경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISC KASQDVSTAVA WYQQKPGQSPELLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QHHYSTPYT FGGGTKLEMK 15
경쇄가변영역 DIVMTQSHSFLSASVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQAPELLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHHYSTPYT FGQGTKLEMK 16
경쇄가변영역 DIVMTQSPSSLSASVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQAPRLLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHHYSTPYT FGQGTKLEIK 17
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQAPRLLIY SASYRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHHYSTPYT FGQGTKLEIK 18
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVSTAVA WYQQKPGQAPRLLIY SASYRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHHYSTPYT FGQGTKLEIK 19
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQAPRLLIY SASYRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHHYSTPYT FGQGTKLEIK 20
(표 2에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄)
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT 단백질, 예컨대, 인간 TIGIT 단백질(NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)의 아미노산 잔기 51-70 영역(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; 서열번호 31) 중 선택되는 하나 이상 또는 2개 이상(예컨대, 연속하여 위치함)의 아미노산에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[인간 TIGIT 단백질(서열번호 30)]
1 MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS GMMTGTIETT GNISAEKGGS IILQCHLSST TAQVTQVNWE
61 QQDQLLAICN ADLGWHISPS FKDRVAPGPG LGLTLQSLTV NDTGEYFCIY HTYPDGTYTG
121 RIFLEVLESS VAEHGARFQI PLLGAMAATL VVICTAVIVV VALTRKKKAL RIHSVEGDLR
181 RKSAGQEEWS PSAPSPPGSC VQAEAAPAGL CGEQRGEDCA ELHDYFNVLS YRSLGNCSFF
241 TETG
본 명세서에서 "항체"라 함은, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질 또는 이를 화학적 합성 또는 재조합적으로 제조한 단백질일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및/또는 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 인간 IgG형 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 형태의 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
완전한 항체(예컨대, IgG형)는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 중쇄 불변영역으로서 IgG의 불변영역, 경쇄 불변영역으로서 카파 불변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 IgG(예컨대, 인간 IgG1)의 불변영역은 야생형일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 IgG의 불변영역은, 인간 IgG1을 기준으로, S240D(240번째 아미노산인 S가 D로 치환됨, 이하 아미노산 변이는 동일한 방식으로 표현됨), A331L, I333E, N298A, S299A, E334A, K335A, L235A, L236A 및 P330G로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 변이형일 수 있으며, 예컨대, 다음의 변이를 포함하는 변이형일 수 있다:
(1) S240D, A331L, 및 I333E;
(2) N298A;
(3) S299A, E334A, 및 K335A; 또는
(4) L235A, L236A 및 P330G.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미하는 것으로, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된 것이다.
본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 항원결합단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
용어, "항원결합단편"은 항원이 결합할 수 있는 부분(예컨대, 본 명세서에서 정의된 6개의 CDR)을 포함하는 모든 형태의 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원결합단편 중, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
본 명세서에서 제공되는　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체는 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 TIGIT의 수용체 결합 도메인과의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해TIGIT의 수용체 결합 도메인에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정할 수 있다.
최종 선택된 항체들은 항원결합부위를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체의 항원결합단편은 상기 항-TIGIT 항체에서 유래하고 항원(TIGIT)에 대한 결합력을 보유하는 단편을 의미하는 것으로, 상기한 항-TIGIT 항체의 6개의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어 scFv, scFv-Fc, scFv-Ck(카파 불변영역), scFv-Cλ(람다 불변영역), (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항원결합단편은 scFv, 또는 scFv가 면역글로불린 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등)의 Fc 부위와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Fc) 또는 경쇄의 불변 영역 (예컨대, 카파 또는 람다)와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Ck 또는 scFv-Cλ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 항체(예컨대, CDR, 가변영역, 또는 중쇄/경쇄, 항원결합단편 등)가 "특정 아미노산 서열을 포함한다, 또는 특정 아미노산 서열로 이루어진다 또는 포함된다" 함은 상기 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 경우, 및 상기 아미노산 서열에 항체 활성 (예컨대, 항원 친화도, 약리적 활성 등)에 유의한 영향이 없는 무의미한 변이(예컨대, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 추가)가 도입된 경우를 모두 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT (e.g., 인간 TIGIT)에 대한 결합 친화도 (KD)가, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance, SPR)으로 측정된 경우를 기준으로, 10mM 이하, 5 mM 이하, 1mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 0.1mM 이하, 0.05mM 이하, 0.01mM 이하, 0.005mM 이하, 또는 0.001mM 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.0001nM 내지 10mM, 0.0005nM 내지 10mM, 0.001nM 내지 10mM, 0.005nM 내지 10mM, 0.01nM 내지 10mM, 0.05nM 내지 10mM, 0.1nM 내지 10mM, 0.5nM 내지 10mM, 1nM 내지 10mM, 0.0001nM 내지 5mM, 0.0005nM 내지 5mM, 0.001nM 내지 5mM, 0.005nM 내지 5mM, 0.01nM 내지 5mM, 0.05nM 내지 5mM, 0.1nM 내지 5mM, 0.5nM 내지 5mM, 1nM 내지 5mM, 0.0001nM 내지 1mM, 0.0005nM 내지 1mM, 0.001nM 내지 1mM, 0.005nM 내지 1mM, 0.01nM 내지 1mM, 0.05nM 내지 1mM, 0.1nM 내지 1mM, 0.5nM 내지 1mM, 1nM 내지 1mM, 0.0001nM 내지 0.5mM, 0.0005nM 내지 0.5mM, 0.001nM 내지 0.5mM, 0.005nM 내지 0.5mM, 0.01nM 내지 0.5mM, 0.05nM 내지 0.5mM, 0.1nM 내지 0.5mM, 0.5nM 내지 0.5mM, 1nM 내지 0.5mM, 0.0001nM 내지 0.2mM, 0.0005nM 내지 0.2mM, 0.001nM 내지 0.2mM, 0.005nM 내지 0.2mM, 0.01nM 내지 0.2mM, 0.05nM 내지 0.2mM, 0.1nM 내지 0.2mM, 0.5nM 내지 0.2mM, 1nM 내지 0.2mM, 0.0001nM 내지 0.1mM, 0.0005nM 내지 0.1mM, 0.001nM 내지 0.1mM, 0.005nM 내지 0.1mM, 0.01nM 내지 0.1mM, 0.05nM 내지 0.1mM, 0.1nM 내지 0.1mM, 0.5nM 내지 0.1mM, 1nM 내지 0.1mM, 0.0001nM 내지 0.05mM, 0.0005nM 내지 0.05mM, 0.001nM 내지 0.05mM, 0.005nM 내지 0.05mM, 0.01nM 내지 0.05mM, 0.05nM 내지 0.05mM, 0.1nM 내지 0.05mM, 0.5nM 내지 0.05mM, 1nM 내지 0.05mM, 0.0001nM 내지 0.01mM, 0.0005nM 내지 0.01mM, 0.001nM 내지 0.01mM, 0.005nM 내지 0.01mM, 0.01nM 내지 0.01mM, 0.05nM 내지 0.01mM, 0.1nM 내지 0.01mM, 0.5nM 내지 0.01mM, 또는 1nM 내지 0.01mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합), 경쇄 상보성 결정 부위 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 또는 이들의 조합), 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다.
상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디, 나노바디, 등), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체의 구성 성분 (예컨대, CDR 또는 가변영역)으로 포함될 수 있다.
용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용할 수 있다.
용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하고, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.
용어 "다중 결합 항체" (이중 결합 항체를 포함하는 의미임)는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 TIGIT에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 제공되는 TIGIT에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편은 유용한 중합체, 표지물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 접합된 접합체 (conjugate) 형태로 사용될 수 있다.
상기 유용한 중합체는, 예를 들어, 폴리펩타이드, 항체, 및/또는 항원결합단편의 체내 반감기를 증가시켜 주는, 단백질 이외의 중합체일 수 있으며, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는 PEG), 덱스트란, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 친수성 중합체를 예시할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 표지물질은, 희토류 킬레이트제, 플루오레스세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민,　152Eu, 댄실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 아에쿠오린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 안정한 유리 라디칼 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 또는 화학발광성 소분자 화합물(chemical), 방사성동위원소 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
의약 용도
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용(예컨대, TIGIT과 이의 리간드인 CD155(PVR)와의 상호작용 등)을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 갖는다. 따라서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 면역증강, 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다. 상기 면역증강 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역증강을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물, 방법, 및 용도에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 다른 면역관문 단백질, 예컨대 PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물(길항제)와 함께 병용될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 병용 가능한 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이들 모두일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항-PD-1 항체는 Pembrolizumab, Nivolumab 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "면역증강(또는 면역강화)"은 항원에 대한 초기 면역반응을 유도하거나 기존의 면역반응을 증가시키는 것을 의미할 수 있으며, 면역자극, 면역강화, 면역활성화 등의 용어와 동등한 의미로 호환될 수 있다. 일 예에서, 면역증강은 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인 등) 생산 및/또는 분비 증가 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "면역 관련 질병"은 면역계의 장애 및/또는 불충분한 활성에 의하여 유발되는 모든 질병을 포괄하는 것으로, 예를 들어, 암, 감염질환, 자가면역질환, 염증성질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 폐암 (예컨대, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 흑색종 (예컨대, 피부 또는 안구내 흑색종 등), 직장암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간암, 담관암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 대장암(예컨대, 결장암, 직장암, 결장직장암 등), 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포를 제거(사멸)하는 효과, 암세포의 발생 및/또는 성장을 억제하는 효과, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과 등을 포함한다.
상기 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환은 앞서 설명한 면역 강화(예컨대, 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인(IL-2, IFN-gamma 등) 등) 생산 및/또는 분비 증가 등)에 의하여 치료, 완화, 및/또는 예방 가능한 모든 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환 중에서 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충과 같이　질병을 일으키는 병원체가 생물체(예, 인간을 포함하는 동물) 내에 전파, 침입하여 발생하는 질병을 총칭하는 것으로, 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원체의 감염 또는 상기 감염으로 인한 질병(감염증)일 수 있다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트 증후군, 루푸스, 쇼그랜 증후군, 중증근무력증, 경피증, 갑상선기증저하증, 갑상선기능항진증, 건선, 백반증, 다발성경화증, 자가면역성 간염, 자가면역성 신장염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 뇌염, 사이토카인 폭풍 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염증성 질환은 염증(예, 만성 염증 또는 급성 염증) 또는 염증으로 인한 질병을 총칭하는 것으로, 예를 들어, 심장 염증(예, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색, 심장막염, 심근염 등), 혈관 염증(예, 죽상경화증, 혈관염, 파종성혈관내응고(DIC), 면역성혈소판감소자반증(ITP), 혈전성혈소판감소자반증(TTP), 빈혈 등), 상기도 염증(예, 급성 비인두염, 알레르기비염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염 등), 하기도 및/또는 폐 염증(예, 기관지염, 기관지확장증, 천식, 만성폐홰성폐질환(COPD), 폐렴, 간질성 폐질환, 결핵 등), 상부 위장관 염증(예, 위염, 식도염 등), 하부 위장관 염증(예, 소장염, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병, 게실염, 과민성대장증후군, 맹장염, 치루 등), 간, 담도 및/또는 췌장 염증(예, 간염, 지방간, 담관염, 담낭염, 췌장염, 제1형 당뇨병 등), 신장(상부요로) 염증(예, 신우신염, 사구체신염, 요로감염증 등), 하부요로 염증(예, 요로감염증, 요관염, 요도염, 방광염, 전립선염/만성골반통증후군 등), 갑상선 및/또는 부갑상선 염증(예, 갑상선염, 부갑상선염 등), 부신 염증(예, 부신염 등), 생식기관 염증(예, 골반내 염증성 질환, 난소염, 고환염, 부고환염 등), 뼈 및/또는 관절 염증(예, 골관절염, 류마티스 관절염, 골수염, 활막염 등), 피부 염증(예, 피부: 연조직염, 단독(Erysipelas), 어루러기, 무좀, 여드름 등), 근육 염증(예, 근염 등), 뇌 염증(예, 뇌염, 주요우울장애 등), 신경 염증(예, 눈, 귀 등 다양한 부위의 신경염, 복합부위 통증 증후군, 길랑-바레 증후군 등), 눈 염증(예, 다래끼, 포도막염, 결막염 등), 귀 염증(예, 중이염, 유양돌기염 등), 구강 염증(예, 구내염, 치주염, 치은염 등), 전신성 염증(예, 전신성 염증반응 증후군(패혈증 등), 대사증후군 관련 질환 등), 복막염, 재관류 손상, 이식거부반응, 과민반응 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편, 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여 대상은 모든 동물 또는 세포일수 있으며, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택되는 동물, 또는 상기 동물로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈청), 또는 이의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 인간 또는 인간으로부터 분리된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈청)일 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 유효성분으로서의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 단백질 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물의 투여는 경구 또는 비경구 경로를 통할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.
또한, 상기 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제, 주사제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분인 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분(항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편)을 기준으로 0.00001 내지 1000㎎/kg, 0.00001 내지 500㎎/kg, 0.00001 내지 100㎎/kg, 0.00001 내지 50㎎/kg, 0.0001 내지 1000㎎/kg, 0.0001 내지 500㎎/kg, 0.0001 내지 100㎎/kg, 0.0001 내지 50㎎/kg, 0.001 내지 1000㎎/kg, 0.001 내지 500㎎/kg, 0.001 내지 100㎎/kg, 0.001 내지 50㎎/kg, 0.01 내지 1000㎎/kg, 0.01 내지 500㎎/kg, 0.01 내지 100㎎/kg, 0.01 내지 50㎎/kg, 0.1 내지 1000㎎/kg, 0.1 내지 500㎎/kg, 0.1 내지 100㎎/kg, 또는 0.1 내지 50㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에서 약학적 유효량은 유효성분이 목적하는 약학적 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 의미하는 것으로, 상기한 투여량 범위일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 발현벡터, 및 항체의 제조
다른 예는 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO S, CHO DXB11, CHO GS-KO, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제조 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 임의로, 배양 배지로부터 항체 또는 항원결합단편을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체(7A6)의 유세포분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 실시예에 따른 키메라 및 인간화 항체의 서열정렬 결과를 보여준다.
도 3a는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 에피토프 맵핑 결과를 보여주고, 도 3b는 TIGIT 단백질의 3차 구조 상의 에피토프 위치를 보여준다.
도 4는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 인간 primary T cell에서의 TIGIT에 대한 결합도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 TIGIT-PVR 차단 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 인간 말초혈액단핵구(PBMCs)에서의 사이토카인(IL-2 및 IFN-gamma) 생산/분비 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 T 세포에서의 사이토카인 생산/분비 효과를 보여주는 그래프로서, 7a는 CD4+ T 세포에서의 결과를, 7b는 CD8+ T 세포에서의 결과를 각각 보여준다.
도 8a 내지 8d는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 T 세포에서의 사이토카인 생산/분비 효과를 보여주는 그래프로서, 8a는 CD4+ T 세포에서의 IL-2 농도, 8b는 CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도, 8c는 CD8+ T 세포에서의 IL-2 농도, 및 8d는 CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도를 각각 보여준다.
도 9a 내지 9d는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 농도에 따른 T 세포에서의 사이토카인 생산/분비 효과를 보여주는 그래프로서, 9a는 CD4+ T 세포에서의 IL-2 농도, 9b는 CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도, 9c는 CD8+ T 세포에서의 IL-2 농도, 및 9d는 CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도를 각각 보여준다.
도 10a 및 10b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 인간 PBMC에서의 T 세포 증식 효과를 보여주는 그래프로서, 10a는 CFSE assay 결과, 10b는 Ki67 assay 결과를 각각 보여준다.
도 11은 Treg 세포 존재 하에서의 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 T 세포 증식 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 및 항-PD1 항체의 병용에 따른 TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 복합 차단 효과를 cell-based NFAT reporter response bioassay로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13a 및 13b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 및 항-PD1 항체의 병용에 따른 TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 복합 차단 효과를 비교항체와의 병용시와 비교하여 보여주는 그래프로서, 13a는 항-PD1 항체로서 pembrolizumab과의 병용 결과이고, 13b는 nivolumab과 병용 결과이다.
도 14a 및 14b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 단독 또는 항-PD1 항체와의 병용시의 인간 T 세포의 사이토카인 생산 결과를 보여주는 그래프로서, 14a는 CD4+ 세포에서의 결과, 14b는 CD8+ 세포에서의 결과를 각각 보여준다.
도 15는 A375 및 SK-OV3 종양 세포주에서의 TIGIT의 리간드인 CD155의 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 16은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 A375 종양(흑색종) 세포주에 대한 세포독성(세포 사멸률)을 보여주는 그래프이다.
도 17a 및 17b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 SKOV-3 종양(난소암) 세포주에 대한 세포독성(세포 사멸률)을 보여주는 그래프이다.
도 18은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 SKOV-3 종양(난소암) 세포주에 대한 세포독성(세포 사멸률)을 보여주는 그래프이다.
도 19는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체를 NK 세포와 공배양시의 SKOV-3 종양(난소암) 세포주에 대한 세포독성(세포 사멸률)을 보여주는 그래프이다.
도 20은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 결장암에 대한 생체 내(in vivo) 항종양 효과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체와 항-PD1 항체의 병용시의 결장암에 대한 생체 내(in vivo) 항종양 효과를 단독 처리시와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 22는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체와 항-PD1 항체의 병용에 따른 종양 미세환경(tumor microenvironment; TME)에서의 면역세포에 대한 효과를 시험한 결과를 보여준다.
도 23은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 간암 환자유래 이종이식 종양에 대한 생체 내(in vivo) 항종양 효과를 보여주는 그래프이다.
도 24는 종양 미세환경(tumor microenvironment;TME)에서의 T cell subset 상의 TIGIT 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 25는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 간암 환자 유래 T 세포에서의 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 폐암 환자 유래 T 세포에서의 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다.
도 27은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 결장암 환자 유래 T 세포에서의 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다.
도 28a 및 28b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT-Fab 단편의 중추 기억 T 세포(도 28a) 및 효과기 기억 T 세포(도 28b)의 활성화(사이토카인 생산)를 보여주는 그래프이다.
도 29는 일 실시예에 따른 항-TIGIT-Fab 단편의 A375 종양 세포에 대한 세포독성(세포 사멸률)을 보여주는 그래프이다.
도 30은 T 세포 서브셋에서의 TIGIT 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 31a 내지 31d는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 처리시의 Tregs, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포의 잔존 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 32는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 처리시의 Tregs 및 NK 세포의 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 33은 NK 세포 존재 하에서 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 처리시의 Tregs 세포의 잔존 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 34a 및 34b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 FcgRIIIA 차단 여부에 따른 T 세포에서의 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다(34a: CD4+ T 세포, 34b: CD8+ T 세포).
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 항-TIGIT 항체의 제작
1.1. 항-TIGIT 단클론 항체의 생성
5 마리의 BALB/c 마우스에 MMB designed 면역원(Ag1585_IMM) 및 인간 TIGIT 단백질(aa22-138; sino biologics, UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)를 19일동안 5회 연속 교차 주입하여 면역화시켰다. 5 마리 마우스로부터 림프구를 수집하고 이를 모아서 정제한 후, SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포는 HAT 선택적 단일-단계 클로닝 배지(HAT selective single-step cloning media)에서 증식시키고, 얻어진 1896개의 하이브리도마 클론을 96-웰 플레이트에 옮겨 담고 배양하였다.
상기 면역원으로 사용된 펩타이드 Ag1585_IMM은 모단백질 내의 접힘 및proximity-based relationships를 잘 반영하도록 모델링된 것으로, 면역원성 단백질의 잠재력을 최대화하여 전장 단백질 내의 대응 에피토프에 대한 완전한 활성을 가지는 항체를 만드는데 유용할 것으로 기대된다. 상기 펩타이드 Ag1585_IMM는 인간 TIGIT의 51번째 아미노산 잔기(T)로부터 70번째 아미노산 잔기(N)까지의 20개 아미노산을 포함하도록 합성하였다. 상기 펩타이드 Ag1585_IMM의 정보를 아래의 표 3에 요약하였다:
Peptide ID Location in Consensus sequence Sequence Secondary Structure RMSD score(Å)
Ag1585_IMM 51-70 TAQVTQVNWEQQDQLLAICN(서열번호 31) β-sheet, turn 0.006
상기 표 3는 모델링된 Ag1585_IMM의 구조적 특징 및 TIGIT 구조(PDB: 5V52)와 정렬한 결과를 나타낸다. 낮은 RMSD score는 정렬이 잘됨을 나타낸다. 상기 펩타이드는 대응하는 면역원 서열에 기초하여 합성하였다. 간접(indirect) ELISA를 이용하여, 면역화 항원인 Ag1585_IMM 및 재조합 인간 TIGIT(His)(sino biologics)에 대하여 효과를 가지는 하이브리도마 조직 배양액의 상청액을 스크리닝하였다. 효과를 가지는 클론(Positive clones)에 대하여 스크리닝 항원(재조합 인간 TIGIT Fc 키메라 단백질(R&D systems, 9464-TG)) 및 포에 대한 indirect ELISA를 추가로 수행하여 Ig 분비 및 특이성을 확인하였다. CHO-K1(ATCC, CCL-61) 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다.
ELISA는 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다;
- ELISA plates는 0.1μg/well의 재조합 인간 TIGIT (rhTIGIT) 단백질을 Carbonate Coating Buffer (pH 9.6) O/N에 100μL/well 농도로 포함하는 코팅액으로 4℃에서 코팅.
- PBS에 포함된 3% skim milk powder로 1시간 동안 실온에서 차단
- PBS-Tween에 포함된 이차항체 1:10000 Goat anti-mouse IgG/M(H+L)-HRP (100uL/well)를 1시간 동안 처리 (37℃, w/shaking).
- 모든 세척 단계는 PBS-Tween으로 3분동안 수행함.
- TMB 기질을 50uL/well 농도로 첨가, 암조건하에 두고(5~10 mins), 동량의 1M HCl로 종료시킴.
이소타이핑(isotyping)에 의하여, IgM 발현 클론을 분리하여 제거하고, IgG 발현 클론들을 수집하였다.
상기 수집된 양성 클론을 서브클로닝하여 안정적인 발현 클론을 확인하였다. 선택된 클론들을 포함하는 배양 상청액을 Protein A 컬럼에 흘려주며 용출시키고, 버퍼를 PBS로 교체하였다. 스크리닝 항원(Recombinant Human TIGIT (T103) Fc Chimera Protein; R&D systems) 및 음성대조군 항원(His peptide)에 대한 indirect ELISA를 수행하여 정제된 항체를 시험하였다.
수집된 양성 클론 중에서 선도 항체로 선별된 클론(7A6)의 결합을 유세포 분석으로 측정하였다. CHO-K1(ATCC, CCL-61) 및 인간 TIGIT 발현 CHO-K1(CHO-K1 TIGIT)(Genscript, M00542) 세포에 트립신을 처리하고, 계수하고, 2x106 cells/ml 농도로 재현탁시키고, Fc block(BD Bioscience 564220)과 함께 30분동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 96-웰에 넣고, 첨가된 항체(single point)를 연속희석 하였다(eight point, 5μg/mL에서 시작하여 3배씩 희석함). CHO-K1 세포(음성 대조군)의 경우, CHO-K1 TIGIT 세포에 대하여 수행된 titration에서의 가장 고농도에 해당하는 5μg/mL의 단일 농도에서 시험하였다. 30분 배양 후, 항-mouse IgG(H+L) Alexa Fluor 647 항체(Sigma A21236) 4μg/mL(protected from light)를 사용하여 항체 결합을 측정하였다. 유세포분석은 AccuriC6 Flow Cytometer를 사용하여 수행하고, 데이터는 FlowJo로 분석하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다.
안정적 발현 클론에 해당하는 하이브리도마 세포 펠렛을 용해시키고, mRNA를 추출하고, 중쇄 및 경쇄의 가변영역 DNA를 시퀀싱 벡터에 클로닝하여 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 분석하였다. 마우스 항 TIGIT 클론(7A6)의 서열을 분석한 결과를 하기의 표 4에 기재하였다.
가변영역 아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열번호
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 9
GATGTGCAGC TTCAGGAGTC GGGACCTGGC CTGGTGAAAC CTTCTCAGTC TCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCACTGGCTA CTCAATCACC AGT GATTATG CCTGGAAC TG GATCCGGCAG TTTCCAGGAA ACAAACTGGA GTGGATGGGC TACATAAGCT ACAGTGGTAG CGCTCGCTAC AACCCATCTC TCAAAAGT CG AATCTCTATC ACTCGAGACA CATCCATGAA CCAGTTCTTC CTGCAGTTGA ATTCTGTGAC TGCTGAGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC AAGA AAGGGG TACCCTGCCT ACTTTGCTTA C TGGGGCCAA GGGACTCTGG TCACTGTCTC TGCA 23
경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISC KASQDVSTAVA WYQQKPGQSPELLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QHHYSTPYT FGGGTKLEMK 15
GACATTGTGA TGACCCAGTC TCACAAATTC ATGTCCACAT CAGTAGGAGA CAGGGTCAGC ATCTCCTGCA AGGCCAGTCA GGATGTGAGT ACTGCTGTAG CCTGGTATCA ACAGAAACCA GGACAATCTC CTGAACTACT GATTTACTCG GCATCCTACC GGTACACTGG AGTCCCTGAT CGCTTCACTG GCAGTGGATC TGGGACGGAT TTCACTTTCA CCATCAGCAG TGTGCAGGCT GAAGACCTGG CAGTTTATTA CTGTCAGCAT CATTATAGTA CTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATGAA A 24
(표 4에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄)
1.2. 마우스 항-TIGIT 클론의 인간화
항체 구조 및 결합에 중요한 아미노산 잔기를 확인인하기 위하여, 단클론항체 가변영역(mAb V regions)의 단백질 구조 모델을 분석하였다. 이러한 정보를 인간 항체 구조의 가상(in silico) 설계와 함께 사용하여, 7A6의 인간화 변이체 제조에 사용 가능한 대규모 예비 서열 단편들을 선별하고, human MHC class II alleles에 대한 펩타이드 결합을 분석하였다. 가능한 경우, human MHC class II에 대하여 유의미한 non-human germline binders로 확인된 서열 단편들은 폐기하였다. 이로 인해 단편들 세트가 감소하였고, 이들 조합을 상기 방법으로 다시 분석하여, 단편들 사이의 접합부가 잠재적 T 세포 에피토프를 포함하지 않음을 확인하였다. 유의미한 T 세포 에피토프를 포함하지 않거나 감소된 완전한 가변영역(V region)이 생성되도록, 선별된 서열 단편들을 조립하여, 잠재적 T 세포 에피토프 인식을 회피하는 인간 가변영역을 설계하였다(탈면역화; deimmunization).
유전자 합성 및 포유류 세포에서의 발현에 사용하기 위하여, 5개 중쇄(VH1 내지 VH5) 및 5개 경쇄(Vκ1 내지 Vκ5) 서열을 선택하였다
하나의 키메라(VH0/Vκ0) 및 25개 인간화 변이체를 포함한 transient transfection에 의하여 생산된 안정한 IgG 항체들(‘○’ 표시)의 아래의 표 5에 요약하였다:
Heavy Chain
% 75.5 83.7 85.7 86.9 88.9 89.9
Light chain VH0 VH1 VH2 VH3 VH4 VH5
66.3 Vκ0 ○
73.7 Vκ1 ○ ○ ○ ○ ○
75.8 Vκ2 ○ ○ ○ ○ ○
77.9 Vκ3 ○ ○ ○ ○ ○
80.0 Vκ4 ○ ○ ○ ○ ○
81.1 Vκ5 ○ ○ ○ ○ ○
(상기 표 5에서, 기재된 수치(%)는 percentage humanness(가장 가까운 매칭 human germline에 대한 상동성(homology) 퍼센트로 결정됨)임).
상기 표 4의 조합의 7A6 클론에 상기 표 5의 조합을 적용한 키메라 항체 (VH0xVκ0) 및 인간화 항체의 서열을 표 6, 표 7, 및 도 2에 나타내었다. 표 6, 표 7, 및 도 2에서, Kabat 정의에 따라 아미노산 서열 넘버링 및 CDR 부위를 결정하고, 도 2에 상기와 같이 결정된 CDR 및 모 서열(VH0 또는 Vκ0)에서 변경된 아미노산 잔기를 음영으로 표시하였다.
중쇄 (불변영역: human IgG1)
아미노산 서열 (N→C) 서열번호
7A6_VH0 가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 9
7A6_VH1 가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSMNQFSLKLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 10
7A6_VH2 가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 11
7A6_VH3 가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 12
7A6_VH4 가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 13
7A6_VH5 가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 14
불변영역(공통) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 21
경쇄 (불변영역: kappa (K, k, 또는 κ로 표시)
아미노산 서열 (N→C) 서열번호
7A6_VK0가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPELLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQHHYSTPYTFGGGTKLEMK 15
7A6_VK1 가변영역 DIVMTQSHSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPELLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEMK 16
7A6_VK2 가변영역 DIVMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 17
7A6_VK3 가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 18
7A6_VK4 가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 19
7A6_VK5 가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 20
불변영역(공통) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 22
상기 제작된 항체 중에서, 7A6 VH3/Vk5 hIgG1 항체의 중쇄의 Fc 영역에 다음의 점변이를 도입하여 Fc-engineered 변이체를 제작하였다:
(1) S240D, A331L, 및 I333E(DLE 변이): 7A6 VH3/Vk5-DLE;
(2) N298A: 7A6 VH3/Vk5 N298A;
(3) S299A, E3334A 및 K335A(AAA 변이): 7A6 VH3/Vk5 AAA; 또는
(4) L235A, L236A 및 P330G(LALAPG 변이): 7A6 VH3/Vk5 LALAPG
상기 Fc-engineered 변이체를 포함하는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 표 8에 기재하였다:
아미노산 서열 (N→C) 서열번호
7A6 VH3/Vk5-DLE 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 25
VH3/Vk5 N298A 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 26
7A6 VH3/Vk5 AAA 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 27
7A6 VH3/Vk5 LALAPG 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 28
7A6 VH3/Vk5 mutant 경쇄 (공통) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 29
(상기 표 8에서, 가변영역은 밑줄로 표시하고, Fc 영역의 변이된 아미노산은 굵은 글씨로 표시함)
1.3. 키메라 및 인간화 IgG1 항체의 임시 발현(Transient expression)
VH0/Vκ0 키메라 항체 코딩 DNA 및 인간화 중쇄 및 경쇄 코딩 DNA의 조합(총 25개 인간화 페어링)을 6-웰 플레이트에서 PEI 트랜스펙션 방법으로 HEK293 EBNA adherent cells(LGC Standards, Teddington, UK) 에 임시 트랜스펙션시킨 후, 7일간 배양하였다. 샘플을 수집하고, 인간 IgG1 항체를 기준으로 하여, Protein A biosensors(Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK)를 사용하여 Octet QK384 상에서 항체 농도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 아래의 표 9에 나타내었다:
Heavy Chain
Light chain VH0 VH1 VH2 VH3 VH4 VH5
Vκ0 16.6
Vκ1 15.4 21.3 20.8 23.5 7.1
Vκ2 18.2 26.1 29.2 32.2 17.9
Vκ3 20.7 27.4 27.1 28.9 16.0
Vκ4 28.4 34.3 35.6 33.3 17.6
Vκ5 18.8 22.8 25.0 25.9 9.9
상기 표 9는 키메라 항체(VH0/Vκ0) 및 다양한 조합의 인간화 항체들의 HEK 세포에서의 발현 후의 상등액 내의 IgG 농도(μg/mL)를 보여준다.
표 9에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 항체들이 잘 발현하였고, 특히 VH5Vκ1 및 VH5Vκ5를 제외한 모든 인간화 변이체는 VH0/Vk0 키메라 항체보다 잘 발현하였다.
1.4. 키메라 및 인간화 변이체의 Single cycle kinetic analysis
인간 TIGIT 항원에 대한 모든 변이체의 결합을 평가하고 키메라 항체(VH0Vκ0)에 가장 가까운 친화력을 가진 선도 인간화 IgG 항체들을 선택하기 위하여, 형질감염된 세포의 배양물의 상등액 상에서 single cycle kinetic analysis(cartoon)을 수행하였다. 동력학 시험은 25°C에서 Biacore T200 Control software V2.0.1 및 Evaluation software V3.0을 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다.
reference surface에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위하여, 1% BSA w/v(Sigma, Dorset, UK)이 보충된 HBS-P+(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 running buffer로 사용하고, 리간드와 분석물 희석에도 사용하였다. IgG를 포함하는 상등액을 running buffer에서 1μg/mL까지 희석하였다. 각 사이클의 개시 시에, 항체를 anti-human sensor chip(GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 상의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. IgG 항체를 10 μl/min 유속으로 캡쳐하여 고정화 수준(immobilization level; RL)이 ~208 RU가 되도록 하였다. 그 후, 표면이 안정화되도록 두었다.
잠재적 질량전달효과(mass transfer effects)를 최소화하기 위하여 40μl/min 유속으로 주입된 재조합 인간 TIGIT(Sino Biological)을 분석물(analyte)로 사용하여 Single cycle kinetic 데이터를 얻었다. 항원은 running buffer에 1.25 nM 내지 10 nM 농도 범위에서 2배씩 희석(4개 지점)하고 각 농도 사이에 regeneration이 없게 하여 사용하였다. 항원 농도가 증가하는 4개 지점의 각각의 주입에 대해 210초 동안 association phases를 모니터링하고, 마지막 항원 주입 이후 900초 동안 single dissociation phase를 측정하였다. 3 M MgCl2의 single injection에 의하여 센서칩 표면을 재생시켰다.
double referenced sensorgrams을 Langmuir(1:1) binding model과 함께 장착하였으며, 이 때, 상기 모델에 대한 데이터의 적합성은 실험적으로 얻어진 곡선 및 적합 곡선(fitted curve; 관찰 및 예상) 간 편차를 설명하는 Chi 제곱값(Chi square value)을 사용하여 평가하였다. 상기 fitting algorithm은 Chi 제곱값을 최소화하려고 한다. 상기 1:1 model fitted curves로부터 결정된 kinetic constants를 표 10에 나타내었다.
Antibody ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)* Relative KD RMAX Chi²(RU²)
VH0Vκ0 2.46E+06 1.60E-03 6.52E-10 1.00 32.4 0.0604
VH1Vκ1 2.33E+06 1.29E-03 5.54E-10 0.85 25.2 0.012
VH1Vκ2 1.80E+06 1.46E-03 8.11E-10 1.24 28.8 0.0374
VH1Vκ3 1.89E+06 1.82E-03 9.63E-10 1.48 27.2 0.0306
VH1Vκ4 1.91E+06 1.67E-03 8.76E-10 1.34 25.4 0.0175
VH1Vκ5 1.80E+06 1.29E-03 7.17E-10 1.10 33.9 0.0428
VH2Vκ1 2.36E+06 1.68E-03 7.15E-10 1.10 25.5 0.0234
VH2Vκ2 1.65E+06 1.58E-03 9.61E-10 1.47 28.4 0.0214
VH2Vκ3 1.49E+06 1.34E-03 8.97E-10 1.38 31.2 0.0198
VH2Vκ4 1.75E+06 1.81E-03 1.03E-09 1.58 31.9 0.0333
VH2Vκ5 1.72E+06 1.30E-03 7.54E-10 1.16 27 0.00959
VH3Vκ1 2.17E+06 1.55E-03 7.15E-10 1.10 24.6 0.0188
VH3Vκ2 1.80E+06 1.73E-03 9.63E-10 1.48 25.1 0.00968
VH3Vκ3 1.66E+06 1.50E-03 9.03E-10 1.38 26.4 0.0168
VH3Vκ4 1.63E+06 1.96E-03 1.20E-09 1.84 29.8 0.0317
VH3Vκ5 1.85E+06 1.61E-03 8.71E-10 1.34 25.1 0.0123
VH4Vκ1 1.73E+06 1.07E-03 6.16E-10 0.94 27.4 0.0479
VH4Vκ2 1.75E+06 1.85E-03 1.06E-09 1.63 29.4 0.025
VH4Vκ3 1.85E+06 1.75E-03 9.44E-10 1.45 27.2 0.0644
VH4Vκ4 1.49E+06 1.92E-03 1.29E-09 1.98 30.1 0.0209
VH4Vκ5 1.76E+06 1.62E-03 9.22E-10 1.41 24.5 0.0117
VH5Vκ1 1.45E+06 1.24E-03 8.58E-10 1.32 30.5 0.008
VH5Vκ2 1.23E+06 2.04E-03 1.66E-09 2.55 28.2 0.026
VH5Vκ3 1.25E+06 1.89E-03 1.51E-09 2.32 34.1 0.0257
VH5Vκ4 1.19E+06 1.81E-03 1.52E-09 2.33 29.3 0.022
VH5Vκ5 1.36E+06 1.70E-03 1.25E-09 1.92 33 0.007
표 10은 Biacore T200을 사용하여 측정된 인간 TIGIT 항원에 결합하는 키메라 항체(VH0/Vκ0) 및 인간화 변이체(세포 배양 상등액으로 시험)의 Single cycle kinetic parameters를 보여준다. relative KD는 인간화 변이체의 KD를 동일한 실험에서 분석된 VH0/Vκ0 키메라 항체의 KD로 나누어 계산하였다.
표 10에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 인간화 변이체(항체)들의 인간 TIGIT에 대한 결합과 관련된 KD 값은 VH0/Vk0 대비 2.55 배 이내로 높게 나타났다. 상대적 발현 수준, humanness의 퍼센티지, 및 relative KD 값(상등액에 대한 Biacore single cycle kinetics analysis으로 얻어짐)을 고려하여, 6개 인간화 변이체(VH2/Vκ5, VH3/Vκ4, VH3/Vκ5, VH4/Vκ4, VH4/Vκ5 및 VH5/Vκ5)를 선택하여 이후 열안정성 분석에 사용하였다.
1.5. 열안정성 평가(Thermal Stability assessment)
본래 상태에서 변성 상태로 언폴딩(unfolding)되는 온도로부터 항체의 열안정성 정보를 얻기 위하여, Thermal ramp stability experiment(Tm 및 Tagg)를 수행하였다. 이러한 언폴딩 과정은 좁은 온도 범위에서 발생하며, 이러한 전이의 중간 지점을 '용융 온도' 또는 'Tm'이라고 한다. 이 때 단백질이 형태적 변화를 겪으므로, Sypro Range(단백질의 노출된 소수성 영역에 결합함)의 형광을 측정하여, 단백질의 용융 온도를 결정하였다.
샘플들을 PBS에서 최종 시험 농도인 0.5mg/ml까지 희석하고, SyproTM Orange(160x Stock 용액; Sigma-Aldrich)를 20x solution의 최종 농도로 첨가하였다. 각 샘플 혼합물은 9μL씩 UNi microcuvettes에 두번씩 로딩하였다. 샘플에 대하여 15~95°C의 thermal ramp를 실시하였다(ramp rate of 0.3 °C/minute and excitation at 473 nm). 250 내지 720 nm에서 전체 방출 스펙트럼을 측정하였으며, 510 - 680 nm 사이의 곡선 아래 면적을 사용하여 전이 곡선의 변곡점(Tonset 및 Tm)을 계산하였다. 473 nm에서 static light scattering(SLS)을 모니터링하여 단백질 응집을 검출하였고, Tagg(응집 개시)는 결과 SLS 프로파일로부터 계산하였다. 데이터 분석은 UNcle™ software version 4.0(ABZENA)을 사용하여 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 아래의 표 11에 나타내었다:
Antibody Tm1(°C) Tonset1(°C) Tagg1(°C)(473nm)
Average SD Average SD Average SD
VH0Vκ0 70.0 0.59 61.9 0.01 80.2 0.43
VH2Vκ5 68.8 0.32 60.8 0.89 79.6 0.34
VH3Vκ4 68.3 0.21 60.5 0.35 79.6 0.20
VH3Vκ5 67.4 0.22 60.0 0.07 76.4 0.16
VH4Vκ4 67.6 0.11 60.2 0.15 78.8 0.15
VH4Vκ5 67.7* N/A 60.2* N/A 76.3 0.08
VH5Vκ5 67.8 0.21 60.6 0.3 77.6 0.18
상기 표 11은 UNcle biostability platform을 사용하여 얻어진 열안정성 수치를 보여준다. 표 11에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 인간화 항체는 키메라 항체와 유사한 수준의 열안정성을 나타내었다.
1.6. multi-cycle kinetic analysis을 이용한 인간화 변이체의 친화도 측정
키메라 항체와 6개 선도 인간화 변이체들(VH2/Vκ5, VH3/Vκ4, VH3/Vκ5, VH4/Vκ4, VH4/Vκ5 및 VH5/Vκ5)의 인간 TIGIT 항원에 대한 결합 친화도를 측정하기 위하여, 정제된 단백질(항체)에 대한 multi-cycle kinetic analysis를 수행하였다. Kinetic experiments는 25°C에서 Biacore T200 Control software V2.0.1 및 Evaluation software V3.0를 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다.
1% BSA w/v(Sigma, Dorset, UK)이 보충된 HBS-P+(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 running buffer로 사용하고, 리간드와 분석물 희석에도 사용하였다. 정제된 선도 항체들을 running buffer에서 1μg/mL까지 희석하고, 각 사이클의 개시 시에, anti-human IgG CM5 sensor chip(GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 상의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. 항체들을 10 μl/min 유속으로 캡쳐하여 고정화 수준(RL)이 ~150 RU가 되도록 하였다. 그 후, 표면이 안정화되도록 두었다.
잠재적 mass transfer effect를 최소화하기 위하여 50μl/min 유속으로 주입된 재조합 인간 TIGIT(acrobiosystems, China)을 analyte로 사용하여 Multi-cycle kinetic 데이터를 얻었다. 항원(TIGIT)은 running buffer에 0.406 nM 내지 30 nM 농도 범위에서 2배씩 희석(7개 지점)하였다. 각 농도 사이에 regeneration이 없게 하여 사용하였다. 각 농도에서, 240초 동안 association phases를 모니터링하고, 900초 동안 dissociation phase를 측정하였다. 3 M MgCl2를 2회 injection하여 사이클 사이에 센서칩 표면 재생을 수행하였다. kinetic cycles에 걸쳐 표면과 analyte 모두의 안정성을 확인하기 위하여, blank의 다회 반복 및 단일 농도의 analyte의 반복을 kinetic run으로 프로그래밍하였다.
상기 얻어진 결과 중 키메라 항체(VH0/Vκ0)와 VH3/Vκ5 항체에 대한 결과를 대표로 표 12에 나타내었다:
Antibody Analyte ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) RMAX Chi2(RU2)
VH0/Vk0 hTIGIT 2.28E+06 1.76E-04 7.70E-11 28.2 0.425
VH3/Vk5 hTIGIT 2.04E+06 1.77E-04 8.67E-11 26 0.246
상기 표 12는 1:1 model fitted curves로부터 결정된 kinetic constants를 보여준다. 표 12에 나타난 바와 같이, 인간 TIGIT 단백질에 대한 결합친화도(KD)는 항체 7A6 VH0Vk0의 경우 77 pM이고 항체 VH3/Vk5의 경우 86.7 pM로, 서로 유사한 수준을 나타내었다.
1.7. 에피토프 맵핑
펩타이드 질량 핑거프린트(Peptide mass fingerprint) 및 H/D 교환(hydrogen/deuterium exchange)을 통하여 항체의 에피토프를 확인하였다.
TIGIT 및 TIGIT과 항체 7A6 Vh3/Vk5의 혼합물에서 중수소 원자의 혼입(incorporation)을 검출하기 위하여, 샘플들의 펩타이드 질량 핑거프린트(Peptide mass fingerprint; PMF)를 최적화 하였다. 단백질 분해 및 크로마토그래피 동안 발생할 수 있는 중수소 원자의 역교환을 제한하기 위한 quenched conditions 하에서 단백질 샘플들의 펩신 단백질 분해를 수행하였다.
TIGIT(서열번호 30; NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)(15μM, 150μl) 용액 및 TIGIT과 Vh3Vk5의 혼합물 TIGIT:Vh3Vk5 = (15μM:30μM, 150μl)을 준비하였다. 상기 단백질 샘플 4 μl를, exchange experiment용으로 Labeling buffer(5mM K2HPO4; 5mM KH2PO4, D2O pH 6.6) 56 μl와 혼합하고, control experiment용으로 equilibration buffer(5mM K2HPO4; 5mM KH2PO4, pH7.0) 56 μl와 혼합하였다. 15X 희석된 용액(60 μl, TIGIT: Vh3Vk5; 1 μM:2 μM)을 15초, 60초, 180초, 600초, 1800초, 및 7200초 동안 배양하고, quench solution(50mM K2HPO4; 50mM KH2PO4; GuCl 2.0 M, TCEP 200 mM, pH 2.3, 0°C) 50 μl을 상기 단백질 샘플에 20초 배양 시간 동안 첨가하였다. 배양 후, 상기 quenched 단백질 용액 80μl를 15°C에서 5분간 단백질분해성 펩신 컬럼에 즉시 주입하였다. 단백질분해 후, MSe Xevo-G2-XS 분석 전에, C18 chromatography(HDX Manager Waters)를 사용하여 생성된 펩신 펩타이드를 액체크로마토그래피로 분석하였다. 이들 시험은 3회 반복 수행하였다.
DynamX3.0 software를 사용하여 H/D 교환 펩타이드를 분석하였다. 중수소 수준은 높은 신뢰도 및 중간 신뢰도의 모든 결과의 평균을 고려하여 결정하였다. 중수소화(deuteration) 수준은 실험적 동위원소 클러스터의 centroid를 기초로 계산하였다.
HDX-MS 분석 결과에서, TIGIT 단백질을 7A6 VH3/Vk5과 함께 또는 단독으로 배양 시의 TIGIT 내의 중수소 incorporation 간 상당한 차이가 확인되었다. 중수소 incorporation에 있어서의 주요 차이는 7A6 Vh3Vk5의 에피토프 영역인 아미노산 잔기 51-70(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; 서열번호 31)에서 관찰되었다.
상기 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 도 3a는 상기 얻어진 HDX-MS 분석 결과를 보여주고(TIGIT의 51-70(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; 서열번호 31) 부위의 중수소 incorporation 수준이 높게 나타남), 도 3b는 TIGIT 리본 구조를 모식적으로 나타내는 것으로, 위쪽은 평면도(top view), 아래쪽은 측면도이고, 에피토프 부위는 화살표로 표시되어 있다.
1.8. 임시 항체 발현 및 선도 인간화 항체의 정제
7A6 VH3/Vk5의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 클로닝 벡터 구축용 측면 제한효소 부위와 함께 합성하였다. 합성 서열의 중쇄 및 경쇄를 적절한 제한 효소(중쇄: Mlu I and Sal I(New England Biolabs); 경쇄: BssH II and BamH I(New England Biolabs))로 처리하고, 동일한 제한효소로 처리된 인간의 IgG1 불변영역을 포함하는 발현 벡터에 라이게이션시켰다. 중쇄 및 경쇄 cDNA 구조체의 모두 시퀀싱하였다. CHO 세포에서 transient transfection을 위한 DNA를 준비하기 위하여 Giga prep을 수행하였다. 상기 Giga prep은 PureLink™ HiPure Expi Plasmid Gigaprep Kit(Thermo Fisher Scientific, K210009XP)를 사용하여 수행하였으며, 상기 Gigaprep Kit은 plasmid DNA 를 E.coli 에서 증폭시킨 후 anion exchange chromatography를 이용하여서 purification 하는 kit이다. 동물성분 불포함 및 혈청 불포함 배지(CD CHO Medium, Thermofisher)를 사용하여 CHO 세포(Evitria)를 배양하였으며, 생산된 항체를 MabSelect™SuRe™를 사용하여 Protein A 정제법으로 배양 상등액으로부터 정제하였다. SEC(size exclusion cromatography) 정제를 연속적으로 실시하여 95% 이상의 순도를 달성하였다. 정제된 항체는 280nm에서의 흡광도 측정 및 SDS-PAGE로 특성 확인하였다.
1.9. 인간 primary T cell에서의 TIGIT에 대한 특이성 및 결합도
APEX™ antibody labeling kit(Invitrogen)를 사용하여 제조자 지침에 따라서, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체를 Alexa Fluor®488(AF488)와 접합시켰다. 자성비드(EasySep™)를 사용하여 인간 PBMCs로부터 T 세포를 분리하고, 다양한 농도의 표지된 항-TIGIT 항체(항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체; 50, 250, 750, 1250 및 2500 ng/ml)와 함께 배양하였다. 결합은 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 측정하고, 얻어진 데이터는 Flowjo software(TreeStar, Inc)를 사용하여 분석하였다. 상기 항-TIGIT 항체의 결합을 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 시험된 항-TIGIT 항체는 primary T cell에 결합하며, TIGIT 분자(per cell)에 대한 결합은 항-TIGIT 항체 농도가 증가할수록 증가하였다.
참조예: 비교 항체(reference antibodies)의 준비
하기 실시예에 비교예로 사용된 비교 항체들(Reference antibodies)을 각각 대응하는 특허에 기재된 서열정보를 기초로 만들거나 제조사로부터 입수하였다. 각 항체들의 대응 특허 또는 제조사를 아래에 요약하였다:
22G2(BMS): US2016/0176963 A1,
31C6(Merck): WO2016/028656 A1,
4.1D3(Genentech): WO2017/053748 A2,
TIG1(Arcus): WO2017/152088 A1,
313M32(Mereo): US2016/0376365 A1,
Tiragolumab(Roche): CrownBio로부터 입수,
10A7(Genentech): Creative Biolabs으로부터 입수,
MBSA43: eBioscience로부터 입수,
Pembrolizumab 및 Nivolumab: InvivoGen으로부터 입수.
실시예 2. 항-TIGIT 항체의 Cell-based reporter assay에 의한 생물학적 활성 측정
항-TIGIT 항체의 TIGIT과 이의 리셉터인 poliovirus receptor (PVR)와의 상호작용에 대한 차단 효과(TIGIT-PVR blocking effect)를 cell-based NFAT reporter response bioassay(Promega)로 분석하였다. TIGIT 이펙터 세포(Promega)를 cell assay buffer(90% RPMI 1640/10% FBS)에 첨가하고, 상기 TIGIT 이펙터 세포를 포함하는 세포 현탁액을 37°C에서 16시간 동안 배양하였다. 항-TIGIT 항체(7A6 VH3/Vk5) 또는 비교 항체를 PBS 버퍼에 준비하고, 상기 미리-배양된 세포 현탁액에 첨가하였다. CD155 aAPC/CHO-K1 세포(Promega)를 상기 세포와 항체 함유 혼합물에 첨가하고, 37°C에서 6시간동안 배양하였다. Promega™ GloMax® Plate Reader로 발광 정도를 측정하였다. curve fitting software(GraphPad Prism® software)를 사용하여 항체반응의 EC50 값을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체의 TIGIT-PVR 차단에 의하여 T 세포 활성화 신호가 증가하였다. 본원의 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체는 BMS(22G2), Arcus(TIG1), Genentech(4.1D3), 및 Mereo(313M32)와 같은 비교 항체 대비 상당히 높은 효과(상당히 낮은 EC50 수치)를 보였다.
실시예 3: 항-TIGIT 항체의 사이토카인 생산 효과
3.1. 인간 PBMCs 및 종양 침윤 림프구의 준비
말초혈액 단핵세포(PBMC)는 성인(whole blood leukocyte cones, NHS Blood and Transplant, UK)에게서 얻거나 STEMCELL Technologies로부터 구입하였다. 간세포암(hepatocellular carcinoma; HCC) 환자 및 건강한 정상 공여자에 대하여 “Centre for Liver and Gastrointestinal Research, University of Birmingham, UK”의 적절한 윤리검토 및 사전 동의 후 본 실시예의 시험을 진행하였다. HCC 환자로부터 얻은 간조직으로부터 PBMC와 간 유래 림프구를 준비하였다. 0.5-1cm의 hepatic needle biopsy로부터 간 침윤 림프구(Liver-infiltrating lymphocytes)를 분리하였다. 그 후, 상기 조직을 Dounce tissue grinder를 사용하여 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(GIBCO) 2-3 ml 내에서 균질화시켰다. 흑색종, 난소암, CRC(Colorectal cancer), HCC, NSCLC(non-small cell lung cancer), 췌장암 환자의 PBMC를 Cureline, Inc.로부터 입수하였다. 상기와 같이 얻어진 암환자의 간 침윤 림프구와 PBMC에 대하여 다음 분석을 수행하였다.
3.2. 인간 PBMCs에서의 사이토카인 생산 측정
3.2.1. 항-TIGIT 항체에 의한 인간 PBMCs의 사이토카인 분비 증가 확인
PBMCs를 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체(2ug/ml 및 10ug/ml) 존재 하에서 항-CD3 항체와 함께 배양하였다. 항-TIGIT 항체를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 배양 후, 샘플들을 400xg에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하여 multiplex immunoassay에 사용하였다. 사이토카인 농도는 Bio-Plex cytokine assay(Human cytokine Assay including IFN-gamma, IL-2)로 측정하였다. 모든 분석은 제조자 지침에 따라 수행하고, 결과는 Bio-Plex 200 array reader(Bio-Rad)를 사용하여 읽었다.
상기 얻어진 결과(IFN-gamma 및 IL-2 농도)를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는 인간 PBMCs에서의 Th1/Tc1 사이토카인 분비를 유의미한 수준으로 유발하였다. 본 명세서 및 도면에서 다르게 기재되지 않은 한, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5-IgG1을 항-TIGIT 7A6 항체 또는 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체로 표시되어 있다.
3.2.2. 항-TIGIT 항체에 의한 인간 T 세포에서의 사이토카인 생산의 증가 확인
인간 T 세포(CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)에서의 사이토카인 생산을 측정하였다. 세포(500,000 cells/reaction)를 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체의 존재 하에서 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences, cat no. 555336; 0.2ug/ml) 및 항-CD28 단클론 항체(BD Biosciences, cat no 555725; 1ug/ml)와 함께 배양하였다. 배양 후, 세포들을 4℃에서 10분간 400xg에서 스핀다운하고, T 세포 내의 사이토카인 농도를 측정하였다. 이를 위하여 다음의 방법으로 세포 내 사이토카인을 염색하였다: 세포를 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution(Biolegend)으로 염색하고, 30분 동안 얼음 위에서 CD4+ and CD8+ T 세포 표면 마커에 대한 플루오로포어(fluorophore)-접합 항체로 표지하였다. 이 때 사용된 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체 (이상, CD4+ 및 CD8+ T 세포 표면 염색에 사용됨), 항-IL-2 항체, 항-IFNg 항체, 및 항-TNFa 항체는 모두 Biolegend에서 입수하였다.
eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(eBiosciences)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 세포를 고정화하고 침투화시켰다(permeabilized). 상기 세포를 세포 내 IL-2, IFNγ 및 TNFα에 대한 플루오로포어-접합 항체(Biolegend) 로 염색하였다. 상기 세포들을 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 분석하고, 데이터는 Flowjo software(BD Biosciences)로 분석하였다.
상기 결과를 도 7a (CD4+ T 세포) 및 7b(CD8+ T 세포)에 나타내었다. 도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 본원의 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는 T 세포 내에서의 Th1/Tc1 사이토카인(IL-2, IFN-gamma) 생산 증가시키고, 이를 통하여 면역반응을 강화시킴을 확인하였다. 상기 얻어진 결과는 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체가 강력하고 용량-의존적인 이펙터 T 세포 기능 증진 효과를 가짐을 시사한다.
3.3. 항-TIGIT 항체와 비교항체들 간의 효능 비교
3.3.1. 항-TIGIT 항체의 항-PD1 약물 대비 증진된 면역 강화 효과 확인
사이토카인 생산에 대한 항-TIGIT 항체의 면역학적 효과를 실시예 3.2.2에 기재된 방법으로 측정하였다. 비교를 위하여, 비교항체로서 항-PD1 항체인 pembrolizumab(‘Pem analog’로 표시) 및 nivolumab(‘Niv analog’로 표시)를 사용하였다. 상기 분석은 항-TIGIT 항체 또는 항-PD1 항체를 처리한 후 유세포분석을 수행하여 진행하였다. 항-PD-1항체와 항-TIGIT 항체는 각각 10ug/ml씩 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 8a(CD4+ T 세포에서의 IL-2 농도), 8b(CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도), 8c(CD8+ T 세포에서의 IL-2 농도) 및 8d(CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도)에 나타내었다. 상기 도 8a-d에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는, pembrolizumab 또는 Nivolumab와 비교하여, 높은 수준으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포 활성화를 유도하였다.
3.3.2. 항-TIGIT 7A6 항체의 항-TIGIT 비교항체 대비 증진된 Th1/Tc1 사이토카인 생산 효과 확인
T 세포를 다양한 농도(2ug/ml, 5ug/ml, 10ug/ml)의 항-TIGIT 항체와 함께 배양한 후, 실시예 3.2.2에 기재된 방법으로 사이토카인 생산을 측정하였다. 비교를 위하여 사용된 항-TIGIT 비교항체들은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 얻어진 결과를 도 9a(CD4+ T 세포에서의 IL-2 농도), 9b(CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도), 9c(CD8+ T 세포에서의 IL-2 농도) 및 9d(CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 농도)에 나타내었다. 도 9a-d에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 7A6V H3/Vk5 항체는 Th1/Tc1 IFN-gamma 및 IL-2 사이토카인 생산 증가시키고, 이를 통하여 면역 반응을 강화시키는 것을 확인하였다. 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는, 항-TIGIT 비교항체들 대비, 보다 강력한 사이토카인 생산 증가 효과를 나타냈다.
실시예 4. 항-TIGIT 항체의 T 세포 증식 효과
4.1. 항-TIGIT 항체의 인간 PBMC에서의 T 세포 증식 효과 확인
항-TIGIT 항체(7A6 VH3/Vk5-IgG1 또는 7A6 VH3/Vk5-IgG4) 10ug/ml를 plate-bound 항-CD3 항체(BD Biosciences)(0.2ug/ml), PBMCs(500,000 cells/reaction) 및 Cytostim activator(Miltenyi Biotec)와 함께 공배양하였다. 배양 후, Incucyte® Live-Cell analysis system(Satorius) 상에서 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester) 측정 및 유세포분석기 상에서 Ki67 측정을 각각 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10a(CFSE assay 결과) 및 10b(Ki67 assay 결과)에 나타내었다 (No Stim: cytostim activator와 항체 모두 무처리; Control: 항체 무처리). 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 본원의 항-TIGIT 항체인 7A6 VH3/Vk5-IgG1 및 7A6 VH3/Vk5-IgG4는 모두 T 세포의 증식을 유도하였으며, 이는 상기 항-TIGIT 항체에 의하여 유도되는 면역반응이 장기간 지속될 수 있음을 시사한다.
4.2. 항-TIGIT 항체의 CD8+ T 세포 증식에 대한 T 조절세포 억제 차단 효과 확인
human CD8+ T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec 130-096-495) 및 CD4+ CD25+ CD127- dim reg T cell isolation kit II(130-094-775)를 사용하여 CD8+ T 세포 및 Tregs (T regulatory cells)를 분리하였다. 분리된 CD8+ T 세포를 cell tracker violet proliferation kit(Thermo Fisher)로 염색하고, CD8:Treg 비율이 4:1이 되도록 세포를 시딩하였다. 세포를 CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher)로 활성화시키고, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vκ5 항체 10ug/ml를 적절한 웰에 첨가하였다. 3일째에, 상기 비드를 씻어내고 IL-2(50ng/ml)를 첨가하였다. 7일째에, live/dead(ThermoFisher LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit), CD3, CD8, CD4에 대한 표면 마커 항체(모두 Biolegend로부터 입수)로 세포를 염색하고, 유세포분석기(CytoFlex, Beckman Coulter) 상에서 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, Tregs 첨가시 CD8+ T 세포 증식이 감소하지만, 이러한 CD8+ T 세포 증식 억제는 항-TIGIT 항체에 의하여 차단되었다. 이는 항-TIGIT 항체가 Tregs-매개 CD8+ T 세포 증식 억제를 차단함을 의미한다.
실시예 5. 항-TIGIT 항체와 항-PD1 약물과의 병용에 의한 상승효과
5.1. cell-based reporter assay를 통한 항-TIGIT/항-PD1 항체의 생물학적 특성 평가
항-TIGIT 항체와 항-PD 항체(pembrolizumab 또는 nivolumab)의 병용에 따른 상승효과를 시험하였다. 항-TIGIT 항체와 항-PD 항체의 TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 복합 차단 효과를 cell-based NFAT reporter response bioassay(Promega)로 분석하였다. PD-1+TIGIT+ 이펙터 세포(Promega; 1X105 cells/reaction)를 세포 어세이 버퍼(90% RPMI 1640/10% FBS)에 첨가하고, 상기 PD-1+TIGIT+ 이펙터 세포 함유 세포 현탁액을 37°C에서 16시간동안 배양하였다. PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1 세포(Promega; 4X104 cells/reaction)를 cell recovery medium(90% Ham’s F-12, 10% FBS)에 첨가하여 준비하였다. 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체와 pembrolizumab 또는 nivolumab의 항체 혼합물을 상기 PD-1+TIGIT+ 이펙터 세포(1X105/reaction) 및 PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1 (4X104/reaction) 함유 세포 현탁액에 넣고, 37°C에서 6시간동안 배양하였다. 항-TIGIT 항체 또는 항-PD1 항체 중 하나만 단독 처리한 경우를 대조군으로 하였다. 단독 처리시 항체 사용량은 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)로하고, 병용 처리시에는 항-TIGIT 항체의 사용량은 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml), 항-PD-1 항체 (Pembrolizumab or Nivolumab)의 사용량은 0.02048, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)로 하였다.
배양 후, Bio-Glo Reagent를 넣고 주위온도(ambient temperature)에서 10분동안 배양하였다. 발광 정도는 Promega™ GloMax® Plate Reader로 측정하였다. curve fitting software(GraphPad Prism® software)를 사용하여 항체 반응의 EC50 값을 결정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 항체와 pembrolizumab 또는 nivolumab의 병용에 의한 상승효과가 나타났다.
5.2. 항-PD1/비교항체 조합과 항-TIGIT/항-PD1 항체와의 생물학적 활성 비교
TIGIT-PVR/PD-1-PD-L1 차단을 위한 항-TIGIT 항체 및 항-PD1 항체의 병용 효과를 cell-based NFAT reporter response bioassay(Promega)로 분석하였다. 항-TIGIT 항체(7A6) 또는 항-TIGIT 비교 항체를 실시예 5.1를 참조하여 pembrolizumab 또는 nivolumab와 공배양하였다. 비교를 위하여, 비교항체를 세포 혼합물과 배양하고 동일한 방법으로 처리하였다. 단독 처리시 항체 사용량은 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)로하고, 병용 처리시에는 항-TIGIT 항체의 사용량은 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml), 항-PD-1 항체 (Pembrolizumab or Nivolumab)의 사용량은 0.013, 0.032, 0.082, 0.204, 0.512, 1.28, 3.2, 8, 20 (ug/ml)로 하였다.
상기 얻어진 결과를 도 13a(pembrolizumab과 병용) 및 13b(nivolumab과 병용)에 나타내었다. 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, pembrolizumab 및 nivolumab과 병용한 항-TIGIT 항체는 모두 상기 항-PD1 항체와 항-TIGIT 비교 항체가 병용된 경우와 비교하여 높은 상승 효과를 보였다.
5.3. 면역 T 세포에 대한 항-TIGIT/항-PD1 항체의 면역학적 효과
항-TIGIT/항-PD1 항체의 병용 또는 단독 처리시의 인간 T 세포의 사이토카인 생산을 측정하였다. 항-TIGIT 항체 7A6 VH3/Vk5(2ug/ml)를 pembrolizumab(2ug/ml) 또는 nivolumab(2ug/ml)와 미리 혼합하고, 세포 배양물에 첨가하였다. 실시예 3.2.2를 참조하여 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 14a(CD4+ 세포) 및 14b(CD8+ 세포)에 나타내었다. 상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체와 항-PD1 항체와의 병용에 의하여 인간 primary T cells에서의 Tc1/Th1 사이토카인 생산에 의한 항-종양 활성이 강화되었다.
실시예 6: 항-TIGIT 항체의 종양 세포에 대한 세포독성 평가
6.1. 종양 세포에서의 TIGIT 리간드인 PVR(CD155)의 발현 수준 평가
표적이 되는 종양세포(A375 및 SK-OV3 세포)(ATCC)에 대하여 1:25 희석된 항-CD155 PE-Cy7(Biolegend)을 사용하여 CD155(PVR) 염색을 수행하고 유세포분석기로 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보여지는 바와 같이, A375 및 SK-OV3 종양세포는 TIGIT의 리간드인 CD155를 상당한 수준으로 발현하였다.
6.2. 항-TIGIT 항체의 A375 흑색종 세포에 대한 세포 독성 확인
항-TIGIT 항체(7A6 VH3/Vk5 및 7A6 VH3/Vk5-DLE) 10ug/ml를 PBMC(250,000 cells/reaction) 및 Cytostim(Milteni Biotec)의 존재 하에서 72시간 동안 A375 세포주(멜라노마)(2.5x10e4 cells/reaction)와 항체를 공배양하여 A375 종양 세포에 대한 세포독성을 시험하였다. 항-TIGIT10A7 비교 항체(Genentech)를 비교예로 사용하였다. 또한, 조작된 항-TIGIT 항체(7A6 VH3/Vk5-DLE)에 대해서도 종양 세포에 대한 사멸능을 테스트하였다. 종양 세포 수는 Incucyte® Live-Cell analysis system(Satorius)으로 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 보여지는 바와 같이, 본원의 항-TIGIT 항체인 7A6 VH3/Vk5 및 7A6 VH3/Vk5-DLE 모두 증가된 종양세포 사멸 효과를 나타내었다.
6.3. 항-TIGIT 항체의 난소암 세포에 대한 세포 사멸능 1
SKOV-3 종양(난소암) 세포주에 대한 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체의 세포 사멸능을 확인하기 위하여, 항-TIGIT 항체(10ug/ml) 또는 비교 항체(10ug/ml)의 존재 또는 부재 하에서 SKOV-3 세포(35k cells/well)를 PBMCs 및 CytoStim(1/50)과 함께 공배양 하였다. 이펙터 세포와 타겟 세포의 비율(E:T)은 6:1로 하였다. 비교 항체로 항-TIGIT 항체 Mereo/313M32, BMS/22G2, Genetech/4.1D3, 및 Arcus/TIG1를 사용하였다(참조예 참고). 얻어진 데이터는 Incucyte® Live-Cell analysis system(Satorius) 및 IncuCyte native software를 사용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 17a(배양 시간에 따른 세포 사멸률) 및 17b(84일 배양 후 세포 사멸률)에 나타내었다. 도 17a 및 17b에서 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체의 종양 세포 사멸능 증가가 관찰되었으며, 이러한 종양세포 사멸능은 비교항체들 대비 현저히 높게 나타났다.
6.4. 항-TIGIT 항체의 난소암 세포에 대한 세포 사멸능 2
항-TIGIT 항체(항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 및 7A6VH4/Vk4)(각각 10ug/ml)의 존재 또는 부재 하에서 SKOV-3 cells(35k cells/well)을 분리된 CD8+ T 세포 및 Cytostim과 함께 108일 동안 공배양하여, 상기 항-TIGIT 항체의 SKOV-3 난소암 세포에 대한 세포독성을 시험하였다. 이펙터 세포와 타겟 세포의 비율(E:T)은 3:1로 하여 분석하였다. pembrolizumab를 동일한 방법으로 처리한 군은 대조군으로 하였다. 데이터는 IncuCyte native software를 사용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 18에 나타내었다. 상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 항-TIGIT 7A6VH3/Vk4 항체의 종양 세포 사멸능 증가가 관찰되었으며, 이러한 종양세포 사멸능은 pembrolizumab 대비 현저히 높게 나타났다.
6.5. TIGIT-CD155(PVR) 차단에 의한 NK 세포의 SKOV3 종양세포에 대한 세포독성 증가 확인
분리된 NK 세포를 48시간 동안 IL-15(5ng/ml)를 사용하거나 사용하지 않고 pre-stimulated 시켰다. 상기 NK 세포는 NK isolation kit(NK Cell Isolation Kit, from Miltenyi Biotec (cat. No. 130-092-657)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 human PBMC로부터 분리하였다. 배양 후, 상기 NK 세포(250,000 cells/reaction)를 항-TIGIT 항체(7A6 VH3/Vk5, 7A6 VH4/Vk4, 7A6 VH3/Vk5-DLE)(각각 10ug/ml)의 존재하에서 E:T를 10:1하여 SKOV3 세포(2.5x10e4 cells/reaction)와 함께 48시간 동안 공배양 하였다. 종양세포 개수는 Incucyte® Live-Cell analysis system(Satorius)를 사용하여 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 19에 나타내었다. 상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 시험된 모든 항-TIGIT 항체는 NK 세포의 SKOV3 종양세포 사멸능을 상당히 증가시켰다.
실시예 7: 생체 내(in vivo) 항암 효과 시험
7.1. MC38 결장암 모델에서의 항-TIGIT 항체의 생체 내 효능 시험
인간 PVR 발현 MC38(MC38-hPVR) 종양세포(CrownBio)를 37°C 및 5% CO2 대기 조건에서 10% FBS(fetal bovine serum)가 보충된 DMEM + 4ug/ml 퓨로마이신 배지에 체외(in vitro) 보관하였다. 대수기(exponential growth phase)의 세포를 수확하고, 종양세포 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다.
　C57BL6 hTIGIT knock-in mouse(GemPharmatech Co.,Ltd)의 우측 뒤편 옆구리 부분에 상기 준비된 종양세포 용액 (2x105 tumor cells in 0.1 mL of PBS solution)을 피하 접종하고 종양을 성장시켰다. 종양 평균 크기(부피)가 80-100 mm3이 된 때 무작위화(randomization)를 수행하였다. 본 시험에 총 15마리의 마우스를 사용하였고, 이들을 무작위로 3개 군으로 나누었다(5 mice/group).
종양 세포 접종 후, 상기 동물들의 병적 상태 및 사망률을 매일 체크하고, 무작위화 후 1주에 3회씩 체중 증가/감소를 측정하였다. 사망률과 관찰된 임상적 증상들을 각 동물 별로 매일 기록하였다. 종양 크기(부피)는 무작위화 후 1주에 3회씩 caliper를 사용하여 2차원으로 측정하고, 다음 수식으로 계산하였다:
V(mm3) = (L x W x W)/2
[V는 종양 부피(mm3), L은 종양 길이(종양의 장축 길이), W는 종양 넓이(L의 수직 중 가장 긴 길이)].
투여와 종양 크기 및 체중 측정은 Laminar Flow Cabinet에서 수행하였다. 체중과 종양 크기는 StudyDirectorTM software(version 3.1.399.19)를 이용하여 측정하였다.
그룹핑 직후 항체 또는 비히클 처리를 진행하였다. PBS 용액을 비히클로 사용하고(대조군; 그룹 1), CHO 세포에서 생산된 7A6 VH3/Vk5 및 Tiragolumab는 각각 20mg/kg 용량으로 처리하였다(각각 그룹 2 및 그룹 3) (표 13 참조).
Group Treatment Dose Level
(mg/kg)		 Dosing Solution
(mg/mL)		 Dosing Volume
(μL/g)		 ROA Dosing Frequency
& Duration
1 Vehicle - - 10 i.p. BIW x 3 weeks
2 7A6 VH3/Vk5 20 2 10 i.p. BIW x 3 weeks
3 Tiragolumab 20 2 10 i.p. BIW x 3 weeks
BIW: Bi-weekly(twice a week)
i.p.: intraperitoneal injection
상기 항체들의 투여군(그룹 2 및 3 해당; 20 mg/kg의 용량, i.p. 투여) 모두 시험 기간 동안 체중 감소가 관찰되지 않았다.
상기와 같이 측정된 마우스의 종양 크기를 도 20에 나타내었다.
도 20에서 보여지는 바와 같이, 항체 처리 후 21일째에, 7A6 VH3/Vk5 항체는 대조군(PBS) 대비 현저한 종양 성장 억제 효과를 나타내었다. 시험군 간의 MC38 종양 크기를 matching day에 unpaired t-test로 분석하면, 대조군 대비 7A6 VH3/Vk5 항체에 의한 종양 성장 억제 효과는 9일째(p-value, 0.029) 및 21일째(p-value, 0.007)에 특히 현저하게 나타났다. 7A6 VH3/Vk5 항체(그룹 2)는 또한 비교항체인 Tiragolumab(그룹 1)과 비교해서도 우수한 항종양 효과를 나타내었다(예, 21일째, p-value, 0.013).
종양 성장 억제(ΔTGI)는 Mean % ΔInhibition으로 계산하였다:
ΔTGI(Mean % ΔInhibition) =((mean(C)-mean(C0))-(mean(T)-mean(T0))) /(mean(C)-mean(C0)) * 100%
[T: 시험군의 측정 시점의 종양 크기,
T0: 시험군의 최초 종양 크기,
C: 대조군의 측정 시점의 종양 크기,
C0: 대조군의 최초 종양 크기]
7A6 VH3/Vk5 항체의 종양 성장 억제(TGI)는 67.9%였으며, Tiragolumab(TGI=55.2%)과 비교하여 상승된 억제 효과를 나타내었다.
7.2. CT26 결장암 모델에서의 항-TIGIT 항체와 항-PD1 항체의 병용 처리에 의한 상승된 체내 항암 효능 시험
CT-26 종양 세포(CrownBio)를 37°C 및 5% CO2 대기 조건에서 10% FBS가 보충된 RPMI1640 배지에 체외(in vitro) 보관하였다. 대수기(exponential growth phase)의 세포를 수확하고, 종양세포 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다.
BALB/c hPD-1/hTIGIT double knock-in mouse(GemPharmatech Co.,Ltd)의 우측 뒤편 옆구리 부분에 상기 준비된 종양세포 용액 (5x105 tumor cells in 0.1 mL of PBS solution)을 피하 접종하고 종양을 성장시켰다. 종양 접종일을 "Day 0"으로 하였다. 종양 평균 크기(부피)가 70-100 mm3이 된 때 무작위화(randomization)를 수행하였다. 본 시험에 총 30마리의 마우스를 사용하였고, 이들을 무작위로 5개 군으로 나누었다(6 mice/group).
종양 세포 접종 후, 상기 동물들의 체중을 측정하였다.
PBS 용액을 비히클로 사용하고(대조군; 그룹 1), 7A6 VH3/Vk5 및 7A6 VH3/Vk5-DLE를 각각 20mg/kg 용량으로 처리(각각 그룹 3 및 그룹 4), 항-PD1 항체 Keytruda(Pembrolizumab; Merck)를 5mg/kg 용량으로 처리(그룹 4), 및 7A6 VH3/Vk5 20mg/kg 및 Keytruda 5mg/kg를 병용 처리(그룹 5)하였다.
비히클 처리군(대조군)의 mean tumor burden이 25일째에 3000 mm3된 때에 시험을 종료하였다(표 14 참조).
Group Treatment Dose level
(mg/kg)		 Dosing Solution
(mg/mL)		 Dosing Volume
(μL/g)		 ROA Dosing Frequency & Duration
1 Vehicle - - 10 i.p. BIW x 3 weeks
2 Keytruda 5 0.5 10 i.p. BIW x 3 weeks
3 7A6 VH3/Vk5 20 2 10 i.p. BIW x 3 weeks
4 Keytruda 5 0.5 10 i.p. BIW x 3 weeks
7A6 VH3/Vk5 20 2 10 i.p. BIW x 3 weeks
BIW: Bi-weekly(twice a week)
TGI%는 다음의 수식으로 계산하였다:
TGI(%) =100 x(1-T/C)
(T 및 C는 각각 특정 날의 시험군(T) 및 대조군(C)의 평균 종양 부피(또는 무게).
상기 얻어진 결과를 표 15 및 도 21에 나타내었다:
Group Treatment Tumor Size(mm3) at randomization Tumor Size(mm3) on day 25 TGI(%) P value
Compared with control vehicle group on Day 25.(Unpaired t-test)
1 Vehicle 73.39 2867.67 - -
2 Keytruda 73.46 1392.99 51.43% 0.022
3 7A6 VH3/Vk5 73.51 1264.40 55.91% 0.024
4 Keytruda+7A6 VH3/Vk5 73.3 602.79 78.98% 0.001
표 15 및 도 21에 나타난 바와 같이, 25일째에, 7A6 VH3/Vk5 처리군(그룹3) 및 Keytruda 처리군(그룹2) 모두에서 각각 TGI 51.43%와 55.91%의 종양 성장 감소가 관찰되었다. Keytruda와 7A6 VH3/Vk5의 병용처리군(그룹 5)에서 TGI 78.98%로 종양 형성 지연 및 종양 성장 억제 효과가 가장 현저하게 나타났다. 25일째의 7A6 VH3/Vk5 처리군, Keytruda 처리군, 및 Keytruda + 7A6 VH3/Vk5 병용 처리군의 종양 성장 억제 효과는 대조군 대비 통계적으로 유의미하게 높게 나타났다(p-value <0.05). 7A6 VH3/Vk5 처리군(1 마리)과 Keytruda+7A6 VH3/Vk5 병용 처리군(2 마리)에서 완전한 종양 제거가 관찰되었다. 항체를 처리한 모든 시험군에서 유의미한 체중 차이는 없었다.
또한, 종양 미세환경(tumor microenvironment; TME)에서의 면역세포에 대한 효과를 시험하여, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
FACS 분석을 위하여, 안락사시킨 마우스로부터 수집된 종양을 절단하고 gentleMACS(Gentle MACSTM Octo Dissociator with Heaters) 및 Multi Tissue Dissociation Kit 1(Miltenyi biotech)를 사용하여 단일 세포로 해리하였다. 세포를 다음의 표면 마커(anti-mouse CD45 FITC(Biolegend), anti-mouse CD3-BUV395(BD), anti-mouse CD4-BV421(Biolegend), anti-mouse CD8-PE-eFluor610(eBiosciences), anti-mouse CD335(eBiosciences), live/dead-APC-eF780(eBiosciences)에 대한 형광 표지된 항체로 염색하였다. 추가로 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(ThermoFisher)를 사용하여 세포 고정 및 투과화 시킨 후 anti-mouse Foxp3(eBiosciences) 로 염색처리 하였다. flow cytometry(LSRFortessa X-20, BD)로 세포를 분석하였고, 데이터는 flowJo data analysis software로 분석하였다.
도 22에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 항체와 항-PD1 항체의 병용투여에 의하여 종양 내의 Tregs 빈도가 감소하면서, CD3, CD4, 및 CD8+ T세포는 증가하였다(도 22).
7.3. 항-TIGIT 항체의 환자유래 종양 이종이식(PDX)된 인간화 간암 마우스 모델에서의 생체 내 효능 시험
세 명의 공여자(Jackson Laboratory, USA)의 제대혈에서 얻은 인간 CD34+ 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSC)를 이식한 면역결핍성 NSG 마우스(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)(Jackson Laboratory, USA)를 in vivo 분석에 사용하였다. 암환자의 절제수술 후의 수술 표본으로부터 간 담관암 LIXFC 2479(Charles river) 종양세포를 얻었다. 계대(passage) 1의 면역결핍 마우스에 종양 단편을 이식하고, 안정적인 성장 패턴이 확립될 때까지 종양 xenografts을 배양하였다(passaged). 누드 마우스에서 연속 계대를 통해 xenografts로부터 종양 단편을 얻었다. 종양을 공여자 마우스로부터 제거한 후, 절편(가장자리 길이 3~4 mm)으로 절단하고, 10%　penicillin/streptomycin이 함유된 PBS에 넣었다. 수여자 마우스의 한 쪽 옆구리에 피하 이식하였으며, 이를 환자-유래 종양 이종이식(PDX) 모델로 칭하였다.
동물을 각각 6마리의 마우스로 구성된 두 그룹에 분배하고, 각 그룹에서 두 마리씩의 마우스에 3명의 각 공여자의 HSC로 재구성(reconstituted)하고, 동시에 개시시 유사 그룹 종양 부피 중앙값 50-150 mm3 및 체중을 보증하였다. 무작위화 수행일을 “Day　0”로 하였다. 대조군으로 PBS를 사용하였다(그룹 1). 그룹 2의 마우스는 7A6 VH3/Vk5를 20 mg/kg 용량으로 처리하였다. 상기 시험물질들은 4주 동안 매주 2회 복강내 주사를 통해 투여하고, 28일째에 실험이 종료될 때까지 종양 크기를 모니터링하였다. 세부사항은 하기 표 16에 나타난 바와 같다:
Group Treatment Dose level [mg/kg] Dosing volume*
[ml/kg]		 Dosing days Route n=**
1 Vehicle 10 ml/kg 10 BIW x3 i.p. 2+2+2
2 7A6 VH3/Vk5 20mg/kg 10 BIW x3 i.p. 2+2+2
*based on last body weight measurement
**donor 1 + donor 2 + donor 3
BIW: Bi-weekly(twice a week), ROA: Route of administration
Tumor growth inhibition(ΔTGI)는 Mean % ΔInhibition로 계산하였다:
ΔTGI(Mean % ΔInhibition) =((mean(C)-mean(C0)) -(mean(T)-mean(T0))) /(mean(C)-mean(C0)) * 100%
[T: 시험군의 측정 시점의 종양 크기,
T0: 시험군의 최초 종양 크기,
C: 대조군의 측정 시점의 종양 크기,
C0: 대조군의 최초 종양 크기]
상기 얻어진 결과 (종양 크기)를 도 23에 나타내었다. 도 23에서 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는 대조군에 비해 종양 성장을 현저하게 억제하였다. TGI 평가를 위하여, 28일째에 항-TIGIT 항체 처리군과 대조군 사이에서 종양 크기를 비교하였다. 7A6 VH3/Vk5 항체의 종양성장억제(ΔTGI)는 76.6%로 나타났으며, 이는 상기 항체가 합성 마우스 모델보다 인간 암에 대한 생리학적 관련성이 큰 것으로 여겨지는 간암 PDX 종양 모델에서 상당한 항암 효과를 가짐을 보여준다.
실시예 8: 인간 PBMC 및 tumor-infiltrating T 세포에서의 항-TIGIT 항체의 항 종양 효능
8.1. 종양 미세환경(tumor microenvironment;TME)에서의 T cell subset 상의 TIGIT 발현 확인
인간 종양 미세환경에서의 항-TIGIT 항체의 잠재적 효과를 측정하기 위하여, HCC(hepatocellular carcinoma; 간세포암종) 환자와 HFE(hemochromatosis; 혈색소증) 공여자의 간에서 TIGIT 발현을 확인하였다. HFE(hemochromatosis)는 정상적인 간 기능을 가진 면역학적으로 건강한 상태로 간주된다. T 세포 서브셋의 TIGIT 발현을 조사하기 위하여, 정상 공여자 및 HCC 암 환자로부터 유래하는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes)를 준비하였다(실시예 3.1 참조). 상기 세포들에 대하여 세포 표면 마커(CD3, CD4, CD8, CD127, CD25, TIGIT)를 염색하고(CD3, CD4, CD8, CD127, 및 CD25 항체는 Biolegend에서 입수, TIGIT 항체는 R&D Systems에서 입수), 유세포분석 및 Flowjo 소프트웨어로 분석하였다. 각 T 세포 서브셋에서의 TIGIT의 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity; MFI)를 Flowjo software (BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 24에 나타내었다. 도 24에서 보여지는 바와 같이, HCC 환자에서의 종양 침윤 T 세포상의 TIGIT 발현은 정상 공여자에 비해 더 높게 나타났다. TIGIT는, HCC 환자의 종양 침윤 T 세포에 있어서, CD4+ 및 CD8+ T 세포와 비교하여, Treg 세포에서 가장 높은 비율로 발현하였다. 이러한 결과는 Treg 세포가 항-TIGIT 항체의 억제 활성에 있어서 바람직한 표적임을 시사한다.
8.2. 간암 환자 유래 T 세포에서의 사이토카인 생산
TIGIT을 발현하는 면역세포는 암 환자에서 기능 장애를 일으키며, 항-TIGIT 항체 처리에 의하여 HCC 환자의 면역 반응을 회복하거나 향상시킬 수 있는지를 시험하였다.
항-TIGIT 항체에 의해 매개되는 T 세포로부터의 사이토카인 생성을 측정하기 위하여, 간세포암종(HCC) 환자 또는 건강한 공여자로부터 얻어진 인간 PBMC를 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체(항-TIGIT 7A6)(10ug/ml) 또는 동일 용량의 비교항체(항-TIGIT 10A7, 22G2) 존재 하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체와 함께 배양하였다. 세포내 사이토카인 생성을 측정하였다(실시예 3.2.2 참조).
상기 얻어진 결과를 도 25에 나타내었다. 비교항체인 항-TIGIT 항체 10A7(Genentech) 및 22G2(BMS)와 비교하여, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체 처리 시, HCC 환자의 PBMC에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산이 높은 수준으로 증가함을 확인하였다. IL-2 및 IFN-γ는 NK 및 T 세포의 증식 및 사멸 활성을 증가시켜 면역계의 핵심적 기능을 갖는 사이토카인이므로, 상기 얻어진 데이터는 HCC 환자에서 대한 항-TIGIT 7A6 항체 처리에 의한 효능을 보여준다.
8.3. 폐암 환자의 T 세포에 대한 항-TIGIT 항체의 효능
비소세포 폐암(non-small-cell lung carcinoma; NSCLC) 환자로부터 유래된 인간 PBMC의 면역세포에서의 항-TIGIT 항체 처리(각각 10ug/ml)에 따른 사이토카인 생산을 시험하였다(실시예 3.2.2 참조).
상기 얻어진 결과를 도 26에 나타내었다. 비교항체인 항-TIGIT 항체 10A7(Genentech) 및 22G2(BMS)와 비교하여, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는 NSCLC 환자의 PBMC 내의 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 사이토카인 생성을 더 높은 수준으로 증가시켰다. 이러한 결과는 항-TIGIT 7A6 항체의 NSCLC 환자에 대한 효능을 입증한다.
8.4. 대장암 환자의 T 세포에 대한 항-TIGIT 항체의 효능
TIGIT 발현 면역세포는 암 환자에서 기능 장애를 일으키며, 항-TIGIT 항체 처리에 의하여 대장암 환자의 면역 반응을 회복 또는 향상시킬 수 있는지 시험하였다. 대장암(colorectal cancer; CRC) 환자로부터 유래된 인간 PBMC의 면역세포에서의 항-TIGIT 항체 처리(각각 10ug/ml)에 따른 사이토카인 생산을 시험하였다(실시예 3.2.2 참조).
상기 얻어진 결과를 도 27에 나타내었다. 비교항체인 항-TIGIT 항체 10A7(Genentech) 및 22G2(BMS)와 비교하여, 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체는 대장암 환자의 PBMC에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 사이토카인 생산을 더 높은 수준으로 증가시켰으며, 이러한 결과는 항-TIGIT 7A6 항체의 대장암 환자에 대한 효능을 시사한다.
실시예 9: 항-TIGIT Fab 단편의 TIGIT-PVR 상호작용 차단을 통한 T 세포 활성화 시험
9.1. 중추 기억 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포에서의 항-TIGIT Fab 단편의 면역학적 효과
항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체에 의한 TIGIT/PVR 경로의 특이적 차단 효과를 검증하기 위해, 상기 항체의 항-TIGIT-Fab 단편(7A6_VH3 가변영역 및 7A6_VK5 가변영역이 디설페이트 결합으로 연결됨)을 HEK293 세포에서 생산하고 Immobilized metal affinity chromatography로 정제하였다. 항-TIGIT Fab 단편은 Fc-유도 효과 없이 특이적 차단 기능만을 나타내기 위해 사용하였다.
상기 항-TIGIT Fab 단편을 사용하여 암에 대한 장기간의 강력한 세포독성 보호 작용을 하는 TIGIT 단백질에 대한 특이적 결합을 통한 중추 기억 T 세포[Tcm](도 28a) 및 효과기 기억 T 세포[Tem](도 28b)의 활성화를 평가하였다. 구체적으로, 500,000 PBMC 세포들을 anti-CD3(0.2ug/ml) (BD Biosciences) 와 anti-CD28 antibodies(1ug/ml) (BD Biosciences) 로 활성화 시킨 후 anti-TIGIT Fab fragment (10ug/ml)를 48시간 처리하였다. Brefeldin A(Sigma) 와 Monensin (Sigma)를 각 well에 최종농도 1/1000 가 되게 더한 후 4시간 더 처리하였다. central memory T cells 와 effector memory T cell의 염색을 위해 세포들을 워시 후 상온에서 10분간 다음의 항체들로 염색처리하였다: Alive/Dead (ThermoFisher LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation), Anti-CD3-APC (Biolegend), Anti-CD8-PerCP (Biolegend), Anti-CD45RA- Brillant Violet 421 (Biolegend), Anti-CCR7-Brilliant Violet 510 (Biolegend). Staining후에 central memory and effector memory T cell에서의 cytokine level을 아래와 같이 측정하였다. Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(ThermoFisher)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 세포를 고정화하고 침투화시켰다(permeabilized). 상기 세포를 세포 내 IL-2, IFNγ, TNFa (all from Biolegend)에 대한 플루오로포어-접합 항체로 염색하였다. 상기 세포들을 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 분석하고, 데이터는 Flowjo software(BD Biosciences)로 분석하였다
상기 얻어진 결과를 도 28a(중추 기억 T 세포) 및 28b(이펙터 기억 T 세포)에 나타내었다. 상기 결과에서 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT-Fab 단편은 향상된 수준의 Tcm 및 Tem 활성화를 유도하며 이는 항-TIGIT(7A6 VH3/Vk5) 항체가 암에서 장기간 지속되는 면역 반응을 매개하는 특이적 차단 활성을 갖는다는 것을 입증한다.
9.2. 항-TIGIT Fab 단편에 의해 매개되는 A375 종양 세포에 대한 세포독성 증가 확인
A375 종양 세포(35k cells/well)를 Syto-9 염료로 염색하고, 항-TIGIT 인간화 항체로부터 생성된 Fab 단편(Fab 7A6 VH0/Vk0, 3VH3/Vk5, VH4/Vk4)(각각 10ug/ml)의 존재 하에서 PBMC 및 CytoStim(1/50)과 공배양하였다. 종양 세포 수는 Incucyte® Live-Cell analysis system(Satorius)을 사용하여 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 29에 나타내었다. 시험된 모든 항-TIGIT Fab 단편 VH0/Vk0, VH3/Vk5 및 VH4/Vk4는 TIGIT-CD155(PVR) 상호작용을 차단하고 A375 종양 세포에 대한 세포독성을 증가시켰다. 이러한 결과는 항-TIGIT 7A6 인간화 항체가 TIGIT-CD155(PVR) 경로를 효과적으로 차단하고 강화된 면역 기능을 유도한다는 것을 확인시켜준다.
실시예 10. 항-TIGIT 항체의 조절 T 세포 및 NK 세포의 면역조절 효과
10.1. TIGIT의 T 조절세포 (regulatory T cells; Tregs) 상에서의 높은 수준 발현 확인
건강한 공여자의 PBMC에서 T 세포 서브셋 및 TIGIT 단백질에 대한 마커를 염색하였다(Anti-CD3-APC (Biolegend), Alive/Dead (ThermoFisher LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit), Anti-CD8-PerCP (Biolegend), Anti-CD4-Alexa Fluor700 (Biolegend), Anti-CD127-PE (Biolegend), Anti-CD25-Brilliant Violet 421 (Biolegend), Anti-TIGIT-PeCy7 (Biolegend)). 염색 후, 세포를 스핀 다운시키고 유세포분석으로 분석하였다.
상기 결과를 도 30에 나타내었다. TIGIT은, non-Tregs CD4+ 및 CD8+ T 세포와 비교하여, 조절 T 세포(regulatory T cells; Tregs)에서 보다 높은 수준으로 발현하였다.
10.2. 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체의 Treg 소거(depletion) 활성
항-CD3 항체(BD Biosciences) 및 항-CD28 항체(BD Biosciences)의 존재 하에서 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체(10ug/ml)를 인간 PBMC와 공배양하였다. 대조군으로 항-TIGIT 10A7(Genentech)을 사용하였다. Tregs, CD4+ T 및 CD8+ T 세포의 빈도를 유세포분석으로 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 31a(Tregs), 31b(CD4+ T 세포), 31c(CD8+ T 세포), 및 31d에 나타내었다. 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 비율은 변화시키지 않으면서 Treg 세포를 특이적으로 타겟팅하였다. 또한, 항-TIGIT 항체는 대조군 항-TIGIT 항체(10A7)에 비해 높은 수준으로 Treg를 고갈시켰다(도 31d).
10.3. NK 세포에 의하여 매개되는 항-TIGIT 7A6 VH3/Vk5 항체의 Treg 소거(depletion) 활성 확인
Treg 및 NK 세포를 항-TIGIT 항체 7A6 VH3/Vk5 또는 VH3/Vk5-DLE(각각 10ug/ml)의 존재 또는 부재 하에서 밤새 함께 공배양하였다. 다음 날 Treg 및 NK 세포의 잔존 세포 수를 유세포분석으로 측정하였다. Treg 세포는 Miltenyi kits(CD4+ CD25+ CD127-dim reg T cell isolation kit II, cat no. 130-094-775)을 사용하고, NK 세포는 Milteny kits (NK Cell Isolation Kit, cat no. 130-092-657)을 사용하여, 제조자 지침에 따라 인간 PBMC에서 분리하였다.
상기 얻어진 결과를 도 32에 나타내었다. Treg 세포 수는 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 항체 및 VH3/Vk5-DLE 항체 처리에 의하여 감소한 반면, NK 세포 수는 변하지 않았다. 이러한 결과는 시험된 항-TIGIT 항체가 NK 세포와 함께 항체 의존적 세포 세포독성에 의해 Treg를 효율적으로 고갈시킴을 보여준다.
한편, 항 TIGIT 항체에 의한 NK 세포 매개 Treg 소거(고갈; depletion)에 Fc 수용체 결합이 필요한지 여부를 시험하였다.
Treg 및 NK 세포를 항-TIGIT 항체 7A6 VH3/Vk5-DLE(10ug/ml)의 존재 하에서 밤새 함께 공배양하였다. Treg 세포는 Miltenyi kits(CD4+ CD25+ CD127-dim reg T cell isolation kit II, cat no. 130-094-775)을 사용하고, NK 세포는 Milteny kits (NK Cell Isolation Kit, cat no. 130-092-657)을 사용하여, 제조자 지침에 따라 인간 PBMC에서 분리하였다. Fc 블로킹 항체 CD16 및 Human TruStain FcX™(BioLegend)를 처리하여 Fc 수용체를 차단하였다. 다음 날, Treg 및 NK 세포의 잔존 세포 수를 유세포분석으로 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 33에 나타내었다. 항-TIGIT 항체는 Tregs를 유의하게 감소시키고 블로킹 항체에 의해 FcR이 차단되면 Tregs 감소가 억제되었다. 이러한 결과는, 항-TIGIT 항체에 의한 NK 세포 매개 Treg 고갈에 Fc 수용체 결합이 필요함을 보여준다.
10.4. Fc-의존적 T 세포 활성화
FcgRIIIA을 사전 차단시키거나 사전 차단 없이 인간 T 세포(CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)에서의 사이토카인 생산을 측정하였다. 500,000 PBMC세포를 FcgRIIIA(Biolegend cat no. 422302)항체와 5분동안 상온에서 pre-incubation하였다. 그 후에 PBMC세포들을 항-TIGIT 7A6VH3/Vk5 (10ug/ml)또는 이소타입 대조항체 (10ug/ml)의 존재 하에서 0.2ug/ml 항-CD3(BD Biosciences) 및 1ug/ml 항-CD28(BD Biosciences) 단클론 항체와 함께 배양하였다. 배양 후, 세포들을 4℃에서 10분간 400xg에서 스핀다운하고, T 세포 내의 사이토카인 농도를 측정하였다. 이를 위하여 다음의 방법으로 세포 내 사이토카인을 염색하였다: 세포를 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution(Biolegend)으로 염색하고, 30분 동안 얼음 위에서 CD4+ and CD8+ T 세포 표면 마커에 대한 CD3, CD4, and CD8+ 플루오로포어(fluorophore)-접합 항체(Biolgend)로 표지하였다. eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(ThermoFisher)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 세포를 고정화하고 침투화시켰다(permeabilized). 상기 세포를 세포 내 IL-2(Biolegend) 와 IFNγ(Biolegend)에 대한 플루오로포어-접합 항체로 염색하였다. 상기 세포들을 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 분석하고, 데이터는 Flowjo software(BD Biosciences)로 분석하였다.
상기 결과를 도 34a(CD4+ T 세포) 및 34b(CD8+ T 세포)에 나타내었다. FcgRIIIA 차단에 의하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 사이토카인 생산을 유의하게 감소시켰으며, 이는 항-TIGIT 항체가 T 세포 활성화를 위한 FcgR 상호작용을 필요로 하고 Treg를 고갈시킨다는 것을 시사한다. 항-TIGIT 항체는 FcgR engagement에 의해 더욱 향상된 T 세포 반응을 나타낸다.
통계처리
통계적 유의성은 GraphPad Prism 9 software(GraphPad Software, USA)를 사용하여, ordinary one-way ANOVA, paired 및 unpaired Student’s tests로 평가하였다. 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. **** p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, ns = not significant, as stated in figure legends.

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
    를 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
    서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
    를 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  4. 제1항에 있어서, TIGIT 단백질의 아미노산 잔기 51-70 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 결합하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항-TIGIT 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역관련 질병은 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환인, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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