JP2023516257A - 粘膜ワクチンの送達のための免疫グロブリン単一ドメイン抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）に特異的に結合する単一ドメイン抗体、およびよりとりわけポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードする核酸に；かかるポリペプチドを調製するための方法に；予防、治療または診断の目的のためのかかるポリペプチドを含む組成物に、およびとりわけ医薬組成物に関する。とりわけ、本発明の単一ドメイン抗体は、部分を粘膜の表面へ標的にすることができる。

Description

本発明の分野
本発明は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）に特異的に結合する単一ドメイン抗体におよびよりとりわけポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードする核酸に；かかるポリペプチドを調製するための方法に；予防、治療または診断の目的のためのかかるポリペプチドを含む組成物に、およびとりわけ医薬組成物に関する。とりわけ、本発明の単一ドメイン抗体は、部分を、粘膜表面へ標的にすることを可能にする。

本発明の背景
病原体のおよび外部の有害な物質の大多数は、呼吸器、胃腸（ＧＩ）および尿生殖路粘膜の表面を通して体に入り、およびよって粘膜免疫は、感染に立ち向かうために最も重要である。それが投与の容易さ、血液由来感染のリスクのなさ、および大規模ワクチン接種のための実用性などの多くの利点を提供するという理由から、目下、無針の経口ワクチン送達は、腸の病原体に対する保護のための最も魅力的な投与のルートである。サブユニットワクチンとは対照的に、生弱毒化ワクチンまたは不活性化された病原体粒子のみが、効率的な免疫応答を刺激することにおいて有効であることが見出されている。しかしながら、経口的に送達される生弱毒化または不活性化された病原体に関連付けられる安全性の問題のために、かかるワクチンの一握りのみが、承認されている。他方、サブユニットワクチンは、それらが病原体のライフコンポーネントを含有しないという理由で、安全であると考えられているが、しかし貧弱な免疫応答につながる、下層の免疫誘導部位へ届くための、腸上皮を越えてのワクチン抗原の貧弱な輸送は、経口ワクチンの開発への大きなハードルを課す。腸細胞または吸収性の絨毛上皮細胞は、すべての腸上皮の９０％を構成し、およびそれらは、腸の病原体または高分子を上皮の障壁を越えて輸送するための、食作用およびトランスサイトーシスの能力を持つ［１］。したがって、腸細胞におけるトランスサイトーシス受容体を標的化する抗原は、ワクチン送達のための関心を引くアプローチであり、および腸の病原体に対する強い粘膜免疫応答およびに全身性免疫応答を誘導する［２］。

近年、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）は、小腸腸細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を包含する様々な細胞上に発現されるＦ４線毛に対する受容体として同定されているが、しかしＧＩ管の他の部分の上皮細胞においては同定されていない［３］。ＡＰＮ特異的ポリクローナル抗体による経口の免疫付与は、粘膜免疫の引き金を引いた［３、WO09/103555］。その上、ＡＰＮ特異的マウスモノクローナル抗体によるマイクロ粒子の機能化（functionalization）はまた、腸上皮によるこれらの粒子の取り込みをも増大させ、および全身性免疫応答の引き金を引いた［４］。これらの知見は、ワクチン抗原と抱合されたＡＰＮ特異的送達剤がより強い腸免疫応答を引き出すための関心を引くストラテジーであり得ることを提案する。

今日まで、抗体、細胞媒介標的化（ＤＣ免疫療法、Ｔ細胞養子移入）、およびグリカンおよびアミノ酸などの小分子への抗原の化学的抱合などのいくつかいくつかの標的化機序が、同定されている［５］。それらの強い親和性および特異性のため、抗体は、関心の抗原がＡＰＮを発現する腸細胞を標的にするために遺伝子学的に融合され得る、理想的なタンパク質である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、または重鎖のみの抗体の可変ドメイン（Nanobody（登録商標）としてもまた知られている、ＶＨＨ）などの種々の抗体のフォーマットは、使用され得る。従来のｍＡｂは、標的化ヒビクルとして、本来は好ましかったものの、抗原と融合されたそれらの産生は、扱いにくく、および時間のかかるものとなった。加えて、それらの構造上の複雑さは、潜在的なリガンドとしてのそれらの使用を妨害する。したがって、他のｓｃＦｖおよびＶＨＨなどのより単純な形態は、フルサイズの抗体への代替のアプローチと考えられていた。

抗体工学における進歩は、ｍＡｂの標的化性能に基づき、ｓｃＦｖ遺伝子を容易に設計し、およびクローンをつくることを可能にしたものの、合成ｓｃＦｖタンパク質の安定性および蓄積は、正しい折り畳みおよび２つの可変ドメインのアセンブリーを得るために必須のリンカーの予測不可能な長さを包含する、いくつかいくつかの因子に依存して大いに変動し、およびこれは、しばしばｓｃＦｖ標的化の適用を制限した［６、７］。他方、ＶＨＨ免疫グロブリンドメインは、ラクダ科の動物の重鎖のみの抗体に由来する、１５ｋＤａにすぎない可変フラグメントである［８］。ｓｃＦｖとは違って、ＶＨＨは、同様の親和性を保持する一方で、従来の抗体および生じたｓｃＦｖにおける２つの可変ドメインにおいてというよりは、単一のドメインにおけるその抗原結合特性を含有する。小さなサイズ、産生の容易さ、良好な熱安定性および効率的な組織浸透などのその特有の特性によって、ＶＨＨは、古典的な抗体と比較して様々な適用のために大きな関心を受けていた［９－１１］。
本発明は、例として強い粘膜免疫応答を誘導するための、ＶＨＨおよび消化管上皮への標的化された送達のための担体としてのそれらの適用を提供する。

本発明の概要
本発明は、高いレベルで安定して生産され得るＶＨＨのファミリーを同定した。ＶＨＨの該ファミリーは、ＡＰＮに結合するのみでなく、生理学的な条件下で、細胞株によっておよびブタの消化管のループにおいて効率的にエンドサイトーシスされ、および注目すべきことに、とりわけ経口投与後に全身性および腸ＩｇＡ応答を引き出す能力がある。本発明のポリペプチドは、ＡＰＮ受容体を標的にする送達ヒビクルとして、および分子を特異的にＡＰＮを発現する粘膜へ、より具体的には（小）腸へ効率的に送達するために、使用され得る。その上、本発明のポリペプチドは、ブタへの経口投与の後に上皮の障壁を通過し、腸粘膜免疫系へ異種の化合物／抗原を標的にするための担体としてその有用性を示す。

一態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ここで該ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（夫々ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１、および
配列番号１と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）、とりわけ２アミノ酸相違、よりとりわけ１アミノ酸相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選出され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３、および
配列番号３と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）、とりわけ２アミノ酸相違、よりとりわけ１アミノ酸相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選出され；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号４、および
配列番号４と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）、とりわけ２アミノ酸相違、よりとりわけ１アミノ酸相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選出される。

より具体的には、（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１または２から選出され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３であり；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号４または５から選出される。本発明に従う具体的なポリペプチドは、以下：
‐ＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＣＤＲ２は、配列番号３であり、およびＣＤＲ３は、配列番号４である；または
‐ＣＤＲ１は、配列番号２、ＣＤＲ２は、配列番号３、およびＣＤＲ３は、配列番号５である、
から選出されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせを含む。
よりとりわけ、本発明に従うＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（夫々ＦＲ１からＦＲ４）および本明細書において提供される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる、または本質的にそれらからなる。

一態様において、本発明は、配列番号６を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、または例として配列番号７または配列番号８などの、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらなる態様において、本発明の少なくとも１のポリペプチドを含むＡＰＮ結合コンストラクトが、提供される。該コンストラクトは、免疫グロブリン単一可変ドメインへ連結された他の部分を含有していてもよい。該さらなる部分は、ＡＰＮに結合しても、しなくてもよい。具体的な態様において、コンストラクトは、さらにＦｃドメイン、および／またはさらに診断用のまたは治療用部分、例として生理活性化合物を含む。

別の態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインはそれ自体として提供されないが、しかし、核酸、すなわち本明細書に記載のとおりのポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え核酸分子として提供される。さらにまた、かかる核酸を含有するベクターまたは宿主細胞は、提供される。典型的には、かかる宿主細胞は、核酸によって形質転換されたまたはトランスフェクトされているだろう。これらの宿主細胞について把握される具体的な使用は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの産生である。よって、本明細書に提供されるポリペプチドをコードする核酸分子によって形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞は、免疫グロブリン単一可変ドメインの産生のために使用され得る。

さらなる側面に従って、本明細書に提供されるポリペプチド、核酸またはコンストラクトは、医薬における使用のため、とりわけ、ヒトまたは獣医学のいずれかの医薬としての使用のためである。別の態様に従って、ポリペプチド（またはそれらをコードする核酸）は、（胃）腸の疾患の治療的処置または予防における使用のために提供される。

本発明のポリペプチドは、タンパク質として（免疫グロブリン単一可変ドメインとして、ＡＰＮ結合コンストラクト、キメラ分子または医薬組成物の一部として）提供されてもよく、または該免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸分子として、またはかかる核酸分子を含むベクターとして投与されてもよい。投与の種々のルートは、把握され得る。非限定例として、ポリペプチドは、全身的に、経口的にまたは鼻腔内に、しかしとりわけ経口的に投与されてもよい。免疫グロブリン単一可変ドメインが核酸またはベクターとして提供される場合、免疫グロブリン単一可変ドメインが遺伝子治療を通して投与されることは、具体的に把握される。特定の態様は、ワクチン接種、とりわけ粘膜ワクチン接種における使用のためのポリペプチド、コンストラクト、キメラ分子、または医薬組成物を提供する。

一態様において、本発明は、本明細書に記載のとおりのポリペプチド、コンストラクトまたはキメラ分子、核酸または宿主細胞、および薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。とりわけ、医薬組成物は、ワクチン、よりとりわけ経口ワクチン、すなわち経口送達のために好適に処方されたワクチンである。
本発明は、対象における腸の疾患または障害を処置する、または予防する方法をさらに網羅し、方法が、該疾患または障害の少なくとも１の症状を処置する、低減する、または予防するために有効な量において該対象へポリペプチド、コンストラクト、キメラ分子または医薬組成物を投与することを含む。

別の態様において、本発明は、例としてバイオイメージングにおける使用のための、または競合アッセイにおける使用のための、診断的な使用のための、本明細書に記載のとおりのポリペプチド、コンストラクトまたはキメラ分子、核酸または宿主細胞にわたる。その上、ポリペプチド、コンストラクトまたはキメラ分子は、対象における粘膜の障壁を横断する能力のある化合物または生物（例としてウイルス）を同定するおよび得るためのin vitro方法において使用され得、該方法は、ａ）試験されるべき化合物または生物とともに、ＡＰＮもしくはこれらの機能的フラグメント含有する供給源、細胞または細胞株をインキュベートすること；およびｂ）本明細書に提供されるとおり、ポリペプチドまたはキメラ分子と競合することへの該分子の能力を決定することを含む。
また提供されるのは、本発明のポリペプチドを生産する方法であり、該方法は、以下のステップ：
－発現系、とりわけPichia pastorisにおいて、ポリペプチドをコードする核酸を導入すること、および
－発現されたポリペプチドを精製すること
を含む。

図面の簡単な説明
図１：ＶＨＨ－ＭＧ（マウスＩｇＧのＦｃドメインへ融合された重鎖のみの抗体の可変ドメイン）の融合物を効率的に得るためのBioXp（商標）3200システム－ベースのＧｉｂｓｏｎクローニングストラテジーの略図。ＶＨＨ－ＭＧ融合フラグメントの末端における４０ｂｐは、ＳａｐＩ－線形化されたｐＫａｉＧＧベクターの末端と相同である。ＭＧは、マウスＩｇＧのＦｃドメインを表す。ＶＨＨ－ＭＧフラグメントを、合成し、およびＢｉｏＸＰシステムにおける終夜操業において、ＳａｐＩ消化されたｐＫａｉＧＧにライゲーションした。ＤＨ５α細胞を、ライゲーション試料によって形質転換し、および形質転換体を、ゼオシン（Ｚｅｏ）－補充培地においてスクリーニングした。続いて、ＤＮＡを、４のランダムに選択されるクローンから単離し、および制限消化、またはコロニーＰＣＲおよび配列決定によって分析し、陽性クローンについてスクリーニングした。（ｂ）ＢｉｏＸＰクローニングシステムを介してエラーのないクローンを得る効率。エラーのないクローンを得る確率は、配列決定を介して１コンストラクト毎に１のクローンをスクリーニングした場合、７７％であり、および２のクローンをスクリーニングした場合、９７％であった。

図２：ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを介するＡＰＮ特異的ＶＨＨ－ＭＧの選択。クローンを、それらが所属するファミリーに従って配置し、および点線によって分離する。（ａ）ＥＬＩＳＡプレートを、ＡＰＮによってコーティングし、および培養培地によってインキュベートした。ＶＨＨ－ＭＧのＡＰＮへの結合を、比色反応のＯ．Ｄ．値として描写する。（ｂ）ＡＰＮ－トランスフェクトされたＢＨＫ２１（ＢＨＫ２１－ＡＰＮ、灰色の棒）およびＡＰＮ－トランスフェクトされたＩＰＥＣ－Ｊ２（ＩＰＥＣ－Ｊ２－ＡＰＮ、黒色の棒）の膜において発現される完全長ＡＰＮへ結合するＶＨＨ－ＭＧについてのフローサイトメトリースクリーニング。ＩＭＭ０１３（マウスＩｇＧ１）は、陽性対照である。ＩｇＧ１アイソタイプ、Ｖ２－ＭＧおよびＤ３－ＭＧは、陰性対照である。Ｖ２－ＭＧおよびＤ３－ＭＧ融合は、無関係な標的に結合するＶＨＨ（夫々、Ｖ２およびＤ３）を含有する。グラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

図３：種々のＶＨＨ－ＭＧ融合の精製。（ａ）その夫々の名前は右上隅にて標識された、プロテインＡ精製後の６の種々のＶＨＨ－ＭＧ融合のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイル。矢印は、２のＶＨＨ－ＭＧポリペプチド（各～４０ｋＤａ）の間のジスルフィド架橋によって集合されるモノマーのＶＨＨ－ＭＧ融合に対応する位置、および～８０ｋＤａの分子量を指し示す。（ｂ）還元（左）および非還元（右）条件両方の下、４～２０％ポリアクリルアミドゲルにおけるＳＥＣの後、８０ｋＤａのピークのプールされた画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。無傷の完全長ポリペプチドの期待される位置は、還元条件における一価のＶＨＨ－ＭＧ（～４０ｋＤａ）について矢じりによって、および非還元条件における二価のＶＨＨ－ＭＧ（～８０ｋＤａ）についての矢印によって、指し示される。M,分子量マーカー(kDa).(収率-3L94-MG: 2.7 mg/L;2L48-MG: 2.3 mg/L;2L69-MG: 1.9 mg/L;2L65-MG: 5.9 mg/L;2L22- MG: 8 mg/L;2L46-MG: 1.4 mg/L).

図４：ＡＰＮを発現する細胞株に結合するＶＨＨのスクリーニング。粗製の周辺質抽出物を、ライブラリからの組換えファージミドを内包するＴＧ１細胞から調製する。 ２８のＡＰＮ結合ＶＨＨ候補を、ＡＰＮを発現する細胞株において、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。クローンを、ＣＤＲ３配列におけるそれらの類似性に従って、グループ化し；点線の間上部における数字は、種々のクローンが所属するファミリーに言及する。Ｙ－軸は、ＡＰＮ－トランスフェクトされた（ＡＰＮ）と親の非トランスフェクトのＢＨＫ２１細胞（親）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の比率を表す。

図５：精製されたＶＨＨ－ＭＧ融合の結合分析およびＡＰＮ媒介のエンドサイトーシス。（ａ）精製されたＶＨＨ－ＭＧ融合のＡＰＮ結合ＥＬＩＳＡ。精製されたＶＨＨ－ＭＧの３倍希釈系列を、ＡＰＮでコーティングされたマイクロタイタプレートにおいてインキュベートし、および西洋ワサビペルオキシダーゼとともに抱合された抗マウスＩｇＧによってプローブした。ＶＨＨ－ＭＧの固定された抗原への結合を、ＯＤ（４９２ｎｍ）値として描写する。ＩＭＭ０１３は、陽性であり、およびＧＢＰ－ＭＧは、陰性対照であった。バックグラウンドの閾値を、陰性対照のＯＤ（４９２ｎｍ）値の２倍として決定した。（ｂ）ＡＰＮを発現する細胞へのＶＨＨ－ＭＧ融合の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。グラフは、指し示される濃度（μｇ／ｍｌ）にて、ＶＨＨ－ＭＧへ結合するＡＰＮ陽性細胞の数を示す。

図６：ＶＨＨ－ＭＧによるコブタの経口免疫付与は、循環するおよび小腸の抗体応答の引き金を引く。（ａ）経口免疫付与実験の設計。（ｂ）１ｍｇのＶＨＨ－ＭＧ ２Ｌ６５および３Ｌ９４および等モル量の無関係なマウスＩｇＧ２ａによるコブタ（ｎ＝４／グループ）の経口免疫付与におけるマウスＩｇＧ２ａ特異的血清ＩｇＧおよびＩｇＡ応答。ｄｐｐｉ：一次免疫付与の後の日数；ＯＤ：光学密度。データを、平均＋ｓｄとして、表す。＊、ＩｇＧ２ａに対してｐ＜０．０５（Friedman）。（ｃ）指し示している時点にて、循環する、マウスＩｇＧ２ａ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡを分泌する細胞の量。ＡＳＣ：抗体を分泌している細胞。＊＊、０日目に対してｐ＜０．０１；Δ、ＩｇＧ２ａに対してｐ＜０．０５（Friedman）。（ｄ）一次免疫付与の後のｄ２８にて小腸のマウスＩｇＧ２ａ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡを分泌する細胞の量。ＭＬＮ：腸間膜リンパ節；ＪＬＰ：空腸の粘膜固有層；ＪＰＰ：空腸のパイエル板；ＩＬＰ：回腸の粘膜固有層；ＩＰＰ：回腸のパイエル板。＊、ｐ＜０．０５（Holm-Sidak）。

図７：Pichia pastorisにおけるＡＰＮ特異的ＶＨＨ－ＭＧ融合の種々のバリアントの発現。酵母形質転換体の培養培地（各コンストラクトについて４のコロニー）を、クマシー染色およびウェスタンブロット分析によってスクリーニングし、最も高く発現するクローンを同定した。ここで、各コンストラクトについて１つの高く発現するクローンのみを示し、およびそれらを、それらのＣＤＲ３類似性に従ってグループ化する；点線の間の数字は、それらの所属するファミリーを表す。タンパク質の発現を、１％メタノールとともに４８ｈの間誘発した。培養物を、採取し、および上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（上部）およびウェスタンブロット（下部）によって分析した。「Ｖ２－ＭＧ Ｐｕｒｅ」を、ローディング対照として使用し、および試料の５００ｎｇを、クマシー染色のために、および２００ｎｇを、ウェスタンブロットのためにローディングした。

図８：本発明のポリペプチドの代表的なアミノ酸および核酸配列。ＣＤＲに、下線を引く。 図９：ＶＨＨ－ＦｃマウスＩｇＧ２ａ融合コンストラクト（２Ｌ６５－ＭＧ融合）のアミノ酸および核酸配列。２Ｌ６５ＶＨＨの配列は、太字である。ヒンジ配列に、下線を引く。 図１０：（ａ）一部のブタＩｇＡ（ＡＡＡ６５９４３．１；Ｕ１２５９４．１）のアミノ酸配列；（ｂ）ブタＩｇＡのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フラグメント；（ｃ）一部のブタＩｇＧ３（ＥＵ３７２６５８．１）のアミノ酸配列；（ｄ）ＩｇＧ３（ＣＨ１ドメインは、位置５にて始まる）のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フラグメント。 図１１：ＡＰＮ特異的ＶＨＨは、ＢＨＫ－ＡＰＮ細胞によって内在化される。

本発明の説明
指し示される、または定義されない限り、使用されるすべての用語は、技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、当業者に明確であるだろう。
本明細書に使用されるとき、文脈が明確に指し示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数形の言及（references）を包含する。よって、例えば、「試薬（単数）（a regent）」への言及は、１つ以上のかかる種々の試薬を包含し、および「方法（the method）」への言及は、本明細書に記載の方法のために改変されたまたは代用されることのできるであろう、当業者に知られている等価なステップおよび方法への言及を包含する。

指し示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連のどの要素も言及すると理解されるべきである。当業者は、わずかルーチンの実験法使用することによって、本明細書に記載の本発明の特定の態様の多くの等価物を認める、または確認することができるだろう。かかる等価物は、本発明によって、網羅されることが意図される。
用語「および／または」は、本明細書に使用される場合はいつでも、「および」、「または」および「該用語によって連結される要素のすべてまたはいずれの他の組み合わせ」の意味を包含する。用語「約」または「およそ」は、本明細書に使用されるとき、与えられる値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、および最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書およびそれに続く請求項を通してずっと、文脈が必要としない限り、語「含む（comprise）」、および「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などのバリエーションは、述べられた整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を示唆するが、しかしいずれの他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除も示唆しないことが理解されるだろう。本明細書に使用されるとき、用語「含むこと」は、用語「含有すること」もしくは「包含すること」によって代用され得、またはときには、本明細書に使用されるとき、用語「有すること」によって代用され得る。

用語「配列」は、本明細書に使用されるとき、（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」のような用語において）、より限定された解釈を必要としない限り、関係のあるアミノ酸配列、ならびに同じものをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を包含することを、一般に理解されるべきである。核酸またはアミノ酸配列は、－例えば、それが得られた反応培地または培養培地と比較して－それが該供給源または培地において、別の核酸またはアミノ酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的構成要素もしくは高分子または少なくとも１の夾雑物、不純物または少数の構成要素などと大抵関連付けられる少なくとも１の他の構成要素から分離されたとき、「（本質的に）単離された（形態）（において）」であると考えられる。

２以上のヌクレオチド配列を比較するという目的のために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を、［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの総数］によって割り、［１００％］をかけることによって計算されてもよく－第１のヌクレオチド配列と比較して－第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの各欠失、挿入、置換または付加は、単一のヌクレオチド（位置）の相違として考えられる。代替的に、２以上のヌクレオチド配列の間の配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの配列アライメントについて知られているコンピュータアルゴリズムを使用し、標準的な設定を使用して、計算されてもよい。

２以上のアミノ酸配列を比較するという目的のために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書において、「アミノ酸同一性」としてもまた言及される）は、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数］によって割り、［１００％］をかけることによって計算されてもよく－第１のアミノ酸配列と比較して－第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換または付加は、単一のアミノ酸残基（位置）の相違として、すなわち、本明細書に定義されるとおりの「アミノ酸相違」として考えられる。代替的に、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、ヌクレオチド配列について配列同一性の程度を決定するための上に言及されたものなどの知られているコンピュータアルゴリズムを使用し、再び標準的な設定を使用して、計算されてもよい。

また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定することにおいて、当業者は、アミノ酸残基が同様の化学的構造の別のアミノ酸残基に置き換えられ、かつ本質的にポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性においてほとんどまたは本質的に影響を与えないアミノ酸置換として一般に記載され得る、所謂「保存的」アミノ酸置換を、考慮してもよい。かかる保存的置換は、好ましくは、以下：（ａ）小さい脂肪族の、非極性のまたはわずかに極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性のある、負に帯電した残基およびそれらの（無電荷の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性のある、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族の残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ、の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換される置換である。

具体的に好ましい保存的置換は、以下のとおりである：Ａｌａを、ＧｌｙにまたはＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎにまたはＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａにまたはＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎにまたはＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕにまたはＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅにまたはＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、ＧｌｎにまたはＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、ＴｙｒにまたはＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、ＬｅｕにまたはＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；および／またはＰｈｅをＶａｌに、ＩｌｅにまたはＬｅｕに。
本明細書に記載のポリペプチドに適用されるいずれのアミノ酸置換もまた、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸のバリエーションの頻度の分析に基づいてもよい。

別様に明記されない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、フルサイズの抗体の両方を包含する一般の用語として使用される。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「ＩＳＶＤ」は、単一可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。全抗体のように、それは、特異的な抗原に選択的に結合し得る。１２～１８ｋＤａのみの分子量によって、ＩＳＶＤは、２つの重タンパク質鎖および２つの軽タンパク鎖から構成される従来の抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもおおいにより小さく、およびＦａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖および半分の重鎖）および単一鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、軽鎖から１つおよび重鎖から１つの２つの可変ドメイン）よりもましてより小さい。一般に、ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を、好ましくは以下の式：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４に従って有するであろう。ＩＳＶＤの抗原結合部位は、わずか３つのＣＤＲによって形成される。用語「ＩＳＶＤ」は、本明細書に使用されるとき、Nanobody（登録商標）としてもまた称されるラクダ科の動物の重鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメイン、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、およびサメに由来するＩＳＶＤ（ＩｇＮＡＲドメイン）を包含する。好ましいフレームワーク配列は、例えば図８において略述され、および本発明のＩＳＶＤにおいて使用され得る。好ましくは、表２において描写されるＣＤＲは、同じＩＳＶＤコンストラクトの夫々のフレームワーク領域と適応する。

用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、「単一可変ドメイン」と互換的に使用される。そのため、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合ユニット（すなわち、単一抗原結合ドメインが機能的抗原結合ユニットを形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないような、単一可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合ユニット）を形成する能力がある限り、軽鎖可変ドメイン配列（例として、ＶＬ配列）もしくはその好適なフラグメント；または重鎖可変ドメイン配列（例として、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）もしくはその好適なフラグメントであってもよい。一態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ配列である。

本発明のＡＰＮバインダーは、いずれの好適な様式において、およびいずれの好適な供給源に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインなどの免疫グロブリンであってもよく、および例えば天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の動物の好適な種から）であってもよく、またはこれらに限定されないが、親和性成熟（例えば、合成の、ランダムのまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始された）、ＣＤ移植、表面修飾（veneering）、種々の免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの組み合わせ、重複プライマーを使用するＰＣＲアセンブリーなどの技法、および当業者に周知である免疫グロブリン配列を改変するための同様の技法によって得られた、「ヒト化された」ＶＨＨ配列、「ラクダ化された」免疫グロブリン配列（およびとりわけラクダ化された重鎖可変ドメイン配列）、およびNanobody（登録商標）を包含する、合成のまたは半合成のアミノ酸配列；または上記のいずれの組み合わせのいずれの好適な組み合わせであってもよい。

よりとりわけ本発明は、とりわけＡＰＮに特異的に結合し、（一般の）構造ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４をもつアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここでＦＲ１からＦＲ４は夫々フレームワーク領域１から４を指し、およびＣＤＲ１からＣＤＲ３は夫々相補性決定領域１から３を指す、ポリペプチドを提供する。本発明の一態様において、該ＩＳＶＤは、配列番号６～８のアミノ酸配列の少なくとも１つと、とりわけ配列番号６と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、ましてより好ましくは少なくとも９２％のアミノ酸同一性を有する（図８を参照－ＣＤＲは、下線される）。

本明細書に使用されるとき、「によって表される」は、いずれかの配列番号の文脈において、該配列番号「を含む」または「からなる」と等価であり、および好ましくは該配列番号「からなる」と等価である。本明細書において使用されるように「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」は、同一の長さを有し（すなわちそれらはそれらの配列内に同数のアミノ酸を有する）およびそのアミノ酸配列が８０％以上（例として８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上）の配列同一性を有する、一群のＶＨＨ配列を指す。

一態様において、等価な配列は、好ましくは（本明細書に定義されるとおりの）保存的アミノ酸置換であるアミノ酸置換を指し；および／または該アミノ酸配列は、好ましくは、本明細書において同定されるアミノ酸配列（単数または複数）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、かつアミノ酸欠失または挿入は全く含有せず；および／または本明細書において同定されるアミノ酸配列（単数または複数）の１つと、３つ、２つまたは１つのみの（本明細書に定義されるとおりの）「アミノ酸相違（単数または複数）」を有するいずれかのアミノ酸配列を指す。より具体的な、等価な配列は、好ましくは（本明細書に定義されるとおりの）保存的アミノ酸置換であるアミノ酸置換を有し；および／または該アミノ酸配列は、好ましくは、本明細書において同定されるアミノ酸配列（単数または複数）と比較して、アミノ酸置換のみを含有し、およびアミノ酸欠失または挿入を全く含有しない。

用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、互換的に使用され得、免疫グロブリン、従来の抗体、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドなどの抗原結合分子によって、およびより具体的に該分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドまたはタンパク質などの高分子の一部を指す。エピトープは、免疫グロブリンのための最小の結合部位を定義し、およびよって免疫グロブリンの特異性の標的を表す。あるエピトープ、抗原またはタンパク質に（またはのそれらのフラグメントまたはエピトープの少なくとも一部）「結合する」または「特異的に結合する」ことができる、「親和性を有する」および／または「特異性を有する」アミノ酸配列（免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、本発明のポリペプチド、または一般的な抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたはそれらのフラグメントなど）は、該エピトープ、抗原もしくはタンパク質に「対する」または「対して向けられる」と言われ、またはかかるエピトープ、抗原もしくはタンパク質に関して「結合する」分子である、または「抗」エピトープ、「抗」抗原もしくは「抗」タンパク質（例として、「抗」ＡＰＮ）と言われる。

親和性は、分子間相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、モル／リットル（またはＭ）の単位を有するＫ_Ｄ、または解離定数によってとして一般的に与えられる。親和性はまた、結合定数、Ｋ_Ａとしても表現され得、１／Ｋ_Ｄと等しく、および（モル／リットル）^－１（またはＭ^－１）の単位を有する。有意義（例として特異的）であると考えられる生物学的な相互作用についてのＫ_Ｄは、典型的には１０^－１２Ｍ（０．００１ｎＭ）から１０^－５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲にある。相互作用がより強くなるにつれ、そのＫ_Ｄはより低くなる。

２分子の間の分子間相互作用の親和性は、１分子はバイオセンサチップの上に固定され、および他の分子は流動条件下で固定された分子の上を通過させ、kon、koff測定およびゆえにＫＤ（またはＫＡ）値を生ずる、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al.［１２］を参照）などのそれ自体が知られている種々の技法を介して測定され得る。これは、例えば周知のBIACORE（登録商標）器械（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を使用し、実行され得る。速度論的な結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）（KINEXA（登録商標））［１３］は、溶液中の結合事象を結合パートナーの標識なしに測定し、および複合体の解離を速度論的に除外することに基づく。溶液中親和性分析はまた、自動化された生物分析および迅速な試料転換のためのプラットホームを提供する、GYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステムを使用しても実行され得る［１４］。

用語「特異性」は、具体的な抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドなどの）分子が結合し得る抗原、または抗原決定基の種々のタイプの数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／または結合活性に基づき決定され得る。典型的には、抗原結合タンパク質（本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなど）は、１０^－５から１０^－１２モル／リットル以下、および好ましくは１０^－７から１０^－１２モル／リットル以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）によってそれらの抗原へ結合するだろう。１０^－４モル／リットルよりも大きいいずれのＫ_Ｄ値も（または１０^－４リットル／モルよりも低いいずれのＫ_Ａ値も）、一般に非特異的結合を指し示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価のＩＳＶＤは、約１０μＭまたは１０μＭ未満、とりわけ約５μＭまたは５μＭ未満、よりとりわけ例として５００ｎＭ未満などの１μＭ未満、より具体的に２００ｎＭ未満、さらにより具体的に例として１０ｐＭと５ｐＭ以下との間などの５００ｐＭ未満などの１０ｎＭ未満の親和性によって所望される抗原に結合するだろう。

ＩＳＶＤなどの抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的な結合は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、およびそれ自体が技術分野において知られているものの種々の変形を包含する、当業者に知られているいずれの好適な様式において；および本明細書に記載される他の技法および好ましくはフローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴によって決定され得る。

一態様において、ブタＡＰＮ（ｐＡＰＮ）へのポリペプチドの結合は、ＥＬＩＳＡを介しておよびｐＡＰＮ発現細胞に対するフローサイトメトリーを介して決定された。しかしながら、固定された抗原への結合は細胞膜への結合と等価でない可能性があるため、フローサイトメトリーのデータが、最も信頼できた。それは、生物学的な膜の上に発現するそのネイティブな形態における完全長タンパク質への結合を示した。その上、我々は、フローサイトメトリーデータをさらに確定する腸組織における結合との明確な相関関係を観察した。

一態様において、本発明は、ＡＰＮに特異的に結合し、およびさらにまたＡＰＮ受容体を介する細胞による、とりわけＡＰＮを発現する細胞による、よりとりわけ腸細胞による特異的な取り込みを示すポリペプチドを提供する。本明細書に使用されるとき、「腸細胞」または腸の吸収性の細胞（吸収性の絨毛上皮細胞ともまた称される）は、小腸および大腸の内側の表面を裏打ちする上皮細胞であり、および食作用および上皮の障壁を越えて腸の病原体または高分子を輸送する、トランスサイトーシス性質を持つ。

「アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）」（ＣＤ１３、ＡＮＰＥＰ、ＰＥＰＮ、アラニルアミノペプチダーゼとしてもまた知られている）は、ＩＩ型膜糖タンパク質であり、膜結合メタロプロテアーゼのファミリーに所属し、および腸の刷子縁膜などの様々な組織において発現される。
ＡＰＮについて関係のある構造上の情報は、下の表１において描写されるとおり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号にて見出されてもよい。

本明細書に使用されるとき、「ＡＰＮ」または「ＣＤ１３」ポリペプチドは、哺乳動物ＡＰＮ遺伝子によってコードされるタンパク質であることを意味し、保存的または非保存的変更を含有する対立遺伝子バリアントおよびそれらの生物学的に活性なフラグメントおよび先述のＡＰＮポリペプチドのいずれか１つと実質的に同一である、すなわち少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である人工タンパク質を包含する。具体的な態様において、ＡＰＮポリペプチドは、ブタの（Porcine）、またはブタ（pig）ＡＰＮ（Sus scrofa；受託番号ＡＤＸ５３３３３．１）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。さらなる態様において、本明細書に定義されるとおりＡＰＮポリペプチドは、それらがグリコシル化されている点でさらに特徴付けられる。

類推によって、「ＡＰＮ」または「ＣＤ１３」ポリヌクレオチドは、保存的または非保存的変更を含有する対立遺伝子バリアントおよび生物学的に活性なフラグメントおよび先述のＡＰＮをコードするポリヌクレオチドのいずれか１つと実質的に同一である、すなわち少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるいずれかの核酸分子を包含することを意味する。
具体的な態様において、ＡＰＮポリヌクレオチドは、ブタのＡＰＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＱ８２４５４７．１）についてコードする核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。

一態様において、本発明のポリペプチドは、哺乳動物の腸のＡＰＮ、とりわけブタのＡＰＮ、よりとりわけブタの腸のＡＰＮ、よりとりわけ小腸において存在する上皮細胞または腸細胞上に発現されるものへ特異的に結合し、およびにそれによって内在化され、該ＡＰＮは、タンパク質受託番号ＡＤＸ５３３３３．１によって表されるアミノ酸配列を含む。本発明におけるユニークなデータは、経口送達後、ポリペプチドが、ＡＰＮに結合するのみでなく、しかし腸の腸細胞によるエンドサイトーシス（細胞内への輸送）およびこれに続く粘膜免疫系への適切な提示によって、上皮の障壁を通るトランスサイトーシス（細胞の内側を越えての輸送）もまた、導くことを実証する。

ＡＰＮを発現する細胞は、本発明のポリペプチドの取り込みまたは内在化を決定するために使用され得る。「発現」は、一般に、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／またはｍＲＮＡがこれに続いてペプチド、ポリペプチドにまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ＡＰＮ発現は、外来性核酸の細胞中への導入を伴う方法によって促進される、または増大されてもよい。かかる細胞は、コードされるＡＰＮポリペプチドの発現を許容する様式において、ポリヌクレオチドまたはベクターを含んでいてもよい。本明細書に提供されるとおりのＡＰＮをコードするポリヌクレオチドは、単離されたタンパク質コード領域を含む環状プラスミドの一部として、または線状ＤＮＡとして、またはウイルスベクターにおいて、宿主細胞中へ導入されてもよい。当該技術分野において周知であるおよびルーチン的に実践される宿主細胞内へ外来性核酸を導入するための方法は、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、核注入、またはリポソームなどの担体との融合、ミセル、幽霊細胞、およびプロトプラストを包含する。本発明の宿主細胞システムは、植物、無脊椎動物および脊椎動物細胞システムを包含する。

内在化を研究するために使用される細胞は、例えば腸細胞調製などの小腸の上皮組織から単離された初代細胞；またはＡＰＮを発現する組換え細胞株、とりわけブタ腸上皮細胞（ＩＰＥＣ－Ｊ２、ＩＰＥＣ－Ｉ、ＩＰＩ－２ｉ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例としてＢＨＫ２１細胞）を包含する一連の細胞、または成体ＩＳＣ（エンテロイド／オルガノイド）もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（オルガノイド）のいずれかに由来する「ミニ腸（mini-intestines）」である。さらなる細胞は、これらに限定されないが、以下：昆虫細胞、ブタ腎臓（ＰＫ）細胞、ブタ腎臓皮質（ＳＫ－ＲＳＴ）細胞、ネコ科腎臓（ＦＫ）細胞、felis catus全胎児細胞（Ｆｃｗｆ－４）、ブタ（swine）精巣（ＳＴ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＭＡ－１０４、ＭＡＲＣ－１４５、ＶＥＲＯ、およびＣＯＳ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞、ヒト結腸癌上皮（ＣａＣｏ２）細胞、ヒトリンパ芽球（Ｋａｓｕｍｉ－３）、ヒト骨髄芽球（Ｋａｓｕｍｉ－４）、ヒト骨髄芽球（Ｋａｓｕｍｉ－６）、ヒト好塩基球細胞株（ＫＵ８１２）、ヒトＢリンパ芽球（ＳＵＰ－Ｂ１５）、ヒト上皮腎臓皮質細胞（ＷＴ９－７、ＷＴ９－１２）を包含してもよい。昆虫宿主細胞培養システムはまた、本発明に従うポリペプチドの発現のために使用されてもよい。

該文脈において、本発明に従うポリペプチドの発現のために好適な発現ベクターの選択は、使用される特定の宿主細胞に当然依存し、および通常の当業者の技能以内であるだろう。好適な発現ベクターの例は、ｐＳｐｏｒｔおよびｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）、およびｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech）を包含する。哺乳動物宿主細胞における使用のための発現ベクターは、ウイルスのゲノムに由来する転写および翻訳制御配列を包含してもよい。本発明において使用されてもよい一般的に使用されるプロモーター配列および修飾因子配列は、これらに限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウィルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものを包含する。

代替として、ポリペプチドの取り込みまたは内在化は、本例中に開示されるとおり、消化管の結紮ループ実験においてブタ腸組織を使用することによって決定され得る。これらのデータは、小腸上皮を越えてのＡＰＮを標的にしたＶＨＨの効率的な輸送を支持する。

ＡＰＮ配列は様々な種からの細胞に存在すると知られているため、内在性遺伝子は、ＡＰＮポリペプチドの発現を許容するまたは増大するように改変されてもよい。細胞は、細胞がより高いレベルでＡＰＮポリペプチドを発現するように、すべてのまたは一部の異種のプロモーターによって、天然に存在するＡＰＮプロモーターを、全体においてまたは部分において置き換えることによって改変され（例として、相同組換えによって）増大した発現を提供し得る。異種のプロモーターは、それが内在性のＡＰＮをコードする配列へ作動可能なように連結されるような様式において挿入される。異種のプロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能マーカーＤＮＡ（例として、カルバミルホスファートシンターゼ、アスパルタートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼについてコードするａｄａ、ｄｈｆｒ、および多機能のｃａｄ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡは、異種のプロモーターＤＮＡと共に挿入されてもよいということもまた、企図される。ＡＰＮをコードする配列へ連結されている場合、標準的な選択方法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞においてＡＰＮをコードする配列の共増幅をもたらす。

代替的に、ＡＰＮ発現はまた、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）による［１５］、またはベスタチンによる［１６］処置などの細胞においてＡＰＮの発現を誘発すると知られている化合物による処置によって誘発されてもよい。

一態様において、本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドは、２つの異なる抗原または抗原決定基（例としてヒトＡＰＮ、ブタＡＰＮ、イヌＡＰＮ、ネコＡＰＮ、ウマＡＰＮ、ウシＡＰＮ、ラットＡＰＮ、マウスＡＰＮ、および／またはアカゲザルＡＰＮなどの、例として哺乳動物の異なる種からのＡＰＮなど）について、それがそれらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書に定義されるとおり）特異的である場合、「交差反応性」であると言われる。ＩＳＶＤまたはポリペプチドは、２つの異なる抗原に対する結合親和性は２、５、１０、５０、１００またはさらにより大きい因数によってなど異なり得るものの、それがこれらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書に定義されるとおり）特異的であるという条件で、交差反応性であると考えられてもよいことは、正しく理解されるだろう。

さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、実例として、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴または競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイによって、とりわけ競合ＥＬＩＳＡによって決定されるとおり、配列番号６、７または８によって表されるものなどの本明細書に記載のとおりのポリペプチドと競合する。

本発明は、さらに配列番号６、７または８のいずれか１つによって表されるものなどの本発明に記載のとおりのポリペプチドと競合する、例としてポリペプチドまたは小分子などの競合物（competitor）を決定するための方法に関し、ここで本明細書に記載のとおりのポリペプチドは、実例としてブタのＡＰＮなどのＡＰＮへ結合するために、ポリペプチドなどの競合物と競合する、または競合物を交差的にブロックし、ここで競合物のＡＰＮへの結合は、本発明のポリペプチドの不在における競合物のＡＰＮへの結合と比較して、本発明のポリペプチドの存在下で少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ超、例えば８０％、９０％または１００％さえ（すなわち所与のアッセイにおいて事実上検出不能）低減される。とりわけ、少なくとも８０％、および好ましくは少なくとも９０％の低減は、本明細書に提供されるアッセイのいずれか１つによって測定されるとき、競合的な結合を指し示す。競合および交差的ブロッキングは、実例として、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉または競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイなどの当該技術分野において知られているいずれの手段によって決定されてもよい。側面において、本発明は、本発明のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、配列番号６、７または８によって表されるポリペプチドの少なくとも１つのＡＰＮへの結合を交差的にブロックする。
アッセイ条件は、当業者に一般に知られているとおりに、および／または本明細書に提供されるとおりに適用される。

用語「（交差的に）ブロッキングすること」、「競合的に結合すること」、および「競合すること」は、免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤の、他の免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは結合剤の所与の標的への結合を阻害する能力を意味するために、本明細書において互換的に使用される。標的の（交差的）ブロック対して向けられる免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤が本明細書に定義されるとおりに競合的に結合する、または競合的であるかどうかを決定することのための方法は、例としてXiao-Chi Jia et al.［１７］またはMiller et al.［１８］（参照によって組み込まれる）において記載される。

本発明は、ＡＰＮに結合する、腸上皮を越えての輸送を誘導する、および免疫応答を誘導する能力のあるＶＨＨのファミリーを同定している。単一ドメイン抗体の該ファミリーは、表２において提供される、以下の相補性決定領域（夫々ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によって特徴づけられる。
特にＣＤＲ３においてかかる高い配列同一性（８０％以上の同一性）を有するＶＨＨは、同じエピトープを認識し、および同じ機能的特徴を有すると予測される。

一態様において、本発明は、腸のアミノペプチダーゼＮに結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、ここで、該ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（夫々ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列からなり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３によって表されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列からなり；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号４によって表されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる。

別の態様において、本発明は、腸のアミノペプチダーゼＮに結合する、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、
ここで該ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（夫々ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１、および
配列番号１と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）を有するアミノ酸配列
からなる群から選出され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３、および
配列番号３と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）を有するアミノ酸配列
からなる群から選出され；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号４、および
配列番号４と１、２または３アミノ酸相違（単数または複数）を有するアミノ酸配列からなる群から選出される。

一態様において、バリアントのアミノ酸は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列の位置（単数または複数）４、６および／または７においてであり；および／または配列番号４によって表されるアミノ酸配列の位置（単数または複数）６、１０および／または１２においてである。

とりわけ、本発明は、本明細書に記載のとおりのＩＳＶＤに関し、ここで該ＩＳＶＤは、ＡＰＮへ特異的に結合し、および４つのフレームワーク領域（夫々、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（夫々、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、
（ｉ）ＣＤＲ１は、以下：
－配列番号１；および
－配列番号１と１、２または３アミノ酸相違を有するアミノ酸配列、ここで位置４においてＩは、Ｆへ変更されている、および／またはここで位置６において、Ｎは、Ｓへ変更されている、および／またはここで位置７において、Ｈは、Ｎに変更されている、
からなる群から選出され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３からなり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下：
－配列番号４；および
－配列番号４と１、２または３アミノ酸相違を有するアミノ酸配列、ここで位置６において、Ｖは、Ａへ変更されている、および／またはここで位置１０においてＶは、Ｌに変更されている、および／またはここで位置１２において、Ｄは、Ｅに変更されている、
からなる群から選出される。

とりわけ、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、ここで該ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（夫々、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１または２からなり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３からなり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号４または５からなる。

さらにより具体的に、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、ここで該ＩＳＶＤは、以下：
－ＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＣＤＲ２は、配列番号３であり、およびＣＤＲ３は、配列番号４であるか；または
－ＣＤＲ１は、配列番号２であり、ＣＤＲ２は、配列番号３であり、およびＣＤＲ３は、配列番号５である、
から選出されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせを含む。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列、またはそれらと少なくとも８０％の同一性、とりわけ少なくとも８５％の同一性、よりとりわけ少なくとも９０％の同一性、さらによりとりわけ少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む、またはそれからなる。具体的な態様において、ＣＤＲにおける配列バリエーションは、配列番号１によって表されるアミノ酸配列の位置（単数または複数）４、６および／または７；および／または配列番号４によって表されるアミノ酸配列の位置（単数または複数）６、１０および／または１２においてに限定される。別の態様において、夫々配列番号１～５によって特徴づけられるとおり、ＣＤＲにおける配列バリエーションは全くなく、およびＦＲの配列のみが異なり得る。より特異的に、本発明は、配列番号６を含むポリペプチド、または配列番号６と少なくとも８０％、より具体的に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供し、およびここでＣＤＲ１は、配列番号１または２からなり；ＣＤＲ２は、配列番号３からなり；および／またはＣＤＲ３は、配列番号４または５からなる。

別の態様において、本発明は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２の核酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性、とりわけ少なくとも８０％の同一性、よりとりわけ少なくとも８５％の同一性を有する配列によってコードされる。

具体的な態様において、ＣＤＲにおける配列バリエーションは、配列番号１によって表される、コードされるアミノ酸配列の位置（単数または複数）４、６および／または７に；および／または配列番号４によって表されるアミノ酸配列の位置（単数または複数）６、１０および／または１２においてに限定される。別の態様において、夫々配列番号１～５によって特徴づけられるとおり、ＣＤＲをコードするアミノ酸における配列バリエーションは、全くなく、およびＦＲの核酸配列のみが異なり得る。
より特異的に、本発明は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の配列を含む、またはそれからなる。

、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、限定することなく、構成ブロックとしての役を担い得る（すなわち、ＡＰＮ上の同じまたは別のエピトープに対する、および／またはＡＰＮではない１つ以上の他の抗原、タンパク質もしくは標的に対する）、１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを任意に含有してもよいポリペプチドの調製のための「構成ブロック」として使用されてもよいことが、正しく理解されるだろう。ゆえに、本発明のポリペプチドは、ＡＰＮに結合し、とりわけＡＰＮに結合しかつＡＰＮを発現する細胞によってエンドサイトーシスされる、少なくとも１つのＩＳＶＤを含む。
一般に、単一の構成ブロック、例として単一のＩＳＶＤを含むまたは本質的にそれからなるポリペプチドまたはコンストラクトは、本明細書において夫々、「一価の」ポリペプチドおよび「一価のコンストラクト」と称されるだろう。２つ以上の構成ブロック（例として、ＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドまたはコンストラクトはまた、本明細書において「多価の」ポリペプチドまたはコンストラクトと称されるだろう、およびかかるポリペプチドまたはコンストラクトにおいて存在する構成ブロック／ＩＳＶＤはまた、本明細書において「多価のフォーマット」においてであるとしても称されるだろう。例えば、「二価の」ポリペプチドは、任意にリンカー配列を介して連結される２つのＩＳＶＤを含んでいてもよく、他方で「三価の」ポリペプチドは、任意に２つのリンカー配列を介して連結される３つのＩＳＶＤを含んでいてもよい；等々である。

結果的に、ＡＰＮに結合しかつ本明細書に提供される本発明のＩＳＶＤは、本質的に単離された形態においてであり得る、またはそれらは、１つ以上の本発明のＩＳＶＤ（単数または複数）を含むまたは本質的にそれからなってもよく、および例としてタンパク質またはポリペプチド、とりわけ抗原性のタンパク質またはポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるアミノ酸配列（１つ以上の好適なリンカーを介してすべてが任意に連結される）を任意にさらに含んでいてもよい、コンストラクトまたはポリペプチドの一部を形成してもよい。

さらなる態様において、本発明は、化学的な（例として小分子）または生物学的な、とりわけ薬物／治療薬、生理活性化合物、抗原、毒素、および／または診断薬（例としてラベル、マーカーまたはイメージング剤）などの生物学的なまたは機能活性を有する少なくとも１つの化合物に（直接的にまたは間接的に）カップリングされた、連結された、または抱合された本明細書に定義されるとおりの少なくとも１つのポリペプチド、とりわけ本明細書に提供されるとおりの少なくとも１つのＩＳＶＤを含む、「キメラ分子」（任意にコンストラクトともまた称される）を提供する。該態様において、ポリペプチドまたはＩＳＶＤは、腸の障壁を越えての該化合物の送達のための担体として、作用するだろう。薬物または治療薬は、腸の粘膜下層においてまたは腸の粘膜関連リンパ組織において活性であるだろう、および／または抗原は、腸の粘膜下層における、または腸の粘膜関連リンパ組織における、免疫応答を誘発するだろう。該治療剤は、抗炎症剤、抗がん剤、細胞傷害剤、抗感染剤（例として、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫性剤、抗ウイルス剤、毒物、細胞傷害薬、放射性核種剤、等々）であってもよい。抗原は、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸、糖脂質および糖タンパク質、炭水化物、オリゴ糖類、および多糖類を包含する。また、例としてナノ粒子（ＮＰ）に基づく、種々の薬物送達システムまたは（薬物をローディングした）担体はまた、本発明のポリペプチドに抱合され得、無機、磁気、およびポリマー粒子またはＮＰをも包含する。

用語「に抱合された」は、本明細書に使用されるとき、とりわけ、安定な共有結合連結をもたらす化学的なおよび／または酵素的な抱合を指す。キメラ分子を得るためのカップリングは、ＩＳＶＤにおいて存在する特定のアミノ酸（例としてリジン、システイン）を介して起こり得る。既に述べられたとおり、剤など（例としてタンパク質、ヌクレオチド配列、脂質、炭水化物、ペプチド、薬物部分（例として細胞傷害薬、抗体薬物抱合体またはペイロード）、トレーサーおよび検出剤）のいずれの部分も、具体的な生物学的または特定の機能活性とカップリングされ得る。カップリングされた部分が遺伝子学的にコードされた治療用または診断用のタンパク質またはヌクレオチド配列である態様において、カップリングされた部分は、当該技術分野において周知である、ペプチド合成または組換えＤＮＡ方法のいずれかによって合成、または発現されてもよい。抱合された部分が非遺伝子学的にコードされるペプチド、例として薬物の部分である別の側面において、抱合された部分は、人工的に合成されるか、または天然の供給源から精製されていてもよい。

さらなる態様において、本明細書に提供されるとおりのポリペプチドまたはキメラ分子は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットを、さらに含み得る。１つ以上他の基、残基、部分または結合ユニットは、好ましくは、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらのフラグメント、血清タンパク質に結合し得る結合ユニット、血清タンパク質に結合し得るＦｃ分割部分または小タンパク質またはペプチド、さらなるアミノ酸残基、タグ、または例として、毒素、ラベル、放射性化学物質、等々の他の機能的部分からなる群から選出される。他の基、残基、部分または結合ユニットは、例えば化学基、残基、部分であってもよく、それら自体が生物学的におよび／または薬理学的に活性であってもよく、または活性ではなくてもよい。例えば、および限定することなく、かかる基は、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの「誘導体」を提供するように、本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドの１つ以上へ連結されていてもよい。

一般に、当該技術分野において知られている様々なリンカーは、本発明に従うＩＳＶＤと（生理活性の）化合物、剤または部分を連結するために使用され得る。明確であるにちがいないとおり、切断可能なおよび切断不能なリンカーは、所望される放出プロファイルを達成するために採用され得る。一般に、リンカーおよび抱合の化学の最適な組み合わせは、各々のユニークな様相：ＩＳＶＤ、抱合される部分、および処置される疾患のプロファイルに相関するように、ユニークに仕立てらなければならない。さらなる他の好適なスペーサーまたはリンカーは、当業者に明確であるだろう、および技術分野において一般に使用されるいずれのリンカーまたはスペーサーであってもよい。特定の側面において、リンカーまたはスペーサーは、医薬的使用が意図される適用において使用されるために好適である。例えば、リジンと抱合体との間のリンカーはまた、ある側面において、好適なアミノ酸配列、およびとりわけ１～５０アミノ酸配列の間、またはより具体的に言うと、１～３０アミノ酸残基の間のアミノ酸配列であってもよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの例は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカーを包含する。さらなる他の好適なリンカーは、有機化合物またはポリマー、とりわけ医薬的使用のためのポリペプチドにおいて使用するために好適なものを一般に含む。実例として、ポリ（エチレングリコール）部分は、抗体ドメインを連結するために使用されている。長さ、柔軟性（flexibility）の程度および／またはリンカーの他の特性は、これらに限定されないが、特異的な標的化のための親和性、特異性または結合活性を包含する、本発明の最終的なＩＳＶＤ抱合体の特性においていくらかの影響を及ぼしてもよいことは、本発明の範囲内に網羅される。本明細書における本開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限られたルーチンの実験の後、本発明の特定のＩＳＶＤにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるだろう。

ＶＨＨの小さなサイズおよび迅速な腎クリアランスは、ときにはある疾患における長期保護を提供するために好ましくない特徴である。いくつかのアプローチは、半減期の延長を確実にし、および本発明の態様と考えられる。ゆえに、現在のＶＨＨの有効性は、滞留時間を微調整することによって改善され得る。本明細書に提供されるＶＨＨは、それらの分子量を増大させるために化学修飾され得る。例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基による、かかる化学修飾はまた、プロテアーゼに対してＶＨＨを保護してもよい。ＶＨＨの半減期を延長するための別のストラテジーは、ＶＨＨを長寿命の血清タンパク質へ、またはこれらの長寿命のタンパク質を標的にする構成ブロックへカップリングすることによってである。さらにまた、負に帯電した小タンパク質は中性タンパク質よりも循環中により長く残ることが観察されている。シアル酸ポリマーの付加（ポリシアリル化）またはヒドロキシエチルデンプンの付加（HESylation)、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ホルモン中に見出される高度にシアリル化された（sialyated）ベータカルボキシ末端のペプチド（ＣＴＰ）のアミノ酸残基との融合によるものを包含する、タンパク質へ負電荷を追加するいくつかの方針がある。最終的に、「Ｆｃドメイン－ベースの融合コンストラクト」はまた、ＶＨＨを包含する、治療用タンパク質の半減期を延長するためにも幅広く使用される。ゆえにさらなるストラテジーは、本発明のＶＨＨをＩｇＧ分子のＦｃ領域または他のＦｃ部分へ融合することである。しかしながら、小腸の環境においてより安定なＩｇＡのＦｃドメインなどの、他のＦｃドメインもまた、適格である。

例えば、親和性および結合活性を増大させ、および同時に容易な精製を可能にするために、本発明のＶＨＨドメインは、マウスＩｇＧのＦＣドメインへ、より具体的にはマウスＩｇＧ２ａへ融合され、本明細書においてＶＨＨ－ＭＧ融合とも称される。ブタＩｇＧまたはブタＩｇＡのＦｃドメインに融合された本発明のＶＨＨはまた、本発明の部分でもあり、および本明細書において、夫々、ＶＨＨ－ＰＧまたはＶＨＨ－ＰＡ融合と称される。好適なＦｃドメインまたはそれらの部分は、例として図１０において提供される。

一態様において、本発明は、少なくとも１つのポリペプチド、とりわけ本明細書に提供されるとおりのＩＳＶＤ、およびＦｃ領域またはＦｃ結合部分、とりわけ、例として配列番号１８～２１のいずれか１つを含むまたはそれからなるＦｃドメインなどのＩｇＧまたはＩｇＡのＦｃドメインを含む、キメラ分子を提供する。特定の態様において、本発明は、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含むＩＳＶＤを含み；配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１もしくはそれらの部分、またはそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、またはそれからなるＦｃドメインへ融合されたポリペプチドを提供する。

本発明のポリペプチドは、とりわけ本明細書に記載のとおりの免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらの最も広い意味において、特定の生物学的な供給源へまたは特定の調製の方法に限定されない。それらは、以下：（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することによって；（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって；（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」によってまたはかかるヒト化されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）既存の抗体へ結合を低減する天然に存在するＶＨＨドメインの「突然変異」によって、またはかかる突然変異ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（５）いずれの動物種からの、およびとりわけ人間からなどの哺乳動物種からの、天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化」によって、またはかかるラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（６）技術分野において記載されるとおりの「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によって、またはかかるラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（７）それ自体が知られている、タンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための、合成のまたは半合成の技法を使用することによって；（８）それ自体が知られている、核酸合成のための技法を使用しNanobody（登録商標）をコードする核酸を調製し、これに続く核酸の発現よって得られた核酸によって；および／または（９）上記の１つ以上のいずれの組み合わせによって、一般に得られ得る。

ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸を、重鎖抗体のＶＨＦドメインにおける対応する位置（単数または複数）において起こる１つ以上アミノ酸残基によって置き換えることによって、「ラクダ化される」。これは、当業者に知られているいずれの方法によっても実行され得る。かかる「ラクダ化する」置換は、好ましくはＶＨ－ＶＬ界面を形成する、および／または、ＶＨ－ＶＬ界面において存在するアミノ酸位置においておよび／または当業者に周知でありおよび例えばWO 94/04678においておよびDaviesおよびRiechmann［１９］によって定義されている、所謂ラクダ科のホールマーク残基において、挿入される。

さらにまた、および当業者に知られているとおり、哺乳動物細胞、酵母、植物、等々などの種々の産生プラットホームは、抗体などの複雑に組み立てられた糖タンパク質の産生のために使用され得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような、哺乳動物の細胞に基づいた産生は、抗体の産生のために簡単である。トランスジェニック植物および酵母発現系もまた、大きな潜在力を示す。Komagataella phaffii［２０］などの酵母は、Pichia pastorisのようにこれまでに命名されおよび古い命名法下でよりよく知られ、短い生成時間、コスト有効性、遺伝子操作および拡張性の容易さの点で、植物発現系を上回る明確な利点を持つ。その上、P.pastorisは、極めて低量の内在性タンパク質を分泌し、したがって分泌される組換えタンパク質は、高度に富化濃縮されあり、下流プロセシングを促進する。他方、植物における組換えタンパク質のグリコシル化のプロファイルは、酵母発現プラットホームよりも動物細胞のそれに大いにより類似する。
一態様において、本発明は、酵母、とりわけPichia pastorisを使用し、本明細書に提供されるとおりのポリペプチド、とりわけＩＳＶＤ、さらにより具体的にキメラ分子の産生を提供する。

本発明のポリペプチドまたはキメラ分子を提供するように、本発明の多価ポリペプチドまたはキメラ分子は、本発明のＩＳＶＤおよび／または一価ポリペプチドを、本明細書に記載のとおりの１つ以上のさらなるＩＳＶＤまたは他の化合物へ任意に１つ以上の好適なリンカーを介して、好適に連結するステップを、少なくとも含む方法によって一般に調製され得る。本発明のポリペプチドはまた、一般に、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、好適な様式において該核酸を発現するステップ、および本発明の発現されたポリペプチドを回収するステップを少なくとも含む方法によっても調製され得る。かかる方法は、例えば本明細書にさらに記載される方法および技法に基づいて、それ自体が知られている、当業者に明確であるだろう様式において実行され得る。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に提供されるとおりのヌクレオチド配列を含むベクターに関する。用語「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウイルス、ＡＡＶもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを包含する、当業者に知られているいずれのベクターをも包含する。該ベクターは、発現ベクターおよびにクローニングベクターを包含する。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、および一般に、具体的な宿主生物（例として、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物）においてまたはin vitro発現系において、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な所望されるコード配列および適切なＤＮＡ配列を含有する。典型的には、「発現ベクター」は、制御ヌクレオチド配列が関連するヌクレオチド配列の転写または発現を制御できるように、発現可能なプロモーターもしくは制御ヌクレオチド配列がｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列もしくはＤＮＡ領域へ作動可能なように連結された、またはそれらに関連するヌクレオチド配列を含む。典型的には、ベクターの制御ヌクレオチド配列またはプロモーターは、自然界において見出されるとおり関連するヌクレオチド配列へ作動可能なように連結されておらず、ゆえに、作動可能に連結されたＤＮＡ領域のコード配列と異種である。

別の態様は、本発明によって提供されるポリペプチド、またはキメラ分子、または核酸配列を含む、宿主細胞または発現宿主に関する。用語「宿主細胞」、「発現宿主」、または「宿主」は、組換えの様式において（遺伝子組換えによって形成される）関心のあるタンパク質または核酸を発現するために使用される細胞系を指す。これはいつでも厳重に必要とされるわけではないものの（例として植物細胞の場合、植物そのものが組換えタンパク質を生産するために使用され得る）、宿主細胞は、「高等真核細胞」（例としてＣＨＯ細胞株）に関し得、典型的には細胞培養物（例としてＨＥＫまたはＣＨＯ細胞株などの、細胞株）の一部である。宿主細胞はまた、糸状菌細胞または酵母細胞を意味する場合、本明細書に使用されるとおり「下等真核細胞」にも関し得る。酵母細胞は、Saccharomyces（例としてSaccharomyces cerevisiae）、Hansenula（例としてHansenula polymorpha）、Arxula（例として Arxula adeninivorans）、Yarrowia（例としてYarrowia lipolytica）、Kluyveromyces（例としてKluyveromyces lactis）、またはKomagataella phaffii（Pichia pastoris）種からであり得、および本明細書にまたさらに使用され得る。特定の態様に従うと、下等真核細胞は、Pichia細胞、および最も具体的な態様においてPichia pastoris細胞である。「原核細胞」に関する宿主細胞は、例えば大腸菌、LactococcusおよびBacillus種などの細菌性細胞のような非病原性の原核生物を、典型的には指す。

さらなる態様において、現発明は、医薬としての使用のための、よりとりわけ腸の疾患の症状を予防、処置および／または低減することにおいて使用するための、さらによりとりわけ腸の疾患に対する経口ワクチン接種において使用するための、本明細書に提供されるＩＳＶＤ、ポリペプチド、キメラ分子、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を提供する。本明細書に使用されるとき、「腸の疾患」は、消化管または腸の感染および消化管または腸の、より特定に小腸の炎症疾患（例として炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎）を指す。かかる炎症は、例として自己免疫疾患によって引き起こされ得る。腸の病原体による感染は、以下：病原性の大腸菌(ＥＴＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ、ＳＴＥＣ，…）、ビブリオ、カンピロバクター、クロストリジウム、サルモネラ、エルシニア、ローソニア、ロタウイルス、シゲラ、ＰＥＤＶ、クリプトスポリジウム、およびイソスポラからなる属の群から選択される種による感染を包含する。とりわけ、本発明は、本発明のポリペプチド、キメラ分子または組成物を対象へ投与することによって腸の疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。一態様において、投与は、経口的である。

本明細書に提供されるとおりのＩＳＶＤは、化合物、とりわけ生理活性の化合物、よりとりわけ抗原を（胃）腸粘膜を越えて標的化する担体として機能し得る。一側面において、本発明は、例として消化管病原体に対する強い粘膜免疫応答を誘導する、消化管上皮への標的化されたワクチン送達のための担体としてのポリペプチドまたはＩＳＶＤに注目する。本明細書に使用されるとき、「粘膜免疫応答」は、腸、尿生殖路および／または呼吸器系粘膜の膜、すなわち、外部環境と接触する表面において起こる免疫応答（液性および細胞性応答）を指す。本発明の文脈において、粘膜免疫応答は、小腸の粘膜の膜において起こる腸粘膜免疫応答、とりわけ免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生である。本発明はさらにまた、本明細書に提供されるとおりのＩＳＶＤ、ポリペプチド、キメラ分子または組成物を、対象へ経口的に投与することによって、対象において、腸の疾患を処置するための方法、および／または腸の病原体に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、医薬組成物の調製における、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／またはキメラ分子の使用に関する。ゆえに、また提供されるのは、医薬組成物および本明細書において述べられる処置の方法の１つ以上におけるその使用である。典型的には、医薬組成物は、本明細書に記載のとおりのＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／またはコンストラクト、および薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含み、任意にアジュバントと組み合わせられる。

「担体」または「アジュバント」、とりわけ「薬学的に許容し得る担体」または「薬学的に許容し得るアジュバント」は、それ自体によって、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導せず、それらが保護を引き出しもしない、いずれの好適な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントでもある。「薬学的に許容し得る」によって、生物学的ではないまたはさもなければ望ましくないことはない材料、すなわち、その材料は、それが含有される医薬組成物の他の構成要素のいずれとも望ましくない生物学的効果を引き起こすこと、または有害な様式において相互に作用することなしに化合物と共に個体に投与され得るることが、意味される。薬学的に許容し得る担体は、好ましくは、担体に帰せられるいずれの副作用もが活性成分の有益な効果を損なわないように、活性成分の有効な活性を両立する濃度において、患者に、相対的に非毒性および安全である担体である。好ましくは、薬学的に許容し得る担体またはアジュバントは、抗原によって引き出される免疫応答を増強する。

好適な担体またはアジュバントは、典型的には、以下の包括的でないリスト：タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの、大型のゆっくりと代謝される高分子において包含される化合物の１つ以上を含む。本明細書で使用されるとき、用語「賦形剤」は、医薬組成物中に存在してもよく、および塩、バインダー（例えば、乳糖、デキストロース、ショ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝剤物質、安定剤、フレーバー剤または着色料など、活性成分ではないすべての物質を包含することを意図する。「希釈剤」、とりわけ「薬学的に許容し得るビヒクル」は、水、生理食塩水、生理学的な塩溶液、グリセロール、エタノール等々のビヒクルを包含する。湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存料などの補助物質は、かかるヒビクル中に包含されてもよい。

本発明のポリペプチド、およびキメラ分子、および任意に薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤は、当業者に一般的に知られているいずれのものなどをいずれの好適なルートによって投与され得る。治療のために、本発明の医薬組成物は、標準的な技法に従っていずれの患者にも投与され得る。投与は、経口的、非経口的、局所的、経鼻的、眼科的、髄腔内、脳室内、舌下、経直腸的、膣内包含する、任意の適切な様式によってであり得、好ましくは経口的である。ナノテクノロジーやエアロゾル、吸入剤としての製剤化のさらなる他の技術もまた、本発明の範囲内である。投与量および投与の頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物との併用投与、禁忌および臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに依存するだろう。担体、賦形剤および安定剤の投薬量および濃度は、対象（ヒト、ブタ、マウスおよび他の哺乳動物）に対して安全であるべきであり、ホスファート、シトラートおよび他の有機酸などの緩衝剤；ビタミンＣなどの抗酸化剤、小ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ＰＶＰなどの親水性ポリマー、アミノアセタート、グルタマート、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グリコース、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンなどの他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；Ｎａ＋などの対イオン、および／またはTWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）またはＰＥＧ等などの界面活性剤を包含する。

本発明のさらなる側面は、以下のステップ：
－好適な発現系または宿主細胞、とりわけPichia pastorisにおける、本明細書で提供されるとおりのポリペプチドまたはキメラ分子の発現、および
－該ＡＰＮ結合ポリペプチドの精製または単離
を含む、本発明のＡＰＮ結合ポリペプチドを生産する方法に関する。
該発現されたポリペプチドの精製または単離によってとは、実例として、限定することなく、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー精製、免疫沈降、タンパク質検出、免疫化学、表面ディスプレイ（surface-display）などのような親和性に基づく精製を意味し、すべては、当該技術分野において周知である。

本発明のさらに別の態様は、本発明に従うポリペプチド、キメラ分子、または核酸を含むキットに関する。キットは、緩衝剤、分子タグ、ベクターコンストラクト、参照試料材料、および好適な固体支持体、細胞、核酸等、などの試薬の組み合わせをさらに含んでもよい。かかるキットは、本明細書に記載のとおり本発明の本出願のいずれにも有用である。本発明の範囲内に網羅されるのはまた、本発明に従ってＡＰＮ結合ＩＳＶＤを含むポリペプチドを含む固体支持体または樹脂である。好適な固体支持体の非現定例は、ビーズ、カラム、スライド、チップまたはプレートを包含する。より具体的には、固体支持体は、粒子状（例として、一般に抽出カラムにおいて使用されるビーズまたは顆粒）であっても、または平坦、プリーツ状、または中空繊維または管であり得るシート形態（例として、膜もしくはフィルター、ガラスもしくはプラスチックスライド、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック、毛管充填装置もしくはかかる様なもの）においてであってもよい。固定化は、当該技術分野において知られている技法を使用する、非共有結合のまたは共有結合のいずれかであってもよい。

以下の例は、開示された主題に従って方法、組成物、および結果を例証するために、挙げられる。これらの例は、本明細書に開示の主題のすべての側面を包含することを意図せず、しかしむしろ代表的な方法、組成物、および結果を例証するためである。これらの例は、本発明の等価物およびバリエーションを除外することを意図せず、これは当業者に明らかである。

例
材料および方法
１．ベクター、株、および細胞株
ＶＨＨライブラリ調製のために、発現されたＶＨＨを細菌のペリプラズムにおいて分泌するためのｐｅｌＢシグナル配列を含有し、かつ精製を可能にするＨＡおよびＨｉｓ６タグをＶＨＨカルボキシ末端において追加する、ｐＭＥＣＳファージディスプレイベクターシステムを使用した。GoldenBraidクローニングのために改変された酵母発現ベクターｐＰＩＣＺαＨ６Ｅ（ＮＣＢＩ受託番号ＫＭ０３５４１９．１）（ｐＫａｉＧＧと命名された）を、ＶＨＨ－ＭＧ（ＭＧ：マウスＩｇＧのＦｃドメイン）融合物をメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下でクローニングするために、使用した。ベクターは、細菌および酵母細胞における選択のためにゼオシン耐性マーカーを含有する。大腸菌株のＴＧ１およびＤＨ５αを、夫々、ＶＨＨライブラリおよび融合発現ベクターの構築のために使用した。ＶＨＨ－ＭＧ融合物を、P. pastoris野生型株ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０（ＡＴＣＣ ７６２７３）で発現させた。安定なＡＰＮ発現細胞株（ブタ腸上皮細胞ＩＰＥＣ－Ｊ２およびベビーハムスター腎臓ＢＨＫ－２１）を、トランスフェクションにより得て、これまでに記載されるとおりにインキュベートした［３、４］。

２．腸のＡＰＮの精製
Lundqvist、Hammarstroem、AthlinおよびHammarstroem［２１］の方法にならって、３週齢のコブタの小腸から腸細胞を、単離した。光学顕微鏡を使用する分析の後、８５％を超える腸細胞の純度を観察した。次に、Melkebeek、Rasschaert、Bellot、Tilleman、Favoreel、Deforce、De Geest、GoddeerisおよびCox［３］によって記載されるとおり、腸細胞から刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）を単離した。得られたＢＢＭＶを、続いて、９倍体積の溶解緩衝液（１００ｍＭ トリス－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ ロイペプチン、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ）中で溶解し、氷上で２分間超音波処理し、４℃にて３０分間回転させ、４℃にて１５分間、１７，４００ｇにて遠心分離をした。上清を回収し、および１０ｋＤａＭＷＣＯ透析カセット（Thermo scientific）を使用しＰＢＳで透析を行った。タンパク質濃度を、製造業者の推奨にならって、ＢＣＡ反応（Pierce ＢＣＡタンパク質アッセイキット）によって決定した。ライセートを、さらなる使用まで、－２０℃にて保存した。

これらのライセートから腸のｐＡＰＮを、免疫沈降によって精製した。初めに、アフィニティ精製したウサギ抗ＡＰＮ ＩｇＧ（自社製）を、プロテインＡセファロースビーズ（ＣＬ－４Ｂ、Sigma)に架橋させた。このために、５０ｍｇのビーズを、１ｍｌの蒸留水において３回洗浄し、４００ｇにて２分間遠心分離によって塩を除去した。ウサギ抗ＡＰＮ ＩｇＧ（４ｍｇ）をＰＢＳ中、室温（ＲＴ）にて１時間、ビーズに添加した。次に、ビーズを１ｍｌの０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）によって２回洗浄し、その後、１ｍｌの０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）＋２０ｍＭ ジメチルピメリミダート（ＤＭＰ、Sigma）を、３０分間、室温にて添加した。架橋の後、ビーズを、１ｍｌの０．２Ｍ エタノールアミン＋５０ｍＭ アンモニウム重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１時間、２回洗浄した。次に、溶離緩衝液（０．２Ｍ グリシン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｌ－アルギニン、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．０））を添加する前に、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、非架橋のＩｇＧを除去した。ビーズをＰＢＳ中で再度３回洗浄し、さらなる使用まで４℃にて保存した。最終的に、抗ＡＰＮビーズを、１ｍｌのＢＢＭＶライセートとともに回転輪上で４℃にて、終夜インキュベートした。ビーズを、遠心分離し（４００ｇ、２分、４℃）、上清を回収した。ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。次に、ＡＰＮを、溶離緩衝液によって１０分間ＲＴにてビーズから溶出させた。遠心分離の後、上清を回収し、１Ｍ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）によって中和した。溶出したＡＰＮを、即時にＰＢＳ中で透析し、－２０℃にて保存した。濃度を、Pierce ＢＣＡタンパク質アッセイキットによって決定し、純度（＞９５％）を、銀染色（Pierce（登録商標）シルバーステインキット；Thermo Scientific）を製造業者の指示にならって実施することによって評価した。

３．ｐＡＰＮ特異的ＶＨＨライブラリの生成
ブタＡＰＮ特異的ＶＨＨは、ブリュッセル（ベルギー）のＶＩＢナノボディコア施設により、以前に記載されるとおり開発された［２２］。手短に言えば、２頭のラマを、０、７、１４、２１、および２８日目において、各回、ブタの腎臓から単離された３２０μｇ（動物あたり）ＡＰＮ（Sigma、カタログ番号Ｌ６００７－５０ＵＮ）によって、皮下的に免疫付与した。３５日目において、各ラマは、ブタの腸から単離された２００μｇのＡＰＮによって最終的なブースターを受けた。ブタ腸のＡＰＮを、上に記載のとおりに精製した。すべての免疫付与について、Gerbu P（GERBU Biotechnik）を、アジュバントとして使用した。４０日目において、リンパ球の調製のために抗凝固処理した血液を回収した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からの全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーによる一本鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。このｃＤＮＡを使用し、ＶＨＨをコードする配列を、ＰＣＲによって増幅し、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＥＣＳのＰｓｔＩとＮｏｔＩ部位にクローニングし、およびヒスチジンタグへこのようにして融合した。エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１細胞を、組換えｐＭＥＣＳベクターによって形質転換した。独立したＶＨＨライブラリを、各々のラマから得て、および各々を、安定的にトランスフェクトされたｐＡＰＮを発現するＢＨＫ－２１細胞において実行されるパンニング（溶液中）に供した。２つのライブラリからの最初のパニングラウンドのファージアウトプットをプールし、プールをさらなるパニングラウンドに使用した。２回目と３回目のパニングラウンドからランダムに選択された１９０個のコロニー（各ラウンドから９５個）を配列決定し、および次いでそれらのＣＤＲ３配列に基づきグループ化した。粗製のペリプラズム抽出物を使用し、２８個のユニークなＶＨＨ（Nanobody（登録商標））配列を、ｐＡＰＮを発現するＢＨＫ－２１細胞を使用しｐＡＰＮに対する特異性についてフローサイトメトリーによって分析した。

４．ＶＨＨ－ＭＧ融合発現ベクターの構築
酵母発現ベクターｐＫａｉＧＧにおいてin silicoで設計されたＶＨＨ－ＭＧ融合物をクローニングするために、挿入物とベクターとの間に４０塩基のオーバーラップとともに、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ尾部（Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３；ＮＣＢＩ受託番号ＫＣ２９５２４６．１）へ融合されたＶＨＨをコードする配列の合成的に生産されたＤＮＡフラグメントである、Gibson Assembly（登録商標）クローニングのために設計されたカスタマイズされた試薬を、SGI-DNA社（La Jolla, California）から得た。Golden Gateクローニングに適応している発現ベクターｐＫａｉＧＧを、ＳａｐＩによって消化し、カラム精製した（GeneJET PCR purification kit、ThermoFisherカタログ番号Ｋ０７０１）。ＶＨＨフラグメントを、同じＦｃフラグメントと常に組み立て、５’末端において、インフレームでα因子分泌シグナル配列（ｐＰＩＣＺＨ６Ｅと命名された新規のP. pastoris発現ベクターから；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＭ０３５４１９）とともに、３’末端において、転写終結配列とともに、BioXp（商標）3200システムを介して自社製のＳａｐＩ消化ｐＫａｉＧＧベクター内へおよそ１８時間の反応においてクローニングし、大腸菌ＤＨ５α内へ形質転換した。プラスミドの調製、および挿入物の配列の確認の際、酵母細胞を、ＰｍｅＩ線化ベクターによって形質転換し、陽性形質転換体を、５０ｍｇ／ｍｌ ゼオシン（Invitrogen）が補充されたＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）において選択した。

５．P. pastorisにおけるＶＨＨ－ＭＧ融合の産生
培地中でのＶＨＨ－ＭＧ融合物の発現および分泌を、２ｍｌの培養物で最初に分析した。１日目において、２５ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％Bacto 酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６）、１％グリセロール）を、個々の形質転換体に植え付け、２８℃にて４８時間、振盪させながらインキュベートした。各ＶＨＨ－ＭＧコンストラクトについて、４つの独立した形質転換体を２４ウェルプレートで増殖させた。細胞を、次いで１５００ｇにて１０分間ペレット化し、および２ｍｌのＢＭＭＹ培地（１％Bacto酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６）、１％メタノール）中に再懸濁し、ＶＨＨ－ＭＧの発現を誘導した。培養物を、２８℃にて４８時間、振盪させながらインキュベートし、および１２時間毎に１％メタノール（ｖ／ｖ）によってスパイクした。４８時間の誘導の後、酵母細胞をペレット化し、および上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで分析し、および分泌されたＶＨＨ－ＭＧ融合物の培地中の蓄積レベルを評価した。

６．ＶＨＨ－ＭＧ融合物のアフィニティ精製
高レベルのＶＨＨ－ＭＧを生産した酵母形質転換体を、２ｍｌの培養物について上に記載のとおり同様の増殖および誘導条件を使用し、１ｌの培養物におけるアップスケールのために選択した。バッフル付きフラスコで増殖させたP. pastoris培養物を、誘導の４８時間の後に採取した。培養物上清を、０．２２μＭ ＰＥＳ膜フィルター（Millipore）を使用してろ過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８によって平衡化された１ｍｌのHiTrap MabSelect SuReプロテインＡカラム（GE healthcare）において、アフィニティ精製した。結合したタンパク質を、１Ｍアルギニン、ｐＨ２．７で溶出し、および即時に１Ｍ トリス、ｐＨ９によって中和した。高濃度のＶＨＨ－ＭＧを含む該当する画分をプールし、およびサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200, GE Healthcare）に供した。クロマトグラム中の主要な抗体ピークを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中２０％ポリエチレングリコールに対して透析することによって濃縮し、および使用まで－８０℃にて保存した。タンパク質濃度を、ＯＤ２８０測定によって決定した。

７．ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
ＶＨＨ－ＭＧ融合物（粗製／精製）を、市販の４～２０％の勾配ゲル（Bio-Rad）において還元条件下で分析し、およびCoomassie G-250によって、製造者の指示にならって染色した。ウェスタンブロッティングのために、タンパク質を、セミドライ式転写法(Bio-Rad）を用いてポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ）上に転写した。ブロットされた膜を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）中２％脱脂乳によって、４℃にて終夜ブロッキングした。その後、ブロッキング液で１：２０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合された抗マウスＩｇＧ（GE healthcare, NXA931）によって膜をプローブし、ＲＴにて１時間インキュベートした。膜を、次いでＰＢＳＴによって３回洗浄し、およびＨＲＰ基質（WesternBright ECL, Advansta）を添加することによってバンドを可視化した。膜を、ChemiDoc MPイメージングシステム（Bio-Rad）を使用して画像化し、およびImageLabソフトウェア（Bio-Rad）によって分析した。

８．抗原結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc Polysorp（登録商標））を、ＰＢＳ中に希釈された４００ｎｇのＡＰＮ（Sigma）によって、３７℃にて２時間コーティングした。プレートを、次いでＰＢＳＴによって３回洗浄し、ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０中で調製した３％（ｗ／ｖ）ゼラチンによって、４℃にて終夜ブロッキングした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄に続いて、ＶＨＨ－ＭＧ融合物を、希釈緩衝液（２％脱脂乳＋ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で段階希釈し、各ウェルへ添加し、およびＲＴにて１時間インキュベートした。自社内で生産されたｐＡＰＮ特異的ｍＡｂ（ＩＭＭ０１３、［４］を参照）を陽性対照として使用し、一方マウスのＩｇＧ３（ＧＢＰ－ＭＧ）へ融合されたＧＦＰ特異的ＶＨＨを陰性対照として使用した［２３］。洗浄の後、結合したＶＨＨ－ＭＧ融合物を、希釈緩衝液において、１：５０００に希釈された抗マウスＩｇＧ（GE healthcare、NXA931）によって検出した。ＲＴでの１時間のインキュベーションに続いて、プレートを、ＰＢＳＴによって３回洗浄し、およびＨＲＰ基質（２０ｍｌ脱イオン水に溶解したSIGMAFAST（商標）OPDタブレット１つ）を添加することによって、現した。最終的に、１Ｍ 塩酸によって反応を停止し、および比色反応の光学密度を４９２ｎｍにおいて測定した（VersaMax（商標））。

９．フローサイトメトリー
種々のＶＨＨ－ＭＧ融合物のＡＰＮ発現細胞株への結合を、フローサイトメトリーを使用し、分析した。野生型およびＡＰＮをトランスフェクトしたＩＰＥＣ－Ｊ２およびＢＨＫ－２１細胞株を、９０％コンフルエンスに達するまで増殖させ、およびStemPro Accutase（Gibco）によって剥離した。剥離された細胞（３．０ｘ１０^５）を、円錐底９６ウェルマイクロタイタープレート（Gibco）の２００μｌの培養培地中へ移し、および３５０ｇおよび４℃にて３分間遠心分離した。細胞を、２μｇ／ｍｌのＶＨＨ－ＭＧ融合物または抗ＡＰＮ ｍＡｂ（クローンＩＭＭ０１３）とともに、氷上で３０分間インキュベートした。結合したＶＨＨ－ＭＧ融合物の検出を、ＩＭＭ０１３について、ＡＦ６４７抱合型抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（４μｇ／ｍｌ；Invitrogen，Ａ２１２４１）によって、およびＡＦ６４７抱合型抗マウスＩｇＧ１抗体（４μｇ／ｍｌ；Invitrogen，Ａ－２１２４０）によって実行した。細胞を、氷上で３０分間インキュベートした。死細胞を、Sytox blue染色（５ｎＭ；Molecular probes）を使用し、除外した。各条件について、合計１０，０００細胞の生存能力のある単一細胞を測定した（Cytoflex, Beckman Coulter）。

１０．ＶＨＨ－ＭＧエンドサイトーシスアッセイ
ＡＰＮを発現するＢＨＫ－２１細胞を、２４ウェルプレートにおいて、滅菌されたカバースリップの上部において播種し（１ｍｌ中、１．０ｘ１０^５細胞）、および単層が形成されるまで培養した。細胞を、氷冷のＰＢＳによって２回洗浄し、および氷冷の培養培地において、ＶＨＨ－ＭＧ融合物またはＩＭＭ０１３を細胞へ添加する（２５０μｌ；１００μｇ／ｍｌ）前に、氷上で保存した。４℃にて３０分または６０分のインキュベート後、細胞を、氷冷のＰＢＳによって３回洗浄し、および３７℃、５％ ＣＯ２、温かい培養培地において、３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄の後、細胞を、室温（ＲＴ）にて１０分間、５００μｌの４％パラホルムアルデヒドによって固定した。次に、細胞膜上のＶＨＨ－ＭＧまたはＩＭＭ０１３の存在を、ＲＴにて３０分間、ＡＦ５６８抱合型抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（２μｇ／ｍｌ；Invitrogen，Ａ－１１００４）によって検出し、および光から保護した。ＰＢＳ＋１％ＦＣＳによる３回洗浄の後、細胞を、２分間、２５０μｌの０．２％トリトン－Ｘ１００によって透過処理し、およびＰＢＳ＋１％ＦＣＳによって再度、洗浄した。ＶＨＨ－ＭＧとＩＭＭ０１３の両方を、次いでＦＩＴＣ抱合型抗マウスＩｇＧ（１／５０；全体分子）（Sigma，Ｆ２８８３）を使用し、ＲＴにて３０分間、検出し、光から保護した。核を、Hoechst（１／１００希釈）染色によって、可視化した。３回洗浄の後、カバースリップを取り出し、およびマウント液（退色防止剤である１，４－ジアゾビシクロ－２，２，２－オクタン－DABCO（商標））中、顕微鏡スライド上にマウントした。画像を、共焦点顕微鏡（Leica）によって撮影した。

１１．抗ＡＰＮ ＶＨＨ－ＭＧのin vivoにおける取り込み
雌性、５週齢のコブタ３頭を使用し、これまでに記載されたとおり［２４］、消化管の結紮ループにおけるＶＨＨ－ＭＧの取り込みを評価した。手短に言えば、麻酔および開腹の後、空腸の位置をつきとめ、パイエル板を避けて各ループ間において１０ｃｍ間隔で６つの３ｃｍのループを作成した。血液供給は、結紮糸を腸間膜アーケードの間に配置することで確保した。ｐＡＰＮ特異的ｍＡｂ（ＩＭＭ０１３、［４］を参照）を陽性対照として使用し、一方ＧＢＰ－ＭＧを陰性対照として使用した［２４］。抗ＡＰＮｍＡｂ ＩＭＭ０１３（１ｍｇ）または等モル量の異なるＶＨＨ－ＭＧを、３ｍｌのＰＢＳ中に希釈し、およびループの内腔中に注入した。注入の際、各ループを腹腔へ戻し、および腹腔を閉じた。５時間のインキュベート後、動物をペントバルビタールナトリウムの過量投与によって安楽死させ、および腸、ループおよび腸間膜リンパ節から組織試料を回収した。組織試料を、２％Methocel（登録商標）MC（Fluka）中に包埋し、液体窒素中で急速凍結し、および使用まで－８０℃にて保存した。すべての動物手順は、ゲント大学獣医学部の倫理委員会によって承認された（EC 2018-04）。

１２．免疫組織化学
３週齢のコブタからまたは消化管ループから得られたブタの回腸の凍結切片（８μｍ）を、Leica CM3050 Sクライオスタットによって切断し、ＡＰＥＳコーティングされたスライドグラス上にマウントし、乾燥し（３０分、４０℃）、およびアセトン中で１０分間、－２０℃にて固定した。続いて、凍結切片を、塩化アンモニウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中で３０分間インキュベートし、および徹底的に洗浄した。すべての洗浄ステップを、ＲＴにて、ＰＢＳ中で行った。Ｆｃ受容体を、１０％ヒツジまたはヤギ血清を含有するＰＢＳによって、３７℃にて３０分間ブロッキングした。ＶＨＨ－ＭＧまたはＩＭＭ０１３の結合を、ＦＩＴＣ抱合型ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma；Ｆ２８８３）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａによって３７℃にて１時間のインキュベートによって検出した。核を、Hoechst（１０μｇ／ｍｌ）によって対比染色した。エンドサイトーシスを評価するために、切片を、ウサギ抗汎サイトケラチン抗体（Abcam，ａｂ９３７７）によって染色し、およびＴｅｘａｓＲｅｄ抱合型抗ウサギＩｇＧによって検出した。切片を、超純水中で洗浄し、およびマウント液（DABCO）中にマウントした。組織を、Scion Corporationのカメラを搭載したLeica DC 100蛍光顕微鏡、またはLeica共焦点顕微鏡によって画像化した。画像を、Fijiを使用し、分析および処理した。

１３．経口免疫付与実験
すべての動物手順は、獣医学部倫理委員会の承認を得た（EC2018-51）。ベルギーの農場から、従来的に飼育された１２頭のコブタ（ベルギーランドレース×ピエトレイン）を、３週齢で離乳させ、および自分たちの施設へ輸送した。動物を、実験の開始の前に５日間硫酸コリスチン（Promycine（登録商標）,１００．０００Ｕ．Ｉ．／動物体重１ｋｇ）によって処置した。経口免疫付与実験の設計を、図６において描写する。動物を、ランダムに３つの群：マウスＩｇＧ２ａ対照群、およびＡＰＮ特異的ＶＨＨ－ＭＧ ２Ｌ６５または３Ｌ９４のいずれかを受ける２つの群に分けた。動物を、３日連続的に経口的に免疫付与し、これに続き、一次免疫付与後１４日目においてブースター免疫付与した。各免疫付与の２４時間前にオメプラゾール（２０ｍｇ／動物）を投与し、胃におけるＨＣｌ産生をブロックし、および動物は、免疫付与の１２時間前に、飼料を枯渇された。動物を、等量の５０μｇのコレラ毒素（Merck，参照：Ｃ８０５２）によってアジュバントした、１ｍｇの３Ｌ９４－ＭＧ、２Ｌ６５－ＭＧ、または等モル量の無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Bio X cell；USA, West Lebanon）のいずれかによって、経口的に免疫付与した。一次免疫付与後（ｐｐｉ）、０、９、１４、２１、２８日目に血液を回収し、引き出された免疫応答を分析した。ｐｐｉ２８日目において、ペントバルビタールナトリウム２０％（６０ｍｇ／２．５ｋｇ；Kela）の静脈内注射によって動物を安楽死させ、および失血のうえ、小腸組織試料を回収した。

１４．マウスＩｇＧ２ａ ＥＬＩＳＡ
頸静脈から血液を、ゲルおよび凝固促進剤入りチューブ（Vacutest, Kima）へ、採取した。室温にて１時間のインキュベート後、チューブを遠心分離し、血清を回収し、５６℃にて３０分間不活性化した。血清試料を、使用まで－２０℃にて保存した。
自社内生産されたマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を、９６ウェルマイクロタイタープレート（ポリソープ；Life Technologies）においてＰＢＳ中６μｇ／ｍｌので、３７℃、２時間、コーティングした。０．２％Ｔｗｅｅｎ８０および３％ＢＳＡで補充されたＰＢＳ中で終夜ブロッキングのうえ、希釈した血清試料（希釈緩衝液において開始希釈１：１０）を、ウェルへ添加した。３７℃にて１時間インキュベートのうえ、プレートを洗浄し、ＨＲＰ抱合型マウス抗ブタＩｇＧ（ＭＴ４２４、１／１０００； MabTech, Nacka Strand, Sweden）またはＨＲＰ抱合型ヤギ抗ブタＩｇＡ（１／１０．０００；Bethyl；Montgomery, Texas, U.S）とともに３７℃にて１時間インキュベートした。３回の洗浄ステップに続いて、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質を添加し、および光学密度を３７℃にて４５分のインキュベートの後、分光光度計（Tecan SpectraFluor）を使用し、４０５ｎｍにおいて光学密度を測定した。

1５．ＥＬＩｓｐｏｔ
血液を、コブタの頸静脈からヘパリン上に採取し、およびＰＢＭＣを、Lymphoprep（登録商標）（Alere Technologies, Oslo, Norway）を使用し、密度勾配遠心分離によって単離した。赤血球を、塩化アンモニウム溶液中に溶解した。その結果得られたＰＢＭＣ画分を、氷冷のＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中で２回洗浄し、１％ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびカナマイシンで補充されたＣＴＬ－テストＢＴＭ（Cellular Technology Limited, Cleveland, USA）で、１ｘ１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。単核細胞（ＭＣ）を、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、空腸パイエル板（ＪＰＰ）、空腸固有層（ＪＬＰ）、回腸パイエル板（ＩＰＰ）、および回腸固有層（ＩＬＰ）から単離し、およびこれまでに記載したとおりに［２５］処理した。単離されたＭＣを、白血球培地（１０％子牛胎児血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ ｌ－グルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、および非必須アミノ酸（１％）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（Gibco））中に再懸濁し、計数した。

マルチスクリーンフィルタープレート（９６ウェルフォーマット、ＭＡＩＰＡ４５１０、Millipore）を、７０％エタノールによって活性化し、超純水で洗浄し、１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ２ａによって、４℃にて終夜、コーティングした。洗浄のうえ、プレートを、ＣＴＬ－テストＢ培地において、３７℃にて２時間、インキュベートした。各組織からの単核細胞（２．５ｘ１０５／ウェル）を、ウェルへ添加し、および加湿された５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて１８時間、インキュベートした。細胞を、次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによって集中的に洗浄することによって、除去した。洗浄のうえ、ＨＲＰ抱合型抗ブタＩｇＧ（ＭＴ４２４、１／１０００；MabTech）またはＩｇＡ（１／１０．０００；Bethyl laboratories）を、アッセイ緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中に添加し、室温にて１時間、インキュベートした。最終的に、膜に対する、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Sigma）を、３回洗浄ステップの後、ウェルに添加した。反応を、ＵＰ水によって集中的に洗浄することによって停止し、およびプレートを、４℃にて終夜乾燥させた。画像を、イムノスポットリーダー（Luminoskan）を使用して撮影した。スポットを、サイズ識別に基づき手動で計数した。

1６．競合アッセイ
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーベースの競合アッセイを、ＶＨＨがＡＰＮ上の同様のエピトープを認識するかどうかを決定するために使用する。ＡＰＮがトランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞株を、９０％コンフルエンスに達するまで増殖させ、およびStemPro Accutase（Gibco）によって剥離した。剥離した細胞（３．０ｘ１０^５）を、２００μｌの培養培地中で円錐底９６ウェルマイクロタイタープレート（Gibco）に移し、および３５０ｇ、４℃で３分間遠心分離した。次に、ＢＨＫ－ＡＰＮ細胞を、最初に２Ｌ６５、３Ｌ２、３Ｌ７３ ＶＨＨ－ＭＧまたは４０ｕｇ／ｍｌの陰性対照とともに氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡによる洗浄のうえ、細胞を、２ｕｇ／ｍｌにおいて第２の標識がされた２Ｌ６５、３Ｌ２、３Ｌ７３ＶＨＨ－ＭＧ（AlexaFluor405マウスＩｇＧ２ａゼノンラベリングキット）とともに、３０分間氷上でインキュベートした。ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡによる洗浄のうえ、細胞を、フローサイトメーター（Cytoflex, Beckman Coulter）によって分析した。死細胞を、ヨウ化プロピジウム染色を使用し除外した。合計１０，０００細胞の生細胞、単一細胞を、各条件について測定した（Cytoflex, Beckman Coulter）。

バイオレイヤー干渉
エピトープビニング測定を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ；Octet RED96）を使用し、常温にて実行する。ここで、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌビオチン化ブタＡＰＮ（Sigma）を、ＰＢＳ中に浸漬された高精度ストレプトアビジン（ＳＡＸ）バイオセンサ上に結合させ、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＴ＋ＢＳＡ）中、５００ｎＭにおけるＶＨＨの添加がこれに続く。次に、２Ｌ６５ＶＨＨを、ＰＢＳＴ＋ＢＳＡ中、２５０ｎＭにおいて添加する。データを、ハイスループットなエピトープビニングソフトウェアによって分析する。

ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc Polysorp（登録商標））を、ＰＢＳで希釈された４００ｎｇのＡＰＮ（Sigma）によって３７℃にて２時間コーティングする。プレートを、次いで、ＰＢＳＴによって３回洗浄し、ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０中に調製された３％（ｗ／ｖ）ゼラチンによって４℃にて終夜ブロッキングする。ＰＢＳＴによる３回洗浄の後、ＶＨＨ－ＭＧ融合物を、希釈緩衝液（２％脱脂乳＋ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）中の飽和濃度において各ウェルに添加し、および１時間、ＲＴにてインキュベートする。洗浄の後、ビオチン化された２Ｌ６５ＶＨＨを、希釈緩衝液中１０ｕｇ／ｍｌにて各ウェルに添加し、および１時間、ＲＴにてインキュベートした。結合したビオチン化２Ｌ６５ ＶＨＨを、希釈用緩衝液で１：５０００に希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰ（ThermoFisher scientific）によって、検出する。ＲＴにて１時間のインキュベートに続いて、プレートを、ＰＢＳＴによって３回洗浄し、およびＨＲＰ基質（２０ｍｌの脱イオン水に溶解された１つのSIGMAFAST（商標）OPDタブレット）を添加することによって、現す。最終的に、反応を１Ｍ塩酸によって停止し、および比色反応の光学密度を４９２ｎｍにおいて、測定する（VersaMax（商標））。

１７．統計分析
データを、GraphPad Prism 6を使用し分析した。血清抗体レベルおよび循環する抗原特異抗体分泌細胞の数を、２元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのDunnettの検定によって分析した。腸抗原特異抗体分泌細胞の数を、多重比較のためにｔ検定およびHolm-Sidakによって分析した。有意水準を、０．０５において設定した。

結果
１．ＡＰＮ特異的ＶＨＨライブラリの構築
抗ＡＰＮＶＨＨライブラリを調製するために、２頭のラマを、市販の腎臓ｐＡＰＮによって、５回免疫付与した。６回目のブースターを、材料および方法の節において記載されたとおりの、同じ遺伝子によってコードされおよび手順によって調製された腸ｐＡＰＮによって与えた。２つの独立したＶＨＨファージディスプレイライブラリを、構築し、各々は約１０^８つの形質転換体からなる。ブタアミノペプチダーゼＮを発現する安定的にトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞において実行したパニングの２回の連続ラウンドの後、１９０つのクローンを、ランダムに選択し、および配列決定した。比較アラインメントを通して、それらのＣＤＲ３領域において８０％超のパーセント配列相同性を有するＶＨＨ（Ｂ細胞系）を、同じエピトープを認識する可能性が最も高いが（［２６］を参照）、しかしそれらの特徴（例として、親和性、発現量、安定性等々）は異なり得るため、１つのファミリーとしてグループ化した。このように、私たちは、１４つの異なるファミリーに所属する２８つのユニークなＶＨＨを、ＡＰＮへのバインダーの候補として得た（図４）。これらの２８つのユニークなＶＨＨを、大腸菌細胞において生産し、および粗製の周辺質抽出物を、それらの結合特異性について、ｐＡＰＮを発現するＢＨＫ２１細胞におけるフローサイトメトリーを介して、分析した。親の非トランスフェクトのＢＨＫ－２１細胞は、陰性対照細胞としての役を担った。無関係なＶＨＨ（Conrathらにより記載される細菌β－ラクタマーゼに特異的なＢＣＩＩ１０［２７］）およびマウス抗ＡＰＮ ｍＡｂ ＩＭＭ０１３［４］を、夫々陰性対照および陽性対照として使用した。このＦＡＣＳ解析は、本来の２８つのスクリーニングされた種々のＶＨＨの２２つがブタＡＰＮに特異的な１１つの種々のファミリーに所属することを確認し、ｐＡＰＮ－トランスフェクトされた細胞におけるライブラリのパニングがＡＰＮ結合ＶＨＨクローンについて高度に豊富にすることを、実証した（図４）。

２．BioXP ＤＮＡプリンターを介するＶＨＨ－ＭＧ発現ベクターの構築
ＡＰＮ－トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞におけるパンニングについてのＦＡＣＳ解析を粗製の周辺質抽出物によって実行したため、種々のＶＨＨの間の比較を許容し、およびＦＡＣＳ解析におけるナノボディの発現、周辺質抽出効率、等々などの実験的な変数を排除するために、種々のＶＨＨの結合の品質を、精製タンパク質によってさらに分析しなければならなかった（図４）。Ｃ末端ヒスチジンタグをもつＶＨＨライブラリをアンバーストップコドン（ＴＡＧ）をグルタミン（Ｑ）として読むサプレッサー大腸菌ＴＧ１株において調製したため、いくつかのＶＨＨがＶＨＨ配列内にアンバーストップコドンを含有してもよいことを、はっきり理解することが重要である。よって、アンバーコドンが配列決定によって同定されたとき、それもまた、グルタミンコドンに置き換えられていた。

古典的に選択されるＶＨＨは、非サプレッサー大腸菌株における親和性タグとの直接融合においてサブクローンをつくられるが、しかしここで私たちは新しいストラテジーにならった。私たちは、ＶＨＨをＦｃフラグメントとの直接融においてサブクローンをつくり、その融合物をPichia pastorisの培地において生産させ、以下の利点：Ｆｃを、タンパク質精製のための親和性タグとして使用し得、それはＶＨＨ－Ｆｃ融合物を二価にして結合活性効果を提供し、およびそれは陽性対照としてのＡＰＮへの結合についてマウスモノクローナル抗体ＩＭＭ０１３との比較を許容することを提供した。２８つの選択されたＶＨＨを、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインに融合し、および自社製のP. pastoris発現ベクター内へクローンをつくった。夫々、腸管毒素原性大腸菌のＦ４およびＦ１８線毛に特異的な２つの無関係なＶＨＨ、Ｖ２［２８］およびＤ３［２９］を、陰性対照として包含した。

ＶＨＨおよびＦｃドメインの配列を、BioXP（商標）３２００システムで合成し、および酵母発現ベクターへ形質転換した（図１ａ）。BioXP ＤＮＡプリンターによってうまく構築されたすべての３０コンストラクト（選択される２８つのＶＨＨおよび２つの陰性対照とともに）を、大腸菌へ形質転換し、およびコンストラクト毎に４つのコロニーを、コロニーＰＣＲまたは制限消化、続いて配列決定することによって分析し、正しい挿入物をもつクローンを同定した。３０コンストラクトのうち２３（７７％）は、１つのコロニーのみを配列決定することによって、エラーのないクローンを結果として生じ、一方ＶＨＨ－ＭＧの７つのコンストラクトについて、２つのコロニーは、正しいクローンを得るために分析しなければならず；１つのみのクローン、すなわち２Ｌ５８ＭＧ（３％）について、配列は、すべての４つのコロニーにおいて配列が不正確であり、コード配列において１つの突然変異を有する（図１ｂ）。偶然にも、ファミリー１２からのこの不正確なクローンはまた、ＶＨＨライブラリ調製の間のパンニングにおいても陰性であった（図４）。したがって、私たちは、それをさらなる分析から抜いた。

３．酵母産生されるＶＨＨ－ＭＧ融合物は、完全長の表面に発現されたＡＰＮへ効率的に結合する
次に、２９つの得られたＶＨＨ－ＭＧをコードするコンストラクトを、次いでPichia pastorisへ形質転換し、および各コンストラクトについて、４つの個々の酵母コロニーを、スクリーニングし、培養培地中に蓄積するＶＨＨ－ＭＧの最も高い量を生産する形質転換体を同定した。したがって、上清の等量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによっておよびウェスタンブロッティングによって分析し、組換えタンパク質のシグナルの強度およびタンパク質の完全性を、調査した（図５）。最もよく発現するコンストラクトについてのみ、バンドを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後に観察し得；しかしほとんどのコンストラクトについて、バンドは、ウェスタンブロット分析の後に期待される分子量において明確に存在した。P. pastorisにおいて生産された種々のＶＨＨ－ＭＧの濃度を、精製されたＶ２－ＭＧおよびＤ３－ＭＧの参照タンパク質を使用し、決定し、およびこれは、ImageLabソフトウェアによる分析に基づき、２ｍｌの培養物中に４から６０ｍｇ／ｌまでの範囲であった。３Ｌ１１ＭＧ（ファミリー１０）、２Ｌ２２ＭＧ（ファミリー５）およびＶ２－ＭＧなどのいくつかの融合物についてのみ、分解生成物を完全長生成物の他にも検出し、ＶＨＨ－ＩｇＡ融合物についてもまた見られたように、ＶＨＨがＶＨＨ－ＭＧ融合物の安定性において効果を有することを示唆した［３０］。

次に、私たちは、腎臓のＡＰＮに特異的なＥＬＩＳＡにおいて、ＶＨＨ－ＭＧ融合物の結合特異性を決定した（図２ａ）。培養物上清中のＶＨＨ－ＭＧの３倍希釈系列を、抗マウスＩｇＧによってプローブした。最も強い３つのＶＨＨ－ＭＧ、すなわち２Ｌ４８ＭＧ、３Ｌ９４ＭＧおよび２Ｌ７６ＭＧは、固定化ＡＰＮへ強い結合活性をディスプレイし、それぞれ異なるＣＤＲ３グループに所属する。これら３つのＶＨＨ－ＭＧはまた、ファージディスプレイされたＶＨＨについてスクリーニングするためのパンニングの後に実行されたＦＡＣＳアッセイにおいても、良好な結合を示した（図４）。興味深いことにしかしながら、ＶＨＨ－ＭＧ融合物のいくつかのファミリー、実例としてファミリー４（２Ｌ６３－ＭＧ、２Ｌ６９－ＭＧ）は、ＥＬＩＳＡでは完全に陰性であった一方、それらは、ＦＡＣＳアッセイにおいて強いバインダーであった（図４）。よって、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＡＰＮコーティングされたウェル上の相対的な結合活性が、細胞に発現されるＡＰＮに対するＶＨＨ－ＭＧ融合物の親和性と相関しなかったことを注記することが重要である。注目すべきことに、ＶＨＨスクリーニングをそれらの表面上にＡＰＮを発現している細胞を使用するＦＡＣＳを介して実行したが、そのため固定されたＡＰＮにおける結合は、おそらく固定化の間エピトープへのアクセス可能性がより低くなるため、細胞への結合から異なるかもしれないことである。また、実験をＶＨＨ－ＭＧタンパク質の集積が平衡化されていない粗製の培地試料によって実行したため、ＥＬＩＳＡシグナルは、親和性にではなく、むしろ培養培地中のタンパク質濃度と関し得るだろう（図２ａ、図４）。

ＶＨＨ－ＭＧ融合物を、親細胞株対それに由来するトランスフェクトされたＡＰＮを発現する細胞株（ＢＨＫ２１とＩＰＥＣ－Ｊ２）における結合特異性および親和性について、等量のＶＨＨ－ＭＧタンパク質によるフローサイトメトリーを介して、さらに評価した（図２ｂ）。注記であるのは、ＩＰＥＣ－Ｊ２は、その表面上に低レベルのＡＰＮを発現するブタ小腸上皮細胞株であり、およびゆえに、安定的にトランスフェクトされた細胞のみを使用した。ウェスタンブロッティングによって決定されたとおりの相対的なＶＨＨ－ＭＧ濃度に基づき、等モル量のＶＨＨ－ＭＧタンパク質および陽性対照（ＩＭＭ０１３）をP. pastorisの使用済みの培地にスパイクした。いくつかの強いＡＰＮバインダーを、フローサイトメトリーを通して、ＶＨＨ－ＭＧを結合した細胞数に基づき、同定したが、反して非トランスフェクトのＢＨＫ２１／ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞の使用済み培地の結合は全く観察されなかった。興味深いことに、ＡＰＮ特異的ＥＬＩＳＡでは陰性であったファミリー４（２Ｌ６３と２Ｌ６９）は、細胞ベースの結合アッセイでは強い結合体を含むものとなった（図２ｂ、図７）。これらの知見は、ＶＨＨライブラリスクリーニングの間に粗製周辺質抽出物から得られたＦＡＣＳデータと一致した（図４）。私たちは、ＩＰＥＣ－Ｊ２－ＡＰＮ細胞における結合活性の振幅がＢＨＫ２１－ＡＰＮと比較して有意により低いことを見出し、それはＩＰＥＣ－Ｊ２細胞膜上に発現されるＡＰＮの量に関するかもしれない。

私たちは、フローサイトメトリースクリーニングにおいて結合活性を示すファミリーから少なくとも１つのクローンを選択し（ファミリー６、１０、１１および１４を除外：ファミリー６、１１および１４はＡＰＮ結合ＶＨＨを含有せず；ファミリー１０（３Ｌ１１）は分解および低い結合強度のみをディスプレイした）、免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して小腸組織に対するそれらの親和性をさらに評価した。それらの結合活性に基づき、いくつかのクローンを選択し、およびin vivo分析のために精製した。２Ｌ７６－ＭＧ、２Ｌ３４－ＭＧ、および２Ｌ５２などの低い収率をもつクローンを、さらなる解析から抜いた。したがって、強いバインダー（１、４、８、９；約１０００００ＭＦＩ）および中程度のバインダー（５、１２；２０００００ＭＦＩより大きい）を含有する６つのファミリーのみが、アップスケールのために選択されたことを示されている。各ＶＨＨ－ＭＧは腸回腸への結合をディスプレイしたが、反してすべての対照は、陰性でありおよびバックグラウンドを示さず；そのうえ、シグナルの強度は、ＦＡＣＳ解析における結合活性と相関した（図２ｂ）。

４．精製されたＡＰＮ結合ＶＨＨ－ＭＧ融合物は腸管上皮細胞によって内在化される
各ファミリーについて、使用済みPichia培地中で、高い発現と分泌をディスプレイしおよびＦＡＣＳで強い結合を示した単一のＶＨＨ－ＭＧ融合物を、アップスケールするために選択した。分泌されたＶＨＨ－ＭＧ融合物を、プロテインＡにおいて親和性精製し、およびさらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した（図３ａ）。ほとんどの融合物について、ＳＥＣプロファイルは、２つの主要なピークを示し、１つは凝集体と多量体を表し、および１つは２つの関連されるＶＨＨ－ＭＧポリペプチドの対応する分子量のモノマーを表した。２Ｌ７６のＶＨＨ－ＭＧの主要分割部分を、凝集体で見出し；したがって私たちは、それをさらなる分析から除外した（データは示されない）。

残存する６つの融合物について、モノマーのＶＨＨ－ＭＧに対応する画分をプールし、およびさらに還元条件および非還元条件の両方の下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ダイマー化を検証した。ＳＥＣプロファイルのモノマーおよび凝集体についてのピークは、わずかに重なるため、プールされた精製ＶＨＨ－ＭＧは、それでもまだ小さい分量の凝集体を含有する。非還元ゲルにおける試料は、８０ｋＤａのバンドをきれいに示し（図３ｂ）、還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて見られたとおり、それは４０ｋＤａのＶＨＨ－ＭＧポリペプチド２つから構成されるモノマーのＶＨＨ－ＭＧに対応する。その上、凝集体あるいはグリカンバリアントを表す可能性の最も高いいくつかの高分子量のバンドを、観察した。

次に、私たちは、精製された種々のＶＨＨ－ＭＧ融合物の結合の特徴を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにおいて試験した（夫々、図５ａ、５ｂ）。マウスＩｇＧ３（ＧＢＰ－ＭＧ）へ融合されたＧＦＰ特異的ＶＨＨを、陰性対照として使用した［２３］。６つの選択された融合物はいずれもＡＰＮ発現細胞に、強い結合を示したものの、ＥＬＩＳＡにおける固定された抗原における結合効率は、粗製の試料によって観察されたとおり、大きく変動した（図４）。

可能性のあるワクチン運搬システムの標的の細胞集団による、効率的なエンドサイトーシスは、強力な免疫反応を得るために高く重要であるため、私たちは、ＡＰＮ結合ＶＨＨ－ＭＧ融合物はＡＰＮ受容体を介する細胞よる特異的な取り込みを示すかどうかを、さらに調査した。私たちは、ＦＡＣＳにおいてＶＨＨ－ＭＧのそれらの強い結合性質のためにＡＰＮを発現するＢＨＫ２１細胞を、使用した（図５ｂ）。ＶＨＨ－ＭＧタンパク質を、膜関連ＶＨＨ－ＭＧおよびＡＰＮ受容体を介して内在化されたＶＨＨ－ＭＧを識別するために、異なる蛍光分子によって染色した。ＶＨＨ－ＭＧ融合物の無関係な取り込みを観察することができなかったため、共焦点画像解析は、ＡＰＮ依存性のＶＨＨ－ＭＧ融合物の取り込みを、明確に実証した。３つのＶＨＨ－ＭＧ融合物（３Ｌ９４－ＭＧ、２Ｌ６５－ＭＧ、および２Ｌ４８－ＭＧ）は、最も強力なＡＰＮバインダーであることが見出され、およびこれらは、ＡＰＮを発現する細胞においてのみ明確な取り込みシグナルをディスプレイした。
図１１に示されるとおり、３Ｌ２および３Ｌ７３ＶＨＨは、２Ｌ６５ＶＨＨと同様に内在化の引き金を引くことが、エンドサイトーシスアッセイによって、さらにまた確認された。

５．消化管の結紮ループアッセイにおける選択されたＡＰＮ特異的ＶＨＨ－Ｆｃ候補のin vivoでの挙動
選択されたＶＨＨ－Ｆｃ ＩｇＧコンストラクトのin vivoでの挙動を評価するために、私たちは、コブタの小腸（空腸）における消化管の結紮ループアッセイを実行した。３Ｌ９４－ＭＧおよび２Ｌ６５－ＭＧは、絨毛の頂膜上皮全体へ結合することができた。対照的に、２Ｌ４８および２Ｌ２２は、よりパッチ的な結合プロファイルを、示した。種々の動物において結合プロファイルが同様であることが見られた。加えて、３Ｌ９４－ＭＧと２Ｌ６５－ＭＧは、ＩＭＭ０１３のように同様の方針において腸細胞によって、エンドサイトーシスされる。消化管の結紮ループアッセイにおけるこのin vivoでの挙動に基づき、私たちは、３Ｌ９４－ＭＧおよび２Ｌ６５－ＭＧが小上皮へ抗原を標的化するために、最も好適な候補であることを結論づけた。これらの単一ドメイン抗体のＣＤＲ１－３領域を特徴づけることを、表３に与える。
表３

６．ＡＰＮ特異的ＶＨＨ－Ｆｃによる経口免疫付与は、循環系および小腸免疫応答を引き出す
選択されたＶＨＨ－ＭＧのワクチン送達システムとしての潜在性をさらに実証するために、コブタにおける経口免疫付与の実験を、実行し、および続いて起こる全身性および小腸免疫応答を、夫々、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩｓｐｏｔを介するマウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的血清抗体応答および抗体分泌細胞の検出を通して見積もった。図６ｂは、２Ｌ６５－ＭＧの経口投与のうえ、マウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの血清レベルが対照群と比較して有意に増大したことを、示す。驚くべきことに、３Ｌ９４は、マウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的血清抗体応答を促進しなかった。加えて、２Ｌ６５－ＭＧによる経口免疫付与は、一次免疫付与の後、２１日目におけるの循環するマウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的ＩｇＡを分泌する細胞の量を、０日目および対照群と比較して有意に増大した（図６ｃ）。これらの結果は、ＡＰＮ特異的ＶＨＨ－ＭＧは、コブタへの経口投与のうえで全身性免疫を促進することを示す。腸管免疫反応もまた増強されたことをさらに示すために、私たちは、種々の小腸組織におけるマウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的抗体分泌細胞の存在を、ＥＬＩｓｐｏｔを介して見積もった。図６ｄに示されるとおり、２Ｌ６５－ＭＧのみは、２８ｄｐｐｉにおいて、腸間膜リンパ節および回腸の粘膜固有層およびパイエル板におけるマウスＦｃ ＩｇＧ２ａ特異的ＩｇＡを分泌する細胞の数を、有意に増強した。まとめると、これらの結果は、２Ｌ６５－ＭＧの経口投与は、コブタにおいて全身性および小腸免疫応答の引き金を引くことを示す。

７．競合アッセイ
このフローサイトメトリーに基づく競合アッセイを、ＶＨＨはＡＰＮ上の同様のエピトープを認識するかどうかを決定するために使用した。表４に示されるとおり、各ＶＨＨは、他のＶＨＨのＢＨＫ－ＡＰＮ細胞への結合をブロックし、これらのＶＨＨ酷似するエピトープに結合する、競合するＶＨＨであることを指し示す。
表４：フローサイトメトリーベースの競合アッセイ。データは、対照値の引き算のうえの蛍光強度中央値として、表現される。

結論として、本発明は、高い配列類似性（２Ｌ６５、３Ｌ２、３Ｌ７３）を有し、およびＡＰＮを発現する細胞に結合するのみでなく、しかしまた小腸上皮を通した輸送の引き金を引くＶＨＨのファミリーを、提供する。該ＶＨＨファミリーは、その上、経口投与後、全身性および腸ＩｇＡ応答を誘発することができ、およびとりわけ抗原特異的ＩｇＡ＋Ｂ細胞を誘発することができるというユニークな特徴を有する。

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Claims (15)

1. 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、ここで該ＩＳＶＤが、特異的にＣＤ１３に結合し、および３つの相補性決定領域（夫々ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、ここで、
   （ｉ）ＣＤＲ１が、配列番号１、および配列番号１の位置４、６および／または７にてアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列からなる群から選出され；
   （ｉｉ）ＣＤＲ２が、配列番号３であり；および
   （ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、配列番号４、および配列番号４の位置６、１０および／または１２にてアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列からなる群から選出される、前記ポリペプチド。
2. （ｉ）ＣＤＲ１が、配列番号１または２から選出され；
   （ｉｉ）ＣＤＲ２が、配列番号３であり；および
   （ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、配列番号４または５から選出される、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ＩＳＶＤが、以下：
   －ＣＤＲ１が、配列番号１であり、ＣＤＲ２が、配列番号３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号４であるか；または
   －ＣＤＲ１が、配列番号２であり、ＣＤＲ２が、配列番号３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５である、
   から選出されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. ポリペプチドが、配列番号６、または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. ポリペプチドが、以下：
   配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、および化合物、とりわけ生理活性化合物、よりとりわけ抗原を含む、キメラ分子。
8. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のキメラ分子、請求項８に記載の核酸、または請求項９に記載の宿主細胞、および薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤を含む、医薬組成物。
11. 医薬として使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のキメラ分子、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の宿主細胞または請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 粘膜ワクチン接種における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のキメラ分子、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 腸の疾患、とりわけ消化管または腸の感染症または炎症を処置すること、または予防することにおける使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のキメラ分子、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
14. －Pichia pastoris発現系において請求項８に記載の核酸を導入するステップ、および
    －発現されたポリペプチドを精製するステップ、
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法。
15. フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴によって決定されるとおり、配列番号６、配列番号７または配列番号８の配列を含むポリペプチドと、ＣＤ１３に結合するために競合する、ポリペプチド。

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