JPWO2006093071A1 - βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体、およびその利用 - Google Patents

Abstract

HM-1キラートキシンに対する中和抗体nmAb-KTをイディオタイプ免疫原として用い、ファージディスプレイ法によって単鎖Fv抗体を取得することに成功した。該抗体は、実際にHM-1キラートキシン活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有することが確認された。該抗体は、抗真菌剤として使用することが可能であり、非常に有用なものである。

Description

本発明は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体、並びに、該抗体を有効成分として含有する抗真菌剤に関する。

ある種の酵母は、他の種の酵母に対して抗酵母（キラー）活性を示すタンパク質（キラートキシン）を分泌する。HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii）と以前に呼ばれていた酵母ウィリオプシス・サチュルヌス（Williopsis saturnus）Var.mrakii IFO 0895により産生される強力な抗酵母ポリペプチドであり、K9型キラートキシン群に属している。HM-1は88アミノ酸からなり、約9500ダルトンの分子量を有する（非特許文献１参照）。HM-1タンパク質の三次元構造はNMRスペクトルを用いて解明されている（非特許文献２参照）。HM-1は、キラートキシンの中では熱処理および広範囲のpH値にわたって非常に安定である。

また、HM-1キラートキシンに関しては、以下のような種々の知見が報告されている。

サッカロマイセス・セレビジエ（Saccaromyces cerevisiae）のハンゼヌラ・ムラキIF O0895由来のHM-1キラートキシンに対する感受性には、N-グリコシレーションが関与している（非特許文献３参照）。また、HM-1キラートキシンは、サッカロマイセス・セレビジエの酵母スフェロプラストにおける、丸い形状の維持に関与している（非特許文献４参照）。

このHM-1と相同性を有する、ハンゼヌラ・サチュルヌス（Hansenula saturnus）によって産生されるHYIキラートキシンも知られている（非特許文献５参照）。ウィリオプシス・サチュルヌスvar.saturnus由来のHYIキラートキシンも、細胞壁合成を阻害し、感受性酵母細胞の出芽に細胞破壊効果を及ぼす。このメカニズムはウィリオプシス・サチュルヌスvar.mrakiiのHM-1トキシンと類似している（非特許文献６参照）。

HM-1は、感受性サッカロマイセス・セレビジエの細胞壁合成を選択的に阻害し（非特許文献７参照）、細胞壁ベータグルカンと相互作用することが報告されている（非特許文献８参照）。また、HM-1は、グルカン合成酵素を低濃度で阻害する（非特許文献９参照）。サッカロマイセス・セレビジエ由来のβグルカン合成酵素（1,3-ベータ-D-グルカン合成酵素）については、精製と遺伝子のクローニングが行われている。（非特許文献１０参照）。HM-1自体については、モノクローナル抗体とサンドウィッチELISAによって定量が可能である（非特許文献１１参照）。

また、サッカロマイセス・セレビジエのGSC1 (glucan synthase of S. cerevisiae 1; FKS1とも呼ばれている）に対するカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の相同体がクローニングされ、カンジダ・アルビカンスGSC1については、ベータ-1,3-グルカン合成酵素のサブユニットに対する遺伝子であることが知られている（非特許文献１２参照）。

また酵母遺伝子であるRHK1は、HM-1キラートキシンに対する細胞壁受容体の合成に関与している（非特許文献１３参照）。

HM-1は広いスペクトルの殺菌活性を有し、治療に広く使用することができる。しかし、毒性および抗原性があるので、用途が限られている。

また、過剰発現することによって、サッカロマイセス・セレビジエ細胞にHM-1キラートキシン耐性を与えることができる遺伝子（HKR1）がサッカロマイセス・セレビジエのゲノムライブラリーからクローニングされている（非特許文献１４参照）。このHKR1は、酵母サッカロマイセス・セレビジエにおける細胞壁ベータグルカン合成および出芽パターンを調節する細胞表面のタンパク質をコードしている（非特許文献１５参照）。

これらの結果から、キラー活性を有するHM-1キラートキシン誘導体を新たな治療法に用いることが期待される。しかし、HM-1キラートキシンの分子機構は十分に理解されておらず、これらのキラー分子の標的については、いまだに決定されていない。

Neils Jerneは、免疫調節のネットワークにおけるイディオタイプ決定基の生物学的重要性について提唱した。イディオタイプは、抗体に特有のエピトープで、抗体の重鎖または軽鎖に関連し、通常、活性には可変領域の関与が必要とされる。抗イディオタイプ抗体ネットワークは、Neils Jerneが提唱したように、元の抗原と接触するイディオタイプ抗体結合部位の一部と重なる抗原決定基を認識できる。従って、抗イディオタイプ抗体の結合部位は、元の抗原の「内部イメージ（internal image）」を有する可能性がある。この考えによって更に、抗イディオタイプ抗体の抗原模倣性を、酵母キラートキシンの生物学的特徴を有する抗体の誘発に使用できるという仮説が導かれた。抗原決定基の内部イメージに相当する抗イディオタイプ抗体は、代用ワクチン、あるいは癌免疫療法では毒素と結合するものとして提案されている。ある場合には、タンパク質抗原と抗イディオタイプ抗体可変領域とのアミノ酸配列相同性は明らかにされており、該配列を適宜改変することにより、該抗体の機能をさらに強化することが可能である。抗イディオタイプ抗体による生物学的受容体のリガンドの機能的模倣性に関しては広く研究がされている。

最近、Polonelliらは、ポリクローナル、モノクローナル、および単鎖組換え抗体の形をした、抗菌活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製した（非特許文献１６参照）。これらの抗体は、広く研究されているピチア-アノマラ（Pichia anomala）により産生される酵母キラートキシンの活性を有する。キラー株はこれらの共通の表現型を有するが、各キラートキシンは種間または株間で異なり、構造遺伝子、分子量、成熟構造および免疫、ならびに感受性細胞を認識および殺傷する機構の点で異なる特徴を示す。さらに、各キラートキシンには独特の特性および用途があり、これらは種および株によって大きく異なる。

さらに、微生物の抗生物質耐性の広がりは大きな公衆衛生問題になっている。抗生物質耐性株が感染の原因になることが多く、結果として死亡率、罹患率、および医療費が増加する。これらの感染の予防および管理には新たな抗菌剤が必要である。真菌感染の発生は世界中で増加しており、AIDS患者、癌患者、または臓器移植を受けた免疫無防備状態の患者や老齢者人口の増加が原因とされている。総合的に、新規な抗菌剤のための新しい戦略の開発が緊急に必要とされている。

Yamamoto T.外３名著、「Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii.」、FEBS Lett.、1986年Jan 20、Vol.195(1-2)、p.253-257 Antuch W.外２名著、「Ancestral beta gamma-crystallin precursor structure in a yeast killer toxin. 」、Nat.Struct.Biol.、1996年、p.662-665 Kimura T.外６名著、「N-glycosylation is involved in the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to HM-1 killer toxin secreted from Hansenula mrakii IFO 0895.」、Appl.Microbiol.Biotechnol.、1999年Feb、Vol.51(2)、p.176-84 Komiyama T.外２名著、「Round shape enlargement of the yeast spheroplast of Saccaromyces cerevisiae by HM-1 toxin」、Biol.Pharm.Bull.、2002年Aug、Vol.25(8)、p.959-65 Komiyama T.外４名著、「Structure and activity of HYI killer toxin from Hansenula saturnus」、Biol.Pharm.Bull.、1995年Aug、Vol.18(8)、p.1057-9 Komiyama T.外６名著、「Action properties of HYI killer toxin from Williopsis saturnus var. saturnus, and antibiotics, aculeacin A and papulacandin B.」、Biol.Pharm.Bull.、1998年Oct、Vol.21(10)、p.1013-9 Yamamoto T.外４名著、「Killer toxin from Hansenula mrakii selectively inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast.」、FEBS Lett.、1986年、Mar.3、Vol.197(1-2)、p.50-54 Kasahara S.外８名著、「Involvement of cell wall beta-glucan in the action of HM-1 killer toxin」、FEBS Lett.、1994年Jul 4、348(1)、p.27-32 Takasuka T.外３名著、「Cell wall synthesis specific cytocidal effect of Hansenula mrakii toxin-1 on Saccharomyces cerevisiae.」、Cell Mol.Biol.Res.、1995年、Vol.41(6)、p.575-581 Inoue SB.外９名著、「Characterization and gene cloning of 1,3-beta-glican synthase from Saccharomycec cerevisiae」、Eur.J.Biochem.、1995年Aug、Vol.231(3)、p.845-54 Komiyama T.外４名著、「Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin.」、Biol.Pharm.Bull.、2004年May、Vol.27(5)、p691-3 Mio T.外９名著、「Cloning of the Candida albicans homolog of Saccharomyces cerevisiae GSC1/FKS1 and its involvement in beta-1,3-glucan synthesis」、J.Bacteriol.、1997年Jul、Vol.179(13)、p.4096-105 Kimura T.外８名著、「A novel yeast gene, RHK1, is involved in the synthesis of the cell wall receptor for the HM-1 killer toxin that inhibits beta-1,3-glucan synthesis」、1997年Mar26、Vol.254(2)、p.139-47 Kasahara S.外８名著、「Cloning of the Saccharomyces cerevisiae gene whose overexpression overcomes the effects of HM-1 killer toxin, which inhibits beta-glucan synthesis.」、J.Bacteriol.、1994年Mar、176(5)、p.1488-99 Yabe T.外７名著、「HKR1 encodes a cell surface protein that regulates both cell wall beta-glucan synthesis and budding pattern in the yeast Saccharomyces cerevisiae.」、J.Bacteriol.、1996年Jan、Vol.178(2)、p.477-83 L.Polonelli, ら著、「Therapeutic potential of antiidiotypic single chain antibodies with yeast killer toxin activity」、Nature Biotech.、1997年、 Vol.15、p.155-158

本発明はβグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体の提供を課題とする。より具体的には、HM-1キラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体、および該抗体を含有する抗真菌剤の提供を課題とする。

上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究を行った。まず本発明者らは、実際にHM-1キラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体の作製を試みた。これまでの従来のハイブリドーマ技術では、ある特定の抗原に対する有効な抗イディオタイプ抗体を作製するのは困難であった。そこで、本発明者らは、ファージライブラリーによって抗イディオタイプ抗体を作製することを想到し、最新のファージディスプレイ技術を用いた効率的な手法を導入した。

一般的に、活性を有する特定のタンパク質の機能を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製するためには、該タンパク質と親和性を有し抗イディオタイプ抗体の免疫原とする中和抗体の選択が非常に重要になる。即ち、あるタンパク質と結合し得る抗体自体は、通常、多数存在するため、種々のバリエーションの中和抗体が存在するものと考えられる。そして、それぞれの中和抗体におけるイディオタイプ決定基も無数の種類が存在し得る。該タンパク質が有する機能（活性）を抗イディオタイプ抗体が有するためには、該タンパク質の機能を司る領域（内部イメージ）を模倣した構造のアミノ酸領域を含んでいる必要があるものと一般的に考えられる。従って、所望のタンパク質の活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製するためには、この所望のタンパク質の機能を担う領域と親和性を有するイディオタイプ決定基を含む中和抗体を、免疫原として用いることが望ましい。

本発明者らは、nmAb-KTと称する中和抗体を免疫原として使用し、上述のようにファージディスプレイ技術を用いることにより、実際にHM-1キラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体の作製に成功した。

また該抗体は、nmAb-KT以外の中和抗体（抗HM-1キラートキシン抗体）とは反応せず、nmAb-KTに対して高い結合親和性を有することが明らかとなった。該抗イディオタイプ抗体は、HM-1キラートキシンの内部イメージを有し、HM-1の活性を担う領域と極めて模倣性の高いアミノ酸配列を有する抗体であることが示唆された。

さらに本発明者らは、該抗体が実際に抗真菌作用を有することを明らかにした。従って、本発明者らによって作製された抗体は、抗真菌剤として使用することが可能であり、非常に有用なものである。

本発明者らは、本発明の抗体にはβグルカン合成酵素阻害作用を有することを見出した。さらに本発明の抗体は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して実際に抗真菌活性を有することが確認された。本発明の抗体は、既存の抗真菌剤では効きめが弱いカンジダ・アルビカンス株に対しても、有効な抗真菌作用を発揮する。即ち、本発明の抗体は、カンジダ・アルビカンス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性を有することが実証された。
さらに本発明者らは、本発明による抗体がin vitro における抗真菌作用だけではなく、カンジダ・アルビカンスを感染させたマウス感染動物モデルを使った実験により、ScFv抗体を静脈内投与することにより、実際に体内で増殖中のカンジダ・アルビカンスに対しても強い抗菌作用を発揮することを確認した。このことは、本発明の抗体が血中に投与された場合であっても、強い抗菌作用を有することを実証するものである。即ち、本発明の抗体は、in vivoにおいても実際に抗真菌作用を有することが証明された。

これまでの本発明者らによる独自の研究から、HM-1の抗菌メカニズムについては、HM-1が、酵母細胞の細胞膜表面に存在するβグルカン合成酵素を阻害し、増殖中の酵母細胞の出芽領域に働き、そのβグルカン合成を抑えることにより穴を開けて、細胞物質を漏出させることにより細胞死を招いていることが明らかとなった。（Komiyama T.７名著、「Pore formation on proliferating yeast Saccharomyces cerevisiae cell buds by HM-1 killer toxin」、J.Biochem.、1996年Apr、Vol.119(4)、p.731-6）。このHM-1キラートキシンのキラー活性については、HM-1トキシンのC末領域にある２つの特異的なアルギニン残基が関与している（Shirai T.外３名著、「The involvement of two specific arginine residues in the action of HM-1 killer toxin was deduced from site-directed mutagenesis」、Biol.Pharm.Bull.、2000年Aug、Vol.23(8)、p.998-1000）。

従って、本発明の抗体は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して、βグルカン合成酵素を阻害することにより、上述のメカニズムによって該真菌細胞を殺傷するものと考えられる。

本発明者らによって作製された抗イディオタイプ抗体は、二種の可変領域(VHおよびVL)が短いリンカーペプチドで連結された構造の一本鎖Fv(ScFv)ポリペプチドである。該ポリペプチドは全長が260アミノ酸程度の比較的短鎖のペプチドであり、また、実際に活性に関与すると考えられる二種の可変領域は、それぞれ、約100アミノ酸程度の長さである。このように比較的短い単鎖ポリペプチドが、実際に有効な機能（抗真菌活性）を有することは、驚くべきことであり、本願は、実際に有効な機能を有するポリペプチドの構造（アミノ酸配列）を、具体的に開示するものである。

抗体が有する活性（例えば、結合能）の違いは、一般的に、可変領域のアミノ酸配列の違いによって生じる。換言すれば、所望の活性を担う可変領域の配列を同定することができれば、該可変領域を含む分子を作出することにより、所望の活性を有する種々の形態の抗体分子を作製することが可能である。また、該可変領域も、そのアミノ酸配列を基に、所望の活性を保持する範囲内で、適宜、改変させることが可能である。本願によって開示されたポリペプチドに対して、一般的な遺伝子工学技術を用いて、適宜アミノ酸を改変することは容易である。また、本願のポリペプチドに対して改変されたポリペプチドの中から、所望の活性を有するポリペプチドあるいは抗体分子を選択することは、当業者においては通常の試行の範囲内である。即ち、本願によって具体的に開示されたポリペプチドの構造を基に、キラートキシン活性並びにβグルカン合成酵素阻害活性を保持する種々の形態の抗体を作製することが可能である。本願によって、本来、HM-1 キラートキシンが持っていたβグルカン合成酵素阻害活性を、中和抗体を経由した巧みな実験によって、HM-1とは全く分子構造の異なる抗体の可変領域のアミノ酸配列によって実質的に現すことが出来たことの意義は限りなく大きい。また、このことは、この発明により、カンジダ・アルビカンス菌を含む、これまで感染により人類を苦しめてきたβグルカン合成酵素を持つ多くの真菌に対して、βグルカン合成酵素阻害活性をもつ抗体を作成することにより対抗する道を拓いたといえる。

また、これまであまり明らかとなっていなかったHM-1キラートキシンの機能の解明にも、本発明者らによって見出された知見は大いに有用である。

上述の如く、本発明者らは、HM-1キラートキシン活性、並びにβグルカン合成酵素阻害活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して顕著な抗真菌活性を有する単鎖ポリペプチドを作製することに成功し、本発明を完成させた。

即ち本発明は、キラートキシン活性、並びにβグルカン合成酵素阻害活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して顕著な抗真菌活性を有する新規な抗真菌剤に関し、具体的には、
〔１〕 βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する、抗イディオタイプ抗体、
〔２〕 βグルカン合成酵素阻害活性を有する、〔１〕に記載の抗イディオタイプ抗体、
〔３〕 抗HM-1キラートキシン抗体と結合親和性を有する、〔１〕または〔２〕に記載の抗イディオタイプ抗体、
〔４〕 抗HM-1キラートキシン抗体が、nmAb-KTと称するモノクローナル抗体である、〔３〕に記載の抗イディオタイプ抗体、
〔５〕 nmAb-KTに対して3.0x10⁷M^-1以上の親和定数(Ka)を有する、〔４〕に記載の抗イディオタイプ抗体、
〔６〕 HM-1キラートキシンの抗原決定基の内部像を有する、〔１〕〜〔５〕にいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体、
〔７〕 カンジダ・アルビカンスに対して抗真菌活性を有する、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体、
〔８〕 重鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む配列からなる、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体、
〔９〕 重鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体、
〔１０〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体の可変領域を含む、抗体の断片、
〔１１〕 重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む一本鎖ポリペプチド(ScFv)である、〔１０〕に記載の抗体の断片、
〔１２〕 βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドであって、以下の（１）および（２）に記載のポリペプチドが、リンカーによって連結された構造のポリペプチド、
（１）配列番号：５に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
〔１３〕 βグルカン合成酵素阻害活性を有する、〔１２〕に記載のポリペプチド、
〔１４〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、抗真菌剤、
〔１５〕 真菌がβグルカン合成酵素を有する真菌である、〔１４〕に記載の抗真菌剤、
〔１６〕 カンジダ・アルビカンスに対して抗真菌活性を有する、〔１５〕に記載の抗真菌剤、
〔１７〕 〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または、〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチドをコードする核酸、
〔１８〕 〔１７〕に記載の核酸を有するベクター、
〔１９〕 〔１７〕に記載の核酸、または〔１８〕に記載のベクターを含む宿主細胞、
〔２０〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドの製造方法、
（ａ）〔１８〕に記載のベクターを細胞へ導入する工程、
（ｂ）前記細胞を培養する工程、
（ｃ）前記細胞培養物からβグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドを有するポリペプチドを回収する工程
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔２１〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチドの、抗真菌剤（防カビ剤）もしくは真菌症治療薬の製造における使用、
〔２２〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチドを個体（患者等）へ投与（例えば、血中投与）、もしくは患部へ塗布する工程を含む、真菌症の治療方法。
〔２３〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチドを、真菌（カビ）を防止もしくは除去させたい対象物へ塗布、混合もしくは接触させる工程を含む、真菌（カビ）を防止もしくは除去する方法、
〔２４〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、〔１０〕もしくは〔１１〕に記載の抗体の断片、または〔１２〕もしくは〔１３〕に記載のポリペプチド、および、薬学的に許容された担体を含んでなる組成物

本発明の抗体（ScFv-A1〜4）のアミノ酸配列を示す図である。N末端の1-113位が重鎖可変領域、114-144位がリンカー、145-245位が軽鎖可変領域、246-248が制限酵素Not I部位、249-261位がE tagに相当する。 4種類のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4について、nmAb-KT、それに2種類のモノクローン抗体である1F1 mAbと4A2 mAbとの結合活性を調べた結果を表すグラフである。ELISAウェルを、nmAb-KT、1F1-mAb、4A2-mAbまたはBSA 10μg/mlでコートした。抗原の結合特異性は、実施例に記載するようにHRP結合抗E-Tag抗体を用いて検出した。 精製した本発明の抗体(scFv)における、酵母および真菌のβ-1,3-グルカン合成酵素活性の阻害効果を示す図である。(A)S. cerevisiae A451、(B)C. albicans ATCCにおけるβグルカン合成酵素の阻害効果を示す。 本発明の抗体(scFv)の抗カンジダ作用を示す写真である。C. albicansの増殖に対するscFv-A3の効果をCFUアッセイにて評価した。標準化した真菌細胞を、37℃、16時間の培養後、プレートした。(A)PBSで処理した真菌細胞、(B)scFv-A3で処理した真菌細胞、および(C)nmAb-KTで中和したscFv-A3によって処理した真菌細胞を表す。 本発明の抗体(scFv)のin vivo抗菌作用を示すグラフである。黒はScFv非投与群を表し、白はScFv投与群を表す。

本発明は、HM-1キラートキシン活性、並びにβグルカン合成酵素阻害活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して顕著な抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体（本明細書において単に「本発明の抗体」と記載する場合あり）を提供する。本発明の抗体は、通常、HM-1キラートキシンと同等、もしくはより広い抗菌スペクトルを有する。

HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii）とも呼ばれている酵母ウィリオプシス・サチュルヌス（Williopsis saturnus）により産生される強力な抗真菌活性を有するポリペプチドである。

HM-1キラートキシンを産生する好ましいハンゼヌラ・ムラキとしては、例えば、IFO 0895またはIFO 8075等をあげることができる。

また、HM-1キラートキシンのアミノ酸配列は既に公知である(FEBS LETT.,195,253-257,1986)。

一般的に抗イディオタイプ抗体とは、抗体可変部のイディオタイプ決定基（イディオトープ）を認識する抗体を言う。抗体分子は通常、重鎖(H鎖)と軽鎖(L鎖)から構成され、その抗原特異性は、抗原結合部位であるH鎖およびL鎖の可変領域(V領域)の構造により決定される。この部分の構造は抗体分子の固有のものであり、イディオタイプと呼ばれる。このイディオタイプ自体も抗原性を有し、このイディオタイプを免疫原として、抗イディオタイプ抗体を作製することができる。

本発明の抗体は、好ましくは、HM-1キラートキシンに対する抗体（抗HM-1キラートキシン抗体）におけるイディオタイプ決定基と結合する（親和性を有する）抗イディオタイプ抗体である。

本発明の抗体と結合するイディオタイプ決定基を有する抗体は、通常、抗HM-1キラートキシン抗体である。より好ましくは、HM-1の有する活性（例えば、βグルカン合成酵素阻害活性、抗真菌活性等）を中和する抗体である。該抗HM-1キラートキシン抗体は、より具体的には、HM-1のモノクローナル中和抗体であるnmAb-KT（Yamamoto T.外３名著、「Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii.」、FEBS Lett.、1986年Jan 20、Vol.195(1-2)、p.253-257）であることが好ましい。

該nmAb-KTは、酵母(Williopsis saturnus) Var. mrakiiから産生されるキラートキシンの活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、標準的なハイブリドーマ技術によって作製されたものであり、抗原特異性が高く、βグルカン合成酵素阻害活性を中和する活性も高い。

即ち、本発明の抗体の好ましい態様においては、該nmAb-KTのイディオタイプと結合する（親和性を有する）抗体であり、好ましくは、該nmAb-KTと特異的に結合する抗体である。

本発明の抗体は、HM-1キラートキシンの内部像（イメージ）を有し、HM-1キラートキシンと同様の機能（活性）を有することを特徴とする抗体である。

より具体的には、本発明の抗体は、以下に示す機能（特徴）を有する。
（１）カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）株に対して抗真菌活性を有する

一例を示せば、本発明の抗体は、25μgml^-1で処理することにより、カンジダ・アルビカンス細胞が95％減少させる程度の活性を有する。（ただし、左記の活性は具体的に一例を示すものであり、必ずしもこの態様に限定されない）
（２）抗HM-1抗体nmAb-KTと結合活性（結合親和性）を有する

一例を示せば、本発明の抗体は、nmAb-KTに対して、通常、親和定数が1.0x10⁶M^-1以上であればよいが、好ましくは、親和定数Kaが1.0x10⁷M^-1以上であり、好ましくは3.0x10⁷M^-1以上であり、より好ましくは4.0x10⁷M^-1以上であり、さらに好ましくは4.4x10⁷M^-1以上である。

なお、本発明の抗体は、nmAb-KT以外の抗HM-1抗体（中和抗体）、例えば、抗HM-1抗体1F1または4F2とは実質的に反応しないことが好ましい。即ち、本発明の抗体は、好ましくは、nmAb-KTと特異的に結合する活性を有する。（なお、抗HM-1抗体1F1および4F2の詳細については、例えば、公知文献(Komiyama T et al., Biol. Pharm. Bull. 2004 May; 27 (5): 691-693)を参照することができる。）
（３）βグルカン合成酵素阻害活性を有する

本発明の抗体は、上記の活性を全て有することが好ましいが、必ずしもこの場合に限定されない。即ち、上述の活性の全てを確認できない場合であっても、上述の活性のうち、１もしくは複数の活性について、有することが判ればよい。

また、任意の抗体（ポリペプチド）について、上記の機能（活性）を有するか否かを、当業者においては適宜評価することができる。

上記（１）は、例えば、CFUアッセイによって、適宜評価することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の手順にて実施することが可能である。

また、上記（２）は、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）分析法によって、適宜評価することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の手順にて実施することが可能である。

また、上記（３）のβグルカン合成酵素活性は、公知の種々の方法（例えば、放射性物質によって標識されたβグルカンを検出する方法等）によって、適宜測定することが可能であり、当業者であれば、所望の物質について、βグルカン合成酵素阻害活性を有するか否かを評価することができる。一例を示せば、Takasukaらの文献(Takasuka T. et al., Cell Mol. Biol. Res. 1995; 41: 575-581)に記載の方法によって、βグルカン合成酵素阻害活性を適宜評価することが可能である。

本発明の抗体の好ましい態様として、より具体的には、後述の実施例によって記載された「ScFv-A1」、「ScFv-A2」、「ScFv-A3」、「ScFv-A4」と名付けられたポリペプチドを好適に示すことができる。「ScFv-A1」のアミノ酸配列を配列番号：１に、「ScFv-A2」のアミノ酸配列を配列番号：２に、「ScFv-A3」のアミノ酸配列を配列番号：３に、「ScFv-A4」のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。

本発明の上記ポリペプチドのアミノ酸配列の特徴を、図１に示す。上記ポリペプチドは、後述の実施例に示すように、HM-1キラートキシン活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体の可変領域を含むポリペプチドである。該ポリペプチドは、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)に相当する領域を有し、これらのVHおよびVLがアミノ酸からなるリンカーによって連結された構造を有する。

例えば、配列番号：１〜４に記載のそれぞれのポリペプチドは、共通の1種のVH（H鎖可変領域）を有する。このVHに相当する領域のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。

また、配列番号：１〜４に記載された各ポリペプチドはそれぞれ固有のVL（L鎖可変領域）を有する。この各ポリペプチドに含まれるVLに相当する領域の4種のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：６〜９に示す。

本発明の抗体は、必ずしも具体的に示される上記のポリペプチドにのみ限定されるものではない。例えば、上述のように、HM-1キラートキシン活性（特に、βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗真菌活性）を担うと考えられる上記のVHおよびVLを有するものであれば、いかなる形態（構造）の抗体もしくはポリペプチドであってもよい。さらに、上記のVHおよび／またはVLのアミノ酸配列においてアミノ酸残基が改変された配列を含む抗体もしくはポリペプチドであっても、上述の機能（活性）を有するものであれば、本発明に含まれる。

具体的なアミノ酸配列（例えば、配列番号：１〜９）を開示された場合においては、当業者であれば、これらアミノ酸配列を基に、適宜アミノ酸が改変された配列からなる抗体（ポリペプチド）を作製し、当該抗体（ポリペプチド）について、上述の機能を有するか否かを評価し、本発明の抗体（ポリペプチド）を適宜選択することが可能である。

本発明の好ましい態様としては、以下の（１）および（２）に記載のポリペプチドが、リンカーによって連結された構造のHM-1キラートキシン活性（特に、βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗真菌活性）を有するポリペプチドが挙げられる。
（１）配列番号：５に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド

なお、ScFv-A1およびScFv-A3はカンジダ・アルビカンスに対して特に顕著な抗真菌作用を有する。従って、特に制限されるものではないが、上記ScFv-A1およびScFv-A3のVLに相当するアミノ酸配列（配列番号：６、８）を基に改変を試み、βグルカン合成酵素阻害程度を高めることを指標に、さらに強力な抗カンジダ作用を有する抗真菌剤を取得することが可能である。

また本発明において、改変に供するアミノ酸の数は特に制限されないが、例えば、１〜５０アミノ酸程度の改変であり、好ましくは、１〜２０アミノ酸の改変であり、より好ましくは、１〜１０アミノ酸の改変であり、さらに好ましくは１〜５アミノ酸の改変である。

上述のように、本発明の抗体（ポリペプチドを含む）は、上述の機能（活性）を有するものであれば、その抗体の形態は特に制限されない。

即ち、本発明において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、上述の機能（活性）を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体（キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多特異性抗体等）が含まれる。また、本発明において「抗体」は、ポリペプチドあるいは異種多量体（例えば、IgG型抗体）のいずれであってもよい。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、および抗体断片等の低分子化抗体であり、最も好ましくは一本鎖Fvポリペプチドである。

本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域もしくは定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加および／もしくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体等でもよい。

「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（V）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C）領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体V領域（例えば、配列番号：５に示すVH）をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる。

「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。また、一般的な遺伝子組換え手法により、例えば、マウス抗体のCDRを決定し、該CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とが連結された抗体をコードするDNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このようなDNAは、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成することができる。

本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のC領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を必要に応じ修飾してもよい。ヒト抗体由来の定常領域は、通常、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgDおよびIgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常領域が用いられるが、これに限定されず、上述のように定常領域を全く有さない場合であってもよい。

本発明におけるキメラ抗体またはヒト化抗体の可変領域および定常領域は、元の抗体（例えば、配列番号：１〜４のいずれかに記載のポリペプチド）の機能（活性）を示す限り、欠失、置換、挿入および/または付加等により改変されていてもよい。

ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体およびヒト化抗体は、体内において抗体産生能力が低下している患者に対して、体外で作製し治療目的に投与することが有用である。

また、低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用いて低コストで製造することが可能であり、経済的にも優れている。

なお、ScFv等の抗体断片（ポリペプチド）を局所投与以外の方法、例えば、静脈投与にて体内へ注入した場合、体内の免疫反応により該ポリペプチドに対する中和抗体が産生され、該ポリペプチドの活性が低下することが考えられる。一方、通常の抗体（完全抗体）であれば、中和抗体の産生が起こりにくいことから、局所投与以外の方法にて体内へ投与する場合には、抗体断片よりも、完全抗体であることが好ましい。

抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体には、抗体の断片をその構造の一部とする抗体も含む。本発明における低分子化抗体は、上述の機能（活性）を有するものであれば、特にその構造、製造法等は限定されない。低分子化抗体は、通常、全長抗体と比較して、高い比活性を有することが多い。本明細書において、「抗体断片」とは、上記の機能（活性）を有するものであれば、全長抗体の特定の部分（領域）に特に限定されないが、好ましくは、重鎖可変領域（例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列）または軽鎖可変領域（例えば、配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列）を含む断片である。

好ましい抗体断片の例としては、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、Fvなどを挙げることができる。抗体断片中の、VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または挿入により改変されていてもよい。さらに上述の機能（活性）を保持する限り、VH（例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列）およびVL（例えば、配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列）の一部を欠損させてもよい。

例えば、前述の抗体断片のうち「Fv」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片である。「Fv」は、1つのVHおよび1つのVLが共有結合により強く結合したダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が立体的に相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。従って、このようなFvより小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる。又、抗体断片の可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。

低分子化抗体は、VH（例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列）とVL（例えば、配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列）の両方を含んでいることが好ましい。低分子化抗体の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して作製され得るScFv（シングルチェインFv）等を挙げることができる。

抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して得ることも可能である。また、該抗体断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号：１〜４に記載のアミノ酸配列）を基に、遺伝子組換えにより製造することもできる。

抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。あるいは、低分子化抗体全体（例えば、配列番号：１〜４に記載のアミノ酸配列）をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる。

また、上記「ScFv」は、2つの可変領域を、必要に応じリンカー等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドである。ScFvに含まれる2つの可変領域は、通常、1つのVHと1つのVLであるが、2つのVHまたは2つのVLであってもよい。一般にScFvポリペプチドは、VHおよびVLドメインの間にリンカーを含み、それにより抗原結合のために必要なVHおよびVLの対部分が形成される。通常、同じ分子内でVHおよびVLの間で対部分を形成させるために、一般に、VHおよびVLを連結するリンカーを10アミノ酸以上の長さのぺプチドリンカーとする。しかしながら、本発明におけるScFvのリンカーは、ScFvの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。一例を示せば、該リンカーとしては、配列番号：１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１１４位〜１４４位の領域からなるポリペプチドを挙げることができる。

また、抗体の２つの可変領域を連結させるリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー等を用いることができる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。

また、「ダイアボディ(diabody; Db)」は、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を言う。ダイアボディは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)が、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは2つの抗原結合部位を有することとなる。

ダイアボディは、2分子のScFvを含むことから、4つの可変領域を含み、その結果、2つの抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させないScFvの場合と異なり、ダイアボディの形成を目的とする場合、通常、各ScFv分子内のVHおよびVL間を結ぶリンカーは、ペプチドリンカーとする場合には、5〜20アミノ酸程度のものとする。しかしながら、ダイアボディを形成するScFvのリンカーは、上記の機能（活性）を妨げず、ダイアボディの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されない。上記ダイアボディの具体例としては、2本の配列番号：５で示すVH、および2本の配列番号：６〜９のいずれかに示すVLを有するポリペプチドを挙げることができる。

また、抗体の可変領域を一本鎖抗体(ScFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するScFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。例えば、配列番号：１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするDNAを担持する適当な発現ベクターを作製し、周知の方法により、種々の抗体を作製することができる。

ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原（例えば、nmAb-KT）を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。

抗体工学における最近の進歩は、細菌およびファージディスプレイシステムにおける抗体フラグメントの発現に向けられてきた。そして、生物医学および製薬（特に、臨床での治療および診断）の分野における様々な出願の増加を導いた。ファージディスプレイシステムが抗体フラグメントを発現する能力は、ハイブリドーマ技術より優れたいくつかの重要な利点をもたらす。従って、本発明の抗体を例えば、nmAb-KTを免疫原として用いて作製する場合、ファージディスプレイ技術を利用することが好ましい。第一に、ファージディスプレイ技術は、望ましい特性を有する試薬の迅速で簡単な選択を可能にする強力な濃縮手順を含み、また、安定した遺伝子供給源を提供する。第二に、ScFvフラグメントを細菌内で大量に産生することができる。第三に、抗体試薬の結合特性を高める変異を導入するように、ScFv遺伝子を操作することができる。ファージディスプレイ法は、機能的な免疫グロブリン遺伝子をクローニングするための信頼性の高い技法である（ファルマシア Vol.40, No.8, 2004）。

ファージディスプレイ法により本発明の抗体は、マウスHM-1中和モノクローナル抗体のnmAb-KTを使用し、以下のような手順にて作製することができる。ただし、以下に示す手順は、本発明の抗体を取得するための一例を簡潔に示すものであり、この方法に特に制限されるものではない。

（１）マウスHM-1中和モノクローン抗体（nmAb-KT）→
（２）マウスへ注射→
（３）脾臓細胞から、抗体H&L鎖mRNAを抽出、cDNA化（H鎖DNA-リンカーL鎖DNAライブラリーを構築）→
（４）cDNAをファージDNAへ組み込んだファージライブラリーを構築→
（５）大腸菌中でファージタンパクを発現→
（６）HM-1中和モノクローン抗体（nmAb-KT）を指標にしたパンニング・スクリーニングを繰り返し、中和抗体と強く結合するファージクローンを選別→
（７）個別クローンによるタンパク発現と、目的とするファージの選別→
（８）選ばれたファージのDNAの塩基配列・アミノ酸配列を解析し、H鎖、L鎖の確認→
（９）抗体（ペプチド）タンパクの発現並びに精製→
（１０）Sc酵母あるいは病原真菌を用いての抗菌力の測定

抗体産生細胞は上述の感作抗原（好ましくは、nmAb-KT）を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原（例えば、nmAb-KT）または該抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、該抗原への結合活性を有するヒト抗体を得ることもできる。

動物の免疫化は、例えば、感作抗原（好ましくはnmAb-KT）をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行うことができる。

ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作製することができる。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。

続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブを用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。

また、H鎖（例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列）およびL鎖（例えば、配列番号：６〜９に記載のアミノ酸配列）をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のH鎖、L鎖の可変領域とヒト抗体のH鎖、L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementary determining region) を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる。CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域(FR)は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい。

本発明においては、上述のようにHM-1キラートキシン活性（特に、βグルカン合成酵素阻害を介する抗真菌活性）を有するポリペプチドについて、そのVHおよびVL領域と併せて、その全長のアミノ酸配列の具体例が示されている。従って、当業者においては本明細書において開示されたアミノ酸配列を基に、適宜、上記方法によって上述の機能（活性）を有する種々の抗体を作製することが可能である。

上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は、基となった抗体の可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号：５〜９に記載のアミノ酸配列）に対して、70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、97％、98％、99％等)のアミノ酸配列相同性および/または類似性を有する。本明細書において、配列の相同性および/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、およびギャップ導入した後、基となった抗体残基と相同(同じ残基)または類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニンおよびロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニンおよびセリン；(3)酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジンおよびリシン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンのグループに分類される。従って、本発明においてアミノ酸の改変を行う場合には、特に制限されないが、上述のように同様の性質を有するアミノ酸へ改変することが好ましい。

通常、H鎖およびL鎖の可変領域中に存在する全部で6つの相補性決定領域(超可変部;CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち1つの可変領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力が保持される場合も知られている。従って、本発明の抗体は、該抗体が所望の抗原（例えば、nmAb-KT）との結合性を維持し、また、上述の機能（活性）を保持している限り、H鎖およびL鎖の各々の抗原結合部位を含むアミノ酸配列の断片部分であってもよい。即ち、本発明の抗体（ポリペプチド）は、配列番号：５〜９に記載のポリペプチドのさらに断片であってもよく、その長さは上述の機能（活性）を有する限り特に制限されない。

上述のように本発明の抗体もしくはポリペプチドは、本明細書によって開示された内容を基に、適宜作製することができる。

また、本発明の抗体（ポリペプチド）をコードする核酸もまた、本発明に含まれる。一例を示せば、配列番号：１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸を示すことができる。当業者においては、アミノ酸の縮重を考慮して、該アミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を容易に知ることができる。

また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などを例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。

上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。

宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。

上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。

組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。

また本発明は、本発明の抗体（例えば、ポリペプチド）を有効成分として含有する抗真菌剤を提供する。

本発明の抗真菌剤が有効と考えられる真菌は、通常、βグルカン合成酵素を有する真菌であるが、一例を示せば、サッカロミセス（酵母）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatos等を例示することができるが、必ずしもこれらに限定されない。

なお、任意の真菌について、βグルカン合成酵素を有するか否かについては、当業者であれば、公知の種々の文献等によって、適宜知ることができる。公知の文献等によって、βグルカン合成酵素を有するか否かについて不明な場合であっても、上述のようにβグルカン合成酵素活性を検出する方法は既に知られていることから、当業者においては公知の一般的な手法を用いて、任意の真菌について、βグルカン合成酵素を有するか否かを適宜調べることが可能である。

本発明の上記抗真菌剤は、真菌症の治療もしくは予防に有効である。即ち本発明の抗体（ポリペプチド）は、例えば、真菌症に対する外用・内用治療薬として有用である。真菌症としては、例えば、皮膚真菌症（白癬菌症(水虫、たむし、しらくも)等）、皮下真菌症（菌腫、放線菌症等）、粘膜真菌症（カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症等）、肺真菌症（クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症等）等が挙げられる。本発明の抗真菌剤の対象となる真菌症としては、特に制限されないが、好ましくは、カンジダ属もしくはアスペルギルス属の真菌を原因とする真菌症である。より具体的には、カンジダ属もしくはアスペルギルス属の真菌を原因とする深在性真菌症を挙げることができる。深在性真菌症の多くは重篤であり致命率も高く、深在性真菌症の治療は医療上の重要な課題となっている。本発明の薬剤は、例えば、深在性真菌症に対して有効な治療効果が期待される。
また本発明は、本発明の抗体を有効成分とする、カビ等の病原性真菌に対するタンパク質性抗生物質に関する。

さらに本発明の抗体（ポリペプチド）は、カビの除去もしくは付着の防止を目的とする洗剤、防カビ剤・防カビ素材として利用することも可能である。

さらに本発明は、本発明の抗体（例えば、ポリペプチド）と医薬的に許容される担体とを含む組成物に関する。

本発明の薬剤もしくは組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルおよび／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。

本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。

投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001〜100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量および投与方法を設定することが可能である。

また、必要に応じ本発明の抗体を、その他の薬効成分と組み合わせて製剤化することもできる。

また本発明は、本発明の抗体（ポリペプチド）をコードする核酸を提供する。さらに該核酸を担持するベクターもまた、本発明に含まれる。

さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系および原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108: 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340）、および昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が例示される。本発明の抗体の発現においては、CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の抗体を産生させることができる。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上述の大腸菌（E. coli）に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗体産生に利用できる。

本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行い、ポリヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8とするのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物または植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ハムスター、ウマ、ウシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。

例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに投与してもよい。

また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる。

さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる。

このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。

必要に応じ、抗体の精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

上述のように本発明の宿主細胞を培養し、該細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収する工程を含む、本発明の抗体（ポリペプチド）の製造方法もまた、本発明の好ましい態様の一つである。

即ち、本発明は上述に示す各種方法を利用した、本発明のHM-1キラートキシン活性（特に、βグルカン合成酵素阻害を介する抗真菌活性）を有するポリペプチドの製造方法に関する。該製造方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法である。
（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する工程、
（ｂ）前記細胞を培養する工程、
（ｃ）前記細胞培養物からHM-1キラートキシン活性（特に、βグルカン合成酵素阻害を介する抗真菌活性）を有するポリペプチドを回収する工程
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
また本発明は、本発明の抗体、該抗体の断片、または本発明のポリペプチドを個体（例えば、患者等）へ投与、もしくは患部へ塗布する工程を含む、真菌症の治療もしくは予防方法を提供する。
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、真菌症を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与（塗布）量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与（塗布）量を適宜選択することが可能である。
さらに本発明は、本発明の抗体、該抗体の断片、または本発明のポリペプチドを、真菌（カビ）を防止もしくは除去させたい対象物へ塗布、混合もしくは接触させる工程を含む、真菌（カビ）を防止もしくは除去する方法に関する。
上記対象物とは、例えば、真菌（カビ）が繁殖・付着した物質、あるいは、防カビ効果を期待する素材等を挙げることができる。
さらに本発明は、本発明の抗体、該抗体の断片、または本発明のポリペプチドの、抗真菌剤（防カビ剤）もしくは真菌症治療薬の製造における使用に関する。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。

〔実施例１〕 免疫化
抗イディオタイプ抗体は、マウスをイディオタイプ免疫原（nmAb-KT）で免疫化することによって作製した。nmAb-KTは、酵母ウィリオプシス・サチュルヌスvar.mrakiiから産生されるキラートキシンの活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、標準的なハイブリドーマ技術によって作製した（Yamamotoら,1986,FEBS letter）。雌Balb/cマウス（3週齢、概算体重10グラム）を、0日目および14日目に、nmAb-KT 50μgと完全フロイントアジュバント（CFA）（1/1:v/v）で皮下に免疫化し、その後に、28日目、42日目、および56日目に、nmAb-KTと不完全フロイントアジュバント（IFA）を腹腔内に追加免疫注射した。最後の追加免疫注射の3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。

〔実施例２〕 mRNA単離
RNA抽出キットを使用し、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））により提供されたプロトコールに従って、総RNAを過免疫マウスから単離し、エタノール沈殿によって精製した。ポリ（AT）トラクトシステム（poly（AT） tract system）（プロメガ（Promega））を用いて、総RNAからmRNAを単離した。

〔実施例３〕 抗体可変領域遺伝子のクローニング
組換えファージ抗体システム-ScFvモジュール（recombinant phage antibody system-ScFv module）（ファルマシア）を使用し、製造業者により提供されたプロトコールを用いて、抗体可変領域遺伝子を構築した。簡潔に述べると、過免疫マウスからのmRNAをランダムプライムcDNA合成に使用した。マウスIgG重鎖可変領域（V_H）および軽鎖可変領域（V_L）の遺伝子断片を、これらの配列に特異的な一組のプライマーを使用し、テンプレートとしてcDNAを使用してPCR増幅した。94℃で5分間変性した後、5単位のTaq DNAポリメラーゼを添加し、その後に、94℃1分、55℃1分、および72℃2分の40サイクルを行った。増幅されたV_H遺伝子およびV_L遺伝子をゲル電気泳動およびエタノール沈殿によって精製した。

〔実施例４〕 ScFvライブラリーの構築
ScFv遺伝子のcDNAは、上記nmAb-KTで免疫化された過免疫マウスの脾臓から単離されたmRNAからの逆転写によって作製した。抗体遺伝子レパートリーの重鎖可変領域（V_H）および軽鎖可変領域（V_L）に対応する遺伝子断片をPCR増幅した。V_HおよびV_Lは両方とも、それぞれ、340bpおよび325bpの鮮明なバンドを生じた。

ScFv遺伝子を、V_HフラグメントおよびV_LフラグメントをテンプレートとしたオーバーラップPCR（overlap PCR）によって構築し、等量のV_H、V_L、および（Gly₄Ser）₃リンカー配列を融合した。PCR増幅は、5'-SfiI部位を含むV_H特異的プライマーおよび3'-NotI部位を含むV_L特異的プライマーの混合物を用いて、94℃1分、55℃1分、および72℃2分の30サイクルによって行った。このようにして一連のScFv遺伝子断片を得た。ScFv遺伝子断片は750bpの明瞭なバンドを生じた。

このように構築した遺伝子産物をゲル精製し、分光光度計で定量した。エタノール沈殿の後、構築した遺伝子をSfiIおよびNotI制限酵素で消化した。消化されたScFvフラグメントをゲル精製し、同じ制限酵素で切断されているファージミド発現ベクターpCANTAB 5E（ファルマシア）に連結した。次いで、連結された産物は、プラスミド1ngにつき1×10⁹形質転換体の効率で、エレクトロポレーションによってサプレッサー大腸菌TG1細胞（ファルマシア）に導入した。エレクトロポレーションの後、細胞を、2％グルコースおよび100μg/mlの濃度のアンピシリンを含むSOBAG培地へ移し、30℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、コロニーをこそぎ取って、10％グリセロールを含む2×YT培地5mlに入れ、その後-80℃で保存した。

〔実施例５〕 ファージレスキュー
nmAb-KTと結合するScFvをファージ粒子の表面に発現するファージ（以下ScFvファージと略す）をレスキューするために、ファージ培養液50μlを、2％グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含む2×YT-AG培地50ml中へ加え、OD₆₀₀が0.5〜0.7の値に達するまで37℃で振盪した。M13 KO7（ファルマシア）ヘルパーファージを20:1（ファージ粒子:細菌細胞数）のMOIで添加し、振盪せずに37℃で1時間放置した。細胞を遠心分離で収集し、100μg/mlアンピシリンおよび50μg/mlカナマイシンを含む新鮮な2×YT-AK培地に懸濁し、振盪しながら30℃で一晩インキュベートした。細菌細胞を遠心分離によって除去し、1/5体積のPEG-NaCl（20％PEG8000,2.5M NaCl）を添加し上清中のファージ粒子を精製および濃縮し、氷上で30分間インキュベートし、4℃で30分間、10,000gで遠心分離した。上清を捨て、ペレットをPBS 5mlに再懸濁した。ファージ懸濁液を再度、PEG-NaClで氷上で30分間処理し、前記のように遠心分離した。このあと、上清を捨て、ペレットを10％グリセロールを含むPBS 2mlに再懸濁し、その後、4℃で保存した。

〔実施例６〕 nmAb-KTと結合するScFvファージのパンニングによるスクリーニング
nmAb-KTに特異的に結合するScFvを産生するファージ（ScFvファージ）を選択的に捕獲するために、以下に述べるパンニングスクリーニングを数回繰り返して実施した。ScFvポリペプチドライブラリーを表面上に発現する組換えファージを、ヘルパーファージを用いるレスキューによって産生し、固定化したnmAb-KTに対する結合を利用してスクリーニングし、濃縮した。

詳しくは、まず、マキシソーブ（Maxisorb）イムノチューブ（ヌンク（Nunc））を、50μg nmAb-KT を50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH9.6）に溶解した溶液1mlでコーティングし、最後の回を除く全ての回のパンニングスクリーニングについて、ファージ混液をこのチューブ内で4℃で一晩インキュベートした。最後の回のパンニングスクリーニングでは、さらに高い親和性のScFvファージを選別するために、イムノチューブは1/10低濃度（5μg nmAb-KTの1ml）でコーティングした。コーティングしたイムノチューブは、PBS-Tween-20（以下PBS-T液と略す）で3回洗浄し、PBSに溶解した3％ドライミルク液を加え、37℃で1時間インキュベートした。3％ドライミルク液によるこの操作は、非特異的に結合するファージを出来る限り排除するためのものである。チューブは、PBSで洗浄した後、10¹²個の組換えファージを含むPBSを入れて37℃で2時間インキュベートした。その後、ファージ液を除き、チューブをPBS-Tで10回徹底的に洗浄し、界面活性剤を取り除くために、さらにPBSで10回洗浄した。余分なPBSを捨て、10mMグリシン-HCl（pH2.2）1mlを加え、nmAb-KTを介してチューブ壁に結合したファージを溶出し、すぐに、2M Tris塩基60μlを加えて中和し、酸性ｐHを中性へ戻した。このようにして選別され、溶出されたScFv-ファージは、新たに調製した増殖期大腸菌TG1細胞に感染させることによって増幅し、更にヘルパーファージを用いるレスキューにより再生させ、次の回のパンニングスクリーニングに使用した。この選抜手順を、根気よく、少なくとも4回繰り返した。このように、連続して行ったパンニングスクリーニングにより、真に特異的にnmAb-KTと結合するScFvファージを選抜することができた。最終的には、ScFvファージをイムノチューブから溶出し、ScFvファージプールとした。

〔実施例７〕 ELISA-ScFvファージ抗体
以上のようにして得られた組換えScFvファージを、これを含む大腸菌の個々のクローンからヘルパーファージを用いる方法によりレスキューし、更に、下記のようにELISA法によってnmAb-KTと結合する能力差を指標にして、選抜スクリーニングを行った。マイクロタイターウェルを前記のようにnmAB-KTでコーティングし、PBSに溶解した3％ドライミルク液を用いて37℃1時間ブロックした。洗浄後、組換えScFvファージをウェル内へ入れ37℃で2時間インキュベートし、次いで、PBS-Tで6回洗浄した。ウェル内でnmAB-KT と結合しているScFvファージは、HRP結合抗M13ファージ抗体（ファルマシア）（1:1000）と37℃で1時間インキュベートすることによって検出した。その際、ウェルを徹底的に洗浄した後、クエン酸に溶解したABTSを基質として添加することによって発色結合したウイルスを発色させ、吸光度をA405nmで測定した。

この結果、パンニングスクリーニング以前には、nmAb-KTと結合するScFvファージはライブラリープール中ごく僅かであったが、4回のパンニングスクリーニングによる選抜・増殖の後ではnmAb-KTと特異的に結合するウイルスは著しく増加した。ScFvファージとnmAb-KTが、真に特異的に結合していることは、nmAb-KTに替えてBSA（Bovine serum albumine）を用いたコントロール実験から証明されている。

4回のパンニング後に選抜されたScFvファージプールを大腸菌（TG1）細胞に感染させた後、アンピシリン含有寒天培地に移し、ファージを含む大腸菌コロニーを増殖させた。このように単一種化された各ファージクローンを得ることが出来た。このようにして得られたScFvが特異的にnmAb-KTに結合することは、ELISA法により確認している。

〔実施例８〕 可溶性ScFv抗体の作製
可溶性ScFv抗体を作製するために、4回のパンニングスクリーニング後に選抜されたファージを、ScFvコーディング領域とM13遺伝子IIIフラグメント領域との間にあるアンバー停止コドンを認識する非サプレッサー大腸菌HB2151（アマシャムファルマシアバイオサイエンス）に感染させた。大腸菌は、OD₆₀₀が0.5〜0.9に達するまで、30℃で振盪培養した。ファージミドを含む増殖期大腸菌を1mMイソプロピルβ,-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）とインキュベートし、さらに22℃で16時間インキュベートすることによりScFv抗体フラグメントのタンパク合成を行い、これにより、ペリプラズムに分泌される可溶型ScFv抗体フラグメントを産生させることが出来た。

細胞を遠心分離によってペレット化し、一方、細胞外へ分泌した可溶性ScFvを含む上清は、0.45μmフィルターに通して濾過し、それぞれ、-20℃で保存した。細胞のペリプラズムからScFv抗体フラグメントを調製するために、細胞を、氷冷した1×TES（0.2M Tris-HCl（pH8.0）、0.5mM EDTA、および0.4Mスクロース）20mに懸濁して遠心洗浄し、次に、氷冷1/5×TES緩衝液30mlに再懸濁し、1時間氷上でインキュベートし、10,800gで30分間遠心分離した。可溶化したScFv抗体フラグメントは上清中に存在する。このようにして得られた可溶性ScFv抗体フラグメントは滅菌チューブに移し、-20℃で保存した。

〔実施例９〕 ScFv抗体のELISA法による解析
マイクロタイターウェルを、前記のように10μg/mlのnmAb-KTまたは1F1 mAbまたは4A2 mAbおよびBSA（負の対照）でコーティングし、それぞれPBSに溶解した3％ドライミルク液により室温で1時間ブロックした。洗浄後、可溶性ScFv抗体をウェル内に入れ、室温で2時間インキュベートし、この後、ウェルは、PBS-Tで3回洗浄した。ScFvのカルボキシ末端には小さなペプチドエピトープ（E-Tag）が組み込まれているので、結合したScFv抗体は、HRP結合抗E-Tag抗体（ファルマシア）（1:1000）と室温で1時間インキュベートした後、先に述べたELISA法により検出することができる。この結果、ScFv抗体を可溶化した形で大腸菌から抽出した事を確認した。

〔実施例１０〕 ScFv抗体の精製
ScFv抗体をコードするファージ遺伝子を含む大腸菌HB2151を、1mM イソプロピルβ,-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を含む2×YT培地中で22℃で16時間増殖させることによって、可溶性ScFv抗体の産生を誘導した。ScFv抗体は、先に述べた方法により大腸菌HB2151細胞のペリプラズムから抽出し、抗E-Tag N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化したセファロースカラム（ハイトラップ抗E-Tag（Hi trap anti-E-Tag）ファルマシア）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製することが出来た。精製されたScFv抗体の収率は1.0〜3.0mg/lであった。

〔実施例１１〕 ゲル電気泳動およびイムノブロッティングによるScFvの検証
アフィニティクロマトグラフィーによって得られた精製ScFv抗体の純度を確かめるために、クロマトグラフィーの溶出画分についてウェスタンブロッティング分析を行った。ScFv抗体タンパク質の確認は15％SDS-PAGEで分離した後に、クマシーブリリアントブルーもしくは硝酸銀による染色により行った。ウェスタンブロット分析の際は、ScFv抗体をゲル電気泳動後、イムノトランスファー緩衝液を含むセミドライ装置（1時間,0.8mA/cm²）を用いて、ニトロセルロースフィルター（プロブロット（ProBlott）膜、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems））に転写した。膜は、PBSに溶解した3％ドライミルク液により室温で1時間ブロックし、その後、HRP結合抗E-Tag抗体（ファルマシア）と1時間インキュベートし、膜上のScFvタンパク質を明らかにした。ゲル電気泳動の際の分子量マーカーとしては、予め着色された広範囲標準（broad range standard）（バイオラド（BIO-RAD））4μlを使用して、ScFvの分子量を測定した。また、ScFv抗体のタンパク質濃度はBCA-ペプチド結合法を用いて測定した。

この結果、大腸菌HB2151細胞のペリプラズムから得られるScFv抗体のタンパク質は約30Kdaの分子量をもつことがわかった。一方、ほぼ同じサイズのScFv抗体が培養液内にも観察され、このことから、抽出・精製の行程で、ScFvの一部は大腸菌ペリプラズム部分から漏出することも分かった。

〔実施例１２〕 ScFv-DNA配列決定
ELISAによりnmAb-KTと強い結合反応性を示す9個のクローンについて、V_H鎖およびV_L鎖をコードするヌクレオチド配列を決定した。CEQ 2000ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing kit）（ベックマンコールター（BECKMAN COULTER））を用いて、選択されたクローンの核酸配列決定を行い、産物をCEQ^TM 2000XL DNA分析システムによって分析した。プライマーは、pCANTAB 5EベクターのR1、S3、S4、およびS6配列決定用プライマー（ファルマシア）を用いた。配列アラインメントおよび操作はDNASISおよびGenetyxソフトウェアによって行った。

その結果、これらのクローンのうち4個は、V_H遺伝子については共通したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を持ち、V_L遺伝子については、それぞれ異なる配列を持つことが判明した。この結果、これらの4種類のクローンはそれぞれ独立したクローンから由来していることが判り、ScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4と名付けた。

〔実施例１３〕 nmAb-KTとの結合特異性
4種類のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4について、先に述べた方法により精製し、生化学的特徴について調べた。その結果、4種類のScFv抗体はすべて分子量29〜30Kdaであり、nmAb-KTと特異的に結合する活性を持つことがわかった。

1F1および4A2モノクローナル抗体はHM-1に対して産生され、HM-1と結合することが出来るが、HM-1の抗菌活性を中和する事は出来ない。更なる生化学的実験により、今回得られた4種類の精製ScFvは、この2種類のモノクローン抗体、1F1 mAbと4A2 mAb、に結合しないことが分かり、これらの実験事実から総合して、4種類のScFvはHM-1の活性部位と相同の機能を持つことが推定された（図２）。

〔実施例１４〕βグルカン合成酵素阻害活性の検出
精製した4種類のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4について、これらのScFvは、酵母サッカロミセスのβグルカン合成酵素を阻害することがわかった。βグルカン合成酵素は増殖期の酵母細胞から抽出し（Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54）、基質であるUDPG (Uridine diphosphate glucose)を含む反応液中におけるβグルカンの合成量を山本らの報告に従い（Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54）、発色反応によって測定した。その際、精製したHM-1をポジティブコントロール（陽性対称）として、また、BSA（牛アルブミンタンパク）をネガテェブコントロール（陰性対称）として用いて比較した。この測定条件下において、ScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4は、HM-1と同等のβグルカン合成酵素阻害活性を示した（図３）。また同様の実験結果は、放射性UDPGを用いたTakasukaらの方法（Takasuka T. et al., Cell Mol. Biol. Res. 1995; 41: 575-581）による実験からも得られている。

〔実施例１５〕 表面プラズモン共鳴（SPR）分析
表面プラズモン共鳴（SPR）分析を用いて、精製ScFv抗体の結合特異性および速度論パラメータを測定した。

ビアコア（BIAcore）X（ビアコア,Uppasala,Sweden）を使用し、製造業者の説明書に従って、表面プラズモン共鳴（SPR）分析により、固定化抗原に対するScFvの結合速度を測定した。抗原を、35μg/ml nmAb-KTまたは1F1 mAbまたは4A2 mAbの濃度で、10mM酢酸ナトリウム（pH5.0）の前濃縮（preconcentration）緩衝液で希釈し、製造業者により供給されたアミン結合キットを接触時間7分および流速10μl/分で用いてCM5センサーチップに固定化し、表面上の反応しなかった部分をエタノールアミンでブロックした。この結果、以下のレゾナンスユニット（1000レゾナンスユニットは1ng/mm²の表面濃度に相当する）を測定することができた。それらは、固定化nmAb-KTの場合、3000、1F1 mAbの場合、2854、4A2 mAbの場合、1825という値である。

それぞれのセンサーチップの1個のチャンネルを、活性化後に、10mM酢酸ナトリウム（pH5.0）を注入するのに使用し、その後に、エタノールアミンで非活性化した。このチャンネルは、ScFvとカルボキシメチル化デキストラン表面との非特異的結合を制御するのに使用した。表面プラズモン共鳴分析の全ての場合において、測定は、流速10μl/分、25℃、HBS-EP中で行った。それぞれの測定の後、チップ表面を1mM HCl 10μlで再生した。

単量体ScFv抗体の分析は15.75nM〜250nMの濃度で行った。組換え抗体フラグメントのそれぞれの注入試料（30μl）と抗原を5分間接触させた。続いて解離が10分間生じた。速度定数k_onおよびK_offを求めるために、速度論センサーグラム曲線をビアエバリュエーション（BIAevaluation）3.0で評価した。速度論親和定数（k_a）はK_a=k_on/ K_offの式を用いて計算した。

様々な濃度のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4と固定化nmAb-KTとの相互作用に関するビアコアセンサーグラムを解析した。

この結果、ScFvは固定化nmAb-KTに結合することが分かった。速度論データの分析から、ScFvのアミノ酸配列は異なるが、これらの抗体はmAb-KTに対して同様の親和性、あるいは結合力を示すことが明らかになった。対照的に、これらの抗体はnmAb-KTには結合するが、1F1 mAbや4A2 mAbやBSA（負の対照）とは測定可能な結合を示さない。会合速度定数（k_on）および解離速度定数（K_off）ならびに親和定数（K_a）の計算値を表１に示す。K_a＝K_on／K_off

ScFv-A2の親和定数（K_a）（6.65×10⁷M^-1）は、ScFv-A3の親和定数（3.04×10⁷M^-1）、またはScFv-A1の親和定数（4.8×10⁷M^-1）、またはScFv-A4の親和定数（4.48×10⁷M^-1）の約2倍または1.2倍であった。これらの選択された抗体の速度論親和定数（K_a）によって、抗体がnmAb-KTに高親和性で結合すると結論付けられる。

〔実施例１６〕 ScFvの抗カンジダ活性測定
CFUアッセイ(colony forming unit assay)によって、精製ScFvクローンの抗カンジダ活性を測定した。

約5×10²細胞/mlのカンジダ・アルビカンスATCC 10231またはカンジダ・アルビカンスIFM 40213またはカンジダ・アルビカンスCAIJ細胞株をPBS 10μlに懸濁し、精製ScFv KTIdAb（25μg/ml）およびPBS（対照）100μlに添加した。対照実験として、nmAb-KTで予め吸着されたScFv KTIdAbにも等量のカンジダ・アルビカンス菌を添加した。それぞれのScFv抗体と37℃で16時間インキュベートした後、カンジダ・アルビカンス菌をサブローデキストロース寒天プレートの表面に分配し、広げ、次いで30℃でインキュベートし、CFUを48時間後に数えた。この実験は、確認のため3回繰り返した。

統計解析を行うために、結果は平均±標準偏差で表した。CFUの数値の差を、スチューデントt検定を用いて評価した。

その結果、CFUアッセイによって、25μgml^-1の4種類のScFv KTIdAbで処理されたカンジダ・アルビカンス菌の増殖は約95％、あるいはそれ以上の阻害をうけることが明らかになった（表２：酵母（サッカロミセス）、およびカンジダ・アルビカンス株に対するScFv抗体の増殖阻害活性）。

（上記表中「コロニー数」は残存コロニー数を表す。）

図４は、本発明の抗体(scFv)の抗カンジダ作用を示す、CFUアッセイのプレートの写真である。 (A)PBSで処理した真菌細胞（カンジダ・アルビカンス株）、(B)scFv-A3で処理した真菌細胞、および(C)nmAb-KTで中和したscFv-A3によって処理した真菌細胞を表す。
上記実験より、通常の酵母（サッカロミセス）はもちろん、既存の抗真菌剤では効きめが弱いカンジダ・アルビカンス株に対しても、本発明のScFvは、有効な抗真菌作用を発揮することが示された。即ち、本発明のScFvは、カンジダ・アルビカンス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性を有することが実証された。

〔実施例１７〕 ScFvの感染動物における抗カンジダ活性測定
CD-1マウス (オス、４週齢)（合計4匹）に各１ｘ10⁵細胞のカンジダ・アルビカンスTUA6株を尾静脈から接種し感染させた。これらのカンジダ感染マウス２匹について、０、２４、４８時間後、上記「実施例８」で精製したScFvA-3抗体（360μg）を200μlのPBS液に溶かした溶液を尾静脈から注射した。一方、抗体を含まないPBS液２００μlを、感染マウス2匹に対して同様に０、２４、４８時間後注射し、以下に記述する方法で、臓器中に生育するカンジダ菌を測定する際のポジティブコントロールとした。

カンジダ菌感染７２時間後（３日後）、マウス腎臓を開腹手術により取り出し、PBS液で洗浄後、腎臓の重さを測定した。次に、腎臓をガラスホモゲナイザーをもちいて１０ｍｌPBS液中にホモゲナイズし、希釈後、その一部をYPD寒天培地上へ塗布し、30度Cで1〜2日間インキュベートした後、マウス腎臓中に生育しているカンジダ・アルビカンスのコロニー数を測定した。この結果、ScFvを投与したマウスの腎臓に成育しているカンジダ菌は、非投与マウスに比べ平均約２０分の１に減少していることがわかった（図５）。（ScFv投与群CFU/ｇ臓器の重さ：2匹平均641、ScFv非投与群CFU/ｇ臓器の重さ：2匹平均12,424）

本発明によって、HM-1キラートキシン活性並びにβグルカン合成酵素阻害活性を有する抗イディオタイプ抗体（ポリペプチド）が提供された。キラートキシンの生物学的な機能を模倣する本抗体は、キラートキシンに対して感受性を有する日和見病原体等に対して抗真菌活性を発揮し、新規な抗真菌剤としてその利用が期待される。

また本発明は、有効なHM-1キラートキシン活性を有する単鎖ポリペプチドを提供する。さらに本発明者らは、実際にHM-1キラートキシン活性を担うアミノ酸配列を具体的に同定することに成功した。該領域を含むように抗体を作製することによって、HM-1キラートキシン活性を有する種々の形態の抗体を新たに作出することが可能である。また、該領域を適宜改変することにより、より強力な、あるいはより特異性の高い所望の抗体を作出することも可能である。

Claims (20)

1. βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する、抗イディオタイプ抗体。
2. βグルカン合成酵素阻害活性を有する、請求項１に記載の抗イディオタイプ抗体。
3. 抗HM-1キラートキシン抗体と結合親和性を有する、請求項１または２に記載の抗イディオタイプ抗体。
4. 抗HM-1キラートキシン抗体が、nmAb-KTと称するモノクローナル抗体である、請求項３に記載の抗イディオタイプ抗体。
5. nmAb-KTに対して3.0x10⁷M^-1以上の親和定数(Ka)を有する、請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体。
6. HM-1キラートキシンの抗原決定基の内部像を有する、請求項１〜５にいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体。
7. カンジダ・アルビカンスに対して抗真菌活性を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体。
8. 重鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む配列からなる、請求項１〜７のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体。
9. 重鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体の可変領域を含む、抗体の断片。
11. 重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む一本鎖ポリペプチド(ScFv)である、請求項１０に記載の抗体の断片。
12. βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドであって、以下の（１）および（２）に記載のポリペプチドが、リンカーによって連結された構造のポリペプチド。
    （１）配列番号：５に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （２）配列番号：６〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
13. βグルカン合成酵素阻害活性を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
14. 請求項１〜９のいずれかに記載の抗体、請求項１０もしくは１１に記載の抗体の断片、または請求項１２もしくは１３に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、抗真菌剤。
15. 真菌がβグルカン合成酵素を有する真菌である、請求項１４に記載の抗真菌剤。
16. カンジダ・アルビカンスに対して抗真菌活性を有する、請求項１５に記載の抗真菌剤。
17. 請求項１０もしくは１１に記載の抗体の断片、または、請求項１２もしくは１３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
18. 請求項１７に記載の核酸を有するベクター。
19. 請求項１７に記載の核酸、または請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
20. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドの製造方法。
    （ａ）請求項１８に記載のベクターを細胞へ導入する工程、
    （ｂ）前記細胞を培養する工程、
    （ｃ）前記細胞培養物からβグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有するポリペプチドを有するポリペプチドを回収する工程