CN111936514A - 多价抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多价抗体，其包括：包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及至少一个附加的结合结构域，其中该碱性抗体部分通过接头连接至该至少一个附加的结合结构域，其中该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且其中该接头包括铰链序列或衍生自铰链序列的序列。本发明还涉及一种多价抗体，其包括：包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及至少一个附加的结合结构域，其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区并且通过所述接头连接至所述碱性抗体部分，所述接头连接所述碱性抗体部分的可变区与所述CH1区，并且其中该多价抗体结合至至少三个不同的表位。
Description
技术领域
本发明涉及具有3个或更多个结合结构域(binding domains)的多价抗体(multivalent antibodies)以及一种用于制造所述多价抗体的方法。本发明进一步涉及所述多价抗体的组成多肽(constituent polypeptides)以及有关于可被用来连接该多价抗体的一个或多个结合结构域的接头(linkers)。本发明另外涉及编码(encode)所述多价抗体、接头的核酸(nucleic acids)以及有关于包括所述核酸的媒介物(vectors)，此外有关于生成所述多价抗体的宿主细胞(host cells)。本发明还涉及多价抗体，它们能够马上同时地结合3种抗原(antigens)或靶标(targets)，包括存在于癌细胞(cancer cells)上的目标抗原(target antigens)或者接合(engage)免疫效应细胞(immune effector cells)的肿瘤细胞抗原(tumor cell antigens)与靶标。另外，本发明涉及一种包括该多价抗体的药学组合物(pharmaceutical composition)以及有关于该多价抗体来供应用于人类或动物体透过疗法(therapy)的治疗(treatment)。另外，本发明涉及一种使用该抗体来治疗人类或动物的方法。
背景技术
多价抗体，诸如能够结合两种抗原或两种表位(epitopes)的双特异性抗体(bispecific antibodies)，为本领域中已知晓的。这样的多价结合蛋白质(multivalentbinding proteins)可以使用各种不同的技术而被产生，包括细胞融合(cell fusion)、化学接合(chemical conjugation)或重组DNA技术(recombinant DNA techniques)。
抗体通常为由4个蛋白质[包括两个相同的重链(heavy chains)和两个相同的轻链(light chains)]所构成的多聚体(multimers)，其中该重链系由一个可变结构域(variable domain)(VH)和3个恒定区(constant regions)(CH1、CH2、CH3)所构成，并且其中该轻链系由一个可变轻链结构域(variable light chain domain)(VL)和一个恒定区(CL)所构成。通常，该轻链和该重链经由许多非共价相互作用(noncovalentinteractions)的影响此外还经由双硫键(disulphide bonds)而配成对。该二重链在连接CH1至CH2的铰链区(hinge region)处，和/或经由位于两个CH3结构域之间的接口(interface)中的氨基酸相互作用(amino acid interactions)，而配成对。VH与VL的配对形成一个抗原结合结构域(antigen binding domain)，而且可变性(variability)通常被发现系在VH和VL结构域的3个表面循环形成区(superficial-loop forming regions)中，所述表面循环形成区是互补决定区(complementarity determining regions)或CDRs。
某些多价抗体型式(multivalent antibody formats)为本领域中已知晓的，诸如具有在诸如双特异性抗体中的可结合两个不同的抗原或两个位于相同抗原的内的不同表位的两个不同的结合结构域的抗体。这样的一种型式可允许校准结合(calibratedbinding)的使用，该校准结合允许多价抗体要被选择性地标靶(selectively targeted)至表达(express)两种抗原或表位的细胞或靶标(诸如一肿瘤细胞)而不标靶表达一种抗原的健康细胞(healthy cells)，或者去标靶以较低的表达水平(expression levels)来表达一种抗原的所述健康细胞。同样地，在多价抗体上具有两个不同的结合结构域，诸如一个双特异性抗体，可以允许不同的抗原的结合，而使得该多价抗体可以被用来标靶位于一个单细胞(single cell)或两个相互作用的细胞上的一种抑制分子(inhibitory molecule)与一种刺激分子(stimulatory molecule)这两者，以导致该多价抗体的增强的效应(enhancedpotency)。多价抗体也可被用来复位向(redirect)细胞，例如免疫调节细胞(immunomodulatory cells)，所述细胞可被复位向至一肿瘤。
两个以上的结合结构域在一个单一抗体(single antibody)内的并入(incorporation)可以允许靶标以及功效(efficacy)的有利组合的一更宽广的排列。举例来说，一个具有3个或更多个结合结构域的多价抗体可以标靶相同的抗原和表位，允许在一较低的抗体对靶标的比值下对于一给定的靶标(a given target)的特异性(specificity)和/或一靶标的饱和度(saturation)。多价抗体可以含有两个或更多个相同的抗原结合结构域以允许对一靶细胞的高亲留力结合(high avidity binding)。这可被用来特异性地标靶抗原，诸如被过度表达(over-expressed)在肿瘤细胞上的神经节苷脂(gangliosides)。这些肿瘤相关抗原(tumor associated antigens)存在于正常细胞之上，但以更高的密度(density)存在于肿瘤细胞之上。一个含有几个较低亲和力结合区(lower affinitybinding regions)的多价抗体可允许对肿瘤细胞的特异性标靶而不与健康细胞反应，或者以一较低比例这样做而且同时活化(activating)或封阻(blocking)另外的受体(receptors)。最终，3个或更多个结合区在这样的应用中是有用的。
虽然某些多价抗体已被描述于本领域中，为了针对一系列的抗原的结合结构域可被容易地制造并且被有效率地、稳定地转换成一个能够结合各种各样的抗原和表位的多价抗体，在本领域中需要有允许多价抗体的有效生产(efficient production)的新的型式以及新的接头。工程化(engineering)一个含有多于两个结合结构域的抗体在传统上是耗时的、低效的和昂贵的。确实，要有效率地生成高质量、低免疫原性(immunogenic)的多价抗体(它们可被产生以标靶各式各样的抗原)，存在有许多阻碍(impediments)。
举例来说，含有3个或4个结合结构域的现有多价型式仰赖合成的接头(syntheticlinkers)，诸如Gly4Ser(G4S)重复序列(repeats)，所述合成的接头含有序列结构域(sequence domains)，所述序列结构域首先倾向于限制对该分子中的所有结合结构域的接近(access)，其次就可发展性(developability)也可能是有问题的。
现有的多价抗体型式还仰赖不同的重链和轻链，它们系通过双硫键和氨基酸相互作用而被相联(associated)，或就单链可变片段(single-chain fragment variables，scFvs)来说可通过短接头而被连接。然而在被使用于一种具有3种或更多种结合特异性(binding specificities)的多特异性型式(multispecific format)中的多个可变结构域的每一者内使用有差别的可变链(重链和/或轻链)的需求需要这些分子的大量工程化，以防止重链和轻链的错配(mispairing)。这总是会影响这些分子的复杂性(complexity)、稳定性(stability)、免疫原性(immunogenicity)和生产水平(production levels)。
多价抗体型式可以仰赖对每个结合结构域使用相同的轻链，其中被配对以该轻链的一个或多个同源可变区(cognate variable regions)被迫经由化学修饰(chemicalmodifications)来配对，而非同源链(cognate chain)因应抗原的暴露(antigenicexposure)而被形成并与一共有轻链(common light chain)配对，以及发生在B细胞发育(B-cell development)期间当中的共同演化(co-evolution)的过程(processes)。
多价抗体型式也可以仰赖来自结合一种抗原的一现有单特异性抗体(monospecific antibody)的轻链，该轻链接而被使用于一个数据库(library)中，以便识别能够配对该轻链同时还结合一相异的表位或抗原的重链。
这样的假-共有轻链(pseudo-common light chains)不被偏好供应用于本发明中。对于本发明优选的共有轻链是那些能够与各种不同的同源链配对而且可以得自于(obtained from)、衍生自(derived from)或者根据(based on)与一重排的同源链(rearranged cognate chain)配对的共有链(common chains)，该重排的同源链系由已经历体细胞重组(somatic recombination)[而且优选为因应抗原的暴露的体细胞超突变(somatic hypermutation)]的DNA所编码。
一个假轻链方法(pseudo light chain approach)限制了可用的同源链的范围。迫使不是在一针对抗原的暴露的反应中被一起形成的重链和轻链的配对导致了特异性和亲和力的丧失而限制了实用性。此外，通常很少见到任何一种给定的抗体会允许VH和VL的混排(shuffling)并且守恒(conserve)亲和力和特异性。
迫使轻链与一重链[其中这两者并未在免疫反应(immune response)中共同演化却维持着去结合一抗原的能力(capacity)]配对并不是微不足道的，而且可能限制了这个方法的灵活性(flexibility)。
同样地，再利用(reusing)一种抗体的一轻链来识别能够结合该轻链且还结合一感兴趣的相异抗体的重链，这限制了可用的重链的范围，而且被寻求要被结合的抗原或表位越多，就变得越来越不可能去识别合适的附加重链。即，我们可使用一种与一重链配对的轻链来形成一个会结合一给定抗原的Fab，以识别一与该轻链配对并且能够结合一种第二抗原之后继重链(subsequent heavy chain)。但是，第三次使用那个轻链来识别能够配对该轻链同时结合一种第三抗原或表位的第三重链变得越来越罕见，而且要被寻找的被识别为能够与该轻链配对同时还结合相异的表位或抗原的重链越多，就会更加地罕见。
被描述于此的本发明的一优选实施方案使用一种共有链，该共有链响应一抗原而与多种多样的重链配对，并且不需要一种来自一单特异性抗体的现有轻链的再利用或者一轻链与一同源链经由化学修饰的强迫配对(forced pairing)。
多价抗体的成功构造仰赖介于不同结构域之间的蛋白质接头的正确选择，因为两个结构域的直接融合(direct fusion)可导致受危害的生物活性(compromisedbiological activity)。该(等)接头的生物物理特征(biophysical characteristics)，诸如电荷(charge)、刚性(rigidity)或可挠曲性(flexibility)此外介于所述结合结构域之间的距离以及介于结合区之间的空间构形(spatial conformation)，可冲击(impact)表位可近性(epitope access)以及该多价抗体去结合它的靶标的能力(ability)。因此，需要一种多价型式，它在一模块化方式(modular fashion)下可以使用具有不同特征的各式各样接头以允许多价抗体的构造，所述多价抗体允许同时结合至不同的表位组合，所述表位可能坐落在不同分子和/或不同细胞上。
因此，在本领域中需要有一组含有不同的刚性、可挠曲性、长度特征的接头的设计，所述接头可根据靶标的组合而以一模块化方式被使用，同时维持着稳定性、低免疫原性以及可发展性的容易度。
因此，需要有用于具有3个或更多个结合结构域的多价抗体的新颖而且有用的型式以及用于所述抗体的生成的接头，它们广泛地适用于一广泛范围的包括两个以上的结合结构域的抗体的快速且稳健的产生。
发明内容
本发明基于用于包括三个或更多个结合结构域的多价抗体(其可为多特异性抗体)的新颖模块化型式。在这些型式中，至少一个结合结构域被连接至一个碱性抗体部分(base antibody portion)，该碱性抗体部分包括两个结合结构域。该附加的结合结构域(additional binding domain)可包括一个可变区、Fv结构域、一个Fab结构域或一个经修饰的(modified)Fab结构域或这些任一者的一功能性片段(functiona l fragment)。该碱性抗体部分，举例来说，可以是一个全长的抗体(full length antibody)或其片段，但就每一种情况而言皆包括两个结合结构域。
该一个或多个附加的结合结构域经由一(多)个接头连接至该碱性抗体部分，这提供了一个或多个除了那些为该碱性抗体部分所具者以外的结合部分(binding moieties)。
一个接头被用来将该一个或多个附加的结合结构域连接至该碱性抗体部分。该接头包括一个肽区(peptide region)，例如一个或多个铰链区和/或一个或多个衍生自一铰链区的区域。该接头和一个它要被连接的恒定区(例如CH1)的组合在决定该多价抗体的性质上可能是至关重要的，并且允许该抗体的正确的功能性(correct functionality)和/或该一个或多个附加的结合结构域对该碱性抗体的定向(orientation)。因此，如果一个接头序列系根据一给定的亚型(subtype)的一铰链，可能优选的是：与该接头序列连接的该附加的结合结构域的恒定区是属于相同的亚型。
该一个或多个附加的结合结构域可包括一个可变区、Fv结构域、一个Fab结构域或一个经修饰的Fab结构域。
Fab结构域具体地构成有益的附加的结合结构域，因为它们包括蛋白质结构域具有对于多价分子的制造是有用的可预测行为(predictable behavior)，所述多价分子是稳定的而且可被容易地制造。
为促进本发明的多价抗体的有效生产以及可发展性，该多价抗体可包括一个共有可变区(common variable region)，该共有可变区可为一个免疫球蛋白(immunoglobulin)重链可变区(VH)或一轻链可变区(VL)，但通常是一个共有轻链(cLC)可变区。
该共有可变区通常被配对以一同源可变区，该同源可变区系由一个已经历体细胞重组而且优选为亲和力成熟作用(affinity maturation)的核酸所编码或者系根据或衍生自一个重排的可变区(rearranged variable region)，该重排的可变区系由一个已经历体细胞重组而且优选为亲和力成熟作用的过程的核酸所编码和/或系根据或衍生自已知的抗体产生技术(antibody generation techniques)，诸如噬菌体显示(phage display)、动物[包括带有人类化免疫系统(humanized immune systems)的基因克隆动物(transgenicanimals)]的免疫(immunization)以及本领域中已详知的其他技术。
一个在本发明的多价抗体的每个结合结构域中基本上是相同的共有可变区的使用促进了所述抗体的发展和制造。
供应用于本发明的多价抗体中的共有可变区的选择因此应该是可与许多不同的同源重链或轻链被广泛地使用的一种。
一个相同的或实质相同的(substantially identical)共有可变区，例如一个cLC可变区，允许完整的或实质完整的Fab结构域使用于全部3个或更多个结合结构域，而不需要如Crossmab技术中所使用的大量工程化或者用于防止重链或轻链的错配的接头(诸如被使用于scFv结构域中的那些)。另外，由于基本上种系编码的(essentially germlineencoded)且为非免疫原性的共有可变区为已知的(参见WO 2009/157771)，将的使用于该3个或更多个Fab结合结构域的每一者之中可以提供降低的免疫原性。
被描述于此的用于生成多价抗体的该型式的一附加益处允许基因克隆动物[优选为转基因的啮齿动物(transgenic rodents)]的使用，所述基因克隆动物在牠们的基因体(genomes)内具有一个能够与各式各样的同源可变区配对的共有可变区(例如，与各式各样的重链可变区配对的共有轻链可变区)(参见WO 2009/157771)，其允许编码从暴露于不同的抗原而被形成的所述同源可变区的DNA被引入(introduced)至一个带有编码该共有可变区的DNA的宿主细胞内，所述DNA可以各自被表达用于多价抗体的产生。
举例来说，一个在牠的种系内包括编码一共有可变区的DNA以及编码一可重排以形成一同源可变区并且能够经历一体细胞重组的未重排的免疫球蛋白基因座(unrearranged immunoglobulin locus)的DNA的基因克隆的小鼠(transgenic mouse)可被暴露于一种或多种抗原，而使得根据对该3种或更多种抗原的暴露而被生成的重排的可变区可接而被用来产生本发明的多价抗体。编码该共有可变区以及该3个或更多个重排的可变区的核酸序列可被转形(transformed)至一个宿主细胞的内，以表达本发明的多价抗体。
因此，被描述于此的用于生成多价抗体的该型式使用了3个或更多个结合结构域，所述结合结构域全都包括一个共有可变区，优选为一个共有轻链可变区。
本发明的型式包括一个或多个除了那些为该碱性抗体部分所具有者的外的结合结构域。这样的一个附加的结合结构域可以是经由一个接头被连接至该碱性抗体部分的一个Fv结构域、一个Fab结构域或一个经修饰的Fab结构域(优选地包括一个CH1结构域以及一个可变结构域)。在一个经修饰的Fab结构域中，该CH1结构域未被配对以一个CL。一个合适的CH1结构域可以是一种被工程化以移除一个或多个疏水性区(hydrophobic regions)之物或者可为一种衍生自一骆驼科动物(camelid animal)或一鲨鱼(shark)之物。另选地，一个附加的结合结构域可包括一个CL结构域以及一个可变结构域，其经由一个接头被连接至该碱性抗体部分。该CL可为一个Cκ(Ckappa)或一个Cλ(Clambda)结构域。
通常，该(等)附加的结合结构域系在该碱性抗体部分的结合结构域的一共有可变部分(common variable portion)或一重排的可变区或这两者的N-端区(N-terminalregion)处被连接至该碱性抗体部分的一个或两个结合结构域。
另选地，一个附加的结合结构域可以经由一个将该碱性抗体部分的结合结构域的一共有链与一重排的可变区这两者连接至该附加的结合结构域的一CH1和CL区的接头连接至该碱性抗体部分。在一个附加的结合结构域缺少一个恒定区的情况下，被公开于此的新颖接头可以将该碱性抗体部分的结合结构域的一共有链与一重排的可变区这两者连接至该附加的结合结构域的共有链和/或重排的可变区。
另选地，一个附加的结合结构域可以是一个VH和VL区，即一个Fv结构域，它通过一个单一接头肽而被连接至该碱性抗体部分。通常，这种型式的附加的结合结构域系在该碱性抗体部分的结合结构域的共有可变部分或者重排的可变区的N-端区处被附接至该碱性抗体部分的一个或两个结合结构域。
这种型式，当以此处所公开的接头[包括不同的长度、结构与刚度(degrees ofrigidity)]来被使用之时，是出奇地可挠曲的。因此，本发明提供了一库(a repertoireof)的具有不同性质的接头来供应用于所公开的多价抗体型式，所述接头使得要将3个或更多个结合结构域组合成多价抗体是发展容易的。
作为此处所公开的接头，本发明因此提供一种模块化方法(modular approach)，其中合适的接头的选择连同一个对应组(corresponding set)的结合结构域(诸如Fab结构域)的选择允许那些结合结构域为了各式各样的功效而在多价抗体中一起发挥作用。
本发明的多价抗体可被使用于疗法中，特别是作为一种所谓的“接合元(engager)”抗体，由此，该抗体能够形成一个介于一免疫效应细胞和一肿瘤细胞之间的连接。
根据本发明，因此被提供的是一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中该碱性抗体部分通过接头连接至该至少一个附加的结合结构域，
其中该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该至少一个附加的结合结构域的每一者全部都具有一个共有可变区，以及
其中该接头包括一个铰链序列(hinge sequence)或一个衍生自一铰链序列的序列。
本发明还涉及一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区并且通过所述接头连接至所述碱性抗体部分，所述接头连接所述碱性抗体部分的可变区与所述CH1区，以及
其中该多价抗体结合至少三个不同的表位。
优选地，该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该至少一个附加的结合结构域的每一者可以全部都具有一个共有可变区。
一个或多个附加的结合结构域的变化(Variety)
一个优选实施方案是一种多价抗体，其中一个或多个结合结构域是一个Fv结构域包括一个重链可变区(VH)以及一个轻链可变区(VL)。
一个进一步的优选实施方案是一种多价抗体，其中一个或多个结合结构域是一个Fab结构域包括一个重链可变区(VH)以及一个轻链可变区(VL)，该Fab结构域的该重链可变区包括一个CH1区(VH-CH1)，以及该Fab结构域的该轻链可变区包括一个CL区(VL-CL)。该Fab结构域可含有一个VL-CL，其为一个Vκ-Cκ、Vλ-Cλ、Vλ-Cκ或Vκ-Cλ。
另一个实施方案是一种多价抗体，其中该一个或多个附加的结合结构域是一种由一个VH-CH1和VL所构成的经修饰的Fab结构域。另选地，一个实施方案是一种多价抗体，其中该一个或多个附加的结合结构域是一种由一个VL-CL和一个VH所构成的经修饰的Fab结构域。在此种经修饰的Fab结构域中，一个恒定区CH1或CL系呈未被配对以它的同源区(cognate region)而存在，和/或一个可变区VH或VL系呈未被配对以它的同源区而存在。
共有链
一个优选实施方案是一种多价抗体，其中该一个或多个附加的结合结构域包括一个Fab结构域包括一个共有重排的可变区被配对至一个重排的可变区，该重排的可变区已经历在暴露给一种抗原之后的体细胞重排(somatic rearrangement)或者为得自于、衍生自或根据一个序列(为体细胞重排的结果)的核酸所编码。另选地，该重排的可变区可为一个得自于、衍生自或根据一个合成库(synthetic repertoire)之物，该合成库系使用本领域中已知的分子生物学技术(molecular biology techniques)[包括合成的噬菌体显示库(synthetic phage display libraries)的使用]而将多样性(diversity)引入至一库而成。优选地，该Fab结构域包括一个共有轻链可变区被配对至一个对应重排的重链可变区(counterpart rearranged heavy chain variable region)。优选地，该共有轻链可变区被连接至一个CL区而该重排的重链可变区被连接至一个CH1区。优选地，该共有轻链经由该CL和CH1区的连接而被配对至该重链可变区。另选地，其中该共有链是一个重链，该重排的可变区是一个轻链，而所述链可分别地包括一个CH1和CL结构域而且可经由该CL和CH1区的连接而被配对。
一个优选实施方案是一种多价抗体，其中该3个或更多个结合结构域各自包括相同的共有链，但是其中该3个或更多个结合结构域包括不同的重排的可变同源链(rearranged variable cognate chains)，更优选地，该相同的共有链是一个共有轻链。
一个优选实施方案是一种多价抗体，其中该3个或更多个结合结构域包括重排的可变区系由得自于、衍生自或根据一包括一共有轻链以及未重排的重链可变区的基因克隆动物的核酸序列的核酸所编码，该基因克隆动物已被暴露给一抗原并且已生成包括一被配对至一共有轻链的重排的重链可变区的抗体。另选地，在多价抗体的一实施方案中，该3个或更多个结合结构域包括重排的可变区系由得自于、衍生自或根据一包括一共有重链(common heavy chain)以及未重排的轻链可变区的基因克隆动物的核酸序列的核酸所编码，该基因克隆动物已被暴露给一抗原并且已生成包括一被配对至一共有重链的重排的轻链可变区的抗体。
接头组成(Linker Composition)
一个优选实施方案是该多价抗体，其中该接头是一个天然存在的序列(naturallyoccurring sequence)，或者是根据一个天然存在的序列。更具体地，该接头是一个铰链序列或者包括一个序列系根据一铰链序列。更具体地该接头可包括一个铰链区系根据一IgG1铰链区、一IgG2铰链区、一IgG3铰链区或一IgG4铰链区。
另选地，该接头包括具有下列中的一者或多者的肽区：
ESKYGPP(SEQ ID NO：1)
EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：2)
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)
ERKSSVESPPSP(SEQ ID NO：4)
ERKCSVESPPSP(SEQ ID NO：5)
ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：6)
ESKYGPPSPSSP(SEQ ID NO：7)
ERKSSVEAPPVAG(SEQ ID NO：8)
ERKCSVEAPPVAG(SEQ ID NO：9)
ESKYGPPAPEFLGG(SEQ ID NO：10)
EPKSCDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：11)
EPKSCDGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：12)
GGGGSGGGGSAPPVAG(SEQ ID NO：13)
EPKSCDKTHTAPELLGG(SEQ ID NO：14)
ERKSSVESPPSPAPPVAG(SEQ ID NO：15)
ERKCSVESPPSPAPPVAG(SEQ ID NO：16)
ELKTPLGDTTHTAPEFLGG(SEQ ID NO：17)
ESKYGPPSPSSPAPEFLGG(SEQ ID NO：18)
EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG(SEQ ID NO：19)
ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG(SEQ ID NO：20)
ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG(SEQ ID NO：21)
ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG(SEQ ID NO：22)
EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG(SEQ ID NO：23)
ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG(SEQ ID NO：24)
或者一个对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约85％序列同一性的序列。
优选地，本发明的多价抗体包括接头，它通过包括一个由SEQ ID NO：1至24之中的任一者所构成的氨基酸序列或一包括一个对SEQ ID NO：1至24之中的任一者具有至少大约85％序列同一性的氨基酸序列的多肽而将该碱性抗体部分连接至一个或多个结合结构域。
表1例示说明这样的接头如何可以被连接至一个CH1区。
本发明的一优选的多价抗体包括接头为刚性的。更优选地，该多价抗体包括接头包括一个螺旋形成序列(helix-forming sequence)。
本发明的一优选的多价抗体包括接头，该接头包括肽序列，肽序列包括(EAAK)2基序(motif)。
本发明的一优选的多价抗体包括接头为可挠曲的。
本发明的一优选的多价抗体包括接头包括3个或更多个氨基酸残基(amino acidresidues)系对应于(correspond to)该多价抗体的一个跟该接头连接的恒定区的一亚型的一个铰链区。
本发明的一优选的多价抗体包括接头，其包括一个SEQ ID NO：1至24的序列，该序列对应于该多价抗体的一个跟该接头连接的恒定区的一亚型的一个铰链区。
接头定位/定向(Linker Location/Orientation)
一个优选实施方案是一种多价抗体，其中该碱性抗体部分通过接头连接至一个或多个附加的结合结构域，其中该接头将该碱性抗体部分的一个可变区的N-端端部(N-terminal end)连接至该一个或多个附加的结合结构域的C-端端部(C-terminal end)。优选地，该碱性抗体部分包括一个Fab结构域以及该一个或多个附加的结合结构域包括一个Fab结构域包括一个CH1结构域和CL结构域，而该接头将该碱性抗体部分的Fab结构域的一可变区的一个N-端端部连接至该一个或多个附加的结合结构域的Fab结构域的CH1结构域和CL结构域之中的一者或两者的C-端端部。
本发明的一优选实施方案是一种多价抗体，其包括一个共有链位于该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该一个或多个附加的结合结构域的每一者，以及一个接头将该碱性抗体部分的一重排的可变区的一个N-端端部连接至该一个或多个附加的结合结构域的一重排的可变区的一个C-端端部。更优选地，该一个或多个附加的结合结构域包括一个Fab结构域包括一个CH1结构域和CL结构域，而该接头将该碱性抗体部分的Fab结构域的一可变区的一个N-端端部连接至该一个或多个附加的结合结构域的Fab结构域的CH1结构域或CL结构域。
包括附加的结合结构域的区的配对
抗体组装(antibody assembly)经由轻链和重链的相联(association)而发生，即VH与VL以及CH1与CL的相联(配对)，这是根据位于介于VH与VL以及CH1与CL之间的接口中的相互作用的残基(interacting residues)。通常，配对被进一步地稳定化，由此，一轻链通过一个双硫键而被共价地连接(covalently connected)至重链，该双硫键系介于该轻链的一个位于该CL中的半胱氨酸残基(cysteine residue)以及该重链的一个位于该CH1或铰链(视亚型而定)处的半胱氨酸残基之间。
因此，在本发明的多价抗体中，附加的一个或多个结合结构域经由一(多)个接头连接至该碱性抗体部分，其中该一个或多个结合结构域包括Fv结构域、Fab结构域或经修饰的Fab结构域，而包括该结合结构域(通常是一重链区和轻链区)的对应免疫球蛋白链呈一稳定的相联(stable association)而被配对在一起。
对于本发明的含有一个附加的结合结构域(其中该结合结构域是一个Fv或Fab结构域)的多价抗体而言，一个半胱氨酸残基可以存在于或者被工程化至所述重链和轻链结构域的内，而使得一个双硫键形成以稳定介于该附加的结合结构域的重链和轻链之间的配对。在本发明的多价抗体包括一个包括一个IgG1子类(subclass)的附加的结合结构域的情况下，一为IgG1的重链之上部铰链(upper hinge)(EPKSC)可被使用，该上部铰链被连接至并且位于一个人工接头(artificial linker)[诸如(G4S)n]之上游(upstream)[N-端侧(N-terminal side)]，以提供一个半胱氨酸来与该附加的结合结构域的轻链共价地配对。就被使用于该附加的结合结构域中的其他子类而言，熟习本领域技术人员将会认知在所使用的接头的内工程化一个半胱氨酸残基的能力，以稳定化该附加的结合结构域的轻链和重链结构域的配对以及在所使用的该轻链和重链之间形成一个双硫键(disulfide bridge)。
野生型(wild-type)IgG1铰链区具有下列序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ IDNO：65)。被划底线的C残基是位于IgG1重链中的Cys220，它与轻链的Cys214配成对。在本发明的多价抗体包括接头系根据这样一种铰链的情况下，优选地任何一个除了Cys220的外的Cys残基被替代(substituted)以一个不能形成一个双硫键的氨基酸残基，例如Ser。
野生型IgG2铰链区具有下列序列：ERKCCV ECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：69)。被划底线的C残基是位于IgG2-B重链中的Cys219，它与轻链的Cys214配成对。在IgG2-A中，位于重链中的Cys127与Cys214配成对。在本发明的多价抗体包括接头系根据这样一种铰链的情况下，优选地任何一个除了Cys215的外的Cys残基被以一个不能形成一个双硫键的氨基酸残基(例如Ser)替代。
野生型IgG3铰链区区具有下列序列：ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG(SEQ ID NO：73)。在IgG3中，位于重链中的Cys131与轻链的Cys214配成对。
IgG4铰链区具有下列序列：ESKYGPPCP SCPAPEFLGG(SEQ ID NO：77)。在IgG4中，位于重链中的Cys131与轻链的Cys214配成对。在本发明的多价抗体包括接头系根据这样一种铰链的情况下，优选地位于该铰链的CPSPC区内的所述Cys残基的一者或两者被替代以一个不能形成一个双硫键的氨基酸残基，例如Ser。
如此处所述的，要根据一个能够同时结合三个不同的表位的IgG结构来产生多价构建体(multivalent constructs)[包括三价构建体(trivalent constructs)]，接头系根据来自不同子类的IgG铰链而被使用，以将一个碱性抗体部分的一结合结构域连接至一个包括一重链恒定区的附加的结合结构域。为确保介于该轻链中的一个半胱氨酸与该附加的结合结构域的重链中的一个半胱氨酸之间的共价键(covalent bond)的稳定化(stabilization)，本发明将一个包括一铰链区或是根据一个具有一特定亚型的铰链区的接头匹配以来自于该相同亚型的附加的结合结构域的CH1。
在该多价抗体包括一个系由成对的区域(pair regions)(例如，VH-CH1配对以VL-CL，或VH配对以VL)所构成的附加的结合结构域的情况下，稳定化介于所述区域之间的接口在本发明中可以各种不同的方法来被完成。在该一个或多个附加的结合结构域是一个由一可变重链区与一可变轻链区所构成的Fab结构域的情况下，一个CH1可被连接至该可变重链区。该CH1可使用一共价键(通常是一双硫键)而被配对至一个被连接至该可变轻链区的CL。此外，一个Fab结构域的重链和轻链经由非共价相互作用而被配对。另选地，将该一个或多个附加的结合结构域连接至该碱性抗体部分的接头也可被用来将该附加的结合结构域的可变重链区配对至该可变轻链区，通过以任一链来形成一个肽键(peptide bond)以及以对应的链(counterpart chain)来形成一个共价键联(covalent linkage)。这可以通过设计一个半胱氨酸位于该接头的N-端(N-terminus)处或附近以及一个半胱氨酸位于该一个或多个附加的结合结构域的可变重链区和/或可变轻链区的C-端(C-termini)而被完成，因而在该接头以及该一个或多个附加的结合结构域的可变重链区和/或可变轻链区之间形成一个共价键。其他的用于配对包括该一个或多个附加的结合结构域的结构域(诸如一个Fab结构域)的方式为具有本领域中的技术人员所知晓的，并且将被进一步详细说明如下。
一个优选实施方案是一种多价抗体，其包括一个碱性抗体部分以及一个或多个附加的结合结构域。在该一个或多个附加的结合结构域是一个包括一重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的Fv结构域的情况下，本发明的一个接头将该碱性抗体部分连接至该Fv结构域，同时将该Fv的重链可变区和轻链可变区配对。
另选地，该结合结构域是一个Fab结构域包括：一个可变重链区包括一个CH1区，以及一个可变轻链区包括一个CL区。本发明的一个接头在该CH1区或该CL区或这两者处将该碱性抗体部分连接至该Fab结构域，同时将该Fab结构域的CH1区和CL区配对。
碱性抗体部分的配对
不同的技术在本领域中被知晓系要用来将一个碱性抗体部分的重链恒定区(例如，CH2和CH3)配对以及造成异二聚体化(heterodimerization)。举例来说，用于造成抗体重链的异二聚体化的DEKK突变的使用[WO 2013/157954以及De Nardis et al.，J.Biol.Chem.(2017)，292(35)：14706-14717，在此被并入本案以作为参考]进一步允许有效率的异二聚体形成、稳定的Fc区以及制造的容易度。这个方法使该分子的Fc区保留功能性而且能够接合免疫受体(immune receptors)[诸如Fc受体、补体(complement)和FcRn]。因此，本发明的某些多价抗体实施方案使用了该DEKK修饰或者熟习本领域技术人员所知晓的其他Fc修饰，以优先地异二聚体化该碱性抗体部分的重链。
此外，就多价抗体的某些实施方案而言，可能企求的是不要参与(engage)免疫系统的效应子功能(effector function)[例如，去限制抗体依赖型细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)、抗体媒介的吞噬作用(antibody-mediatedphagocytosis)和/或细胞依赖型细胞毒性(cellular-dependent cytotoxicity)]，诸如使用多价抗体去接合、刺激和/或共-刺激(co-stimulate)T细胞，在这种情况下，可以对该Fc区采用另外的修饰以消除(eliminate)或减轻(mitigate)效应子功能。因此，本发明的某些多价抗体实施方案含有对该碱性抗体部分的重链恒定区的修饰，所述修饰消除或减轻了效应子功能。
本发明的一附加的优选实施方案是一种多价抗体，其包括一个碱性抗体部分系由两个缺乏CH2或CH3区的重链所构成，其中所述重链在该铰链区处被接合在一起。
本发明还提供一种用于多价抗体的制备的方法，该方法包括提供一种包括一个或多个核酸的细胞，该一个或多个核酸编码能够组装成本发明的多价抗体的多肽。该细胞可以被培养(cultivated)在用于提供该碱性抗体部分、该至少一个附加的结合结构域以及该至少一个接头的表达以及让它们组装成本发明的多价抗体的条件下。
本发明还提供编码本发明的多价抗体的组成蛋白质的核酸以及它们所生成的多价抗体。
本发明还提供一种包括本发明的一核酸序列的媒介物。
本发明还提供表达所述核酸并且生成该多价抗体的宿主细胞。
本发明还提供用于产生该多价抗体的方法，包括经由使用在牠的种系内包括一共有链的基因克隆动物，该基因克隆动物生成在一同源链处具有多样性的共有链抗体(commom chain antibodies)，其中该多价抗体包括一个或多个结合结构域，其具有由一得自于、衍生自或根据已被暴露给一抗原的该基因克隆动物所表达的共有链抗体的一个或多个同源链的核酸所编码的一重排可变区。
本发明还提供一种非人类基因克隆动物，牠包括一个共有人类轻链可变区能够与各式各样的人类重链可变区配对，其中编码该共有轻链可变区和人类重链可变区的核酸系存在于该非人类基因克隆动物的内源性可变区基因座(endogenous variable regionloci)(分别为轻链和重链或者反之亦然)处和/或被稳定地整合(stably integrated)至该基因克隆动物的种系中的别处[例如，Rosa基因座(Rosa locus)]，其中令该基因克隆动物与一抗原接触产生一系列的重排的人类重链可变区与该共有轻链可变区配对，其中一个编码所述重排的人类重链可变区的核酸被转形至一个能够生成本发明的多价抗体的宿主细胞的内，而该多价抗体包括一个或多个结合结构域，其包括由一得自于、衍生自或根据已被暴露给一抗原的该基因克隆动物所生成的一个或多个重排的人类重链可变区的核酸所编码的该重排的人类重链可变区。
本发明还提供一种药学组合物，其包括本发明的一种抗体以及一药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)和/或稀释剂(diluent)。
本发明还提供本发明的一种抗体来供应用于人类或动物体透过疗法的治疗。
本发明还提供一种用于一患有一医疗适应症(medical indication)的人类或动物的治疗的方法，该方法包括对该人类或动物给药(administering)一治疗有效量(therapeutically effective amount)的本发明的一种抗体。
附图说明
为便于参考，就图15至28，当描述三特异性分子(trispecific molecules)之时，下面的型式被使用：MFAxMFB：MFC或者抗原Ax抗原B：抗原C(AntigenAxAntigenB：AntigenC)，而使得MFA或抗原A接续以x构成该“短臂(short arm)”，同时该x表示二聚体化(dimerization)，接续以MFB或抗原B描述该长臂(long arm)的内部位置(interiorposition)，接续以一个“：”指明一个接头接续以MFC或抗原C描述位于该长臂的远程结构域(distal domain)处的MFC或抗原C。在术语“模拟(mock)”就一个多价分子的背景而被使用的情况下，它意指这样的分子的一个结合结构域，它能够结合一个不存在于它被测试的给定分析中的抗原。通常，此处所用的模拟结合结构域(mock binding domains)结合破伤风毒素(tetanus toxin，TT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fibri)或甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Thyro)。
图1(a-u)阐述本发明的多价抗体的型式，包括不同的结合结构域结构、接头以及碱性抗体部分。
图2a阐述被使用于在媒介物MV1626内克隆(cloning)构建体的VH1-CH1-接头-VH2插入物(insert)的一示意图(schematic diagram)。虽未被示出，可了解到的是：该媒介物也可编码被连接至该VH2的CH3-CH2-CH1区。图2b显示一个三特异性抗体，其中VH1结合一个破伤风类毒素(tetanus toxoid)抗原，VH2结合一个纤维蛋白原抗原以及VH3结合一个甲状腺球蛋白。
图3阐述该MV1626媒介物的一示意图。
图4阐述MG1025C377表达媒介物的一示意图。
图5阐述被用来供克隆至MV1626的内的插入物的序列的排比(alignment)。注意，为了明确性目的，该排比只有涵盖CH1-接头。
图6阐述MV1057媒介物的一示意图。
图7阐述MV1260媒介物的一示意图。
图8阐述在非还原条件(non-reducing conditions)(上方)以及还原条件(reducing conditions)(下方)中的SDS-PAGE凝胶(gels)。
图9阐述24个多价构建体的筛选数据(screening data)。
图10阐述18个多价构建体的筛选数据。
图11A：共有轻链氨基酸序列。图11B：共有轻链可变结构域DNA序列以及翻译(translation)(IGKV1-39/jk1)。图11C：共有轻链恒定区DNA序列以及翻译。图11D：IGKV1-39/jk5共有轻链可变结构域翻译。图11E：V-区IGKV1-39A；图11F：该共有轻链的CDR1、CDR2以及CDR3。
图12：18个多价IgG构建体以及4个对照组抗体(control antibodies)在4种不同条件下被分析的稳定性分析(stability analysis)。
图13：8个接头的生物信息模型化(bioinformatic modeling)。
图14：两个接合元三特异性型式，带有一个长臂内部免疫细胞结合结构域和一个短臂肿瘤细胞抗原结合结构域(14a)或者一个长臂远程肿瘤细胞抗原结合结构域和一个短臂肿瘤细胞抗原结合结构域(14b)。
图15：BxPC3细胞[中位EGFR表达(median EGFR expression)]中的T细胞活化，其系通过以CD25和CD69的表达来作为下面这两种型式的一读出(read out)的流动式细胞测量术(flow cytometry)：EGFR位于短臂上(在图15a处的EGFRxCD3：TT)以及EGFR位于长臂上(在图15b处的ThyroxCD3：EGFR)。双特异性抗体(EGFRxCD3)被用作一个正对照组(positivecontrol)。
图16：HCT116细胞(中位EGFR表达)中的T细胞细胞毒性(T cell cytotoxicity)系通过测量ATP水平而被决定，通过CellTiterGlo来对EGFRxCD3：TT(图16a)和ThyroxCD3：EGFR(图16b)这两者进行评估。上方图片(top charts)ATP水平，通过在一个Envision微盘式分析仪(Envision Microplate reader)上的发光(luminescence)来被测量，结果为相对光单位(Relative light unit，RLU)数值，所述RLU数值系使用GraphPad Prism被分析，而下方图片(bottom chart)涉及根据下面方程式(equation)的杀灭百分比(percentkilling)：杀灭％＝(100-(RLU样品/RLU无IgG)×100)。
图17：接头对于HCT116细胞中的T细胞细胞毒性的效应(图17a)。关于一系列的接头的靶细胞裂解(target cell lysis)与细胞激素释放(cytokine release)的比较已就IL-2(图17b)、IFN-γ(图17c)以及TNF-α(图17d)来被证明。
图18：带有坐落在短臂上的CD3结合结构域的CD3xPD-L1：EGFR三特异性T细胞接合元分子的构形(configuration)。
图19：带有坐落在长臂的内部区域(internal region)上的CD3结合结构域的EGFRxCD3：PD-L1三特异性T细胞接合元分子的构形。
图20：对抗MDA-MB-231细胞的T细胞细胞毒性活性数据被提供，比较了三特异性分子(组合一个CD3结合结构域和两个肿瘤细胞抗原结合结构域)以及三特异性对照组(带有一个肿瘤细胞抗原结合结构域、一个模拟结构域和一个CD3结合结构域)和前面所述的正对照组。
图21：对抗MDA-MB-231细胞的T细胞细胞毒性活性数据被提供，比较了三特异性分子(组合一个CD3结合结构域和两个肿瘤细胞抗原结合结构域)与三特异性对照组(带有一个肿瘤细胞抗原结合结构域、一个模拟结构域和一个CD3结合结构域)，其中所述三特异性分子包括肿瘤细胞抗原结合结构域对于标靶EGFR和PD-L1系包括一定范围的亲和力。
图22：对抗HCT116细胞的T细胞细胞毒性活性数据被提供，比较了三特异性分子(组合一个CD3结合结构域和两个肿瘤细胞抗原结合结构域)与三特异性对照组(带有一个肿瘤细胞抗原结合结构域、一个模拟结构域和一个CD3结合结构域)，其中所述三特异性分子包括肿瘤细胞抗原结合结构域对于标靶EGFR和PD-L1系包括一定范围的亲和力。
图23a：针对MDA-MB-231细胞的FACS数据被显示为有关于一定范围的PD-L1亲和力和一定范围的EGFR亲和力的曲线下面积(area under the curve，AUC)，证明了双重-抗原结合(dual-antigen binding)与肿瘤抗原结合结构域的增高的亲和力相关。
图23b：针对BxPC3细胞的T细胞细胞毒性活性数据被提供，为某些具有CD3xPD-L1：EGFR的型式的三特异性分子作证明。同时的双重抗原结合和免疫细胞接合(immune cellengagement)发生，对结合一个单一抗原与CD3的分子(CD3xEGFR：模拟或者CD3x模拟：PD-L1)的细胞毒性具有一相加效应(additive effect)。特异性重链序列未被显示。
图24：带有坐落在长臂的远程区域上的CD3结合结构域的EGFRx纤维蛋白原：CD3三特异性T细胞接合元分子的构形。
图25：针对HT29细胞的T细胞活化数据被提供，并且证明了相较于图15中所用的正对照组EGFRxCD3双特异性抗体，通过各种不同的使用不同CD3结合结构域的EGFRx纤维蛋白原：CD3三特异性T细胞接合元分子的T细胞活化。
图26：带有相同的EGFR结合结构域(MF9891)的EGFRxCD3：EGFR双特异性三价分子的构形。
图27：在HCT116细胞中的T细胞活化活性系就一系列的双特异性三价EGFRxCD3：EGFR分子[带有相同的EGFR结合结构域(MF9891)与来自不同超级簇团(superclusters)的相异CD3结合结构域偕同一定范围的接头]来被测量。
图28：在MDA-MB-231细胞中的T细胞活化活性系就一系列的双特异性三价EGFRxCD3：EGFR分子[带有相同的EGFR结合结构域(MF9891)与来自不同超级簇团的相异CD3结合结构域偕同一定范围的接头]来被测量。
具体实施方式
“抗体”是属于蛋白质的免疫球蛋白类的蛋白质性分子(proteinaceousmolecule)，其含有结合一位于一抗原上的表位的一个或多个结构域，其中所述结构域系衍生自或者共享(share)一个抗体的可变区的序列同源性(sequence homology)。
抗体结合(antibody binding)具有不同的特质(qualities)，包括特异性和亲和力。特异性决定那个抗原或它的表位被该结合结构域特异性地结合。亲和力是对于一个特定抗原或表位的结合量值的量度(measure)。在此可方便地注意到：一个抗体的“特异性”意指它对于一个特定抗原的选择性(selectivity)，而“亲和力”意指介于该抗体的抗原结合位(antigen binding site)以及它结合的表位之间的相互作用的量值。
因此，如此处所用的“结合特异性(binding specificity)”意指一个单独的抗体结合位去跟一个抗原决定位(antigenic determinant)反应的能力。通常，本发明的抗体的结合位系坐落在所述Fab结构域的内，并且系从一个重链和/或轻链的高度变异区(hypervariable region)被构造。
“亲和力”是介于一个单一抗原结合位和它的抗原之间的相互作用的量值。本发明的一个抗体对于一个抗原的一个单一抗原结合位可以用解离常数(dissociationconstant，KD)来表示。通常，用于治疗应用(therapeutic applications)的抗体可以具有高达1×1010M或甚至更高的亲和力。
一个“抗原”是一个能够在一宿主生物体(host organism)内诱发(inducing)一免疫反应(以生成一抗体)和/或被一抗体标靶的分子。处在分子级(molecular level)下，一个抗原的特征系在于它被一个抗体的抗原结合位所结合的能力。另外，由抗原所构成的混合物(mixtures)可被视为是一个“抗原”，即熟习本领域的技术人员将会理解：有时候肿瘤细胞的一溶胞产物(lysate)或病毒粒子(viral particles)可被表示为“抗原”，而这样的肿瘤细胞溶胞产物或病毒粒子制品(preparation)存在有许多抗原决定位。一个抗原胞含有至少一个但通常是更多的表位。
一个“表位”或“抗原决定位”是一个位于一抗原上的地址，一个免疫球蛋白或抗体特异性地结合至该地址。表位可以从相连氨基酸(contiguous amino acids)或通过一个蛋白质的三级折迭(tertiary folding)而被并置(juxtaposed)的非相连氨基酸[分别为所谓的线形(linear)或构形(conformational)表位]而被形成。形成自相连直链氨基酸(contiguous，linear amino acids)的表位于暴露于变性溶剂(denaturing solvents)之下通常被保留(retained)，而通过三级折迭形成的表位于使用变性溶剂处理之下通常会丧失构形。一个表位通常可以在一个独特的空间构形中包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何一种生物体的一个免疫球蛋白重链恒定区序列，而且除非另有规定，包括一个重链可变结构域。除非另有规定，术语重链可变结构域包括3个重链CDRs以及4个FR区。重链的片段包括CDRs、CDRs与FRs以及这些的组合。一个典型的重链在该可变结构域(从N-端至C-端)之后具有一个CH1结构域、一个铰链、一个CH2结构域以及一个CH3结构域。一个重链的一功能性片段包括一个能够特异性地识别一个抗原并且包括至少一个CDR的片段。
术语“轻链”包括来自任何一种生物体的一个免疫球蛋白轻链可变结构域或VL(或其功能性片段)，以及一个免疫球蛋白恒定结构域(constant domain)或CL(或其功能性片段)序列。除非另有规定，术语轻链可包括一个选自人类κ、λ以及其组合的轻链。除非另有规定，轻链可变(VL)结构域通常包括3个轻链CDRs以及4个架构(framework，FR)区。一般而言，一个全长的轻链从N-端至C-端包括了一个VL结构域(包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)以及一个轻链恒定结构域。可随本发明被使用的轻链包括那些，例如，不会选择性地结合一个选择性地被所述重链所结合的表位之物。
供应用于本发明的多价抗体的合适的轻链包括一个共有轻链，诸如那些可通过筛选现有的抗体库(existing antibody libraries)[湿式库(wet libraries)或计算机仿真(in silico)]中最常被使用的轻链而被鉴定出之物，其中所述轻链大体上不会干扰(interfere)所述重链的表位-结合结构域(epitope-binding domains)的亲和力和/或选择性，但也适合于与一系列的重链配对。举例来说，一个合适的轻链包括一个来自一基因克隆动物(诸如一转基因的啮齿动物)之物，该基因克隆动物包括被整合(integrated)至它的基因体的内的共有轻链，而且牠可被用来在暴露于一抗原之时产生大量的(large panelsof)在重链处具有多样性的共有轻链抗体(common light chain antibodies)。
根据本发明，术语“共有轻链”系意指可以是相同的或者具有某些氨基酸序列差异但本发明的抗体的结合特异性不被影响(即所述差异不会实质地影响功能性结合区的形成)的轻链。
例如，有可能在如此处所用的共有链的定义的范围内来制备或发现非为相同的但仍为功能上等效的(functionally equivalent)可变链，例如通过引入以及测试守恒的氨基酸变化(conservative amino acid changes)、位于当被配对以一同源链之时不会或仅部分地有助于结合特异性的区域内的氨基酸的变化，诸如所述。这样的变异体(variants)因此能够结合不同的同源链而且形成功能性抗原结合结构域。如此处所用的术语“共有轻链”因此意指可以是相同的或者具有某些氨基酸序列差异但在与一重链配对之后保留了所形成的抗体的结合特异性的轻链。某些共有轻链和这样的功能上等效的变异体的一组合被涵盖在术语“共有轻链”的内。
一个“Fv结构域”意指一个包括一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)的结合结构域。
一个“Fab结构域”意指一个包括一个可变区的结合结构域，通常是一个包括一配对的重链可变区和轻链可变区的结合结构域。一个Fab结构域可包括恒定区结构域，包括一个CH1与VH结构域被以一个恒定轻链结构域(CL)与VL结构域配对。这样的配对可以发生，例如，经由一个位于CH1和CL结构域处的双硫键来作为共价键联。
一个“经修饰的Fab结构域”意指一个包括一个CH1和一个VH结构域的结合结构域，其中该VH与一个VL结构域配对且没有CL结构域存在。另选地，一个经修饰的Fab结构域是一个包括一个CL和一个VL结构域的结合结构域，其中该VL与一个VH结构域配对且没有CH1结构域存在。为了使该CH1或CL区可呈一非配对形式(non-paired form)而存在，可能有需要来移除或降低具疏水性(hydrophobicity)的区域的长度。来自于自然地表达单链抗体的动物物种[例如来自于一骆驼科动物，诸如一骆马(llama)或一骆驼(camel)，或来自于一鲨鱼]的CH1区可被使用。一个经修饰的Fab结构域的其他实施例包括一个恒定区CH1或CL，其未与它的同源区配对，和/或存在一个可变区VH或VL，其未与它的同源区配对。
如此处所用的术语“免疫效应子细胞”或“效应子细胞”意指一种位于哺乳动物免疫系统(mammalian immune system)中的天然细胞库(natural repertoire of cells)的内的细胞，该细胞可被活化以影响一靶细胞的存活率(viability)。免疫效应子细胞包括淋巴谱系(lymphoid lineage)的细胞，诸如自然杀手(natural killer，NK)细胞、T细胞[包括细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells)]或B细胞，但此外骨髓谱系(myeloid lineage)的细胞可以被视为免疫效应子细胞，诸如单核细胞(monocytes)或巨噬细胞(macrophages)、树突细胞(dendritic cells)以及嗜中性颗粒细胞(neutrophilic granulocytes)。因此，该效应子细胞优选地为一个NK细胞、一个T细胞、一个B细胞、一个单核细胞、一个巨噬细胞、一个树突细胞或一个嗜中性颗粒细胞。
当在此提及核酸或氨基酸序列时，“百分比(％)相同性[Percent(％)identity]”被定义为：在排比(aligning)序列用于最佳比较(optimal comparison)目的之后，一候选序列(candidate sequence)中的残基与一选定序列(selected sequence)中的残基为相同的百分比。为了优化(optimize)该两个序列之间的排比，可以在被比较的该两个序列的任何一者内引入空位(gaps)。这样的排比可于正被进行比较的序列的全长上来被进行。另选地，该排比可于一较短的长度上来被进行，例如在大约20个、大约50个、大约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸。序列同一性是在所报告的排比区域(aligned region)上，介于两个序列之间的相同匹配(identical matches)的百分比。
介于两个序列之间的序列比较以及序列同一性百分比的测定可以使用一个数学算法(mathematical algorithm)来被完成。熟习本领域的技术人员将会了解下列事实：数种不同的计算机程序(computer programs)可以应用于排比两个序列并且测定介于两个序列之间的相同性(Kruskal，J.B.(1983)An overview of sequence comparison.InD.Sankoff and J.B.Kruskal，(ed.)，Time warps，String edits and Macromolecules：The theory and Practice of Sequence Comparison，pp.1-44，Addison Wesley)。介于两个氨基酸序列或核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用供两个序列的排比的尼德曼-翁施算法(Needleman and Wunsch algorithm)来被测定(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。该尼德曼-翁施算法已在计算机程序NEEDLE中被执行。为了本发明的目的，来自EMBOSS软件包(EMBOSS package)的NEEDLE程序(NEEDLEprogram)被用来决定氨基酸和核酸序列之间的相同性百分比(版本2.8.0或更高阶版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice，P.LongdenJ.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp.276-277，http：//emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62被使用于替代矩阵(substitution matrix)。对于DNA序列，DNAFULL被使用。所使用的参数(parameters)是一为10的空位开放罚分(gap-open penalty)以及一为0.5的空位延伸罚分(gap extensionpenalty)。
在通过如上所述的程序NEEDLE的排比之后，介于一个查询序列(query sequence)和一个本发明的序列之间的序列同一性百分比系如下述来被计算(calculated)：在排比中显示出一个相同的氨基酸或相同的核苷酸(nucleotide)系位于两条序列中的对应位置的数目(number of corresponding positions)除以减去(subtraction)排比中的空位总数(total number of gaps in the alignment)后的排比总长度(total length of thealignment)。
在此，术语“连接(connected)”系指经由位于一级氨基酸序列(primary aminoacid sequence)处的肽键而被彼此连接的结构域。举例来说，一个包括VH-CH1-CH2-CH3的碱性抗体部分的一重链可被连接至一个附加的结合结构域VH-CH1的一重链(或者一个附加的结合结构域至一个附加的结合结构域)，其经由一个接头(在CH1处将该附加的结合结构域的该重链连接至该碱性抗体部分的VH区)，它们一起组成一个多肽链。同样地，一个CH1结构域可被连接至一个可变重链区，而一个CL结构域可被连接至一个可变轻链区。
“配对”意指介于构成本发明的多价抗体的多肽之间的相互作用，而使得它们可以多聚体化(multimerize)。举例来说，一个附加的结合结构域可以包括一个重链区(VH-CH1)被配对至一个轻链区(VL-CL)，其中该CH1和CL配对以形成该结合结构域。如此处所述的，抗体结构域的配对(例如，重链和轻链)系由于非共价相互作用且还经由双硫键而发生，而且可以经由此处所公开的技术以及本领域中已知的方法来被工程化。
在本案发明说明书以及检附的权利要求书的全文中，词语“包括(comprise)”、“包括(include)”和“具有(having)”以及诸如“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的变化(variations)将被包括性地解释(interpreted inclusively)。即，这些词语被意欲用于表达(convey)：在上下文允许的情况下，未被具体叙述其他的要素(elements)或整数(integers)的可能包括(possibleinclusion)。
如此处所用的冠词“一个(a)”和“一个(an)”系指该冠词的语法制品(grammaticalobject)有一个或多于一个(即一个或至少一个)。举例来说，“一个要素”可以表示一个要素或多于一个要素。
本发明提供一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中该碱性抗体部分通过接头连接至该至少一个附加的结合结构域，
其中该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该至少一个附加的结合结构域的每一者全部都具有一个共有可变区，以及
其中该接头包括铰链序列或衍生自铰链序列的序列。
本发明还提供一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区并且通过所述接头连接至所述碱性抗体部分，所述接头连接所述碱性抗体部分的可变区与所述CH1区，以及
其中该多价抗体结合至少三个不同的表位。
在这样的一种多价抗体中，该碱性抗体部分的每个结合结构域以及该至少一个附加的结合结构域的每一者可以全部都具有一个共有可变区。
本发明还提供一种多价抗体，它通常能够经由至少3个结合结构域而结合至它的靶标(们)，即该抗体是多价抗体。该多价抗体选择性地可为一种多特异性抗体。也就是说，本发明的一抗体也许能够结合两个或更多个不同的表位或是两个或更多个不同的抗原，例如两个、3个、4个或更多个不同的表位或抗原。
不同型式的多价抗体
应被注意的是：本发明的其他特征和方面从详细说明，结合以检附的说明书附图，是明显可见的，所述说明书附图通过实施例来例示说明根据本发明的实施方案的特征。所述说明书附图是示例性的而且它们不被意欲也不会限制本发明的范围，该范围系由权利要求书以及详细的揭露内容的全部内容来被限定，该揭露内容描述了被阐述于此的发明并使的能实现。本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个附加的结合结构域，优选为一个Fab结构域包括一个VH-CH1区被配对至一个VL-CL区。该多价抗体包括3个VH区以及3个VL区。该VH或者VL可为一个共有可变区(VHc或VLc)被配对至该同源链的一个重排的可变区。举例来说，该3个VL区可为一个共有链(VLc)，而每个VH区(VH1-VH3)可包括一个重排的可变区，其中该VH1、VH2和VH3区可结合相同的表位或高达三个不同的表位。其中，该多价抗体包括一个共有轻链(VLc)以及3个重链可变区(VH1-VH3)，由一个被配对以一个VLc-CL的VH3-CH1所构成的该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体，该接头位于该碱性抗体部分的一个VH1或VH2区以及该附加的Fab结构域的CH1之间。参见，例如，图1a。
另选地，该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体，该接头位于该碱性抗体的共有轻链区(VLc)以及该附加的Fab结构域的CL区之间。参见，例如，图1b。在本发明的另一个方面中，该3个VH区可为一个共有链(VHc)，而每个VL区可包括一个重排的可变区，其中该3个VL区可结合相同的表位或不同的表位(VL1-VL3)。在该多价抗体包括一个共有重链(VHc)以及3个轻链可变区(VL1-VL3)的情况中，该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体，该接头位于该碱性抗体部分的一个VL1或VL2区以及该附加的Fab结构域的CL区之间。参见，例如，图1c。另选地，该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体，该接头位于该碱性抗体的共有重链区(VHc)以及该附加的Fab结构域的CH1区之间。参见，例如，图1d。
另选地，该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体，该接头位于该碱性抗体的重链与轻链可变区以及该附加的Fab结构域的CH1和CL区之间，不管该共有链是否为重链或轻链。参见，例如，图1e。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个以上的附加的结合结构域，例如两个Fab结构域。该多价抗体的VH或VL区可为一个共有可变区(例如，VHc或VLc)连同包括一个重排的可变区的同源链来结合相同或不同的抗原或表位(例如，VHc和VL1-VL4；或者VH1-VH4和VLc)。该附加的Fab结构域可经由一个接头连接至该碱性抗体部分，该接头位于该碱性抗体部分的共有链(VHc或VLc)以及该附加的Fab结构域的共有可变区的个别恒定区之间，或者位于该碱性抗体的重排的可变结构域(VH1与VH2；或VL1与VL2)以及该附加的Fab结构域的重排的可变结构域的个别恒定区之间。举例来说，图1f描绘本发明的多价抗体包括一个碱性抗体以及两个附加的Fab结构域，其中该抗体包括一个共有轻链(VLc)以及4个重链可变区(VH1-VH4)，其中一个接头在该碱性抗体的重排的重链可变结构域(VH2与VH3)以及所述附加的Fab结构域的CH1区处将该碱性抗体连接至所述附加的Fab结构域。另选地，图1g描绘本发明的多价抗体，其中该碱性抗体被连接至两个附加的Fab结构域，在一个第一重排的可变结构域(VH2)至该第一附加的Fab结构域的CH1区处，以及在该碱性抗体的一个共有轻链可变区(VLc)至该第二附加的Fab结构域的CL区处。另选地，图1h描绘本发明的多价抗体，其中该碱性抗体经由一个接头连接至两个附加的Fab结构域，该接头将该碱性抗体的两个共有轻链区(VLc)连接至该两个附加的Fab结构域的CL区。另选地，图1j描绘本发明的多价抗体，其中该碱性抗体经由一个接头连接至该第一附加的Fab结构域，该接头分别地将该碱性抗体的重排的重链可变区(VH3)和共有轻链区(VLc)连接至该第一附加的Fab结构域的CH1和CL处，而该第二附加的Fab结构域系在它的CH1处经由一个接头连接至该碱性抗体的该第二重排的重链可变区(VH2)。另选地，(图1i)该第二附加的Fab结构域经由一个接头而在它的CL处被连接至该碱性抗体的共有轻链可变区(VLc)。另选地，(图1k)该第二附加的Fab结构域经由一个接头而在它的CH1和CL处被分别地连接至该碱性抗体部分的第二个重排的重链可变区(VH2)以及共有轻链(VLc)。被描述于此以及被描绘于图1f-1k处的型式还适用于其中该共有链是一个重链(VHc)而该多价抗体包括4个重排的轻链可变区(VL1-VL4)包括高达4个不同的结合特异性的情况。
此外，两个或更多个附加的结合结构域可经由接头而只被连接至一个碱性抗体部分的一个结合结构域，而使得一个第一附加的Fab结构域经由一个接头连接至一个第二附加的Fab结构域，后者接而被连接至该碱性抗体部分。也就是说，一个第一接头系位于该碱性抗体部分和所述附加的Fab结构域当中一个之间，而一个第二接头系位于该两个附加的Fab结构域之间。该两个接头可为相同或不同。
在本发明的另一个方面中，构成该多价抗体的个别的蛋白质可以将重链和轻链混合在同一个蛋白质中。举例来说，多价抗体可以由一个第一蛋白质所构成，该第一蛋白质包括附加的Fab结构域被连接至该碱性抗体从N-端至C-端依序为VLc-CL-VH2-CH1-CH2-CH3，而使得一个接头在VH2-CL处将该附加的Fab结构域的VLc-CL区连接至该碱性抗体部分。一个第二蛋白质包括VH1-CH1，其与该第一蛋白质的VLc-CL配对。一第三蛋白质包括从N-端至C-端依序为VH3-CH1-CH2-CH3，而使得该第三和该第一蛋白质在它们的CH1区之下方处配对。而一个第四蛋白质包括从N-端至C-端依序为VLc-CL，其与该第一蛋白质的VH2-CH1以及该第三蛋白质的VH3-CH1配对。参见，例如，图11。
虽然被描述于此以及被描绘于图11中的型式例示说明了一个共有轻链和至少3个重排的重链可变区(VH1-VH3)(包括高达3个不同的结合特异性)的使用，应被了解的是：这个型式适用在该共有链是一个重链(VHc)而该多价抗体包括3个或更多个重排的轻链可变区(VL1-VL3)(包括高达3个不同的结合特异性)的情况下。
本发明的另一个方面是一种包括4个蛋白质的多价抗体，其中该共有链是一个共有轻链。该多价抗体系由4个蛋白质所构成从N-端至C-端依序包括：一为VH1-CH1-VLc-CL的第一蛋白质，其中一个接头将CH1连接至VLc；一为VLc-CL的第二蛋白质，该VLc-CL与该VH1-CH1配对以形成一个附加的Fab结构域；一包括VH2-CH1-CH2-CH3的第三蛋白质，其中该第三蛋白质的CH1与该第二蛋白质的CL配对；以及一包括VH3-CH1-CH2-CH3的第四蛋白质，其中该第三和该第四蛋白质在CH1区之下方处配对，而该第二蛋白质(VLc-CL)在该第四蛋白质的CH1区处跟该第四蛋白质配成对。参见，例如，图1m。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个附加的Fab结构域，其中该多价抗体的VH或VL区可为一个共有可变区，并且其中该附加的Fab结构域可经由一个位于该碱性抗体的VH(图1n)或VL(图1o)处的接头连接至该碱性抗体部分，其中该接头同时连接该碱性抗体至该Fab结构域并且将该Fab结构域的同源链配对。在这样的情况下，该Fab结构域可选择性地缺少一个CH1-CL结构域，并且使用该接头来配对该Fab结构域的可变结构域。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个包括一配对的VH和VL的附加的结合结构域。包括一VH和VL的该附加的结合结构域可经由一个被形成于该VH和VL之间的半胱氨酸桥而被配成对，而使得它可以不需要一个CH1或CL区的存在。参见，例如，图1p。注意，一个半胱氨酸桥被描绘于1p中，虽然具有本领域中的技术人员了解附加的半胱氨酸桥通常存在于CH1/CL接口处(未被显示于说明书附图中)。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个附加的经修饰的Fab结构域。该经修饰的Fab结构域可包括一个经修饰的CH1，而使得它不需要与一个CL配对。举例来说，该CH1可为一个骆驼科CH1或根据一个骆驼科CH1，或可经由本领域中已知的技术来被修饰以缺少疏水性残基(hydrophobic residues)。各个VH或VL可为一个共有或重排的可变区。该附加的经修饰的Fab结构域可经由一个位于该碱性抗体部分的VH2以及该经修饰的Fab结构域的CH1之间处的接头连接至该碱性抗体部分。该经修饰的Fab结构域的VH和VL可经由一个半胱氨酸桥，或任择地非共价相互作用，而被配成对。参见，例如，图1q。另选地，该附加的经修饰的Fab结构域可经由一个位于该碱性抗体部分的VL以及该经修饰的Fab结构域的CH1之间处的接头连接至该碱性抗体部分。该经修饰的Fab结构域的VH和VL可经由一个半胱氨酸桥而被配成对。参见，例如，图1r。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个附加的经修饰的Fab结构域，其中该经修饰的Fab结构域可包括一个经修饰的CL，而使得它不需要与一个CH1配对。举例来说，该CL可被工程化以移除疏水性区。该经修饰的Fab结构域的各个VH或VL可为一个共有或重排的可变区。该附加的经修饰的Fab结构域可经由一个位于该碱性抗体部分的VL以及该经修饰的Fab结构域的CL之间处的接头连接至该碱性抗体部分。该经修饰的Fab结构域的VH和VL可经由一个半胱氨酸桥而被配成对。参见，例如，图1s。
本发明的多价抗体可包括一个碱性抗体部分以及一个附加的经修饰的Fab结构域，其中该经修饰的Fab结构域可包括一个经修饰的CL，而使得它不需要与一个CH1配对。举例来说，该CL可被工程化以移除疏水性区。该经修饰的Fab结构域的各个VH或VL可为一个共有或重排的可变区。该附加的经修饰的Fab结构域可经由一个位于该碱性抗体部分的VH2以及该经修饰的Fab结构域的CL之间处的接头连接至该碱性抗体部分。该经修饰的Fab结构域的VH和VL可经由一个半胱氨酸桥而被配成对。参见，例如，图1t。
本发明的碱性抗体部分
应被注意的是，虽然图1a-1u将该多价抗体的碱性抗体部分描绘为包括配对的重链恒定区(包括CH2和CH3区)，这些区域仅是为了例示说明的目的而被显示，而且本发明不受限于这些实施方案。在此被描述的是适合供应用于所公开的抗体的不同型式的碱性抗体部分和附加的结合结构域。
本发明的多价抗体的碱性抗体部分可为一个全长的免疫球蛋白，例如一个全长的IgG、IgA、IgE、IgD或IgM部分，但优选为IgG，而且更优选为IgG1。
在本发明的任何一个抗体中，所述附加的结合结构域之中的至少一者，优选为一个Fab结构域，可包括一个CH1结构域具有一免疫球蛋白子类系不同于那个为该抗体的碱性抗体部分的CH1结构域所具者，和/或可具有一个具一不同类型的轻链。举例来说，在该抗体的碱性部分是一个全长的IgG1的情况下，所述附加的结合结构域之中的至少一者可以包括一个属于IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4子类的CH1结构域，和/或在该抗体的碱性部分包括一个κ轻链(kappa light chain)的情况下，所述附加的结合结构域之中的至少一者可含一个λ轻链(lambda light chain)。
经由那些具有本领域的技术人员所知晓的技术，诸如将DEKK修饰工程化至该碱性抗体的CH3区的内，该碱性抗体的重链可被设计成优先地配对。参见WO 2013/157954以及DeNardis et al.，J.Biol.Chem.(2017)292(35)14706-14717(在此被并入本案以作为参考)，这些证明在CH3区的内进行工程化用于驱动所述重链的异二聚体化。可被使用于本发明的用于驱动异二聚体化的替代方法(alternative approaches)包括孔中钮型式(knob-in-hole format)(WO 1998/050431)以及电荷工程(charge engineering)的使用(Gunasekaran，JBC 2010，vol 285，pp.19637-19646)。
该Fc区调解(mediates)一个抗体的效应子功能，诸如补体依赖型细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖型细胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)以及抗体依赖型细胞吞噬作用(antibody-dependent cellphagocytosis，ADCP)。取决于该多价抗体而定，可能被企求的是要降低或提高该效应子功能。如在本发明的某些实施方案中，当一免疫反应是要被活化、增强或刺激之时，降低的效应子功能可以被企求。具有降低的效应子功能的抗体可被用来标靶免疫细胞的细胞表面分子(cell-surface molecules)，以及其他等等。当一抗体正在标靶有害的细胞(harmfulcells)时，增高的效应子功能可以被企求，而因此补强(boosting)免疫效应子细胞的能力或补体级联反应(complement cascade)以消除或裂解(lyse)所述靶标。
该重链Fc区的效应子功能可以经由那些具有本领域的技术人员所知晓的修饰而被减轻或消除。同样地，该重链Fc区的效应子功能可以经由那些具有本领域的技术人员所知晓的修饰而被增强。举例来说，ADCC可经由CH2结构域的基因改造(geneticmodification)而被增强。参见，例如，Strohl，Curr.Opin.Biotechnol.2009(6)685-91。
本发明的多价抗体在一个实施方案中可以是去岩藻糖化的(afucosylated)。当相较于在一正常的CHO细胞内所生成的相同抗体，本发明的多价抗体优选地在该Fc区内包括一降低数量的岩藻糖化(fucosylation)的N-连接的醣类结构(N-linked carbohydratestructure)。
本发明的多价抗体的一个方面还包括一个缺少一个CH2或CH3区的碱性抗体，其中该碱性抗体部分的所述重链可通过一个位于CH1区之下方处的半胱氨酸共价桥(cysteinecovalent bridge)而被连接。
本发明的方面(包括针对本发明的碱性抗体部分的变化)被例示说明于图1u处。
在此被描述的是一库(repertoire)的接头，它们可被用来将本发明的抗体的碱性部分与一个或多个结合结构域连接。一个或多个结合结构域，诸如一个可变区、一个Fv结构域、一个Fab结构域或一个经修饰的Fab结构域，可被连接至本发明的一个抗体的碱性抗体部分。
本发明的抗体包括一个碱性抗体部分以及经由一(多)个接头而被附接至该碱性抗体部分的一个或多个结合结构域。
包括一个全长的IgG碱性抗体部分的多价抗体被偏好，因为这样的结构通常具有有益的性质(beneficial properties)，诸如一有利的半衰期(a favorable half-life)、可预测的生物物理行为(predictable biophysical behavior)以及较低的免疫原性。本发明的抗体通常适合于供治疗用途(therapeutic use)而因此系由供应用于人类治疗(humantherapeutics)的人类序列所构成。另选地，使用那些具有本领域的通常技术人员所详知的技术，所述抗体具有属于该治疗正在被施用的物种(species)的序列或具有根据落在那个给定物种之中的共有序列(consensus sequences)的序列。
在本发明的多价抗体的碱性抗体部分为一个全长的IgG的情况下，该全长的IgG可包括提供所企求的特征的突变。所述突变通常不是所述区域的任何一者的实质部分(substantial portions)的缺失(deletions)。但是，当中的一个或数个氨基酸残基被插入(inserted)、缺失(deleted)或取代(substituted)而基本上不改变所形成的IgG部分的结合特征的全长的IgG部分被包罗(embraced)在术语“全长的IgG”的内。例如，所述IgG部分可以具有一个或多个具有介于1个和10个氨基酸残基之间的插入、缺失或取代，优选地系位于非-CDR区中，其中所述被插入、缺失或取代的氨基酸对于IgG的结合特异性而言不是必需的。
IgG1根据它在人体内的长循环半衰期(long circulatory half-life)而可能被偏爱。另外，为了要减轻在人体内的免疫原性，被偏好的是：根据本发明的一个抗体的碱性抗体部分是一个人类抗体。
本发明的抗体的碱性部分可以是全长免疫球蛋白，它被限定为包括一个基本上完整的抗体(essentially complete antibody)。这样一个基本上完整的抗体可不必然地具有一个完整的抗体(intact antibody)的所有功能。
如此处所述的一个抗体的一全长的碱性部分包括两个重链和两个轻链。各个链含有恒定区(C)和可变区(V)，它们就重链而言可被分解成CH1、CH2、CH3、VH以及就轻链而言可被分解成CL、VL。该抗体可经由所述恒定结构域(通常经由该Fc部分)而与免疫系统的分子和细胞相互作用。
本发明的一个抗体(包括双特异性或多特异性抗体)的恒定区优选地是一个人类恒定区。该恒定区对于一个天然存在的人类抗体的恒定区可以含有一个或多个(优选为不多于10个，优选为不多于5个)氨基酸差异。此处所生成的抗体的各种不同的可变结构域系衍生自一个人类抗体可变结构域库(human antibody variable domain library)。照此，这些可变结构域是人类的。独特的CDR区可以衍生自人类、可以是合成的或衍生自另一种生物体。本发明的一个抗体或双特异性抗体优选地为一个人类的或人类化抗体。合适的重链恒定区被非限制性地例证(exemplified)于表21中。
本发明的一个抗体通常具有一个完整的Fc区维持着多特异性抗体的半衰期与稳定性。该Fc也可允许与免疫效应子分子(诸如Fc受体、补体和FcRn)的相互作用。如具有本领域的技术人员所了解的，技术可以用于设计一个Fc区以防止或减轻与Fc受体的相互作用或者增强与Fc受体的相互作用。
该碱性抗体部分和一个或多个附加的结合结构域(例如Fab结构域)经由一个或多个接头而被连接。该至少一个附加的Fab结构域可具有一给定的同型(isotype)或子类，例如IgG1、2a、2d、3或4：至少一个附加的Fab可具有一个子类系不同于那个为该全长的IgG部分的Fab结构域所具者或可携带一个具有不同类型的轻链(κ或λ)。
用于多价抗体型式的接头
本发明的抗体包括一个或多个接头，该一个或多个接头将一个或多个附加的结合结构域连接至该碱性抗体部分。该接头连同该接头所连接的结合结构域至少部分地决定了该多价抗体的功能性。
在本发明的一个抗体中，一个接头的肽区可包括一个铰链序列或包括一个根据一铰链序列的序列。因此，一个合适的肽区的氨基酸序列可包括一个天然存在的序列或包括一个根据一天然存在的序列的序列。这样的序列的使用可帮助本发明的多价抗体的可发展性以及帮助确保低免疫原性。
一个铰链区是一个位于IgG和IgA免疫球蛋白类型的重链的中间部分(centralpart)中的可挠曲氨基酸拉伸物(flexible amino acid stretch)(即那个将Fab连接至Fc的部分)，它通过双硫键来将这两个重链配成对。它富含半胱氨酸和脯氨酸(proline)氨基酸并且对于任何其他的免疫球蛋白区带有极少的相似性(resemblance)。
因此，用于将该一个或多个附加的结合结构域连接至供应用于本发明的多价抗体的碱性抗体部分的一合适的接头可以衍生自一个IgG或IgA铰链序列。该接头区可以根据一个IgG1铰链区、一个IgG2铰链区、一个IgG3铰链区或一个IgG4铰链区。
通常，所使用的铰链区的类型系与跟该接头所连接的该附加的Fab结构域的恒定区(例如CH1)的类型相匹配。也就是说，如果一个接头系根据来自一个IgG1铰链区的一(多)个序列，跟该接头所连接的该附加的Fab结构域的CH1为一个来自一个IgG1的CH1。
一个抗体的一接头可以根据一个上部(upper)、中间(middle)或下部(lower)铰链区，或为这样一个区域的一个次群(subset)。
该IgG1铰链区具有下面序列：EPKSCDKTHT CPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：42)。
该上部铰链区被限定为：EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：43)。
该中间铰链区被限定为：CPPCP(SEQ ID NO：44)。
该下部铰链区被限定为：APELLGG(SEQ ID NO：45)。
因此，在本发明的一个抗体中，该接头可包括这些序列之中的一者或多者，和/或一个根据这些序列之中的一者或多者的序列。
该IgG2铰链区具有下面序列：ERKCCVECPP CPAPPVAG(SEQ ID NO：46)。
该上部铰链区被限定为：ERKCCVE(SEQ ID NO：47)。
该中间铰链区被限定为：CPPCP(SEQ ID NO：48)。
该下部铰链区被限定为：APPVAG(SEQ ID NO：49)。
因此，在本发明的一个抗体中，该接头可包括这些序列之中的一者或多者，和/或一个根据这些序列之中的一者或多者的序列。
该IgG3铰链区具有下面序列：ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG(SEQ ID NO：50)。
该上部铰链区被限定为：ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：51)。
该中间铰链区被限定为：CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO：52)。
该下部铰链区被限定为：APEFLGG(SEQ ID NO：53)。
该IgG4铰链区具有下面序列：ESKYGPPCPS CPAPEFLGG(SEQ ID NO：54)。
该上部铰链区被限定为：ESKYGPP(SEQ ID NO：55)。
该中间铰链区被限定为：CPSCP(SEQ ID NO：56)。
该下部铰链区被限定为：APEFLGG(SEQ ID NO：57)。
带有共有序列CXXC的该中间区在一个野生型IgG的背景下连接两个IgG重链而且为刚性的。这些双硫键对于现今应用而言是不被需要的，而因此在一个接头包括一个中间铰链序列的情况下，优选地，位于该CXXC共有序列之中的一个或多个Cys残基被取代，例如使用一个Ser残基。因此，在一个优选实施方案中，CxxC可以是SxxS。
一个适合供应用于本发明的多价抗体的接头可以是一个根据一个中间铰链序列之物，例如一个包括一个中间铰链序列但是不包括一个下部和/或一个上部铰链序列的序列。一个适合供应用于本发明的多价抗体的接头可以是一个根据一个上部铰链序列之物，例如一个包括一个上部铰链序列但是不包括一个下部和/或一个中间铰链序列的序列。一个适合供应用于本发明的多价抗体的接头可以是一个不包括一个中间铰链序列之物，例如一个包括上部铰链序列和下部铰链序列的一组合的序列。
因此，本发明提供一种接头，其包括一个具有序列识别编号3至5、7至11或13至24之中的一者的氨基酸序列。
因此，在本发明的一个抗体中，该接头可包括这些序列之中的一者或多者，和/或一个根据这些序列之中的一者或多者的序列。一个肽区可以基本上由一个中间区序列所构成或根据该序列，或者基本上由一个上部和一个下部区序列所构成或根因所述序列。
一个适合供应用于本发明的一个抗体的接头可以参照一个包括如此处所阐述的任何一个接头序列的氨基酸序列的序列[其中有0至5个氨基酸插入、缺失、取代或添加(additions)(或其组合)被进行]来被限定。在某些实施方案中，该接头包括一个氨基酸序列，它相对于一个如此处所阐述的接头序列包括从0至4个(优选为从0至3个，优选为从0至2个，优选为从0至1个，优选为0个)氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)。
一个合适的接头可以是从大约7个至大约29个氨基酸的长度，例如从大约10个至大约20个氨基酸的长度。但是，一个合适的接头可为一短型接头，例如从大约7个至大约10个氨基酸的长度，或可为一长型接头，例如从大约20个至大约29个氨基酸的长度。
该接头可包括一个Ig铰链区或者包括一个序列系根据一个被连接至一个与该接头系属相同子类的CH1区的Ig铰链区，而且可以包括半胱氨酸来供该共有轻链的共价键联。
一个适合供应用于本发明的一个抗体的接头可以根据一个IgG1铰链区、一个IgG2铰链区、一个IgG3铰链区或一个IgG4铰链区。
如果一个(G4S)n序列要被使用，优选地它系组合以一个来自于一个非为IgG的同型或一个非为IgG1的子类的铰链序列而被使用并且包括一个CH1区。
在本发明的一个抗体中，该接头可以是刚性的或可挠曲的，可包括一个带电荷的序列(charged sequence)，可为笔直的(straight)或弯曲的(bent)。
一个为了本发明的目的的刚性序列是具有一为大约1.015或更低的卡帕斯与舒兹可挠曲性预测度(Karplus and Schulz flexibility Prediction)的序列。一个部分可挠曲的序列是一个具有一为从大约1.015至大约1.04的卡帕斯与舒兹可挠曲性预测度之物。一个为了本发明的目的的可挠曲的序列是一个具有一为至少大约1.015的卡帕斯与舒兹可挠曲性预测度的序列(Karplus PA，Schulz GE.Prediction of Chain Flexibility inProteins-A tool for the Selection of Peptide Antigens.Naturwissenschaften1985；72：212-3；http：//tools.immuneepitope.org/bcell/)。可挠曲性预测度系透过7个残基的连续窗口(consecutive windows)沿着序列[1残基步进式(1 residue step)]来计算以产生每个窗口的预测的“可挠曲性”指数(predicted “flexibility”index perwindow)。该接头序列的整体可挠曲性(overall flexibility)被给定为是整个序列的平均值(average)。
位于一个IgG铰链区中的Cys残基的移除或取代，包括经由以一个丝氨酸(serine，Ser)来替换该Cys残基，可以使一个根据那个铰链的接头成为更加可挠曲的。另选地，一个接头可基于一个螺旋形成序列的存在而为一个刚性接头。因此，一个中间铰链区，例如守恒的CPPCP基序(conserved CPPCP motif)，可被一个螺旋形成序列[例如(EAAAK)2]来替换，这会导致一个短刚性螺旋位于该接头中。因此，在本发明的一个抗体中，该接头可包括一个螺旋形成序列，例如包括该氨基酸序列(EAAAK)2。这样一个序列的使用可帮助增加刚性。
本发明的一个接头优选地可以包括一个如SEQ ID NO：3至5、7至11或13至24之中的任一者所阐述的氨基酸序列，或一个对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约90％序列同一性(优选为对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约95％序列同一性、更优选为对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约97％序列同一性、更优选为对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约98％序列同一性、更优选为对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约99％序列同一性)的氨基酸序列。
举例来说，一个适合供应用于本发明的多价抗体的接头可以参照一个包括SEQ IDNO：1至24之中的任一者的氨基酸序列的序列[其中有0至5个氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)被进行]来被限定。在某些实施方案中，该接头包括一个氨基酸序列，它相对于一个被阐述于SEQ ID NO：3至5、7至11或13至24之中的序列具有从0至4个(优选为从0至3个，优选为从0至2个，优选为从0至1个，以及优选为0个)氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)。
一个适合供应用于本发明的多价抗体的接头可以参照一个包括SEQ ID NO：1至24之中的任一者的氨基酸序列的序列或一个对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约85％序列同一性(诸如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约90％序列同一性、例如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约95％序列同一性、诸如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约98％序列同一性、例如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约99％序列同一性)的氨基酸序列来被限定。
表1例示说明一个接头序列如何可被连接至CH1和VH2区。
表1：划底线的序列(underlined sequence)是该接头序列；侧翼序列(flanking
sequences)为该附加的Fab的CH1区的CH1区以及一个随后的重链VH区的VH2区
注意，取决于所使用的特定可变区而定，跟随在该接头(上面被划底线者)之后的VH2序列可以变化。在其他实施方案中，跟随在该接头之后的序列可以是一个轻链可变区，包括一个共有轻链。
使用接头来配对该附加的结合结构域的区域
在此被使用的接头可以连接该碱性抗体部分至该至少一个附加的结合结构域。此外，在该至少一个附加的结合结构域是一个Fab结构域或者系由一个重链可变区和一个轻链可变区的配对所构成的情况下，该接头可经由共价键联(通常经由一个双硫键)来配对该重链和轻链。该双硫键可以在该接头之中的一个半胱氨酸残基和该(等)附加的结合结构域的一个可变区之间形成。由该接头所造成的该配对可适用于一个包括一个Fab结构域的附加的结合结构域，该Fab结构域包括一个共有轻链和一个对应重排的重链可变区，或包括一个共有重链和一个对应重排的轻链可变区。
多价性(multivalency)以及多特异性(multispecificity)
在本发明的一个多价蛋白质的碱性抗体的两个结合结构域结合不同的抗原的情况下，该第一个和第二个抗原可以是坐落在一个细胞上或坐落在不同的细胞类型上的两个不同的分子或部分。包括两个通过招募(recruiting)以及活化内源性免疫细胞来调解细胞毒性的结合结构域的抗体是一种新兴类型的抗体治疗剂(antibody therapeutics)。这可通过将对于靶细胞(即肿瘤细胞)和效应子细胞(即T细胞、NK细胞以及巨噬细胞)的抗原结合特异性组合在一个分子中而被达成(参见，例如，WO 2014/051433)。本发明的一个抗体包括至少3个结合结构域。该碱性抗体部分通常将包括两个不同的结合结构域(虽然该两个结合结构域可以具有相同的序列或结合相同的表位)。一个包括3个或更多个结合结构域的多价抗体可以标靶一个、两个、3个或更多个肿瘤相关抗原，这允许对有害的细胞(deleterious cells)而非健康细胞的一特异性标靶(specific targeting)。举例来说，该多价抗体的一个或两个结合结构域可以结合一个位于一异常的(aberrant)(肿瘤)细胞上的抗原，而该多价抗体的一个第二或第三结合结构域可以结合一个位于一可造成表达一个或多个肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的直接杀除(directed killing)的免疫效应子细胞上的抗原。另选地，该多价抗体的两个结合结构域可以特异性地结合至位于被表达于肿瘤细胞上的一相同抗原或不同抗原上的两个不同表位，而这些臂的亲和力被减弱(attenuated)以减轻结合至仅表达一种抗原的细胞或者只有该多价抗体的一个结合结构域被接合处。或者本发明的多价抗体的3个结合结构域可以结合至3个不同抗原或相同的抗原，但位于免疫效应子细胞的不同表位处。
同样地，一个包括3个或更多个结合结构域的多价抗体可以结合一个功能性靶标，诸如一个配位基(ligand)或酵素(enzyme)，触发(triggering)该靶标的一生物反应(biological response)或封阻该靶标的功能，导致抑制性或促效性细胞活性(inhibitoryor agonistic cellular activity)。本发明的多价抗体的至少一个结合结构域经由一个接头连接至该碱性抗体部分的一个结合结构域。在该碱性抗体部分的该结合结构域是一个Fab结构域的情况下可以采用例如VH-CH1-接头-VH-CH1的型式，其中该接头连接该碱性抗体部分的重链至该至少一个附加的结合结构域(优选为一个Fab结构域)。
另选地，这可以采用，例如，VL-CL-接头-VL-CL的型式，其中该接头连接该碱性抗体部分的轻链至该至少一个附加的结合结构域(优选为一个Fab结构域)。
一个附加的结合结构域，诸如一个Fab结构域，可被连接至该碱性抗体部分的所述结合结构域的每一者，各自经由一个独立的接头。连接所述附加的结合结构域至该碱性抗体部分或附加的结合结构域的该两个或更多个接头可以是相同的或不同的。此外，所述接头可以允许该结合结构域的同源链的配对。
如果本发明的一个抗体包括多于一个接头，那些接头可以是相同的或不同的或者其组合。后者情况的一实施例是在一个多特异性抗体包括3个接头的情况下，它们之中的两个是相同的而第3个则为不同的(有别于另外两个)。
此外，经由一个接头连接至一个碱性抗体部分的一结合结构域的一个结合结构域它本身可以被附接至一个经由此处所述的一个接头而被连接的结合结构域，其中该碱性抗体部分可呈一模块化方式而被延伸(extended)，通过透过一个接头连接至一个附加的结合结构域以及经由一个接头将那个结合结构域连接至一个第二附加的结合结构域，以所述推。
以此方式，本发明的一个抗体也许能够结合3个或更多个表位。因此，本发明的一个多特异抗体也许能够特异性地结合3个或更多个表位。
本发明的一个抗体也许能够结合两个、3个或更多个抗原。本发明的一个多特异抗体也许因此能够特异性地结合两个、3个或更多个抗原。
本发明的一个抗体可包括两个或更多个结合结构域，诸如两个或更多个Fab结构域，它们能够结合至位于一个抗原上的不同表位。
因此，本发明的一个抗体包括至少3个结合结构域，诸如两个或更多个为不同的Fab结构域。
本发明的另一个方面包括多价抗体，其包括至少3个Fab结构域而因此能够结合至3个通常彼此互不同的表位。
本发明的一个抗体可以是多价的。本发明的一个抗体也可以是多特异性的。多价的表示该抗体具有至少3个结合结构域而因此具有至少3个抗原结合位。多特异性表示该抗体能够结合至少两个不同的表位，例如两个不同的抗原或者两个位于相同抗原上的表位。三特异性表示该抗体能够结合三个不同的表位。四特异性表示该抗体能够结合4个不同的表位，以所述推。
本发明的一个抗体可结合坐落在相同分子上的目标表位(target epitopes)。相较于一种当中仅有一个表位被标靶的情况，这可允许该目标分子的(生物)功能的更有效率的抵消(counteraction)。举例来说，本发明的一个抗体可同时地结合至存在于一个抗原细胞上的2个或3个或更多个表位，例如生长因子受体(growth factor receptors)或对于肿瘤细胞要增殖(proliferate)至为关键的可溶性分子(soluble molecules)，而因此有效地封阻导致失控的增殖(uncontrolled proliferation)的数个独立的讯息传递路径(signaling pathways)。
由本发明的至少两个抗体所构成的任何一种组合可同时结合至存在于一个目标分子(诸如一个生长因子受体或可溶性分子)上的2个、3个、4个或更多个表位。
该目标部分(target moiety)可以是一个可溶性分子或者可以是一个膜结合的部分(membrane-bound moiety)或者可以是一个在结合之时内在化(internalizes)的存在于一细胞表面上的部分。
该目标表位可以坐落在不同的部分上，例如位于两个(即两个或更多个目标表位系位于一个第一部分上，而一个或多个目标表位系位于一个第二部分上)或3个不同的部分(即在3个部分的每一者之上有至少一个目标表位)。在这个情况下，所述不同的目标部分的每一者可以是一个可溶性部分或一个膜结合的部分或一个在结合之时内在化的存在于一细胞表面上的部分。在一个实施方案中，所述不同的目标部分是可溶性部分。另选地，至少一个目标部分是一个可溶性部分，而有至少一个目标部分是一个膜结合的部分。在另一个替代方案中，所有的目标部分是膜结合的部分。在一个实施方案中，所述不同的目标部分被表达在相同的细胞上，而在其他实施方案中，所述不同的目标部分被表达在不同的细胞上。
作为一个非限制性示例，本发明的任何一个抗体或者由本发明的一个抗体和一个附加抗体(additional antibody)所构成的任何一个组合也许适合于同时封阻多个膜结合的受体、中和(neutralizing)多个可溶性分子(诸如用于肿瘤细胞的细胞激素或生长因子)或者中和不同的病毒血清型(viral serotypes)或病毒株(viral strains)。
在本发明的一个抗体中，至少一个目标表位可以坐落在一个肿瘤细胞上。另选地，或另外地，至少一个目标表位可以坐落在一个效应子细胞的表面上。这适合于，例如，用于肿瘤细胞杀除的T细胞或NK细胞的招募。举例来说，本发明的一个抗体也许能够通过特异性地结合至一个坐落在免疫效应子细胞上的目标分子来招募免疫效应子细胞，优选为人类免疫效应子细胞。在一个进一步的实施方案中，该免疫效应子细胞在本发明的抗体结合至该目标分子之时被活化。效应子机制中的招募可能涵盖，例如，通过给药一种根据本发明的一方法而被生成的Ig样分子(Ig-like molecule)来复位向免疫调节的细胞毒性(immunemodulated cytotoxicity)，该Ig样分子能够结合至一个细胞毒性触发分子(cytotoxictrigger molecule)[诸如T细胞受体(T cell receptor)或一个Fc γ受体(Fc gammareceptor)]，而因此活化下游免疫效应子途径(downstream immune effector pathways)或免疫效应子细胞。
免疫细胞接合元(Immune cell engagers)
一个多价多聚体，诸如本发明的一个抗体，可以是一个免疫效应子细胞接合元抗体(immune effector cell engager antibody)。也就是说，本发明的多价抗体可以是一个如下之物：包括至少一个结合结构域特异性地结合至一个抗原或一个免疫效应子细胞(诸如一个T细胞)，而且也包括至少一个结合结构域特异性地结合至一个位于一异常细胞(诸如一个癌或肿瘤细胞)上的抗原。
本发明的一个多价多聚体，诸如一个三特异性抗体，可以是一个具有3个结合结构域之物，该3个结合结构域将3个细胞(包括一个肿瘤细胞以及两个免疫效应子细胞)一起聚集在一个接合元复合物(engager complex)中。
本发明的一个多价多聚体，诸如一个三特异性抗体，可进一步是一个具有3个结合结构域之物，该3个结合结构域标靶两个细胞以及一个可溶性分子。
对于被阐述于此的实施方案，该Fc可以是一个野生型Fc，可以根据具有本领域的技术人员所知晓的方式而就ADCC以及Cq1的结合来被增强，或者可以根据具有本领域的技术人员所知晓的方式而就这样的活性来被废除(abrogated)。
这样的免疫细胞接合多价抗体(immune cell engaging multivalentantibodies)的组分(components)可以呈各式各样的构形而相对于彼此来被配置(arranged)。示范性构形被描绘于图1a至1u中。在特定的实施方案中，本发明系针对一种免疫细胞接合多价抗体，其中一个第三结合结构域在该被Fab重链的C-端处被连接至该碱性抗体的一个第一或第二结合结构域的N-端。
在一个实施方案中，一个免疫细胞接合多价抗体包括3个结合结构域，即一个碱性抗体部分以及一个附加的结合结构域，而使得该多价抗体为三特异性。
该碱性抗体部分的所述结合结构域之中的一个可以结合至一个位于一个免疫效应子细胞上的抗原。另选地，该附加的结合结构域可以结合至一个免疫效应子细胞的一个抗原。也就是说，用于一个位于一个免疫效应子细胞上的抗原的结合结构域可以是位于位置1、2或3处，其中这些位置对应于图1a中所示的VH1、VH2和VH3。另选地，在一个共有重链被使用的情况下，用于一个位于一个免疫效应子细胞上的抗原的该结合结构域可以是位于位置1、2或3处，其中这些位置对应于VL1、VL2和VL3，例如，如图1c中所示者。
在本发明的一个免疫效应子细胞接合元抗体中，所述结合结构域之中的至少一者可以特异性地结合至一个位于一异常细胞上的抗原。通常，至少两个结合结构域结合至一个位于一异常细胞上的抗原，通常至少两个结合结构域结合至位于一异常细胞上的两个不同的抗原或者一个抗原上的两个不同表位。在本发明的一个免疫效应子细胞接合元抗体中，两个或更多个结合结构域可以结合相同的靶标(包括抗原和表位)，而另一个结合结构域接合一个免疫效应子细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的多价抗体特异性地结合至于一个位于一个免疫效应子细胞上的抗原，而且也特异性地结合至位于一异常细胞(诸如一肿瘤细胞)上的两个不同的抗原。
在本发明的一个实施方案中，该T细胞接合多价抗体能够同时结合至一个靶细胞抗原(特别是一个肿瘤细胞抗原)以及一个人类T细胞的一表面抗原(surface antigen)。在一个实施方案中，该T细胞接合多价抗体能够同时结合至一个靶细胞抗原(特别是一个肿瘤细胞抗原)以及一个CD3。在一个实施方案中，该T细胞接合多价抗体能够通过同时结合至一个靶细胞抗原和CD3来交联(crosslinking)一个T细胞和一个靶细胞。在另一个实施方案中，该同时的结合导致该靶细胞(特别是一个肿瘤细胞)的裂解。在一个实施方案中，该同时的结合导致T细胞的活化。在其他实施方案中，该同时的结合导致一个T淋巴细胞(Tlymphocyte)(特别是一个细胞毒性T淋巴细胞)的一个选自下列群组中的细胞反应(cellular response)：增殖、分化(differentiation)、细胞激素分泌(cytokinesecretion)、细胞毒性效应子分子释放(cytotoxic effector molecule release)、细胞毒性活性(cytotoxic activity)以及活化标记(activation markers)的表达。在一个实施方案中，将T细胞接合多肽(T cell engaging polypeptide)结合至CD3而没有同时结合至该靶细胞抗原不会导致T细胞活化，在那样的情况下，例如，剩余的结合结构域不结合一个肿瘤细胞抗原。
在一个实施方案中，该T细胞接合多价抗体能够复位向一个T细胞的细胞毒性活性至一个靶细胞。在一个实施方案中，该复位向不依赖于该靶细胞的MHC-介导的肽抗原呈现(MHC-mediated peptide antigen presentation)和/或T细胞的特异性。在一个实施方案中，该T细胞是一个细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，该T细胞是一个CD4+或一个CD8+ T细胞。在另一个实施方案中，该T细胞是一个CD8+ T细胞。
本发明的T细胞接合多价抗体包括至少一个能够结合至一个人类T细胞的一表面抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，该结合结构域结合CD3(在此还被称之为一个“CD3抗原结合结构域”)。
術語“CD3[分化簇团3(cluster of differentiation 3)]”意指一种蛋白质复合物(protein complex)，它系由一个CD3γ链(SwissProt P09693)、一个CD3δ链(SwissProtP04234)、一个CD3ε链(SwissProt P07766)以及一个CD3ζ链同质二聚体(CD3 zeta chainhomodimer)(SwissProt P20963)所构成。CD3ε系以各种不同的别名(aliases)而闻名，之中有一些为：“CD3e分子，ε(Epsilon)(CD3-TCR复合物)”；“CD3e抗原，ε多肽(TiT3复合物)”；T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链；T3E；T细胞抗原受体复合物，T3的ε次单位(epsilon subunit)；CD3e抗原；CD3-ε3；IMD18；TCRE。关于CD3E基因的识别号码(Ids)是HGNC：1674；EntrezGene：916；Ensembl：ENSG00000198851；0MIM：186830；以及UniProtKB：P07766。这些链与该T细胞受体(TCR)和该ζ-链(ζ-chain)联合(associate)以形成一个TCR复合物，该TCR复合物在有丝分裂讯息传递(mitogenic signaling)之时可在T淋巴细胞内产生一个活化讯息(activation signal)。CD3被表达在T细胞和NK T细胞上。在CD3于此处被提到的情况下，所指的是人类CD3，除非另有特别说明。
在一个特别的实施方案中，该T细胞接合多肽包括不多于一个结合结构域能够特异性地结合至CD3。在一个实施方案中，该T细胞接合多肽提供对CD3的单价结合(monovalent binding)。在一个实施方案中，该T细胞接合多肽包括一由结合CD3的结合结构域所构成的超级簇团的一成员。一个“超级簇团”在此被使用于意指具有被允许(tolerated)的氨基酸变化的可变区，例如，相对于重链可变区(包括本发明的一个VH或VL和/或它里面的CDR)，而不会失去对特定抗原的结合特异性。更具体地，一个“超级簇团”是一群克隆体(clones)，它们共享相同的VH V基因使用并且具有在HCDR3中至少70％的序列同一性以及相同的HCDR3长度。一个超级簇团中的克隆体被预期可能以不同的亲和力和/或位于表位上的不同位置来结合相同的抗原。
CD3结合结构域可涉及亲和力、表位和其他特征。可结合CD3的一个细胞外部分(extracellular part)的特异性可变结构域是包括以下的可变结构域：MF8057、MF8058、MF8078和这个超级簇团的可变区、MF8397和这个超级簇团的可变区、MF8508和这个超级簇团的可变区、MF9249以及MF9267和这个超级簇团的可变区的VH的氨基酸序列。
CD3抗原结合结构域包括至少一个选自由MF8057、MF8058、MF8078和这个超级簇团的可变区、MF8397和这个超级簇团的可变区、MF8508和这个超级簇团的可变区、MF9249以及MF9267和这个超级簇团的可变区的VH(SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、SEQID NO：124、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：99、SEQID NO：108、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：144和/或SEQ IDNO：153)所构成的群组中的重链互补决定区(CDR)，以及至少一个选自由SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256所构成的群组中的轻链CDR。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：142的重链CDR1，具有SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：134、SEQ IDNO：143或SEQ ID NO：152的重链CDR2，具有SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：144或SEQ ID NO：153的重链CDR3，具有SEQ IDNO：254的轻链CDR1，具有SEQ ID NO：255的轻链CDR2，以及具有SEQ ID NO：256的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合结构域包括一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自由SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：118、SEQID NO：127、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：154所构成的群组中的氨基酸序列的重链可变区序列，以及一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40所构成的群组中的氨基酸序列的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：154的重链可变区，以及包括具有SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链可变区。
位于该多价抗体中的结合结构域的位置可以被限定。当该碱性抗体的结合或可变结构域被称为结合结构域1和2之时，该附加的一个或多个结合结构域可被称为结合结构域3、4等等。一个结合结构域还被称之为BD。BD3可以被连接至BD1或BD2。当BD3被连接至BD1和BD2之中的一者之时，BD4(当存在之时)被连接至BD1和BD2之中的另一者。
本发明的T细胞接合多价抗体包括至少两个能够结合至一个靶细胞抗原的抗原结合结构域(在此还被称之为一个“靶细胞抗原结合结构域”或“第二”或“第三”抗原结合结构域)。在某些实施方案中，该T细胞接合多价抗体包括两个能够结合至一个靶细胞抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，这些抗原结合结构域的每一者特异性地结合至相同的抗原决定位。在另一个实施方案中，所述靶细胞抗原结合结构域是相同的。在一个实施方案中，该T细胞接合元多肽包括不多于两个能够结合至一个靶细胞抗原的靶细胞抗原结合结构域。
在一个实施方案中，该多价抗体包括一个BD1为一个CD3结合结构域，一个BD2为一个结合一个第一靶细胞抗原(被进一步称为TA1)的结合结构域，以及一个BD3为一个结合一个第二靶细胞抗原(被进一步称为TA2)的结合结构域。在这个实施方案中，BD3可以被连接至BD1或BD2。在一个实施方案中，该结合TA2的BD3被连接至该结合CD3的BD1。在另一个实施方案中，该结合TA2的BD3被连接至该结合TA1的BD2。
在一个实施方案中，该多价抗体包括一个结合TA1的BD1、一个结合TA2的BD2以及一个结合CD3的BD3。在这个实施方案中，BD3可被连接至BD1或BD2。在一个实施方案中，该结合CD3的BD3被连接至该结合TA1的BD1。在另一个实施方案中，该结合CD3的BD3被连接至该结合TA2的BD2。
在一个实施方案中，本发明提供一种多价抗体，其中该碱性抗体包括结合结构域1和2(BD1和BD2)，并且其中该附加的结合结构域3(BD3)被连接至该结合结构域1(BD1)，并且其中一个选择性附加的结合结构域4(BD4)被连接至该结合结构域2(BD2)。在一个实施方案中，结合结构域1是一个CD3结合结构域，而结合结构域2和3结合至不同的靶细胞抗原。在另一个实施方案中，结合结构域2是一个CD3结合结构域，而结合结构域1和3结合至不同的靶细胞抗原。在一个进一步的实施方案中，结合结构域3是一个CD3结合结构域，而结合结构域1和2结合至不同的靶细胞抗原。
在一个优选实施方案中，该多价抗体包括一个结合另外一种不同的靶细胞抗原的结合结构域4。
本发明进一步提供一种如此处所述的多价抗体，其中该碱性抗体包括结合结构域1和2，并且其中该附加的结合结构域3被连接至该结合结构域1，并且其中一个选择性附加的结合结构域4被连接至该结合结构域2。在一个实施方案中，结合结构域1是一个CD3结合结构域，而结合结构域2和3结合至不同的靶细胞抗原。在另一个实施方案中，结合结构域2是一个CD3结合结构域，而结合结构域1和3结合至不同的靶细胞抗原。在一个进一步的实施方案中，结合结构域3是一个CD3结合结构域，而结合结构域l和2结合至不同的靶细胞抗原。
当包括一个结合结构域4之时，该结构域优选地结合另外一种不同的靶细胞抗原。
在一个实施方案中，一个第一靶细胞抗原结合结构域结合PD-L1、EGFR、CD137、CLEC12A、纤维蛋白原或甲状腺球蛋白。在一个实施方案中，一个第一和一个第二靶细胞抗原结合结构域结合选自PD-L1、EGFR、CD137、CLEC12A、纤维蛋白原和甲状腺球蛋白之中的抗原。该第一和该第二靶细胞结合结构域优选地结合不同的抗原。
一个CD3结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，它们带有MF8057或MF8058或MF8078或MF8397或MF8508或MF9249或MF9267的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。该CD3结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区带有MF8057或MF8058或MF8078或MF8397或MF8508或MF9249或MF9267的VH的氨基酸序列，且在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
一个靶细胞抗原结合结构域可以是一个PD-L1结合结构域。如果存在的话，该PD-L1结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，它们带有MF5377或MF5444或MF5380的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。该PD-L1结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区带有MF5377或MF5444或MF5380的VH的氨基酸序列，且在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
一个靶细胞抗原结合结构域可以是一个EGFR结合结构域。如果存在的话，该EGFR结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，它们带有MF8233或MF9891或MF9886或MF9873或MF9988的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。该EGFR结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区带有MF8233或MF9891或MF9886或MF9873或MF9988的VH的氨基酸序列，且在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
一个靶细胞抗原结合结构域可以是一个CLEC12A结合结构域。如果存在的话，该CLEC12A结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，它们带有MF4327的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。该CLEC12A结合结构域优选地包括重链可变区，所述重链可变区带有MF4327的VH的氨基酸序列，且在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
在一个实施方案中，该多价抗体包括一个CD3结合结构域、一个EGFR结合结构域以及一个PD-L1结合结构域。
带有被指示的重链可变区的结合结构域包括一个轻链可变区。该轻链可变区优选地包括一个CDR1、CDR2和CDR3区，其包括氨基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP，即IGKV1-39(根据IMGT)的CDRs。氨基酸变化、插入、缺失、取代、添加或其组合优选地不是位于该轻链可变区的CDR3区内，优选地不是位于该轻链可变区的CDR1或CDR2区内。在一个优选实施方案中，该轻链可变区相对于该被指示的序列不包括一个缺失、添加或插入。在这个实施方案中，该轻链可变区相对于该被指示的序列可具有0至5个氨基酸取代。一个氨基酸取代优选地是一个守恒的氨基酸取代。本发明的一个抗体的一轻链的CDR1、CDR2和CDR3优选地分别包括氨基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP，即IGKV1-39(根据IMGT)的CDRs，如本文中其他地方所述。带有被指示的重链可变区的结合结构域的轻链优选地全部都包括相同的轻链。优选为一个如本文中其他地方所限定的共有轻链。
氨基酸插入、缺失、取代、添加或这些的组合优选地不是位于该重链可变区的CDR3区内，优选地不是位于该重链可变区的CDR1和/或CDR2区内。在一个优选实施方案中，该重链可变区相对于该被指示的序列不包括一个缺失、添加或插入。在一个实施方案中，该重链可变区相对于该被指示的序列可具有0-10个(优选为0-5个)氨基酸取代。在一个优选实施方案中，该重链可变区相对于该被指示的序列包括0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个(优选为0-3个、优选为0-2个、优选为0-1个、优选为0个)氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合位于非为所述CDRs处。如果被排比的序列在不多于10个(优选为不多于5个)位置处有差异，一个插入、添加、缺失或取代的一组合是一个如所请求(as claimed)的组合。位于被排比的序列之中的一者内的一个空位计数为(counts for)是跟在另一个序列中被跳过(skipped)的一样多的氨基酸。一个氨基酸取代，如果有的话，优选地是一个守恒的氨基酸取代。
在一个实施方案中，该靶细胞抗原结合结构域是一个Fab分子。在一个实施方案中，该靶细胞抗原结合结构域是一个Fab分子，它结合至一个特异性抗原决定位而且能够引导该T细胞接合多价抗体至一个目标地址(target site)，例如至一个带有该抗原决定位的特定类型(specific type)的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，该靶细胞抗原结合结构域特异性地结合计划性细胞死亡1蛋白质(Programmed Cell Death 1 protein，PD-L1)，优选为人类PD-L1(SEQ ID NO：257)。
PD-L1是一种第一型跨膜蛋白质(type 1 transmembrane protein)，它在特定事件(particular events)[诸如妊娠(pregnancy)、组织同种异体移植(tissueallografts)，自体免疫疾病(autoimmune disease)以及其他诸如肝炎(hepatitis)的疾病状态(disease states)]期间当中扮演一个压制(suppressing)一免疫反应的角色。PD-L1对PD-1或B7.1(CD80)的结合传送(transmits)一个降低PD-1表达T细胞(PD-1 expressingT cells)的增殖的抑制讯息(inhibitory signal)。PD-1被认为系能够经由细胞凋亡(apoptosis)来控制外来抗原特异性T细胞(foreign antigen specific T cells)的蓄积(accumulation)。PD-L1被各式各样的癌细胞所表达，而它的表达被认为是至少部分地负责一种对抗该癌细胞的免疫反应的一减弱(dampening)。PD-L1是B7蛋白家族(B7-family ofproteins)的一个成员，并以各式各样的其他名称而闻名，诸如CD274分子；CD274抗原；B7同源物1(B7 Homolog 1)；PDCD1配位基1(PDCD1 Ligand 1)；PDCD1LG1；PDCD1L1；B7H1；PDL1；计划性细胞死亡1配位基1(Programmed Cell Death 1 Ligand 1)；计划性死亡配位基1(Programmed Death Ligand 1)；B7-H1；以及B7-H。关于CD274的外部识别号码(externalIds)是HGNC：17635；Entrez Gene：29126；Ensembl：ENSG00000120217；OMIM：605402；UniProtKB：Q9NZQ7。
该PD-L1结合结构域可以在亲和力、表位和其他特征上有个范围。可结合PD-L1的一个细胞外部分的特异性可变结构域是包括MF5377、MF5444或MF5380的VH的氨基酸序列的可变结构域。
该PD-L1抗原结合结构域包括至少一个选自由SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：162、SEQ IDNO：171和SEQ ID NO：180的VH所构成的群组中的重链CDR，以及至少一个选自由SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255和SEQ ID NO：256所构成的群组中的轻链CDR。
在一个实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：160、SEQ IDNO：169或SEQ ID NO：178的重链CDR1，具有SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：170或SEQ ID NO：179的重链CDR2，具有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：180的重链CDR3，具有SEQ ID NO：254的轻链CDR1，具有SEQ ID NO：255的轻链CDR2，以及具有SEQ ID NO：256的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域包括一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自由SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：181所构成的群组中的氨基酸序列的重链可变区序列，以及一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40所构成的群组中的氨基酸序列的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：163、SEQ IDNO：172或SEQ ID NO：181的重链可变区，以及包括具有SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域包括含有就下列而被公开的氨基酸序列的PD-L1抗体的重链和轻链可变区：MPDL3280A、RG7446，参见US 2010/0203056 A1；MEDI-4736，参见WO 2011/066389；MSB-0010718C，参见WO 2013/079174；STI-1014，参见WO2013/181634；CX-072，参见WO 2016/149201；KN035，参见Zhang et al.，Cell Discov.7：3(March 2017)；LY3300054，参见，例如WO 2017/034916；以及CK-301，参见Gorelik et al.，AACR：Abstract 4606(Apr 2016)；以及12A4或MDX-1105，参见，例如WO 2013/173223。
在某些实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域与下列PD-L1抗体的重链和轻链可变区结合相同的表位：MPDL3280A、RG7446，参见US 2010/0203056 A1；MEDI-4736，参见WO2011/066389；MSB-0010718C，参见WO 2013/079174；STI-1014，参见WO 2013/181634；CX-072，参见WO 2016/149201；KN035，参见Zhang et al.，Cell DisGov.7：3(March 2017)；LY3300054，参见，例如WO 2017/034916；以及CK-301，参见Gorelik et al.，AACR：Abstract4606(Apr 2016)；以及12A4或MDX-1105，参见，例如WO 2013/173223。
在某些实施方案中，该PD-L1抗原结合结构域与下列PD-L1抗体的重链和轻链可变区竞争(competes)对于PD-L1的结合：MPDL3280A、RG7446，参见US 2010/0203056 A1；MEDI-4736，参见WO 2011/066389；MSB-0010718C，参见WO 2013/079174；STI-1014，参见WO 2013/181634；CX-072，参见WO 2016/149201；KN035，参见Zhang etal.，Cell Discov.7：3(March2017)；LY3300054，参见，例如WO 2017/034916；以及CK-301，参见Gorelik et al.，AACR：Abstract 4606(Apr 2016)；以及12A4或MDX-1105，参见，例如WO 2013/173223。
在某些实施方案中，该靶细胞抗原结合结构域特异性地结合人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)(SEQ ID NO：258)。“ErbB1”或“EGFR”是一个具有4个受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)(被命名为Her-或cErbB-1、-2、-3和-4)的家族的一成员。该EGFR具有一个细胞外结构域(extracellular domain，ECD)系由4个次结构域(sub-domains)所构成，之中的两个涉及到配位基结合(ligandbinding)，以及之中的一个涉及到同质二聚体化(homo-dimerisation)和异二聚体化。被使用于此节中的参考编号(reference numbers)是指在标题为“被引述于说明书中的参考文献(References cited in the specification)”的列表之中的参考文献的编号。EGFR整合(integrates)来自各式各样的配位基的细胞外讯息(extracellular signals)以产生互异的细胞内反应(diverse intracellular responses)。由EGFR所活化的主要讯息传导路径(major signal transduction pathway)系由Ras-促分裂原活化蛋白激酶(Ras-mitogen-activated protein kinase，MAPK)有丝分裂讯息传递级联反应(mitogenic signallingcascade)所构成。这个路径的活化是通过招募Grb2至酪氨酸磷酸化的EGFR(tyrosinephosphorylated EGFR)而被起动(initiated)。这导致Ras经由Grb2-结合的Ras-鸟嘌呤核苷酸交换因子(Grb2-bound Ras-guanine nucleotide exchange factor)无七的子(Sonof Sevenless，SOS)的活化。此外，PI3-激酶-Akt讯息传导路径(PI3-kinase-Akt signaltransduction pathway)还为EGFR所活化，虽然这个活化在有Her3的共表达(co-expression)的情况下是更加强烈的。EGFR牵涉到数种人类上皮恶性肿瘤(humanepithelial malignancies)，特别是乳癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、头颈癌和脑癌。活化基因中的突变已被发现，此外该受体和它的配位基的过度表达(over-expression)引起自体分泌活化图(autocrine activation loops)。这个RTK因此已被广泛使用作癌症治疗(cancer therapy)的靶标。标靶该RTK的小型分子抑制剂(small-moleculeinhibitors)以及针对细胞外配位基-结合结构域的单株抗体(monoclonal antibodies，mAbs)这两者已经被发展并且迄今已显示了几个临床成功，尽管大多数是对于一选定群组的病患。一个有关于该人类EGFR蛋白质以及编码它的基因的数据库登录编号(databaseaccession number)是(GenBank NM_005228.3)。该登录编号被给予主要是要提供一个进一步的方法来识别作为一个靶标的EGFR蛋白质，被一个抗体结合的EGFR蛋白质的实际序列(actual sequence)可能有变化，例如，因为该编码基因的内的一个突变(诸如发生在某些癌症中的那些)，诸如所述。除非另有说明，当在此处提到EGFR之时，所指的是人类EGFR。结合EGFR的抗原结合位结合EGFR以及它的各式各样的变异体，诸如被表达在某些EGFR阳性肿瘤(EGFR positive tumors)上的那些。
该EGFR结合结构域可以在亲和力、表位和其他特征上有个范围。可结合EGFR的一个细胞外部分的特异性可变结构域是包括MF8233、MF9891、MF9886、MF9873、MF9988的VH的氨基酸序列的可变结构域。
该EGFR抗原结合结构域包括至少一个选自由SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：196、SEQID NO：205、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：207、SEQID NO：216和SEQ ID NO：225所构成的群组中的重链CDR，以及至少一个选自由SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256所构成的群组中的轻链CDR。
在一个实施方案中，该EGFR抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：214或SEQ ID NO：223的重链CDR1，具有SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：215或SEQ ID NO：224的重链CDR2，具有SEQ IDNO：189、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：216或SEQ ID NO：225的重链CDR3，具有SEQ ID NO：254的轻链CDR1，具有SEQ ID NO：255的轻链CDR2，以及具有SEQ ID NO：256的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该EGFR抗原结合结构域包括一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自由SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：217以及SEQ ID NO：226所构成的群组中的氨基酸序列的重链可变区序列，以及一个系至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同于一个选自SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40所构成的群组中的氨基酸序列的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，该EGFR抗原结合结构域包括具有SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：226的重链可变区，以及包括具有SEQ IDNO：37或SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，该EGFR抗原结合结构域包括EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)[C225，
Lilly]或帕尼单抗(panitumumab)[维克替比(Vectibix)，Amgen]的重链和轻链可变区。
在某些实施方案中，该EGFR抗原结合结构域与该EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)[C225，
Lilly]或帕尼单抗(panitumumab)[维克替比(Vectibix)，Amgen]的重链和轻链可变区结合相同的表位。
在某些实施方案中，该EGFR抗原结合结构域与该EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)[C225，
Lilly]或帕尼单抗(panitumumab)[维克替比(Vectibix)，Amgen]的重链和轻链可变区竞争对于EGFR的结合。
共有可变区
本发明的多价抗体优选地在该3个或更多个结合结构域的每一者处使用一个共有链。如所述，本发明的多价抗体的碱性抗体部分优选地具有一个结合一个抗原的第一重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合，以及一个结合一第二个抗原的第二VH/VL组合。被连接至该碱性抗体部分的每个附加的结合结构域也可以包括一个附加的VH/VL组合(结合位于一个抗原上的一个进一步的表位)。
本发明的一个碱性抗体部分优选地包括两个重链(一者或两者包括一个或多个附加的CH1和VH结构域)以及一个与各个CH1和VH结构域配对的轻链。优选地该两个重链具有兼容的异二聚体化结构域(compatible heterodimerization domains)，而且优选地该轻链是一个共有轻链。另选地，本发明的多价抗体的碱性抗体部分包括两个轻链(一者或两者包括一个或多个附加的CL和VL结构域)以及一个与各个CL和VL结构域配对的重链可变区，而该重链可变区包括一个共有重链可变区。
在本发明的实施方案包括一个包括一个共有轻链的多价抗体的情况下，其中该轻链系在一个包括了编码两个或更多个重链可变区的DNA的宿主细胞的内被表达，该轻链能够和各个可用的重链(或CH1-VH1区)配对，而因此形成至少3个功能性抗原结合结构域。
一个功能性抗原结合结构域能够特异性地结合至一个位于一个抗原上的表位。优选地，一个被使用于本发明的多价抗体中的共有轻链能够与利用一个根据本发明的方法而被生成的所有重链(或CH1-VH1区)来配对，而因此形成功能性抗原结合结构域，而使得不匹配的重链和轻链的错配被避免或者在一要比该多价抗体明显更低的比例下被生成。
本发明的一个优选方面是：本发明的多价抗体具有一个共有轻链(可变区)，它可与一系列的重链可变区组合以形成一个具有功能性抗原结合结构域的抗体(WO 2004/009618、WO 2009/157771)。
一个供应用于本发明的多价抗体的共有轻链(可变区)优选地是一个人类轻链(可变区)。一个共有轻链(可变区)优选地具有一个种系序列。一个优选的种系序列是一个轻链可变区，它经常在人类库(human repertoire)中被使用并且具有良好的热力学稳定性(thermodynamic stability)、产率(yield)和可溶性(solubility)。一个优选的种系轻链是012。一个共有轻链优选地是重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(图11A；SEQID NO：35)。该共有轻链可变区优选地是该重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(图11A；SEQ ID NO：35)的可变区。一个共有轻链优选地包括一个如图11B或8D(分别为SEQID NO：37或40)中所描绘的轻链可变区，带有0-5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。该共有轻链优选地进一步包括一个轻链恒定区，优选为一个κ轻链恒定区。一个编码该共有轻链的核酸可以就被用来表达该共有轻链蛋白质的细胞系统而被密码子优化(codonoptimized)。该编码核酸可以偏离(deviate from)一个种系核酸序列。
供应用于本发明的多价抗体的共有轻链(可变区)可以是一个λ轻链，而这因此还被提供在本发明之上下文中，但是一个κ轻链被偏好。本发明的共有轻链可以包括一个或一个λ轻链的一恒定区。它优选地是一个κ轻链的一恒定区，优选地其中该共有轻链是一个种系轻链，优选为一个包括IgVκ1-39基因节段(gene segment)的重排的种系人类κ轻链，例如重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(图11)。术语重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGκJ1、huVκ1-39轻链或简而言的huVκ1-39，或简单地1-39在整个申请案中被互换地使用。那些熟习本领域的技术人员将会认知：“共有”也意指具有不是相同的氨基酸序列的轻链的功能等效物(functional equivalents)。有许多该轻链的变异体存在，其中不会实质地影响功能性结合区的形成的突变(缺失、取代、添加)是存在的。
IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39Gene)的缩写。该基因还被称为免疫球蛋白κ可变1-39、IGKV139、IGKV1-39、012a或012。关于该基因的外部识别号码是HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。关于IgVκ1-39的一优选的氨基酸序列被给予在图11中。这列示了V-区的序列。该V-区可以被组合以5个J-区(J-regions)之中的一者。图11描述两个关于IgVκ1-39与一个J-区组合的优选序列。被连接的序列被表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5；替代名称(alternativenames)是IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01[根据位于imgt.org的IMGT数据库全球网站(IMGT database worldwide web)的命名(nomenclature)]。
一个共有轻链可变区优选地被连接至一个κ轻链恒定区。在一个优选实施方案中，被使用于本发明的多价抗体中的轻链可变区包括κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选实施方案中，位于该多价抗体中的共有轻链是IgVκ1-39*01/IGJκl*01。
一个生成一共有轻链的细胞可以生成，例如，重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01以及一个包括所提到的轻链的可变区被融合(fused)至一个λ恒定区的轻链。在此处一个种系序列被提到的情况下，被偏好的是：该可变区是一个种系序列。
一个供应用于本发明的多价抗体中的优选共有轻链是一个包括被阐述于SEQ IDNO：29中的序列之物。
供应用于本发明的多价抗体中的共有链也可以是一个重链，而这因此还被提供于本发明之上下文中。共有重链在本技术领域中已经被用来制造双特异性抗体，而在此可被用于制造一种包括3个或更多个结合结构域的多价抗体，所述结合结构域之中的两个或更多个包括一个本技术领域中已知的共有重链。举例来说，使用抗体库，其中该重链可变结构域对于所有的库内成员是相同的，而因此多样性是根据该轻链可变结构域。这样的抗体库被描述于，例如，PCT/US2010/035619以及PCT/US2010/057780，它们之中的每一者以其整体在此被并入本案以作为参考。用于产生具有共有重链的结合结构域的这些以及其他技术可以由熟习此艺者来产生并且可以在本发明中被使用，以生成具有此处所公开的新颖型式的多价抗体。
多价抗体的生成
本发明的多价抗体可以通过单个细胞(individual cells)利用一个或多个基因构建体(genetic constructs)的共转染(co-transfection)而被产生，该一个或多个基因构建体一起编码3个或更多个蛋白质，这些蛋白质形成一个包括该多价抗体(诸如上面所描述的那些，包括图1a-u的内者)的多聚体。举例来说，一个宿主细胞可以被共转染以编码3个或更多个重链可变区和一个共有轻链可变区的核酸，以生成多价抗体。另选地，本发明的多价抗体可以通过单个细胞利用一个或多个基因构建体的共转染而被产生，该一个或多个基因构建体一起编码3个或更多个轻链可变区以及一个共有重链。
几个有利于为异二聚体(heterodimers)的抗体的生成的方法已被发表。在本发明中，被偏好的是：细胞有利于异二聚体的生成胜过个别的同质二聚体的生成。这通常系通过修饰所述重链的恒定区来被达成，而使得它们有利于异二聚体化(即一种重链组合以一个第二重链的二聚体化)胜过同质二聚体化(homodimerization)。在一个优选实施方案中，本发明的抗体包括两个不同的免疫球蛋白重链带有相容的异二聚体化结构域。
所述相容的异二聚体化结构域优选地为相容的免疫球蛋白重链CH3异二聚体化结构域。当野生型CH3结构域被使用之时，两个不同的重链(A和B)以及一个共有轻链的共表达将会导致3个不同的抗体物种类，AA、AB和BB。AA和BB是用于该两个同质二聚体抗体的称号，而AB是用于该异二聚体抗体的称号。为了提高所欲的异二聚体产物(AB)的百分比，CH3工程化可以被采用，或者换句话说，可以使用如下面所限定的带有兼容的异二聚体化结构域的重链。本技术领域描述了各种不同的方式，其中这样的重链的异二聚体化可以被达成。
如此处所用的术语“相容的异二聚体化结构域”意指蛋白质结构域，它们被工程化而使得被工程化的结构域A’会与被工程化的结构域B’优先地形成异二聚体，反之亦然，而A’-A’和B’-B’之间的同质二聚体化被减少(diminished)。
在US13/866,747(现已获准领证为US 9,248,181)、US14/081,848(现已获准领证为US 9,358,286)、WO 2013/157953以及WO 2013/157954中，使用兼容的异二聚化结构域来生成多价抗体的方法和手段(means)被公开。这些方法和手段也可以在本发明中被有利地采用。具体地，本发明的一个抗体优选地包括突变以生成基本上只有双特异性全长的IgG分子。优选的突变为位于该第一CH3结构域中的氨基酸取代L351K和T366K[EU编号(EUnumbering)]或者位于与的对应的位置(“KK-变异体”的重链)处的氨基酸取代，以及位于第二结构域中的氨基酸取代L351D和L368E或者位于与的对应的位置(“DE-变异体”的重链)处的氨基酸取代，反之亦然。先前在我们的美国9,248,181和9,358,286专利以及WO 2013/157954 PCT申请案中证明了DE-变异体和KK-变异体优先地配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。DE-变异体重链的同质二聚体化(DE-DE同质二聚体)或KK-变异体重链的同质二聚体化(KK-KK同质二聚体)由于位于相同重链之间的CH3-CH3接口中的带电荷残基之间的排斥(repulsion)而几乎不会发生。
在本发明的一个能够表达会多聚体化以形成多价抗体的蛋白质的优选宿主细胞中，该宿主细胞系以一个编码3个蛋白质的核酸来被转形。依序地从N-端至C-端，被编码的蛋白质包括一个第一蛋白质，其包括VH1-CH1-VH2-CH1-CH2-CH3，其中一个接头连接位于该第一蛋白质上的VH2和CH1；一个第二被编码的蛋白质，其包括VLc-CL；一个第三被编码的蛋白质，其包括VH3-CH1-CH2-CH3，其中该第一和第三被编码的蛋白质的CH1与该第二被编码的蛋白质的CL配对，而该第一和第三蛋白质的被编码的CH3区编码位于该第一CH3蛋白质中的氨基酸L351K和T366K(EU编号)或者位于与的对应的位置处的氨基酸以及位于该第三蛋白质中的氨基酸L351D和L368E或者位于与的对应的位置处的氨基酸，反之亦然。另选地，该第一和第三蛋白质包括造成这些蛋白质的每一者的CH3结构域的有效配对的其他兼容的异二聚体化结构域。
编码该3个蛋白质的所述核酸可以是位于一个或多个媒介物上，以产生本发明的多价抗体。同样地，对于上面所述的多价抗体的每一者(包括图1a-1u的内者)，编码多于3个蛋白质的宿主细胞可以被产生。
编码该3个蛋白质的所述核酸可进一步被稳定地整合至宿主细胞的基因体的内，优选地系在已知为高度表达而且不存在有或者是减少的基因缄默化的染色体区域处。
根据本发明，因此被提供的是一种用于多价抗体的制备的方法，该方法包括：
提供一种包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为一个根据本发明的多价抗体；以及
在用于提供所述多肽的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养该宿主细胞。
根据总表达的免疫球蛋白，本发明的一个宿主细胞也许能够在一为至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％的本发明的多价抗体的纯度下来生成该多价抗体。
本发明的一个宿主细胞也许能够生成该多价抗体，其中至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％的被生成的该多价抗体包括一个可变重排区(variable rearranged region)被配对以一个用于所有的结合地址的同源共有链(cognate common chain)。
本发明的一个宿主细胞也许能够生成该多价抗体，其中至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％的被表达的共有链被配对至该多价抗体而因此没有游离的、未相联的蛋白质(free，unassociatedprotein)。
用于抗体生成的合适的系包为一种融合瘤细胞(hybridoma cell)、一种中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、一种NS0细胞或一种PER-C6细胞。在一个特别的优选实施方案中，该细胞是一种CHO细胞。用于此处所公开的一种抗体的生成的细胞在此还被称之为宿主细胞。
各种不同的机构和公司已开发展出用于抗体[例如用于临床应用(clinicaluse)]的大规模生产(large scale production)的细胞系(cell lines)。这样的细胞系的非限制性实施例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。这些细胞中的至少某一些也被使用于其他目的，诸如蛋白质的生成。為了蛋白质和抗体的工业规模生产(industrial scaleproduction)而被发展出的细胞系在此进一步被称为工业细胞系(industrial celllines)。在一个较佳具体例中，本发明提供一种生成本发明的一抗体的工业细胞系。
本发明在一个具体例中提供一种细胞(宿主细胞)包括一根据本发明的抗体和/或一根据本发明的核酸。该细胞优选的是一动物细胞，更优选为一哺乳动物细胞，更优选为一灵长类动物细胞(primate cell)，最佳为一人类细胞。为了本发明的目的，一个合适的细胞、合适的宿主细胞为任何一种能够包括而且优选地生成一种根据本发明的抗体和/或一种根据本发明的核酸的细胞。
本发明进一步提供一种细胞包括一根据本发明的抗体。优选地该细胞[通常是一活体外(in vitro)、分离的(isolated)或重组型(recombinant)细胞]生成该抗体。在一个优选具体例中，该细胞是一种融合瘤细胞、一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、一种NS0细胞或一种PER.C6细胞。在一个特别的优选具体例中，该细胞是一种CHO细胞。进一步被提供的是一种细胞培养物(cell culture)包括一种根据本发明的细胞。各种不同的机构和公司已开发展出用于抗体(例如用于临床应用)的大规模生产的细胞系。这样的细胞系的非限制性实施例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。这些细胞也被使用于其他目的，诸如蛋白质的生成。為了蛋白质和抗体的工业规模生产而被发展出的细胞系在此进一步被称为工业细胞系。因此在一个优选具体例中，本发明提供一种为了抗体的大规模生产而被发展出的细胞系用于生成本发明的一抗体的使用。本发明进一步提供一种用于生成多价抗体的细胞，该细胞包括一个或多个核酸分子单独地或者一起编码一个如所请求的多价抗体。
本发明还提供一种用于通过相同细胞来生成两个或更多个抗体的方法，其中所述抗体之中的至少一者是一个如此处所请求的多价抗体。这个实施方案现在通过先前所述的DE/KK异二聚体化系统来被例证。但是，本发明不受限于一个用于实现(enabling)重链的异二聚化的特定方法。如先前所述的，该DE-变异体和KK-变异体优先地配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”双/多价分子)。DE-变异体重链的同质二聚体化(DE-DE同质二聚体)或KK-变异体重链的同质二聚体化(KK-KK同质二聚体)由于位于相同重链之间的CH3-CH3接口中的带电荷残基之间的排斥而几乎不会发生。引入具有DE-或KK-变异体重链的另外一个重链允许另外一个DEKK双/多价分子的生成。一个新引入的DE-重链(DE2)可与现有的KK重链相联。该细胞因此生成两个双/多价抗体，一个DE1KK以及一个DE2KK双价抗体。如果一个新的KK重链(KK2)而非该新的DE重链被引入，具有DEKK1和DEKK2组合的双价抗体(bivalentantibodies)被生成。不同的抗体可被该细胞所生成的水平通常通过调整DE1/2和KK1/2链相对于彼此的相对表达(relative expression)而被最佳地调整。轻链通常被充分地生成以降低单一重链的水平，而一个链被生成的水平通常系足以允许与互补链(complementarychains)的有效配对。在DE1/2；KK的实施例中，该DE1和DE2重链优选地被生成至一个水平，其一起匹配该KK重链的水平。个别抗体的水平可以通过调整该DE1和DE2相对于彼此而被生成的水平来被调整。就该KK1/2DE变异体而言，情况当然是类似的，但现在是针对相对于彼此的KK1和KK2链。取决于与所述重链的每一者相联的结合结构域和可变结构域的数目而定，这个方法允许各式各样的不同双/多价抗体的生成。几个非限制性示例现在在此被说明。在这个实施例中，重链DE1具有一个重链可变区，其与共同于所有的结合结构域的轻链形成一个结合抗原V的结合结构域或可变结构域；重链DE2具有两个重链可变区，其与该共有轻链一起形成两个结合抗原W和X的结合结构域或可变结构域。重链KK具有一个重链可变区与该共有轻链一起形成一个结合抗原Y的结合结构域或可变结构域。在一个细胞内生成这些重链和轻链将会生成一个抗体DE1KK和一个抗体DE2KK，其中抗体DE1KK是一个结合抗原V和Y的双价抗体。抗体DE2KK是一个结合抗原W、X和Y的多价抗体。如果在上面的实施例中，DE1也具有两个重链可变区与该共有轻链一起形成两个结合结构域或可变结构域，两个本发明的多价抗体被生成。该KK重链也可被提供以一个附加的重链可变区，而因此添加具有相同或不同抗原结合特异性的其他另外的结合结构域。两个或更多个不同的异二聚体化结构域(诸如上面所述的DE/KK)与孔中钮结构域(knob in hole domains)的组合可以进一步在寡株抗体生成(oligoclonic antibody production)中添加多样性。举例来说添加两个重链，一个具有钮(knob)而另一个具有互补孔(complementary hole)，允许一个包括一个钮重链和一个孔重链的独立双/多价抗体的生成。取决于与各重链相关联的重链可变区的数目以及取决于它们是相同的或不同的，一个进一步的单特异性抗体或者一个进一步的双或多价抗体被生成。
根据本发明，被提供的是一种组合物包括两个或更多个抗体，它们之中的至少一者可以是一个本发明的多价抗体。本发明的这样一种组合物可以包括两个或更多个本发明的多价抗体。这样一种组合物可以包括3个、4个、5个或更多个抗体，它们之中的至少一者可以是一个本发明的多价抗体。在这样一种组合物中，存在于该组合物中的所述抗体之中的一个或多个可以具有一个共有的重链。
本发明的一个宿主细胞可以表达或者能够表达两个或更多个抗体，它们之中的至少一者可以是一个本发明的多价抗体。本发明的一个宿主细胞可以表达或者能够表达两个或更多个本发明的多价抗体。这样的宿主细胞可以表达或者能够表达3个、4个、5个或更多个抗体，它们之中的至少一者可以是一个本发明的多价抗体。这样的宿主细胞可以表达或者能够表达3个、4个、5个或更多个抗体，它们全部都可以是一个本发明的多价抗体。
根据本发明，因此被提供的是一种用于制备一包括两个或更多个抗体的组合物的方法，该方法包括：
提供一种包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为两个或更多个抗体，之中的至少一者是一个根据本发明的多价抗体：以及
在用于提供所述多肽的表达以及它们的组装成为两个或更多个抗体(之中的至少一者是一个根据本发明的多价抗体)的条件下来培养该宿主细胞。
本发明还提供一种通过相同细胞来生成两个或更多个抗体的方法，其中所述抗体之中的至少一者是一个如此处所描述的多价抗体。
本发明提供一种用于生成一包括两个或更多个抗体的组合物的方法，所述抗体之中的至少一者是一个如所请求的多价抗体，该方法包括提供一种具有下列的细胞：
-核酸，它编码一个第一重链带有一重链可变区与一个共有轻链一起形成一个结合结构域或可变结构域结合一个第一抗原；
-核酸，它编码一个第二重链带有一重链可变区与该共有轻链一起形成一个可变结构域结合一个第二抗原以及一重链可变区与该共有轻链一起形成一个可变结构域结合一个第三抗原；
-核酸，它编码一个第三重链带有一重链可变区与该共有轻链一起形成一个可变结构域结合一个第四抗原；以及
-核酸，它编码一个多肽包括该共有轻链；
其中所述核酸之中的两个或更多个可以是或者不是物理连接的(physicallylinked)，并且其中所述核酸之中的每一者进一步包括一个表达控制序列(expressioncontrol sequence)以允许被编码的重链和轻链在该细胞中的表达，并且其中该方法进一步包括培养该细胞以允许所述重链和轻链的表达，以及选择性地，收集该两个或更多个抗体。在一个实施方案中，该第一和第二重链具有一个兼容的异二聚体化结构域，优选为一个DE/KK异二聚体化结构域。在一个优选实施方案中，该第三重链包括该兼容的异二聚体化结构域的部分之中的一者，由此而产生两种抗体。在一个实施方案中，该方法进一步包括提供一由带有所述核酸的细胞所构成的收集以及从该收集中选择出一个具有个别的重链和轻链的一所欲的表达比例(desired ratio of expression)的细胞。在一个优选实施方案中，该两个或更多个抗体为两个或更多个多特异性抗体。在一个优选实施方案中，所述细胞生成基本上等摩尔数量(essentially equimolar amounts)的该两个或更多个抗体。在某些优选实施方案中，所述细胞生成该两个或更多个抗体之中的一者要多于另外一者。
非人类动物
多价结合蛋白质的合成和表达一直是有问题的，部分系由于与鉴定一可与两个或更多个不同重链相联与表达的合适的轻链有关联的议题，以及部分系由于分离议题。此外，本技术领域一直缺少一系列允许各式各样的抗体效价(antibody valence)、具有稳定性的可挠曲性(flexibility with stability)以及低免疫原性的接头。
此处所描述的方法和组合物允许制造合适的多价结合蛋白质，所述多价结合蛋白质具有得自于、衍生自或根据合适的方法的结合结构域。合适的方法可包括噬菌体显示法(phage display methods)(包括在噬菌体显示系统中被产生的种系序列的修饰)以及本技术领域中已知的其他活体外方法(in vitro methods)。一个特别有用的方法是让一个基因改造的(genetically modified)非人类动物透过体细胞重组以及亲和力成熟作用的自然过程(natural processes)来制造一个可与一共有轻链相联以及表达的合适的重链可变结构域。
在一个实施方案中，被使用于本发明的多价抗体中的可变结构域系得自于、衍生自或根据一个非人类基因克隆动物的重链和轻链可变区，该非人类基因克隆动物(例如一个共有轻链哺乳动物，诸如一啮齿动物)在牠的种系内包括一个未重排的重链可变基因座(unrearranged heavy chain variable locus)并且表达一个单一重排的人类轻链可变结构域。这样一个非人类基因克隆动物当暴露至一个抗原将会表达多种多样的与一个共有轻链配对的重链可变区，所述重链可变区接而可被用来发展编码得自于、衍生自或根据来自该基因克隆动物的重链可变区的重链可变区的核酸序列，所述核酸序列能够被有效地转形至用于生成多价抗体的宿主细胞的内。
具体地，来自一个被免疫的(immunized)共有轻链动物[牠被基因工程化(genetically engineered)以表达衍生自不超过1个或不超过两个人类VL基因节段的人类轻链可变结构域]的合适的B细胞的人类可变区序列可以被使用作用于本发明的多价抗体的有潜力的VH结构域(potential VH domains)的一来源。该B细胞来自于被免疫以一个或多个感兴趣的抗原的该动物，在各种不同的实施方案中，该一个或多个感兴趣的抗原是该多价抗体将会结合的抗原。所述动物的细胞、组织或血清(serum)、脾脏或淋巴物质(splenicor lymph materials)被筛选以获得展现出相对于该感兴趣的抗原的所欲特征(例如高亲和力、低亲和力、封阻能力、活化、内在化或其他特征)的重链可变结构域(或者表达它们的B细胞)。因为实际上因应一个抗原的刺激(antigenic stimulation)而在该基因克隆动物体内被产生的所有重链可变结构域系连同一个衍生自不超过1个或不超过两个VL基因节段的人类免疫球蛋白轻链的表达而被制造，所述重链可变区能够表达并且与被表达于该基因克隆动物体内的共有轻链结构域相联。
在一个方面，一个如此处所述的表位结合蛋白质(epitope-binding protein)被提供，其中人类VL和VH序列为根据得自于已被免疫以一个包括一感兴趣的表位的抗原的一个此处所述的基因克隆的小鼠和/或一个被公开于WO 2009/157771(在此被并入本案以作为参考)中的基因克隆动物的B-细胞的核酸的核酸所编码。
核酸序列、多肽、媒介物和细胞
本发明进一步提供：编码可被使用于本发明的多价抗体的组装中的多肽或接头的核酸序列；包括所述核酸序列的媒介物；一个能够生成本发明的多价抗体的细胞；以及一种使用这样的一个细胞来制备这样的多价抗体的方法。
根据本发明的多价抗体通常系通过表达编码一起组装以形成发明的一个抗体的多肽的核酸序列的细胞而被生成。
因此，本发明提供一个接头，其包括一个如SEQ ID NO：1至3或5至24之中的任一者所阐述的氨基酸序列，或一个对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约85％序列同一性(诸如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约90％序列同一性，例如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约95％序列同一性，诸如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约98％序列同一性，例如对这些序列识别编号的任何一者具有至少大约99％序列同一性)的多肽。
本发明进一步提供一种多肽包括一个VH1-CH1-以铰链为基础的接头(hinge-based linker)-VH2-CH1。
在某些实施方案中，VH1和VH2结合相同的表位。在某些实施方案中，该VH1和VH2结合相同的抗原但是不同的表位。以及在某些实施方案中，该VH1和VH2结合独立的表位和抗原。
还为本发明所提供的是一个编码这样一个接头或多肽的核酸序列以及一个包括这样一个核酸序列的媒介物。
被使用于制造所描述的多肽的核酸序列可以被放置在任何一个合适的表达媒介物中，以及在适当的情况下，被放置在位于一个单一宿主细胞内的两个或更多个媒介物中。
一般而言，编码可变结构域的核酸序列系与合适的接头和/或恒定区被克隆，而且所述序列系与一个启动子(promoter)呈可操作连接(operable linkage)而被放置在一个用于表达的合适的细胞系内的一个合适的表达构建体(expression construct)中。
因此，本发明还提供一种用于一个抗体的制备的方法，该方法包括：
提供一种包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为本发明的多价抗体；以及
在用于提供所述多肽的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养该宿主细胞。
多价抗体的表达
抗体在重组型宿主细胞(recombinant host cells)中的表达已经被描述于本技术领域中。编码本发明的一个抗体的轻链和重链的核酸分子可以有如染色体外拷贝(extrachromosomal copies)而存在，和/或被稳定地整合至宿主细胞的染色体的内。后者被偏好，在那样的情况下，一个被知晓为缺乏基因缄默化的基因座可以被标靶。
为了得到编码会组装为本发明的一个抗体的多肽的核酸分子的表达，被那些熟习本领域的技术人员所详知的是：能够驱动这样的表达的序列可以被功能性地连接至编码所述多肽的核酸序列。被功能性地连接意在描述：编码所述多肽或它们的前体(precursors)的核酸序列被连接至能够驱动表达的序列，而使得这些序列可以驱动所述多肽或它们的前体的表达。有用的表达媒介物在本技术领域中是可以得到的，例如Invitrogen的pcDNA媒介物系列(pcDNA vector series)。在编码感兴趣的多肽的序列参考操纵(governing)被编码的多肽的转录(transcription)和翻译的序列而被适当地插入的情况下，所形成的表达盒(expression cassette)可以用来生成感兴趣的多肽，这被称之为表达。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子(enhancers)诸如所述以及这些的组合。这些应该能够在宿主细胞中产生作用，而因此驱动被功能性地连接至它们的核酸序列的表达。该启动子可为组成型(constitutive)或调控型(regulated)，而且可以得自于各种不同的来源，包括病毒、原核生物的(prokaryotic)或真核生物的(eukaryotic)来源，或者是人工设计的(artificiallydesigned)。
本发明的核酸序列的表达可以来自于天然启动子(natural promoter)或它的一个衍生物(derivative)，或来自于一个完全异源的启动子(entirely heterologouspromoter)。一些众所周知而且常被使用于真核生物的细胞中的表达的启动子包括衍生自病毒的启动子，诸如腺病毒(adenovirus)(例如E1A启动子)、衍生自巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的启动子[诸如CMV立即早期(immediate early，IE)]启动子、衍生自猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)的启动子，诸如所述。合适的启动子也可以衍生自真核生物的细胞，诸如金属硫蛋白(metallothionein，MT)启动子、延长因子1α(elongationfactor 1a，EF-1a)启动子、肌动蛋白(actin)启动子、一个免疫球蛋白启动子、热休克启动子(heat shock promoter)，诸如所述。能够驱动本发明的一个核酸序列在一个宿主细胞中的表达的任何一种启动子或增强子/启动子在本发明中是合适的。在一个实施方案中，能够驱动表达的该序列包括来自于一个CMV启动子的一个区域，优选为包括CMV立即早期基因增强子/启动子的核苷酸-735至+95的区域。熟习本领域的技术人员将会理解：被使用于本发明中的表达序列可被合适地组合以可以稳定化或增强表达的要素，诸如绝缘子(insulators)、基质结合区(matrix attachment regions)、STAR要素(STAR elements)，诸如所述。这可以增进表达的稳定性和/或水平。
任何适合于表达一个重组型核酸序列的细胞可被用来产生本发明的一个抗体。优选地，该细胞被调适用于悬浮生长(suspension growth)。
本发明的多价抗体可以在宿主细胞中被表达，通常系通过培养本发明的一个合适的细胞，以及从该培养物(culture)来收获(harvesting)该抗体。优选地，该细胞被培养在一个不含血清的培养基(serum free medium)中。本发明的多价抗体可以通过通常为熟习本领域的技术人员所知晓的方法而从该细胞或者从细胞培养基来被回收(recovered)。
进一步被提供的是一种可得自于一种用于生成一个根据本发明的抗体的方法的抗体。该抗体优选地系纯化(purified)自培养物的培养基。
在回收(recovery)后，一个抗体可通过使用本技术领域中已知的方法而从培养物被纯化出。这样的方法可包括沉淀法(precipitation)、离心法(centrifugation)、过滤法(filtration)、粒径筛析层析法(size-exclusion chromatography)、亲和力层析法(affinity chromatography)、阳离子和/或阴离子交换层析法(cation-and/or anion-exchange chromatography)、疏水性交互作用层析法(hydrophobic interactionchromatography)，诸如所述。亲和力层析法，包括根据该接头序列来作为分离本发明的多价抗体的一手段，可以被使用。
药学组合物以及使用方法(methods of use)
还为本发明所提供的是一种药学组合物，其包括本发明的一个抗体以及一药学上可接受的载体和/或稀释剂。
因此，本发明提供一种如此处所述的多特异性抗体来供应用于人类或动物体透过疗法的治疗。
进一步为本发明所提供的是一种用于一个患有(suffering from)一种医疗病症(medical condition)的人类或动物的治疗的方法，该方法包括对该人类或动物给药一治疗有效量的一种如此处所述的抗体。
要被给药给一个病患的根据本发明的抗体的数量通常系位于治疗范围(therapeutic window)中，这意指一足够的数量被使用于供获得一治疗成效(therapeuticeffect)，而该数量不超过一个导致一不可接受程度的副作用(unacceptable extent ofside-effects)的阀值(threshold value)。为了获得一所欲的治疗成效而需要的抗体的数量越低，该治疗范围通常将会越大。在低剂量(low dosage)下发挥(exerting)充分治疗成效的一个根据本发明的抗体因此被偏好。
在此对一个被提供作为背景技术的专利文献或其他制品的引述不应被视为承认该文献或制品是已知的或者它含有的数据在本案权利要求书的任何一项的优先权日(priority date)之时为通常一般知识(common general knowledge)的部分。
此处所提到的每一份参考文献的揭露内容在此以其整体被并入本案以作为参考。
为了明确性以及一个简洁的发明说明的目的，特征在此被描述以作为相同的或独立的实施方案的部分，然而，将会被理解的是：本发明的范围可以包括具有全部的或者一些的所述特征的组合的实施方案。
下面的实施例例示说明本发明。为便于参考，针对实施例8至15，当描述三特异性分子之时，下面的型式被使用：MFAxMFB：MFC或者抗原Ax抗原B：抗原C，而使得MFA或抗原A接续以x构成该“短臂”，同时该x表示二聚体化，接续以MFB或抗原B描述该长臂的内部位置，接续以一个“：”指明一个接头接续以MFC或抗原C描述位于该长臂的远程结构域处的MFC或抗原C。
实施例
实施例1：用于产生能够表达多特异性抗体的媒介物的可变结构域和接头的克隆
24个接头构建体根据它们如表2中所詳述的尺寸在库中(in pools)被克隆(cloned)至MV1626載体(参见图3)的内，该MV1626載体在该CH3区内含有所述KK残基(L351K、T366K)用于IgG重链异二聚体的产生(WO 2013/157954和WO 2013/157953)。所述构建体系使用限制酶(restriction enzyme)SfiI和XhoI而被克隆至載体MV1626的内。所有的构建体依序地含有MF1337的VH基因、一个CH1结构域、该接头序列(它的翻译被列示于表2中)以及MF1122的VH基因。作为一个是范例，构建体MF1337xIgG4UHxMF1122的DNA序列被提供于下面的表3中。该构建体被示意地描绘于图2a中。所述构建体系根据被表明在所述构建体的名称中的IgG同型的CH1和接头序列这两者。全部24个CH1区组合以所述接头序列的一翻译被提供于图5中。全部3个VH基因和共有轻链基因的一翻译被提供于表4中。
表2：如所使用的24个不同的接头/构建体的序列以及命名；注意，在CH1中也存在 有差异(图5)。接头序列被表明如下。个别的CH1序列连同接头被表明于图5中。“接头名称” 意指被表明的接头序列连同该CH1结构域。
表3：构建体MF1337xIgG4 UHxMF1122的DNA序列
表4：全部3个VH基因和共有轻链基因的翻译
所述插入物和该載体系在50℃下使用SfiI限制酶被消化(digested)历时2小时，继而在37℃下使用XhoI酶历时2小时。经消化的DNA被装填(loaded)至一个0.8％琼脂糖凝胶(agarose gel)上，并且在100伏特(volts)下被运行(run)历时2小时。经消化的載体和插入物随后使用Qiagen Q1Aquick凝胶萃取套组(Qiagen Q1Aquick Gel Extraction kit)而从该凝胶被分离出，然后呈1/5比例(w/w，媒介物/插入物)在16℃下使用T4 DNA连接酶(T4DNA ligase)进行连接(ligation)过夜。50μL的DH5α-T1R胜任大肠杆菌(competentE.coli)在5μL的连接混合物(ligation mix)的存在下被转形，继而为一个热休克程序(heat shock procedure)(在冰上30分钟，然后在42℃下2分钟，然后在冰上2分钟)。被转形的细菌被平板接种(plated)在补充有安比西林(Ampicillin)的LB琼脂培养基(LB agar)上，并于37℃下被培育(incubated)过夜。单一菌落(single colonies)被挑取(picked)并被混合以100μL的无菌去离子水(sterile deionised water)而且被使用于使用引物D0_2130和D0_1056的菌落PCR(colony PCR)以确认该插入物的存在，继而使用引物D0_2130以
Terminator V1.1Cycle Sequencing Kit(Thermofisher)来做序列PCR(sequence PCR)用于克隆体确认(clone confirmation)。
经确认的克隆体的单一菌落被用来接种(inoculate)4mL的LB-Amp。在37℃下的过夜培养物(overnight cultures)系根据制造商手册(manufacturer manual)使用QIAGENPlasmid Mini Kit而在24wells format mini-prep中被制得。在从管柱(column)洗提(elution)之后，被纯化的DNA通过添加0.7倍容积(volumes)的室温异丙醇(room-temperature isopropanol)而被沉淀出。DNA沉淀丸(DNA pellet)以1mL的70％乙醇(ethanoi)被清洗并在无菌状况(sterile conditions)下被风干(air dried)以及在储存于-20℃下之前将的再散浮(resuspended)于无菌的Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTA buffer)中。最终的构建体系使用
Terminator V1.1Cycle Sequencing Kit来被双脱氧定序(dideoxy sequenced)，对于插入物使用引物DO_1488、DO_1056和DO_2130，此外对于CH2/CH3区使用引物D0_0182和D0_0091。
所有的引物序列被阐述于表5中。
定序(sequencing)显示所有的构建体已被成功地制备。
表5：引物序列
| 引物 | 序列 | 描述 | SEQ ID NO |
| D0_0091 | CCTCATGCATCACGGAGCATG | CH3_rev | SEQ ID NO：30 |
| D0_0182 | CAAAGGCCAAACTCTCCACTC | CH2 fwd | SEQ ID NO：31 |
| D0_1056 | CGCTGTGCCCCCAGAGGTGC | VH_rev | SEQ ID NO：32 |
| D0_1488 | GTACCGGTGAATTGGCCGG | VH_fwd | SEQ ID NO：33 |
| D0_2130 | GCGCCCTACTATCACTTCGCTCTGG | MF1337 CDR3 fwd | SEQ ID NO：34 |
实施例2：转染以及IgG纯化(purification)
在实施例1中被产生的表达載体被组合以表达多特异性抗体的碱性抗体部分的第二重链的載体MG1025C377(图4)，其在该CH3区带有L351D-L368E突变(WO 2013/157954和WO2013/157953)以及抗体MF1025的甲狀腺球蛋白Fab基因(参见WO 2013/157953的实施例2)。两个重链连同一个共有轻链的表达导致如图2b中所示的三特异性抗体的生成。
FreeStyle 293-F细胞(Thermofisher)被使用于在一种24孔培养盘形式(24wells plate format)中表达所设计的抗体。在转染之前两天，FreeStyle 293-F细胞原液(stock)以一为1∶1的比例被分离(split)于293-F培养基中，并且在一为155rpm的回转式振荡速度(orbital shaking speed)之下、于37℃和8％CO2之下被培育过夜。细胞在转染之前一天被稀释至一为5×105个细胞/mL的密度。4mL的悬浮细胞(suspension cells)被播种(seeded)至一个24深孔培养盘(24 deep wells plate)的内，以一个透气封件(breathableseal)被覆盖(covered)并在一为285rpm的回转式振荡速度之下、于37℃和8％CO2之下被培育过夜。在转染当天，4.8mL的293-F培养基被混合以240μg的线性聚乙烯亚胺[polyethylenimine(PEI)linear](MW 25，000)。对于每一种要被生成的IgG，200μL的293F培养基-PEI混合物被添加8μL的如表6中所详述的DNA(对于异二聚体，4μL的编码各个重链的DNA)。在被温和地添加至所述细胞之前，该混合物在室温下被培育历时20分钟。在转染之后一天，被稀释于500μL的293F培养基中的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，Pen-Strep)被添加至每个孔内。所述培养盘在一为285rpm的回转式振荡速度之下、于37℃和8％CO2之下被培育直到转染之后7天要收获(harvest)之时。培养盘在500g之下被离心5分钟，含有IgGs之上清液(supernatants)使用10-12μm熔喷聚丙烯过滤板(melt blownpolypropylene filter plates)被过滤并在纯化之前被储存在-20℃之下。
各种不同的对照组抗体还被表达，即：
使用Fab MF1337的双价抗-破伤风类毒素抗体(使用載体MG1337C057)
使用Fab MF1025的双价抗-甲狀腺球蛋白抗体(使用載体MG1025C059)
使用Fab MF1122v的双价抗-纤维蛋白原抗体(使用載体MG1122C057)
MG1337C057表示一个构建体表达来自載体MV1057的MF1337的VH区。MG1025C059表示一个构建体表达来自載体MV1059的MF1025的VH区。MG1122C057表示一个构建体表达来自載体MV1057的MF1122的VH区。MV1057(图6)和MV1059是表达单特异性-双价人类IgG1分子的載体。MV1057和MV1059基本上是相同的載体导致相同的IgG1分子的表达。
双特异性抗-甲狀腺球蛋白x抗-破伤风类毒素抗体组合Fab MF1337和Fab MF1025(使用MG1025C377×MG1337C260)
双特异性抗-甲状腺球蛋白x抗-纤维蛋白原抗体组合Fab MF1122和Fab MF1025(使用MG1025C377×MG1122C260)
MG1025C377(图4)表达抗体MF1025[在一个人类IgG1重链的背景下含有L351D、L368E(DE)突变]的重链可变结构域。MG1337C260(图7)表达抗体MF1337[在一个人类IgG1重链的背景下含有L351K、T366K(KK)突变]的重链可变结构域。MG1122C260表达抗体MF1122[在一个人类IgG1重链的背景下含有L351K、T366K(KK)突变]的重链可变结构域。
表6：用于IgG生成的转染方案(transfection scheme)
在收获之后，抗体系如下述在24孔形式(24 well format)中来被纯化：上清液被混合以50μL的1M Trizma(pH 8)以及100μL的蛋白质A Sepharose CL-4B珠粒(protein ASepharose CL-4B beads)(50％v/v，G.E Healthcare Life Sciences)并且在600rpm的回转振荡下、于25℃之下被培育历时2小时。珠粒被真空过滤(vacuum filtered)并且以3mL的PBS(pH 7.4)被清洗2次。抗体的洗提(elution)系通过添加200μL的柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer)(0.1M，pH 3)继而为利用300μL的1M Trizma(pH 8)的中和反应(neutralization)来被执行。被纯化的IgG分馏物(fractions)被立即更换缓冲液为PBS(pH7.4)。IgG样品被转移至一个30kDa 96孔过滤板(96 well filter plate)[聚醚砜膜(polyethersulfone membrane)]的内，并且在1500g、4℃之下被离心直到每个孔被留下一为10μL的容积。200μL的PBS被添加至每个孔的内，样品在500rpm之下被混合3分钟，然后IgGs被收集用于在4℃下的储存。IgG浓度(concentration)系通过Octet和蛋白质A生物感测剂(Protein A biosensors)(Pall ForteBio)来被测定。7个从192μg/mL开始以至3μg/mL的2倍稀释物(2 folds dilutions)的人类IgG被使用作标准品(standard)。IgG样品的浓度系以两次重复(in duplicate)来被测定。对于全部30个被生成的IgGs(而因此包括了对照组)，还原的和非还原的SDS-PAGE(Reduced and Non-Reduced SDS-PAGE)被执行。结果被呈现于图8中。在非还原条件(NR conditions)下，观察到三特异性多价抗体的预期的产物大小(expected product sizes)为-200kDa，而对照组单株IgGs和
为-150kDa。就还原条件(R conditions)，观察到三特异性多价抗体的产物大小为-25kDa(LC)、-50kDa(HC/1VH)以及-75kDa(HC/2VH)。具有-25kDa(LC)以及-50kDa(HC)的对照组单株IgGs带大小(band sizes)系如所预期的。所述结果还显示所述三特异性构建体位于-150kDa的带。这些是从DE重链的相联而形成的同质二聚体，这可能是含有DE的较短重链要比含有KK的较长重链有更高的表达水平的结果。
实施例3：在ELISA中被测量的Fab结构域在VH1、VH2和VH3位置中的结合活性
在每个构建体中的3个Fab结构域的结合活性系通过使用破伤风类毒素、纤维蛋白原和甲状腺球蛋白抗原以及作为一负对照组(negative control)的huEGFR-Fc抗原的ELISA来被检查[关于涂覆条件(coating conditions)、供货商(supplier)和产品目录编号(catalogue numbers)，参见表7]。
每个多特异性IgG样品首先以PBS被稀释至10μg/mL，并且针对纤维蛋白原、破伤风类毒素和甲状腺球蛋白以滴定法来被分析(analysed in titration)；在4个从10至0.08μg/mL的5倍稀释物中。全部30个样品在10μg/mL之下针对huEGFR-Fc来被分析。配于PBS的内的适当数量的抗原被制备。在4℃下，每个ELISA盘孔(ELISA plate well)被添加50μL的经稀释的抗原溶液并且被涂覆过夜(coated o/n)。所述盘以清洗缓冲液(wash buffer)(PBS/Tween)被清洗两次。在室温下以300μL/孔的封阻缓冲液(block buffer)(PBS/2％BSA)来封阻所述孔历时1小时。在培育期间当中，适当的IgG稀释物在封阻缓冲液中被制造出。所述盘通过在水槽上方倒置(inverting above sink)然后于棉纸上拍打(slapping on tissue)而被清空(emptied)。50μL的IgG样品以及对照组被添加至经封阻的盘的孔内，以封件被覆盖并且在室温下被培育60分钟。所述盘以清洗缓冲液(PBS/0.05％Tween)被清洗3次。每个孔被添加50μL的以封阻缓冲液配成1/2000的经稀释的检测抗体(detection antibody)[HRP-缀合的(HRP-conjugated)小鼠抗-人类IgG；Becton Dickinson，cat.no.555788)。该盘以封件被覆盖并且在室温下被培育60分钟。该盘以清洗缓冲液被清洗3次。TMB基质溶液(TMB substrate solution)(BD，OptEIATM cat.no.51-2606KC)系通过以1∶1的比例将试剂A和B混合而被制成，以及对每个孔添加50μL并且显色(developed)历时(最高)10分钟。50μL的1M H2SO4被添加至每个孔以终止染色反应(staining reaction)。
所述盘系在A450之下使用一个BioTek Elx808 ELISA盘读取仪(BioTek Elx808ELISA plate reader)来被读取。结合曲线(binding curves)系使用GraphPad Prism 7来被绘图(plotted)，且针对每个构建体的每个抗原ELISA所计算(calculated)的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)系列示于表8中。就对于甲状腺球蛋白(VH1，位于该DE-臂，参见图1)以及破伤风类毒素[VH3，位于该KK-臂的顶端(tip)，参见图1]的结合，一个在AUC上为12％以及8％的小变化被看到。对于纤维蛋白原-臂(这是VH2，图1)，一个较大的变化被看到。这表示：位于VH2位置中的Fab结构域的可及性(accessibility)或亲和力取决于将位于VH2位置中的Fab结构域连接至位于VH3位置中的Fab结构域的接头而定。所有的接头提供有功能的VH2s。
表7：被使用于ELISA的抗原的列表
表8：从表6中所列示的24个三特异性多价抗体的ELISA结合分析(binding assays)而得到的曲线下面积数值。所述抗体在ELISA中被滴定用于结合至3种不同的抗原。 所形成的AUC数值根据对于纤维蛋白原的结合活性(由位于VH2位置中的Fab所产生)来被分 选(sorted)。这确认：位于VH2位置中的Fab存在有一定范围的结合活性。对位于VH2位置中 的Fab具有最高活性的15个构建体被优先处理(prioritized)来供进一步的实验 (experimentation)，具有最低活性的6个构建体以斜体字来表示。ND表示未做。
实施例4：结合活性的稳定性
位于所述三价抗体构建体中的3个Fab结构域的结合活性的稳定性系跟随在4种加速压力状况(accelerated stress conditions)之后来被分析。所述样品以PBS被稀释至10μg/mL并且被培育在4℃下历时1个月。所述样品以D10F培养基被稀释至10μg/mL并且被培育在40℃下历时7天。所述样品也以D10F培养基被稀释至10μg/mL并且被培育在50℃下历时2天。所述样品也用PBS被稀释并进行5次冻融循环(freeze-thaw cycles)(5XFT)。
在这些加速压力状况之后，对于被该3个Fab结构域所识别的抗原的结合活性系如前面所述的在ELISA中来被分析。曲线下面积被计算并且列表(tabulated)。
在所测试的不同构建体中，在40℃下被施加的压力仅显着地影响位于VH2位置中的Fab的结合，对纤维蛋白原的结合至不同的程度。在所测试的不同构建体中，在4℃下、在50℃下以及5xFT的压力影响全部3个Fab结构域至不同的程度。
所述结合活性系针对各个抗原以及压力状况而被排序(ranked)，并且针对各个Fab位置来鉴定出在各个压力状况之下的16个最佳构建体。根据该3个Fab在加速压力状况之下的结合活性的守恒(conservation)，一个构建体系居于该16个最佳构建体之中的次数被加起来(added up)并且被用来排序所有的构建体。
所述结果被阐述于图9中，这表示：在加速压力状况之下，所述不同构建体存在有一定范围的稳定性。位于21个被生成的三价抗体构建体中的该3个Fab结构域的结合活性的稳定性系跟随在4种加速压力状况之后被分析。ELISA数据(AUC)被列表。所述结合活性被排序，并且针对各个Fab位置来鉴定出在各个压力状况之下的16个最佳构建体。根据该3个Fab在加速压力状况之下的结合活性的守恒，一个构建体系居于该16个最佳构建体之中的次数被加起来并且被用来排序所有的构建体。
所有的抗体是稳定的而且有些要比其他者更为稳定。
实施例5：大规模转染以及IgG纯化
18个如下的构建体被选择用于一个大规模生产用于进一步的分析：IgG1 MH、IgG1H、IgG1 R、IgG1 G4S、IgG1 UH、IgG3 R、IgG3 UH、**IgG2A R、IgG2A MH、IgG3 ULH、IgG2B R、IgG4 MH、IgG4 UL、IgG2A H、IgG2B H、*IgG1 UL、*IgG4 H、*IgG4 R。作为一个对照组，下面的产品被包括：双特异性抗-甲状腺球蛋白x抗-破伤风类毒素(使用被描述于实施例2中的MG1025C377xMG1337C260)以及双特异性抗-甲状腺球蛋白x抗-纤维蛋白原(使用之前所描述的MG1025C377xMG1122C260)。
这些构建体的DNA系如之前所描述的来被制备。多特异性IgGs系如之前所描述的通过被列示于表6中的构建体的共转染而被转染。那些被选择的构建体系在更大的规模下被生成。在转染之前两天，FreeStyle HEK293-F细胞原液以一为1∶1的比例被分离于293-F培养基中，每个500mL培养瓶(culture flask)中含有100mL最終体积，并且在一为155rpm的回转式振荡速度之下被培育于37℃和8％CO2之下。在转染之前一天，细胞被计数，而一具有一为5.0×105个细胞/mL的密度的细胞悬浮液(cell suspension)系通过以293-F培养基来稀释细胞而被制备出。细胞接而在每个T500烧瓶(T500 flask)含有100mL细胞悬浮液之下被播种并且在一为155rpm的回转式振荡速度之下被培育于37℃和8％CO2之下。隔天所述细胞被转染。一个含有293-F培养基、PEI和DNA的混合物被制备，通过混合7.5mL的293-F培养基、187.5μL的PEI原液(处在1μg/μL之下)以及150μL的DNA(处在0.5μg/μL之下)。这个混合物在室温下被培育历时20分钟并接而被添加至细胞，然后细胞在一为155rpm的回转式振荡速度之下被培育于37℃和8％CO2之下历时7天。
含有抗体蛋白质之上清液在1000g之下被离心历时10分钟以移除细胞。使用一个0.45μm过滤器(filter)来过滤该上清液。使用一个
100 system(GEHealth Care)以及蛋白质A亲和力层析法继之以脱盐(desalting)而从该上清液纯化出IgG。一个HiTrap MabSelect SuRe 5mL管柱以及HiTrap 5mL脱盐管柱(Desalting column)(GE Health Care)系根据制造商的指示说明来被使用。IgG浓度系通过OD280吸收光谱(OD280absorption)来被测定。对于所有的构建体，这生成了0.8-4.9mg IgG配于PBS的内。如之前在实施例2中所述的，所产生的蛋白质在(还原的或非还原的)SDS-PAGE上被分析。所述数据确认了如在实施例2中所发现到的数据而在此未被提供。
HP-SEC被执行以建立介于构成所述多特异性抗体的碱性抗体部分的两个重链之间的表达比值。由于位于所述三价构建体中的两个重链的尺寸差异，半体(halfbodies)和同质二聚体可以在高性能粒径筛析层析法(High Performance Size ExclusionChromatography，HP-SEC)中被鉴定出并且定量。HP-SEC系使用一个装配有一个TSK保护管柱(TSK guard column)SWXL(Tosoh Bioscience cat#08543)以及一个TSK-凝胶管柱(TSK-gel column)G3000SWXL(Tosoh Bioscience cat#08541)的Dionex HPLC系统来被执行。对于每个分析，配于PBS中的20μg蛋白质样品被注射至在4℃下于一为1mL/min的流动速度(flow speed)下使用200mM磷酸钠(sodium phosphate)、50mM NaCl作为运行缓冲液(running buffer)被运行的管柱。层析图(chromatograms)系使用Chromeleon 6.80软件(Chromeleon 6.80 software)根据UV280结果而就滞留时间(retention times)和相对波峰面积(relative peak areas)来被分析。介于三价IgG/DEDE同质二聚体的数量之间的比值被计算并且被呈现于下面的表9中。具有一个高于平均值的三价/DEDE比值的构建体系呈斜体字被展现。
表9：HP-SEC被执行以建立介于构成所述多特异性抗体的碱性抗体部分的两个重 链之间的表达比值。介于三价IgG/DEDE同质二聚体的数量之间的比值被计算并且被列表。
被大规模纯化的IgG(包括两个对照组)的稳定性系如前面所述的在不同的压力状况之后被评估：在PBS中进行5次冻融循环之后，在D10F培养基中于40℃下培育一周之后，在D10F培养基中于50℃下培育一周之后，以及在PBS中于50℃下培育一周之后。受压力的样品(stressed samples)的性能被拿来跟在4℃下培育一周之后的相同样品(对照组)的性能做比较。为了那个目的，来自所述100mL产品的纯化的IgG在PBS中被稀释至0.2mg/mL并且被分成两批(batches)：一批用于在PBS中、于0.2mg/mL之下的稳定性试验(4℃、3xFT以及50℃)，一批在D10F中被稀释至0.1mg/mL用于如前面所述的在4℃、40℃和50℃之下的压力试验。关于样品IgG1 H，一为0.194mg/mL的浓度被使用。
在这些加速压力状况之后，对于被该3个Fab片段所识别的抗原的结合活性系如前面所述的在ELISA中来被分析。曲线下面积被计算并且列表(参见图10)。对于每个结合活性，相较于被储存在4℃下的对照组样品的活性的压力后剩余结合活性百分比(percentageremaining binding activity after stress)被计算。所述样品系根据这些有关于在各个压力状况下对于每个靶标的结合活性的百分比来被排序。高于平均值的所述百分比被表明而且每个样品表现出高于平均值的次数被加起来并且被呈现于图10中的表格的最后一栏中。这显示：如通过该3个Fab臂在压力后的结合活性来被测量的，该构建体的稳定性存在有一定范围。
实施例6：18个多价IgG构建体的稳定性分析
在图10中所鉴定出的18个多价IgG构建体上执行如先前在实施例5中所述的稳定性分析。此外，4个对照组抗体被使用，它们具有重链结合结构域包括先前被描述于WO2018/056821 A1(在此被并入本案以作为参考)中的MF6744(SEQ ID NO：91)、MF1337(SEQID NO：28和SEQ ID NO：288)，以及MF1122(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：286)，被偶合至一个cLC，即：
使用Fab MF6744/cLC的单特异性抗-CD137抗体；
使用Fab MF1122/cLC的单特异性抗-纤维蛋白原抗体；
使用Fab MF1337/cLC的单特异性抗-破伤风类毒素抗体；以及
含有Fab MF1122/cLC和Fab MF1337/cLC的双特异性抗-纤维蛋白原x抗-破伤风类毒素抗体作为一个DEKK双特异性对照组。
就稳定性分析而被测试的样品的列表被提供于下面的表10之中。
表10：就稳定性分析而被测试的样品的列表：18个多价抗体以及4个对照组抗体
18个多价抗体以及4个对照组抗体的稳定性系跟随在4种不同的状况之后被分析。因此，所述22个样品(18个三价+4个对照组)在PBS中被稀释至0.2mg/mL并且被施予下列处理：
在4℃之下历时1个月(T0)，这被视为参考；
在50℃之下历时7天；
在80℃之下5次的冻融(FT)循环；或
在室温下进行4小时的400rpm振荡(shaking)。
在这4种状况的每一者之后，稳定性系使用7种不同的方法来被分析，即：
紫外-可见吸收光谱法(UV-Vis absorption spectroscopy)：如在Eckhardt，1994：Mulinacci，2011b and Peters，2013中所解说的，在减去(subtraction)背景缓冲液吸收(background buffer absorption)以及由于聚集体(aggregates)的光散射(light-scatter)之后，吸亮度(absorbance)系在350nm之下被测试，以提供所述样品的聚集状态(aggregation state)的数据；
90°光散射谱法(90°light-scattering spectroscopy)：在溶液中，光的散射量值(scatter intensity)可被不同的因素所影响，诸如蛋白质浓度、折射率(refractiveindex)、粒子尺寸和形状(particle size and shape)以及入射光(incident light)的波长(wavelength)。如Cappelle，2005；Demeule，2007a and b；Mulinacci，2011a and 2013；Luca，2010；Patois，2011 and 2012；Peters 2013之中所报导的，这个方法被使用以研究蛋白质聚集(protein aggregation)；
色氨酸内在荧光发射(Tryptophan intrinsic fluorescence emission)，被表示为相较于T0的变化％(％change)：对环境的疏水性和刚性的变化可经由色氨酸的荧光发射来被测量(Capelle，2005；Demeule，2007a and b and 2009；Mulinacci，2011a and b；Luca，2010；Patois，2011；Peters，2013)；
1，8-ANS荧光发射，被表示为相较于T0的变化％：作为一个未荷电小型疏水性荧光探针(uncharged small hydrophobic fluorescent probe)，1-苯胺基萘-8-磺酸(1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，1，8-ANS)当被结合至蛋白质、蛋白质聚集体、清洁剂微胞(detergent micelles)、可浸出物(leachables)、胞膜(membranes)和细胞组分中的静电囊袋(electrostatic pockets)之时在水中变成荧旋光性，而因此可以被用来研究胞膜表面和蛋白质(Demeule，2009；Mulinacci，2011a and b；Luca 2010)；
尼罗红(Nile Red)荧光发射，被表示为相较于T0的变化％：作为一个未荷电小型疏水性荧光探针，尼罗红被环境的极性(polarity)所影响而可以被用来分析蛋白质降解(protein degradation)、蛋白质聚集、脂质结构(lipid structures)、蛋白质去折迭(protein unfolding)(Sackett and Wolff，1987)；
尼罗红荧光显微镜法(fluorescence microscopy)，其中粒子数目/1μL被测量：尼罗红被用来染色(stain)样品以可视化(visualize)蛋白质聚集体来供使用一个莱卡DMi8显微镜(Leica DMi8 microscope)的荧光显微镜法(Demeule，2007a and b，and 2009；Mulinacci，2011b and 2013；Patois 2011)；
动态光散射(Dynamic light-scattering)，被表示为相较于T0的单体(量值计算)变化％[％monomer(intensity calculation)change]：动态光散射系使用一个NanoFlex仪器(NanoFlex instrument)来被测量。通经光纤(optical fiber)的雷射(laser)被散射并且从粒子被反射(reflected)朝向检测器(detector)，该检测器测量被散射的光量值(scattered light intensity)以决定粒子的尺寸分布曲线(size distributionprofile)。
这些方法的读出(readout)涉及所述蛋白质的聚集、片段化(fragmentation)以及去折迭，这是所述蛋白质的稳定性的一测量(measure)。结果显示：在400rpm下振荡4小时对于抗体的稳定性具有最大冲击。对照组单特异性PG1337/MF1337抗体是受到压力状况影响最大者。因此，由于所有的18个多价构建体以及该双特异性对照组含有PG1337/MF1337Fab，所有的结果系以被设定作为门坎(threshold)的PG1337来被标准化(normalized)。
所述分子的稳定性系通过将所有7种方法在4种不同状况的期间的计分(scores)组合而被计算出。所述结果可在图12中被看到并且显示：所述构建体具有一定范围的稳定性，这对于一系列的三特异性分子而言证明了比对照组双特异性IgG要优越的稳定性。
实施例7：生物信息接头特征鉴定(Bioinformatic Linker
Characterization)
如下面表11中所阐述的以及图13中所描绘的8个接头被进一步地特征鉴定(characterized)。使用卡帕斯与舒兹可挠曲性预测度方法[它对于序列中的每个氨基酸来计算(computes)可挠曲性指数的平均值]而获得有关这些序列的每一者的一个可挠曲性预测度。如Karplus PA，Schulz GE.Prediction of Chain Flexibility in Proteins-Atool for the Selection of Peptide Antigens.Naturwissenschaften 1985，72：212-3(http：//tools.immuneepitope.org/bcell/)中所述的，该可挠曲性预测度系衍生自蛋白质结构中的每个氨基酸的平均性质(average properties)。在表11中，我们将一个接头标示为刚性(R)如果KS计分是1.015或更低，部分可挠曲的如果KS计分是从大约1.015至大约1.04。一个可挠曲序列，为了本发明的目的，是一个具有一高于1.04的卡帕斯与舒兹可挠曲性预测度的序列。
表11：8个接头以及如根据卡帕斯和舒兹所测定的可挠曲性
| # | 接头 | 序列 | 可挠曲性 | SEQ ID NO |
| 1 | IgG1 G4S | EPKSCDGGGGSGGGGS F | F | 12 |
| 2 | IgG1 H | EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG | F | 19 |
| 3 | IgG1 MH | EPKSCDKTHTSPPSP | F | 11 |
| 4 | IgG1 UH | EPKSCDKTHT | Med | 2 |
| 5 | IgG2A H | ERKSSVESPPSPAPPVAG | F | 15 |
| 6 | IgG2A MH | ERKSSVESPPSP | R | 4 |
| 7 | IgG2B H | ERKCSVESPPSPAPPVAG | Med | 16 |
| 8 | IgG2B R | ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG | R | 21 |
使用罗瑟塔局部结构预测(Rosetta local structure prediction)来获得这些分子的一第二种生物信息预测(bioinformatic prediction)。如Gront D，Kulp DW，VernonRM，Strauss CEM，Baker D(2011)Generalized Fragment Picking in Rosetta：Design，Protocols and Applications.PLoS ONE 6(8)：e23294.https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0023294中所述的，在此罗瑟塔片段捡出器(Rosetta fragment picker)被使用于提供局部结构预测。为了该预测工具的这个使用，一为40个残基的最低数目被偏好，而因此甘氨酸残基(glycine residues)在所述接头的末端处被引入以使所述序列各有40个残基的长，以该接头序列位于中间。這些接头系就二级结构(secondary structure)来被特征鉴定，将所述序列运行通经罗瑟塔片段管线(Rosetta fragment pipeline)[该管线在蛋白质数据库(Protein Data Bank)中找到在结构上接近的局部序列匹配]并且使用这些接近的序列-序列匹配来预测局部结构。对于上述8个序列的每一者，居中的片段(centeredfragment)接而被可视化。图13。
所述结果的汇总被阐述于下面的表12中：F＝可挠曲的；M＝中等的(medium)；R＝刚性；C＝螺旋(coil)＝可挠曲的；H＝螺旋(helix)＝刚性；以及E＝股线(strand)＝中等的，這证明了与根据预测的二级结构的卡帕斯与舒兹计分(Karplus and Schultz score)是一致的。
表12：可挠曲性结果的汇总
| # | 接头 | SEQ ID NO | 卡帕斯和舒兹 | 片段预测 |
| 1 | IgG1 G4S | 12 | F | CE |
| 2 | IgG1 H | 19 | F | CH |
| 3 | IgG1 MH | 11 | F | C |
| 4 | IgG1 UH | 2 | M | H |
| 5 | IgG2A H | 15 | F | C |
| 6 | IgG2A MH | 4 | R | H |
| 7 | IgG2B H | 16 | M | CE |
| 8 | IgG2B R | 21 | R | H |
实施例8：抗-CD3、PD-L1以及EGFR结合结构域的产生
被使用于免疫的小鼠(Mice used for immunization)
如下面所见的，为了结合至CD3、EGFR和PD-L1的人类抗体的产生，就该人类共有轻链和一个人类重链(HC)微小基因座(minilocus)(包括一群挑选的人类V基因节段、所有的人类Ds和所有的人类Js)而为基因克隆的小鼠(参见WO2009/157771，在此被并入本案以作为参考)可以用编码所述蛋白质的DNA或重组型DNA来被免疫。这些小鼠被称为
小鼠。有关于特异性重链可变区，或者具有此处所公开的序列的三价多聚体，它们可通过具有本领域中的技术人员所知道的方式来被生成。
蛋白质免疫(Protein immunizations)
DNA免疫(DNA immunizations)
淋巴组织的回收(Recovery of lymphoid tissue)
从被成功免疫的所有小鼠体内取出脾脏和引流淋巴结(draining lymph nodes)。从脾脏和腹股沟淋巴结(inguinal lymph nodes)产生单细胞悬浮液(single cellsuspensions)，而随后这些组织被裂解(lysed)于Trizol LS试剂(Trizol LS reagent)中并被储存在-80℃之下直到使用之时。通过RT-PCR克隆(RT-PCR cloning)来自被成功免疫的小鼠的VH基因来产生“免疫”噬菌体抗体库(‘immune’phage antibody repertoires)，腹股沟淋巴结被使用于供“免疫”噬菌体抗体库的构造。为此，从被Trizol LS裂解的淋巴组织萃取出RNA，而1μg的总RNA(total RNA)被使用于一个使用一种IgG-CH1特异性引物(IgG-CH1 specific primer)的RT反应(RT reaction)中。基本上如Marks et al.，J Mol Biol.，1991 Dec 5；222(3)：581-97所述的，所形成的cDNA接而被使用，以使用内部开发的VH-特异性引物(in-house developed VH-specific primers)来扩增(amplify)VH-编码cDNA的多克隆库(polyclonal pool)。如de Haard et al.，J Biol Chem.，1999Jun 25；274(26)：18218-30所述的，为供Fab片段在噬菌体上的显示，所形成的PCR产物(PCR product)接而被克隆至一个噬菌粒媒介物(phagemid vector)中，但有例外是：该轻链对于每个抗体而言是相同的并且为该媒介物所编码。在连接之后，所述噬菌粒被用来转形大肠杆菌TG1菌体(E.coli TG1 bacteria)，而被转形的细菌被平板接种在含有安比西林和葡萄糖的LB-琼脂105平板上。所有的噬菌体库(phage libraries)含有＞106个转形体(transformants)并且具有一个＞80％的插入物频率(insert frequency)。根据已建立的操作程序(establishedprotocols)，细菌在过夜生长之后被收获并且被用来制备噬菌体(de Haard et al.，JBiol Chem.，1999 Jun 25；274(26)：18218-30)。
标靶抗体(Targeting antibodies)
使用先前所描述的方法而从产生自被成功地靶标-免疫的(target-immunised)
小鼠的噬菌体抗体库来获得EGFR-和PD-L1 cLC抗体。此外，用来产生用于EGFR抗体(包括人类抗-EGFR抗体)的抗体可变结构域VH链的方法已经被描述于在此被并入本案以作为参考的审查中申请案(pending applications)：WO 2015/130173 A1；WO 2015/130172A1。
用CDR3来免疫
小鼠
为了结合至CD3的人类抗体的产生，就该人类共有轻链和一个人类重链(HC)微小基因座(minilocus)(包括一群挑选的人类V基因节段、所有的人类Ds和所有的人类Js)而为基因克隆的小鼠(参见WO 2009/157771，在此被并入本案以作为参考)系使用含有TCR/CD3的脂质球(TCR/CD3 containing lipoparticles)(Intergral Molecular)来被免疫。这些小鼠被称为
小鼠。有关于特异性重链可变区，或者具有此处所公开的序列的三价多聚体，它们可通过具有本领域中的技术人员所知道的方式来被生成。
脂质球直接从细胞表面集结(concentrate)构形上完整的胞膜蛋白质(conformationally intact membrane proteins)，允许这些复杂的蛋白质有如供抗体免疫和筛选的可溶性高浓度蛋白质来被操作(manipulated)。
在本研究中被使用于供免疫的脂质球含有5D5M TCRαβ组合。氨基酸序列(SEQ IDNO：289和SEQ ID NO：290)。
该5D5M TCRαβ组合的Hek293T-衍生的TCR/CD3脂质球系通过瞬时转染至HEK293T细胞(Intergral Molecular)中而被合成、克隆和使用于供产生含有这个TCR/CD3组合的脂质球。
5D5M TCRα(SEQ ID NO：289)
5D5M TCRβ(SEQ ID NO：290)
免疫排程表(immunization schedule)包括在第35、56、77和98天之时点(points)，于所述时点抗原-特异性Ig血清力价被检测，其系通过使用QTG-衍生的3SDXTCR/CD3阳性和阴性脂质球(positive and-negative lipoparticles)的ELISA(使用抗小鼠IgG检测)以及通过使用CD3c5E-Fc融合蛋白质(CD3c5E-Fc fusion protein)作为一正对照组的ELISA。在第35天被抽取出(drawn)的血清中被观察到的反应性将会决定那些小鼠发展出一个相关的抗-TCR/CD3反应。
对于所有被免疫的小鼠，用于抗体探索(antibody discovery)的淋巴材料(lymphoid material)被收集和储存，当有下列情况：
对于人类TCR/CD3的力价为1/300(在使用脂质球的ELISA中)；或
对于人类TCR/CD3的力价为<1/300和>1/100而且在最后的补强注射免疫期间当中不会增高。
使用脂质球的初打免疫(Priming immunisation)
为了促发(prime)
小鼠对于TCR/CD3的体液性免疫反应(humoral immuneresponse)，含有人类5D5M TCRαβ组合的脂质球被使用于免疫。脂质球和Gerbu佐剂一起被使用于第一次和第二次注射。
使用多克隆T细胞的补强注射免疫
小鼠系通过细胞悬浮液的皮下注射来被免疫。第一次的补强注射免疫品(第28天)包括一个由配于PBS中的细胞和佐剂所构成的混合物，而所有随后的注射品是仅由配于PBS中的细胞所所构成。在第35天之时对人类TCR/CD3已发展出血清IgG力价为1/300(通过使用脂质球的ELISA来被测定)的小鼠在第42、43和44天当天接受使用细胞的附加注射。不符合这些标准的小鼠接受使用细胞的补强注射免疫(第42天和第49天)。所有随后的免疫皆是当作配于PBS中的细胞的皮下注射被给予。在最后的免疫之后，小鼠被牺牲，为了血清而被放血，而脾脏和左侧腹股沟淋巴结被收集。
在ELISA中筛选来自被免疫的小鼠的血清
通过ELISA使用含有TCR/CD3的脂质球以及“空(null)”脂质球来筛选期中血清IgG力价(interim serum IgG titers)。通过使用抗-小鼠IgG染色法来测定血清IgG力价，因为这个染色法被显示是最为灵敏的(most sensitive)。
CD3结合可变结构域系使用如SEQ ID NO：92-154中所出示的一个CD3 MF的重链可变区的氨基酸序列或该重链可变区的CDR区而被制造出。
来自噬菌粒媒介物的VH-编码cDNAs至IgG-表达媒介物的再克隆(re-cloning)
所有的靶标-特异性克隆体(target-specific clones)的VH-编码cDNAs被定序。根据序列同一性和簇团分析(cluster analysis)的一群挑选的独特克隆体接而被再克隆至不同的IgG表达媒介物，使用SfiI-BstEII或SfiI/XhoI消化(digestion)以及根据标准化的分子生物学技术(standardised molecular biological techniques)来完成具有被消化的cDNAs的库(pool)至IgG表达质体之中的连接。
来自培养物上清液的抗体的纯化
含有抗体的培养基被收获并且离心以移除细胞碎片(cell debris)。随后蛋白质ASepharose珠粒被添加至该培养基。该培养基和蛋白质A Sepharose珠粒连同抗体被培育以允许结合。
在培育之后，通过一个真空过滤器(vacuum filter)，所述珠粒从该培养基被分离出并且清洗。所述抗体系通过使用洗提缓冲液(elution buffer)的培育而从所述珠粒被洗脱(eluted)。
选择性地，被纯化的IgG的缓冲液被交换(exchanged)/脱盐。
缓冲液交换(Buffer exchange)
为了要将被纯化的IgG脱盐，使用一个滤板(filter plate)或滤柱(filtercolumn)来离心抗体分馏物。该滤板或滤柱被离心以减少该抗体分馏物的容积。随后，PBS或所需要的缓冲液被添加至该分馏物，以用一低盐缓冲液来替换该缓冲液。选择性地，该离心步骤继之以添加缓冲液被重复，以便进一步将该抗体的储存缓冲液脱盐。
实施例9：具有一肿瘤细胞抗原位于短臂或长臂上的三特异性抗体的产生
三特异性抗体系通过两个编码具有不同VH结构域的IgG的质体的短暂共转染(transient co-transfection)、使用用于三特异性抗体的有效的异二聚体化与形成的CH3工程化技术来被产生。共有轻链也被共转染于相同的细胞中，其系位于相同的质体或者另一个质体上。在我们的共审查中申请案(co-pending applications)(例如WO 2013/157954以及WO 2013/157953，在此被并入本案以作为参考)中，我们已公开从一个单细胞来生成多特异性抗体的方法和方式，而因此有利于多特异性抗体的形成胜过单特异性抗体的形成的方式被提供。这些方法也可以有利地被运用在本发明中用于多价构建体多聚体(包括三特异性抗体)的产生。
具体地，用于占优势地生成三特异性全长的IgG分子的优选变化是有关于一个人类野生型序列在位置351和366的氨基酸取代，例如位于第1个CH3结构域(“KK-变异体”重链)中的L351K和T366K(根据EU编号法来编号)，以及位于位置351和368的氨基酸取代，例如位于第2个CH3结构域(“DE-变异体”重链)中的L351D和L368E，反之亦然。先前在我们的共审查中申请案的内被证明的是：带负电荷的(negatively charged)DE-变异体重链和带正电荷的(positively charged)KK-变异体重链优先地配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”分子)。DE-变异体重链或KK-变异体重链的同质二聚体化(DE-DE同质二聚体或KK-KK同质二聚体)由于位于相同重链之间的CH3-CH3接口中的带电荷残基之间的强烈排斥而几乎不会发生。
根据本发明，该免疫细胞接合结合结构域或该肿瘤抗原结合结构域可以被放置在该多价分子的任何位置(包括该长臂或该短臂的远程或内部位置)上，而异二聚体化技术可以被应用以有利地产生该三特异性分子胜过单特异性、双价同质二聚体或四特异性(quadrospecific)同质二聚体。
首先，已被证实的是：一个肿瘤细胞抗原结合结构域可以被放置在该长臂或该短臂的远程或内部区域处。
对于此处所述的三特异性和/或三价抗体的每一者，表达系通过被调适的293细胞的悬浮生长而被完成，所述细胞被培养于位于一个振荡器盘(shaker plateau)上的T125培养瓶(T125 flasks)内直到一为3.0×106个细胞/mL的密度。细胞在一为0.3-0.5×106个活细胞/mL的密度之下被播种至一个24深孔培养盘的每个孔的内。所述细胞被短暂转染以一个由两种编码不同的抗体、被克隆至专属媒介物系统的内的质体所构成的混合物。在转染7天之后，细胞上清液被收获并且被过滤通经一个0.22μm过滤器。无菌之上清液被储存在4℃之下直到所述三特异性抗体的纯化之时。
关于一个具有一个免疫接合结合结构域位于该长臂的内部位置以及一个肿瘤细胞抗原位于该短臂的三特异性分子的一实施例，编码用于CD3结合结构域(MF8078)的VH基因、本发明的一个接头以及一个破伤风类毒素(TT)结合结构域(MF1337)的DNA被克隆到一个编码该带正电荷的CH3结构域(KK)的媒介物的内，而编码用于EGFR结合结构域(MF8233)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带负电荷的CH3结构域(DE)的媒介物的内，而因此编码一个具有EGFRxCD3：TT的三特异性分子。用于该3个结合结构域的重链可变区被阐述于表13中，而关于这些三特异性分子的活性被描述于图15a和16a中。关于这些三特异性分子，每个重链可变区配对以一个共有轻链(SEQ ID NO：29)。
表13：
关于一个具有一个免疫接合结合结构域位于该长臂的内部位置以及一个肿瘤细胞抗原位于该长臂的远程位置的三特异性分子的一实施例，编码用于CD3结合结构域(MF8078)的VH基因、本发明的一个接头的DNA以及编码用于EGFR结合结构域(MF8233)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带正电荷的CH3结构域(KK)的媒介物的内，而编码用于甲状腺球蛋白结合结构域(“Thyro”)(MF1025)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带负电荷的CH3结构域(DE)的媒介物的内，而因此编码一个具有ThyroxCD3：EGFR的三特异性分子。图14b。用于该3个结合结构域的重链可变区被阐述于表14中，而关于这些三特异性分子的活性被描述于图15b和16b中。关于这些三特异性分子，每个重链可变区与一个共有轻链配对(SEQ ID NO：29)。
表14：
实施例10：将肿瘤细胞抗原结合结构域定位在T细胞接合三价分子的短臂或长臂
上的效果
细胞系
BxPC3是一种人类胰脏癌(pancreatic cancer)细胞系。
HCT-116是一种人类结肠癌(colon carcinoma)细胞系。
上述系列的三特异性IgGs系在24孔生成法(24 well production)之下被产生，该24孔生成法将11个不同的接头并入至含有一个抗-EGFR结合结构域位于短臂上(图14a和表13)以及一个抗-EGFR结合结构域位于长臂上(图14b和表14)的三特异性分子(trispecifics)以及一系列的对照组抗体的内。这些分子已就它们引起T细胞活化的能力以及在一个细胞毒性分析(cytotoxicity assay)来被评估。
根据标准技术使用Ficoll和EasySep人类T细胞分离套组(Ficoll and EasySephuman T cell isolation kit)而从来自健康的供给者(healthy donors)的全血(wholeblood)分离出静止T细胞(resting T cells)，通过抗-CD3抗体使用流动式细胞测量术分析(flow cytometric analysis)来检查＞95％T细胞纯度(T cell purity)以及随后被冷冻保存(cryopreserved)。关于一个细胞毒性分析，冷冻保存的T细胞被解冻(thawed)并且被使用，如果在解冻之时它们的存活率(viability)通过标准锥虫蓝染色法(standardTrypan Blue staining)来被测定是＞90％。细胞毒性分析简而言的，被解冻的静止T细胞和BxPC3(图15)或HCT116(图16和17)靶细胞以一为5∶1的E∶T比例被共培养(co-cultured)历时48小时。关于所述三价抗体，一个从一浓度为4μg/mL开始的6步骤3倍稀释系列(6-step3 fold dilution series)被使用。EGFRxCD3双特异性抗体被使用作一正对照组；模拟x模拟：模拟、模拟xCD3：模拟和EGFRx模拟：模拟三价抗体被使用为特异性对照组。T细胞活化系使用流动式细胞测量术(flow cytometry)来被定量(quantified)；CD4和CD8 T细胞系根据CD4和CD8表达来被闸控(gated)并且随后通过测量T细胞上的CD25和CD69表达来分析它们的活化状态(activation status)。靶细胞裂解系通过测量透过CellTiterGlo(Promega)来被评估的ATP水平来测量活细胞的分率(fraction)而被测定。ATP水平，通过在一个Envision微盘式分析仪上的发光来被测量，结果为相对光单位(RLU)数值，所述RLU数值系使用GraphPad Prism被分析。
关于每个样品的靶细胞裂解系如下来被计算：
杀灭％＝(100-(RLU样品/RLU无IgG)×100)
这些有关于T细胞活化(参见图15)和细胞毒性(图16)的数据证明所述三特异性抗体是有功能的。如图15和16中所显示的，仿真xCD3：EGFR以及EGFRxCD3：模拟三特异性分子被证明系能够诱发EGFR标靶特异性T细胞活化和细胞毒性。就T细胞活化(图15)和细胞毒性(图16)这两者而言，当该抗-EGFR Fab被放置在该长臂的远程位置上，该仿真xCD3：EGFR三特异性分子显示出增强的活性胜过双特异性EGFRxCD3和具有EGFR结合结构域位于该短臂上以及该CD3与模拟TT(MF1337)结合结构域位于该长臂上的三特异性分子(参见图14a)这两者。
此外，如图17b-d所显示的，根据具有EGFR和CD3位于该长臂上的所述三特异性抗体的活性，所述接头可以被装入(binned)至与相对高的细胞激素生成相关的那些[IgG1 UH(SEQ ID NO：2)、IgG1 MH(SEQ ID NO：11)、IgG2A MH(SEQ ID NO：4)和IgG1 G4S(SEQ IDNO：12)]以及与相对低的细胞激素生成相关的那些[IgG1 UL(SEQ ID NO：14)、IgG2A H(SEQID NO：15)、IgG2BR(SEQ ID NO：21)、IgG2A R(SEQ ID NO：20)、IgG1 H(SEQ ID NO：19)、IgG1R(SEQ ID NO：23)]之中。接头使用上的变化以及在细胞毒性上的冲击是不太明显的。图17a。
实施例11：具有一个免疫细胞接合结合结构域位于该短臂或长臂上的三特异性抗
体的产生
根据本发明，该免疫细胞接合结合结构域可以被放置在该多价分子的任何位置(包括该长臂或该短臂的远程或内部位置)上，而异二聚体化技术可以被应用以有利地产生该三价分子。参见图18(CD3结合结构域位于该短臂上)、图19(CD3结合结构域位于长臂内部上)和图25(CD3结合结构域位于长臂远程上)。
举例来说，一个免疫接合结构域被定位在该短臂处，其中编码用于该CD3结合结构域(MF8078)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带正电荷的CH3结构域(KK)的媒介物的内，而编码用于该EGFR结合结构域[MF9988(SEQ ID NO：218)或MF9891(SEQ ID NO：191)]的VH基因、该接头IgG2A MH以及用于该PD-L1结合结构域[MF5380(SEQ ID NO：173)或MF5444(SEQ ID NO：164)]的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带负电荷的CH3结构域(DE)的媒介物的内。图18(CD3xPD-L1：EGFR)。
表15：
另选地，一个免疫接合结构域被定位在该长臂的内部位置处，其中编码用于一个CD3结合结构域(MF8078)的VH基因、该接头IgG2A MH(SEQ ID NO：4)以及一个用于一个PD-L1结合结构域[MF5444(SEQ ID NO：164)、MF5380(SEQ ID NO：173)、MF5377(SEQ ID NO：155)]的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带正电荷的CH3结构域(KK)的媒介物的内，而编码用于一个EGFR结合结构域[MF9886(SEQ ID NO：200)、MF9988(SEQ ID NO：218)、MF9891(SEQ ID NO：191)或MF9873(SEQ ID NO：209)]的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带负电荷的CH3结构域(DE)的媒介物的内。图19(EGFRxCD3：PD-L1)。
表16：
另选地，一个免疫接合结构域被定位在该长臂的远程位置上，其中编码用于一个CD3结合结构域[MF8078(SEQ ID NO：110)、MF8508(SEQ ID NO：128)或MF8057(SEQ ID NO：92)]的VH基因、一个接头IgG 1H(SEQ ID NO：19)以及一个用于一个纤维蛋白原结合结构域(“Fibri”)(MF1025)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带正电荷的CH3结构域(KK)的媒介物的内，而编码用于一个EGFR结合结构域(MF8233)的VH基因的DNA被克隆到一个编码该带负电荷的CH3结构域(DE)的媒介物的内。图24(EGFRxFibri：CD3)。
表17：
关于上面所述以及被阐述于图18、19和24之中的所述三特异性分子的每一者，每个重链可变区与一个共有轻链配对(SEQ ID NO：29)。
如下面被进一步描述的，每一种CD3结合结构域安置(placement)被证明在产生对抗表达一个或多个暴露在细胞外的肿瘤细胞抗原的细胞的T细胞细胞毒性或活化之下是有效的。
实施例12：关于EGFRxCD3：PD-L1的三特异性型式经由CD3的有效的双重肿瘤抗原
结合以及T细胞接合
细胞系：
MDA-MB-231细胞(
HTB-26)是乳癌细胞；衍生自转移的地址(metastaticsite)。
三特异性抗体系根据在图19处的型式被生成以透过细胞毒性来分析此分子可达成同时的肿瘤抗原标靶和T细胞接合的能力。这些抗体系通过上面所述的技术而被产生。
具有一定范围的亲和力(从相对高至低)的4个抗-EGFR Fabs(MF9886、MF9988、MF9891、MF9873)被使用于该短臂并且被组合以用于该远程长臂的也含有一定范围的亲和力的不同抗-PD-L1 Fabs(MF5444、MF5380和MF5377)。该抗-CD3 Fab与接头被保持恒定，使用MF8078以及接头IgG2 AMH(SEQ ID NO：4)。
关于EGFR和PD-L1亲和力的排序系分别地根据来自表18和19的数据；该排序系根据相对于一个如下面所述的参考抗-EGFR和抗-PD-L1抗体的结合。
表18：具有重链MF9886、MF9988、MF9891、MF9873的EGFR组(EGFRpanel)单特异性双
价EGFR抗体
| MF | MDA-MB-231细胞(％) |
| 9886 | 10.7 |
| 9988 | 21.0 |
| 9891 | 44.2 |
| 9873 | 82.5 |
| 8233 | 100 |
EGFR重链的亲和力排序系根据这些单特异性双价抗体，相较于一个具有重链MF8233的单特异性双价抗体的正对照组，去结合如上面所阐述的表达EGFR的细胞的相对能力(relative ability)。
表19：具有重链MF5444、MF5380和MF5377的PD-L1组单特异性双价PD-L1抗体
| 抗-PD-L1重链 | 结合至huPD-L1 | 比值EC<sub>50</sub>/RG7446的EC<sub>50</sub> |
| MF5377 | 是 | 3.09 |
| MF5380 | 是 | 3.67 |
| MF5444 | 是 | 5.46 |
所述PD-L1重链臂的相对亲和力排序系根据在ELISA中结合人类PD-L1的能力。为此，ELISA盘被涂覆以从10μg/mL开始的呈一个8步骤3倍滴定稀释范围(8-step，3-foldtitration diulation range)的huPD-L1-His(Sinobiological)。随后地，每个PD-L1 Fab的结合系有如一个PD-L1xTT IgG 5μg/mL来被评估。关于结合的EC50值被测定并且就存在于每个ELISA盘上的抗-PD-L1 RG7446 MPDL3280A(参见US 2010/0203056)所测定的结合EC50来被归一化。
这些三特异性EGFRxCD3：PD-L1分子接而根据之前在此针对两个对于肿瘤细胞抗原具有不同的抗原密度的细胞系(HCT116和MDA-MB-231)所描述的方法来测试它们去诱发细胞毒性的能力。这些细胞系的表达曲线(expression profiles)系通过FACS染色法(FACSstaining)使用对照组抗体[西妥昔单抗(cetuximab)用于EGFR，以及MPDL3280A用于PD-L1)来被测定，有关于感兴趣的抗原的表达当平均荧光量值(mean fluorescence intensity，MFI)是3倍高于背景信号(background signal)之时被认为是阳性的。对于PD-L1系以3次重复(triplicates)来执行，而对于EGFR系以4次重复(quadruplicates)来执行，而且结果系如下面所阐述的被当作MFI来报导。
表20：
| 细胞系 | EGFR(MFI) | PD-L1(MFI) |
| HCT116 | 178,523 | 10,876 |
| MDA-MB-231 | 276,915 | 74,581 |
这个检查所述三特异性分子对抗这些细胞系的细胞毒性的研究显示出所述EGFRxCD3：PD-L1三特异性分子的全部3个结合结构域能够同时结合该两个肿瘤细胞抗原和CD3，而使得所述三特异性分子的该两个肿瘤抗原结合结构域在T细胞接合之时促成细胞毒性。图20和21(对抗MDA-MB-231细胞)以及图22(对抗HCT116细胞)。这些三特异性分子大抵上显示出增强的功能活性胜过该双特异性EGFRxCD3x模拟以及所述模拟xCD3xPD-L1对照组，以该三特异性分子9873x8078：5377显示出最大的百分比裂解(largest percentlysis)。图21。在此被测试的所述三特异性分子在对抗MDA-MB-231细胞(相较于HCT116细胞具有相对高的目标抗原水平)是最有效的。图21和22。
实施例13：关于CD3xPD-L1：EGFR的三特异性型式经由CD3的有效的双重肿瘤抗原
结合以及T细胞接合
三特异性抗体系根据在图18处的型式被生成，以进一步显示在免疫接合结构域系存在于该短臂上的情况下的同时的肿瘤抗原标靶。这些抗体系通过上面所述的技术而被产生。关于这个型式，如同就CD3xPD-L1：EGFR分子而观察到的，当通过FACS在MDA-MB-231细胞上来进行测量时，双重的抗原标靶-相关的结合被证明，而使得随着增高的PD-L1亲和力，存在有靶标细胞结合的一持续的增强。图23a。对于具有该CD3xPD-L1：EGFR的型式的这些三特异性分子之中的某些，同时的双重抗原结合和免疫细胞接合已被证明在BxPC3细胞的细胞毒性上系具有一相加效应胜过结合一个单一抗原和CD3(重链序列未示出)的分子，验证这些分子要同时地接合全部3个结合臂的能力。图23b。关于这些数据的细胞毒性分析的操作程序已被描述于上。
实施例14：关于EGFRx纤维蛋白原：CD3的三特异性型式经由位于远程长臂处的CD3
的有效的T细胞活化
Jurkat-NFAT-RE-luc2细胞(Promega)是一种被基因工程化的Jurkat T细胞系，它表达一个被一个NFAT-反应要素(NFAT-response element，NFAT-RE)所驱动的荧光素酶报导子(luciferase reporter)。
HT29(ATCC HTB-38)是一种人类结肠癌细胞。
一个有关于将CD3结合结构域放置在该长臂的远程区域上的研究被执行，使用一为EGFR(MF8233)x纤维蛋白原(MF1122)：CD3(MF8078)的三价分子。图24。在Jurkat-NFAT-RE-luc2细胞执行一个针对靶标细胞HT29的T细胞活化分析，以建立有关于这个型式的功能性T细胞活化能力。报导子分析(reporter assay)简述：Jurkat效应子T细胞与靶标细胞在一个浓度范围的三特异性抗体和对照组抗体的存在下被共培养。在5个小时的培育之后，使用Bio-Glo荧光素酶分析系统(Bio-Glo Luciferase Assay System)(Promega)，报导细胞(reporter cells)的荧光素酶活性被测量以作为一有关于T细胞活化的读出。发光活性系在一个Envision微盘式分析仪上被测量，结果为相对光单位(RLU)数值，所述RLU数值系使用GraphPad Prism被分析。
如图25中所显示的，T细胞通过EGFRxFibri：CD3三特异性分子的活化被证明系在相等于或大于正对照组的水平之下，该正对照组是一个之前被证明产生(engender)图15a中的T细胞活化的EGFRxCD3抗体。
实施例15：关于一系列的CD3结合结构域与接头经由CD3的有效的肿瘤抗原结合以
及T细胞接合
一组的EGFRxCD3：EGFR双特异性三价分子被产生(图26)以证明跨越各式各样的不同CD3、免疫细胞接合结合结构域以及8个不同的接头的肿瘤标靶和T细胞接合的功效。每个三价分子含有两个相同的抗-EGFR结合结构域(MF9891)位于该短臂和远程长臂位置处，以及该CD3结合结构域位于该内部长臂位置处。关于这个研究，通过先前所述的方法，一种为Jurkat-NFAT-RE-luc2细胞的报导细胞系以及靶细胞HCT116[中间物EGFR表达(intermediate EGFR expression)]和MDA-MB-231被用来测量T细胞活化。关于一个负对照组，使用一个来自不同超级簇团的CD3结合结构域的三价分子被生成为模拟xCD3x模拟或双特异性[EGFR(MF8233)xTT(MF1337)](4,000ng/mL)。读出系仰赖在5个小时的培育之后的报导子活化(reporter activation)。
来自变化的超级簇团的每个被测试的CD3结合结构域证明了使用HCT116细胞的报导子活性，而以一个来自超级簇团7的CD3结合结构域证明有最低的相对报导子活性，同时证明了一系列的(a spectrum of)根据接头臂的活性。相反地，不管接头臂是谁，该两个来自超级簇团1的CD3结合结构域(MF8058和MF8078)以及一个来自超级簇团4的CD3结合结构域(MF8508)证明了相对一致的活性。最后，一个属于超级簇团1的CD3结合结构域(MF8057)证明了相对低的报导子活性，这提供某种与不同接头相关联的分化。参见图27。这些数据的一回顾指出：跨越超级簇团，含有IgG1MH接头的三价分子看来一致地是最有效的。
同样地，来自变化的超级簇团的每个被测试的CD3结合结构域证明了使用MDA-MB-231细胞的报导子活性，而以来自超级簇团7的CD3结合结构域证明有相对低的相对报导子活性，随同一系列的根据所用的接头的活性。相反地，3个来自超级簇团1的CD3结合结构域(MF8057、MF8058和MF8078)以及来自超级簇团4的CD3结合结构域证明了极为相似的活性，不管所用的接头是谁。参见图28。
表21
用于双特异性分子的产生的IgG重链。表21A：CH1区。表21B：铰链区。表21C：CH2区。表21D：含有L235G和G236R沉默化取代的CH2。表21E：含有取代L351K和T366K(KK)的CH3结构域。表21F：含有取代L351D和L368E(DE)的CH3结构域。
表21A
CH1：
表21B
铰链：
表21C
CH2：
表21D
含有L235G和G236R沉默化取代的CH2：
表21E
CH3：DEKK的KK
表21F
CH3：DEKK的DE
Claims (83)
1.一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，
其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且
其中所述接头包括铰链序列或衍生自铰链序列的序列。
2.根据权利要求1所述的多价抗体，其中至少一个附加的结合结构域包括Fv结构域、Fab结构域或经修饰的Fab结构域。
3.根据权利要求1所述的多价抗体，其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区并且通过所述接头连接至所述碱性抗体部分，所述接头连接所述碱性抗体部分的可变区与所述CH1区。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述共有可变区呈包括VL-CL的共有轻链的形式。
5.根据权利要求4所述的多价抗体，其中所述共有轻链包括SEQ ID N0：29的序列。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的多价抗体，其中所述共有可变区呈包括VH-CH1的共有重链的形式。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域结合不同的表位。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其结合至少三个不同的表位。
9.一种多价抗体，其包括：
-包括两个结合结构域的碱性抗体部分；以及
-至少一个附加的结合结构域，
其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区并且通过所述接头连接至所述碱性抗体部分，所述接头连接所述碱性抗体部分的可变区与所述CH1区，并且
其中所述多价抗体结合至至少三个不同的表位。
10.根据权利要求9所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区。
11.根据权利要求9或10所述的多价抗体，其中至少一个附加的结合结构域包括Fv结构域、Fab结构域或经修饰的Fab结构域。
12.根据权利要求10或11所述的多价抗体，其中所述共有可变区呈包括VL-CL的共有轻链的形式。
13.根据权利要求12所述的多价抗体，其中所述共有轻链包括SEQ ID NO：29的序列。
14.根据权利要求10或11所述的多价抗体，其中所述共有可变区呈包括VH-CH1的共有重链的形式。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域结合不同的表位。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头包括如SEQ ID NO：1至24中的任一者所阐述的序列或对SEQ ID NO：1至24中的任一者具有至少约85％序列同一性的多肽。
17.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分是全长免疫球蛋白。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的所述结合结构域是Fab结构域。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述抗体的碱性部分包括与第二CH3结构域二聚体化的第一CH3结构域，其中第一CH3结构域包括位于位置351和366处或者对应于这些位置的位置处的氨基酸残基赖氨酸，并且其中第二CH3结构域包括位于351处的天冬氨酸的氨基酸残基以及位于368处的谷氨酸的氨基酸残基或者位于对应于这些位置的位置处的氨基酸残基。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述抗体的所述结合结构域的所述共有可变区由核酸编码，所述核酸得自于、衍生自或基于由转基因的啮齿动物所编码的核酸，所述转基因的啮齿动物在其种系内包括重排的可变链核酸序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的每个Fab结构域经由接头连接至附加的结合结构域。
22.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的结合结构域的N-端端部经由接头连接至一个附加的结合结构域的C-端端部。
23.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的第一结合结构域的N-端端部经由接头连接至第一附加的结合结构域的C-端端部，并且其中所述碱性抗体部分的第二结合结构域的N-端端部经由接头连接至第二附加的结合结构域的C-端端部。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体部分的第一结合结构域的N-端端部经由接头连接至第一附加的结合结构域的C-端端部，并且其中第二附加的结合结构域的C-端端部经由接头连接至所述第一附加的结合结构域的N-端端部。
25.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其能够结合至至少四个不同的表位。
26.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其能够结合至至少两个不同的抗原。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中至少一个附加的结合结构域是Fab结构域，并且相较于所述碱性抗体部分的CH1，所述附加的Fab结构域包括属于不同子类的CH1。
28.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头是短的、长的、带电荷的、刚性的或可挠曲的。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头的氨基酸序列包括天然存在的序列或者包括衍生自天然存在的序列的序列。
30.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头包括中间铰链区序列。
31.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头包括上部铰链序列和下部铰链序列。
32.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述接头包括螺旋形成序列。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的多价抗体，其中所述接头包括根据SEQ ID NO：1至24中的任一者的氨基酸序列。
34.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中至少一个附加的结合结构域包括CH1结构域。
35.根据前述权利要求中任一项所述的多价抗体，其中所述结合结构域中的至少一者特异性地结合至位于免疫效应子细胞上的抗原。
36.根据权利要求35所述的多价抗体，其中所述免疫效应子细胞是T细胞。
37.根据权利要求36所述的多价抗体，其中位于所述T细胞上的抗原是CD3。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的多价抗体，其中所述结合结构域中的至少一者特异性地结合至位于异常细胞上的抗原。
39.根据权利要求38所述的多价抗体，其中至少两个结合结构域特异性地结合至位于异常细胞上的抗原。
40.根据权利要求39所述的多价抗体，其中所述至少两个结合结构域特异性地结合至位于异常细胞上的至少两个不同的抗原。
41.根据权利要求40所述的多价抗体，其中所述至少两个结合结构域特异性地结合至至少EGFR和PD-L1。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的多价抗体，其中第一结合结构域特异性地结合PD-L1，第二结合结构域特异性地结合CD3，并且第三结合结构域特异性地结合至EGFR。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的多价抗体，其中所述异常细胞是肿瘤细胞。
44.根据权利要求35至43中任一项所述的多价抗体，其中所述碱性抗体包括结合结构域1和2，并且其中所述附加的结合结构域3连接至结合结构域1，并且其中任选的附加的结合结构域4连接至结合结构域2。
45.根据权利要求44所述的多价抗体，其中结合结构域1是CD3结合结构域，并且结合结构域2和3结合至不同的靶细胞抗原。
46.根据权利要求44所述的多价抗体，其中结合结构域2是CD3结合结构域，并且结合结构域1和3结合至不同的靶细胞抗原。
47.根据权利要求44所述的多价抗体，其中结合结构域3是CD3结合结构域，并且结合结构域1和2结合至不同的靶细胞抗原。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的多价抗体，其包括还结合另外不同的靶细胞抗原的结合结构域4。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的多价抗体，其中所述靶细胞抗原结合结构域中的第一靶细胞抗原结合结构域结合PD-L1、EGFR、CD137、CLEC12A、纤维蛋白原或甲状腺球蛋白。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的多价抗体，其中所述第一靶细胞结合结构域和第二靶细胞结合结构域结合不同的抗原。
51.根据权利要求50所述的多价抗体，其中所述靶细胞抗原结合结构域中的第一靶细胞抗原结合结构域和第二靶细胞抗原结合结构域结合选自PD-L1、EGFR、CD137、CLEC12A、纤维蛋白原和甲状腺球蛋白的抗原。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的多价抗体，其中所述CD3结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括带有MF8057、或MF8058、或MF8078、或MF8397、或MF8508、或MF9249或MF9267的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
53.根据权利要求44至52中任一项所述的多价抗体，其中所述CD3结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区带有MF8057、MF8058、MF8078、MF8397、MF8508、MF9249或MF9267的VH的氨基酸序列，在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的多价抗体，其中靶细胞抗原结合结构域是PD-L1结合结构域。
55.根据权利要求54所述的多价抗体，其中所述PD-L1结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括带有MF5377、或MF5444或MF5380的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的多价抗体，其中所述PD-L1结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区带有MF5377、MF5444或MF5380的VH的氨基酸序列，在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
57.根据权利要求44至56中任一项所述的多价抗体，其中靶细胞抗原结合结构域是EGFR结合结构域。
58.根据权利要求57所述的多价抗体，其中所述EGFR结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括带有MF8233、或MF9891、或MF9886、或MF9873或MF9988的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的多价抗体，其中所述EGFR结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区带有MF8233、MF9891、MF9886、MF9873或MF9988的VH的氨基酸序列，在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
60.根据权利要求44至59中任一项所述的多价抗体，其中靶细胞抗原结合结构域是CLEC12A结合结构域。
61.根据权利要求60所述的多价抗体，其中所述CLEC12A结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括带有MF4327的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的多价抗体，其中所述CLEC12A结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区带有MF4327的VH的氨基酸序列，在一个或多个除CDR之外的位置处具有0至10个、优选地0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。
63.根据权利要求52至62中任一项所述的多价抗体，其包括CD3结合结构域、EGFR结合结构域以及PD-L1结合结构域。
64.一种用于多价抗体的制备的方法，所述方法包括：
提供包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为根据权利要求1至63中任一项所述的多价抗体；以及
在用于提供所述多肽的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养所述宿主细胞。
65.一种用于多价抗体的制备的方法，所述方法包括：
提供包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，所述至少一个接头包括铰链序列或衍生自铰链序列的序列，
在用于提供所述碱性抗体部分、所述至少一个附加的结合结构域以及所述至少一个接头的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养所述宿主细胞，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，并且其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区。
66.一种用于多价抗体的制备的方法，所述方法包括：
提供包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，
在用于提供所述碱性抗体部分、所述至少一个附加的结合结构域以及所述至少一个接头的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养所述宿主细胞，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且其中所述多价抗体结合至至少三个不同的表位。
67.一种用于多价抗体的制备的方法，所述方法包括：
提供包括一个或多个编码多肽的核酸序列的细胞，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，
在用于提供所述碱性抗体部分、所述至少一个附加的结合结构域以及所述至少一个接头的表达以及它们的组装成为多价抗体的条件下来培养所述宿主细胞，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且其中每个结合结构域包括重排可变区，所述重排可变区得自于、基于或衍生自已经历响应于抗原刺激的体细胞重组的核酸以与所述共有可变区形成Fab结构域。
68.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中至少一个附加的结合结构域包括Fv结构域、Fab结构域或经修饰的Fab结构域。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，其中至少一个附加的结合结构域包括CH1区。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述共有可变区呈包括VL-CL的共有轻链的形式。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述共有轻链包括SEQ ID NO：29的序列。
72.根据权利要求64至71中任一项所述的方法，其中所述共有可变区呈包括VH-CH1的共有重链的形式。
73.根据权利要求64至72中任一项所述的方法，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域结合不同的表位。
74.一种细胞，其包括一个或多个编码多肽的核酸序列，所述多肽能够组装成为根据权利要求1至63中任一项所述的多价抗体。
75.一种细胞，其包括一个或多个编码多肽的核酸序列，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，所述至少一个接头包括铰链序列或衍生自铰链序列的序列，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，并且其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区。
76.一种细胞，其包括一个或多个编码多肽的核酸序列，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且其中所述多价抗体结合至至少三个不同的表位。
77.一种细胞，其包括一个或多个编码多肽的核酸序列，所述多肽能够组装成为：(i)包括两个结合结构域的碱性抗体部分；(ii)至少一个附加的结合结构域；以及(iii)至少一个接头，
其中在组装时，所述碱性抗体部分通过接头连接至所述至少一个附加的结合结构域，其中所述碱性抗体部分的每个结合结构域以及所述至少一个附加的结合结构域中的每个附加的结合结构域全部具有共有可变区，并且其中每个共有可变区已和它的同源区共同演化。
78.一种多肽，其包括如SEQ ID N0：3至5、7至11或13至24中的任一者所阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID N0：3至5、7至11或13至24中的任一者具有至少约85％序列同一性的多肽。
79.一种核酸序列，其编码根据权利要求78所述的多肽。
80.一种媒介物，其包括根据权利要求79所述的核酸序列。
81.一种药学组合物，其包括根据权利要求1至63中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
82.根据权利要求1至63中任一项所述的多价抗体，其用于人类或动物体透过疗法的治疗。
83.一种用于患有医疗病症的人类或动物的治疗的方法，所述方法包括向所述人类或动物施用治疗有效量的根据权利要求1至63中任一项所述的抗体。
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