JP2023526977A - Ｃｄ４０結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

ＣＤ４０と結合し、そのアゴニストである結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を提供する。また、免疫細胞への抗原送達のための、結合タンパク質を含む二重特異性コンジュゲートと、抗原を含むタグ構築物に非共有結合した二重特異性コンジュゲートを含む複合体、も提供される。本発明の結合タンパク質、コンジュゲート及び複合体の医学的用途もまた、提供される。【選択図】図１３

Description

本発明は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のアゴニストである結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を提供する。また、免疫細胞への抗原送達のための、結合タンパク質を含む二重特異性コンジュゲートと、抗原を含むタグ構築物に非共有結合した二重特異性コンジュゲートを含む複合体と、が提供される。本発明の結合タンパク質、コンジュゲート及び複合体の医学的用途もまた、提供される。
免疫応答を調節するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、このような応答を利用して腫瘍の持続的な根絶を提供することができるという証拠が増えると共に、がん治療において非常に有効であることが証明されている。例えば、免疫チェックポイントであるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１を標的とした、異なる標的に対する様々な抗体が開発されており、Ｔ細胞免疫が、がんへの効果的な治療を提供できるという見解が支持されている。また、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の共刺激受容体ＣＤ４０にアゴニスト的に結合する免疫刺激性ｍＡｂの有望な臨床データが得られている。
ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５；ＴＮＦＲＳＦ５としても知られる）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ及び単球などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、並びに上皮細胞及び内皮細胞及び特定の腫瘍細胞に発現している。主に成熟Ｔ細胞に発現するリガンド（ＣＤ４０リガンド；ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４としても知られる）によって活性化されると、ＣＤ４０は、ＡＰＣを活性化し、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を誘導する。抗ＣＤ４０抗体などのアゴニストＣＤ４０剤を使用して、免疫系を誘導してがん細胞の増殖を防ぐ、及び／又はがん細胞を殺し、したがって、がんに対する有効な治療法を提供することができる。特に、アゴニストＣＤ４０剤によって活性化されたＡＰＣは、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞を刺激し、がん細胞（例えば、腫瘍）のＴ細胞媒介破壊をもたらす可能性がある。また、ＡＰＣがマクロファージであれば、直接的にがん細胞を殺すことができ、抗ＣＤ４０抗体の腫瘍細胞への結合がアポトーシスを誘導する場合、直接的な抗腫瘍メカニズムがＣＤ４０陽性の腫瘍に対して観察される可能性がある。ウイルス感染に関連して、Ｔ細胞の活性化が感染細胞の死滅を促進する可能性がある。
抗体ＡＤＣ－１０１３、ＣＰ－８７０，８９３、Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４、ＳＥＡ－ＣＤ４０及びＡＰＸ００５Ｍを含む様々な抗ＣＤ４０抗体が、前臨床又は臨床開発段階にある。抗体ＡＤＣ－１０１３は、ＷＯ２０１６／０２３９６０に記述されており、様々な他の抗ＣＤ４０抗体は、ＷＯ２０１５／０９１８５３及びＵＳ２０１７／０３４２１５９に抗がん剤としての使用が提案されている。Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４は、ＵＳ２００９／００７４７１１に記述され、ＳＥＡ－ＣＤ４０は、ＵＳ２０１７／０１３７５２８に記述され、ＣＰ－８７０，８９３は、ＵＳ２０１７／０３４２１５９に記述され、ＡＰＸ００５Ｍ（単にＡＰＸ００５として代替表記する場合もある）は、ＷＯ２０１４／０７０９３４に記述されている。
本出願は、ＣＤ４０に対する更なるアゴニスト抗体（又は関連する結合タンパク質）を提供する。結合タンパク質は、高い親和性でＣＤ４０と結合し、強力なアゴニスト活性を示し、したがって、上記のように、単独のがん治療薬として使用できることが示されている。また、この結合タンパク質は、治療上の二重特異性コンジュゲートに関連する使用に特に適しており、同様にがん治療、あるいは、感染症に対する治療又はワクチン接種に使用することができる。
Ｔ細胞の効果的な刺激（又はプライミング）には、ＡＰＣへのＣＤ４０刺激の適用だけでなく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識及び結合のためのＡＰＣによる（ＭＨＣとの関連において）抗原の提示が必要である。したがって、ＡＰＣが、Ｔ細胞刺激のために抗原をＴ細胞に交差提示すること、言い換えれば、Ｔ細胞に（細胞外由来の）抗原を取り込み、処理し、提示することは有利である。しかしながら、抗原物質が（例えば、腫瘍が切除された場合、又は感染症に対するワクチンとの関連において）常に存在するとは限らず、ＣＤ４０アゴニストは、このような状況において有効なＴ細胞刺激を促進する効果が乏しい場合がある。また、ＣＤ４０刺激は、（例えば、輸液製品としてのＣＤ４０アゴニストの用量制限毒性がある場合）Ｔ細胞の活性化には不十分な可能性がある。
これらの理由から、ＡＰＣに抗原を送達すると同時に、アゴニストでＡＰＣ表面のＣＤ４０を活性化することが有利である。この目的のための二重特異性コンジュゲートは、ＷＯ２０２０／１０４６９０に記述されている。そこに記述されている二重特異性コンジュゲートは、共有結合された２つの結合タンパク質を含む。第１の結合タンパク質は、ＣＤ４０に特異的であり、第２の結合タンパク質は、抗原に直接特異的ではなく、代わりにタグに特異的である。タグが抗原と共有結合したタグ構築物が提供され、タグ構築物は二重特異性コンジュゲートと複合体を形成する。したがって、タグに結合することにより、第２の結合タンパク質は、間接的に抗原に結合し、抗原と抗体との間に化学結合が存在しないため、抗原を変化させることができる柔軟なモジュラー法を提供する。
したがって、ＷＯ２０２０／１０４６９０は、二重特異性コンジュゲートとタグ構築物との間で形成される複合体を提供し、この複合体は、（ＡＰＣの活性化のための）ＣＤ４０アゴニスト及び（ＡＰＣによる提示のための）抗原の両方を提供する。これにより確実に、ＣＤ４０アゴニストによるＡＰＣの活性化が、標的抗原に特異的なＴ細胞の活性化をもたらし、個別化医療に使用するためのコンジュゲート及び複合体の調製の柔軟性、及び有効な抗病原体免疫応答を開始するためにＣＤ４０経路を使用する個体のワクチン接種用のワクチン開発のための、この柔軟なプラットフォームの使用を有利に実現する。
ＷＯ２０２０／１０４６９０の複合体は、抗原に対するＢ細胞応答を刺激することもできる。複合体は、Ｂ細胞と２つの相互作用を形成することができる、すなわち、抗ＣＤ４０結合タンパク質がＢ細胞表面のＣＤ４０と結合でき、タグ構築物中の抗原が特定のＢ細胞受容体と結合できる。これら２つの相互作用の組み合わせにより、抗原を認識するＢ細胞が活性化される。実際に、ＷＯ２０２０／１０４６９０に記述されているような複合体を使用するこの方法で活性化されたＢ細胞は、完全な活性化のためにヘルパーＴ細胞による共刺激を必要としない可能性がある。
患者ごと（又は少なくとも異なる腫瘍抗原ごと）又は病原性血清型ごとに別々のコンジュゲートを大変な労力で合成かつ製造しなければならないであろう、ＣＤ４０アゴニストに直接融合した抗原、又はアゴニストに融合した抗原特異的結合剤を含むコンジュゲートを調製せずに、二重特異性コンジュゲートは、特定の個々の患者の必要性に応じて、異なる抗原を含むが同じタグを持つ異なるタグ構築物に結合することによって、個々の個人使用に調整することが可能である。二重特異性コンジュゲートは、この戦略によって、高い抗原ドリフトを伴う病原体に対するワクチン接種のための個別化戦略にも適応し、柔軟なワクチン接種戦略を確保するように調整される。このようにして、タグ構築物を別々に用意すればよく、患者／病原体特異的治療薬の調製の容易さ及びコスト面で利益がもたらされる。さらに、抗原とＣＤ４０アゴニストの非共有結合は、ＣＤ４０アゴニストに直接かつ共有結合で融合した抗原を含むコンジュゲートと比較して、又はＣＤ４０アゴニスト及び抗原を別々に提供する場合と比較して、複合体の有効性に有利な場合があると考えられている。
本発明者らは、現在、全てのアゴニストＣＤ４０抗体が、ＷＯ２０２０／１０４６９０の二重特異性コンジュゲートにおける使用に等しく適切だとは限らないことを発見している。多くのアゴニストＣＤ４０抗体は、このような二重特異性コンジュゲートに関連して使用した場合、アゴニスト活性が低下することが見出されている。理論に拘束されることなく、二重特異性コンジュゲートに関連するアゴニスト活性の保持は、抗体によって認識されるエピトープのＣＤ４０内の位置に依存する場合がある。ＣＤ４０と膜の遠位で結合する抗体は、二重特異性コンジュゲートに関連するアゴニスト活性を維持するが、ＣＤ４０と膜の近位で結合する抗体は、抗ＣＤ４０抗体と共有結合した嵩高い第２の結合タンパク質がエピトープへの接近を立体的に阻害するため、二重特異性コンジュゲートに関連する活性を失うという仮説が立てられる。
本発明のＣＤ４０結合タンパク質（多くの場合、Ａ９として知られる抗体の形態）は、膜から離れたＣＤ４０のＮ末端に近いエピトープでＣＤ４０と結合し、上記のような二重特異性コンジュゲートに関連して使用した場合、高いレベルのアゴニスト活性を保持することが見出されている。したがって、本発明の抗体は、二重特異性コンジュゲートに関連して有利に使用され得る。
したがって、第１の態様では、本発明は、ＣＤ４０に特異的に結合する結合タンパク質を提供し、前記結合タンパク質は、ＣＤ４０のアゴニストであり、抗体の結合ドメインを含み、当該結合ドメインは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、それぞれが３つの相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）を含み、
ＶＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載された配列を有し、
ＶＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載された配列を有し、
ＶＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載された配列を有し、
ＶＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載された配列を有し、
ＶＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載された配列を有し、
ＶＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載された配列を有する。
第２の態様では、本発明は、
（ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの第１の結合タンパク質と、
（ｉｉ）抗体の結合ドメインを含み、ペプチド部分を結合する、少なくとも１つの第２の結合タンパク質と、
を含む、二重特異性コンジュゲートを提供し、
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、共有結合している。
第３の態様では、本発明は、本発明の二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物を含む複合体を提供し、当該タグ構築物は、抗原に共有結合した当該コンジュゲートの当該第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分を含み、
前記タグ構築物のペプチド部分は、二重特異性コンジュゲートの当該第２の結合タンパク質に非共有結合している。
第４の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の結合タンパク質
（ｉｉ）本発明の二重特異性コンジュゲート、又は
（ｉｉｉ）本発明の複合体
を含む医薬組成物を提供し、
少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤である。
第５の態様では、本発明は、本発明の二重特異性コンジュゲートと、治療における別々の、同時の又は連続した使用のための結合製剤として上記に記載のタグ構築物と、を含む生成物を提供する。
第６の態様では、本発明は、本発明の二重特異性コンジュゲート及び上記に記載のタグ構築物を含むキットを提供する。
第７の態様では、本発明は、治療における使用のための、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体、本発明の組成物又は本発明のキットを提供する。
第８の態様では、本発明は、がんの治療又は予防に使用するための、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体、本発明の組成物又は本発明のキットを提供する。
同様に、本発明は、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体又は本発明の組成物を被験体に投与することを含む、がんを治療又は予防する方法を提供する。
また、がんの治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート又は本発明の複合体の使用も提供される。
第９の態様では、本発明は、感染症の治療又は予防に使用するための、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体、本発明の組成物又は本発明のキットを提供する。
同様に、本発明は、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体又は本発明の組成物を被験体に投与することを含む、感染症を治療又は予防する方法を提供する。
また、感染症の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート又は本発明の複合体の使用も提供される。
第１０の態様では、本発明は、本発明の結合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
第１１の態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え構築物を提供する。
第１２の態様では、本発明は、本発明の核酸分子又は本発明の組換え構築物を含むベクターを提供する。
第１３の態様では、本発明は、本発明の核酸分子、本発明の組換え構築物又は本発明のベクターを含む細胞を提供する。
第１４の態様では、本発明は、抗原を認識するＴＣＲを発現するＴ細胞を活性化するｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供し、前記方法は、抗原提示細胞を、
ｉ）本発明の二重特異性コンジュゲート及び上記に記載のタグ構築物であって、前記タグ構築物が、前記ＴＣＲによって認識される抗原を含む、二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物又は
ｉｉ）本発明の複合体であって、前記複合体のタグ構築物が、前記ＴＣＲによって認識される抗原を含む、複合体
と接触させることを含む。
当業者に知られているように、抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖の計４本のポリペプチド鎖を含むタンパク質である。典型的には、重鎖は互いに同一であり、軽鎖は互いに同一である。軽鎖は、重鎖より短い（したがって、より軽い）。重鎖は、４つ又は５つのドメインを含み、Ｎ末端には可変（ＶＨ）ドメインが位置し、３つ又は４つの定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端までそれぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び、存在する場合はＣＨ４）が続いている。軽鎖は、２つのドメインを含み、Ｎ末端には可変（ＶＬ）ドメインが、Ｃ末端には定常（ＣＬ）ドメインが位置する。重鎖では、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に非構造化ヒンジ領域が位置する。抗体の２本の重鎖は、ヒンジ領域に存在するシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合によって結合し、それぞれの重鎖は、ＣＨ１及びＣＬドメインにそれぞれ存在するシステイン残基の間のジスルフィド結合によって１本の軽鎖と結合している。
哺乳類では、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）として知られる２種類の軽鎖が産生される。κ軽鎖の場合、可変ドメイン及び定常ドメインは、それぞれＶＫドメイン及びＣＫドメインと呼ばれる場合がある。軽鎖がλ軽鎖であるかκ軽鎖であるかは、その定常領域によって決定し、λ軽鎖とκ軽鎖の定常領域は異なるが、任意の種の同じ種類の軽鎖では、全て同じである。
重鎖の定常領域は、ある種の任意のアイソタイプの全ての抗体で同じであるが、アイソタイプ間では異なる（抗体のアイソタイプの例としては、クラスＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＤがあり、また多くの抗体のサブタイプがある、例えば、ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４という４つのサブタイプがある）。抗体の特異性は、その可変領域の配列によって決定される。可変領域の配列は、どの個体においても、同じ種類の抗体間で異なる。特に、抗体の軽鎖及び重鎖の両方は、３つの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一組の軽鎖及び重鎖では、２本の鎖のＣＤＲは、抗原結合部位を形成する。ＣＤＲの配列は、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位を含む、一組の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、（抗原）結合ドメインとして知られている。
重鎖の３つのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３として知られ、軽鎖の３つのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３として知られている。
本発明は、ＣＤ４０と特異的に結合し、ＣＤ４０のアゴニストである新規の結合タンパク質を提供する。用語「結合タンパク質」は、抗体の結合ドメインを含む結合タンパク質（すなわち、抗体から得られた若しくは由来する、又は抗体の結合ドメインに基づく結合ドメイン）を示すために本明細書で使用される。したがって、結合タンパク質は、抗体の結合部位、又は抗体由来の結合部位を含む、抗体ベースの、又は抗体類似の分子である。したがって、それは免疫学的結合剤である。
上記のように、抗体の結合ドメインは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインからなる（したがって、古典的な二価抗体は、２つの結合ドメインを有する）。したがって、結合タンパク質は、天然抗体若しくはそのフラグメント、又は人工抗体若しくは合成抗体、又は抗体構築物、又は誘導体（例えば、更に後述するように、単鎖抗体）であってもよい。要約すると、本発明の結合タンパク質は、抗体の結合ドメインを含み、抗体の前記結合ドメインは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。
本発明の結合タンパク質は、ＣＤ４０と特異的に結合する。「特異的」とは、結合タンパク質が、非標的分子への結合と区別できる方法で、その標的（すなわち、ＣＤ４０）に結合すること、より具体的には、結合タンパク質が他の分子と結合するよりも大きな結合親和性でその標的（ＣＤ４０）と結合することを意味する。すなわち、結合タンパク質は、他の非標的分子には結合しない、又は評価できる程度若しくは有意な程度には結合しない、又はＣＤ４０と結合するよりも低い親和性でこのような他の分子に結合する。ＣＤ４０と「特異的に結合する」結合タンパク質は、代替的に、ＣＤ４０に「対して向けられる」又はＣＤ４０を「認識する」と言及される場合がある。言い換えれば、ＣＤ４０は、本発明の結合タンパク質の抗原であり、したがって、結合タンパク質は、ＣＤ４０を抗原として結合するという意味で、「抗原結合タンパク質」である。
「ＣＤ４０」という用語は、任意の種からのＣＤ４０を言及する。したがって、それは、ヒトＣＤ４０又は他の種、特に他の哺乳類におけるその等価物若しくは対応する分子であってもよい。好ましくは、ＣＤ４０は、本発明の結合タンパク質がヒトＣＤ４０と特異的に結合し、ヒトＣＤ４０のアゴニストであるような、ヒトＣＤ４０である。ヒトＣＤ４０は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５９４２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列を有する。特に、本発明の第１の結合タンパク質は、天然状態、すなわち、細胞表面で発現しているときのＣＤ４０（特にヒトＣＤ４０）に結合する。
本発明の結合タンパク質は、ＣＤ４０のアゴニストである。すなわち、この分子は、ＣＤ４０をアゴニスト化（ａｇｏｎｉｓｉｎｇ）、又は活性化することができる（すなわち、本発明の結合タンパク質がＣＤ４０と結合すると、ＣＤ４０を活性化する）。これは、本発明の結合タンパク質が、ＣＤ４０のシグナル伝達を増強できることを意味する。したがって、結合タンパク質は、ＣＤ４０を発現する細胞、特に、樹状細胞、又はＢ細胞、マクロファージ、単球若しくは任意のミエロイド細胞などのＣＤ４０を発現するＡＰＣの活性を高める（すなわち、活性化又は刺激する）ことができる。当該細胞は、ＣＤ１１ｂ陽性又はＣＤ１１ｃ陽性であってよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＤＣを活性化することができる。
ＤＣなどのプロフェッショナルＡＰＣは、ＣＤ４０を介したシグナル伝達が起こると活性化され、免疫細胞の活性化、増殖、並びにサイトカイン及びケモカインの産生を含む幾つかの生物学的事象を引き起こす。ＣＤ４０によるＤＣ、又は他のＡＰＣの活性化を決定する方法は、当該技術分野（例えば、Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋら、２００１，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５８：４０－４３、並びにＷＯ２０１５／０９１８５３及びＵＳ２０１７／０３４２１５９を参照）で知られており、以下の実施例に記述されている。
ＤＣのなどのＡＰＣの活性を調節（又は増加）する特定の抗ＣＤ４０結合分子の能力を、例えば、ＣＤ８６及びＣＤ８０などの細胞表面マーカーのレベルを測定すること、サイトカイン放出を測定すること（例えば、ＤＣによるＩＬ－１２放出）、及び／又は抗ＣＤ４０結合分子誘導Ｔ細胞活性（例えば、ＩＦＮγの分泌）を測定することによって決定する方法が、当該技術分野において知られ、報告されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＣ活性化アッセイは、以下の実施例に記述されており、活性化マーカーとしてＩＬ－１２放出を利用する。
当該技術分野でよく知られているように、ＣＤ４０は、細胞表面タンパク質である。リガンド又はアゴニストと結合すると、ＣＤ４０は、内在化される可能性がある。ＴＮＦＲの内在化は、免疫活性化を制御する方法となり得る。ＣＤ４０への抗体は、異なる内在化特性を有する可能性がある。抗体結合後のＣＤ４０の内在化は、抗体の内在化をもたらし、したがって、その抗体に（非共有結合又は共有結合で）結合したカーゴは、ＣＤ４０を介した抗体の取り込みによる細胞によって取り込まれることが可能である。次に、ＣＤ４０受容体は、細胞表面に再利用して戻ることができ、理論に束縛されることなく、ＣＤ４０の内在化及び再利用が、抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性に影響を及ぼす可能性がある。現在の発明では、結合タンパク質がＣＤ４０に結合すると、ＣＤ４０の内在化を誘発し、その後、アゴニスト活性化が、表面上のＣＤ４０クラスター化によって引き起こされ得る場合に、ＣＤ４０が細胞表面へ再利用されることが好ましい。しかしながら、アンタゴニスト抗体は再利用を誘発せず、それによって、受容体（ＣＤ４０）の内在化が免疫活性化を阻害する可能性がある。
詳細に述べたように、本発明の特異的結合分子は、６つのＣＤＲ配列を含む。軽鎖及び重鎖可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲを含む、すなわち、軽鎖可変ドメインは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含み、重鎖可変ドメインは、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を含む。６つのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＶＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載された配列を有する
ＶＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載された配列を有する
ＶＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載された配列を有する
ＶＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載された配列を有する
ＶＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載された配列を有する;及び
ＶＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載された配列を有する。
本発明の結合タンパク質は、当該技術分野において知られている方法によって合成することができる。好ましくは、結合タンパク質は、原核生物（例えば、細菌）細胞又は真核生物（例えば、酵母、真菌、昆虫又は哺乳類）細胞を使用した細胞発現系などのタンパク質発現系を使用して合成される。代替的なタンパク質発現系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系における無細胞であり、結合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが、タンパク質に翻訳される、ｉｎ ｖｉｔｒｏのものである。無細胞発現系キットは広く入手可能であり、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入することができる。あるいは、結合タンパク質は、非生物学的系で化学的に合成されてもよい。液相合成又は固相合成を使用して、本発明の結合タンパク質を形成し得る又は結合タンパク質内に含まれ得るポリペプチドを生成することができる。
当業者は、当該技術分野で一般的な適切な方法論を用いて、結合タンパク質を容易に製造することができる。特に、結合タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞で組換え発現されてもよい。タンパク質発現系で合成された結合タンパク質は、当該技術分野の標準的な技術を使用して精製することができ、例えば、アフィニティータグを用いて合成し、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。結合タンパク質が抗体である場合、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＡ／Ｇ又はプロテインＬなどの１つ以上の抗体結合タンパク質を使用して、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。
上述したように、結合タンパク質は、抗体ベースの、又は抗体類似の分子である。したがって、結合タンパク質は、天然抗体若しくはそのフラグメント、又は人工抗体若しくは合成抗体、又は抗体構築物、又は誘導体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
好ましい実施形態では、結合タンパク質は、抗体、特にモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体種からなる抗体製剤、すなわち、製剤中の全ての抗体が、同一のＣＤＲを含む同一のアミノ酸配列を有し、したがって、標的抗原上の同一のエピトープ（「標的抗原」とは、特定の抗体によって結合されるエピトープを含む抗原を意味し、すなわち、本発明の結合タンパク質の標的抗原は、ＣＤ４０である。）と結合して同一の効果を発揮するものを意味する。言い換えれば、本発明の抗体は、ポリクローナル混合物抗体の一部でないことが好ましい。
上記のような抗体では、ＣＤＲ配列は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインに配置される。ＣＤＲ配列は、抗原結合のためにＣＤＲを適切に配置するポリペプチドのフレームワーク内に位置する。したがって、可変ドメインの残りの部分（すなわち、ＣＤＲのいずれかの部分を形成しない可変ドメイン配列の部分）は、フレームワーク領域を構成する。成熟可変ドメインのＮ末端は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）を形成し；ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間のポリペプチド配列は、ＦＲ２を形成し；ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間のポリペプチド配列は、ＦＲ３を形成し；ＣＤＲ３を定常ドメインと結合するポリペプチド配列は、ＦＲ４を形成する。本発明の結合タンパク質では、可変領域のフレームワーク領域は、結合タンパク質が、そのＣＤＲを介してＣＤ４０に結合するように、適切なアミノ酸配列を有してもよい。
結合タンパク質が抗体である場合、抗体は、任意のアイソタイプ及びサブタイプであってよい。したがって、その抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ抗体であってもよい。免疫グロブリンの異なるアイソタイプに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれている。異なるアイソタイプの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造は、よく知られている。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体である。上記のように、ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４という４つのサブタイプが存在する。本発明のＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体は、いずれかのＩｇＧサブタイプであってもよく、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であってもよい。
しかしながら、本発明者らは、ＩｇＧ２サブタイプのＩｇＧ抗体（すなわち、ＩｇＧ２抗体）がＣＤ４０に対して特に強力なアゴニスト効果を有し、また効果的なＣＤ４０の内在化及び再利用を誘発することを証明した。アゴニストＩｇＧ２抗体のＣＤ４０への結合は、ＣＤ４０（及びそれに結合したカーゴ）の内在化を促進することにおいて、特に効果的である。重要なことに、アゴニストＩｇＧ２抗体は、ＷＯ２０２０／１０４６９０で実証されているように、ＩｇＧ１抗体よりも、ＣＤ４０の内在化を促進し、それによって、結合したペプチドカーゴ分子に対するＴ細胞活性化を刺激することにおいてより効果的である。これは、本実施例に示されるように、ＩｇＧ２抗体は、一般に、同じ可変ドメインを有するＩｇＧ１抗体よりも高いアゴニスト効果を有することを意味する。したがって、一実施形態では、本発明の結合タンパク質は、ＩｇＧ２抗体（特に、ＩｇＧ２モノクローナル抗体）である。しかしながら、他の実施形態では、結合タンパク質は、ＩｇＧ１抗体である。さらに他の実施形態では、結合タンパク質は、ヒンジ領域がＩｇＧ２サブタイプであり、一方で定常領域の残りの部分がＩｇＧ１サブタイプである、ハイブリッド定常領域などの、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の間のハイブリッドである定常領域を有している。
上述のように、抗体軽鎖は、κ（カッパ）型及びλ（ラムダ）型のいずれかに属している。本発明の結合タンパク質は、κ軽鎖又はλ軽鎖を含むことができる。特定の実施形態では、本発明の結合タンパク質は、κ軽鎖を含む。
あるいは、結合タンパク質は、抗体の結合フラグメント（すなわち、抗体フラグメント）、すなわち、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体の能力を保持するフラグメントであってもよい。このようなフラグメントは、よく知られており、例としては、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、又はｄＡｂフラグメントが挙げられ、これらは、当技術分野でよく知られた技術に従って調製することができる。
Ｆａｂフラグメントは、抗体の抗原結合ドメインからなり、すなわち、個々の抗体は、軽鎖及びその結合した重鎖のＮ末端部分からそれぞれなる、２つのＦａｂフラグメントを含むものと見なすことができる。したがって、Ｆａｂフラグメントは、軽鎖全体並びにそれが結合している重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体をパパインで消化することにより得ることができる。
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体の２つのＦａｂフラグメント、加えて２つの重鎖を結合するジスルフィド結合を含む重ドメインのヒンジ領域からなる。言い換えれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの共有結合したＦａｂフラグメントとして見なすことができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで消化することにより得ることができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを還元すると、フラグメントを他の分子に結合させるために有用である追加のスルフヒドリル基を有するＦａｂフラグメントと見なすことができる、２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
あるいは、結合タンパク質は、合成構築物又は人工構築物、すなわち、結合ドメインを含むが、遺伝子操作又は人工的に構築された抗体様分子であってもよい。これには、キメラ又はＣＤＲグラフト化抗体、並びに単鎖抗体及び他の構築物、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂｓダイマー及びＶＨＨなどの重鎖抗体などが含まれる。特定の実施形態では、人工構築物は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、単一のポリペプチドが抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方を含む融合タンパク質である。ｓｃＦｖフラグメントは、一般に、ＶＨ領域及びＶＬ領域を共有結合で結合し、分子の安定性に寄与するペプチドリンカーを含む。リンカーは、例えば、１、２、３若しくは４個のアミノ酸、５、１０若しくは１５個のアミノ酸、又は１～２０個の範囲の都合の良い他の中間数などの１～２０個のアミノ酸を含んでよい。ペプチドリンカーは、グリシン及び／又はセリンなどの、一般に便利なアミノ酸残基から形成されてもよい。適切なリンカーの一例は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。このようなリンカーの多量体、例えば、二量体、三量体、四量体又は五量体、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）若しくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）などが使用されてもよい。しかしながら、リンカーが存在することは必須ではなく、ＶＬドメインは、ＶＨドメインとペプチド結合で結合してもよい。ｓｃＦｖは、典型的に、Ｎ－末端からＣ－末端まで、リンカー配列によってＶＬ領域に結合したＶＨ領域を含む。ｓｃＦｖ分子の調製は、当該技術分野でよく知られている。
好ましい実施形態では、結合タンパク質は、ヒトタンパク質、特にヒトモノクローナル抗体、抗体フラグメント又はｓｃＦｖである。ヒト結合タンパク質は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するＶＨ及びＶＬ領域、並びに定常領域がタンパク質に含まれる場合には、ヒト定常領域も含んでもよい。しかしながら、このようなタンパク質は、例えば、無作為又は部位特異的な変異誘発によって導入された変異のように、ヒト生殖細胞系Ｉｇ配列によってコード化されていないアミノ酸を含んでもよい。
上述のように、本発明の結合タンパク質は、抗体の結合ドメインを含み、結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（又は可変領域）及び軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、結合タンパク質は、Ａ９抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン、又はその変種を含む。Ａ９抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを有する軽鎖、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを有する重鎖を有する。したがって、特定の実施形態では、本発明の結合タンパク質は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列、又はその変異体を含む（又はそれらからなる）軽鎖可変ドメイン、及び
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列、又はその変異体を含む（又はそれらからなる）重鎖可変ドメイン
を含む。
本開示では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。これは当然ながら、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の変異体のＣＤＲ配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に記載のＡ９抗体の天然ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３配列に対して変化していない、という但し書き付きである。同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。これは当然ながら、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の変異体のＣＤＲ配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に記載のＡ９抗体の天然ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３配列に対して変化していない、という但し書き付きである。
上述のように、本発明の好ましい実施形態では、結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む可変領域を有する軽鎖、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む可変領域を有する重鎖を有してもよい。
上述のように、モノクローナル抗体は、好ましくはヒトであり、モノクローナル抗体は任意のアイソタイプであってもよいが、例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体及びＩｇＧ１／２定常領域を持つハイブリッド抗体を有する抗体から選ばれるＩｇＧ抗体であることが好ましく、最も好ましくはＩｇＧ２抗体である。
ヒトＩｇＧ２定常領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に記載されている（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５９）。全長Ａ９重鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の定常領域を含む。全長Ａ９軽鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列を有するκ軽鎖であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の定常領域（ヒトκ軽鎖定常領域、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４）を含む。
本発明の実施形態では、結合タンパク質は、
（ｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）軽鎖、並びに、
（ｉｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）重鎖、
を含む（又はこれらからなる）モノクローナル抗体である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及び８の変異体は、上記で定義されている。本開示では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。
天然ＩｇＧ２定常領域の変異体は、例えば、修飾（変異）定常領域を含む抗体又は抗体構築物の特性を変更又は影響するものが知られている。このような変異体（又は突然変異体）ＩｇＧ２定常領域の１つは、ＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓであり、その使用については、ＷＯ２０２０／１０４６９０において実証されている。この突然変異体は、ＩｇＧ２抗体が免疫応答を開始する能力を高めることが見出されているＩｇＧ２Ｂ立体構造に固定されている。ＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓ変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される。配列の比較から明らかなように、天然ＩｇＧ２定常配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に記載）の１４位のシステイン残基は、Ｃ１２７Ｓ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に記載）においてセリンに置換される。ＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓ定常領域は、本発明の結合タンパク質に使用することができる。ＩｇＧ２形式が、アンタゴニストＣＤ４０抗体をスーパーアゴニスト抗体に変化させることができ、その効果が、ＩｇＧ２Ｂヒンジ－ＣＨ１領域に依存することが、最近Ｙｕら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３７（６）：８５０－８６６，２０２０）により示された。
したがって、本発明の他の実施形態では、結合タンパク質は、
（ｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）軽鎖、並びに、
（ｉｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）重鎖、
を含む（又はこれらからなる）モノクローナル抗体である。
同様に、ＩｇＧ１定常領域は、本発明の結合タンパク質に使用することもでき、後述の実施例においてアゴニスト活性を有することが示されている。したがって、本発明の他の実施形態では、結合タンパク質は、
（ｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）軽鎖、並びに、
（ｉｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）重鎖、
を含む（又はこれらからなる）モノクローナル抗体である。
同様に、サブクラスＩｇＧ１とＩｇＧ２との間のハイブリッドである定常領域は、本発明の結合タンパク質に使用することもでき、後述の実施例でアゴニスト活性を有することが示されている。したがって、本発明の他の実施形態では、結合タンパク質は、
（ｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン
を含む（又はこれらからなる）軽鎖、並びに
（ｉｉ）
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれからなる）可変ドメイン、及び
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）定常ドメイン、
を含む（又はこれらからなる）重鎖
を含む（又はこれらからなる）モノクローナル抗体である。
本発明の特定の実施形態では、結合タンパク質は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれらからなる）軽鎖、及び
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列又はその変異体を含む（又はこれからなる）重鎖、
を含む（又はこれらからなる）モノクローナル抗体である。
特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の軽鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の重鎖を含む、Ａ９抗体である。
本開示では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。これは当然ながら、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の変異体のＣＤＲ配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に記載のＡ９抗体の天然ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３配列に対して変化していない、という但し書き付きである。同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列として定義される。これは当然ながら、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の変異体のＣＤＲ配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に記載のＡ９抗体の天然ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３配列に対して変化していない、という但し書き付きである。
Ａ９ ＶＨドメイン及びＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓ定常ドメインからなる抗体重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に記載のアミノ酸配列を有する。したがって、特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の軽鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４の重鎖を含む。
Ａ９ ＶＨドメイン及びＩｇＧ１定常ドメインからなる抗体重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に記載のアミノ酸配列を有する。したがって、特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の軽鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６の重鎖を含む。
Ａ９ ＶＨドメイン及びハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２定常ドメインからなる抗体重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５に記載のアミノ酸配列を有する。したがって、特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の軽鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５の重鎖を含む。
Ａ９可変ドメイン及び／又は定常ドメインの配列の変異体を有する結合タンパク質は、上記の活性（すなわち、ＣＤ４０、特にヒトＣＤ４０と特異的に結合し、そのアゴニストである）を有する、機能的変異体である。変異体配列は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失により、天然Ａ９配列に対して修飾されてもよい。
天然Ａ９配列に対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよい。本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸置換に言及する。類似の側鎖を有するアミノ酸は、類似の性質を持つ傾向があるため、ポリペプチドの構造又は機能に重要なアミノ酸の保存的置換は、同じ位置の非保存的アミノ酸置換よりもポリペプチドの構造/機能への影響が少ないことが予想される。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。したがって、保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸残基が、同じファミリーにおける異なるアミノ酸に置換される置換と考えることができる。しかしながら、アミノ酸置換は同様に、あるアミノ酸が、異なるファミリーに属する側鎖を有する別のアミノ酸に置換される、非保存的置換であってもよい。
上述のように、本開示によれば、天然Ａ９配列の変異体は、天然配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。配列同一性は、任意の便利な方法によって評価され得る。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定するために、配列のペアワイズアライメント又はマルチプルアライメントを行うコンピュータプログラムが有用であり、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ又はＥＭＢＯＳＳ ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（共にＲｉｃｅ，Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６，（６）ｐｐ２７６－２７７，２０００）は、ペアワイズ配列アライメントに使用でき、一方でＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆら、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．７：５３９，２０１１）又はＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：１７９２－１７９７，２００４）は、マルチプル配列アライメントに使用できるが、任意の他の適切なプログラムを使用することもできる。アライメントがペアワイズであろうとマルチプルであろうと、局所的よりむしろ全体的に（すなわち、参照配列の全体にわたって）実行されなければならない。
配列のアライメント及び％同一性の計算は、例えば、標準的なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａパラメータである、Ｇｏｎｎｅｔ、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ ６、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ １を使用して決定できる。あるいは、標準的な ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅパラメータである、ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．５を使用することもできる。他の適切なパラメータを使用することもできる。
本出願の目的では、異なる方法で得られた配列同一性値間に論争がある場合、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して、デフォルトパラメータで全般的ペアワイズアライメントによって得られた値が有効であるとみなされる。
上記のように、本発明の更なる態様は、
上記のような本発明の少なくとも１つの第１の結合タンパク質、及び
抗体の結合ドメインを含み、ペプチド部分を結合する、少なくとも１つの第２の結合タンパク質、
を含む二重特異性コンジュゲートであり、
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、共有結合している。
上記のように、本発明の二重特異性コンジュゲートは、モジュールシステムの構成要素である。二重特異性コンジュゲートは、（１）ＣＤ４０；及び（２）ペプチドタグ、又はタグ部分とも呼ばれる、ペプチド部分を認識する（すなわち、特異的に結合する）。以下に更に説明するように、ペプチドタグは、本質的に任意のペプチド又はアミノ酸配列であってもよい。本発明の二重特異性コンジュゲートを、ペプチド部分及び抗原の両方を含むタグ構築物と組み合わせることにより、抗原に対する特異的な免疫応答を誘発できるワクチン複合体が形成される。上記のように、ワクチン複合体は、樹状細胞などの標的抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のＣＤ４０と結合してアゴニスト化することにより、標的抗原提示細胞を活性化し、複合体の内在化に続いてＡＰＣの内部に抗原を送達し、その結果、抗原提示及び抗原を認識するＴ細胞の活性化が生じる。
本発明の二重特異性コンジュゲートは、少なくとも１つの第１の結合タンパク質及び少なくとも１つの第２の結合タンパク質を含む。上記のように、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、異なる標的を認識し、したがって、異なるタンパク質である。少なくとも１つの第１の結合タンパク質及び少なくとも１つの第２の結合タンパク質を含む二重特異性コンジュゲートは、２つ以上の第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質を含んでもよい。一実施形態では、コンジュゲートは、１つの第１の結合タンパク質及び２つ以上、例えば、２～４の第２の結合タンパク質を含む。このような実施形態では、第１の結合タンパク質は、２価であってもよく、又は２以上の結合価を有してもよい。このような実施形態では、第２の結合タンパク質は、１価であってもよい。
いずれにせよ、コンジュゲートは、２つの標的のそれぞれ、すなわちＣＤ４０及びタグ部分のそれぞれについて、２つ以上の結合ドメインを有することが好ましい。言い換えれば、コンジュゲートは、各標的に対して少なくとも２価の結合価を有することが好ましい。これに関連して、結合価は、特定の標的を認識する結合ドメインの数と等価であると見なすことができる。したがって、第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質は、それぞれ２つ以上の結合ドメインを有していてもよく、及び／又はコンジュゲートは、２つ以上の第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質を含んでもよい。したがって、二重特異性コンジュゲートに使用される結合タンパク質は、１価であってもよく、又は２価以上であってもよい、すなわち、１つ又は２つ以上の結合ドメイン、例えば、２～６、又は２～４の結合ドメインを含んでもよい。
さらに、二重特異性コンジュゲートは、１つの第１の結合タンパク質又は第２の結合タンパク質を含んでもよく、又は２つ以上の第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質、例えば、２～６つ、又は２～４つの第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質を含んでもよい。結合タンパク質が１より大きい結合価を有する場合、一実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、その結合タンパク質の１つ、例えば、２以上の結合価を有する１つの第１の結合タンパク質を含んでもよい。結合タンパク質が１の結合価を有する場合、一実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、その結合タンパク質の２つ以上、例えば、２つ以上、例えば２～４つの１価の第２の結合タンパク質を含んでもよい。複数の第２の結合タンパク質が存在する場合、第２の結合タンパク質は、同じ標的ペプチド部分に特異的であることが理解される。コンジュゲート中に複数の第１の結合タンパク質又は第２の結合タンパク質が存在する場合、各第１の結合タンパク質及び各第２の結合タンパク質は、一般に同じであるが、異なっていてもよい（例えば、各コンジュゲートは、ＣＤ４０と結合する単一の２価の第１の結合タンパク質、及び２つの異なる１価の第２の結合タンパク質を含むことができ、各々が異なるタグ部分と結合するか、又は各々が同じタグ部分に向けられているが、例えば、その中の異なる部分に結合するか、又は異なるＣＤＲを使用して同じエピトープを認識する）。
好ましい一実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、１つの２価の第１の結合タンパク質、及び２つの１価の第２の結合タンパク質を含む。上記のように、２つの１価の第２の結合タンパク質が同一であることが好ましい。したがって、このような実施形態では、コンジュゲートは、４価である。
用語「結合親和性」は、結合分子が結合相手若しくはターゲットと結合する、又は結合しない能力に言及する。結合親和性は、結合相手に対する親和定数（Ｋｄ）を決定することによって定量化することができる。同様に、結合分子のその標的への結合の特異性は、結合分子及び非標的分子に関する親和定数と比較した、その標的に対する結合分子の親和定数の観点から定義されてもよい。典型的には、その標的に対する結合分子のＫｄは、別の非標的分子に関するＫｄよりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又は２００倍小さくなる。結合親和力及び解離定数は、以下の実施例で実証されるように、よく知られた方法を使用して容易に決定することができる。第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、他の非標的分子への結合に対する親和性よりも少なくとも２、５、１０、５０、１００又は２００倍高い親和性でそれらの標的に結合することが可能であってよい。
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、１０、５、４、３、２若しくは１μＭ、又は１０００ｎＭ以下の親和定数でそれぞれの標的と結合し得るが、より高い親和性を示すこともでき、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、７、５、４、３、２、１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０１ｎＭ以下である。親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）又は蛍光偏光アッセイを使用して決定することができる。以下に実証するように、Ａ９抗体は、約５ｎＭの親和定数でヒトＣＤ４０と結合する。
上述のように、本発明の二重特異性コンジュゲートの第１の結合タンパク質は、ＣＤ４０と特異的に結合し、アゴニスト化する、本発明の第１の態様の結合タンパク質である。好ましい実施形態では、第１の結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。上記のように、本発明者らは、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体が、ＣＤ４０及び受容体に結合したカーゴの内在化の促進において、特に効果的であることを見出した。受容体は、その後、細胞表面へ再循環することができる。これは、本発明の二重特異性コンジュゲートに関連して特に重要であり、（上記のように）ワクチン複合体として投与される場合、ＣＤ４０によるコンジュゲートの内在化は、タグ構築物の内在化、ひいては抗原の処理及び提示に必要である。したがって、第１の結合タンパク質が、ＩｇＧ２アイソタイプのモノクローナル抗体（又はＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓ変異体などの変異体）であることが好ましい。特定の好ましい実施形態では、第１の結合タンパク質は、Ａ９抗体である。
第２の結合タンパク質は、抗体の結合ドメインを含む。上述のように、このようなドメインは、抗体から得られる若しくは抗体に由来する、又は抗体の抗原結合ドメインに基づく。したがって、第２の結合タンパク質はまた、抗体の結合部位、又は抗体由来の結合部位を含む、抗体ベースの、又は抗体類似の分子である。それは結合ドメインを含むため、第２の結合タンパク質はまた、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、それぞれ３つのＣＤＲを含む。
第２の結合タンパク質は、上記に示したような任意の種類の結合タンパク質であってもよい。しかしながら、ある特定の実施形態では、それは合成抗体構築物であり、特に一本鎖抗体である。好ましい実施形態では、第２の結合タンパク質は、ｓｃＦｖである。好ましくは、第１の結合タンパク質は、モノクローナル抗体（最も好ましくはＩｇＧ２アイソタイプの）であり、第２の結合タンパク質は、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、第１の結合タンパク質として、１つのモノクローナル抗体、及び第２の結合タンパク質として、２つのｓｃＦｖを含む。
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、共有結合している。上述のように、第２の結合タンパク質が単鎖抗体誘導体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、第１の結合タンパク質は、モノクローナル抗体であることが好ましい。この例では、第２の結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、第１の結合タンパク質（モノクローナル抗体）の軽鎖又は重鎖に共有結合していてもよい。第２の結合タンパク質は、モノクローナル抗体のいずれかの鎖のいずれかの末端、すなわち、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に結合されてもよい。特定の実施形態では、第２の結合タンパク質は、第１の結合タンパク質（モノクローナル抗体）の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合される。したがって、第２の結合タンパク質は、軽鎖の定常領域（ＣＬ）又は重鎖の定常領域の定常ドメイン（ＣＨドメイン）、例えばＣＨ３ドメインに結合され得る。
特定の実施形態では、第１の結合タンパク質は、モノクローナル抗体であり、第２の結合タンパク質は、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは、抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン、又は抗体の軽鎖のＣＬドメインのいずれかと共有結合している。第１の結合タンパク質がモノクローナル抗体であり、第２の結合タンパク質がｓｃＦｖである場合、二重特異性コンジュゲートは、１つのモノクローナル抗体及び２つのｓｃＦｖを含むことが特に好ましい。この場合、２つのｓｃＦｖが抗体の別々の鎖に結合していること（すなわち、２つのｓｃＦｖが抗体の同じ鎖に結合していないこと）が好ましい。２つのｓｃＦｖが抗体の対応する鎖に結合していること、すなわち、１つのｓｃＦｖが抗体の２つの重鎖のそれぞれに結合していること、又は１つのｓｃＦｖが抗体の２つの軽鎖のそれぞれに結合していることが特に好ましい。しかしながら、これは必ずしもそうではなく、すなわち、１つのｓｃＦｖが重鎖に、１つが軽鎖に結合していてもよい。
２つのｓｃＦｖは、抗体の対応する鎖に同等の位置で結合していることが特に好ましい。特定の実施形態では、（ｉ）１つのｓｃＦｖが抗体の各重鎖のＣＨ３ドメインに結合している、又は（ｉｉ）１つのｓｃＦｖが抗体の各軽鎖のＣＬドメインに結合している、のいずれかである。
前述のように、第２の結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）が、コンジュゲートの第１の結合タンパク質を構成するモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合されることも代替的に可能である。第１の結合タンパク質が単鎖抗体誘導体である、本発明の実施形態では、第２の結合タンパク質は、第１の結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合されてもよい。上記とは逆に、第２の結合タンパク質が重鎖及び軽鎖を含み、第１の結合タンパク質が単鎖のみを含む場合、第１の結合タンパク質は、上記の説明と同等に、第２の結合タンパク質の重鎖又は軽鎖のいずれかのＮ末端又はＣ末端に結合してもよい。
第２の結合タンパク質のいずれかの末端は、第１の結合タンパク質に結合されてもよく、例えば、第２の結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端は、上記の位置で、第１の結合タンパク質に結合されてもよい。特定の実施形態では、第２の結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端は、第１の結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合している。好ましい実施形態では、第１の結合タンパク質がモノクローナル抗体であり、第２の結合タンパク質がｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖのＮ末端は、抗体の重鎖のＣ末端に結合される。他の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖのＮ末端は、抗体の軽鎖のＣ末端に結合している。あるいは、ｓｃＦｖのＣ末端は、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合されてもよい。他の代替案では、ｓｃＦｖのＣ末端は、リンカー分子を介して抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合されてもよい。
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質の末端による結合の上記の議論では、Ｃ末端への結合は、Ｃ末端のカルボキシル基を介した結合を意味し、Ｎ末端への結合は、Ｎ末端のアミノ基を介した結合を意味している。あるいは、それらの末端で結合されるのではなく、第２の結合タンパク質は、第１の結合タンパク質内のアミノ酸の側鎖に結合されてもよく、及び／又は第１の結合タンパク質は、第２の結合タンパク質内のアミノ酸の側鎖に結合されてもよい。この例では、アミノ酸は、第１の結合タンパク質及び／又は第２の結合タンパク質内の任意の場所、すなわち、Ｎ末端又はその付近、Ｃ末端又はその付近、又はポリペプチド鎖内の中央の位置に配置されてもよい。
適切な種類の共有結合を使用して、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質を結合することができる。例えば、２つのタンパク質は、システイン残基の側鎖の間のジスルフィド結合によって結合されてもよい。あるいは、２つのタンパク質は、例えば、アミノ酸側鎖間（例えば、一方の抗原結合タンパク質のリシン残基の側鎖と、他方の抗原結合タンパク質のグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖との間）、又は側鎖と末端との間（例えば、一方の結合タンパク質のＣ－末端と、他方の結合タンパク質のリシン残基の側鎖との間）のイソペプチド結合によって結合されてもよい。好ましい実施形態では、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、ペプチド結合によって結合されており、すなわち、第２の結合タンパク質（又は第２の結合タンパク質の少なくとも１つの鎖）は、第１の結合タンパク質の鎖の少なくとも１つと同じポリペプチド鎖内に位置している。
上述のように、第２の結合タンパク質は、好ましくは単鎖抗体誘導体、例えば、ｓｃＦｖであり、第１の結合タンパク質は、好ましくはモノクローナル抗体である。第２の結合タンパク質が単鎖抗体誘導体（好ましくはｓｃＦｖ）であり、第１の結合タンパク質がモノクローナル抗体である例では、第２の結合タンパク質は、抗体の軽鎖又は重鎖と同じポリペプチド鎖内に位置してもよい。
第２の結合タンパク質及び第１の結合タンパク質の１つの鎖が、単一のポリペプチド鎖内に位置する場合、第１の結合タンパク質の鎖は、第２の結合タンパク質に対してＮ末端に位置することが好ましいが、第２の結合タンパク質は、第１の結合タンパク質の鎖に対して代替的にＮ末端に位置してもよい。
特定の実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、モノクローナル抗体である第１の結合タンパク質と、ｓｃＦｖである第２の結合タンパク質と、を含み、ｓｃＦｖは、抗体の重鎖と同じポリペプチド鎖内に位置している。好ましくは、ｓｃＦｖは、抗体のＣＨ３ドメインに結合するように、抗体重鎖のＣ末端に位置する（ただし、ｓｃＦｖは、抗体重鎖のＮ末端に位置してもよい）。あるいは、ｓｃＦｖは、抗体の軽鎖と同じポリペプチド鎖内に位置してもよい。好ましくは、ｓｃＦｖは、抗体のＣＬドメインに結合するように、抗体軽鎖のＣ末端に位置する（ただし、ｓｃＦｖは、抗体軽鎖のＮ末端に位置してもよい）。
第１の結合分子及び第２の結合分子は、互いに直接結合していてもよく、又はリンカーを介して結合してもよい（すなわち、互いに間接的に結合してもよい）。リンカーによって２つのタンパク質を結合させる方法は、当技術分野でよく知られており、文献に広く記載されている。例えば、２つのチオール基と反応可能な二官能性薬剤、例えば、ヨード酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）又はＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）をタンパク質と反応させることによって、２つのシステイン残基のチオール基間のリンカーを介して２つのタンパク質を互いに結合することも可能である。アミド及びチオエーテル結合は、例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いて達成することができ、したがって、システイン残基のチオール基間及び／又はアミン基間のリンカーとして使用することができる。したがって、リンカーは、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質中の官能基と反応して、２つの鎖の間に共有結合を形成する化学試薬、すなわち、架橋剤であってもよい。多くのリンカー分子が知られており、抗体構築物の分野を含む、コンジュゲートの構成部分を一緒に連結するための当該技術分野において標準であり、任意のこのようなリンカーを使用することができる。
代替的かつ好ましい実施形態では、上記のように、第２の結合タンパク質（又はその鎖）は、第１の結合タンパク質（又はその鎖）と同じポリペプチドに位置する。本実施形態では、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、ペプチドリンカーによって結合されてもよい。例示的なペプチドリンカーは、潜在的に繰り返されるＧ４Ｓモチーフ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を含む。このモチーフは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーにおいて使用されてもよく、ｎは、典型的には１～１０、例えば、２～６である。代表的なリンカー（ｎ＝２、すなわち、当該リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーである）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される。適切なリンカーの他の例は、リジッドリンカーＥＡ３Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）である。このリンカーモチーフはまた、例えば、二量体（ＥＡ３Ｋ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）の形態で、繰り返されてもよい。リンカーペプチドは、２つの結合タンパク質（又はその鎖）を一緒に連結すること以外には、機能的又はエフェクター的な役割を果たさない。リンカーは、２つの結合タンパク質を空間的に分離し、どちらかのタンパク質の機能が他方によって立体的に阻害されることを回避するために機能することができる。
特定の実施形態では、二重特異性コンジュゲートは、モノクローナル抗体である第１の結合タンパク質と、ｓｃＦｖである第２の結合タンパク質と、を含み、ｓｃＦｖは、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、抗体重鎖、リンカー（特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２のリンカー）及びｓｃＦｖを含むポリペプチド鎖中に位置する；又は（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、抗体軽鎖、リンカー（特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２のリンカー）及びｓｃＦｖを含むポリペプチド鎖中に位置する。
上記のように、二重特異性コンジュゲートの第２の結合タンパク質は、本質的に任意のペプチド又はアミノ酸配列であってもよいペプチド部分（すなわち、ペプチド配列）を認識する。ペプチド部分は、ヒト細胞の表面で発現していないペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチド部分は、非ヒトアミノ酸配列を有する（すなわち、非ヒトアミノ酸配列からなる）。「非ヒトアミノ酸配列」とは、ヒトゲノムにコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列から若しくはポリペプチド中のアミノ酸配列から得られない、又は由来しないアミノ酸配列を意味する。したがって、本実施形態では、第２の結合タンパク質によって認識されるエピトープは、非ヒトエピトープ、すなわち、非ヒト配列を有するエピトープであり、第２の結合タンパク質は、ヒトタンパク質と特異的に結合又は認識しない。
ペプチド部分は、天然ペプチド、すなわち、天然のタンパク質配列に由来する配列を有するペプチドであってもよい。この場合、ペプチド配列は、非ヒト由来のタンパク質に由来することが好ましく、例えば、ペプチド配列は、微生物に由来していてもよい。微生物由来のペプチド配列は、原核生物（すなわち、細菌又は古細菌）又は微生物真核生物（例えば、酵母）から得られるものであってもよい。したがって、特定の実施形態では、ペプチド部分は、細菌に由来するアミノ酸配列、すなわち、細菌アミノ酸配列（細菌タンパク質に由来するアミノ酸配列）を有する。細菌アミノ酸配列は、任意の適切な細菌、例えば、グラム陽性菌又はグラム陰性菌に由来してもよい。他の実施形態では、ペプチド部分の配列は、ウイルスに由来する。すなわち、第２の結合タンパク質は、微生物タンパク質、例えば、細菌タンパク質、又はウイルスタンパク質からのエピトープを認識してもよい。
特定の実施形態では、ペプチド部分は、微生物毒素に由来する（すなわち、微生物によって産生される毒素に由来する）アミノ酸配列を有する。好ましくは、アミノ酸配列は、細菌毒素に由来する（すなわち、第２の結合タンパク質が、細菌毒素に由来する配列を認識することが好ましい）。有利には、アミノ酸配列は、標準的なワクチン接種スケジュールにおいて（トキソイドの形態で）使用される細菌毒素に由来する。これらのトキソイドに対するヒトの免疫学的応答は既知であり、このようなトキソイドは、負の（すなわち損傷を与える）免疫応答を誘発することなくヒトに投与することができることが知られている。したがって、本発明のワクチン複合体に関連するペプチドタグとしてのこのような配列の使用は、安全であると合理的に仮定することができる。好ましくは、同定された配列は、内因性抗体と高い親和性で結合しないか、又は内因性抗体が結合しても、二重特異性コンジュゲートのｓｃＦｖ結合を上回らない（ｄｏ ｎｏｔ ｏｕｔ－ｃｏｍｐｅｔｅ）。
現在のトキソイドワクチンとしては、破傷風ワクチン及びジフテリアワクチンが挙げられ、それぞれ破傷風トキソイド（Ｔｔｄ、破傷風毒素の不活性型、Ｔｔｘ）及びジフテリアトキソイドが使用されている。したがって、第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（破傷風の原因物質）又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリアの原因物質）由来のものであってもよい。特に、第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分は、破傷風毒素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｃ４ＰＤ０５）又はジフテリア毒素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ００５８８）由来であってよい。ジフテリア毒素は、技術的にはＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ細菌ゲノムではなく、プロファージＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｂｅｔａによってコード化されることが当業者には知られているが、本開示の目的では、ジフテリア毒素は、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ由来であると定義される。好ましい実施形態では、第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分は、破傷風毒素に由来する（すなわち、第２の結合タンパク質は、破傷風毒素内のエピトープを認識する）。「破傷風毒素に由来する」とは、第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分が、破傷風毒素中に存在するアミノ酸配列を含む、又はアミノ酸配列からなることを意味する。
あるいは、タグペプチドは、人工的な配列、すなわち、第２の結合タンパク質が、天然に存在するいかなるタンパク質とも特異的に結合しないような、自然界に存在しないアミノ酸配列を有してもよい。
一実施形態では、タグペプチドは、αらせん構造を有する。他の実施形態では、タグペプチドは非構造化であり、すなわち、特定の二次構造を採用しない。ペプチドの二次構造は、一般に公開されているソフトウェア（例えば、Ｊｐｒｅｄ４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｊｐｒｅｄ／，Ｄｒｏｚｄｅｔｓｋｉｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（Ｗ１）：Ｗ３８９－Ｗ３９４，２０１５）及びＰＡＳＴＡ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｂｉｏ．ｕｎｉｐｄ．ｉｔ／ｐａｓｔａ２／，Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（Ｗ）：Ｗ３０１－Ｗ３０７，２０１４）を使用して予測することができる。ペプチド二次構造は、当該技術分野でよく知られているように、円偏光二色性分光法によって実験的に決定することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（６）：２８７６－２８９０，２００６を参照)。
タグペプチドを選択する際の一つの考慮点は、当該ペプチドが可変構造を有するべきではないことである。言い換えれば、理論に拘束されることなく、タグペプチドの構造が状況によって変化しない、又は変更されないことが望ましい可能性がある。例えば、タグペプチドが溶液中で「裸」である場合（すなわち、未修飾）、支持体に結合している場合（すなわち、固定化）、並びにＮ末端及び／又はＣ末端が修飾されている場合、例えば、ペプチドが（例えば、抗原との）融合タンパク質に関連して合成されている場合、又は化学標識されている場合などに、タグペプチドの構造が同一であることが望ましいと思われる。ペプチドが変化しやすい構造を持つ場合、幾つかの状況では第２の結合タンパク質と高い親和性で結合しない可能性がある。例えば、円偏光二色性分光法を使用して、タグペプチドの構造が状況間で変化するかどうかを決定することができる。
上記のように、好ましい実施形態では、タグペプチドは、破傷風毒素に由来する。破傷風毒素に由来する適切なタグペプチド配列の例には、以下でさらに議論するＭＴＴＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＷＯ２０１１／１１５４８３）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のペプチド（Ｐ００１～Ｐ００５、ＷＯ２０２０／１０４６９０）が含まれる。
ＭＴＴＥは、既知の破傷風毒素由来の配列であり、殆どの個体が内因性抗体を発達させている普遍的なＢ細胞エピトープである。本発明者らは、ＭＴＴＥ配列をトリミングした（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＭＴＴＥのアミノ酸１～１２に対応する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に説明されるペプチドを得る）場合、このより短いペプチドに対するｓｃＦｖの結合が保持されることを発見した。したがって、特定の実施形態では、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に記載されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。他の実施形態では、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６～２９に説明されるもののいずれか１つなどのＭＴＴＥのより長いフラグメント、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に記載される全長ＭＴＴＥを含む、又はそれらからなることができる。
あるいは、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して最大２つのアミノ酸置換を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の最小ＭＴＴＥエピトープの変異体を含んでもよい。したがって、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して１つのアミノ酸置換を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の変異体、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して２つのアミノ酸置換を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の変異体を含んでもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のこのような変異体の数は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～４１に記載されており、したがって、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～４１に記載されたアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよい。したがって、第２の結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含むエピトープ、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して最大２つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を認識してもよい。
Ｐ００１～Ｐ００５ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５）は、ＷＯ２０２０／１０４６９０に記述されている。そこに詳述されているように、Ｐ００１～Ｐ００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１４）は、破傷風毒素に由来し、一方で、Ｐ００５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）は、Ｎ末端のＡｓｐ残基及びＣ末端のＡｒｇ残基でキャップされたＰ００１に相当する。Ｎ－ビオチン化Ｐ００１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｐ００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）及びＰ００５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）は、αらせん二次構造を示すことを見出したが、Ｐ００２～Ｐ００３は構造化されていなかった。予想通り、ＭＴＴＥは、最近破傷風に対してワクチン接種をした被験体からの血清からの抗体と結合することが明らかとなり、Ｐ００２は、同じ被験体の少数からの血清からの抗体と結合し、Ｐ００１及びＰ００３～Ｐ００５は、どの被験体からの血清からの抗体とも結合しなかった。
したがって、特定の実施形態では、タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、又はそれらからなる。タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のいずれか１つの変異体、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のいずれか１つに対して最大２つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のいずれか１つに対して１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５のいずれか１つに対して２つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列）を代替的に含む、又はそれらからなってもよい。更なる代替案では、タグペプチドは、例えば、少なくとも５、６、７又は８アミノ酸のフラグメント（例えば、８～１５、１０～１５、８～１２又は１０～１２アミノ酸のフラグメント）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１５の破傷風毒素由来のペプチドのいずれかの一部を含む、又はそれからなってもよい。例えば、タグペプチドは、（Ｐ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のフラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２の破傷風毒素由来ペプチド、又は（Ｐ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のフラグメントである）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、４４、４５及び４６の破傷風毒素由来ペプチドのいずれか１つを含む、又はそれらからなってもよい。タグペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６のいずれか１つに対して最大２つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６のいずれか１つに対して１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６のいずれか１つに対して２つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列）を代替的に含む、又はそれらからなってもよい。したがって、第２の結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１６又は２５～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するエピトープを認識し、したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１６、２５又は４２～４６のいずれか１つの配列を有するエピトープで破傷風毒素を結合してもよい。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のＭＴＴＥフラグメント(及び実施例で示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の全長ＭＴＴＥ)を結合するｓｃＦｖの例には、１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）及び１ＢＩＩＩＣＩ－ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８） が含まれる。１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂ ｓｃＦｖのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９～５４に記載されている。１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂのＶＨＣＤＲ１、２及び３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９～５１に記載のアミノ酸配列を有し、１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂのＶＬＣＤＲ１、２及び３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２～５４に記載のアミノ酸配列を有する。１ＢＩＩＩＣＩ－ｂ ｓｃＦｖのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５～６０に記載されている。１ＢＩＩＩＩＣＩ－ｂのＶＨＣＤＲ１、２及び３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５～５７に記載のアミノ酸配列を有し、１ＢＩＩＩＩＣＩ－ｂのＶＬＣＤＲ１、２及び３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８～６０に記載のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、第２の結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９～５４に記載のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含むｓｃＦｖである。他の実施形態では、第２の結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５～６０に記載のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含むｓｃＦｖである。更に他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載のアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に記載のアミノ酸配列、又はそれらに少なくとも８０、９０又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列（ＣＤＲは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９～５４又は５５～６０に記載のとおりであるという但し書き）を含むｓｃＦｖである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及び１４のＰ００３及びＰ００４ペプチドに結合するｓｃＦｖの例としては、ｓｃＦｖのＹ－ＳＭ０８３－ｐ０３－Ｃ０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｃ０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｄ０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｆ０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｇ０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）及びＹ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｈ０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）が挙げられる。これらのｓｃＦｖは、全てＷＯ２０２０／１０４６９０に記載されている。Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０３－Ｃ０６は、Ｐ００３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）と結合し、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｃ０４、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｄ０４、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｆ０４、Ｙ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｇ０４及びＹ－ＳＭ０８３－ｐ０４－Ｈ０４は、全てＰ００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に結合する。一実施形態では、第２の結合タンパク質は、したがって、Ｐ００３と結合するｓｃＦｖであってもよく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０、９０又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。他の実施形態では、第２の結合タンパク質は、Ｐ００４と結合するｓｃＦｖであってもよく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～７３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０、９０又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれらからなる。
本発明の二重特異性コンジュゲートは、当該技術分野において知られている方法によって合成することができる。特に、上記のように、コンジュゲートの第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、融合タンパク質（特に、抗体の重鎖（第１の結合タンパク質）及びｓｃＦｖ（第２の結合タンパク質）を含む融合タンパク質であり、軽鎖は別のポリペプチドとして提供される）として関連して提供されることが好ましい。この例では、コンジュゲートは、本発明の結合タンパク質の産生に関して上述したように、タンパク質発現系を使用して合成することができる。
他の態様では、本発明は、本発明の結合タンパク質又は二重特異性コンジュゲートをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。Ａ９軽鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に記載され、Ａ９重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に記載される。この態様の実施形態による核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。核酸分子は、１つ以上のポリペプチド鎖をコード化してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、軽鎖、重鎖、又はその両方をコード化してもよい。２つの核酸分子が提供されてもよく、その中の１つは、軽鎖をコードし、その中のもう１つは、対応する重鎖をコード化している。このような核酸分子又は一対の核酸分子は、コンジュゲートが生成されるように一緒に発現されてもよい。軽鎖及び重鎖をコード化するポリヌクレオチドは、２つの鎖を別々に（すなわち、２つの別々のプロモーター及び他の発現制御要素の制御下にある別々の遺伝子として）コード化してもよく、又はそれらをポリシストロン的（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃａｌｌｙ）にコード化してもよい。あるいは、２つの鎖は、自己スプライシングリンカー（２Ａリンカーなど、Ｌｅｗｉｓら、２０１５，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５６：２２－２９を参照）により分離された単一のポリペプチドとしてコード化されてもよい。
本発明の核酸分子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）によって記載されているように、当技術分野でよく知られている方法に従って合成することができる。
核酸分子は、コード化ヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む発現カセットの形態で提供されてもよく、したがって、タンパク質発現系でのコンジュゲートの発現を可能にする。これらの発現カセットは、今度は、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運ぶことができ、コンジュゲート又はその鎖を発現させることができるベクターであってもよい。
したがって、本開示及び本発明はまた、本明細書に定義される核酸分子を含む組換え構築物も含み、好ましくは、核酸分子は、異種核酸配列に連結されている。本明細書で使用される「異種」とは、本明細書に記載の核酸分子に天然に連結されていない核酸配列、すなわち、本明細書に記載の核酸分子に自然界で連結されていない核酸配列を意味する。当該構築物では、本明細書に記載の核酸分子は、本発明の核酸分子の容易なクローニングを可能にするために、制限部位（すなわち、１つ以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列）によって隣接されてもよい。「組換え」構築物は、組換え技術、例えば、分子クローニングを使用して合成された核酸構築物である。
構築物に関して本明細書で使用される用語「連結され（ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸分子が異種核酸配列に直接結合されることを単に意味する場合がある。好ましい実施形態では、組換え構築物において、本明細書に開示される核酸分子は、発現制御配列が核酸分子の発現を制御するように、異種発現制御配列に作動可能に連結される。
したがって、本明細書で定義される核酸分子を含む発現カセット、又は本明細書で定義される核酸分子若しくは組換え構築物を含むベクターもまた提供される。発現ベクターは、分子生物学の技術分野において日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡ、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び、コンジュゲート又はその鎖の発現を可能にするために必要であり、正しい方向に配置されているポリアデニル化シグナルなどの他の要素、の使用を含むことができる。他の適切なベクターは当業者には明らかであり、例えば、クローニングベクターを含む。
本発明はまた、本発明の核酸分子、組換え構築物、又はベクターを含む細胞を提供する。このような細胞は、このような分子、構築物、又はベクターが導入された細胞である。細胞は、宿主細胞、例えば、クローニング宿主細胞（核酸分子、組換え構築物又はベクターの合成及び／又は産生内で使用）又は生産宿主細胞（核酸分子、組換え構築物又はベクターによってコード化されるタンパク質の発現に使用）として定義され得る。
このような細胞としては、哺乳類細胞若しくは昆虫細胞などの一過性の、若しくは好ましくは安定した高等真核生物細胞株、酵母などの低級真核生物細胞、又は細菌細胞などの原核生物細胞が挙げられる。細胞の特定の例としては、哺乳類ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳＯ及びＣＯＳ細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化及び細胞表面発現を可能にするものである。
上記のように、更なる態様では、本発明は、本発明の第２の態様の二重特異性コンジュゲートと、抗原に共有結合したコンジュゲートの第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分を含むタグ構築物と、を含む複合体を提供し、タグ構築物のペプチド部分は、コンジュゲートの第２の結合タンパク質に非共有結合している。このような複合体は、タグ構築物がコンジュゲートの第２の結合タンパク質に結合するように、二重特異性コンジュゲートをタグ構築物と接触させることによって形成することができる。
第２の結合タンパク質によって認識されるペプチド部分は、上述したとおりである。記載のように、本質的に任意の配列であってよいが、好ましくは非ヒト配列、好ましくは細菌配列、最も好ましくは破傷風毒素に由来する配列である。
ＷＯ２０２０／１０４６９０に記述されているように、ペプチドライブラリーをスクリーニングして、可能性のあるタグペプチドを同定してもよい。例えば、非ヒトタンパク質配列、例えば細菌タンパク質、例えば破傷風毒素（ＴＴＸ）からの、又はそれらに由来するペプチドのライブラリーを得て、適切な特性を有するペプチドを同定するためにスクリーニングしてもよい。このような特性には、例えば、良好な水溶性、及びα－らせん構造又は二次構造の欠如が含まれ得る。ペプチドライブラリーは、合成ペプチドの調製を含む様々な方法で作成することができる。スクリーニングは、様々な利用可能なソフトウェアプログラムを使用してｉｎ ｓｉｌｉｃｏで行われてもよく、及び／又は構造解析若しくは他の解析によって行われてもよい。
上述のように、タグ構築物は、抗原に共有結合したタグペプチドを含む。共有結合は、コンジュゲート中の第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質の共有結合に関して、上述したとおりであってもよい。連結は、直接的であっても間接的であってもよく、すなわち、タグペプチドは、上記のように、リンカーを介して抗原に結合されてもよい。
特定の実施形態では、タグ構築物は、すなわち融合ポリペプチドとして、抗原ペプチドに連結されたタグペプチドを含むポリペプチドである。融合は、（リンカーペプチドを介して）直接的であっても間接的であってもよい。タグペプチド及び抗原ペプチドは、いずれの順序で連結されてもよく、すなわち、タグペプチドは、抗原ペプチドのＮ－末端又はＣ－末端に位置していてもよい。他の実施形態では、抗原はタグ構築物に埋め込まれている、すなわち、抗原のＮ－末端及びＣ－末端の両方にタグ部分がある。したがって、タグ構築物は、タグペプチドが構築物のＮ－末端及びＣ－末端に位置するような、タグペプチドと隣接する抗原を含んでもよい。
上記のように、タグペプチドは本質的に任意のペプチドであってもよいが、特定のペプチドが特に好ましい。抗原は、同様に、被験体において免疫応答を生じさせることが望まれることに対するペプチドであってもよい。しかしながら、特に、タグ構築物は、天然に存在するペプチドではない。好ましくは、タグペプチド及び抗原は、異なるタンパク質に由来し、より好ましくは異なる種に由来する。したがって、タグ構築物は、自然界に存在する配列ではなく、その一方の部分がタグ部分として機能し、そのもう一方の部分が抗原として機能する。むしろ、タグ構築物は、人工的な配列を有している。
抗原は、ＣＤ４０を保有する細胞、及び特にＡＰＣ、例えば、ＤＣに送達することが望まれる抗原であってよい。したがって、抗原は、ＡＰＣが提示することが望まれる抗原であってもよい。したがって、抗原は、ＡＰＣによって提示されたときに、活性化することが望まれるＴ細胞によって認識される抗原であってよい。治療との関連で、治療若しくは予防が望まれる疾患又は状態に関連する抗原を認識するＴ細胞を活性化することが望ましい。したがって、抗原は、切除することが望まれる、又はより詳細には切除のために標的化することが望まれる細胞によって（例えば、その表面上に）発現される抗原であってもよい。したがって、抗原は、がん抗原（すなわち、がん細胞の発現を示す配列）又は感染に関連する抗原、例えば、病原体の抗原又は病原体に由来する抗原であってもよい。したがって、Ｔ細胞の標的細胞は、がん細胞であってもよいし、病原体に感染した細胞であってもよい。病原体は、ウイルスであってもよいし、細胞内細菌（例えば、ｃｈｌａｍｙｄｉａ種）又は原虫（例えば、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍなどのアピコンプレキサン）などの細胞内病原体であってもよい。
したがって、抗原は、１つ以上の抗原性エピトープを含むペプチドである。エピトープは、ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はＢ細胞エピトープであってもよい。抗原は、がん細胞又は病原体によって発現されるタンパク質又はポリペプチド、若しくはその一部であってもよい。特に、抗原は、がん細胞によって発現されるネオ抗原、すなわち、がん細胞における体細胞突然変異によって生じた抗原であり、非がん細胞によって発現されない抗原であってもよい。したがって、抗原ペプチドは、１つ以上のネオエピトープを含んでもよい。このようなネオエピトープは、例えば、フレームシフト変異によって生成される場合がある。このような変異は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示すがんにおいて生じる可能性がある。様々なネオ抗原及びネオエピトープが知られており、様々な異なるがんに関連して、文献に記述されている。ネオアンチゲンは、代替的にがん特異的抗原と呼ばれることがある。代替的又は追加で、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原又はオンコウイルスからの抗原からの１つ以上のエピトープであってもよいし、それらを含んでもよい。さらに、腫瘍関連抗原は、当該技術分野でよく知られており、例えば、がん精巣抗原及びｈＴＥＲＴ抗原を含む文献に広く記述されている。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原を含む、腫瘍ウイルス抗原はまた、よく知られ、記述されている。既知の有効ながん抗原（腫瘍特異的ネオエピトープ及び腫瘍関連抗原の両方）の包括的な一覧は、オンラインで公開されており、「Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」は 、ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ／Ｐｅｐｔｉｄｅ／ｌｉｓｔでアクセス可能である。腫瘍抗原の広範な一覧はまた、Ｗａｎｇ＆Ｗａｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１１－３７，２０１７に提供されている。ネオ抗原、がん関連抗原、及びオンコウイルス抗原は、本明細書においてがん抗原として定義される。
ウイルス抗原及び他の細胞内病原体によって発現される抗原はまた、当該技術分野でよく知られている。抗原は、所定の病原体の１つ以上の血清型からの１つ以上のエピトープであるか、又はそれらを含むことができ、ＣＤ４及びＣＤ８エピトープ、及び／又は線形若しくは立体構造的Ｂ細胞エピトープを含むこともできる。
したがって、抗原は天然に存在するペプチド分子、又は天然に存在するタンパク質のフラグメント若しくはその一部であってもよい。あるいは、合成ペプチド、例えば、１つ以上の異なるエピトープ、例えば、天然には一緒に存在しないエピトープを含むように設計されかつ調製されたペプチドであってもよい。このような合成ペプチドは、直接的に、又はリンカー若しくはスペーサー配列によって間接的に連結された２つ以上のエピトープを含んでもよい。このような合成エピトープ含有ペプチド（例えば、合成ロングペプチド、ＳＬＰ）の合成は、当該技術分野で知られており、既知のＳＬＰペプチドが使用され得る。
更なる態様では、本発明は、（ｉ）上述のような本発明の結合タンパク質、（ｉｉ）上述のような本発明の二重特異性コンジュゲート、又は（ｉｉｉ）上述のような本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供する。結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート又は複合体に加えて、医薬組成物はまた、少なくとも1つの薬学的に許容される担体又は賦形剤も含んでいる。
また、本発明によって提供されるものは、上記で定義したように、二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物を別々に含む、キット及び製品である。このようなキット及び製品では、コンジュゲート及びタグ構築物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物中に別々に提供され得る。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体又は賦形剤」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などが含まれる。
好ましくは、担体又は賦形剤は、非経口、例えば、皮内、静脈内、筋肉内若しくは皮下投与（例えば、注射又は注入による）に適している。投与経路に応じて、結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート、複合体又はその構成成分は、それを不活性化若しくは変性させる可能性のある酸及び他の自然条件の作用からそれらを保護する材料でコーティングされてもよい。
好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。医薬組成物、キット及び製品に採用され得る適切な水性担体の例としては、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの適切な混合物、オレイン酸エチルなどの植物油及び注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合の必要な粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを含むことが好ましいであろう。
医薬組成物、製品又はキットはまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。また、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、及び様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によって、確保され得る。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含有させることにより、注射用医薬品の吸収を延長させることができる。
治療用組成物は通常、無菌であり、かつ製造及び保管の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。
無菌注射液は、必要な量の活性剤（例えば、複合体）を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせで適切な溶媒中に取り込み、その後、滅菌精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性剤を、基本的な分散媒体と、上記に列挙した成分の中から必要な他の成分と、を含む無菌媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）に組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性剤の粉末、加えてそのあらかじめ無菌濾過した溶液から追加の所望の成分、を得る真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
医薬組成物、製品及びキットは、結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート、複合体又はその成分と同様に、追加の活性成分を含んでいてもよく、例えば、それらは、追加の治療剤又は予防剤を含んでもよい。したがって、複合体は、例えば、がんの治療において、単剤療法として、又は併用療法の一部として使用することができる。本明細書に記述されるようなキット又は組み合わせ製品は、使用説明書を追加で含んでもよい。
本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体、本発明の医薬組成物、本発明のキット、及び本発明の組み合わせ製品は、治療において使用することができる。したがって、本発明は、治療に使用するための本発明の結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート、複合体、医薬組成物又はキットを提供する。治療とは、被験体の治療を意味する。本明細書で使用する「治療」とは、あらゆる医学的状態の治療を意味する。このような治療は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）（すなわち、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ））、治癒的（又は治癒を意図した治療）、又は緩和的（すなわち、単に状態の症状を制限、緩和又は改善することを目的とした治療）であってよい。治癒的及び緩和的な適用において、複合体又は組成物は、既に障害又は状態に苦しんでいる対象に、その状態又はその症状の１つ以上を治癒、緩和若しくは部分的に停止させるために十分な量で投与される。このような治療的処置は、疾患症状の重症度の減少、又は無症状期間の頻度若しくは持続時間の増加をもたらす可能性がある。これを達成するための十分な量は、「治療的有効量」と定義される。ある目的に対する有効量は、治療される疾患又は状態、その重症度、並びに被験体の大きさ／体重及び一般的な状態に依存する。
予防的治療には、症状の予防、又は症状の進展若しくは発症の遅延が含まれる場合がある。例えば、複合体を使用して、感染症を予防する、又は感染症が進展する程度を低減する、又はがんの進展又は再発を予防、遅延若しくは低減する、例えば、転移の程度を予防又は低減することができる。
本明細書で定義される被験体とは、哺乳類、例えば、牛、馬、羊、豚若しくはヤギなどの家畜、ウサギ、猫若しくは犬などのペット動物、又はサル、チンパンジー、ゴリラ若しくはヒトなどの霊長類のことに言及する。最も好ましくは、被験体は、ヒトである。
本発明の組み合わせ製品は、本明細書に定義される二重特異性コンジュゲート及び本明細書に定義されるタグ構築物を、治療における同時又は逐次使用のための結合製剤として含む。すなわち、本明細書に開示された組み合わせ製品が、本発明に従って使用される場合、すなわち、治療において、コンジュゲート及びタグ構築物は、被験体に同時に又は逐次的に投与される。同様に、本発明のキットが治療において使用される場合、二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物は、被験体に同時に又は逐次的に投与される。本明細書で使用される「同時」投与とは、２つの成分が、同じ投与経路によって、かつ実質的に同じ場所で、同時に、又は少なくとも実質的に同時に、被験体に投与されることを意味する。本明細書で使用される「逐次」投与とは、２つの成分が異なる時間に被験体に投与されることを意味する。特に、第１の成分の投与は、第２の成分の投与が開始される前に完了する。
本発明の性質上、二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物を逐次投与するためには、両方を同じ経路で、実質的に同じ場所に投与することが必要である。さらに、コンジュゲート及びタグ構築物の投与は、時間的に間隔があってもよいが、投与の間隔は、両方の成分が投与されたときに、複合体が形成されるような間隔であるべきである。したがって、例えば、両成分は、互いに１時間以内、より詳細には、互いに４０、３０、２０、１５、１０、８、７、６、５、４、３、２若しくは１分以内、又は１分未満で投与されてもよい。
本発明の複合体（又はこのような複合体を含む医薬組成物）が治療目的で被験体に投与されるという言及は、複合体の両方の成分（すなわち、本発明の二重特異性コンジュゲート及び上記のようなタグ構築物）を含む予備混合組成物（例えば、溶液）を指すものとして理解され、この成分は、複合体及びその二つの個々の成分を含む動的平衡状態に存在し得る。
特に、本発明の結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート、複合体、組成物、キット、又は複合製品は、がんの治療又は予防に使用することができる。がんとは、悪性又は前悪性の新生物状態を意味する。したがって、がんは、臓器、組織又は細胞型のいずれかのがんであってもよい。固形腫瘍として現れるがん、及び固形腫瘍を示さないがんが含まれる。したがって、造血器系のがんが含まれる。
がんは、前立腺がん、乳がん、大腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、メラノーマ、膀胱がん、頭頸部がん、リンパ腫、グリオブラストーマ又は皮膚がんであってもよい。また、副腎がん、骨がん、脳腫瘍、上食道がん、眼がん、胃がん、口腔がん、陰茎がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、及び膣がんであってもよい。肥満細胞腫及び血管肉腫はまた、本発明に従って治療され得る。がんは、新たに診断され、治療に対してナイーブであってもよいし、再発又は難治性であってもよいし、再発及び難治性、原発性又は転移性であってもよい。
以上説明したように、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質は、ＡＰＣ、特に樹状細胞上のＣＤ４０をアゴニスト化又は刺激することにより、免疫系を活性化させる。特に、これは、Ｔ細胞の活性化をもたらすと考えられる。その後の免疫応答は、腫瘍によるＣＤ４０の発現に関係なく、隣接する又はアクセス可能な腫瘍細胞に対して抗がん効果を発揮する。したがって、本発明の結合タンパク質、又はそれを含む複合体は、ＣＤ４０陽性及びＣＤ４０陰性の両方のがんに対して有効であると考えられる。結合タンパク質はまた、病原体に対するワクチン接種レジメン内のアジュバントとしてその効果を発揮することができる。ワクチンプラットフォーム（例えば、弱毒化ウイルス又はＤＮＡ／ＲＮＡベースのワクチン）がそれ自体では十分な免疫応答を刺激しない場合、中和抗体又はＴ細胞応答をもたらす有効な抗病原体免疫応答を刺激するために、ＣＤ４０活性化が必要な場合がある。
ＣＤ４０特異的結合タンパク質によって提供されるアゴニスト的な免疫活性化効果に加えて、本発明の複合体はまた、処理されて活性化されたＴ細胞に提示される可能性がある抗原を提供し、したがって、Ｔ細胞は、抗原を発現するがん細胞又はウイルス感染細胞に刺激される可能性がある。これは、例えば、腫瘍が外科的に切除された場合など、がん抗原の存在が低い若しくは減少している状況、又は抗ＣＤ４０治療薬を腫瘍内に送達できない場合に、特に有益であると考えられる。複合体は、アゴニスト活性化シグナルの近傍にがん抗原を提供するための手段を提供する。
複合体によって送達されるがん抗原は、被験体及び特定のがんに基づいて選択される場合があり、その結果、個別化医療が可能になる。例えば、被験体のがんは、遺伝子プロファイリングに供され、適切な抗原を選択することが可能である。抗原のバンク若しくはライブラリー、又は抗原を含むタグ構築物が提供され、そこから被験体のがんの種類に応じて、適切なタグ構築物を調製又は選択することができる。
本発明の結合タンパク質、複合体（並びにキット及び組み合わせ製品）はまた、感染症の治療又は予防に有用である。本発明は、ウイルス感染症、特にＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染症に対する治療（例えば、ワクチン接種に対して）において、特に使用され得る。本発明に従って（ワクチン接種によって）治療又は予防され得るＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染症としては、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＳＡＲＳの原因物質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ１９の原因物質）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶなど）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロス川ウイルス及び麻疹ウイルスによる感染症が挙げられる。
本発明はまた、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ－６）、パルボウイルスＢ１９及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こる感染症に対する治療又はワクチン接種に使用できるが、原則として、あらゆるウイルス感染を、本発明に従い治療又は予防することができる。
細胞内細菌感染症はまた、例えば、ブルセラ症（Ｂｒｕｃｅｌｌａ属の細菌種によって引き起こされる）、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉによって引き起こされる）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによって引き起こされる）及び肺炎（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる）などの、クラミジアの種によって引き起こされる疾患、ハンセン病（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓによって引き起こされる）、並びに、（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる）播種性結核を含む結核、はまた、本発明に従って治療され得る。リーシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属のトリパノソーマによって引き起こされる）及びトキソプラズマ症（アピコンプレキサンＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉによって引き起こされる）を含む、細胞内真菌又は原虫感染症はまた、本発明によって治療され得る。したがって、抗原はまた、前述の病原体のいずれかに由来するものであってもよい。
ＣＤ４０特異的結合タンパク質の場合、ＣＤ４０のアゴニズムは、免疫系を活性化して、（がんの治療における結合タンパク質の使用と同様の原理で）感染と闘うことができる。本発明の複合体の場合、上述のように、これは、標的病原体に由来する抗原が提供されてもよく、したがって、病原体に対する特異的な免疫応答を誘導することができる。ワクチンプラットフォームは、例えば、パンデミック状況に対して有益に適応可能である。この適応性は、ウイルスの多様性及び抗原ドリフトに対して改変可能な抗原を含むタグ構築物を使用することによって、特に提供され得る。ウイルス抗原は、ウイルスの血清型決定因子と共に、特定の地域におけるＨＬＡ有病率に基づいて選択することができる。
抗原（例えば、がん抗原又は病原体由来抗原）は、治療される被験体におけるＴ細胞の特定のサブセットによって認識されるように選択されてもよく、Ｔ細胞は、選択された抗原を認識することが知られているＴＣＲを発現する。特に、抗原は、治療される被験体の養子細胞療法に使用されるＴ細胞によって認識されることに基づいて選択することができる。
例えば、養子細胞療法では、被験体からＴ細胞を入手し、関心のある抗原を認識するＴ細胞を分離することができる。単離されたＴ細胞は、その後、エフェクター機能を刺激するために膨張及び／又はその他の処理が施され、その後、治療される被験体に再注入される可能性がある。これに関連して、再注入されたＴ細胞によって認識される抗原は、タグ構築物において使用されてもよい。その後、抗原が、再注入されたＴ細胞を活性化させるように、本発明の複合体を被験体に投与してもよい。
あるいは、Ｔ細胞は、治療される被験者又はドナーから入手し、遺伝子改変して標的抗原を認識するＴＣＲを発現することができる。その後、遺伝子改変Ｔ細胞は、そのエフェクター機能を刺激するために膨張及び／又はその他の処理が施され、治療される被験者に注入（又は再注入）される可能性がある。これに関連して、遺伝子改変Ｔ細胞によって認識される抗原は、タグ構築物において使用され得る。その後、抗原が、注入されたＴ細胞を活性化させるように、本発明の複合体を被験者に投与してもよい。本発明の複合体の投与が養子細胞療法と組み合わされる方法は、タグ構築物において使用される抗原が、がん抗原である場合において、がんの治療において特に有用である。
したがって、本発明は、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体又は本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む、がんを治療又は予防する方法を提供する。
同様に、本発明は、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート、本発明の複合体又は本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む、感染症を治療又は予防する方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、被験体においてがんを治療する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）被験体からＴ細胞を得る工程、
（ｉｉ）標的がん抗原を認識するＴ細胞を単離し、任意選択で、単離されたＴ細胞を膨張させる工程、
（ｉｉｉ）単離されたＴ細胞を被験体に再注入する工程、及び
（ｉｖ）被験体に本発明の複合体を投与することであって、タグ構築物が標的がん抗原を含む工程、を含む。同様に、工程（ｉｖ）では、被験体は、代替的に、本発明の二重特異性コンジュゲートと、標的がん抗原を含むタグ構築物とを別々に投与され得る。
他の実施形態では、本発明は、被験体においてがんを治療する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）被験体又はドナーからＴ細胞を得る工程、
（ｉｉ）Ｔ細胞を遺伝子改変して標的がん抗原を認識するＴＣＲを発現させ、任意選択で、遺伝子改変前又は遺伝子改変後にＴ細胞を拡大する工程、
（ｉｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞を被験体に注入する工程、及び
（ｉｖ）被験体に本発明の複合体を投与することであって、タグ構築物が、標的がん抗原を含む工程、を含む。同様に、工程（ｉｖ）では、被験体は、代替的に、本発明のコンジュゲートと、標的がん抗原を含むタグ構築物とを別々に投与され得る。
本発明は、同様に、がんを予防する治療のための薬剤の製造における、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート又は本発明の複合体の使用を提供する。
本発明はまた、感染症を予防する治療のための薬剤の製造における、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート又は本発明の複合体の使用を提供する。
上記の実施形態を通じて、本発明の複合体の使用への言及は、別々に又は逐次投与される、本発明の二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物の複合的な使用を含む。
代替の実施形態では、本発明の複合体は、遺伝子療法において使用され得る。本実施形態では、本発明の二重特異性コンジュゲート及び対応するタグ構築物の両方をコード化する遺伝子治療ベクター又は送達システムが、被験体に投与されてもよい。被験体の細胞によって取り込まれると、コンジュゲート及びタグは、発現及び分泌され、ｉｎ ｖｉｖｏで複合体を形成する。
上述のように、本発明の結合タンパク質、本発明の二重特異性コンジュゲート又は本発明の複合体は、単剤療法として、若しくは他の治療剤と併用して使用することができる。したがって、がんの治療において、他の治療剤は、当該技術分野で多数の種類が知られている化学療法剤などの抗がん剤、又は例えば、インターフェロン、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１、－ＰＤ－Ｌ１又は－ＣＴＬＡ４抗体）及び他の免疫増強剤（例えば抗ＯＸ４０作動性抗体）などの免疫学的薬剤であってもよい。他の治療剤は、がん又は実際には感染症の治療において有益であり、例えば、抗増殖性又は抗炎症性サイトカイン、及び抗増殖性、免疫調節性又は血液凝固に影響を及ぼす因子、又は血管新生の阻害剤である。感染症の治療の場合、他の（又は第２の）治療剤は、抗菌剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤又は抗ウイルス剤であってもよい。
結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート又は複合体（若しくはそのコンジュゲート及びタグ構築物成分）を含む、結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート、複合体、又は医薬組成物は、当該技術分野において知られている様々な方法の１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路で投与することができる。同様に、コンジュゲート及びタグ構築物は、これらの同じ方法によって個別に投与されてもよい。当業者には理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路、例えば、注射又は注入による、例えば、腫瘍の部位への直接投与が挙げられる。
本明細書で使用する「非経口投与」という語句は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射による投与である。あるいは、局所投与、表皮投与又は粘膜投与経路などの非経口投与経路が、使用されてもよい。腫瘍周辺投与、腫瘍近接投与、腫瘍内投与、病巣内投与、病巣周囲投与、腔内注入、小胞内投与、及び吸入を含む局所投与が、好ましい。しかしながら、抗原結合タンパク質、複合体又は組成物は、全身的に投与することもできる。
二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物が個別に投与される、すなわち、複合体を形成するためにこれらが最初に予備混合されることはない実施形態では、コンジュゲート及びタグ構築物は、同じ経路で投与されなければならない。好ましくは、二重特異性コンジュゲート及びタグ構築物は、投与後速やかに２つの成分が混合し、したがって複合体を形成するように、局所的に、例えば皮内に、同じ（又は実質的に同じ）部位に投与される。これらの実施形態では、２つの成分は、第１の成分の投与と第２の成分の投与との間の遅延を避けて、同時に又は急速で順々に被験者に投与されなければならない。これにより、第１の成分が劣化するか、又は投与部位から過剰に拡散する前に、第２の成分が投与され、複合体形成が可能になることが保証される。
本発明の特異的結合タンパク質、二重特異性コンジュゲート又は複合体の適切な投与量は、熟練した医療従事者によって決定され得る。本発明の医薬組成物及び製品中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の被験体、すなわち、患者に対して、患者への毒性がなく、所望の治療反応を達成するために有効な有効成分の量を得るように、変化させることができる。選択された投与量は、採用された特定の複合体／コンジュゲートの活性と、投与経路と、投与時間と、複合体の排泄速度と、治療の期間と、採用された特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物及び／又は材料と、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全身状態及び以前の病歴と、医学分野で良く知られている同様の要因とを含む、様々な薬物動態的要因に依存する。
本発明の結合タンパク質又は複合体の適切な投与量は、例えば、治療される患者の約０．１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であってよい。例えば、適切な投与量は、１日当たり約０．１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１日当たり約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために、調整することができる。例えば、単一のボーラスを投与してもよいし、数回に分けて経時的に投与してもよいし、治療状況の緊急性に適応して、投与量を相対的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される被験体への単位投与量として適した物理的に離散した単位に言及し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含んでいる。
結合タンパク質又は複合体（若しくはコンジュゲート及びタグ構築物）は、単回投与又は複数回に分けて投与することができる。複数回の投与は、同じ又は異なる経路で、同じ又は異なる部位に投与することができる。あるいは、複合体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、より少ない頻度での投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者における投与種の半減期及び所望する治療期間に応じて変化し得る。投与量及び頻度はまた、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて変化させることができる。予防的な用途では、比較的低い投与量を長期間にわたって比較的不定期間隔で投与することができる。治療的な用途では、例えば、患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的高い投与量が投与され得る。例示的な投与体制では、複合体（又はコンジュゲート及びタグ構築物の組み合わせ）は、１週間に１回、２週間に１回又は３週間に１回、２～１０回繰り返される周期で、被験体に投与される。
２つ以上の薬剤の複合投与は、多くの異なる方法で達成することができる。一実施形態では、複合体及び他の薬剤は、単一の組成物中で一緒に投与されてもよい。他の実施形態では、複合体及び他の薬剤は、複合療法の一部として別々の組成物で投与されてもよい。例えば、複合体は、他の薬剤の前、後、又は同時に投与されてもよい。本発明の複合体は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲ、及びＬＡＧ３を標的とする、腫瘍標的抗体、標的治療、経路阻害剤又は他の免疫調節抗体と組み合わせて又はこれらに連続して投与されてもよい。さらに、複合体はまた、局所放射線照射と組み合わせてもよい。同様に、コンジュゲート及びタグ構築物が被験体に個別に投与される場合、このような追加の治療が共投与されてもよい。
上述のように、本発明はまた、抗原を認識するＴＣＲを発現するＴ細胞を活性化するｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供し、前記方法は、抗原提示細胞を、
ｉ）本発明の二重特異性コンジュゲート及び上記で定義されたタグ構築物であって、前記タグ構築物が、前記ＴＣＲによって認識される抗原を含むもの、又は
ｉｉ）本発明の複合体であって、前記複合体のタグ構築物が、前記ＴＣＲによって認識される抗原を含むもの、
と接触させることを含む。
したがって、本発明の複合体又は二重特異性コンジュゲートを使用して、上記のようなｉｎ ｖｉｔｒｏと同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでＡＰＣを活性化することができる。（タグペプチドとの組み合わせにおける）複合体及び二重特異性コンジュゲートは、したがって、医学的及び非医学的用途の両方を有し、全てのこのような用途は、本明細書に包含される。例えば、単離された又は培養されたＡＰＣは、例えば、研究、開発又は試験の目的のために、例えば、実験室環境において、複合体と接触させることができる。これは、コンジュゲート及びタグ構築物を予め混合して、複合体を形成し、次いで複合体をＡＰＣに適用することによって達成することができる。あるいは、複合体をＡＰＣ培養物内で形成するように、コンジュゲート及びタグ構築物を個別にＡＰＣに適用することができる。
上述のように、複合体を使用して、タグ構築物に存在する抗原を認識するＴＣＲを発現するＴ細胞を活性化することができる。具体的には、ＴＣＲは、ＡＰＣによって提示されたときに（すなわち、ＭＨＣに関連して）抗原を認識する。したがって、複合体によって活性化されたＡＰＣ、又は複合体による活性化のためのＡＰＣを、Ｔ細胞と接触させることができる。したがって、例えば、ＡＰＣは、複合体（又はその構成部分）の存在下で、培養又はインキュベートされてもよく、その後にＡＰＣをＴ細胞と接触させてもよく、例えば、共培養してもよく、Ｔ細胞の存在下で更にインキュベートすることも可能である。あるいは、複合体（又はその構成部分）、ＡＰＣ及びＴ細胞は、一緒にインキュベート又は共培養されてもよい。したがって、抗原は、ＡＰＣに送達され、Ｔ細胞に提示され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。
本発明は、以下の非限定的な図及び例によって、更に説明される。
図１では、ＣＤ４０Ｌの存在下及び非存在下における、（ＳＰＲで測定された）１１種類の抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０への結合を示している。ＣＤ４０Ｌ存在下でのＣＤ４０への結合の減少は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用が、その抗体のＣＤ４０への結合を妨害していることを示す。 図２では、様々な抗ＣＤ４０抗体で４８時間刺激した後の、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ８３の表面発現に対する集計データのｔ－ＳＮＥ ＦＡＣＳ分析を示している。試験した抗体は、３つのクラスター、すなわち、ＩｇＧ２アイソタイプコントロールを含む非拮抗薬、Ａｂ１（すなわち、ＩｇＧ１アイソタイプの１１５０／１１５１）を含む中間アゴニスト、並びにＡｂ２（すなわち、ＩｇＧ２アイソタイプの１１５０／１１５１）及びＬＰＳコントロールを含む強力アゴニスト、に分けることができる。本明細書に開示された新規抗体のうち、Ａ９抗体及びＦ４抗体のみが、強力なアゴニストとしての可能性を示した。 図３では、ＥＬＩＳＡ法により測定した、（凡例に記載した）様々な濃度での様々な抗ＣＤ４０抗体で刺激した樹状細胞によるＩＬ－１２産生を示している。 図４は、抗ＣＤ４０－ＦＩＴＣ抗体５Ｃ３による染色の検出を示す、一対のＦＡＣＳヒストグラムである。薄い灰色のヒストグラムは、ＣＤ１９＋細胞上の５Ｃ３のみによる染色を表示する。濃い灰色のヒストグラムは、非標識ＣＤ４０結合抗体Ａｂ－５（Ａ）又はＡ９（Ｂ）とプレインキュベーションした後の、５Ｃ３染色を表示する。点線の灰色のヒストグラムは、ネガティブコントロールのバックグラウンド基準として、染色されていないＣＤ１９＋細胞を表示する。 図５は、ヒト単球由来樹状細胞を使用して、５分から４時間にわたるＡ９抗体（黒丸）及びＡｂ－２抗体（１１５０；白丸）の内在化パターンを示す図である。 図６は、高濃度（２００ｎＭ）又は低濃度（１．６ｎＭ）のＡ９抗体（Ｄ）並びにＡ９ベースの二重特異性コンジュゲートＢｉ－２１（Ａ）、Ｂｉ－２２（Ｂ）及びＢｉ－２３（Ｃ）で刺激した樹状細胞の顕微鏡写真である。非刺激ネガティブコントロール（Ｆ）及びＬＰＳ刺激ポジティブコントロール（Ｅ）も示す。 図７は、高濃度（２００ｎＭ）又は低濃度（１．６ｎＭ）のＢ８抗体（Ａ）並びにＢ８ベースの二重特異性コンジュゲートＢｉ－２４（Ｂ）、Ｂｉ－２５（Ｃ）及びＢｉ－２６（Ｄ）で刺激した樹状細胞の顕微鏡写真である。 図８では、ＥＬＩＳＡによって測定された、抗ＣＤ４０抗体Ａ９及びＢ８、Ａ９ベースの二重特異性コンジュゲートＢｉ－２１、Ｂｉ－２２及びＢｉ－２３、並びにＢ８ベースの二重特異性コンジュゲートＢｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６で刺激した樹状細胞の上清中のＩＬ－１２のｐｇ／ｍｌにおける濃度（ｙ軸）を示している。凡例に示すように、様々な抗体／コンジュゲート濃度で試験を行った。 図９では、２００ｎＭのＡ９並びにＢ８抗体、Ｂｉ－２１、Ｂｉ－２２、Ｂｉ－２３、Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６二重特異性コンジュゲートによる樹状細胞刺激後の、フローサイトメトリーによって測定した樹状細胞活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲ（「ＭＨＣ－ＩＩ」と表示される；Ａ）、ＣＤ８３（Ｂ）及びＣＤ８６（Ｃ）の発現を示している。ＬＰＳをポジティブコントロールとして使用した。倍率変化（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）は、ネガティブコントロール（培地）の値との関係で定義されている。 図９では、２００ｎＭのＡ９並びにＢ８抗体、Ｂｉ－２１、Ｂｉ－２２、Ｂｉ－２３、Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６二重特異性コンジュゲートによる樹状細胞刺激後の、フローサイトメトリーによって測定した樹状細胞活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲ（「ＭＨＣ－ＩＩ」と表示される；Ａ）、ＣＤ８３（Ｂ）及びＣＤ８６（Ｃ）の発現を示している。ＬＰＳをポジティブコントロールとして使用した。倍率変化（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）は、ネガティブコントロール（培地）の値との関係で定義されている。 図９では、２００ｎＭのＡ９並びにＢ８抗体、Ｂｉ－２１、Ｂｉ－２２、Ｂｉ－２３、Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６二重特異性コンジュゲートによる樹状細胞刺激後の、フローサイトメトリーによって測定した樹状細胞活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲ（「ＭＨＣ－ＩＩ」と表示される；Ａ）、ＣＤ８３（Ｂ）及びＣＤ８６（Ｃ）の発現を示している。ＬＰＳをポジティブコントロールとして使用した。倍率変化（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）は、ネガティブコントロール（培地）の値との関係で定義されている。 図１０では、抗ＣＤ４０抗体Ａ９（ＩｇＧ２又はＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓとして）及び示した二重特異性コンジュゲートで刺激した樹状細胞からのｐｇ／ｍｌ（ｙ軸）でのＩＬ－１２産生を示している。ＬＰＳ：ポジティブコントロール。培地：ネガティブコントロール。 図１１では、実施例１５に記載のように、タグペプチドＵＵ０１又はペプチド単独（ネガティブコントロール基準）の存在下で構築物ＳＰ－７及びＳＰ－９で樹状細胞を刺激した後の、フローサイトメトリーによって測定した、樹状細胞活性化マーカーＣＤ８６（Ａ）及びＨＬＡ－ＤＲ（「ＭＨＣ－ＩＩ」と表示される；Ｂ）の発現を示している。ＬＰＳをポジティブコントロールとして使用した。 図１２では、実施例１５に記載のように、タグペプチドＵＵ０１又はペプチド単独と複合した構築物ＳＰ－７及びＳＰ－９で刺激された樹状細胞からのＩＬ－１２産生を示している。ＬＰＳをポジティブコントロールとして使用した。 図１３では、２つの二重特異性コンジュゲートのいずれか単独（それぞれ「Ｂｉ－２３」及び「Ｂｉ－１７」）、又はペプチドＵＵ４４との複合体（それぞれ「Ｂｉ－２３＋ＵＵ４４」及び「Ｂｉ－１７＋ＵＵ４４」）、又はＵＵ４４ペプチド単独で刺激したＭｏＤＣ：ｓによる、実施例１６に記載のＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張を示している。 図１４では、ＳＰＲによって測定された、様々な短縮型ＭＴＴＥペプチドに対するｓｃＦｖのＩＢＩＩＩＣＩ（灰色の棒）及び１４ＧＩＩＩＣＩＩ（白色の棒）の正規化された結合応答を示している。結合反応値は、ペプチドＵＵ２４へのｓｃＦｖの結合について得られたシグナルに正規化されている。また、値は、ｓｃＦｖの捕捉レベル及び標的ペプチドの分子量の違いについて正規化されている。各サンプルの結合反応は、解離段階の開始時に取得された。
実施例１
ヒトｓｃＦｖライブラリーを使用するヒトＣＤ４０のファージディスプレイ選択
ファージディスプレイ選択を行い、ヒトＣＤ４０に特異的なｓｃＦｖフラグメントの単離を可能にした。
材料及び方法
ファージディスプレイ選択
バイオパニングは、２つのヒト合成ｓｃＦｖファージライブラリー、ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１及びＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ２（ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ、ストックホルム、スウェーデン）を採用した４回の選択ラウンドの濃縮を使用して実施した。ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１及び２は、ナイーブなヒト合成ｓｃＦｖライブラリーであり、以前に報告されたもの（Ｓａｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１６）２９：４２７－４３７）と同様の設計及び構造である。簡単に言えば、ヒト生殖細胞遺伝子ＩＧＨＶ３－２３及びＩＧＫＶ１－３９をライブラリーの足場として使用し、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を使用して６つのＣＤＲのうち４つ、すなわち、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３及びＶＬＣＤＲ３への多様性を導入した。ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１１２０６Ｄ）、及びｈＣＤ４０－ａｖｉと称するＡｖｉタグ付きヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＣＤ０－Ｈ８２Ｅ８、アミノ酸２１－１９３）を使用して選択を行った。Ａｖｉタグは、ビオチンの部位特異的な組み込みを可能にする。抗原量を徐々に（３２７ｎＭから３５ｎＭに）減らし、異なるラウンドの間の洗浄の回数及び強度を増やすことによって、選択圧力を増加させた。
非特異的結合剤又はストレプトアビジン結合剤を除去するために、ラウンド１及び２の前に空のストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズに対してファージストックをインキュベートすることによって、予備選択を実施した。また、ブロッキング剤として１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を選択手順の間中含んでいた。抗原結合ファージの溶出は、トリプシン－アプロチニン法を使用して実施した。ファージ－標的タンパク質のインキュベーション工程を除く選択プロセス全体は、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘロボットを用いて自動化され、実施された。回収したファージをＸＬ１ ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉで、３７℃で一晩寒天培地上（ラウンド１及び２）、又は３０℃で一晩溶液中（ラウンド３及び４）のいずれかで増殖させた。ファージストックは、過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｎ０３１５Ｓ）に感染させ、ＩＰＴＧの添加によりｓｃＦｖ発現を誘導することにより作製した。一晩培養したものをＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させ、選択バッファーに再懸濁し、次のラウンドの選択に使用した。
ｓｃＦｖの再クローニングと発現
可溶性ｓｃＦｖの産生を可能にするため、各選択トラックの第３ラウンド及び第４ラウンドのファージミドＤＮＡを単離した。プールでは、ｓｃＦｖフラグメントをコード化する遺伝子を制限酵素消化し、スクリーニングベクターにサブクローニングし、Ｃ末端にトリプルＦｌａｇタグ及びヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグと共に、ｓｃＦｖの分泌のためのシグナルを提供した。続いて、この構築物をＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。９６ウェルフォーマットで可溶性ｓｃＦｖを発現させるため、シングルコロニーを摘出し、培養し、ＩＰＴＧ誘導した。合計で、細菌上清に存在する９４０個のｓｃＦｖクローンが、一次ＥＬＩＳＡスクリーニングのために調製された。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ストレプトアビジンを１μｇ／ｍｌのＰＢＳで３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩、洗浄後、ブロッキングバッファー（０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳ）で０．１μｇ／ｍｌに希釈したｈＣＤ４０－ａｖｉを添加した。ストレプトアビジン及びＢＳＡの２種類のネガティブコントロールタンパク質もプレート上にコーティングした。細菌上清中に存在するＦｌａｇタグｓｃＦｖクローンをブロッキングバッファーで１：３に希釈し、コーティングされたタンパク質に結合するようにした。結合の検出は、ＨＲＰ結合α－Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ８５９２）に続いて、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ基材（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３４０２９）とのインキュベーションによって可能になった。１Ｍ硫酸を加えることで発色を停止し、４５０ｎｍで測定した。全てのサンプルは、二重にアッセイした。
ＤＮＡシークエンシング
ｈＣＤ４０－ａｖｉに結合する１５７個の陽性ｓｃＦｖクローンをＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｅｂｅｒｇｓｂｅｒｇ、ドイツ、）に送り、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡシークエンシングが行われた。
結果
ＳｃｉＬｉｆｅＬｉｂ１及び２を使用して、ヒトＣＤ４０について２つの選択トラックを並行して実施した。選択されたｓｃＦｖクローンの再クローニング後、合計９４０個のコロニーが選択ラウンド３及び４から選ばれた。一次ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果、１５９件のヒット候補が得られた。これらのＤＮＡシークエンシングの結果、５９の配列特異的なクローンが同定された。
実施例２
ＳＰＲによる５９の配列特異的ｓｃＦｖの速度論的スクリーン（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｃｒｅｅｎ）
実施例１からの５９の配列特異的ｓｃＦｖクローンを、異なるクローンのランク付けを可能にするために、速度論的スクリーンベースの方法で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による更に特性評価のために選択した。
材料と方法
速度論的スクリーニングは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。捕捉リガンドとして機能するα－Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ１８０４）を、製造元の推奨に従ってＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４面全てに固定化した。
細菌上清中に存在する５９のＦｌａｇタグ付きｓｃＦｖクローンを注入し、チップ表面に捕捉した後、２５ｎＭのヒトＣＤ４０細胞外ドメイン－Ｆｃ融合構築物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１４９３－ＣＤＢ、ＣＤ４０アミノ酸 ２１－１９３；ｈＣＤ４０－Ｆｃ）を注入した。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．２で再生された。全ての実験は、ランニングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＨＢＳ、ｐＨ７．５）中、２５℃で行った。
基準面（α－Ｆｌａｇ Ｍ２抗体固定化表面）の応答曲線を差し引くことにより、応答曲線センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）が得られた。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１ソフトウェアを使用して解析した。
結果
α－Ｆｌａｇ Ｍ２抗体をＣＭ５－Ｓチップの４つの表面全てに固定化し、同様のＲＵレベルの捕捉ｓｃＦｖクローンを得た。２５ｎＭのｈＣＤ４０－Ｆｃを注入後、低ｐＨの酸溶液を使用して各表面の再生に成功した。
データの分析は、センサーグラムの目視検査によって行った（図示されていない）。試験したｓｃＦｖのうち１５個は、ｈＣＤ４０への結合に基づき有望であると考えられた。特に、高い結合反応及び好ましいスローオフレート（ｓｌｏｗ ｏｆｆ－ｒａｔｅ）が考慮された。
実施例３
完全抗体フォーマットへの変換
ファージ選択から最も有望な１２個のｓｃＦｖが、完全長ヒトＩｇＧ２抗体フォーマットへの変換のために選択された。これらの特定のクローンを含む根拠は、結合アッセイのパネルにおける性能（実施例１及び２を参照）及び配列分析であった。２つのネガティブコントロールは同様に、ヒトＩｇＧ２に変換された：Ｇ－Ｓｔｒｅｐ－１（ＧＳ１、社内の抗ストレプトアビジンｓｃＦｖ）及びＢ１－８（抗４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）ｓｃＦｖ、Ｒｅｔｈら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８（６）：３９３－４００，１９７８）、並びに文献で見出された２つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体、すなわち、１１５０／１１５１（ＷＯ２０１５／０９１８５３）及びＣＰ－８７０，８９３（ＵＳ２０１７／０３４２１５９）。比較として、後者の２つもヒトＩｇＧ１フォーマットに変換された。ｈＩｇＧ１及びｈＩｇＧ２としての１１５０／１１５１は、本明細書においてそれぞれＸ－ＳＭ０８３－Ａｂ－１及びＸ－ＳＭ０８３－Ａｂ－２と呼ばれ、ｈＩｇＧ１及びｈＩｇＧ２としてのＣＰ－８７０，８９３は、本明細書においてそれぞれＸ－ＳＭ０８３－Ａｂ－４及びＸ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５（略して、それぞれＡｂ－１、Ａｂ－２、Ａｂ－４及びＡｂ－５）と呼ばれる。ファージ選択によるｓｃＦｖから産生された１２個のＩｇＧ２抗体を、Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ１、Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ６、Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ９、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ１、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ３、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ８、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｃ６、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｅ７、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｅ８、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｆ４、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｆ７及びＹ－ＳＭ０８３－Ｇ２（略して、それぞれＡ１、Ａ６、Ａ９、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ８、Ｃ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｆ４、Ｆ７及びＧ２）と呼ぶ。
材料及び方法
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング、ＨＥＫ２９３への遺伝子導入、発現及び精製
選択したｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域をＰＣＲ増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｐｌｕｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃６３８９０９）を使用して、社内で構築したベクターｐＨＡＴ－ｈＩｇＧ２に挿入した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ａ１４５２５）を使用して、８０ｍｌ培養でプラスミドＤＮＡのｅｘｐｉＨＥＫ２９３細胞への遺伝子導入を実施した。培養物を５日後に採取し、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＡ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）を使用したアフィニティークロマトグラフィーと、続いてＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケア）を使用したＰＢＳへのバッファー交換によって抗体を精製した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬ発色エンドトキシンアッセイにより決定され、＜１ＥＵ／ｍｇであった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って精製ＩｇＧの純度及び完全性を決定し、濃度はＩｍｐｌｅｎ ＮＰ８０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して決定した。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーを各精製抗体に対して実行した（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－３）。
ＥＬＩＳＡ
ビオチン化抗原は、ｈＣＤ４０－ａｖｉ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＣＤ０－Ｈ８２Ｅ８）では０．１μｇ／ｍｌの濃度で、ＮＰ及びニトロヒドロキシヨードフェニルアセテート（ＮＩＰ、Ｂ１－８ ｓｃＦｖによっても認識される）では１μｇ／ｍｌの濃度で、ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ）を通じて３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定化された。精製した抗体をブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で希釈し、最終濃度を１、０．２、０．０４μｇ／ｍｌとし、ウェルに添加した。結合したＩｇＧの検出は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧκ抗体を使用し、次に発色剤ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）をインキュベートすることにより行った。シグナル発現は、１Ｍ硫酸の添加により停止され、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
結果
全てのＣＤ４０結合抗体及びコントロールは、ヒトＩｇＧフォーマットに再クローニングされ、ＨＥＫ２９３細胞で発現し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ装置でプロテインＡ結合磁気ビーズにより精製された。全ての抗体は、予想される分子量であり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価して、許容可能なレベルの純度を示していた。ＥＬＩＳＡでは、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｃ６を除いて、変換後も全てのクローンの抗原結合が維持されていることが確認された（データは示されていない）。したがって、このクローンは、更なる分析から除外された。
Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ９のＶＬ及びＶＨ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及び８に記載されており、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ８のＶＬ及びＶＨ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１及び６２に記載されている。１１５０／１１５１及びＣＰ－８７０，８９３のＶＬ及びＶＨ配列は、先行技術から知られている（上記を参照）。ＩｇＧ２フォーマットに変換された他のｓｃＦｖクローンの配列は、示されていない。
実施例４
１１個の抗ＣＤ４０ ｈＩｇＧ２抗体の速度論的測定
ヒトＣＤ４０に対するＩｇＧ２抗体（実施例３で作製された）のうち１１の速度定数を、シングルサイクルカイネティック（ＳＣＫ）法を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。また、マウスＣＤ４０（ｍＣＤ４０）及びカニクイザルＣＤ４０（ｃＣＤ４０）の両方に対する異種間結合を評価した。
材料及び方法
シングルサイクルカイネティック（ＳＣＫ）又はシングルインジェクション法を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）におけるＳＰＲにより、速度定数を決定した。
捕捉リガンドとして機能するα－κ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃２８９５８３２５）を、製造元の推奨に従って、ＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４面全てにＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーによって固定化した。プロテインＡ精製ＩｇＧ２抗体（実施例３）を注入し、クローン間の応答単位（ＲＵ）が等しくなるように、チップ表面に捕捉させた。
それぞれ１００ｎＭ～１．２ｎＭ及び８０ｎＭ～０．３１ｎＭの範囲の５つの濃度からなる、ｈＣＤ４０－ａｖｉの３倍希釈系列、並びにｈＣＤ４０－Ｆｃ及びｃＣＤ４０－Ｆｃの４倍希釈系列を、ランニングバッファー（ＨＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０添加、ｐＨ７．５）に調製し、チップ表面上に逐次注入した。解離段階の後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１で表面を再生した。８０ｎＭの単濃度注入も、ｍＣＤ４０で行われた。本研究で使用したＣＤ４０タンパク質の詳細を表１に示す。
基準面（α－κ抗体固定化表面）の応答曲線を差し引くことで、全ての抗体の応答単位センサーグラムを得た。反応速度定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価用ソフトウェア３．１及び１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して計算した。
Figure 2023526977000002
結果
全ての抗体について、等しい捕捉レベル（ＲＵ）が得られた。分析対象物の注入後、チップ表面は正常に再生され、次の抗体捕捉サイクルに備えて活性表面が残された。決定された速度定数及び親和性の概要については、表２を参照されたい。
ここで使用した抗原のうち２つは、Ｆｃ融合型であり、したがってこれらは、結合してホモダイマーを形成することを覚えることが重要である。結合の強さは、従来から親和定数（ＫＤ）で報告されている。しかしながら、この定数は、一価の相互作用の強さを表すのに使用され、Ｆｃ融合抗原は、抗体表面と二価で相互作用し、それによって相乗効果及び親和性の見かけ上の増加をもたらす可能性があることを考慮して、筆者らは、代わりに見かけの親和性（ａｐｐＫＤと表記する）を報告した。
相互作用のアビディティの寄与は、抗原が単量体又は二量体であることだけでなく、抗体自体にも依存する。同一の抗原に特異的な結合剤は、結合速度論が異なるため、親和性効果が大きく異なる場合がある。幾つかの結合剤には潜在的なアビディティの寄与があるものの、筆者らは、ｈＣＤ４０－ｆｃ及びｃＣＤ４０－Ｆｃの両方との相互作用について、ａｐｐＫＤの計算にはＬａｎｇｍｕｉｒ １：１結合モデルを選択した。これは、実用的な方法で、前進するために最良の結合剤を選択することができる平均的な画像を提供するために考えられた。
予想通り、全ての抗体がヒトＣＤ４０タンパク質と結合することが示された。しかしながら、幾つかのクローンは、ｈＣＤ４０－Ｆｃに対する結合のみを示し、ｈＣＤ４０－ａｖｉに対する結合は示さなかった（又は結合反応が低すぎて速度論的測定に適さなかった）。ｈＣＤ４０－Ｆｃに対する結合のａｐｐＫＤは、全てのＹ－ＳＭ０８３抗体で５～２０ｎＭの範囲であったが、ｈＣＤ４０－ａｖｉに対する対応値はかなり高いものであった。この相違は、ｈＣＤ４０－Ｆｃが二量体であり、アビディティ効果（複数の親和性の蓄積された強さ）を引き起こす可能性がある、という事実によって説明できる可能性が最も高い。Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ１及び－Ｇ２を除く全ての抗体は、カニクイザルＣＤ４０－Ｆｃとの交差結合も示した。マウスＣＤ４０との結合は、いずれの抗体も検出できなかったが、これはヒトとマウスＣＤ４０との間の配列相同性が比較的低い（５８％）ことから、ある程度予想されたことである。
Figure 2023526977000003
実施例５
表面プラズモン共鳴によるイヌＣＤ４０との結合の評価
実施例４では、新規抗ＣＤ４０抗体のセットについて、マウスＣＤ４０（ｍＣＤ４０）及びカニクイザルＣＤ４０（ｃＣＤ４０）の両方に対する異種間結合を評価した。本実施例では、同じ抗体のサブセットを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、イヌＣＤ４０（ｃａＣＤ４０）への結合について分析した。
材料及び方法
ＳＰＲ実験は、シングルサイクルカイネティック（ＳＣＫ）法を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）で実施された。捕捉リガンドとして機能するα－Ｆａｂ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃２８９５８３２５）を、製造業者の推奨に従って、ＣＭ５－Ｓアミンセンサーチップの４面全てにＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーを通して固定化させた。実施例３の７つのプロテインＡ精製ＩｇＧ２抗体（Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ１、Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ９、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ１、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｂ８、Ｙ－ＳＭ０８３－Ｆ７、Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－２、Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５）を注入して、クローン間の応答単位（ＲＵ）が等しくなるように（４００－５００ＲＵ）チップ表面に捕捉させた。ｈＣＤ４０－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃１０７７４－Ｈ３８Ｈ）及びｃａＣＤ４０－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃７０１０５－Ｄ０２Ｈ）を０．１６～１００ｎＭの範囲で５倍に希釈したものをランニングバッファー（ＨＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．５）中で調製し、１２０秒の会合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を使用してチップ表面上に逐次注入した。６００秒間の解離段階の後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１で表面を再生した。
ＣＰ－８７０，８９３（Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５）の速度定数をより確実に決定するために、フォローアップ実験で実験パラメータを最適化した。ここでは、抗体捕捉レベルを約４００から２００ＲＵに減らし、抗原濃度範囲を０．６２～５０ｎＭ（５濃度、３倍希釈系列）に減らし、会合時間及び解離時間をそれぞれ２４０秒及び１２００秒に増加させた。α－κ抗体を固定化した基準面の応答曲線を差し引くことで、全ての抗体の応答単位センサーグラムを得た。データの解析には、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌ ｖ．３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
結果
予想通り、分析された全ての抗体は、ヒトＣＤ４０に対する結合を示した。得られたセンサーグラム（データは示されていない）は、以前に得られたものと類似しており、速度論的パラメータは、表２に報告されているものと同様であった。一方、１つの抗体のみ、すなわちＸ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５（ＣＰ－８７０，８９３）は、イヌのＣＤ４０にも結合することが示された。しかしながら、イヌＣＤ４０に対するＡｂ－５の親和性は、ヒト相同分子種に対して約１０倍低く（０．２ｎＭ対２．５ｎＭ）、これは主に前者の相互作用の解離時間がより速いことに起因している。表３では、ヒト及びイヌＣＤ４０に対するＡｂ－５（ＣＰ－８７０，８９３）の得られた速度論的パラメータを示す。両抗原は、Ｆｃ融合体であるため二量体であり、アビディティ効果の寄与を含む速度定数が得られる可能性が高い。したがって、ＫＤではなくａｐｐＫＤが与えられている。アビディティ効果の寄与が考えられるにもかかわらず、ヒトＣＤ４０及びイヌＣＤ４０の両方との相互作用のために、ａｐｐＫＤの計算に対してＬａｎｇｍｕｉｒ １：１結合モデルを選択した。
Figure 2023526977000004
結論
異なる抗ＣＤ４０抗体間の異種結合の差は、エピトープの違いによって説明できる可能性が高い。実施例６で以下に示すＣＤ４０リガンド阻害実験では、Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５及びＹ－ＳＭ０８３－Ａ９ＣＤ４０リガンドの存在に影響されないと思われる唯一の２つの抗体候補であったため、Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－５及びＹ－ＳＭ０８３－Ａ９を一緒にグループ化している。それにもかかわらず、ここで提示するデータは、Ａｂ－５（ＣＰ－８７０，８９３）のみが、イヌＣＤ４０と結合することを示しており、これらの抗体は、ＣＤ４０上の異なるエピトープに結合することが示唆される。驚くべきことに、ここでの発見とは矛盾するが、ＵＳ２００６－００９３６００の発明者は、ＣＰ－８７０，８９３がイヌ（犬）ＣＤ４０に結合しないと述べている。ＵＳ２００６－００９３６００で報告されていることと、今回のＳＰＲ試験の結果との間の相違がある理由は、現在のところ不明である。
実施例６
ＣＤ４０リガンド阻害
本実験では、１１種類の抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とヒトＣＤ４０との間の相互作用の遮断／阻害を、ＳＰＲベースの方法で説明する。
材料及び方法
捕捉リガンドとして機能するα－ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃２８９５８３２５）を、製造者の推奨に従ってＣＭ５－Ｓアミンチップの４面全てに固定化した。１１種の抗ＣＤ４０抗体（実施例４の表２に記載）を、クローン間で等しい応答単位（ＲＵ）を目指して、注入し、チップ表面に捕捉させた。ヒトＣＤ４０－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃１４９３－ＣＤＢ）をランニングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＨＢＳ）で２０ｎＭに希釈し、単独又は１０倍モル過剰のヒトＣＤ４０リガンド（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃６４２０－ＣＬ）とプレインキュベートのいずれかで注入した。２００ｎＭのＣＤ４０リガンド単独での注入も行った。解離段階の後、チップ表面を１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．１で再生した。ネガティブコントロールとして、抗ＮＰ抗体Ｂ１－８（実施例３）を含んだ。
基準面（α－ヒトＦａｂ抗体固定化表面）の応答曲線を差し引くことにより、ｈＣＤ４０－Ｆｃ単独又はＣＤ４０Ｌとプレインキュベーションされた各抗体の応答センサーグラム及び結合レベル（応答単位（ＲＵ））を取得することができた。データは、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌ ｖ．３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解析された。
結果
α－ヒトＦａｂ抗体ミックスは、チップの４つの表面全てに固定化することができ、全ての抗体クローンで同様の捕捉レベルを得ることができた。分析対象物の注入後、チップ表面は再生され、次の抗体捕捉サイクルに備えて活性表面を残すことに成功した。
得られた各抗体のＣＤ４０－Ｆｃに対する結合単位（ＲＵ）を、ＣＤ４０リガンドとプレインキュベーションしたＣＤ４０－Ｆｃに対する結合単位と比較した（図１）。その結果、９つのクローンは、ＣＤ４０リガンドが存在するとＣＤ４０－Ｆｃに対する結合の減少が示されたが、２つの抗体（Ｘ－ＳＭ０８３－ａｂ－５及びＹ－ＳＭ０８３－Ａ９）は、ＣＤ４０リガンドの存在に影響されないようであった。結合の減少を示したクローンのうち、５つは多かれ少なかれ完全に阻害され（Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ１、－Ｂ１、－Ｂ３、－Ｅ７及び－Ｇ２）、４つはリガンドの存在によって部分的に阻害されたに過ぎなかった（Ｙ－ＳＭ０８３－Ｆ７、－Ｂ８、－Ｆ４及びＸ－ＳＭ０８３－ａｂ－２）。
予想どおり、ＢＩ－８ ｈＩｇＧ２は、ＣＤ４０－Ｆｃに対する結合を示さず、ＣＤ４０リガンドとプレインキュベーションしたＣＤ４０－Ｆｃ又はＣＤ４０リガンド単独に対する結合も示さなかった。
結論
ここで得られたデータは、文献に記載されているものとほぼ一致する。Ｙｕら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３３（４）：６６４－６７５，２０１８）は、アゴニスト抗体ＣＰ－８７０，８９３、すなわちここでＸ－ＳＭ０８３－ａｂ－５と呼ばれる抗体が、ＣＤ４０リガンド相互作用を阻害せずにＣＤ４０の膜遠位システインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）に結合することを証明した。同様に、Ｘ－ＳＭ０８３－ａｂ－２のエピトープ（１１５０／１１５１）は、このドメインに位置することが報告されている。以前の研究では、この抗体とＣＤ４０リガンドとの間の競合は観察されなかった（ＷＯ２０１５／０９１８５３）。一方、ここでは、リガンドが存在する場合、抗体結合への小さな影響が観察される。この不一致は、使用した方法の違いによって説明できる可能性がある。
実施例７
新規結合剤のアゴニスト活性
継続研究のために選択された１１個のＣＤ４０結合剤のアゴニスト活性が、樹状細胞を活性化する能力によって決定され、試験された。樹状細胞の活性化は、抗体結合に反応した活性化マーカーのアップレギュレーション及びＩＬ－１２の発現に基づいて評価された。
材料及び方法
ヒト単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）の分化誘導
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なボランティアから提供されたバフィーコートから、ＳｅｐＭａｔｅ（８５４５０，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と細胞密度勾配Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（１７－５４４２－０２，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＦｉｃｏｌｌ分離により単離された。ＣＤ１４Ｐｏｓ（ＣＤ１４＋）単球の更なる分離は、製造業者のプロトコルに従って、ＭＡＣＳ細胞分離ＣＤ１４＋ビーズを使用したポジティブセレクションにより行った。
溶液及び細胞は、ＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄工程を行い、分離の間、氷上に保たれた。単離したＣＤ１４＋細胞画分の純度は、（ＣＤ１４発現に対する）フローサイトメトリーで評価した。単離したＣＤ１４＋単球をφ１０ｃｍ組織処理培養プレートで４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で培養した。１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１％ＨＥＰＥＳ及び０．２％β－メルカプトエタノール添加のＲＰＭＩ培地に１５０ｎｇ／ｍｌのｈＧＭ－ＣＳＦ（ＰｒｅＰｒｏｔｅｃｈ）及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４（ＰｒｅＰｒｏｔｅｃｈ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養を行った。培地の半分は、３日目及び５日目に、ｈＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全培地に交換された。
ＭｏＤＣの活性化
上記に続き、６日目に培養単球を採取し、ＣＤ１４及びＣＤ１ａの染色によりフローサイトメトリーで分化状態を評価した。ＤＣ活性化は、９６ウェルＴＣＴプレート（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆ、Ｓａｒｓｔｅｄ）において、異なる抗ＣＤ４０抗体のパネルを使用して、ｈＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４（前述のように使用した濃度）を補充した完全培地中にウェル当たり１×１０５個の未熟ＭｏＤＣを播種して行った。１：２連続希釈を５００ｎＭから開始した。上清は、ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ用に４８時間培養後に採取され、細胞は表面マーカー発現用にフローサイトメトリーで分析された。
フローサイトメトリー解析は、ＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＨＣＤ１４）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＰＥ－Ｃｙ５（Ｌ２４３）、ＣＤ８６－ＢＶ４２１（ＩＴ２．２）、ＣＤ４０－ＦＩＴＣ（５Ｃ３）、ＣＤ１ａ－ＰＥ（ＨＩ１４９）及びＣＤ８３－ＡＰＣ（ＨＢ１５ｅ）の細胞外発現染色により行われた。全ての抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。細胞を抗体とともに４℃で２０分間インキュベートし、その後、３ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｔＳＮＥ分析
ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）をフローサイトメトリーデータ（Ｒｔｎｓｅ ｐａｃｋａｇｅ ｉｎ Ｒ，ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｋｒｉｊｔｈｅ／Ｒｔｓｎｅ；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｔｅｎ ａｎｄ Ｈｉｎｔｏｎ（２００８），Ｊ Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ ９：２５７９－２６０５；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｔｅｎ （２０１４），Ｊ Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ １５：３２２１－３２４５）に対して行い、以前に検証したＡｂ１（Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－１）及びＡｂ２（Ｘ－ＳＭ０８３－Ａｂ－２）と同様の特性を持つ抗体の同定を行った。ＬＰＳは、追加のポジティブコントロールとして使用した。ＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＨＣＤ１４）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＰＥ－Ｃｙ５（Ｌ２４３）、 ＣＤ８６－ＢＶ４２１（ＩＴ２．２）、ＣＤ４０－ＦＩＴＣ（５Ｃ３）、ＣＤ１ａ－ＰＥ（ＨＩ１４９）及びＣＤ８３－ＡＰＣ（ＨＢ１５ｅ）パネルからのＭＦＩ（平均蛍光強度）値を、分析実行時に変数として使用した。スケーリングは、ｔ－ＳＮＥ分析の前に各マーカーに対して行われた。パープレキシティ（ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ）は、全ての分析で２に設定された。
ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、ヒトＩＬ－１２ｐ４０ ＥＬＩＳＡ Ｍａｘｉキット（４３０７０４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して行った。Ｃｏｓｔａｒ高結合９６－ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）にヒトＩＬ－１２ｐ４０捕捉抗体をコーティングした。プレートは、１×Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ａで１時間、振盪台（５００ｒｐｍ）で遮断した。全てのインキュベーションは、常温で振盪しながら行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄を行った。特に断りのない限り、各工程の後に洗浄手順を繰り返した。サンプルは、標準品と同様に、１×Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ａで希釈した。ＩＬ－１２標準品は、１：１で希釈し、開始濃度は、４０００ｐｇ／ｍｌとした。サンプル及び標準品をプレートに加え、２時間インキュベートした。その後、１×検出抗体（１００μｌ／ウェル）を加え、１時間インキュベートした。最後に、１×Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ溶液（１００μｌ／ウェル）を全てのウェルに加え、３０分間室温で振盪しながらインキュベートした。プレートは、５回洗浄し、１回につき３０～６０秒浸漬した。同量の１ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させる前に、ＴＭＢ溶液（１００μｌ／ウェル）を加え、１５分間インキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて４５０ｎＭで吸光度を測定した。
結果
ｔＳＮＥ分析の結果は、刺激抗体の濃度が１２５ｎＭの場合、図２に示されている。４８時間の刺激後のＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ８３の表面発現に関するデータを集約すると、３つのクラスター、すなわち、刺激を受けていない細胞の１つのクラスター、中間活性化プロファイル（Ａｂ１とのクラスター化、すなわちＩｇＧ１アイソタイプの１１５０／１１５１）、及び強力な作動性プロファイル（ＬＰＳ及びＡｂ２とのクラスター化、すなわちＩｇＧ２アイソタイプの１１５０／１１５１）を有する１つのクラスターが得られる。Ａ９抗体及びＦ４抗体は、強力なアゴニストとしての可能性を示す。幾つかの抗体は、中間的なアゴニストであり、多くの抗体はアゴニスト活性を示さない。
ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡの結果も同様である（図３）。この測定では、Ａ９及びＥ７が、新しい抗体の中で最も高いアゴニスト活性を有するように見えた。試験した他の新しい抗体は、低レベル又は中レベルのアゴニスト活性を示した。２つの実験で最も高いレベルのアゴニスト活性を示した抗体として、Ａ９がリード候補に選ばれた。
実施例８
ＨＤＸ－ＭＳによるエピトープマッピング
本実施例では、ヒトＣＤ４０のエピトープをマッピングするために、ヒトＣＤ４０と共にＹ－ＳＭ０８３－Ａ９抗体で水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を行った。
タンパク質を、重水（Ｄ２Ｏ）を含むバッファーに溶かすと、ヘテロ原子に結合した水素原子（例えば、－ＯＨ、－ＮＨ、又は－ＳＨ基に関連して）は、重水素で置換される。各重水素原子は、水素原子より１質量単位重いため、重水素の取り込みの程度は、ＭＳで測定することができる。さらに、重水素標識と酵素によるタンパク質分解を組み合わせると、タンパク質内の異なる領域の重水素化プロファイルを測定することができる。リガンドがタンパク質に結合すると、水素結合に局所的な変化、例えば構造の安定化又は不安定化などが生じ、したがってＨＤＸ－ＭＳ法を使用して、タンパク質複合体の結合界面を同定することができる。
材料及び方法
０．９２ｍｇ／ｍｌのｈＣＤ４０－Ｆｃ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１４９３－ＣＤＢ）のＰＢＳ溶液４μｌを、１ｍｇ／ｍｌ Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ９の１０５．７μｌとモル比で１：１になるように混合した。ＣＤ４０／抗体複合体は、１０Ｋ遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｅｒｃｋ）を使用して３６μｌに濃縮された。並行して、抗体を添加せず、ｈＣＤ４０－Ｆｃのみを含むサンプルを同様に調製した。サンプルは、自動ＨＤＸ－ＭＳシステム（ＣＴＣ ＰＡＬ／Ｂｉｏｍｏｔｉｆ ＨＤＸ）で分析され、サンプルは、自動的に標識化、クエンチ、消化、洗浄及び分離が２℃で行われた。具体的には、４μｌのｈＣＤ４０－Ｆｃ（又はｈＣＤ４０－Ｆｃ／抗体複合体）を２４μｌの重水素化ＰＢＳと混合することによって標識化し、４℃で３点の標識化時間、すなわち１０分、２５分及び６０分でインキュベートされた。
６Ｍ尿素、４１７ｍＭのＴＣＥＰ及び０．５％ＴＦＡを含む溶液を２５μｌ添加し、ｐＨを～２．３、温度を～４℃に下げることで標識反応を停止／クエンチした。サンプルは、固定化ペプシンカラム（２．１カラム（２．１×３０ｍｍ））を使用して６０μｌ／分で２分間消化した後、２ｍｍ Ｉ．Ｄ×１０ｍｍ長さのＣ－１８プレカラム（ＡＣＥ ＨＰＬＣカラム，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）を使用して０．２％ギ酸で４００μｌ／分、１分間オンライン脱塩を行った。次に、２ｍｍ Ｉ．Ｄ×５０ｍｍ長さのＨＡＬＯ Ｃ１８／１．８μｍ分析カラムを使用し、０．１％ギ酸中のＡＣＮの１８分間の８～５５％直線グラジエントでペプチドを分離し、６０μｌ／ｍｉｎで操作した。分析には、ｍ／ｚ ４００で７０，０００の分解能で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ペプチドの同定には、ソフトウェアＭａｓｃｏｔを使用し、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＵＳＡ）を使用して、全てのＨＤＸ－ＭＳデータを処理した。統計解析は、９５信頼区間を使用して行った。
結果
２５個のペプチドの重水素化速度論を、タンパク質構築物の５０％をカバーするＨＤＸ－ＭＳで追跡した。ＣＤ４０単独とＹ－ＳＭ０８３－Ａ９存在下との間の重水素標識（１０分、２５分及び６０分）及び重水素取り込み速度論を計算した。Ｎ末端に近いペプチドは、Ｙ－ＳＭ０８３－Ａ９抗体存在下で統計的に低い重水素取り込みを示し、エピトープをこの領域にマッピングした（表４）。
Figure 2023526977000005
ペプチド１及び２は、重複して、ＣＤ４０のＣＲＤ１のＮ末端に位置し、ペプチド３は、ＣＲＤ２のＮ末端（又はどのように規定されるかに応じて、ＣＲＤ１とＣＲＤ２との間の橋渡し配列）に位置している。これらは、Ａ９によって認識される立体構造エピトープの２つの部分を構成する可能性がある。
実施例９
抗ＣＤ４０抗体５Ｃ３との比較によるエピトープマッピング
本実施例では、フローサイトメトリー及び競合結合を使用して、参照として蛍光標識を持つ既知のＣＤ４０結合抗体５Ｃ３を使用し、新規抗体Ａ９が結合するＣＤ４０エピトープと既知の抗体ＣＰ－８７０，８９３（Ａｂ－５）を比較する。Ａ９又はＡｂ－５抗体で細胞を処理した後に５Ｃ３染色が行われない場合、同時結合を妨げる立体障害が存在することを意味する。言い換えれば、もし被検候補抗体への曝露後に５Ｃ３染色が起こらなければ、被検抗体及び５Ｃ３が、ＣＤ４０受容体の類似したエピトープを共有していることを示すことになる。
材料及び方法
ＰＢＭＣは、実施例７と同様に単離した。本実施例では、ＣＤ１４ネガティブ細胞画分を、２５ｎＭ～５０ｎＭの抗体Ａ９及びＡｂ－５と氷上で３０分間インキュベートして、抗体が内在化せずにその標的に結合するようにしたものを使用した。インキュベーションを終了した後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、実施例７に記載したようにＣＤ３－ＢＶ５１０（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＣＤ１９－ＡＰＣ（クローン：ＨＩ１４９）及びＣＤ４０－ＦＩＴＣ（クローン：５Ｃ３）で染色した。細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、その後ＣＤ１９＋細胞をゲートアウトして（ｗｅｒｅ ｇａｔｅｄ ｏｕｔ）ＣＤ４０発現を調査した。実験は、２人の別々のドナーで行い、双方とも同じ標識抗ＣＤ４０クローン（５Ｃ３）で染色し、同じ実験装置を使用した。
結果
図４では、薄い灰色のヒストグラムは、染色されていないＣＤ１９＋細胞と比較して、抗ＣＤ４０抗体（５Ｃ３）の検出を表示する。図４Ａでは、濃い灰色のヒストグラムは、Ａｂ－５抗体とのプレインキュベーション後の５Ｃ３による染色を示す。図４Ｂでは、濃い灰色のヒストグラムは、代わりにＡ９抗体でプレインキュベーションした後の５Ｃ３による染色を示す。図４Ａで見られるように、Ａｂ－５での前染色は、ＦＩＴＣシグナルの損失をもたらす（ネガティブコントロールに類似するヒストグラム）。逆に、図４Ｂは、Ａ９とのプレインキュベーションが５Ｃ３からのＦＩＴＣシグナルを保持することを示す。Ａｂ－５クローンで見られるシグナルの損失は、染色された５Ｃ３抗体との共有されたエピトープ結合に起因すると考えられ、Ａｂ－５の結合時の競合をもたらす。しかしながら、Ａ９抗体とのプレインキュベーションでは、５Ｃ３抗体の結合を阻害することはなく、このことは、Ａ９及び５Ｃ３がＣＤ４０の同じ結合エピトープを共有していないことを示している。
結論
その結果は、Ａｂ－５は標識５Ｃ３抗体の結合を阻害するが、Ａ９は阻害しないため、既知抗体Ａｂ－５（ＣＰ－８７０，８９３）及び新規抗体Ａ９は、同じＣＤ４０結合エピトープを共有しないことを示す。
実施例１０
Ａ９抗体の内在化
本発明との関連で、アゴニストＣＤ４０抗体の内在化は、二重特異性フォーマットでカーゴを送達するその能力にとって非常に重要である。本実施例では、新規Ａ９抗体が樹状細胞（ＤＣ）に内在化される能力を研究する。
材料及び方法
ＭｏＤＣを実施例７に記載したように単離し、培養した。６日目に、細胞を採取し、２つの９６ウェル組織処理プレートに再プレートし、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次に、試験抗体Ａｂ－２及びＡ９を１２５ｎＭの濃度で添加し、氷上で３０分間インキュベートして受容体結合を可能にした。その後、細胞を冷たい無血清ＲＭＰＩで３回洗浄し、２５０ｇで５分間、４℃で遠心分離を行った。上清は、洗浄の間に廃棄した。細胞は、内在化用には温めた完全培地に、コントロールプレートでの使用には冷えた培地に再懸濁させた。１枚のプレートは、４℃で終始インキュベートされ、１枚のプレートは、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。インキュベーションは、５分から４時間までの異なる時点で、冷ＰＢＳの添加により終了させた。次に、細胞表面に結合した抗体は、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）で分析する前に、抗κＡＰＣ（ｃａｔ ｎｏ：９２３０－１１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で４℃、３０分間染色することで検出された。内在化の程度は、以下のように計算された。
Figure 2023526977000006
結果
Ａ９（モノクローナルＩｇＧ２）抗体の内在化を、Ａｂ－２抗体（モノクローナルＩｇＧ２として１１５０）と比較した。図５に示されるように、２つの抗体の内在化パターンは、類似しており、時間の経過とともにゆっくりと内在化し、６０分後には５０％の内在化に達した。４時間培養後、約３０％の抗体が細胞外に残存していた。結論として、新規Ａ９抗体の内在化は、数時間かけてゆっくりと起こり、既知のＡｂ－２抗体（１１５０）の内在化と同程度である。
実施例１１
二重特異性抗体（コンジュゲート）の設計及び作製
Ａ９に基づく二重特異性抗体（二重特異性コンジュゲート）を多数作製した。比較のために、中程度のアゴニスト活性を示すＢ８に基づく二重特異性抗体も作製した。作製した二重特異性抗体の詳細は、表５に記載される。
Figure 2023526977000007
１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂ ｓｃＦｖは、上記に記載されており、破傷風毒素に由来する既知のＢ細胞エピトープと結合し、ＭＴＴＥと表記される。ＦＩＴＣ８ ｓｃＦｖは、ＦＩＴＣを結合し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有する（当初、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８（８）：８５２－８５６，２０００に記載された。）。上記のように、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ４０抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかと単一のポリペプチド鎖としてコード化されたものであった。表に記載されるように、各二重特異性抗体において、ｓｃＦｖは、関連する抗体鎖のＣ末端に融合され、したがって、示されるように、重鎖ＣＨ３ドメインのＣ末端又は軽鎖ＣＬドメインのいずれかに位置した。前述のように、各二重特異性抗体において、ｓｃＦｖは、表５に示されるように、リンカーによって抗体に結合されていた。
前述のように、二重特異性抗体は、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィーと続く分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。ｈＣＤ４０及びＭＴＴＥ又はＦＩＴＣとの結合が保持されていることは、ＥＬＩＳＡによって確認された。
実施例１２
二重特異性抗体による樹状細胞の活性化
材料及び方法
樹状細胞顕微鏡
培養したヒトｍｏＤＣの写真は、Ｍｏｔｉｃａｍ １０８０カメラを搭載したＶｉｓｉｓｃｏｐｅ顕微鏡を使用して、１０倍の倍率で撮影された。
ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ実験は、１：２連続希釈を２００ｎＭから開始したことを除いて、実施例７で上述したように行った。
フローサイトメトリー
抗体ＨＬＡ－ＤＲ－ＰＥ－Ｃｙ５（Ｌ２４３）、ＣＤ８６－ＢＶ４２１（ＩＴ２．２）及びＣＤ８３－ＡＰＣ（ＨＢ１５ｅ）を使用して、上記の実施例７のようにフローサイトメトリーを行い、その標的細胞表面活性化マーカーの発現量を測定した。
結果
活性化すると、樹状細胞は、ＬＰＳで活性化した樹状細胞（図６Ｅ）と比較して、活性化されていない樹状細胞（図６Ｆ）の発言によって示されるように、特徴的なクラスターを形成する。樹状細胞をＡ９抗体及びＢ８抗体、並びにそれらに由来する二重特異性抗体で処理し、その後可視化し、クラスター化によって決定される活性化を評価した。予想どおり、Ａ９抗体は、高濃度（２００ｎＭ）及び低濃度（１．６ｎＭ）の両方で有意なクラスター化（樹状細胞の活性化を示す）を誘導した（図６Ｄ）。（Ａ９ ＣＬドメインのＣ末端に付加した１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂ ｓｃＦｖを有する）Ａ９二重特異性抗体Ｂｉ－２２及び（Ａ９ ＣＨ３ドメインのＣ末端に付加したＦＩＴＣ８ ｓｃＦｖを有する）Ｂｉ－２３は、同程度のクラスター化を誘発することが分かり（図６Ｂ、６Ｃ）、同じレベルのアゴニスト活性であることが示された。（Ａ９ ＣＨ３ドメインのＣ末端に付加した１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂ ｓｃＦｖを有する）Ｂｉ－２１二重特異性抗体は、より低いレベルのクラスター化を引き起こすことが分かり（図６Ａ）、このことは、Ａ９親抗体と比較してアゴニスト活性が低下していることを示す可能性があるが、Ｂｉ－２１はまた、製造が難しいことも分かり、この二重特異性抗体は使用することに一般的に問題があることを示すこともできた。
中程度のＣＤ４０アゴニストとして予想されるように、Ｂ８抗体は、特に２００ｎＭで、樹状細胞の活性化の程度を示す幾つかのクラスター化を誘導した（図７Ｄ）。しかしながら、二重特異性抗体Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６は、いずれもＢ８抗体よりも有意に低いレベルのアゴニスト活性を示した（図７Ａ～Ｃ）。実際に、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６は、最高濃度の２００ｎＭでも殆どクラスター化を誘発せず（図７Ｂ、Ｃ）、一方でＢｉ－２４は、最高濃度で低レベルのクラスター化を誘発した（図７Ａ）。このことから、Ｂ８抗体は、Ａ９抗体には見られない、二重特異性フォーマットへの変換により、アゴニスト活性における相当な損失を被ることが示唆された。
ＩＬ－１２産生による樹状細胞の活性化を分析すると、Ａ９クローンは、相当のサイトカイン放出を誘導した一方で、Ａ９ベースの二重特異性抗体もサイトカイン放出を誘導したが、同じレベルには達しなかった。Ｂｉ－２３は、Ａ９クローン由来の二重特異性抗体の中で最も高いレベルのＩＬ－１２を誘導し、Ｂｉ－２１は最も低いレベルであった（図８）。予想どおり、Ｂ８は、Ａ９よりも低いレベルのＩＬ－１２産生を誘導したが、Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６抗体は、予想外に、いずれの抗体濃度でも検出可能なレベルのＩＬ－１２産生を誘導しなかった。
同様に、Ａ９及びＢ８の両方は、樹状細胞表面活性化マーカーであるＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣ－ＩＩ構成要素、図９Ａ）、ＣＤ８３（図９Ｂ）及びＣＤ８６（図９Ｃ）の発現を誘導した。Ａ９ベースの二重特異性抗体Ｂｉ－２３は、殆どのＡ９のアゴニスト活性を保持し、３つの表面マーカー全ての発現を誘導したが、Ｂｉ－２２及びＢｉ－２１（特に）は、アゴニスト活性が低下していた。Ｂ８ベースの二重特異性抗体Ｂｉ－２４、Ｂｉ－２５及びＢｉ－２６は、ＩＬ－１２のデータと一致するように、最小レベルのＨＬＡ－ＤＲの発現、並びに検出できない又は殆ど検出できないレベルのＣＤ８３及びＣＤ８６の発現を誘導した。
結論
これらの結果は、Ｂ８が、標準的なモノクローナル抗体に関連して中程度のアゴニスト活性を示すにも拘らず、二重特異性に関連して全てのアゴニスト活性を失っていることを予想外に示すものであった。このことは、全ての抗ＣＤ４０抗体が、本発明の二重特異性抗体への使用に適しているわけではないことを示している。Ａ９抗体は、高いアゴニスト活性を有し、Ａ９を二重特異性フォーマットに変換するときに、ある程度のアゴニズムは失われるが、一般に有効性については十分な活性が保持される。したがって、Ａ９は、本発明の二重特異性コンジュゲートにおける使用に特に適切な抗体であることが明らかである。
二重特異性フォーマットでアゴニズムが完全に消失することは、我々の知る限り、これまで観察されたことのない現象である。Ｂ８エピトープの位置は、確立されていないが、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用により抗体の結合が阻害されるため、ＣＤ４０Ｌの結合部位に近い、又は重なる部位に結合することが知られている（図１）。一方、Ａ９抗体は、ＣＤ４０Ｌ結合部位から離れたＣＤ４０のＮ末端領域に結合することが知られている（実施例８、図１参照）。このことから、本発明の二重特異性抗体において活性化させるためには、抗ＣＤ４０抗体は、嵩高いｓｃＦｖ分子がエピトープへのアクセスを立体的に阻害しないように、膜から遠位で、アクセスの良い場所でＣＤ４０に結合しなければならないという仮説が導かれた。エピトープの位置によっては、嵩高いｓｃＦｖ分子が活性化中に起こるＣＤ４０の三量体化を阻害する、又は活性化時にＣＤ４０で起こる構造変化を阻害する、という可能性もある。現在のところ、アゴニズムの損失が、二重特異性フォーマットにおけるＣＤ４０との結合の損失に起因するのか、又は二重特異性フォーマットにおいてＣＤ４０とは依然として結合するが、受容体を介したシグナル伝達を活性化する能力を損失したのかは、明らかではない。
実施例１３
追加の二重特異性コンジュゲートによる樹状細胞の活性化
本実施例では、Ａ９クローンに由来し、実施例１１に記載したように調製した追加の二重特異性構築物を使用して、ＩｇＧ２定常領域におけるＣ１２７Ｓ変異とともにリンカーの長さの影響を評価した。試験した二重特異性コンジュゲート中のｓｃＦｖは、表５に示すように、ＣＨ３又はＣＬのいずれかに位置するヒト抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖであった。実施例は、リンカー長に起因するｓｃＦｖによる潜在的な立体障害と、それが二重特異性コンジュゲートのアゴニスト能力にどのように影響するかを調べるために行われた。
材料及び方法
ＣＤ１４＋細胞の単離及び分化は、７５ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを使用したことを除いて、実施例７及び１２に記載したように行った。１００～１２．５ｎＭの間の濃度のＩｇＧ２若しくはＩｇＧ２ Ｃ１２７Ｓ定常領域を有する抗体Ａ９又は二重特異性試験コンジュゲートＢｉ－２３、Ｂｉ－２８、Ｂｉ－２９、Ｂｉ－３０、Ｂｉ－３１、Ｂｉ－３２、Ｂｉ－３３、又はポジティブコントロールとして１μｇ／ｍｌのＬＰＳを用いて、上清を採取する前に４８時間ＭｏＤＣを処理し、実施例７で説明されるようにＩＬ－１２ｐ４０ ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ－１２の産生を測定した。
結果
Ａ９及びＡ９をベースにした二重特異性抗体（Ｂｉ２３、Ｂｉ２８）及びＡ９ Ｃ１２７Ｓ及びＡ９ Ｃ１２７Ｓ二重特異性抗体（Ｂｉ２９、Ｂｉ３０、Ｂｉ３１、Ｂｉ３２及びＢｉ３３）の滴定においてＭｏＤＣからのＩＬ－１２産生量を測定し、その結果を図１０に示す。親抗体Ａ９及びＡ９ Ｃ１２７Ｓには用量依存的なアゴニスト能が見られた。実施例１２において先に試験した二重特異性コンジュゲートについて観察されたように、二重特異性コンジュゲートＢｉ－２３、Ｂｉ－２８、Ｂｉ－２９、Ｂｉ－３０、Ｂｉ－３１、Ｂｉ－３２及びＢｉ－３３は、これらの二重特異性コンジュゲートからのＩＬ－１２産生は、これらの親の対応物よりも低いレベルであるけれども、これらのそれぞれの作動能を用量に依存して保持していた。結論として、リンカー長及びリンカーの位置は、試験した二重特異性コンジュゲートのアゴニスト活性に悪影響を及ぼすことはなかった。
実施例１４
更なる二重特異性コンジュゲートの設計及び生成
材料及び方法
ＣＨＯ細胞における設計及びタンパク質発現
本開示による抗体及び二重特異性コンジュゲートの更なる変異体が設計された。簡潔には、３つの異なる抗体アイソタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びヒトＩｇＧ２ヒンジ及びＣＨ１配列をＩｇＧ１構造に移植した前記ＩｇＧ１配列からなるハイブリッド、を使用した。二重特異性コンジュゲートにおいて、ヒト化タグ結合ｓｃＦｖ配列は、可動性の（Ｇ４Ｓ）２又は強固な（ＥＡ３Ｋ）２リンカーのいずれかによって、３つのアイソタイプ変異体のいずれかのＣＨ３ドメインにＣ末端に連結された。各変異体をコード化するＤＮＡは、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ遺伝子導入システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、２４個のディープウェルプレートで細胞に遺伝子導入された。遺伝子導入は、２．５ｍｌの培養液に合計２μｇのプラスミドＤＮＡを入れ、２回に分けて行った。スケールアップ産生には、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞を製造者の指示に従い、２５ｍｌ培養液で各構築物の遺伝子導入あたり合計２０μｇのプラスミドＤＮＡで遺伝子導入を行った。
ＩｇＧの定量化
遺伝子導入したＣＨＯ細胞の上清中のＩｇＧ濃度は、Ｄｉｐ ａｎｄ ＲｅａｄＴＭプロテインＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を備えたＯｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６ｅシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，米国）で、製造者の指示に従ってバイオレイヤー干渉測定により測定した。培養５日目の上清を、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、０．５ＭのＮａＣｌで１：１に希釈した。標準曲線は、７００～１μｇ／ｍｌのサンプルＩｇＧから作製した。
ＩｇＧ精製
サイズ排除クロマトグラフィー分析のため、発現した構築物は、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケア）を用いたＡｋｔａＳＴＡＲＴシステム（ＧＥヘルスケア）でのプロテインＡ促進精製で精製した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．３）バッファーを結合及び洗浄バッファーとして、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を溶出バッファーとして、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を中和バッファーとして使用した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬカートリッジ及びＥｎｄｏｓａｆｅ Ｎｅｘｔｇｅｎ－ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ，米国）を用いて、メーカーの説明書に従って測定した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
上記のように精製した各サンプル合計４μｇを、非還元条件では３×ローディングバッファー（０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、４５％グリセロール、０．０３％ブロモフェノールブルー、０．３％ＳＤＳ）と混合し、還元分析では０．１５ＭのＴｒｉｓ２－カルボキシエチル－ホスフィン塩酸塩を含む３×ローディングバッファーと混合して、９５℃で７分インキュベートした。サンプルは、４～２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＭＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭタンパク質ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で、同社のプロトコルに従って測定した。ゲルをＧｅｌＣｏｄｅＴＭＢｌｕｅ Ｓａｆｅタンパク質染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、室温で穏やかに振盪しながら１時間染色することにより、バンドを可視化した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
合計で、１００μｌ中の２５μｇの各発現コンジュゲートを、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合した Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ２００ １０／３０ ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。ＳＥＣは、ＰＢＳをランニングバッファーとして用い、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。溶出したタンパク質フラグメントは、オンラインの２８０ｎｍ吸収測定によって検出された。データ解析及びピーク積分は、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行った。
結果
新規抗体及び二重特異性コンジュゲートの発現及び特性評価
設計した構築物（表６）は、エンドトキシンレベルが閾値の０．５ＥＵ／ｍｌを下回る状態で発現かつ精製することに成功した。精製したサンプルの還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、抗体重鎖及び軽鎖それぞれについて期待されるサイズのバンドが見られた。
サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥＣ分析では、精製された構築物に有意な量の高分子凝集体の兆候は見られなかった。低分子量種の形態における非ネイティブ集団は、程度の差こそあるものの、試験した構築物全体で観察された。
発現抗体及び二重特異性コンジュゲートの概要
表６に示す抗体及び二重特異性コンジュゲートの設計、発現及び精製に成功した。全ての二重特異性コンジュゲートにおいて、以前に試験したｓｃＦｖ：ｓの変異体を、第２の結合タンパク質として使用した。
Figure 2023526977000008
実施例１５
本実施例では、実施例１４に記述したように調製した構築物を、そのアゴニスト活性について分析した。
材料及び方法
ＣＤ１４＋細胞の分離及び分化は、７５ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を使用して、実施例７、１２及び１３に記述されるように行った。タグペプチドＵＵ０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）を含む又は含まない抗体又は二重特異性コンジュゲートを用い、上清を採取する前に２４時間又は４８時間ＭｏＤＣを処理し、ＩＬ－１２ｐ４０ ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ－１２産生を測定した。２４時間のインキュベーションについては、細胞を、以前に説明した活性化マーカーについて追加で染色した。
結果
測定されたＩＬ－１２産生は、Ａ９（本明細書ではＳＰ９と呼ぶ）抗体と比較して、４８時間後の相対％活性を与えて、以下の表７に要約される。
Figure 2023526977000009
表７は、ＳＰ９（Ａ９）抗体と比較して、試験した構築物ＳＰ２－ＳＰ８のアゴニスト活性を纏めたものである。ＩｇＧ１ベースの抗体、すなわち親抗体ＳＰ８及び二重特異性バージョンＳＰ２及びＳＰ３は、参照よりも低いアゴニスト活性を有していた。ＩｇＧ１／２ハイブリッド抗体、すなわち親抗体ＳＰ４並びに二重特異性抗体ＳＰ５及びＳＰ６は、ＩｇＧ１ベースのクローンと比較して、アゴニスト活性が向上した。ＳＰ５（フレキシブルリンカー）は、ＳＰ６（リジッドリンカー）よりも優れたアゴニスト活性を保持していた。さらに、参照のＡ９ ＩｇＧ２抗体の二重特異性バージョンであるＳＰ７は、同様のアゴニスト活性を保持していた。
また、親抗体（Ａｂ５）及びＣＰ－８７０，８９３抗体（Ｂｉ２）（ＷＯ２０２０／１０４６９０を参照）の二重特異性バージョンは、異なるＡ９ベースの構築物と並べて評価された。Ｂｉ２は、ｓｃＦｖとしてネズミ１４ＧＩＩＩＣＩＩ－ｂクローンを保有する。このバージョンでは、Ｂｉ２のアゴニスト活性は、親抗体Ａｂ－５（ＣＰ－８７０，８９３）の４３％であった。ＦＩＴＣ８ ｓｃＦｖを保有するＡ９ベースの二重特異性抗体Ｂｉ２３は、ＳＰ９（Ａ９）親バージョンと比較して、９２％のアゴニスト活性を保持していた。
さらに二重特異性コンジュゲートＳＰ７及び親抗体ＳＰ９（Ａ９）のアゴニスト活性を、ＵＵ０１ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）の存在下で評価した。二重特異性抗体へのペプチドの結合は、親ＳＰ９（Ａ９）抗体と比較して、２４時間後の活性化マーカーのアップレギュレーション（図１１）又はＩＬ－１２分泌（図１２）に関してアゴニスト活性に影響を及ぼさなかった。
実施例１６
ＣＭＶ特異的Ｔ細胞増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｔ細胞の効率的な活性化には、活性化された樹状細胞（ＤＣ）との相互作用が必要である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＤＣ上のＭＨＣ分子に担持されたペプチドを認識し、ＣＤ２８受容体を介して共刺激分子ＣＤ８３／ＣＤ８６と相互作用する。ＩＬ－１２のようなサイトカインは、Ｔ細胞に作用する活性化されたＤＣによって産生される。この実施例は、本質的に、新規のＡ９抗体に基づく二重特異性コンジュゲートがＴ細胞の病原体特異的集団の拡大を刺激する能力を、公知のＣＤ４０結合抗体ＣＰ－８７０，８９３に基づくＷＯ２０２０／１０４６９０においてＢｉ－１７と示される二重特異性コンジュゲートと比較しても行うために、ＷＯ２０２０／１０４６９０の６４、６５ページの実施例４を繰り返したものである。Ａ９抗体に基づく二重特異性コンジュゲートは、ＣＤ４０結合を介して活性化を誘導し、第２の結合タンパク質（ｓｃＦｖ）とタグとの間の相互作用を介してタグ／抗原ペプチドを細胞内に輸送することが示された。タグの蛍光は、検出可能なシグナルを提供する。
材料及び方法
ＨＬＡ＊２Ａ及びＣＭＶ陽性のドナーを使用した。ＣＤ１４＋細胞の単離及び分化は、本質的に実施例７、１２、１３及び１５に記述したように行った。６日目に、ＭｏＤＣを、それぞれの二重特異性コンジュゲートのｓｃＦｖ部分及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのエピトープと相互作用するためのＦＩＴＣタグを含むＵＵ－４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）と名付けられたペプチドの単独及び複合体の両方で試験した二重特異性コンジュゲートＢｉ－２３（表５）及びＢｉ－１７（５３ページの表１又はＷＯ２０２０／１０４６９０）で刺激した。複合体では、コンジュゲートとペプチドの間の比率は、コンジュゲート５０ｎＭの濃度で１：２であった。二重特異性コンジュゲート及び複合体は、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートされた。刺激されたＤＣは、６ウェルプレートで２つの複製に分けられた。同じドナーからのＣＤ１４陰性集団を解凍し、刺激されたＤＣと１：１０の割合で混合した。特異的ＣＭＶ ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定する前に、共培養をさらに１１日間インキュベートした。細胞を、ＣＭＶ四量体－ＰＥ（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；カタログ番号ＴＢ－００１０－１）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（クローン：ＵＣＨＴ１）及びＣＤ８－ＦＩＴＣ（クローン：ＳＫ１）で実施例７に記述されるように染色した。サンプルは、抗体で染色する前に、ＣＭＶテトラマーと、室温で１０分間プレインキュベーションした。
結果
その結果を図１３に示す。ＵＵ－４４ペプチド単独でも、二重特異性コンジュゲート単独でも、特異的なＴ細胞の膨張は誘導されなかった。しかしながら、二重特異性コンジュゲートとＣＭＶ抗原配列を含むタグペプチドとの複合体は、ＣＭＶ集団を０．６％から平均９～１０％に増加させた。結論として、二重特異性抗体とＵＵ４４ペプチドとの複合体は、ペプチドのみ、又は抗体のみと比較して、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大をもたらした。
実施例１７
１４ＧＩＩＩＣＩＩ及びＩＢＩＩＩＣＩが認識する最小エピトープの決定
マウスモノクローナル抗体１４ＧＩＩＩＣＩＩ及びＩＢＩＩＩＣＩは、当初は１８－ｍｅｒ ＭＴＴＥペプチド（ＦＩＧＩＴＥＬＫＫＬＥＳＫＩＮＫＶＦ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）でマウスを免疫することによって飼育されたものである。これら２つの抗体のｓｃＦｖ－フォーマットへの変換、及びその後のＭＴＴＥへの結合のＳＰＲによる結合特性評価は、ＷＯ２０２０／１０４６９０の実施例１０に記述されている。
以下の例では、ＭＴＴＥ配列のＣ末端短縮は、ｓｃＦｖ結合を損失することなく実施できることを実証している。ペプチドの短縮は、例えばプロテアーゼによる分解からタグ構築物（タグペプチドと腫瘍／病原体抗原）をより効率的に保護し、より効率的に製造できることを含む、産生目的の幾つかの利点をもたらす可能性がある。
材料及び方法
本実施例で使用したペプチド（Ｃａｐｒａ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｕｎｄ，スウェーデン）を表８に示す。
Figure 2023526977000010
１４ＧＩＩＩＣＩＩ及びＩＢＩＩＩＣＩ ｓｃＦｖクローンの親和性測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００プラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びシングルサイクルカイネティック（ＳＣＫ）法を使用してＳＰＲで行われた。α－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＮＨＳ－ＥＤＣ化学を使用した一次アミンカップリングによってＣＭ５－Ｓチップに固定化され、そのＦＬＡＧタグを介してｓｃＦｖの捕捉が可能となった。５種類の異なる濃度（０．１６ｎＭ～１００ｎＭ）の異なるペプチド（表８）を含む５倍希釈系列をフローセル上に逐次注入し、捕捉したｓｃＦｖと結合させた。解離段階の後、１０ｍＭグリシン－塩酸、ｐＨ２．２を使用して酸性条件下で表面を再生させた。基準面（α－ＦＬＡＧ抗体固定化表面）の応答曲線を差し引くことで、全てのペプチドに対する応答単位のセンサーグラムが得られた。データは、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌ ｖ．３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解析した。
結果
全てのサイクルで同様の捕捉レベル（ＲＵ）を得ることができた。分析物の注入後、チップ表面を次の抗体捕捉サイクルに備えて活性表面を残して再生することに成功できた。
驚くべきことに、ＩＢＩＩＩＣＩ ｓｃＦｖの結合は、ペプチドを１８アミノ酸から１２アミノ酸に短縮しても一見影響がないように見える。センサーグラムの目視検査（図示されていない）では、試験したペプチドの全てに対して非常に類似した結合パターンを示している。このことは、異なるペプチドの速度論的パラメータが示されている表９、及び図１４に説明されている。１４ＧＩＩＩＣＩＩ ｓｃＦｖはまた、試験したペプチドの全てに対して明確な結合を示す。しかしながら、ＩＢＩＩＩＣＩとは対照的に、親和性（ＫＤ）は、ペプチドの短縮に伴って幾分増加する。これは、表９に示されるように、主にオフレート（解離速度定数（ｋｄ））の増加の結果である。
ここで示された結果は、ＭＴＴＥタグペプチドは、ＩＢＩＩＩＣＩ又は１４ＧＩＩＩＣＩＩへの結合を相当損失することはなく、それぞれ１２又は１３アミノ酸に短縮できることを示唆している。ここで報告された速度論的パラメータは、同じｓｃＦｖクローンについて以前に報告されたものといくらか異なっている。この相違は、異なるペプチド設計を含む実験装置の違いによって説明される可能性がある。また、得られたｋｄ値は、装置の検出限界に非常に近い値であった（＜１０－５）。これは、特にＩＢＩＩＩＣＩに結合する異なるペプチドに当てはまる。オフレートをより正確に推定するためには、解離時間をかなり長くすることが推奨される。したがって、報告された速度論的パラメータは、正確な絶対的速度論的パラメータを提供することよりもむしろ、２つのｓｃＦｖへの異なるペプチドの結合を比較するために主に使用されるべきであると注意深く見るべきである。
Figure 2023526977000011
配列一覧
大文字で書かれた配列はタンパク質配列、小文字で書かれた配列は核酸配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
ＱＳＩＳＳＹ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ＡＡＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
ＱＱＧＹＰＹＰＦＴ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
ＧＦＴＦＳＳＹＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
ＩＳＧＹＳＧＳＴ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
ＡＲＹＹＳＹＹＧＹＹＹＦＤＹ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＰＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＧＹＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＳＹＹＧＹＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＰＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＧＹＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＳＹＹＧＹＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
ＧＩＬＦＬＱＷＶＲＤＩＩＤＤＦＴＮＥＳＳＱＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ＤＳＤＫＤＲＦＬＱＴＭＶＫＬＦＮＲＩＫＮＮ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＩＤＩＫＮＤＬＹＥＫＴＬＮＤＹＫＡＩＡＮＫＬＳＱＶ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＱＤＰＡＬＬＬＭＨＥＬＩＨＶＬＨＧＬＹＧＭ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＤＧＩＬＦＬＱＷＶＲＤＩＩＤＤＦＴＮＥＳＳＱＫＲ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９
ＦＩＧＩＴＥＬＫＫＬＥＳＫＩＮＫＶＦＡＧＩＬＡＲＮＬＶＰＭＶＡＴＶＱＧＱＮＬＫＹ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０
ＥＡＡＡＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１
ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＧＹＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＳＹＹＧＹＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ


ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＧＹＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＳＹＹＧＹＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７
ＡＧＩＬＡＲＮＬＶＰＭＶＡＴＶＱ

Claims (25)

  1. ＣＤ４０と特異的に結合する結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、ＣＤ４０のアゴニストであり、抗体の結合ドメインを含み、前記結合ドメインが、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、それぞれが、３つの相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）を含み、
    ＶＬＣＤＲ１が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載された配列を有し、
    ＶＬＣＤＲ２が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載された配列を有し、
    ＶＬＣＤＲ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載された配列を有し、
    ＶＨＣＤＲ１が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載された配列を有し、
    ＶＨＣＤＲ２が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載された配列を有し、及び
    ＶＨＣＤＲ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載された配列を有する、
    結合タンパク質。
  2. 前記結合タンパク質が、ヒトＣＤ４０と結合し、ヒトＣＤ４０のアゴニストである、請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. 前記結合タンパク質が、モノクローナル抗体、抗体フラグメント又はｓｃＦｖである、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。
  4. 前記抗体、前記抗体フラグメント又は前記ｓｃＦｖが、ヒトのものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
  5. 前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントである、請求項３又は４に記載の結合タンパク質。
  6. 前記軽鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記重鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項３～５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  7. 前記特異的結合分子が、ＩｇＧ２アイソタイプのモノクローナル抗体である、請求項３～６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  8. 前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
  9. （ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの第１の結合タンパク質と、
    （ｉｉ）抗体の結合ドメインを含み、ペプチド部分と結合する、少なくとも１つの第２の結合タンパク質と、
    を含む、二重特異性コンジュゲートであって、
    前記第１の結合タンパク質及び前記第２の結合タンパク質が、共有結合している、
    二重特異性コンジュゲート。
  10. 前記第１の結合タンパク質が、モノクローナル抗体であり、前記第２の結合タンパク質が、ｓｃＦｖであり、好ましくは前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧ２アイソタイプである、請求項９に記載の二重特異性コンジュゲート。
  11. 前記ｓｃＦｖが、
    （ｉ）前記抗体のＣＨ３ドメイン、又は
    （ｉｉ）前記抗体のＣＬドメイン、
    と共有結合している、請求項１０に記載の二重特異性コンジュゲート。
  12. 前記二重特異性コンジュゲートが、１つのモノクローナル抗体及び２つのｓｃＦｖを含み、
    （ｉ）１つのｓｃＦｖが、前記抗体の各重鎖の前記ＣＨ３ドメインに結合している、又は
    （ｉｉ）１つのｓｃＦｖが、前記抗体の各軽鎖の前記ＣＬドメインに結合している、
    請求項１１に記載の二重特異性コンジュゲート。
  13. 前記ペプチド部分が、非ヒトアミノ酸配列を有し、好ましくは前記ペプチド部分が、微生物由来のアミノ酸配列を有する、請求項９～１２のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート。
  14. 前記ペプチド部分が、細菌毒素由来のアミノ酸配列を有し、好ましくは前記ペプチド部分が、破傷風毒素由来のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の二重特異性コンジュゲート。
  15. 前記ペプチド部分が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１６若しくは４２～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１６若しくは４２～４６のいずれか１つに対して最大２つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の二重特異性コンジュゲート。
  16. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲートと、タグ構築物と、を含み、前記タグ構築物が、抗原に共有結合した請求項９又は１３～１５のいずれか一項に記載のペプチド部分を含む、複合体であって、
    前記タグ構築物の前記ペプチド部分が、前記二重特異性コンジュゲートの前記第２の結合タンパク質に非共有結合している、複合体。
  17. 前記抗原が、がん抗原である、請求項１６に記載の複合体。
  18. 前記がん抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、又はオンコウイルス由来の抗原である、請求項１７に記載の複合体。
  19. 前記抗原が、病原体由来である、請求項１６に記載の複合体。
  20. （ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、
    （ｉｉ）請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート、又は
    （ｉｉｉ）請求項１６～１９のいずれか一項に記載の複合体、
    と、
    少なくとも１種の薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  21. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲートと、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のタグ構築物と、を含む、キット。
  22. 治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の複合体、請求項２０に記載の組成物、又は請求項２１に記載のキット。
  23. がん若しくは感染症の治療又は予防に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の複合体、請求項２０に記載の組成物、又は請求項２１に記載のキット。
  24. 請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の複合体、又は請求項２０に記載の組成物を、被験体に投与することを含む、がん若しくは感染症を治療又は予防する方法。
  25. がん若しくは感染症の治療又は予防のための薬剤の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性コンジュゲート、又は請求項１６～１９のいずれか一項に記載の複合体、の使用。
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