JP2022550976A - ハイブリッド抗体 - Google Patents
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Abstract
がんの治療における使用のための標的化されたハイブリッド抗体が本明細書に記載される。抗体は、Fcε受容体及び胎児性Fc受容体に対する結合能を有し、それは、例えばIgE定常ドメインにおける配列又はアミノ酸を、IgGに由来する相当する配列及びアミノ酸で置き換えることによって達成され得る。
Description
本発明は、それらの治療的使用とともに、合成(天然に存在しない)ハイブリッド抗体、特にハイブリッドIgE抗体の設計にある。
免疫グロブリンE(IgE,immunoglobulin E)は、哺乳類にのみ見出されている抗体のクラス(又は、免疫グロブリン(Ig)「アイソタイプ」)である。IgEは形質細胞によって合成される。すべての抗体クラスと同様に、IgEの単量体は、2本のより大きな同一の重鎖(ε鎖)及び2本の同一の軽鎖(すべての抗体クラスに共通である)からなり、ε鎖は4つのIg様定常ドメイン(Cε1~Cε4)を含有する。
異なる抗体クラスを区別するのは重鎖の性質であり、IgEクラスのものは、より一般的なIgGクラスの重鎖よりも大きく、より大量にグリコシル化される。各抗体鎖は、一連の直列に並んだ免疫グロブリンドメインから構成される。N末端ドメイン(軽鎖及び重鎖上にそれぞれ1つ)は、広範にわたる抗原への結合を可能にする高度に可変の配列の領域(可変ドメイン)を含有する。残りのドメインは、高度に保存されたいわゆる定常(Fc)ドメインからなる。
IgEの1つの機能は、蠕虫等の寄生生物に対する免疫である。IgEは、アレルギー性喘息、大部分のタイプの副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、並びに特異的タイプの慢性蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎等の様々なアレルギー性疾患として現れるI型過敏症においても必須の役割を有する。IgEは、アナフィラキシー性薬物、ハチの針、及び脱感作免疫療法において使用される抗原調製物等のアレルゲンに応答して極めて重大な役割も果たす。
IgEは、典型的に最も存在量の少ないアイソタイプであるが、正常な(「非アトピー性」)個体におけるIgEレベルは、大部分の古典的適応免疫応答に関与するアイソタイプでありかつ最も強力な炎症反応を誘発し得る10mg/mlのIgGに関する75%と比較して、Ig濃度のほんの0.05%である。
IgGは、血液及び細胞外液に見出される主なタイプの抗体であり、身体組織の感染を制御することを可能にする。ウイルス、細菌、及び真菌等の多くの種類の病原体に結合することによって、IgGは身体を感染から守る。IgG抗体は、4本のペプチド鎖から作製される約150kDaの分子量を有する大きな分子である。各分子は、約50kDaの2本の同一クラスのγ重鎖、及び約25kDaの2本の同一の軽鎖、したがって四量体の4次構造を含有する。2本の重鎖は、互いに及び軽鎖に、それぞれジスルフィド結合によって連結される。結果として生じる四量体は2つの同一の半分を有し、それは一緒にY様の形状を形成する。二股の各末端は、同一の抗原結合部位を含有する。
構造の差異は、多数のエフェクター細胞、及び各抗体クラスの異なる定常ドメインに結合する因子に起因して、抗体のクラス間で異なる生物学的活性を付与する。IgGのガンマ鎖は、古典的な膜結合型表面受容体並びに非定型の細胞内受容体及び細胞質糖タンパク質を含む、幅広いファミリーの受容体に結合する。膜結合型表面受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(CD16)、及びFcγRIIIbを含む。同様に、IgEのエプシロン鎖は、高アフィニティー受容体FcεRI及びより低いアフィニティー受容体FcεRIIに結合する。種々の免疫エフェクター細胞上のこれらの様々な受容体の差示的発現は、IgG及びIgEによって生み出され得る免疫応答のタイプを決定する。
非定型FcγRの間で、胎児性Fc受容体(FcRn,neonatal Fc receptor)は、IgG生物学に対するその緊密な影響、及びアルブミンにも結合するその能力を考慮して、悪名を得ている。FcRnは、循環においてIgG及びアルブミンを維持すること、並びに極性細胞壁を越えてこれら2種のリガンドを双方向に輸送することに関与する、リサイクリング又はトランスサイトーシス受容体として機能する。FcRnは、IgG免疫複合体(IC,immune complex)と相互作用し、かつそれに由来するペプチドの抗原提示を促すことによって、免疫受容体として作用することも解されている。
胎児性Fc受容体(FcRn)は、広域でかつ機能的に多様なファミリーのMHC分子に属する。古典的MHCファミリーメンバーとは違って、FcRnはほとんど多様性を所有せず、抗原を提示することができない。その代わりに、低いpHで高いアフィニティーでIgG及びアルブミンに結合するその能力を通じて、FcRnは、これらタンパク質の両方の血清半減期を調節する。IgGは、FcRnに結合しないIgEを含む同様のサイズの球状タンパク質よりも実質的に長い血清半減期を享受する(IgGに関して大体21日間、及びIgGに関して2日間未満)。加えて、FcRnは、IgGの寿命に影響を及ぼすその能力、並びに先天性及び適応免疫応答へのその参加の両方を通じて、粘膜及び全身部位での免疫において重要な役割を果たす。
FcRn発現は、広範囲であり、生涯にわたって存在し、かつ多くの異なる種における多種多様な実質細胞型によって発現されると現在認識されている。これらは、血管内皮(中枢神経系を含む)、胎盤等の大部分の上皮細胞型(合胞体性栄養膜)、表皮(ケラチノサイト)、腸(腸細胞)、腎糸球体(足細胞)、気管支、乳腺(乳管及び腺房)、網膜色素上皮細胞、腎臓近位尿細管細胞(PTC,proximal tubular cell)、肝細胞、メラニン細胞、並びに目における脈絡膜、毛様体、及び虹彩の細胞を含む。FcRnは、極性上皮細胞とは対照的に、それが細胞表面に相当な分量で検出される、単球、マクロファージ、樹状細胞(DC,dendritic cell)、好中球、及びB細胞を含む造血細胞によっても広く発現される(Zhu X et al (2001) J. Immunol. 166(5):3266-76)。
ヒトにおける4種のIgGサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)のうち、FcRnへの結合アフィニティーは20nM(IgG1)から80nM(IgG4)に及ぶ(West AP Jr, Bjorkman PJ (2000) Biochemistry 39(32):9698-708)。構造調査は、FcRnが、非平衡又は平衡条件下で、それぞれ1:1又は2:1の化学量論でIgGに結合することを示している(Popov S. et al (1996) Mol. Immunol. 33(6):521-30;Sanchez L.M. et al (1999) Biochemistry 38(29):9471-6)。FcRnは、IgGホモ二量体の両部位に同一のアフィニティーで独立して結合する(Haberger M. et al (2015) mAbs 7:331-43)が、2:1の複合体形成により生じるアビディティー効果は、半減期延長に重要であることが公知である。
生化学的及び結晶学的データは、pH6.0で結合しても、FcRnもIgGも大きな立体構造的変化を受けないことを示す。FcRnへの結合に影響を与えると考えられるIgG4における主要な残基は、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、及びHis435である。IgG1では、それは、結合を可能にする、Cγ2-Cγ3ヒンジ領域におけるヒスチジン残基のプロトン化である(Martin W.L. et al (2001) Molecular Cell 7:867-877)。それらのpKaに起因して、ヒスチジン残基はpH約6でプロトン化され、それはFcRn残基Glu115及びAsp130との相互作用を可能にする。pHが6より上に増加するにつれて、ヒスチジンプロトン化は徐々に失われ、それは相互作用のpH依存性を説明する(Oganesyan V. et al、上記;Raghavan M. et al (1995) Biochemistry 34:14649-57;Kim J.K. et al (1999) Eur J Immunol. 29:2819-2825)。これは、FcRn-Fc界面、具体的にはFcRnにおけるα2ドメインのC末端部分にある酸性残基での塩橋の形成を可能にする(West et al、上記、Martin et al、上記、Vaughn DE, Bjorkman PJ. (1998) Structure 6:63-73)。重鎖相互作用に加えて、β2mも、Ile1残基を通じてIgGとの接触を形成する(Shields R.L. et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604)。IgG上のFcRn結合部位は、IgGのFc領域のAsn297残基におけるグリコシル化を要する、古典的FcγRに対する結合部位と明確に区別できかつそれから遠く離れている(Tao M.H., Morrison S.L. (1989) J. Immunol. 143:2595-601)。
慢性炎症、感染症、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、及び移植医学を含む広範なヒト病気における治療としてのモノクローナル抗体(mAb,monoclonal antibody)の拡大する使用を考慮して、FcRnは、mAb効力の主たる修飾因子として浮上している(Chan A.C., Carter P.J. (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301-16;Weiner L.M. et al (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:317-27)。これは、血流における治療用抗体の持続性に直接関係し、それが今度は、標的部位への局在を増加させ得る。IgGの長い循環半減期を確保するために、pH依存的結合及びFcRn依存的リサイクリングは重大である。重要なことには、細胞からのIgGの適正な放出には、中性pHでの限定された結合が要され、酸性pHでFcRnへのmAbアフィニティーを増加させることは半減期延長と相関する。したがって、FcRnへのpH依存的結合を最適化するようなIgG Fc改変が、薬物動態を調整しかつIgG mAb半減期を増加させるために探求されている(Dall'Acqua W.F. et al (2006) J. Biol. Chem. 281:23514-24;Yeung Y.A. et al (2009) J. Immunol. 182:7663-1;Zalevsky J. et al (2010) Nat. Biotechnol. 28:157-9)。
IgEは、大部分はアレルギーにおけるその有害な役割で知られるが、いくつかの調査は、この抗体アイソタイプの天然の腫瘍監視機能に長い間向いてきた(Jensen-Jarolim E. et al (2008) Allergy 63: 1255-1266;Jensen-Jarolim E., Pawelec G. (2012) Cancer Immunol. Immunother. 61: 1355-1357)。突き合わせて試験された、同じエピトープ特異性についてのIgG及びIgE抗体を用いた先駆的調査は、細胞傷害の観点からIgEのより高い潜在性を明らかにした(Gould H.J. et al (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3527-3537)。
IgEは、組織に生息する多細胞寄生生物を殺傷するように進化しており、また大部分が組織に存在する固形腫瘍の治療における使用にとってそれを理想的にするいくつかの主要な特質をそれに授ける。IgEのエプシロン定常領域は、マクロファージ、単球、好塩基球、及び好酸球を含む免疫エフェクター細胞の表面にあるその同族受容体(FcεRI)に対して比類なく高いアフィニティーを有する(FcεRIに対するKa約1010/M、及びCD23三量体複合体に対するKa約108~109/M;Gould H.J., Sutton B.J. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8: 205-217)。この相互作用は、IgGのガンマ鎖がその同族受容体に対して有するアフィニティーよりも最高10,000倍大きく、これは、免疫エフェクター細胞の表面に恒久的に付着しているIgE分子の大多数をもたらす(Fridman W.H. (1991) FASEB J. 5: 2684-2690)。したがって、後者はプライムされ、IgEによって認識される抗原を発現する細胞をすぐに破壊できる。結果として、IgEは、IgGよりも有効に組織に浸透し得、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷し得る2つの主なメカニズムである抗体依存性細胞媒介性貪食(ADCP,antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC,antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)の両方の有意により大きなレベルを刺激し得る。細胞上のFcε受容体へのその迅速な結合に起因して、IgEは、循環から急速に除去され、IgGよりも有意に長い組織半減期を有し(2週間対2~3日間)、それは、血流における化合物の短い持続期間が理由で副作用の観点から有利であり、固形腫瘍の殺傷における役割も支持する。
さらに、例えば肥満細胞上のFcε受容体に結合したIgE抗体は、それらの細胞をシャトルシステムとして使用して悪性腫瘍に浸透し得るため、潜在的なIgE免疫療法は腫瘍組織に有効に分配されるはずであり、肥満細胞は組織に存在する免疫細胞であるため(St John A.L., Abraham S.N. (2013) J. Immunol. 190: 4458-4463)、この輸送は非常に効率的であろう。
他の考え得る利点は、抗原による活性化に対するIgEエフェクター細胞の高い感度、並びに応答の速度及び大きさを含み、それは、アレルゲン曝露があると典型的には数分以内に始まるアレルギー反応及びアナフィラキシー反応の間に最も印象的に見られ得る。それと同時に、これは、がんに対してIgEに基づく免疫療法を使用することの最も大きな関心事項でもあり:静脈内に適用される組換えIgEは、アナフィラキシー反応のリスクを常に抱える。したがって、標的エピトープの慎重な選択は、これに関して極度に重要である。
Zhu X et al (2001) J. Immunol. 166(5):3266-76
West AP Jr, Bjorkman PJ (2000) Biochemistry 39(32):9698-708
Popov S. et al (1996) Mol. Immunol. 33(6):521-30
Sanchez L.M. et al (1999) Biochemistry 38(29):9471-6
Haberger M. et al (2015) mAbs 7:331-43
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Raghavan M. et al (1995) Biochemistry 34:14649-57
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したがって、IgE及びIgGアイソタイプの両方と比較して改善された特性を有し、例えばがんの治療において有用である抗体の必要性がある。
固形腫瘍背景におけるIgGを上回るIgEの利点にもかかわらず、IgGは、IgEと比較してより長い半減期等、IgEが欠くある特定の機能を所有する。したがって、免疫グロブリンドメイン間の高い程度の構造類似性を活用することによって、本発明は、1つの態様において、IgG及びIgEアイソタイプの組み合わせられた機能性を所有するIgE/IgGハイブリッド抗体を提供する。
1つの態様において、本発明は、Fcε受容体及び胎児性Fc受容体(FcRn)に結合するハイブリッド抗体を提供する。この文脈において、「結合する」とは、典型的に、ハイブリッド抗体のその1又は2以上の定常ドメインを介した結合を指し、すなわち「結合する」とは、その可変ドメインを介した標的抗原へのハイブリッド抗体結合の特異性を指すわけではない。好ましくは、ハイブリッド抗体は、FcRnにpH依存的様式で結合する。例えば、ハイブリッド抗体は、pH7.4でよりもpH6.0で、FcRnに対するより高いアフィニティーを有し得る。
ハイブリッドという用語は、本明細書において、その構造が1種を上回るクラスの抗体に由来する抗体を指す。本発明において、それは典型的に、ハイブリッドであるFc領域であり、それによって、種々のクラスの抗体と会合している、免疫系の細胞表面受容体に結合する能力を抗体に提供する。典型的に、ハイブリッド抗体は、Fcε受容体及びFcRn受容体の両方に結合し得かつ両方を活性化し得、それによって、これらの受容体が発現される免疫系の細胞において受容体シグナル伝達及びエフェクター機能を形質導入する。
1つの実施形態において、本発明の抗体は、IgE抗体に由来する(例えば、ε重鎖に由来する)1又は2以上の重鎖定常ドメインを含む。例えば、抗体は、Cε1、Cε2、Cε3、及びCε4から選択される1又は2以上のドメインを含み得る。好ましくは、抗体は、少なくともCε3ドメイン、より好ましくは少なくともCε2、Cε3、及びCε4ドメインを含む。
1つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、定常ドメインの1又は2以上が、IgGにおけるFcRn結合に関係があると同定される1又は2以上のアミノ酸置換を含み得る、IgEに由来するCH2、CH3、及びCH4ドメイン(すなわち、Cε2、Cε3、及びCε4ドメイン)を含むFc領域を有する四量体IgEを含み得る。FcRn結合は、四量体IgEの少なくとも1つのFcドメインにおける1又は2以上のアミノ酸置換によって提供され得る。フラグメント結晶化可能/定常領域(Fc領域,fragment crystallisable/constant region)は、細胞表面Fc受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する、抗体のテール領域である。この特性により、抗体は免疫系を活性化することが可能となる。
アミノ酸置換は、IgEのCε3及びCε4のいずれか又は両方において行われ得る。置換は、IgEにおける天然残基の、IgGの対応する位置に見出されるアミノ酸での置き換えであり得、それにより、IgGのFcRn結合特性がIgEに与えられ得る。例えば、IgEのCε3Cε4ドメインは1又は2以上のHis置換を含み得、それによって、IgEによるFcRn結合(例えば、pH依存的様式での)を可能にする。四量体IgEは、Fab領域及びFc領域を含み得、Fcドメインは、少なくともCε2、Cε3、及びCε4ドメインを含む。
別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、定常ドメインの1又は2以上が、IgG抗体に由来するFcRnに対する結合部位のすべて又は一部を含み得る、IgEに由来するCH2、CH3、及びCH4ドメイン(すなわち、Cε2、Cε3、及びCε4ドメイン)を含むFc領域を有する四量体IgEを含む。FcRn受容体結合部位又は配列は、IgGの1又は2以上の定常ドメインに見出される、IgGに由来する1又は2以上の配列によって提供され得る。FcRnが結合するIgG上の領域との相同性を呈するIgE上の構造領域が同定され得る。そのような領域が同定されると、次いでアミノ酸及び/又は配列置換を行って、IgEバックグラウンドへのIgG機能性の移行を可能にし得る。
したがって、1つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、78位にヒスチジン残基を含むIgE Cε3ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号2に規定されるIgE CH3ドメイン、又はT78H変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。この文脈において、番号付けは、IgE Cε3ドメインのスタートからのアミノ酸残基位置を指し、すなわちIgE Cε3ドメインのN末端におけるアミノ酸残基は1位である。配列が、配列番号2を含みかつT78H変異を含む抗体の機能的特性、例えばFcε受容体及びFcRnへの結合を保持するという条件で、配列番号2のバリアント及びフラグメントは、例えば配列番号2の少なくとも30、50、若しくは100個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号2の全長及び同様の長さのフラグメントにわたって、配列番号2の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する配列を含む。
別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、95位にヒスチジン残基を含むIgE Cε4ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号3に規定されるIgE CH4ドメイン、又はS95H変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、98位にヒスチジン残基を含むIgE Cε4ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号3に規定されるIgE CH4ドメイン、又はQ98H変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。この文脈において、番号付けは、IgE Cε4ドメインのスタートからのアミノ酸残基位置を指し、すなわちIgE Cε4ドメインのN末端におけるアミノ酸残基は1位である。配列が、配列番号3を含みかつS95H及び/又はQ98H変異を含む抗体の機能的特性、例えばFcε受容体及びFcRnへの結合を保持するという条件で、配列番号3のバリアント及びフラグメントは、例えば配列番号3の少なくとも30、50、若しくは100個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号3の全長及び同様の長さのフラグメントにわたって、配列番号3の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する配列を含む。
好ましくは、ハイブリッド抗体は、2つ又は3つのヒスチジン置換を含み、例えば抗体は、78位にヒスチジン残基を含むIgE Cε3ドメイン、並びに/又は95及び/若しくは98位にヒスチジン残基を含むIgE Cε4ドメインを含む。特に好ましい実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号2に規定されるIgE CH3ドメイン、又はT78H変異を含むそのバリアント若しくはフラグメント、並びに/或いは配列番号3に規定されるIgE CH4ドメイン、又はS95H及び/若しくはQ98H変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含む。
したがって、さらに好ましい実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号31に規定されるIgE Cε3ループ配列(すなわち、PVGHR)、及び/又は配列番号32若しくは33に規定されるIgE Cε4ループ配列(すなわち、AHPSHTV又はRAVHEAAHPSHTV)を含み得る。
代替的に、FcRn受容体結合部位は、例えばIgGに由来する1又は2以上のFcγドメインによって、IgEのC末端に付着され得る。別の表現をすると、ハイブリッド抗体は、IgEに由来するCH2、CH3、及びCH4ドメイン(すなわち、Cε2、Cε3、及びCε4ドメイン)、並びにIgGに由来するCH2ドメイン又はそのバリアント(すなわち、Cγ2ドメイン)を含むFc領域を含み得る。抗体は、IgGに由来するCH3ドメイン若しくはそのバリアント(すなわち、Cγ3ドメイン)、及び/又はIgGに由来するヒンジ領域のすべて若しくは一部をさらに含み得る。
1又は2以上の定常ドメインの付着は、任意の適切な付着、連結、移植、固定、又は融合によるものであり得る。例えば、構築物は、IgGに由来するヒンジ領域のすべて又は一部を含み得る。定常ドメイン配列のすべて又は一部、並びにそのバリアントが使用され得ることが解されるであろう。
本明細書に記載される抗体ドメインは、任意の種、好ましくは哺乳類種、より好ましくはヒトに由来し得る。
1つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、FcRn及びFcεRIに結合する。
他の受容体結合部位、及び腫瘍標的化の文脈においてIgGに特異的な望ましい機能をIgE分子の上又は中に移植して、その機能性を変化もさせ得ることが解されるであろう。
ハイブリッド抗体は、1又は2以上の標的抗原への特異的結合を決定する可変ドメイン配列をさらに含み得る。そのような可変ドメイン配列は、任意の免疫グロブリンアイソタイプ(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、又はIgM)に由来し得る。1つの実施形態において、可変ドメイン配列はIgEに由来し得る。別の実施形態において、可変ドメイン配列は、IgG、例えばIgG1に由来し得る。代替的に、可変ドメインは、2又は3以上の異なるアイソタイプに由来する配列を含み得、例えば可変ドメインは、IgEに由来する部分配列及びIgG1に由来する部分配列を含み得る。1つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、IgE以外の免疫グロブリンアイソタイプ(例えば、IgA、IgD、IgG、又はIgM、例えばIgG1)に由来する1又は2以上の相補性決定領域(CDR,complementarity-determining region)、並びにアイソタイプIgEの免疫グロブリンに由来する1若しくは2以上のフレームワーク領域及び/又は定常ドメインを含む。
可変ドメイン又はその一部分(例えば、相補性決定領域(CDR)又はフレームワーク領域)は、ハイブリッド抗体に存在する定常ドメインと同じ又は異なる哺乳類種にも由来し得る。したがって、ハイブリッド抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。
典型的に、抗体の可変ドメインは、がんの治療において有用な1又は2以上の標的抗原に、例えばがん抗原(すなわち、がん細胞上で選択的に発現される又はがん細胞上で過剰発現される抗原)に、又は免疫媒介性腫瘍細胞殺傷を阻害する若しくは抑制する抗原に結合する。1つのそのような可変ドメイン配列の(すなわち、がん抗原HER2/neuに結合するトラスツズマブ(ハーセプチン)IgEの)配列が配列番号1に示される。
1つの実施形態において、抗体は、配列番号26に規定されるIgEアミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号26の少なくとも50、100、若しくは200個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号26の全長にわたって、配列番号26の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型IgE CH3及び/又はCH4配列に対して少なくとも1、2、又は3つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号26の78、203、及び/又は206位にヒスチジン残基を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号34に規定されるIgE(例えば、重鎖)アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号34の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号34の全長にわたって、配列番号34の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型IgE CH3及び/又はCH4配列に対して少なくとも1、2、又は3つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号34の408、533、及び/又は536位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号35に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号35の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号35の全長にわたって、配列番号35の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号186に規定されるIgE(例えば、重鎖)アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号186の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号186の全長にわたって、配列番号186の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型IgE CH3及び/又はCH4配列に対して少なくとも1、2、又は3つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号186の411、536、及び/又は539位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号187若しくは189に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号187若しくは189の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号187若しくは189の全長にわたって、配列番号187若しくは189の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号188に規定されるIgE(例えば、重鎖)アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号188の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号188の全長にわたって、配列番号188の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型IgE CH3及び/又はCH4配列に対して少なくとも1、2、又は3つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号188の410、535、及び/又は538位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号187若しくは189に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号187若しくは189の少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号187若しくは189の全長にわたって、配列番号187若しくは189の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。
一部の実施形態において、抗体は、配列番号15~25のうちのいずれか1若しくは2以上に規定されるIgEアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号15~25の配列のうちのいずれか1又は2以上と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号9と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するIgG CH2アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号10と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するIgG CH3アミノ酸配列をさらに含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号8と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するIgGヒンジアミノ酸配列をさらに含む。
特定の実施形態において、抗体は、i)配列番号1~3と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する(例えば、IgE由来)アミノ酸配列、好ましくは配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のそれぞれと少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列;並びにii)配列番号8、9、及び/又は10(より好ましくは、少なくとも配列番号9及び配列番号10)と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する(例えば、IgG由来)アミノ酸配列を含む。
IgG由来アミノ酸配列は、好ましくは、直接的に又は適切なリンカー配列を使用して、IgE由来アミノ酸配列のC末端に付着される。例えば、配列番号3の配列は、配列番号8、9、又は10、好ましくは配列番号8の配列に近接してあり得る。したがって、一部の実施形態において、ハイブリッド抗体は、少なくともCε4ドメイン及び少なくともIgGヒンジ領域及びCγ2ドメイン、好ましくは少なくともCε4ドメイン並びに少なくともIgGヒンジ領域並びにCγ2及びCγ3ドメインを含み得る。したがって、抗体は、配列番号27又は配列番号28と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好ましい実施形態において、抗体は、例えば配列番号29若しくは配列番号30の少なくとも50、100、200、300、500、若しくは700個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号29若しくは配列番号30の全長にわたって、配列番号29又は配列番号30、最も好ましくは配列番号30と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する(例えば、重鎖)アミノ酸配列を含む。
IgEに由来する少なくともCH3ドメイン又はそのフラグメント(すなわち、Cε3ドメイン)、及びIgG CH2ドメイン(すなわち、Cγ2ドメイン)に由来する1又は2以上のループ配列を含む抗体も本明細書に記載される。そのような抗体は、1又は2以上のループ配列(例えば、配列番号4及び5に規定される)が、Cγ2ドメインに由来する1又は2以上のFcRn結合ループ(例えば、配列番号11及び12に規定される)によって置き換えられているCε3ドメインを含み得る。IgEのCε3ドメインにおいて置き換えられるループ配列は、IgGのCγ2ドメインにおけるFcRn結合ループとの構造相同性を示し得る。そのような抗体は、配列番号15、16、19~25の配列のうちのいずれか1又は2以上と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列(例えば、ハイブリッドCε3/Cγ2ドメインをコードする)を含み得る。
IgEに由来する少なくともCH4ドメイン又はそのフラグメント(すなわち、Cε4ドメイン)、及びIgG CH3ドメイン(すなわち、Cγ3ドメイン)に由来する1又は2以上のループ配列を含む抗体も本明細書に記載される。そのような抗体は、1又は2以上のループ配列(例えば、配列番号6及び7に規定される)が、Cγ3ドメインに由来する1又は2以上のFcRn結合ループ(例えば、配列番号13及び14に規定される)によって置き換えられているCε4ドメインを含み得る。IgEのCε4ドメインにおいて置き換えられるループ配列は、IgGのCγ3ドメインにおけるFcRn結合ループとの構造相同性を示し得る。そのような抗体は、配列番号17、18、20~25の配列のうちのいずれか1又は2以上と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列(例えば、ハイブリッドCε4/Cγ3ドメインをコードする)を含み得る。
別の態様において、本発明は、がん、例えば良性又は悪性腫瘍を治療する又は予防することにおける使用のための、上に規定されるハイブリッド抗体を包含する。別の表現をすると、本発明は、がん、例えば良性又は悪性腫瘍を治療する、予防する、又は遅延させるための、ヒト又は動物への投与のための医薬の製造における、上で記載されるハイブリッド抗体の使用を包含する。別の態様において、本発明は、それに罹患した哺乳類におけるがん(例えば、良性又は悪性腫瘍)を予防する、治療する、及び/又は遅延させる方法であって、方法は、上で記載されるハイブリッド抗体の治療有効量を哺乳類に投与するステップを含む、方法を包含する。
がんは、例えば黒色腫、メルケル細胞がん腫、非小細胞肺がん(扁平上皮型及び非扁平上皮型)、腎細胞がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮細胞がん腫、中皮腫、ウイルスにより誘導されたがん(子宮頸がん及び鼻咽頭がん等)、軟部組織肉腫、血液悪性腫瘍、例えばホジキン及び非ホジキン疾患、並びにびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(例えば、黒色腫、メルケル細胞がん腫、非小細胞肺がん(扁平上皮型及び非扁平上皮型)、腎細胞がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮細胞がん腫、及び中皮腫、又は例えばウイルスにより誘導されたがん(子宮頸がん及び鼻咽頭がん等)、及び軟部組織肉腫)であり得る。本発明のハイブリッド抗体は、薬学的に許容される組成物又は製剤の形態で投与され得ることが解されるであろう。
さらに別の態様において、本発明は、上で記載されるハイブリッド抗体、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含む組成物にある。組成物は、別の抗体若しくはそのフラグメント、アプタマー、又は小分子等の治療剤をさらに含んでいてもよい。組成物は、無菌の水溶液中にあり得る。
なおさらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする(組換え)核酸であって、重鎖が、(i)配列番号1、及び(ii)配列番号15~26のうちのいずれか1又は2以上、好ましくは配列番号26と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。
さらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする(組換え)核酸であって、重鎖が、配列番号34と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。
なおさらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする(組換え)核酸であって、重鎖が、(i)配列番号1、2、及び3のうちのいずれか1又は2以上、並びに(ii)配列番号8及び配列番号9及び/又は配列番号10と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。1つの実施形態において、核酸は、配列番号9又は配列番号30と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
上で規定される核酸を含むベクターであって、任意で、ベクターはCHOベクター(すなわち、チャイニーズハムスター卵巣(CHO,Chinese Hamster Ovary)細胞におけるハイブリッド抗体の発現に適切な発現ベクター)である、ベクターも提供される。
さらなる態様において、上で記載されるハイブリッド抗体をコードする組換え核酸、又は本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞であって、コード核酸が、哺乳類細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞が提供される。
抗体の発現のための条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養するステップ、及び宿主細胞培養物から抗体又はそのフラグメントを回収するステップを含む、上で記載されるハイブリッド抗体を産生する方法も本明細書において提供される。
本明細書において使用するとき、「a」、「an」、及び「the」という単数形形態は、文脈上別様に明瞭に述べられない限り、単数形及び複数形の指示対象の両方を含む。
本明細書において使用される「含む(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「から構成される」という用語は、「含む(including)」、「含む(includes)」、又は「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、内包的であり又は無制限であり、付加的な列挙されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外しない。該用語は、「からなる」及び「から本質的になる」も包含する。
メンバーの群の1又は2以上のメンバー等、「1又は2以上」という用語は、さらなる例示によってそれ自体が明瞭である一方で、該用語は、とりわけ、メンバーのいずれか1つへの言及、又はメンバーのいずれか2若しくは3以上、例えばメンバーの任意の≧3、≧4、≧5、≧6、若しくは≧7等、及び最高すべてのメンバーへの言及を包含する。
本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、概して免疫学的結合剤を指す。「抗体」という用語は、免疫を含む方法によって作出される抗体を含むだけでなく、目的の抗原上のエピトープに特異的に結合し得る少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を包含するように作製される任意のポリペプチド、例えば組換えで発現されるポリペプチドも含む。したがって、該用語は、それらがインビトロ又はインビボで産生されるかどうかにかかわらず、そのような分子に適用される。
抗体は、ポリクローナル抗体、例えばそこから精製された(例えば、アフィニティー精製された)抗血清又は免疫グロブリンであり得る。抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物であり得る。モノクローナル抗体は、より大きな選択性及び再現性を有して、特定の抗原又は抗原内の特定のエピトープを標的にし得る。例としてであり限定ではなく、モノクローナル抗体は、Kohler et al 1975(Nature 256: 495)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号明細書にある)によって作製され得る。モノクローナル抗体は、例えばClackson et al 1991 (Nature 352: 624-628)及びMarks et al 1991 (J. Mol. Biol. 222: 581-597)によって記載される技法を使用したファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
抗体という用語は、任意の動物種、好ましくは例えば鳥類及び哺乳類を含む脊椎動物種に由来する1又は2以上の部分を起源とする又はそれを含む抗体を含む。限定されることなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラ、又はキジであり得る。また限定されることなく、抗体は、ヒト、ネズミ科(例えば、マウス、ラット等)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ(例えば、フタコブラクダ(Camelus bactrianus)及びヒトコブラクダ(Camelus dromaderius))、ラマ(例えば、アルパカ(Lama paccos)、ラマ(Lama glama)、又はビクーニャ(Lama vicugna))、又はウマであり得る。
当業者であれば、抗体は、1又は2以上のアミノ酸欠失、付加、及び/又は置換(例えば、保存的置換)を、そのような変化がそれぞれの抗原についてのその結合を保つ限りにおいて含み得ることを理解するであろう。抗体は、その構成成分アミノ酸残基の1又は2以上の天然又は人工の修飾(例えば、グリコシル化等)も含み得る。
ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにそのフラグメントを産生する方法は、組換え抗体又はそのフラグメントを産生する方法のように、当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988;Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447;"Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760;"Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229;Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照されたい)。
したがって、提示担体に付着されていてもよい、本明細書において教示される任意の1又は2以上の(単離された)マーカー、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそのフラグメントを使用して(すなわち、免疫抗原として使用して)、動物、例えば実験動物又は家畜等の非ヒト動物に免疫するための方法も開示される。免疫、及び免疫血清からの抗体試薬の調製は、それ自体が周知であり、本明細書における他の箇所で言及される文書に記載される。免疫される対象となる動物は、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは例えば鳥類、魚類、及び哺乳類を含む脊椎動物種を含み得る。限定されることなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、サメ、ウズラ、又はキジであり得る。また限定されることなく、抗体は、ヒト、ネズミ科(例えば、マウス、ラット等)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、サメ、ラクダ、ラマ、又はウマであり得る。「提示担体」又は「担体」という用語は、概して、第2の分子に結合した場合に、通常では付加的なT細胞エピトープの提供を通じて、後者に対する免疫応答を増大させる免疫原性分子を表す。提示担体は、とりわけグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣体、合成ポリマー等、(ポリ)ペプチド構造又は非ペプチド構造であり得る。例示的な非限定的な担体は、ヒトB型肝炎ウイルスコアタンパク質、多重C3dドメイン、破傷風毒素フラグメントC、又は酵母Ty粒子を含む。
本明細書に記載される本発明は、ハイブリッドIgE分子をもたらす、改変された重鎖(Fc)部分を有するIgE抗体にある。FcRnが結合するIgG上の同様の領域との相同性を呈する、IgEのCH3及びCH4ドメインの構造領域を同定した。そのような領域を同定したら、IgEバックグラウンドへのIgG機能性の移行を可能にするアミノ酸置換を行った。特に、IgEの1又は2以上の定常ドメインにおける1又は2以上のループにおけるアミノ酸又は配列を、IgG FcRnアミノ酸又は配列で置き換えて、IgEにFcRn機能性を与えた。
本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、典型的に、Fcε受容体に、例えばFcεRI及び/又はFcεRII受容体に結合し得る。好ましくは、抗体は、FcεRI(すなわち、高アフィニティーFcε受容体)に少なくとも結合し得る、又はFcεRII(CD23、低アフィニティーFcε受容体)に少なくとも結合し得る。
典型的には、IgEによって媒介されるエフェクター機能を始動するために、抗体は、例えば免疫系の細胞上に発現した、Fcε受容体も活性化し得る。例えば、抗体は、FcεRIに結合し得、かつ肥満細胞、好塩基球、単球/マクロファージ、及び/又は好酸球を活性化し得る可能性がある。
これらの受容体相互作用に関与するIgE上の部位は、Cε鎖上のペプチド配列にマッピングされており、明確に区別できる。FcεRI部位は、Gln301とArg376との間の残基によって創出される裂け目にあり、Cε2及びCε3ドメイン間の接合部を含む(Helm, B. et al. (1988) Nature 331, 180183)。FcεRII結合部位は、Val370残基周辺のCε3内に位置する(Vercelli, D. et al. (1989) Nature 338, 649-651)。2種の受容体を識別する主たる差異は、FcεRIは単量体Cεに結合し、一方でFcεRIIは二量体化Cεにのみ結合し、すなわち2本のCε鎖が会合しなければならないことである。IgEはインビボでグリコシル化されるが、これは、FcεRI及びFcεRRIIへのその結合に必要であるわけではない。結合は、実際、グリコシル化の非存在下においてわずかにより強い(Vercelli, D. et al (1989)、上記)。
したがって、Fcε受容体への結合及び関連するエフェクター機能は、典型的に、抗体の重鎖定常ドメインによって、特に抗体のFc領域を一緒に形成するドメインによって媒介される。本明細書に記載される抗体は、典型的に、IgE抗体の少なくとも一部分、例えばIgE、好ましくはヒトIgEに由来する1又は2以上の定常ドメインを含む。特定の実施形態において、抗体は、Cε1、Cε2、Cε3、及びCε4から選択される(IgEに由来する)1又は2以上のドメインを含む。1つの実施形態において、抗体は、少なくともCε2及びCε3、より好ましくは少なくともCε2、Cε3、及びCε4を含み、好ましくはドメインはヒトIgEに由来する。1つの実施形態において、抗体は、エプシロン(ε)重鎖、好ましくはヒトε重鎖を含む。
ヒトIgEに由来する定常ドメイン、特にCε1、Cε2、Cε3、及びCε4ドメインが、それぞれ配列番号1、2、及び3に示される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝暗号に従って当業者によって推測され得る。ヒトCε1、Cε2、Cε3、及びCε4ドメイン並びにヒトε重鎖配列を含む、他のヒト及び哺乳類IgE並びにそのドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、公的にアクセス可能なデータベースから入手可能である。例えば、ヒト免疫グロブリン配列のデータベースは、http://www.imgt.orgにてInternational ImMunoGeneTics Information System(IMGT(登録商標))ウェブサイトからアクセス可能である。1つの例として、様々なヒトIgE重(ε)鎖アレル及びそれらの個々の定常ドメイン(Cε1~4)の配列は、http://www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect?query=2+IGHE&species=Homo+sapiensにてアクセス可能である。
本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、典型的に、胎児Fc(FcRn)受容体にさらに結合し得る。好ましくは、ハイブリッド抗体は、FcRnに結合し得かつ活性化し得、及び/又はそのような受容体を発現する免疫系の細胞(例えば単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、及び好酸球等、造血系の骨髄細胞を含む)を活性化し得る。
好ましくは、ハイブリッド抗体は、FcRnにpH依存的様式で結合する。特に、ハイブリッド抗体は、酸性pHでFcRnに優先的に結合し得、例えば抗体は、pH7又はそれよりも上でと比較して、7より下のpHでFcRnに対するより高いアフィニティーを有し得る。例えば、1つの実施形態において、抗体は、4~6.5のpHで(例えば、pH6.0で)FcRnに結合するが、pH7.0又は7.4では結合しない。
本明細書に記載される抗体は、典型的に、FcRnへのIgGの結合に関与するIgG抗体の少なくとも一部分、例えばIgG(例えば、IgG1)、好ましくはヒトIgGに由来する1又は2以上の配列又はアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、抗体は、四量体IgEの少なくとも1つのFcドメインにおける1又は2以上のアミノ酸置換を含む。例えば、少なくとも1つのアミノ酸置換は、IgEのCε3において行われ得る。代替的に又は加えて、少なくとも1つのアミノ酸置換は、IgEのCε4において行われ得る。具体的には、1つのアミノ酸置換がCε3において行われ得、2つのアミノ酸置換がIgEのCε4において行われ得る。
好ましくは、IgEに、例えばIgEのCε3又はCε4ドメインに存在する少なくとも1つの天然アミノ酸は、ヒスチジンに置換される。したがって、ハイブリッド抗体は、1又は2以上の非天然ヒスチジン残基、すなわちIgE配列におけるその位置で典型的にはヒスチジンでない残基を含むIgEであり得る。典型的に、非天然ヒスチジン残基は、ヒスチジン残基が存在するIgG抗体における位置に対応するIgE抗体の位置に存在する。したがって、IgE抗体は、典型的に、IgE抗体にFcRn結合を付与し得る1、2、又は3つの異種ヒスチジン残基を含む。この文脈において、「異種」又は「非天然」とは、それが比較されている実体の残りのそれとは遺伝子型的に明確に区別できる実体に由来することを意味する。例えば、異なるポリペプチドに遺伝子改変技法によって導入される、特定のタンパク質又はポリペプチドに由来するアミノ酸残基又は配列は、異種又は非天然残基である。したがって、例えば、天然に存在する、野生型の、又は天然のIgEドメインにおいて通常ではヒスチジンでない位置にヒスチジン残基を含むIgE抗体は、その位置に異種又は非天然ヒスチジン残基を含むと言われる。
例えば、IgEのCε3のループ2において、トレオニン残基がヒスチジンに置換され得る。付加的に又は代替的に、IgEのCε4のループ3において、セリン残基がヒスチジンに置換され得、グルタミンがヒスチジンに置換され得る。そのようなバリアントの例は、配列番号26及び31~34に見出され得る。
別の実施形態において、抗体は、Cγ2及び/又はCγ3に見出されるループ配列から選択される、IgGに由来する配列を含む。1つの実施形態において、抗体は、Cγ2、より好ましくは少なくともCγ2及びCγ3に由来するループ配列の少なくとも一部を含み、好ましくはドメインはヒトIgG1抗体に由来する。1つの実施形態において、抗体は、IgG、例えばIgG1に由来するヒンジ領域をさらに含む。
ヒトIgGに由来する定常ドメインCγ2及びCγ3が、それぞれ配列番号9及び10に示される。ヒトIgGに由来するヒンジドメインは、配列番号8に記される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝暗号に従って当業者によって推測され得る。ヒトCγ2及びCγ3ドメイン並びにヒンジ配列を含む、他のヒト及び哺乳類IgG定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、IgE定常ドメインに関して上で記載されるように、公的にアクセス可能なデータベースから入手可能である。
1又は2以上のIgEドメイン及び1又は2以上のIgGドメインのアミノ酸配列は、直接的に又は適切なリンカーを介して連結され得る。ポリペプチドドメインを接合するための適切なリンカーは、当技術分野において周知であり、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態において、リンカー配列は、最高20個のアミノ酸残基を含み得る。
Fcε及びFcRn受容体へのハイブリッド抗体の結合は、標準的技法を使用して査定され得る。結合は、例えば、抗原/抗体解離速度を判定することによって、競合ラジオイムノアッセイによって、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)によって、又は表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore)によって測定され得る。結合アフィニティーは、例えばFrankel et al (1979) Mol. Immunol. 16:101-106によって記載されるスキャッチャード法に基づく、標準的方法を使用しても計算され得る。
一般的に、本明細書に規定される配列の機能的フラグメントは、本発明において使用され得る。機能的フラグメントは、フラグメントが、抗体に存在する場合に、要される活性(例えば、FcRn及び/又はFcε受容体への結合)を保持するという条件で、任意の長さ(例えば、少なくとも50、100、300、若しくは500個のヌクレオチド、又は少なくとも50、100、200、300、若しくは500個のアミノ酸)のものであり得る。
本明細書に記載されるアミノ酸及びヌクレオチド配列のバリアントも、結果として生じる抗体が、FcRn及びFcε受容体の両方に結合するという条件で、本発明において使用され得る。典型的に、そのようなバリアントは、本明細書において指定される配列の1つと高い程度の配列同一性を有する。
アミノ酸又はヌクレオチド配列間の類似性は、別様に配列同一性と称される、配列間の類似性の観点から表現される。配列同一性は、同一性(又は類似性又は相同性)パーセンテージの観点からしばしば測定され;パーセンテージが高ければ高いほど、2つの配列はより類似している。アミノ酸又はヌクレオチド配列のホモログ又はバリアントは、標準的方法を使用してアラインした場合に、比較的高い程度の配列同一性を所有するであろう。
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482;Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443;Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444;Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237;Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151;Corpet et al (1988) Nucleic Acids Research 16:10881;及びPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444に記載される。Altschul et al (1994) Nature Genet. 6:119は、配列アライメント法及び相同性計算についての詳細な検討事項を提示する。
NCBIの基本的ローカルアライメント検索ツール(BLAST,Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403)は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、及びtblastxと関連した使用のために、アメリカ国立生物工学情報センター(NCBI,National Center for Biotechnology Information、Bethesda、Md.)を含むいくつかの供給源から及びインターネットで利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を判定する方法についての説明は、インターネットでNCBIウェブサイトにて入手可能である。
本明細書に記載される特異的抗体又はそのドメイン(例えば、VL、VH、CL、又はCHドメイン)のホモログ及びバリアントは、典型的に、初期設定パラメーターに設定されたNCBI Blast 2.0、ギャップありblastpを使用して、例えば少なくとも20、50、100、200、若しくは500個のアミノ酸残基にわたって、又は抗体若しくはそのドメインのアミノ酸配列との全長アライメントにわたってカウントされる、元の配列(例えば、本明細書に規定される配列)と少なくとも約75%、例えば少なくとも約80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する。約30個のアミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較に関しては、初期設定パラメーター(11のギャップ存在コスト、及び1の残基あたりのギャップコスト)に設定された初期設定BLOSUM62行列を使用して、Blast2配列機能が採用される。短いペプチド(おおよそ30個のアミノ酸よりも少ない)をアラインする場合、アライメントは、初期設定パラメーター(オープンギャップ9、伸長ギャップ1ペナルティ)に設定されたPAM30行列を採用した、Blast2配列機能を使用して実施されるべきである。参照配列とさらに大きな類似性を有するタンパク質は、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性等、この方法によって査定された場合、増加する同一性パーセンテージを示すであろう。全体に満たない配列が配列同一性に関して比較されている場合、ホモログ及びバリアントは、典型的に、10~20個のアミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも80%の配列同一性を所有すると考えられ、参照配列とのそれらの類似性に応じて、少なくとも85%又は少なくとも90%若しくは95%の配列同一性を所有し得る。そのような短いウィンドウにわたる配列同一性を判定するための方法は、インターネットでNCBIウェブサイトにて利用可能である。当業者であれば、これらの配列同一性域は、単なる手引きのために提供されるものであり;提供される域から外れる強力に有意なホモログが獲得され得ることは全く可能であることを解するであろう。
典型的に、バリアントは、元のアミノ酸又は核酸配列と比較して、1又は2以上の保存的アミノ酸置換を含有し得る。保存的置換とは、FcRn及び/又はFcε受容体に対する抗体のアフィニティーに実質的に影響を及ぼさない又は減少させないそうした置換である。例えば、FcRn及び/又はFcεに結合するヒト抗体は、元の配列(例えば、上で規定される)と比較して、最高1、最高2、最高5、最高10、又は最高15個の保存的置換を含み得、FcRn及び/又はFcε受容体への特異的結合を保持し得る。保存的変動という用語は、抗体がFcRn及び/又はFcεに結合するという条件で、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含む。非保存的置換とは、活性、又はFcRn及び/若しくはFcε受容体への結合を低下させるものである。
保存的置換によって交換され得る機能的に類似したアミノ酸は、当業者に周知である。以下の6つの群は、互いに対して保存的置換であると見なされるアミノ酸の例である:1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
上で記載されるドメイン(例えば、1又は2以上のIgE及びIgG定常ドメイン)は、典型的に、抗体における重鎖に存在する。ハイブリッド抗体は、本明細書に記載される1又は2以上の重鎖配列に加えて、1又は2以上の軽鎖をさらに含み得る。例えば、1つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号35に規定される軽鎖配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含み得る。抗体は、典型的に、そのそれぞれが、可変重(VH)領域及び可変軽(L)領域と称される可変領域を有する、重鎖及び軽鎖から構成される。一緒になって、VH領域及びVL領域は、抗体によって認識される抗原に結合することに関与する。典型的に、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重(H)鎖及び軽(L)鎖を有する。2種のタイプの軽鎖、ラムダ(λ)及びカッパ(k)がある。したがって、ハイブリッド抗体は、典型的に、例えば各重鎖のC末端で融合したIgGヒンジ、CH2、及び/又はCH3ドメインを含むIgE抗体に基づく、2本の重鎖及び2本の軽鎖(例えば、ジスルフィド結合によって接合した)を含む。
本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、がんを治療するのに有用な1又は2以上の標的抗原に特異的に(すなわち、それらの可変ドメイン又はその相補性決定領域(CDR)を介して)結合し得る。例えば、ハイブリッド抗体は、1又は2以上のがん抗原(すなわち、がん細胞上で選択的に発現される又は過剰発現される抗原)に特異的に結合し得る。組み合わされたFcεR及びFcRn結合能により形質導入されたエフェクター機能の新規の組み合わせは、免疫系細胞(例えば、単球/マクロファージ及びナチュラルキラー細胞)の細胞傷害、貪食(例えば、ADCC及び/又はADCP)、及び他のがん細胞殺傷機能を増強させ得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えばEGF-R(上皮成長因子受容体)、VEGF(血管内皮成長因子)、又はerbB2受容体(Her2/neu)に特異的に結合し得る。Her2/neuに選択的に結合する可変ドメインを含む抗体の1つの例はトラスツズマブ(ハーセプチン)である。
一部の実施形態において、可変ドメインの1若しくは2以上及び/又はCDRの1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくは6つすべてのCDRは、以下の抗体:アレムツズマブ(配列番号36~41)、アテゾリズマブ(配列番号42~47)、アベルマブ(配列番号48~53)、ベバシズマブ(配列番号54~59)、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セミプリマブ、セルトリズマブ(配列番号60~65)、セツキシマブ(配列番号66~71)、デノスマブ、デュルバルマブ(配列番号72~77)、エファリズマブ(配列番号78~83)、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ(配列番号84~89)、パニツムマブ(配列番号90~95)、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ(配列番号96~101)、リツキシマブ(配列番号102~107)、又はトラスツズマブ(配列番号108~113)のうちの1又は2以上に由来し得る。
そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表1に挙げられる抗体の1つ由来のCDRの1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくはCDR配列の6つすべてを含み得る。
代替的な実施形態において、可変ドメインの1若しくは2以上及び/又は1若しくは2以上のCDR、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくは6つすべてのCDRは、以下の抗体:アブシキシマブ、アダリムマブ(配列番号114~119)、アデュカヌマブ、アデュカヌマブ、アレファセプト、アリロクマブ、アニフロルマブ、バルスチリマブ、バシリキシマブ(配列番号120~125)、ベリムマブ(配列番号126~131)、ベンラリズマブ、ベズロトクスマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロスマブ、カナキヌマブ、カプラシズマブ、クリザンリズマブ、ダクリズマブ(配列番号132~137)、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、ドスタルリマブ、デュピルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エマパルマブ、エミシズマブ、エプチネズマブ、エレヌマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、フレマネズマブ、ガルカネズマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イダルシズマブ、イネビリズマブ、インフリキシマブ(配列番号138~143)、イサツキシマブ、イキセキズマブ、ラナデルマブ、レロンリマブ、マルジェツキシマブ、メポリズマブ、モガムリズマブ、ムロモナブ、ナルソプリマブ、ナタリズマブ(配列番号144~149)、ナキシタマブ、ネシツムマブ、オビルトキサキシマブ、オクレリズマブ、オムブルタマブ、パリビズマブ(配列番号150~155)、ラムシルマブ、ラニビズマブ(配列番号156~161)、レスリズマブ、リサンキズマブ、ロモソズマブ、サリルマブ、サトラリズマブ、セクキヌマブ、スパルタリズマブ、スチムリマブ、タファシタマブ、タネズマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トリパリマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、又はザリフレリマブのうちの1又は2以上に由来し得る。
そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表2に挙げられる抗体の1つ由来のCDRの1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくはCDR配列の6つすべてを含み得る。
他の実施形態において、可変ドメインの1若しくは2以上及び/又はCDR配列の1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくは6つすべてのCDRは、抗HMW-MAA抗体に由来し得る。1つの実施形態において、可変ドメインの1若しくは2以上及び/又はCDR配列の1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくは6つすべてのCDRは、国際公開第2013/050725号パンフレットに記載される抗HMW-MAA抗体に由来し得る(可変ドメインに関しては配列番号168及び169、並びにCDRに関しては配列番号162~167)。HMW-MAAとは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4,chondroitin sulfate proteoglycan 4)又は黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP,melanoma chondroitin sulfate proteoglycan)としても知られる高分子量-黒色腫関連抗原を指し、例えばUniprot Q6UVK1を参照されたい。
そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表3に規定される、CDR配列の1若しくは2以上、好ましくは少なくとも3つのCDR、又はより好ましくはCDR配列の6つすべてを含み得る。他の実施形態において、抗体の可変ドメインの1又は2以上は、表3に挙げられる可変ドメイン配列の1又は2以上を含む。
担体、並びにFcRn及びFcε受容体又はその機能的フラグメントに結合する1又は2以上のハイブリッド抗体を含む組成物が本明細書において提供される。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製され得る。投与の量及びタイミングは、所望の目的を達成するための、治療を行う医師の裁量にある。抗体は、全身又は局所(腫瘍内等)投与のために製剤化され得る。1つの例において、抗体は、静脈内投与等の非経口投与のために製剤化され得る。
投与のための組成物は、水性担体等の薬学的に許容される担体中に溶解された抗体又はその機能的フラグメントの溶液を含み得る。多様な水性担体、例えば緩衝生理食塩水等が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般的に、望ましくない物質を含んでいない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌され得る。
組成物は、pH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、生理学的条件に近づけるために要される薬学的に許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤における抗体の濃度は、広く変動し得、選択された投与の特定の様態及び対象の必要性に従って、主として流体容量、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。
静脈内投与のための医薬組成物の典型的な用量は、1日あたり対象のkg体重あたり約0.1~15mgの抗体を含む。特に、薬剤が、体腔に又は臓器の内腔に等、隔離された部位に投与され、循環系又はリンパ系に投与されない場合、1日あたりkgあたり0.1~最高約100mgの投薬量が使用され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知である又は明らかであると考えられ、Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)等の刊行物により詳細に記載される。
抗体は、凍結乾燥形態で提供され得、投与の前に滅菌水で水和され得るが、既知の濃度の滅菌溶液でも提供される。次いで、抗体溶液は、0.9%塩化ナトリウム、USPを含有する注入バッグに添加され得、典型的に、体重の0.5~15mg/kgの投薬量で投与され得る。抗体は、静脈内プッシュ又はボーラスでよりもむしろ緩徐な注入によって投与され得る。1つの例において、より高い負荷用量が投与され得、後続の維持用量がより低いレベルで投与される。例えば、4mg/kgの初回負荷用量が、およそ90分間の期間にわたって注入され得、前の用量が良好な忍容性を示された場合、その後に、30分間の期間にわたって注入される2mg/kgの4~8週間の週1回の維持用量が続く。
本明細書に記載される抗体(又はその機能的フラグメント)を投与して、がん細胞等の細胞の増殖を遅らせ得る又は阻害し得る。これらの適用において、治療有効量の抗体が、がん細胞の増殖、複製、若しくは転移を阻害する、又はがんの兆候若しくは症状を阻害するのに十分な量で対象に投与され得る。一部の実施形態において、抗体を対象に投与して、転移の進行を阻害し得る若しくは阻止し得る、又は微小転移、例えば領域リンパ節への微小転移等の転移のサイズ若しくは数を減少させ得る(Goto et al (2008) Clin. Cancer Res. 14(11):3401-3407)。
抗体の治療有効量は、疾患の重症度及び患者の健康の全般的状態に依存するであろう。抗体の治療有効量は、症状の主観的軽減、又は臨床医若しくは他の有資格観察者によって気付かれる客観的に確認可能な改善のいずれかを提供するものである。これらの組成物は、同時に又は逐次的に、別の化学療法剤と併せて投与され得る。
多くの化学療法剤が現在当技術分野において公知である。1つの実施形態において、化学療法剤は、分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、インターカレート抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答修飾因子、抗ホルモン、例えば抗アンドロゲン、及び抗血管新生剤からなる群から選択され得る。
本明細書において引用されるすべての文書は、参照によりそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によってより詳細に記載されるであろう。
[実施例]
[実施例]
以下の実施例において、IgEのCH3及びCH4ドメインにおける特異的アミノ酸を、IgGのFcRn結合部位に見出されるアミノ酸で置き換えることによって、FcRn結合がIgE抗体に付与され得ることが実証される。
FcRn構築物
IgEのCε3及びCε4ドメインに見出されるループに点変異が行われた、IgEバリアントを創出した。変異により、固有のアミノ酸は、IgG-FcRn相互作用に関わることが公知の位置にてヒスチジンで置き換えられた。IgE抗体は、例えばKaragiannis et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58(6):915-30に開示されるトラスツズマブIgEに基づいた。
IgEのCε3及びCε4ドメインに見出されるループに点変異が行われた、IgEバリアントを創出した。変異により、固有のアミノ酸は、IgG-FcRn相互作用に関わることが公知の位置にてヒスチジンで置き換えられた。IgE抗体は、例えばKaragiannis et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58(6):915-30に開示されるトラスツズマブIgEに基づいた。
IgEのCε3及びCε4ドメインにおけるループが、IgG抗体のCγ2及びCγ3ドメインに由来する1又は2以上のFcRn結合ループで置き換えられた、さらなるバリアントIgE抗体を作出した。IgEのCε3及びCε4ドメインにおいて置き換えられたループは、IgGのCγ2及びCγ3ドメインにおけるFcRn結合ループとの構造相同性を示す。
比較のために、i)IgGに由来するヒンジ及びCγ2ドメインがトラスツズマブIgEのC末端に融合され、並びにii)IgGヒンジ並びにCγ2及びCγ3ドメインがトラスツズマブIgEのC末端に融合され、2種のIgE融合構築物を創出した。
構造分析により、IgG CH2(Cγ2)及びCH3(Cγ3)から、3つのループがFcRn結合に関わると同定された。IgEにおける構造的に等価のループを同定し、IgGループでの置き換えに選定した。3つのループL1、L2、及びL3を同定し、ループ3は、短縮置換(L3a)又は伸長置換(L3b)のいずれかを含有した。付加的に、IgG CH2CH3内の3つのヒスチジン残基が、FcRnとの相互作用に関わると同定された。IgEにおける等価の残基を同定し、ヒスチジンによって置き換えた。
ヒト重鎖及びカッパ軽鎖に対するAbzena社製pANT二重Ig発現ベクターシステムへのクローニングのための隣接制限酵素部位を有して、野生型(WT,wild type)IgE定常ドメイン、及び別個に、IgG FcRn L1、2、3a又はL1、2、3bを含有するIgEの両方に相当するDNA配列を合成した(GeneArt、ThermoFisher Scientific社)。トラスツズマブVHも含有する重鎖を、Mlu I及びKpnI制限部位の間にクローニングした。別個に合成されたトラスツズマブVkを、Pte I及びBamH I制限部位の間にクローニングした。目的のループを増幅する特異的プライマーを使用し、及びすべての考え得る組み合わせで1つ又は2つのIgG1ループを有するIgEを作出するプルスルー(pull through)PCRを使用して、個々のループバリアントを構築して、合計8種の付加的な構築物(L1単独、L2単独、L3単独、L1+2、L1+3a、L1+3a、L2+3a、及びL2+3bを含有する)を作出した。
WT IgE定常ドメインを鋳型として使用した部位指向性変異導入、関連残基をヒスチジンで置き換えることによって、3Hisバリアントを作出した。
IgE-IgG1 CH2及びCH2-CH3融合バリアントを作出するために、特異的プライマーを使用してWT IgEを増幅し、一方でIgE CH4の末端における終止コドンを除去し、かつ別個の反応において、別個に合成されるIgG1 CH2又はIgG1 CH2-CH3のいずれかを増幅した。プルスルーPCRを使用して、両フラグメントを組み合わせ、二重発現ベクターへのクローニングのためのMlu I及びKpnI制限部位を導入した。
以下のハイブリッド抗体分子を構築した。
IgG FcRnループ1を含有するIgE;
IgG FcRnループ2を含有するIgE;
IgG FcRnループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2を含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ2+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ2+ループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3bを含有するIgE;及び
3×IgGヒスチジン残基入れ替えのみを含有するIgE
IgG FcRnループ1を含有するIgE;
IgG FcRnループ2を含有するIgE;
IgG FcRnループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2を含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ2+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ2+ループ3bを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3aを含有するIgE;
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3bを含有するIgE;及び
3×IgGヒスチジン残基入れ替えのみを含有するIgE
加えて、以下の融合タンパク質を構築した。
IgE+IgG1ヒンジ-CH2
IgE+IgG1ヒンジ-CH2-CH3
IgE+IgG1ヒンジ-CH2
IgE+IgG1ヒンジ-CH2-CH3
野生型トラスツズマブIgEに対する配列は以下のとおりであった。
WT IgE_VH_CH1_CH2:
WT IgE_CH3(置き換えられたループは下線が引かれている;ヒスチジンで置き換えられた残基は太字の斜体である):
WT IgE_CH4:
IgEループ1:
IgEループ2:
IgEループ3a:
IgEループ3b:
野生型IgGに対する配列は以下のとおりであった。
WT IgG_ヒンジ:
WT IgG_CH2(ループは斜体でかつ下線が引かれている;置換ヒスチジンは太字である):
WT IgG_CH3:
IgG FcRn結合ループ1:
IgG FcRn結合ループ2:
IgG FcRn結合ループ3a:
IgG FcRn結合ループ3:
ハイブリッド分子に対する配列は以下のとおりであった。各ハイブリッド分子は、野生型IgE_VH_CH1_CH2(すなわち、配列番号1)をさらに含む。
IgG FcRn結合ループ1を含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ2を含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ3aを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ3bを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ1+ループ2を含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ1+ループ3aを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ1+ループ3bを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ2+ループ3aを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRn結合ループ2+ループ3bを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3aを含有するIgE_CH3_CH4:
IgG FcRnループ1+ループ2+ループ3bを含有するIgE_CH3_CH4:
IgE_CH3_CH4 3His
融合タンパク質に対する配列は以下のとおりであった。各融合タンパク質は、野生型IgE_VH_CH1_CH2及びIgE_CH3(すなわち、配列番号1及び2)をさらに含む。
IgE_CH4+IgG1ヒンジ_CH2(RSリンカーを含有する):
IgE_CH4+IgG1ヒンジ_CH2_CH3(RSリンカーを含有する)
IgEの重鎖+IgG1ヒンジ_CH2構築物の全アミノ酸配列が下に示される:
IgEの重鎖+IgG1ヒンジ_CH2_CH3構築物の全アミノ酸配列が下に示される:
以下の変異体ループ配列は、IgE 3His構築物のCH3及びCH4ドメインに見出される。
IgEループ2:
IgEループ3a:
IgEループ3b:
IgE 3His構築物の重鎖の全アミノ酸配列が下に示される(すなわち、WT IgE_VH_CH1_CH2+IgE_CH3_CH4 3His):
IgE 3His構築物の軽鎖の全アミノ酸配列(及び、本明細書に開示される他の構築物)が下に示される:
すべての構築物をシーケンシングによって確認した。DNAを調製し、OC-400プロセシングアセンブリを有するMaxCyte STX(登録商標)エレクトロポレーションシステム(MaxCyte社、Gaithersburg、USA)を使用して、CHO細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの7~10日後、上清を採取した。
抗体(すなわち、上で記載されるバリアント重鎖及びトラスツズマブIgEに由来するカッパ軽鎖を含む)を、IgG1 CH2-CH3融合体に対して、CaptureSelect(登録商標)IgEアフィニティーマトリックス(ThermoFisher社、Loughborough、UK)又はMab Select Sureカラム(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)のいずれかを使用して、細胞培養上清から精製した。溶出された画分をPBSにバッファー交換し、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数(Ec(0.1%))を使用したA280nmによる定量の前に濾過滅菌した。
FcRnへのIgEバリアントの結合
FcRn(Sino Biological社、カタログ番号CT009-H08H)への抗体バリアントの結合を査定するために、トランスフェクトされたCHO細胞培養物由来の上清に対して、単一濃度でのBiacore速度論的分析を実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0(GE Healthcare社、Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)で、速度論的実験を実施した。アッセイの原理は図1に示される。すべての速度論的実験を、0.05% P20(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)及び付加的な150mM NaCl(pH6.0)を含有するPBSを用いて25℃でランした。CaptureSelectビオチン抗IgE抗体(Thermo社、カタログ番号7103542500)をあらかじめロードされたストレプトアビジン(Straptavidin)チップ(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)のFc2、Fc3、及びFc4に抗体をロードした。抗体を10μl/分の流速で捕捉して、約250RUの固定化レベル(RL)を与えた。2000nMのFcRnを10μl/分の流速で40秒間用いて、結合データを獲得した。野生型IgEを陰性対照として使用した。参照チャネルFc1(抗体なし)からのシグナルをFc2、Fc3、及びFc4のものから差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正した。抗IgE抗体捕捉表面の再生を、グリシンpH2.0の1回のインジェクションを使用して行った。
FcRn(Sino Biological社、カタログ番号CT009-H08H)への抗体バリアントの結合を査定するために、トランスフェクトされたCHO細胞培養物由来の上清に対して、単一濃度でのBiacore速度論的分析を実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0(GE Healthcare社、Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)で、速度論的実験を実施した。アッセイの原理は図1に示される。すべての速度論的実験を、0.05% P20(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)及び付加的な150mM NaCl(pH6.0)を含有するPBSを用いて25℃でランした。CaptureSelectビオチン抗IgE抗体(Thermo社、カタログ番号7103542500)をあらかじめロードされたストレプトアビジン(Straptavidin)チップ(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)のFc2、Fc3、及びFc4に抗体をロードした。抗体を10μl/分の流速で捕捉して、約250RUの固定化レベル(RL)を与えた。2000nMのFcRnを10μl/分の流速で40秒間用いて、結合データを獲得した。野生型IgEを陰性対照として使用した。参照チャネルFc1(抗体なし)からのシグナルをFc2、Fc3、及びFc4のものから差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正した。抗IgE抗体捕捉表面の再生を、グリシンpH2.0の1回のインジェクションを使用して行った。
図2に見てわかるように、捕捉された抗体のレベルの有意な差異が見られた。ループ1又は3b又は2種ループ入れ替えのいずれかを含有するバリアントを用いて捕捉された量は、野生型IgEIgG融合抗体又は3His置換抗体に関して観察されたものよりもはるかに低いようであった。この理由は、発現が低い又は捕捉があまり効率的でないということであり得る。FcRn結合ランの間の十分なローディングを可能にするように、希釈及び接触時間を調整した。
図3に見てわかるように、バリアントに関して結合の差異が観察されたが、いくつかのバリアントをさらに追求することは興味深い。概して、対照タンパク質は、予想通りに挙動するようであり、野生型IgEの結合は見られなかったが、一方でIgE-IgG_CH2_CH3の結合は観察された。参照Fc1へのいくらかの結合があり得、IgEバリアントの一部に対するベースラインを下回る推移につながる。
非精製タンパク質を使用した場合、結合速度論は、融合タンパク質IgE_IgG_CH2_CH3に関して観察されたものとは異なるようである。融合タンパク質IgE_IgG_CH2_CH3の結合プロファイルは、代わりに、チップにカップリングされたFcRnを用いてランされたアッセイから予想されるであろう結果と同様である。精製抗体を用いる場合、標準的アミン化学を使用してチップにFcRnを固定化すること、及び種々の濃度の抗体の上を流すことが典型的である。上清におけるIgEの濃度は未知であるため、この手法は適切ではない。
CaptureSelectへの結合が低い場合には、代替的な精製が必要とされ得る。発現が低い場合には、精製及びさらなる分析のための十分な抗体を作出するために、大容量の細胞が要され得ることが推察された。しかしながら、分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC,size exclusion chromatography)とともに抗カッパセレクト樹脂を使用した精製により、発現は問題ではないことが示唆される(示されず)。
これらの結果に基づき、標準的アッセイセットアップにおいて精製材料を使用して、バリアントの大多数を精製しかつ再試験することを決定した。
精製ハイブリッドIgEバリアントの結合
この実験の目標は、ヒトFcRnへの精製IgEバリアント抗体の結合を査定することであった。野生型IgEを陰性対照として使用し、ハーセプチンを陽性対照として使用した。
この実験の目標は、ヒトFcRnへの精製IgEバリアント抗体の結合を査定することであった。野生型IgEを陰性対照として使用し、ハーセプチンを陽性対照として使用した。
FcRnへのIgGの結合はpH依存的であり、血清中に戻るエンドソームに取り入れられる抗体のリサイクリングに関わる。FcRnは、pH7.4でよりもpH6.0で、IgGに対するより高いアフィニティーを有する。
FcRnへの選択されたバリアントの速度論を判定するために、精製抗体に対してマルチサイクル速度論的分析を実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0(GE Healthcare社、Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)で、速度論的実験を実施した。すべての速度論的実験を、0.05% P20(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)及び付加的な150mM NaCl(pH6.0又はpH7.4)を含有するPBSを用いて25℃でランした。アッセイの原理は図1に示される。ヒトFcRnを、標準的アミン化学を使用して、CM5チップ(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)に約300RUまで直接カップリングした。任意の潜在的な大量輸送制限を最小限に抑えるために、精製抗体を30μl/分の流速で分析物として用いて、マルチサイクル速度論データを獲得した。抗体の24.7nM~2000nMの5点3倍希釈域をpH6.0分析に関して使用し、pH7.4分析に関しては、抗体の222.2nM~2000nMの3点3倍希釈域を使用した。抗体のインジェクションに対する会合相を25秒間モニターし、解離相を75秒間測定した。FcRn表面の再生を、0.1M Tris pH8.0インジェクションを使用して実施した。参照チャネルFc1からのシグナルを差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正し、定常状態結合モデルを使用してデータをフィットさせた。
結果として生じたデータに対して定常状態分析を行い、そのような分析は、低アフィニティー相互作用に特に適切である。平衡状態にある応答(Req)のプロットを濃度に対してプロットする。アフィニティー測定に関して、センサーグラムは、結合の会合相の間に定常状態(Xにおけるプラトー)に達するべきである(図5を参照されたい)。応答対濃度のプロット上で、KD値は、最大応答の50%を与える濃度に等しい。平衡状態にある応答(Req)が濃度に対してプロットされた場合に合理的な曲率が獲得された場所で、KDは提供される。
図6及び表1は、pH6.0での、FcRnへのIgG1、IgG4、及び融合構築物IgE_IgG_CH2_CH3の結合を示している。
表1:
図7及び表2は、pH6.0での、ヒトFcRnへのハーセプチン、野生型IgE、IgE_IgG_CH2_CH3、3×IgGヒスチジン残基を含有するIgE、IgG FcRnループ2及びループ3aを含有するIgE、IgG FcRnループ1を含有するIgE、並びにIgG FcRnループ1、ループ2、及びループ3aを含有するIgEの結合に関する生データ及びフィットさせたデータを示している。
表2:
図8及び9並びに表3及び4は、pH7.4で行われた同じ実験の結果を示している。
表3:
表4:
見てわかるように、FcRnへのIgE_IgG_CH2_CH3の結合は、野生型IgGのものと概ね同様である。
別様に指定されない限り、技術的及び科学的用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解される意味を有する。さらなる手引きによって、用語定義は、本発明の教示をよりよく解するために含まれ得る。
抗HMW-MAAハイブリッド抗体
さらなる実施例において、別のIgE 3Hisバリアントを創出する(実施例1、配列番号34及び35を参照されたい)。この実施例において、IgE抗体は、実施例1にあるトラスツズマブIgEではなく、例えば国際公開第2013/050725号パンフレットに開示される抗HMW-MAA抗体に基づく。したがって、この実施例において、トラスツズマブVH及びVLドメイン(配列番号34及び35に存在する)は、抗HMW-MAA抗体VH及びVLドメインで置き換えられる。抗体は、実施例1に記載されるように産生されかつ精製される。抗体結合の分析は、実施例2~3に記載されるように試験される。
さらなる実施例において、別のIgE 3Hisバリアントを創出する(実施例1、配列番号34及び35を参照されたい)。この実施例において、IgE抗体は、実施例1にあるトラスツズマブIgEではなく、例えば国際公開第2013/050725号パンフレットに開示される抗HMW-MAA抗体に基づく。したがって、この実施例において、トラスツズマブVH及びVLドメイン(配列番号34及び35に存在する)は、抗HMW-MAA抗体VH及びVLドメインで置き換えられる。抗体は、実施例1に記載されるように産生されかつ精製される。抗体結合の分析は、実施例2~3に記載されるように試験される。
HMW-MAA IgEに対する可変ドメイン配列は以下のとおりである。
HMW-MAA VH(配列番号170):
HMW-MAA VL(配列番号171):
代替的な実施形態において、HMW-MAA IgEに対する可変ドメイン配列は以下のとおりである。
HMW-MAA VH(配列番号184):
HMW-MAA VL(配列番号185):
したがって、具体的な実施形態において、抗HMW-MAA抗体は、以下の重鎖又は軽鎖配列の1つを含み得る(下線は可変ドメイン配列を示し、標準的文字列はIgE Fc配列を示し、太字の下線配列はHis変異を示す)。
HMW-MAA重鎖(配列番号186):
HMW-MAA軽鎖(配列番号187):
代替的HMW-MAA重鎖(配列番号188):
代替的HMW-MAA軽鎖(配列番号189):
ヘテロ二量体IgEの産生
IgE-IgG-Fc(IGEG)融合タンパク質の構築
WT IgE定常ドメインに相当するDNA配列をCHO発現のためにコドン最適化し、ヒト重鎖及びカッパ軽鎖に対するpANT二重Ig発現ベクターシステムへのクローニングのための隣接制限酵素部位を有して合成した(GeneArt、ThermoFisher Scientific社、Loughborough、UK)。トラスツズマブVHも含有する重鎖を、Mlu I及びKpn I制限部位の間にクローニングした。別個に合成されたトラスツズマブVkを、カッパ定常領域の上流にあるBssH II及びBamH I制限部位の間にクローニングした。
IgE-IgG-Fc(IGEG)融合タンパク質の構築
WT IgE定常ドメインに相当するDNA配列をCHO発現のためにコドン最適化し、ヒト重鎖及びカッパ軽鎖に対するpANT二重Ig発現ベクターシステムへのクローニングのための隣接制限酵素部位を有して合成した(GeneArt、ThermoFisher Scientific社、Loughborough、UK)。トラスツズマブVHも含有する重鎖を、Mlu I及びKpn I制限部位の間にクローニングした。別個に合成されたトラスツズマブVkを、カッパ定常領域の上流にあるBssH II及びBamH I制限部位の間にクローニングした。
IgE-IgG(IGEG)融合体を作出するために、特異的プライマーを使用してWT IgEを増幅し、一方でIgE CH4の末端における終止コドンを除去し、かつ別個の反応において、別個に合成されるIgG1ヒンジ-CH2-CH3を増幅した。プルスルーPCRを使用して、両フラグメントを組み合わせ、二重発現ベクターへのクローニングのためのMlu I及びKpnI制限部位を導入した。その後、BsmBI制限部位を部位指向性変異導入(Quikchange、Agilent社)によってトラスツズマブVHのFW4領域内に導入し、それは、Mlu IとともにVH領域の入れ替えを可能にした(ベクターの略図に関しては、図10を参照されたい)。
IgGヒンジ領域内の潜在的遊離システイン残基を除去するために、BsmBI含有IgE-IgG構築物を鋳型として使用した部位指向性変異導入によって、Cys220Serアミノ酸置換を導入するようにプライマーを設計した(番号付けは、IGEG配列のIgG部分を参照して、EU番号付けスキームに基づく)。Cys220Ser変異は、下の配列において青色で示される。
FcRnに結合するIGEGのIgG部分の能力を除去するために、通常FcRn結合に関わる3つの残基においてアミノ酸置換Ile253Ala、His310Ala、及びHis435Alaを行った(番号付けは、IGEG配列のIgG部分を参照して、EU番号付けスキームに基づく)。プライマーを設計し、BsmBI含有IgE-IgG構築物(Cys220又はSer220のいずれかを含有する)を鋳型として使用して、部位指向性変異導入(Agilent社Quikchange)を実施した。
構築物のCH1シリーズを作出するために、CH1 VH及びVKを合成し(GeneArt)、IGEGベクターにクローニングした。CH1 VHをMluI及びBsmBI制限部位の間にクローニングし、CH1 VkをBssH II及びBamH I制限部位の間にクローニングした。
すべての構築物をサンガーシーケンシングによって確認した。
配列は以下のとおりであった(下線は可変ドメイン配列を示し、標準的文字列はIgE Fc配列を示し、太字はIgG由来配列を示し、太字の下線は特異的変異を示す)。
トラスツズマブIgE/IGEGバリアント配列
トラスツズマブIgE重鎖(配列番号172)
トラスツズマブIgE-IgG-Fc重鎖(配列番号173)
トラスツズマブIgE-IgG-Fc C220S重鎖(配列番号174)
トラスツズマブIgG-IgG-Fc dFcRn重鎖(配列番号175)
トラスツズマブIgG-IgG-Fc dFcRn C220S重鎖(配列番号176)
カッパトラスツズマブ軽鎖(配列番号177)
HMW-MAA IgE/IGEGバリアント配列
HMW-MAA IgE重鎖(配列番号178)
HMW-MAA IgE IgG-Fc重鎖(配列番号179)
HMW-MAA IgE-IgG-Fc C220S重鎖(配列番号180)
HMW-MAA IgG-IgG-Fc dFcRn重鎖(配列番号181)
HMW-MAA IgG-IgG-Fc dFcRn C220S重鎖(配列番号182)
HMW-MAAカッパ軽鎖(配列番号183)
IgE-IgG(IGEG)バリアントのCHO一過性発現
種々のIGEG構築物をコードするエンドトキシンフリーDNAを、OC-400プロセシングアセンブリ及びMaxCyte STX(登録商標)エレクトロポレーションシステム(MaxCyte社、Gaithersburg、USA)を使用して、Freestyle(登録商標)CHO-S細胞(ThermoFisher社、Loughborough、UK)に一過性に共トランスフェクトした。細胞回収の後、細胞をプールし、8mM L-グルタミン(ThermoFisher社)及び1×ヒポキサンチン-チミジン(ThermoFisher社)を含有するCD Opti-CHO培地(ThermoFisher社)中にて3×106個細胞/mLに希釈した。トランスフェクションの24時間後、培養温度を32℃に低下させ、30%(スタート容量の)Efficient Feed B(ThermoFisher社)、3.3% FunctionMAX(登録商標)TiterEnhancer(ThermoFisher社)、及び1mM酪酸ナトリウム(Sigma社、Dorset、UK)を添加した。培養物に、15%(現容量の)CHO CD Efficient Feed B(ThermoFisher社)及び1.65% FunctionMAX(登録商標)TiterEnhancer(ThermoFisher社)の添加によって7日目に培養物を供給した。すべてのトランスフェクションを、上清を採取する前に最高14日間培養した。
種々のIGEG構築物をコードするエンドトキシンフリーDNAを、OC-400プロセシングアセンブリ及びMaxCyte STX(登録商標)エレクトロポレーションシステム(MaxCyte社、Gaithersburg、USA)を使用して、Freestyle(登録商標)CHO-S細胞(ThermoFisher社、Loughborough、UK)に一過性に共トランスフェクトした。細胞回収の後、細胞をプールし、8mM L-グルタミン(ThermoFisher社)及び1×ヒポキサンチン-チミジン(ThermoFisher社)を含有するCD Opti-CHO培地(ThermoFisher社)中にて3×106個細胞/mLに希釈した。トランスフェクションの24時間後、培養温度を32℃に低下させ、30%(スタート容量の)Efficient Feed B(ThermoFisher社)、3.3% FunctionMAX(登録商標)TiterEnhancer(ThermoFisher社)、及び1mM酪酸ナトリウム(Sigma社、Dorset、UK)を添加した。培養物に、15%(現容量の)CHO CD Efficient Feed B(ThermoFisher社)及び1.65% FunctionMAX(登録商標)TiterEnhancer(ThermoFisher社)の添加によって7日目に培養物を供給した。すべてのトランスフェクションを、上清を採取する前に最高14日間培養した。
IGEGバリアントの精製及び分析
培養物採取の後、抗体上清を濾過して、残存する細胞残屑を除去し、10×PBSを補給してpHを中和した。大多数のIGEG精製(dFcRn IGEGを含む)を、バッチ結合様態で、IgE CaptureSelect(登録商標)アフィニティー樹脂(ThermoFisher Scientific社)を使用して実施した。アフィニティー樹脂をPBS pH7.2中で平衡化し、次いで、回転させながら室温で2時間各試料とともにインキュベートし、その後に一連のPBS洗浄が続いた。すべての試料を、50mMクエン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウムpH3.5中に溶出し、PBS pH7.2にバッファー交換した。試料を、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数(Ec(0.1%))を使用してOD280nmによって定量した。
培養物採取の後、抗体上清を濾過して、残存する細胞残屑を除去し、10×PBSを補給してpHを中和した。大多数のIGEG精製(dFcRn IGEGを含む)を、バッチ結合様態で、IgE CaptureSelect(登録商標)アフィニティー樹脂(ThermoFisher Scientific社)を使用して実施した。アフィニティー樹脂をPBS pH7.2中で平衡化し、次いで、回転させながら室温で2時間各試料とともにインキュベートし、その後に一連のPBS洗浄が続いた。すべての試料を、50mMクエン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウムpH3.5中に溶出し、PBS pH7.2にバッファー交換した。試料を、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数(Ec(0.1%))を使用してOD280nmによって定量した。
選択されたIGEG構築物(例えば、Cys220又はSer220のいずれかを含有するトラスツズマブIGEG)を、プロテインAを使用して精製して、プロテインA結合の保持を実証した。培養物採取の後、抗体上清を濾過して、残存する細胞残屑を除去し、10×PBSを補給してpHを中和した。次いで、PBS pH7.2で事前に平衡化された1mL Hitrap MabSelect PrismAカラム(Cytiva社、Little Chalfont、UK)を使用して、抗体を上清から精製した。試料ローディングの後、カラムをPBS pH7.2で洗浄し、タンパク質を0.1Mクエン酸ナトリウムpH3.0で溶出した。画分を収集し、pHを1M Tris-HCl pH9.0で調整し、その後にPBS pH7.2へのバッファー交換が続いた。試料を、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数(Ec(0.1%))を使用してOD280nmによって定量した。
すべてのIGEG抗体バリアントを、PBS pH7.2を移動相として使用したHiLoad(登録商標)26/60 Superdex(登録商標)200pg分取SECカラム(GE Healthcare社、Little Chalfont、UK)を使用してさらに精製した。単量体タンパク質を含有する精製物からのピーク画分をプールし、濃縮し、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数(Ec(0.1%))を使用したA280nmによる定量の前に濾過滅菌した。
次いで、精製された材料を、分析的SE-HPLC及びSDS-PAGEによって分析した。Dionex Ultimate 3000RS HPLCシステム(ThermoFisher Scientific社、Hemel Hempstead、UK)に接続されたAcquity UPLC Protein BEH SEC Column、200Å、1.7μm、4.6mm×150mm(Waters社、Elstree、UK)及びAcquity UPLC Protein BEH SEC guard column 30×4.6mm、1.7μm、200Å(Waters社、Elstree、UK)を使用して、分析的SECを実施した。方法は、10分間にわたるイソクラテイック溶出からなり、移動相は、0.2Mリン酸カリウムpH6.8、0.2M塩化カリウムであった。流速は0.35mL/分であった。280nmにおけるUV吸収によって検出を行った。精製の後、すべてのIGEG抗体バリアントは、95%を超える単量体種を含有することが示された。
同族抗原へのIGEGバリアントのシングルサイクル速度論的分析
Biacore分析による、HMW-MAA IGEGバリアントのその同族抗原への結合分析は、立体構造的に適当な抗原がないことに起因して不可能であった。その代わりに、結合をフローサイトメトリーによって分析した。
Biacore分析による、HMW-MAA IGEGバリアントのその同族抗原への結合分析は、立体構造的に適当な抗原がないことに起因して不可能であった。その代わりに、結合をフローサイトメトリーによって分析した。
ヒトHer2抗原への精製トラスツズマブIGEGバリアントのすべてについての結合を査定するために、シングルサイクル速度論的分析を精製抗体に対して実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0(Cytiva社、Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200で、速度論的実験を25℃で実施した。プロセスの概略に関しては、図11を参照されたい。
1% BSA(Sigma社、Dorset、UK)を補給したHBS-EP+(Cytiva社、Uppsala、Sweden)をランニングバッファーとして、並びにリガンド及び分析物希釈に使用した。精製抗体を、ランニングバッファー中にて10μg/mLに希釈した。各サイクルのスタート時に、抗Fab抗体(抗カッパ抗体及び抗ラムダ抗体の混合物からなる)CM5センサーチップ(Cytiva社、Little Chalfont、UK)のFc2、Fc3、及びFc4に抗体をロードした。抗体を10μl/分の流速で捕捉して、約45RUの固定化レベル(RL)を与えた。次いで、表面を安定させた。
任意の潜在的な大量輸送効果を最小限に抑えるために、組換えヒトHer2抗原(Sino Biological社、Beijing、China)を40μL/分の流速でインジェクトされる分析物として使用して、シングルサイクル速度論データを獲得した。ランニングバッファー中の抗原の1.1nM~30nMの4点3倍希釈域を、各濃度間での再生なしで使用した。増加する濃度の抗原の4回のインジェクションのそれぞれに対して、会合相を240秒間モニターし、抗原の最後のインジェクションの後に、単回解離相を600秒間測定した。センサーチップ表面の再生を、10mMグリシンpH2.1の2回のインジェクションを使用して行った。
参照チャネルFc1(捕捉された抗体なし)からのシグナルをFc2、Fc3、及びFc4のものから差し引いて、バルク効果及び参照表面への非特異的結合の差異を補正した。各抗体ブランクラン(抗体は補足されたが抗原なし)からのシグナルを差し引いて、表面安定性の差異を補正した(図12を参照されたい)。試験された各トラスツズマブ構築物は、ヒトHer2への同様の結合を示した(表6)。
ヒトFc受容体へのIGEGバリアント結合についての査定
高及び低アフィニティーFcガンマ受容体並びに高アフィニティーFcエプシロン受容体への精製IGEGの結合を、30μl/分の流速でランする、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1(Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)機器を使用してシングルサイクル分析によって査定した。ヒトFcガンマ受容体のすべて(低アフィニティー受容体hFcγRIIIa(176F及び176V多型の両方)及びhFcγRIIIbとともにhFcγRI)を、Sino Biological社(Beijing、China)から獲得し、hFcεR1をR&D Systems社(Minneapolis、USA)から獲得した。標準的アミン化学を使用して、His capture kit(Cytiva社、Uppsala、Sweden)を使用してあらかじめカップリングしたCM5センサーチップ上にFcRsを捕捉した。Fcガンマ受容体への抗体結合を査定するために使用されたアッセイを詳述する概略は、図13に見出され得る。
高及び低アフィニティーFcガンマ受容体並びに高アフィニティーFcエプシロン受容体への精製IGEGの結合を、30μl/分の流速でランする、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1(Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)機器を使用してシングルサイクル分析によって査定した。ヒトFcガンマ受容体のすべて(低アフィニティー受容体hFcγRIIIa(176F及び176V多型の両方)及びhFcγRIIIbとともにhFcγRI)を、Sino Biological社(Beijing、China)から獲得し、hFcεR1をR&D Systems社(Minneapolis、USA)から獲得した。標準的アミン化学を使用して、His capture kit(Cytiva社、Uppsala、Sweden)を使用してあらかじめカップリングしたCM5センサーチップ上にFcRsを捕捉した。Fcガンマ受容体への抗体結合を査定するために使用されたアッセイを詳述する概略は、図13に見出され得る。
各サイクルのスタート時に、0.05% v/v界面活性剤P20(HBS-P+)を含有するHEPES緩衝生理食塩水中に希釈したHisタグ付けされたFc受容体を、指定のRUレベルまでロードした(表7)。各濃度間での再生なしで、試験抗体の5点3倍希釈域を、試験された各受容体に対して使用した。各Fc受容体に対してロードされた標的RU、各試験抗体に対して使用された濃度域とともに試験抗体結合に使用された会合及び解離時間が(表7)に示される。すべての場合において、抗体を、増加する濃度でチップ上を通過させ、その後に単回の解離ステップが続いた。解離の後、グリシンpH1.5の2回のインジェクションを用いて、チップを再生した。参照チャネルFc1(ブランク)からのシグナルを、受容体をロードされたFcのものから差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正した。高アフィニティー相互作用を、1:1フィットを使用して分析し(例となるデータに関しては、図17a及び17bを参照されたい)、一方で低アフィニティー相互作用を、定常状態モデルを使用して分析した(例となるデータに関しては、図17c及び17dを参照されたい)。表8は、獲得されたデータの要約を示している。IGEGバリアントは、試験されたFcガンマ受容体及びFcエプシロン受容体の両方に結合した。IgG対照は、Fcガンマ受容体に行き着いたがFcエプシロンには行き着かず、一方で逆に、IgE対照は、Fcエプシロン受容体に行き着いたが試験されたFcガンマ受容体には行き着かなかった。
ヒトFcRnへのIGEGバリアント結合についての査定
FcRnへの精製抗体の結合を、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1(Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)機器を使用して、定常状態アフィニティー分析によって査定した。hFcRn(Sino Biological社、Beijing、China)を、標準的アミンカップリングを使用して、酢酸ナトリウムpH5.5中10μg/mLでSeries S CM5(カルボキシメチル化デキストラン)センサーチップ(Cytiva社、Uppsala、Sweden)上にカップリングした。精製HMW-MAA抗体を、pH6.0で0.05%ポリソルベート20(P20,Polysorbate 20)を含有するPBS中31.25nM~2000nMの7点2倍希釈、又はpH7.4で0.05%ポリソルベート20(P20)を含有するPBS中250nM~2000nMの4 3点2倍希釈において力価測定した。抗体を、30μl/分の流速でかつ25℃で、増加する濃度を用いてチップ上を通過させた。インジェクション時間は濃度あたり40sであり、解離時間は75秒であった。単回解離の後、0.1M Tris pH8.0を用いて、チップを再生した。図15は、FcRnへの抗体結合を査定するために使用されたアッセイの概略を示している。相互作用を、定常状態モデルを使用して分析した(例となるデータに関しては、図16a~16dを参照されたい)。表9は、獲得されたデータの要約を示している。FcRn結合部位が除去されたもの(dFcRn)及びFcRnに結合できなかったものを除いて、IGEGバリアントはpH6.0でFcRnに結合した。IgG対照は、予想通りFcRnに行き着き、一方でIgEはFcRnへのいかなる結合も示さなかった。
FcRnへの精製抗体の結合を、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1(Uppsala、Sweden)をランするBiacore T200(シリアル番号1909913)機器を使用して、定常状態アフィニティー分析によって査定した。hFcRn(Sino Biological社、Beijing、China)を、標準的アミンカップリングを使用して、酢酸ナトリウムpH5.5中10μg/mLでSeries S CM5(カルボキシメチル化デキストラン)センサーチップ(Cytiva社、Uppsala、Sweden)上にカップリングした。精製HMW-MAA抗体を、pH6.0で0.05%ポリソルベート20(P20,Polysorbate 20)を含有するPBS中31.25nM~2000nMの7点2倍希釈、又はpH7.4で0.05%ポリソルベート20(P20)を含有するPBS中250nM~2000nMの4 3点2倍希釈において力価測定した。抗体を、30μl/分の流速でかつ25℃で、増加する濃度を用いてチップ上を通過させた。インジェクション時間は濃度あたり40sであり、解離時間は75秒であった。単回解離の後、0.1M Tris pH8.0を用いて、チップを再生した。図15は、FcRnへの抗体結合を査定するために使用されたアッセイの概略を示している。相互作用を、定常状態モデルを使用して分析した(例となるデータに関しては、図16a~16dを参照されたい)。表9は、獲得されたデータの要約を示している。FcRn結合部位が除去されたもの(dFcRn)及びFcRnに結合できなかったものを除いて、IGEGバリアントはpH6.0でFcRnに結合した。IgG対照は、予想通りFcRnに行き着き、一方でIgEはFcRnへのいかなる結合も示さなかった。
IGEGバリアントについてのUNcle生体内安定性プラットフォーム分析
IGEGバリアントを、UNcle生体内安定性プラットフォーム(Unchained labs社、Pleasanton、USA)を使用して熱安定性について分析した。熱傾斜安定性実験(Tm及びTagg)は、タンパク質及び製剤を安定性についてランク付けするための十分に確立された方法である。タンパク質の変性プロファイルは、その熱安定性についての情報を提供し、構造的変更及び製剤バッファー変更を査定するための構造的「フィンガープリント」を表す。タンパク質の熱構造安定性についての広く使用されている測定は、それが天然状態から変性状態にアンフォールドする温度である。多くのタンパク質に関して、このアンフォールディングプロセスは、狭い温度域にわたって生じ、この遷移の中間点は「融解温度」又は「Tm」と称される。タンパク質の融解温度を判定するために、UNcleは、タンパク質が立体構造的変化を受けるときのSypro Orange(タンパク質の曝露された疎水性領域に結合する)の蛍光を測定する。
IGEGバリアントを、UNcle生体内安定性プラットフォーム(Unchained labs社、Pleasanton、USA)を使用して熱安定性について分析した。熱傾斜安定性実験(Tm及びTagg)は、タンパク質及び製剤を安定性についてランク付けするための十分に確立された方法である。タンパク質の変性プロファイルは、その熱安定性についての情報を提供し、構造的変更及び製剤バッファー変更を査定するための構造的「フィンガープリント」を表す。タンパク質の熱構造安定性についての広く使用されている測定は、それが天然状態から変性状態にアンフォールドする温度である。多くのタンパク質に関して、このアンフォールディングプロセスは、狭い温度域にわたって生じ、この遷移の中間点は「融解温度」又は「Tm」と称される。タンパク質の融解温度を判定するために、UNcleは、タンパク質が立体構造的変化を受けるときのSypro Orange(タンパク質の曝露された疎水性領域に結合する)の蛍光を測定する。
各バリアントに対する試料を、0.8mg/mLの最終濃度でPBS及びSypro Orange中に製剤化した。9μLの各試料混合物を、UNiマイクロキュベットに二つ組でロードした。試料を、0.3℃/分の傾斜速度及び473nmでの励起を用いて、25~95℃の熱傾斜に供した。全発光スペクトルを250~720nmから収集し、510~680nm間の曲線下面積を使用して、遷移曲線の変曲点(T開始及びTm)を計算した。473nmでの静的光散乱(SLS,static light scattering)のモニタリングにより、タンパク質凝集の検出が可能となり、Tagg(凝集の開始)を、結果として生じるSLSプロファイルから計算した。データ分析を、UNcle(登録商標)ソフトウェアバージョン4.0を使用して実施し、表10に要約した。Tm1値は、各セットのバリアント内並びにIgE及びIGEGバリアント間で概ね一貫していた(図17a)が、しかしながら、IGEGバリアントは、等価のIgEバリアント単独と比較して、静的光散乱プロファイルの有意な改善を示した(図17b)。
A375細胞へのIGEGバリアント結合についての査定
HMW-MAAへの実施例4及び5に詳述される抗体バリアントの結合を、HMW-MAA(CSPG4)を発現するA375細胞を使用して査定した。
HMW-MAAへの実施例4及び5に詳述される抗体バリアントの結合を、HMW-MAA(CSPG4)を発現するA375細胞を使用して査定した。
方法
A375細胞を採取する
A375細胞を、標準的方法を使用して培養した。A375細胞がコンフルエントになった場合、細胞を採取した。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、その後TrypLE(登録商標)と37℃で10分間インキュベートして、細胞をフラスコから切り離した。細胞を10mLの培地に再懸濁し、250gで3分間遠心分離した。次いで、細胞を1mL FACSバッファーに再懸濁し、Cellometer(登録商標)でカウントして、細胞数及び生存率を判定した。この後、細胞をFACSバッファーを用いてmLあたり1×106個細胞に希釈し、この細胞懸濁液の100μLをプレート上にウェルごとに播種した。
A375細胞を採取する
A375細胞を、標準的方法を使用して培養した。A375細胞がコンフルエントになった場合、細胞を採取した。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、その後TrypLE(登録商標)と37℃で10分間インキュベートして、細胞をフラスコから切り離した。細胞を10mLの培地に再懸濁し、250gで3分間遠心分離した。次いで、細胞を1mL FACSバッファーに再懸濁し、Cellometer(登録商標)でカウントして、細胞数及び生存率を判定した。この後、細胞をFACSバッファーを用いてmLあたり1×106個細胞に希釈し、この細胞懸濁液の100μLをプレート上にウェルごとに播種した。
結合アッセイ
A375細胞(ATCC、Virginia、US)への精製IGEGの結合を、AttuneソフトウェアV3.1.2をランするAttune(登録商標)NxT Acoustic Focusing Cytometer(ThermoFisher Scientific社、Loughborough、UK)を使用して、フローサイトメトリーによって査定した。A375細胞を一次抗体(実施例5に記載される)とともに4℃で30分間インキュベートし、その後に、10μg/mlのFITCコンジュゲートヤギ抗ヒト抗IgG又はIgE二次抗体(Vector Laboratories社、California、US)との4℃でさらなる30分間のインキュベーションが続いた。細胞を洗浄し、FACSバッファーに再懸濁し、次いでAttune(登録商標)NxT Acoustic Focusing Cytometer上に取得した。FlowJo(登録商標)ソフトウェアバージョン10(Becton, Dickinson and Company社、New Jersey、US)及びGraphPad Prism 8(GraphPad Software社、California、US)を使用して、データを分析した。
A375細胞(ATCC、Virginia、US)への精製IGEGの結合を、AttuneソフトウェアV3.1.2をランするAttune(登録商標)NxT Acoustic Focusing Cytometer(ThermoFisher Scientific社、Loughborough、UK)を使用して、フローサイトメトリーによって査定した。A375細胞を一次抗体(実施例5に記載される)とともに4℃で30分間インキュベートし、その後に、10μg/mlのFITCコンジュゲートヤギ抗ヒト抗IgG又はIgE二次抗体(Vector Laboratories社、California、US)との4℃でさらなる30分間のインキュベーションが続いた。細胞を洗浄し、FACSバッファーに再懸濁し、次いでAttune(登録商標)NxT Acoustic Focusing Cytometer上に取得した。FlowJo(登録商標)ソフトウェアバージョン10(Becton, Dickinson and Company社、New Jersey、US)及びGraphPad Prism 8(GraphPad Software社、California、US)を使用して、データを分析した。
結果
図18a及び18bに実証されるように、すべてのHMW-MAA抗体及びバリアントはA375細胞に結合した。
図18a及び18bに実証されるように、すべてのHMW-MAA抗体及びバリアントはA375細胞に結合した。
ADCC及びADCPアッセイ
アッセイを実施して、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷し得る2つの主なメカニズムである抗体依存性細胞媒介性貪食(ADCP)及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の両方のレベルに対する、記載される抗体の効果を判定した。実施例5に記載される抗体バリアントを、トラスツズマブIgE及びハーセプチンIgG抗体と比較した。
アッセイを実施して、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷し得る2つの主なメカニズムである抗体依存性細胞媒介性貪食(ADCP)及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の両方のレベルに対する、記載される抗体の効果を判定した。実施例5に記載される抗体バリアントを、トラスツズマブIgE及びハーセプチンIgG抗体と比較した。
方法
U-937エフェクター細胞及びSK-BR-3標的細胞を使用して、当技術分野に存在するもの(例えば、Three-colour flow cytometric method to measure antibody-dependent tumour cell killing by cytotoxicity and phagocytosis. J Immunol Methods. 2007 Jun 30;323(2):160-71を参照されたい)と同様の方法を使用して、ADCC及びADCPアッセイを実施した。
U-937エフェクター細胞及びSK-BR-3標的細胞を使用して、当技術分野に存在するもの(例えば、Three-colour flow cytometric method to measure antibody-dependent tumour cell killing by cytotoxicity and phagocytosis. J Immunol Methods. 2007 Jun 30;323(2):160-71を参照されたい)と同様の方法を使用して、ADCC及びADCPアッセイを実施した。
アッセイを実施する前日、Her2発現腫瘍細胞(SK-BR-3)を染色した。これを行うために、SK-BR-3細胞を、TrypLEを使用してプレートから切り離し、完全RPMI培地(pen/strep及び10% HI FBSを補給されたRPMI 1640培地)で洗浄し、その後、無血清HBSSに添加した。HBSS中0.75μLの0.5mMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CSFE)を1×106個細胞ごとに添加し、細胞を37℃で10分間インキュベートした。洗浄後、細胞を播種し、一晩インキュベートした。
翌日、U-937エフェクター細胞を継代し、トリパンブルーを使用してカウントし、完全RPMI培地に再懸濁して、mLあたり1.5×106個細胞を提供した。CFSE標識SK-BR-3細胞をTrypLE処理によって切り離し、洗浄し、カウントし、完全RPMI培地に再懸濁して、mLあたり0.5×106個細胞を提供した。次いで、実施例5に詳述されるトラスツズマブIgE、ハーセプチンIgG、トラスツズマブ-IGEG、トラスツズマブ-IGEG-C220S、及びIgGアイソタイプ抗体を、120nMのスタート濃度に希釈し、次いで6の倍数で連続希釈した。25μLの各抗体希釈物を、50μLのSK-BR-3細胞懸濁液(25000個細胞と等価)及び25μLのU-937エフェクター細胞懸濁液(37500個細胞と等価)とともに、96ウェルプレートに二つ組で添加した。CSFE染色、U-397細胞、SK-BR-3細胞、生存SK-BR-3細胞(熱ショックされたSK-BR-3細胞によって置き換えられた)、又は試験抗体のうちの1又は2以上を欠く、適当な対照ウェルがアッセイに含まれた。次いで、プレートを37℃で3時間インキュベートし、遠心分離し、FACSバッファー(PBS+2% FCS)で2回洗浄し、その後、2μL CD89 APCコンジュゲート標識化抗体を有する100μL FACSに再懸濁した。対照ウェルをFACSバッファー単独に再懸濁した。4℃で30分後、プレートを遠心分離し、FACSバッファーで再度2回洗浄し、その後、ヨウ化プロピジウム(PI,propidium iodide)染色剤(100μLあたり5μL)を含有する100μL FACSバッファーに細胞を再懸濁した。対照ウェルをFACSバッファーに再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。
次いで、50,000個細胞/チューブをAttune(登録商標)NxT Acoustic Focusing Cytometer上に取得した。補償は、対照ウェルを使用したセットアップであった。R1、R2、R3ゲーティングを分析ソフトウェア(Flow Jo)において適用し(図19)、細胞カウントをゲートごとに獲得した。次いで、計算を実施して、細胞傷害(ADCC)又は貪食(ADCP)活性を判定した。
結果
図20に実証されるように、トラスツズマブ-IGEG(IGEG-CH2CH3)抗体は、試験されたすべての濃度(120~7.5nM)にわたって、ハーセプチンIgG及びトラスツズマブIgE抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。トラスツズマブ-IGEG-C200S(IGEG-CH2CH3-C220S)抗体は、ハーセプチンIgG及びトラスツズマブIgE抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。加えて、結果は、トラスツズマブIgE、ハーセプチンIgG、及び両IGEG抗体が、細胞傷害に対して同等の効果を有したことを実証する。
図20に実証されるように、トラスツズマブ-IGEG(IGEG-CH2CH3)抗体は、試験されたすべての濃度(120~7.5nM)にわたって、ハーセプチンIgG及びトラスツズマブIgE抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。トラスツズマブ-IGEG-C200S(IGEG-CH2CH3-C220S)抗体は、ハーセプチンIgG及びトラスツズマブIgE抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。加えて、結果は、トラスツズマブIgE、ハーセプチンIgG、及び両IGEG抗体が、細胞傷害に対して同等の効果を有したことを実証する。
本出願は、2019年10月1日に出願された英国特許出願第1914165.4号明細書、2019年11月22日に出願された英国特許出願第1917059.6号明細書、及び2020年6月2日に出願された英国特許出願第2008248.3号明細書からの優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。上記明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の記載される実施形態の様々な変更及び変形が当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているものの、主張される本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を行うための記載される様態の様々な変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
Claims (30)
- Fcε受容体及び胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する、ハイブリッド抗体。
- IgE抗体に由来する、1又は2以上の重鎖定常ドメイン又はそのバリアント若しくは機能的フラグメントを含む、請求項1に記載のハイブリッド抗体。
- 少なくともCε3ドメイン又はそのバリアント若しくは機能的フラグメントを含む、請求項1又は2に記載のハイブリッド抗体。
- 少なくともCε2、Cε3、及びCε4ドメイン又はそのバリアント若しくは機能的フラグメントを含む、請求項1~3のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- IgG抗体に由来する、FcRnに対する結合部位のすべて若しくは一部又はそのバリアント若しくは機能的フラグメントを含む、請求項1~4のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- FcRn結合が、四量体IgEの少なくとも1つのFcドメインにおける1又は2以上のアミノ酸置換によって提供される、請求項1~5のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- (i)IgEのCε3における少なくとも1つのアミノ酸置換;
(ii)IgEのCε4における少なくとも1つのアミノ酸置換;並びに/又は
(iii)IgEのCε3における1つのアミノ酸置換及びCε4における2つのアミノ酸置換;
を含む、請求項6に記載のハイブリッド抗体。 - IgEにおけるアミノ酸置換が、IgGの対応する位置に存在する非天然ヒスチジン残基を含む、請求項6又は7に記載のハイブリッド抗体。
- FcRn結合を付与する1、2、又は3つの異種ヒスチジン残基を含むIgE抗体を含む、請求項1~8のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- IgEのCε3のループ2において、トレオニンがヒスチジンに置換される、請求項6~9のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- IgEのCε4のループ3において、セリンがヒスチジンに置換され、グルタミンがヒスチジンに置換される、請求項6~10のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- (i)78位にヒスチジン残基を含むバリアントIgE Cε3ドメイン;
(ii)95及び/又は98位にヒスチジン残基を含むバリアントIgE Cε4ドメイン;
を含む、請求項1~11のいずれかに記載のハイブリッド抗体。 - (i)配列番号2と少なくとも85%、90%、95%、若しくは99%の配列同一性を有し、かつ、T78H変異を含むIgE Cε3ドメイン;並びに/又は
(ii)配列番号3と少なくとも85%、90%、95%、若しくは99%の配列同一性を有し、かつ、S95H及び/若しくはQ98H変異を含むIgE Cε4ドメイン;
を含む、請求項1~12のいずれかに記載のハイブリッド抗体。 - (i)配列番号31に規定されるIgE Cε3ループ配列;及び/又は
(ii)配列番号32若しくは33に規定されるIgE Cε4ループ配列;
を含む、請求項1~13のいずれかに記載のハイブリッド抗体。 - 配列番号26と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有し、かつ、配列番号26の78、203、及び/又は206位にヒスチジン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項1~14のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 配列番号1と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~15のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 配列番号34の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有し、かつ、配列番号34の408、533、及び/又は536位にヒスチジン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項1~16のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- FcRnへの結合がpH依存的である、請求項1~17のいずれかに記載のハイブリッド抗体であって、好ましくは、pH7.4でよりもpH6.0で、FcRnに対するより高いアフィニティーを有する、前記ハイブリッド抗体。
- がん抗原に特異的に結合する、請求項1~18のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 請求項1~19のいずれかに規定されるハイブリッド抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
- がんの予防又は治療における使用のための、請求項1~20のいずれかに規定されるハイブリッド抗体又は医薬組成物。
- ハイブリッド抗体の重鎖をコードする核酸であって、前記重鎖が、(i)配列番号1及び配列番号26;並びに/又は(ii)配列番号34;と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記核酸。
- 請求項22に規定される核酸を含む発現ベクターであって、任意で、(i)前記ベクターがCHOベクターであり、及び/又は(ii)前記核酸が、哺乳類細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結されている、前記発現ベクター。
- 請求項1~19のいずれかに規定されるハイブリッド抗体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞。
- 請求項22に規定される核酸配列又は請求項23に規定されるベクターを含む、請求項24に記載の宿主細胞。
- 請求項1~19のいずれかに規定されるハイブリッド抗体の発現のための条件下で、請求項24又は25に規定される宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞培養物から前記ハイブリッド抗体又はそのフラグメントを回収するステップとを含む、前記ハイブリッド抗体を産生する方法。
- 配列番号35の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1~19及び21のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 配列番号186の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有し、かつ、配列番号186の411、536、及び/又は539位にヒスチジン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項1~19、21、及び27のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 配列番号188の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有し、かつ、配列番号188の410、535、及び/又は538位にヒスチジン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項1~19、21、27、及び28のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
- 配列番号187又は189の配列と少なくとも85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1~19、21、及び27~29のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
Applications Claiming Priority (7)
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