JP2016014020A - 最適化されたFc変異株 - Google Patents
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Abstract
Description
ものである。
この変異株は親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加し、Fc領域中にも
少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。
症および心血管病気を含む各種状態の治療で治療方学として使用されている。現在、20種
以上のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片製品が流通されており、400種
以上が臨床開発中である。こうした市況および承認にもかかわらず、抗体の構造上および
機能上の特性を最適化するという大きなニーズが残っている。
ることである。抗体のクリアランス速度は治療効果、従って、患者に悪影響を生じさせる
医薬品の投与頻度および投薬量に直接影響し、医学コストを増大させる。
されている。IgGホメオスタシス機構は母親から胚または齧歯動物の新生児への受動免
疫のトランスファーに関する研究で明らかになった(非特許文献1〜3)。初期の研究でBr
ambellはIgGの母胎間(maternofetal)伝達のためのレセプタがあり、このIgGの母
胎間伝達およびIgG異化に関与する機構は同じものであるか、少なくとも非常に密接に
関連していると仮定した(非特許文献1)。
cレセプタ(新生Fcレセプタ(FcRn)といわれる)に結合することによって仲介さ
れるということが分かった。このFcRnは主組織適合性複合クラスI分子のα-鎖の細
胞外領域に対して構造上の相同性を有するトランスメンブレンα-鎖I分子とβ2−ミク
ログロブリン(β2m)とから成る可溶性の軽鎖から成るヘテロダイマである (非特許文
献4)。
細胞、例えば小腸マクロファージ、単核細胞および単核細胞派生樹状細胞で発現される(
非特許文献5)。FcRnはその2つの主たるリガンドIgGおよび血清アルブミンに結
合し、pH依存性で、pH 6.0〜6.5で有効な結合が起こり、pH 7.0〜7.5で解放する (非特許
文献6)。
シスによって血管内皮細胞のエンドソームに内面化され、低pHでFcRnへの結合が促進
されるという機構が提案されている(非特許文献7)。結合したIgG-FcRn錯体が細
胞表面へ再循環され、細胞外液の中性pHで分離し、血液循環中へ戻る。FcRnに結合し
ないIgGはリソソームへ送られ、プロテアーゼによって分解される。低漿液IgG濃度
で生き残ったIgGの濃度依存異化機構によってリセプタは全てのエンドサイトーシス(
endocytosed)IgGを結合し、それを効率的に循環形に返し、IgG半減期を長くする
。逆に、高IgG濃度ではリセプタがIgGで飽和され、IgGの主画分がリセプタによ
って結合解除され、劣化し、束縛を解かれたIgGがより急速に異化する。
Rnとの間の相互作用に関係するある種の重要なアミノ酸残基が確認された非特許文献7
〜11)。これらの研究および配列比較研究から、位置253のイソロイシン、的位置310のヒ
スチ遺伝子、位置435のヒスチ遺伝子(Kabatに従った番号)がヒトおよびウサギで高度に
保持され、結合IgG-FcRnでのその重要性を示唆していることが見出された(非特許
文献12)。これらのアミノ酸残基はCH2-CH3領域界面に位置し、ラットFcと錯体化したラ
ットFcRnのX−線結晶構造でこれら残基に対する機能サイトのマッピングが作られた
(非特許文献13)。
置256がランダムに突然変異化(mutagenized)された。そのぞれ、1つのミュータントは
ハツカネズミFcRnに対して3倍の親和性を示し、2つのハツカネズミ株では半減期が
野生型と比べ約23%または65%長くなった。
てヒトIgG1を突然変異して突然変異Fcヒンジ断片が野性型IgG1 Fc-ヒンジ断片
と比較してハツカネズミ漿液中の半減期を減らすことを示し、Ne253、His310およびHis43
5がIgGの漿液半減期のコントロールで中心的な役割を演じていると結論している。
換でハツカネズミの排除を加速し、固形腫瘍の免疫シンチグラフィを改善することを示し
た。
を変え、ヒトFcRnへの結合性をアセスしている。アラニンに変えた時のFcRn結合
性を効果的に排除する位置には1253、S254、H435およびY436が含まれる。結合性がそれよ
り少なく減少した他の位置はE233-G236、R255、K288、L309、S415およびH433である。ア
ラニンに変えた時にいくつかのアミノ酸位置でFcRn結合性が改良した。特にP238、T2
56、E272、V305、T307、Q31 1、D312、K317、D376、E380、E382、S424およびN434で顕著
である。多くの他のアミノ酸位置でFcRn結合性がわずかな改良を示し(D265、N286、
V303、K360、Q362およびA378)すか、変化がなかった(S239、K246、K248、D249、M252、
E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280(V282)E283、H285、T2
89、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322
、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、
E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E3
88、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430
、T437、K439、S440、S442、S444およびK447)。
mbination 変異株)の場合である。例えばE380Aでは2倍、N434Aでは3倍であるが、E380A/N
434A変異株はpH 6.0で天然のIgG1に対してFcRnに対する結合性が8倍強くなる。
これにT307Aを加えると天然IgG1に対して結合性は12倍改良する。
ンジ-Fc断片ファージのスクリーニングのライブラリを示しており、位置251、252、254
-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434および436でのランダム
突然変異生成を記載している。IgG1-ヒトFcRn錯体の安定性の主たる改良はFc-
FcRn境界(M252、S254、T256、H433、N434およびY436)を横切るバンド中に位置する
残基の置換で起こり、より小さい改良はV308、L309、Q311、G385、Q386、P387およびN389
でのような末梢での残基の置換で起こる。ヒトFcRnに対して最も高い親和性を示す変
異株は例えばM252Y/S254T/T256E突然変異とH433K/N434F/Y436H突然変異とを組合せた時に
得られ、天然型IgG1に対して57倍の増加を示す。
Rnに対するヒトIgG2の結合性をそれぞれ約3倍および7倍増加させる。これらの2つ
の突然変異は、組み合わせると、IgG2の28倍の結合能の増加を誘発する。薬物動態学
研究のためにM428LおよびT250Q/M428の両方のIgG2ミュータントをアカゲザルに注射す
ると野生型抗体より半減期が約2倍長くなる。
ルスIgG1(M252Y/S254T/T256E)が記載されている。これらの突然変異はヒトFcRn
に対する結合性をpH 6.0で約10倍増加させ、pH 7.4で効率的な解除を許す(非特許文献18
)。こうした変移させたヒトIgG1のインビボ挙動によってカニクイザルで漿液の半減
期を野生型IgG1と比べてほぼ4倍増加する。
Rn-結合ポリペチドを分子中に入れる(特許文献1〜5)方法や、上記分子をFcRn-
結合親和性を保存し、他のFcレセプタに対する親和性を大きく減少させた抗体と溶合す
る方法(特許文献6)や、抗体のFcRn結合領域と溶合する(特許文献7、8)方法が
ある。
減期を減少された抗体を生産する方法が開示されている。この突然変異にはFc-ヒンジ
領域の位置253、310、31 1、433または434のアミノ酸の置換が含まれる。上記で引用した
特許文献9およびその他全て米国特許の開示内容は本明細書の一部を成す。
されている。このポリペチドはFc領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、
265、272、286、288、303、305、307、309、31 1、312、317、340、356、360、362、376
、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439および447の任意
の一つ以上のアミノ酸が突然変異し、Fc領域の残基の位置の数え方はEUインデックス
の位置の数え方 (上記Kabat et al.) と同じである。
たIgG不変領域を有する変成IgGが開示されている。変成したIgGは野性型IgG
の不変領域に比べてIgGの半減期が増加し、一つ以上のアミノ酸変異は位置251、253、
255、285-290、308-314、385-389および428-435の一つ以上で行われる。
された特性には対応する親ポリペチドよりFcRnに対する高い結合性が含まれる。本発
明の好ましい実施例では、親のポリペチドの変異株は親ポリペチドに比べてFcRnに対
する結合性か増加したFc領域を有し、親ポリペチドのFc領域中に少なくとも一つのア
ミノ酸突然変異を有し、その突然変異は親ポリペチドに対してFc領域の中の下記の群の
中から選択される:226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、25
2、256、259、264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 2
94, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315, 317, 320, 322
, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355
, 356, 359, 360, 361 , 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 3
86, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404,
408, 41 1 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433、434
、438、439、440、443、444、445、446および447。(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え
方はKabat中でのEUインデックスの数え方と同じである)
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供
する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記核酸を含むベクターを提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の他の実施例では、上記宿主細胞を培養して核酸を発現させることから成る、ポ
リペチド変異株の生産方法を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬品を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は医薬品製造での本発明変異株の使用を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明はFc最適化変異株を識別する方法を提供する。
の定義は文法的に均等なものを含む。
本明細書および特許請求の範囲でFc領域の残基の数の教え方は非特許文献12(Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, Nation
al Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991)に記載のKabat et al.,のEUインデ
ックスに従った免疫グロブリン重鎖の教え方である。非特許文献12の内容は本明細書の一
部を成す。「KabatでのEUインデックス」とはヒトIgG1 EU抗体の残基の数え方で
ある。
酸を意味し、タンパク質、ポリペチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。
「アミノ酸」とは特定の定義された位置に存在する20の天然または類似の非天然のアミ
ノ酸を意味する。天然のアミノ酸は3文字または1文字暗号で略記できる:
デックスに従って番号を付ける。
「アミノ酸の変更」とはポリペチドのアミノ酸配列の変化を意味する。この「アミノ酸
変更」は「アミノ酸変化」ともよばれ、アミノ酸の置換、挿入および/またはポリペチド
配列の欠失を含む。「アミノ酸の置換」または「置換」とは親ポリペチド配列の特定の位
置でのアミノ酸を他のアミノ酸と置換することを意味する。例えば、置換N434Sとは位置4
34でのアスパラギンがセリンと置換した変異ポリペチド、この場合Fc変異株を意味する
。「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは親ポリペチド配列の特定位置でのアミノ酸の付
加を意味する。例えば、挿入G>235-236とは位置235と236の間にグリシンを挿入すること
を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは親ポリペチド配列の特定位置のアミノ酸を
取り去ることを意味する。例えば、E294delは位置294でのグルタミン酸の欠失を示す。
ノ酸が位置434で(すなわちアスパラギンが)セリンと置換することを意味する。
I/N315D/N434Y。これは変異株中に3つの置換(一つは位置259、一つは位置315、一つは位
置434)を意味する。すなわち、親ポリペチドの位置259のアミノ酸すなわちバリンがイソ
ロイシに置換され、親ポリペチドの位置315のアミノ酸すなわちアスパラギンがアスパラ
ギン酸に置換され、親ポリペチドの位置434のアミノ酸すなわちアスパラギンがチロシン
に置換されることを意味する
子座を形成するVH遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる一つ以上のIg領域
を有する免疫グロブリンの領域を意味する。可変領域はコンプレメンタリティ−決定領域
(CDR)およびフレームワーク領域(FR)を含む。
成るポリペチドを意味する。従って、FcはIgA、IgD、IgGの最後の2つの恒常
部の免疫グロブリン領域、IgEおよびIgMの最後の3つの恒常部の免疫グロブリン領
域、これら領域への可撓性ヒンジN末端を意味する。IgAおよびIgMの場合、Fcは
J鎖を含むことができる。IgGの場合、Fcは免疫グロブリン・領域Cγ2およびCγ3か
ら成る(それぞれCH2およびCH3領域であるCγ2、Cγ3、IgGで)およびCgammal(Cγ1
)とCγ2(Cγ2)との間の低ヒンジ領域を含む。ヒトIgG1重鎖Fc領域はそのカルボ
キシル末端に残基C226を含むと定義されるが、数え方はKabatでのEUインデックスに従
う。ヒトIgG1では、低ヒンジはKabatでのEUインデックスに従った位置226-236を示
し、CH2領域は位置237-340を示し、CH3はと位置341-447を示す。他の免疫グロブリンの対
応するFc領域は配列アランメントによって同定できる。
この領域を示す。「Fcポリペチド」とはFc領域の全部または一部のポリペチドを意味
する。Fcポリペチドには抗体、Fc融合体、単離されたFc、Fc-コンジュゲートお
よびFc断片を含むが、これらに限定されるものではない。
領域および(ii) 免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペチド領域を含む任意のポ
リペチドを意味する。この結合ポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗
原に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変部から生じる結合ポリペチド領域は一つ
以上CDRを有する。抗体には完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多くの特異
抗体、少なくとも一つの可変部を有するFc-融合タンパク、合成の抗体(ここでは「ミメ
ティック抗体」ともいう)、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体-融合タンパク
、抗体複合体および各々の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
を意味し、変数領域および恒常領域を含む。「完全長の抗体」はモノクローナル完全長抗
体、野性型完全長抗体、キメラの完全長抗体、ヒト化完全長抗体を含むがこれらに限定さ
れるものではない。
ラマである。このテトラマは2つの全く同じ一組のポリペプチド鎖から成り、その1つの
「軽」鎖(一般に約25kDaの分子量を有する)であり、その1つは「重」鎖(一般に約50-7
0kDaの分子量を有する)である。いくらかの哺乳類、例えばラクダおよびラマでは、完全
長の抗体が2つの重鎖だけから成り、各重鎖はFc領域に付いた変数領域から成る。
酸の可変部を含む。可変部では3つの輪状構造が重鎖および軽鎖の各々のV領域と集まり、
抗原結合部位を形成する。輪状構造の各々をコンプレメンタリティ-決定領域という(以
下に「CDR」という)。ここでのアミノ酸配列の変異が最も重大である。
bat et alは重鎖および軽鎖の可変部の多くの一次配列を集めてある。配列の保護度に基
づいてそれらはCDRおよびフレーム・ワークへの個体一次配列を分類して、リストを作っ
た(非特許文献21)。この文献の内容は本発明の一部を成す。
E. A. Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91 -3242
ミュー、デルタ、ガンマ、αまたはエプシロンに分類され、それぞれIM、ID、IgG
、IAおよびIEとして抗体のアイソタイプを定義する。IgG1は複数のサブクラスを
有し、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むが、これらに限定されない。
IgMもサブクラスを有し、IgMIおよびlgM2があるが、これらに限定されない。
「アイソタイプ」とは恒常部の化学特性および抗原性特性によって定義される免疫グロブ
リンのサブクラスを意味する。公知のヒト免疫グロブリン・アイソタイプはIgG1、I
gG2、IgG3、IgG4、IgAI、lgA2、IgMI、lgM2、lgDおよびl
gEである。
抗体のクラスに属するポリペチドを意味する。ヒトではIgGはサブクラスまたはアイソ
タイプIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から成る。ハツカネズミではIgGは
IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3から成る。完全長のIgGはテトラマで、2対
の全く同じ2つの免疫グロブリン鎖から成り、1つの軽鎖と1つの重鎖を有する各一組から
成り、各軽鎖は免疫グロブリン・領域VLおよびCLから成り、各重鎖は免疫グロブリン領域
VH、Cγ1(CH1とも呼ばれる)、Cγ2(CH2とも呼ばれる)およびCγ3(CH3とも呼ばれる
)から成る。ヒトIgG1では、「CH1」は位置118-220、CH2領域がは位置237-340、CH3
領域は位置341−447にある(KabatでのEUインデックスに従う)。IgG 重鎖もIgG
Lの場合、位置221-236と称するヒンジ領域にある。
更のポリペチドを意味する。この親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリ
ペチドの変異株、天然由来のポリペチドの設計バージョンまたは合成ポリペチドにするこ
とができる。親ポリペチドはそれをコードするポリペチド自体またはアミノ酸配列を表す
こともできる。本発明での親ポリペチドはFc領域は野生型Fc領域、その断片およびそ
のミュータントから成る群の中から選択される。従って、親ポリペチドは野生型Fc領域
と比べてそのFc領域中に既存のアミノ酸突然変異(すなわちFcミュータント)を含む
ことができる。
しいが、これらに限定されるものではない。従って、「親免疫グロブリン」とは変異体の
免疫グロブリンを生じるように修正された免疫グロブリン・ポリペチドを意味し、「親抗
体」とは変異体の抗体を生じるように修正された抗体を意味する。「親抗体」には公知の
商業的な組み換え抗体も含まれる点に留意する必要がある。
アミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異なるポリペチド配列をを有するも
のを意味する。
ブリン変異株、IgG変異株にすることができるが、これらに限定されるものではない。
ノ酸突然変異によって親免疫グロブリン配列のそれと異なる免疫グロブリン配列となった
ものを意味する。親ポリペチドは天然由来の野性-型(WT)ポリペチドまたはWTポリペチ
ドの修正バージョンでもよい。
はFc領域の少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異な
るポリペチド配列を有するのが好ましい。従って上記変異株はFc変異株から成る。
によって親Fc配列のそれと異なるFc配列を意味する。このFc変異株は単離されたF
c領域およびそ断片にすることができ、また、抗体はFc合着およびその断片にすること
ができるが、これらに限定されるものではない。
によって親タンパクと異なるタンパクを意味する。「抗体変異株」または「変異株抗体」
とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親抗体と異なる抗体を意味する。「Ig
G変異株」または「変異株IgG」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親I
gGと異なる抗体を意味する。変異株は親ポリペチドと比較して少なくとも一つのアミノ
酸突然変異を有し、例えば約1〜約45のアミノ酸突然変異、好ましくは約1〜約20のアミノ
酸突然変異、より好ましくは約1〜約10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。
少なくとも約90%の一致性を有するのが好ましい。
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5%のアミノ酸一
致性を有するポリペチドが含まれる。
整列させる。例えば、最適のアランメントのためにギャップ期を第一および第二のアミノ
酸配列の一方または両方に導入でき、非相同配列は比較のためには無視できる。最適比較
のためにの2つのアミノ酸配列の一致性パーセントは下記パラメータでCLUSTAL W(バー
ジョン1.82)で実行できる:
(1) CPU MODE = ClustalW mp ;
(2) ALIGNMENT = full;
(3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers;
(4) OUTPUT ORDER = aligned;
(5) COLOR ALIGNMENT = no;
(6) KTUP (word size) = default;
(7) WINDOW LENGTH = default ;
(8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ;
(10) PAIRGAP = default;
(11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none;
(12) MATRIX = default;
(13) GAP OPEN = default;
(14) END GAPS = default;
(15) GAP EXTENSION = default;
(16) GAP DISTANCES = default;
(17) TREE TYPE = cladogram;
(18) TREE GRAP DISTANCES = hide
伝子の(allelic)変異を含む。WTタンパク、ポリペチド、抗体、免疫グロブリン、Ig
G、その他は修正されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
もFCRN遺伝子によって、部分的にコードされるタンパクを意味する。FcRnはヒト
、ハツカネズミ、ラット、ウサギおよびサルを含む任意のものからのものにすることがで
きる。公知のように、機能性FcRnタンパクは2つのポリペチド、大抵は重鎖および軽
鎖から成る。軽鎖はβ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はFCRN遺伝子によってコー
ドされる。特に断らない限り、FcRnまたはFcRnタンパクはβ-2ミクログロブリン
を有するα鎖の錯体を言う。ヒトではFcRnをコードする遺伝子はFCGRTと呼ばれ
る。
FcRnに対する本発明の変異株が結合能を増加することを意味する。FcRnを結合す
るポリペチド変異株の能力はELISA(実施例1のIV.1.a)またはSPR(実施例1のIV
.I.b)でインビトロで評価できる。FcRnに対する改良された結合性を最も有する変異
株はインビトロで改良された漿液保持性を有し、従って半減期が増加する。
約pH 7.4で低い親和性を維持する必要がある。
せ、Fc領域はインビボで長い半減期を有すると考えられている(非特許文献22参照)
。
Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598
放されると、より高いpH(約7.4)で血液中へ戻り、Fc領域の開放を誘発する。従って
、インビボでFc領域の半減期を増やすFc領域のアミノ酸突然変異は、理想的にはより
低いpHでFcRn結合性を増加させ、より高いpHでFc領域を開放するものである。
を意味し、動物の循環および/または他の組織からの循環に中に存在する半分の量が浄化
されるのに必要な時間で表される。
定することをベースにしたものである。重要なアミノ酸突然変異はランダム突然変異生成
によって2つのFc変異株ライブラリを作り、その変異株のFcRnに対する結合性を測
定することで決定される。
する親ポリペチドの変異株に関するものである。
リペプチド鎖または共有結合ではなく一緒にリンクした複数のポリペプチド鎖から成るこ
とができる。親ポリペチドは抗体、Fc融合タンパク、Fc共役、Fc由来のポリペチド
、単離されたFcおよびその断片を含むが、これらに限定されるものではない。従って、
親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリペチドの変異株、合成ポリペチド
または非タンパク性断片から成るポリペチドの設計バージョンにすることができる。天然
由来のポリペチドの設計バージョンは天然由来の遺伝子によってコードされないポリペチ
ドである。例えば、設計されたポリペチドはキメラ抗体またはヒト化抗体にできる。
トから成る群の中から選択するのが好ましい。IgGのFc領域は「低ヒンジ」-CH2-CH3
領域(IgGではCH2およびCH3はCγ2およびCγ3領域とも呼ばれる)に対応する。野生型
ヒトIgG1の「低ヒンジ」-CH2-CH3領域の配列はSEQ ID番号:1の配列である。ヒトI
gG1では、低ヒンジは位置226-236、CH2領域は位置237-340、CH3領域は位置341-447で
ある。これらの位置はKabatでのEUインデックスに従う。他のIgGサブクラスの類似
領域はヒトIgG1のそれとIgGサブクラスの重鎖または重鎖断片のアミノ酸配列のア
ランメントで決定できる。
CH2-CH3」領域由来の一つ以上のポリペチドを有するポリペチドと定義される。この断片
のFcRnに対する解離定数は実施例1のIV.1に記載のSPRアッセイで1microM以下で
ある。
例えば、Fc領域は既存のアミノ酸突然変異、例えば付加、挿入および/または置換を有
することができる。ただし、このミュータントはSPRアッセイに従った解離定数が実施
例1のIV.1に記載のSPRアッセイで1microM以下でなければならならず且つ野性-型Fc
領域ではない。
て親ポリペチドのそれと異なるポリペチド配列を意味する。
合性を示す。換言すれば、変異株の親和性は親ポリペチドよりFcRn対する結合性が高
い。そうした変異株が本発明の最適化された変異株である。
業者は実施例1のIV.I .bに示すように、表面プラスモン共鳴(Surface Plasmon Resonan
ce、SPR)実験を使用して解離定数(Kd)を求めることができる。変異株のKdが対応す
る親のそれより1.1倍以下であれば、その変異株は本発明の最適化された変異株である。
イによって実施例 1に示すように、変異株のFcRnに対する結合強度と親のそれとを比
較することができる。変異株および親ポリペチドで検出される特定信号を比較する。この
特定信号は親ポリペチドのそれより少なくとも1.2-倍強く、より好ましくは少なくとも3.
2-倍強い場合、その変異株は本発明の最適化された変異株である(例えば、少なくともダ
ブルアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するFc変異株と同程度)。
チドを評価することによって(実施例 2のIII参照)または単離されたFc領域を評価す
ること(実施例 1のIV参照)で一義的に決定できる。
然変異をそのFc領域に含む。このアミノ酸突然変異はアミノ酸の挿入、欠失および置換
から成る群の中から選択される。
変異株を得るためには、少なくとも一つのアミノ酸突然変異が親ポリペチドと比較して、
Fc領域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、
259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、
298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、322、325、327、3
30、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、3
60、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、3
90、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、4
14、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、4
43、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置で導入されなけ
ればならないことを示した。ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUイン
デックスの数え方である。
う。例えば、他のFc領域での類似位置はそのFc領Fc領域をSEQ ID 番号:1のポリペ
チドから成るヒトIgG1の重鎖断片とアミノ酸配列アランメントして決定できる。例と
して、図6にヒトIgG1、IgG2、IgG3および「低ヒンジ-CH2-CH3」領域から成る
IgG4 重鎖断片の配列アランメントを示した。
領域に20を超えるアミノ酸の突然変異を導入するその生物学的活性度は著しく悪くすると
考えられる。従って、ポリペチド変異株は上記でリストした位置の好ましくは1〜20、よ
り好ましくは1〜10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。「1〜20のアミノ酸突然変
異」には1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16
、17、18、19、そして、20のアミノ酸突然変異を含む。この変異株配列はその親ポリペチ
ド配列と少なく約90%のポリペチド一致性を有するのが好ましい。
なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%
のアミノ酸一致性を有することを含む。
然変異を有する。実施例IIに記載のファージELISAアッセイから得られる結果は、複
数のアミノ酸突然変異を有する最適化された変異株野生型Fcより約3.2-倍から30-倍ま
での強い特定信号を有することを示し(表2および表3を参照)、単一の先端アミノ酸突然
変異を有する変異株は野生型Fcより約1.2-倍から3.5-倍までの強い信号を示す(表1参
照)。表3に示すように、二重のアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するFc変異株とよぶ
最適化された変異株の信号はFc−Hのそれより約1-倍から約10-倍強い。
50、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、2
92、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、32
2、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、35
5、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383(384)385、38
6、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、40
8、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、43
8、439、440、443、444、445、446およ447から成るリストの中から選択される少なくとも
2つのアミノ酸突然変異を親ポリペチドと比較したFc領域中に有する。Fc領域のアミ
ノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
のアミノ酸突然変異を有する。
、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284
、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308
、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343
、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378
、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398
、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415、416、418、419、420、421、42
2、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446、447から成る群の中
から選択されるアミノ酸位置で親ポリペチドと比較してFc領域中に3〜6のアミノ酸突然
変異を有する。
上記リストのいくつかのアミノ酸位置、すなわち226、230、241、264、307、315、330
、342、362、378、382、389、396、397、421および434にはキーとなる重要な位置である
。換言すれば、FcRnに高い結合能を示すFc変異株は少なくとも一つのアミノ酸突然
変異を上記アミノ酸位置に有する。
、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434
から成る群の中から選択されるアミノ酸位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有す
る。Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
アミノ酸位置230、264、307、315、330、378および434が最も多く変化した位置であるこ
とが示された。従って、本発明の他の実施例では、少なくとも一つの突然変異は親ポリペ
チドと比べてFc領域中の264、315、378および434、より好ましくは230、264、307、315
、330、378および434から成る群の中から選択される1つの位置で起こる。Fc領域のアミ
ノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
への結合能はFc親と比べて顕著に改良できる。
し、この少なくとも2つのアミノ酸突然変異は親ポリペチドと比較したFc領域中の下記
にある:
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、
264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、
299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330,
332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360,
361 , 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389,390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412,414, 4
15, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443、
444、445、446、447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突
然変異。ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方で
ある。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起らない。
のリストの中の位置434を除く任意の位置で少なくとも一つのアミノ酸突然変異(ii)が起
こる。
する、その少なくとも2つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つ
の突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、
264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、
299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、
332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、
361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414
, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 44
3, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
少なくとも2つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ
酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変
異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
突然変異を有する:
(i) 378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異
と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変
異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
のFc領域中に含む。この少なくとも3つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成
ることができる:
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される2つのアミノ酸位置での2つの突然変異と
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,
264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298,
299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311 , 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330
, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359,360,
361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411 , 412, 414
、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443
、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一
つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
の少なくとも3つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つ
の突然変異;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264
、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299
、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332
、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361
、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392
、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415
、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444
、445、446および447から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に
起こらない)
し、その少なくとも3つのアミノ酸突然変異Fc領域中の下記から成る:
(i) 378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異
;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434の群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264,
265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 294, 297, 298, 299
, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 3
32, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 3
61, 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414
, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 44
3, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に
起こらない)
群の中から選択されるのが好ましい。
も一つのアミノ酸突然変異を有する、親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合正が増
加した親ポリペチドの変異株にある:
230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230L、230A、230Q、231T、231V、23
3D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E
、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、
289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G1、298N1、299M1、299A1、29
9K1、301C1、302A1、303A1、3031、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、
317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、33
8R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G
、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、
378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、38
7S、387T、389T、389K、389R、390S、401G、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S
、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401のA 403T、404L、408T、411A、412A、414R
、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、
424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、44
4F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
択される少なくとも一つの突然変異を有する:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、26
7R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、34
2R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T
、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T、416K1、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
〜10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。既に述べたように、「1〜20の突然変
異」は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20
の突然変異を意味する。
される3〜6のアミノ酸突然変異を有する:
226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、23
3D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E
、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、
289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、
301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、32
0T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E
、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、
359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、37
8T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T
、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N1、394A1、395A1、395S1、396S1、396L1、
397A1、397M1、398P1、399N1、400P1、401A1、401G1、403T、404L、408T、411A1、412A、
414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、42
2A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R
、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
選択される3〜6のアミノ酸突然変異を有する:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、26
7R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、34
2R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T
、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K1、421T、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
cRnに高い結合能を示すFc変異株はこの重要な突然変異から選択される少なくとも一
つのアミノ酸突然変異を有する。
0T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T
、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成っている群の中から選択される少なく
とも一つの突然変異を有する。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
4E、378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ
酸突然変異から成る。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つアミノ酸突然変異
を有する。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
cRnに対して結合正が顕著に改良されるFc変異株にすることができる。上記突然変異
の少なくとも1つはこの重要な突然変異から選択できる。すなわち342R、226G、230S代、2
30T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389
K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される。
も2つのアミノ酸突然変異を有し、その少なくとも2つの突然変異は下記アミノ酸位置か
ら成る:
(i) 226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V
、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択
される1つの突然変異と、
(ii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、
265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、
301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、
334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、
362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、
393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415
、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444
、445、446および447から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異
。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
の少なくとも2つの突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸突然変異
と、
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つのアミノ
酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
とも2つのアミノ酸突然変異は下記から成る:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226G、230S代、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、3
78V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434S、より好ましくは226
G、230S、230T、230L、241Lから、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、3
89K、434Yおよび434Sから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
が増加した、Fc領域中に少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せを有する親ポリペ
チドの変異株にある。この突然変異の少なくとも一つの組合せはFc領域中の下記の群の
中から選択される:
50A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V
/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/31
5D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V
、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、2
41L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
とも一つの突然変異をさらに含むことができる:227S、226G、226Y、227L、228R、228L、
230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、24
3L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D
、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、
294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、
307P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、33
0V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G
、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、
362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、38
3N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、401G
、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A 4
03T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418K、418R 418E、419H
、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、
438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
有する:
(i) 下記の群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/330
V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、
264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330
V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/4
34S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y
、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、3
78V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R 230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、25
9I, 264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、3
25S1 327V1 330V1 342R1 347R1 352S1 361のD1 362R1 362E1 370R1 378V1 378T1 382V、3
83N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N1、41
6K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rから成る群の中から選択される少
なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yから成る群の中から選
択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せをFc領域中に有する。Fc領域の
アミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
とも一つのアミノ酸突然変異を有する:230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、23
0S、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R
、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、
270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、
297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、307P、30
7A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T
、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、
350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361のD、361S、362R、362E、
369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、38
4I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N
、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、
404L、408T、1A 41、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、4
20R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、4
38R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i) 下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せ:
250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264
E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、2
59I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、3
25S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383
N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T
416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rの中から選択される少なくとも一つの
アミノ酸突然変異。
そこにおいて、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する:
226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、
230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、
241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、
2591/315D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/294del 416K1/307P/434Y、264E/307P/378V
、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y
、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y
、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Y
および378V/383N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
少なくとも一つの追加の突然変異を有する:226Y、226G、227S、227L、228R、228L、230S
、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241のR、243L
、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、
269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、29
4del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、30
7P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V
、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、
347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N1、359A1、360N1、360R1、361D1、361S1、36
2R1、362E1、369A1、370R1、371D1、375A1、375G1、378V、378T、378S、380Q、382V、382
G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S
、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、
401A、401G、403T、404L、408T、41 1A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、4
18K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、4
34Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよ
び447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
:
(i)下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226
G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230
T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241
L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389 K/434Y、256N/378V/434Y、25
91/315 D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、
264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、
307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、
315D/378V/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yお
よび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:226G、227
L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265
G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330
V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386
K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T
、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する:
226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、
241のL/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y
、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/43
4Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383
N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
選択される少なくとも一つの追加の突然変異を有する:226G1、226Y1、227S1、227L1、22
8R1、228L1、230S1、230T1、230L1、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L
、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、
267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、29
1S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、30
3I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S
、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、
343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、36
1D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V
、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、
390S,392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400
P、401A、401G、403T、404L、408T、41の1つのA、412A、414R、415D、415N、416K、416G
、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R
、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、
447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
:
(i) 下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:22
6G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、
230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、
2591/315 D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S
、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/43
4Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:227L、228
R 226G、228L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、
267R、290E、294del、303A、305A、307P、362R、307A、308I、315D、322R、325S、327V、
330V、342R、347R、352S、361D、370R、362E 378V、378T、382V、383N、386R、386K、387
T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
は1〜10の変異株を有するのが好ましい。
酸突然変異の1つの組合せを有する:307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/3
89T/434Y、256N/378V/383N/434Y、256N/378V/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、315D/36
1D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250
A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/
434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T
/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/3
96L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378
V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y
、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/
434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/3
15D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241のL/264E/378T/397M/434S、230L/2
64E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378
V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/3
89T/404L/434S。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
8V/383N/434Y、315D/330V/361のD/378V/434Y、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434
Yから成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の1つの組合せを含む。
且つ下記から成る群の中から選択されるFc変異株を含むポリペチド変異株を提供するこ
とにある:307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/389T/434Y、256N/378V/383
N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/
434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、305A/315D/330V/3
95A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/
315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、26
4E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y
、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、
290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、23
0T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315
D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/
378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/38
6K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y
、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ド変異株は下記から成っている群の中から選択されるFc変異株を有する:256N/378V/43
4Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y
、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434Y。
えば、「低ヒンジ-CH2-CH3」)およびその断片)から作ることができる。
より多くの好ましい実施例において、親ポリペチドのFc領域は、ヒトIgGサブクラス
(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)に由来する。他の好ましい実
施例では、親ポリペチドのFc領域は野性-型IgG1 Fc領域(SEQ ID:NO1)、野生
型IgG2 Fc領域(SEQ ID:NO2)、野性-型IgG3 Fc領域(SEQ ID:NO3)および
野性-型IgG4 Fc領域(SEQ ID:NO4)から成る群の中から選択される。
1 Fc変異株はIgG1 Fc(SEQ ID NO:1)の野生型配列と比較して少なくとも一つ
のアミノ酸突然変異を有し、野性-型IgG1 Fcと比較してFcRnに対する結合性が
増加する。ただし、このIgG1 Fc変異株の配列はSEQ ID 番号2、SEQ ID 番号3およ
びSEQ番号4ではない。
Fc変異株はFcRnに野性-型IgG2Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型IgG2Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし
、このIgG2Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号3およびSEQ番号4ではな
い。
Fc変異株はFcRnに野性-型IgG3Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型IgG3Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし
、このIgG3Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号2およびSEQ番号4ではな
い。
Fc変異株はFcRnに野性-型IgG4Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型IgG4Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし
、このIgG4Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号2およびSEQ番号3では
ない。
ドから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異はは、上記の対応す
る親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加するアミノ酸突然変異、アミノ酸
突然変異の組合せの群の中から選択される。
加した結合性を示す。一つの実施例ではエフェクタ機能および結合性は対応する親のそれ
と同様である。この変異株は特にFc-γリセプタまたはC1qに対する結合性が親ポリペチ
ドと比べて大きく変化しない。
能および/またはFcリガンド結合性(FcRn以外の)を有する。
CC(抗体依存細胞介在細胞毒性(Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)活性および
CDC(Complement-Dependent Cytotoxicity)活性を変えずに、ポリペチド変異株と比
較したFcRnへの結合性が増加する。また、本発明変異株は少なくともそのポリペチド
親と同じADCCおよびCDC活性を有すると同時にFcRnに対する結合性が増加する
。他のケースでは、本発明変異株は親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加
すると同時に、親ポリペチドと同等なADCCおよびCDCの中から選択される少なくと
も一つのエフェクタ活性とを組み合わせて有する。
法で評価できる。
記とは異なる追加のアミノ酸突然変異を含む変異株を提供することにある。
である他のFc突然変異(例えば関連技術の説明に記載のものを参照)と組み合せること
ができる。
ンドを有する他のFc突然変異と組み合せることができる。すなわち、この種の変異株は
親ポリペチドと比較して1つのFcリガンド(FcRn以外)および/またはエフェクタ機
能と、FcRnに対する結合性の増加とを組み合わせて有する。
マンノースレセプター、プロテインA、溶連菌タンパクGおよびウイルス性FcγRsを
含むが、これに限定されるものではない。FcリガンドもFcレセプタ相同体(FcRH
)を含む。これはFcγRs(非特許文献23)に対応するFcレセプタのファミリーで
ある。
Debis et al.,2002、Immunological Reviews 190 123-136
で生じる生化学的または細胞事象である。エフェクタ機能はADCC(抗体依存細胞介在
細胞毒性(Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)、ADCP(抗体依存細胞介在食作
用-Dependent Cell-mediated Phagocytosis)およびCDC(補体依存細胞介在細胞毒(Dep
endent Cytotoxicity)を含むが、これらに限定されるものではない。
加を示す任意のポリペチドを含み、そのポリペチドFc領域のアミノ酸突然変異の少なく
とも一つのアミノ酸突然変異またはその組合せが親ポリペチドと異なる。重要なアミノ酸
の突然変異およびその組合せは本発明の変異株の一般的な特徴を説明した上記の突然変異
である。
およびそれらの断片を含むが、これに限定されるものではない。特に、変異株はFc-含
有結合タンパクにすることができる。換言すれば、変異株は(i) Fc変異株と(ii)所定
分子に特異的に結合可能な結合ポリペチド領域とを有する。
をFc-接合(conjugates)から成る群の中から選択される。Fc-融合タンパクおよびFc
-接合(conjugates)はパートナーにリンクされるFc領域から成る。Fc領域はスペーサ
を介してまたは介さずにパートナーにリンクできる。
パク、ポリペチドまたはFc領域に結合した小さいペプチドから成る。Fc融合タンパク
は必要に応じてペプチド・スペーサを含む。実質的には任意のタンパクまたは小分子をに
Fc領域にリンクさせて、Fc合着させることができる。タンパク合着には任意の抗体、
任意の抗体可変部に由来するポリペチド、リセプタ、接着分子、リガンド、酵素、サイト
カイン、ケモキンまたは他のタンパクの標的結合領域またはタンパク領域を含むが、これ
らに限定されるものではない。特に、Fc-融合タンパクは抗体のようなタンパク、免疫
グロブリン不変領域(すなわちFc領域)断片と接着する異種「接着」タンパクの結合領
域を結合する免疫接着要素(immunoadhesin)、例えば、リセプタ、リガンドまたは酵素に
することができる。免疫接着要素(immunoadhesin)に関しては下記文献が参照できる。
Ashkenazi A, Chamow SM. 1997, Curr Opin Immunol.;9(2):195-200
まれるが、これに限定されるものではない。この種の標的は任意の分子、好ましくは病気
に関係する細胞外リセプタにすることができる。
。共役パートナーはタンパク性のものでも非タンパク性のものでもよい。共役反応は一般
にFc領域上および共役パートナー上の官能基を使用する。共役の合成に適切な種々のリ
ンカーが公知である。例えば、ホモ-またはヘテロ-二官能性リンカーが周知である(非特
許文献25を参照)。
Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, pages 321 -350
、細胞毒(例えば化学療法剤)、トキシンおよびこの種のトキシンの活性断片を含むが、
これに限定されるものではない。適切なトキシンおよびそれらの対応断片にはdiptheria
A連鎖、エキソトキシンA連鎖、リシンA鎖、アブリンA連鎖、curcin、クロチン、phenomyc
in、enomycin等が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞毒素剤はFc変異
株と直接共役できる任意の放射性核種またはFc変異株に共有結合できるキレート剤にす
ることができる。追加の実施例では、共役パートナーはcalicheamicin、auristatins、ゲ
ルダナマイシン、メイタンシンおよびduocarmycins等から成る群の中から選択できる(特
許文献12を参照、この特許の内容は本明細書の一部を成す)。
例えば約pH 7,4)では実質的に結合性が変更されてない。特に重要なFc-融合タンパク
およびFc-共役体変異株は親ポリペチドと比べてインビボでの半減期が増加するもので
ある。
」という用語はここでは最も広い意味で使われる。本発明で「抗体」とはは少なくとも(i
) Fc領域および (ii) 免疫グロブリンの可変領域と結合するポリペチド領域を含む任意
のポリペチドを意味する。このポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗
原に特異的に結合できる。
する。ここで、抗体は完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多特異抗体、少な
くとも一つの可変部を有するFc-融合タンパク、合成抗体(「疑似抗体(mimetics)」と
も呼ばれる)、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含むが、これに限定される
ものではない。抗体はさらに抗体-融合タンパク、抗体複合体およびその各断片を含む。
従って、本発明の異なる抗体はそのFc領域中に親抗体と比べてFcRnに対する結合能
が増加させる上記の少なくとも一つのアミノ酸突然変異または突然変異の組合せを含む。
FcRnに低pH(例えば、約pH 6)で結合能が増加し、高pH(例えば約pH 7,4)で実質的
に接合性が変更しない抗体変異株が重要である。さらに、親ポリペチドと比べてインビボ
での半減期が増加する抗体変異株が重要である。
ら選択される。「完全長の抗体」とは可変領域および恒常部を含む天然抗体の生物学的な
形および構造を有するものを意味する。本発明の完全長の抗体変異株の親ポリペチドは野
生型抗体、野生型抗体ミュータント(例えば、既存の突然変異を含む)、野生型抗体の設
計バージョン(例えばキメラ)、ヒト化抗体または完全ヒト抗体にすることができるがこ
れらに限定されるものではない。完全長の抗体の構造は一般にラマやラクダ等のいくつか
の哺乳類を除いて免疫グロブリンがテトラマおよびダイマーである。各テトラマは典型的
に2つの全く同じペアー(1つが典型的に約25kDaの分子量を有する「軽」鎖の1つの「重
」鎖(典型的に約50-70kDaの分子量を有するペアー)から成るポリペプチド鎖である。
および免疫グロブリンEのクラスを含むヒト免疫グロブリンである。
体である。
G3およびIgG4の変異株から成る群の中から選択されるが、そのが変異株のFc領域
の配列はSEQ ID番号1、SEQ ID 番号2、SEQ ID番号3およびSEQ ID 番号4ではない。
のIgG アミノ酸突然変異は、上記のFc領域から成り且つFcRnに対して対応する
親ポリペチドより結合性が増加したポリペチド変異株を一般に定義する際に説明した突然
変異またはその組合せから成る。
ペチド領域を含むFc-融合タンパクから成る群の中から選択される。特に重要な抗体は
下記から成る:
(a) 本発明のFc変異株、
(b)免疫グロブリンの可変部から誘導される以下の結合ポリペチド領域の一つ(すなわち
少なくとも一つのCDRから成る):
(i) VL、VHClおよびCH1領域から成るFab断片、
(ii) VHおよびCH1領域から成るFd断片、
(iii) 単一抗体のVLおよびVH領域から成るFv断片;
(iv) 単離されたCDR領域、
(v)F(ab')2断片、2つの連結されたFab断片から成る二価断片、
(vi)単鎖Fv分子(scFv)、VH領域とVL領域がペプチドリンカーによって連結され、2つ
の領域が抗原結合部位を形成する、
(vii)二特異性単鎖Fv、
(viii)「diabodies」または「triabodies」(遺伝子融合によって構築される多価性また
は多特異性断片。
しかし、上記リストに限定されない。
dy)はCH3領域に連結したscFvから成る最小抗体のようなタンパクである(非特許文献2
6参照)場合によっては、scFvは完全長のFc領域に結合でき(非特許文献27)、また
、ヒンジ領域またはその断片を含むことができる。
Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061 De Lorenzo et al., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895
)」とよばれる二特異性抗体の群の中から選択される。これらの抗体は2つ以上の異なる
抗原を結合する。ジアボディー(diabodies)は公知の複数の方法、例えば化学的方法ま
たはハイブリドーマにして作ることができる(非特許文献28)。
Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449
抗体変異株はキメラ抗体および/またはヒト化抗体にできる。一般に、「キメラ抗体」お
よび「ヒト化抗体」の両方は複数の生物種かの領域を結合した抗体を意味する。例えば伝
統的な「キメラ抗体」は非ヒト動物、一般にハツカネズミまたはラットの可変部とヒトか
らの恒常部とから成る。ほとんどの場合、ヒト化抗体は非ヒト免疫グロブリン由来の最小
配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体では、CDR以外の全抗体がヒト起源遺
伝子のポリヌクレオチドによってコードされるか、CDRないを除いてヒト抗体と同一であ
る。非ヒト生物由来の核酸によってコードされるCDRの全てまたは一部は、ヒト抗体可変
部のβ-シート・フレーム・ワークにグラフトされて抗体を作る。その特異性はグラフト
されたCDRによって決定される。例えば、この種の抗体の生成は特許文献13に記載され
、非特許文献28、非特許文献29にも記載されている。これら文献の内容は本明細書の
一部を成す。
部から成り、従って、典型的にはヒトFc領域を含む。また、ヒト化抗体は遺伝子操作で
設計された免疫系を有するハツカネズミを使用して発生できる (非特許文献30参照)。
非ヒトの抗体をヒト化して作り直す方法は種々の方法が公知である(非特許文献31)。
非特許文献31〜非特許文献40にも各種のヒト化方法が記載されている。しかし、これ
ちのものに限定さるものではない。これら文献の内容は全て本明細書の一部を成す。ヒト
化または非ヒトの抗体可変部の免疫原性を減らす他の方法には例えば非特許文献40に記
載のリサーファス法が含まれる。この文献の内容も全て本明細書の一部を成す。
Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), Jones et al., 1986, Nature 321 :522-525 ; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 ; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 ; He et al., 1998, J. mmunol. 160: 1029-1035 ; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 ; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 ; Gorman et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 -4185 ; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973
である。その概略について述べましたように、ここでは突然変異である。「完全ヒト抗体
」または「ヒト化抗体」は完全にヒト・遺伝子由来の配列から成る抗体を意味する。場合
によっては、これは突然変異を有するヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列を有するヒト抗
体である。あるいは、抗体成分はヒトであるが、単一遺伝子に由来しない。従って、例え
ば、1つの抗体からのヒトCDRは一つ以上のヒト抗体からの配列(例えば足場配列)と組み
合せることができる。例えば、各種の生殖細胞配列をヒト抗体またはヒト足場を形成する
ために結合できる(例えばヒト化またはキメラの配列の概略については特許文献14参照
)。
トIgGから成る群の中から選択される。
lationally)されない。この種の突然変異はグルコシレート(glycosylates)、標識化お
よび共役を含むが、これらに限定されるものではない。
ルコホーム(engineering glycoforms)を含むように修正できる。「グルコホームを含む
ように修正」とは共有結合でFc変異株から成っているポリペチドに付けられる炭水化物
組成物を意味する。この炭水化物組成物は親のポリペチドのそれとは化学的に異なる。設
計されたグルコホームはエフェクタ機能を改良するかまたは減らす等を含む種々の目的で
有用である。設計されたグルコホーは変異配列の任意のアミノ酸に取付けることができる
。グルコホームは実施例のFc領域のアミノ酸に取付けるのが好ましい。
特許文献47、特許文献15〜22参照)。これら文献の内容は本明細書の一部を成す。
Umaa et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Potelligent (登録商標) technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb(登録商標) glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]
び/または二分オリゴ糖レベルを制御することをベースにしている。例えば、種々の生物
の抗体変異株または細胞系、例えば設計(engineering)したLec-13 CHO細胞またはラット
・ハイブリドーマYB2/0細胞を発現することによって、グリコシル化経路に関係する酵素
(例えばFUT8 [α1,6-フコシトランスラーゼ]および/またはβ1-4-N-セチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼIII [GnTIII])をコントロールするか、抗体変異株の発現後に炭
水化物を修正することによってコントロールする。
もある。グリコシル化パターンはタンパクの配列(例えば特定のグリコシル化アミノ酸残
基の有無記)またはタンパクが生じる宿主細胞または生物の両方依存することは公知であ
る。特定の発現系については以下で説明する。
はアスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分である。トリ−ペプチド配列アスパラギン−
X−セリンおよびアスパラギン−X-チロシン(ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸
)はアスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素付加の認識配列である。従って、ポリペチ
ドのこれらのトリ−ペプチド配列のどちらかの存在が潜在的なグリコシル化サイトを作る
。Oに結合されたグリコシル化は糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシ
ロースの中の1つの付加、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的なセリンまたはスレオニンへ
の付加であり、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンも使うことができる。
つを含むようにアミノ酸配列を変えて行っている(N結合グリコシル化サイト)。また、
付加または出発配列に一つ以上のセリンまたはスレオニン残基を置換して製造することも
できる(O結合グリコシル化サイト)。簡単には、抗体アミノ酸配列をDNAレベルで所
望のアミノ酸変更で変え、特に標的ポリペチドをコードするDNAを所定塩基で突然変異
させて、所望アミノ酸に翻訳するコードンを発生される。
クにカップリングすることである。N結合やO結合グリコシル化可能な宿主細胞のタンパ
クの生産を必要としない点でこの手順は有利である。使用する結合モードに従って糖を下
記に付けることができる:
(a) アラニンおよびヒスチジン、
(b) 遊離カルボキシル基、
(c) シスチンのようなフリーのスルフヒドリル基、
(d) セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのような遊離水酸基、
(e) フェニルアラニン、チロシンまたはヒドロキプロリンのような芳香族残基、
(f) グルタミンのアミド基。
これらの方法は1987年9月11日公開の特許文献23および非特許文献48に記載されて
いる。
学的脱グリコシルはトリフルオロメタンスルフン酸またはその均等化合物にタンパクを暴
露する必要がある。この操作で結鎖糖(N アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラク
トサミン)以外の大部分の糖を開裂し、ポリペチドは保護できる。化学的グリコシルは非
特許文献49、非特許文献50に記載されている。ポリペチド上の炭化水素部分の酵素開
裂は非特許文献51に記載のように各種エンド−およびエクソ−グルコダーゼを使用して
行うことができる。非特許文献52に記載のように、潜在的なグリコシル化サイトでのグ
リコシル化はタンパク-N- グリコシド結合の形成をブロックするツニカマイシン化合物の
使用によって防止できる。ツニカマイシンは非特許文献52に記載されている。
Hakimuddin et al., 987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 Edge et al., 1981 , Anal. Biochem. 118:131 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105
されたグリコホームから成る完全ヒトIgGから成る群の中から選択される。
ら成る。場合によっては、これは抗体融合と考えられる。「標識化基」という用語は検出
可能な任意の標識を意味する。他の実施例では、標識化基はポテンシャル立体障害を減ら
すための種々の長さのスペーサアームを介して抗体に連結する。タンパクの標識化は種々
の方法が公知で、本発明を実行する際に使用できる。
:
a) 同位体タグ。これは放射性元素または重質同位体にできる;
b) 磁気標識(例えば磁気粒子);
c) レドックス活性成分;
d) 光学染料、酵素基(例えばワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェ
ラーゼ、アルカリホスファターゼ)
e) ビオチン化された基;
f) 第2リポータで認識される所定ポリペチドエピトープ(例えばロイシン・ジッパー対
配列、第2抗体用の結合部、金属結合領域、エピトープタグ、その他)。
ものではない。フッ化燐の蛍光性団は「小分子」蛍光剤でも蛍光タンパクでもよい。
は小分子に融合または共役させることができる。実際に、任意のタンパクまたは小分子を
抗体に連結できる。タンパク合着パートナーにはリセプタの標的-結合領域、接着分子、
リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンまたは他のタンパクまたはタンパク領域を含む
が、これらに限定されるものではない。小分子は医薬品(例えば、細胞障害剤)、トキシ
ンまたはこのトキシンの活性種(例えば化学療法剤)を含むが、これら限定されるもので
はない
的に結合できる。「標的抗原」とは所定抗体または免疫グロブリンの可変部に特異的に結
合する分子を言う。標的抗原はタンパク、炭水化物、リピド、その他の化学化合物にする
ことができる。
。例えば、膜タンパク質、RhD抗原、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、
CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71 (トランスフェリン・リセプタ)、CD80、CD86、C
TLA-4、CD147、CD160、CD224、リセプタErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 ErbBファミリーに
属するような生長因子レセプタ(EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)、VEGF-R1、VEGF-R2、IG
F-FM 1、PIGF-R、MHCクラスIおよびMHCクラスIl分子、例えばHLA-DR、IL-1 R、IL-2Rα)
IL-2RβおよびIL-2Rガンマ、IL-6Rのようなインターロイキンレセプタ、M llerian抑制物
質タイプIlリセプタのようなホルモンレセプタ、LDLリセプタ、NKp44L、CXCR4およびC
CR5のようなケモキンリセプタがあるが、これらに限定されるものではない。膜タンパク
はGD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16のような腫瘍マーカー、carcinoembrionic抗原(CEA
)、Tn、グリコプロテイン72、PSMA、HMW-MAAを含む。また、本発明の抗体はサイトカイ
ン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFベータ、TNFα、IFNガンマ)、ケ
モキン、成育因子状VEGF-A、EGF、PIGF、PDGF、IGF、ホルモン、細菌毒素、その他のボツ
リヌス毒素のようなオリ遺伝子トキシン、リシン、B. anthracis感染防御抗原、B. anthr
acis致死因子、B. anthacis水腫因子、shigatoxins 1および2、異なるウィルスからのウ
イルス性抗原、例えばFVIII阻害抗体を含む病原ウイルス(阻害抗体)を含む可溶タンパ
クを目標とすることができるが、これらに限定されない。
ポリペチドは以下から選択できる:EMAB6またはEMAB603(WO2006064121参照)、RITUXIMA
B(Rituxan(登録商標、IDEC/ジェネンテク/ロシュ)(特許文献24参照)、HUMAX(登
録商標-CD20)(特許文献25に記載)AME-133(Applied Molecular Evolution)(hA20
(Immunomedics社)HumaLYM(Intracel)およびPRO70769(「免疫グロブリン変異株およ
びその利用」と題する特許文献26)。これらとの内容は本明細書の一部を成す。
親ポリペチドはEMAB2(特許文献27参照)(SymOOI(Symphogen A/S)またはMonoRho(Z
LB、チューリッヒ)から選択できる。
itux(登録商標)、Vectibix(登録商標)、抗EGFR、Tysabri(登録商標)、integrineの
抗α4鎖、Herceptin(登録商標)、抗HER2/neuでもよいが、これらに限定さるものではな
い。
合わせたFcRnに対する結合性が増加した変異株を提供する。最適化できる最も好まし
い特性はインビボでの半減期である。インビボでの半減期を増加させるためには変異株は
低pH(例えばエンドソームと関連があるpH)、例えばpH 6.0でFcRnに対する結合能が
増加し、しかも、より高いpH(例えば7.4)で親和性を維持して、FcRnへの結合をエ
ンドソームへ増加させ、且つ通常の開放速度にできるものでなければならない(非特許文
献53、非特許文献54);
Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180 Gurbaxani et al., 2006, MoI Immunol. 43(9):1462-73)
他の望ましい特性、例えば調整されたFcγR結合特性を有することができる。1つの追加
の実施例では、変異株はFcRn結合性に加えてヒト活性FcγR、好ましくはFcγRll
laに対して改良された親和性を有するように最適化される。変形実施例では、変異株はF
cRnに対する親和性が増加し、FcγRI、FcγRlla、FcγRllb、FcγRllcおよび
FcγRlllbにallelicな変異を含むヒトFcγRに対する親和性を増減するように最適化
されるがこれらに限定されない。
は減少したこと)エフェクタ機能を増やすことができた。特に好ましい実施例では、本発
明変異株は漿液半減期の増加と同様に、その親ポリペチドと比べてADCC活性の増加お
よび/またはFcγRへの結合の増加を有することができる。他の実施例では、本発明変
異株はその親ポリペチドと比べてCDC活性の増加も有することができる。
、診断に使われ、調査試薬として使用されるが、治療で好ましく使用できる。
る、より正確には親ポリペチドよりインビボで長い漿液半減期を有することが予期される
。従って、本発明変異株は、親ポリペチドが循環血液から急速に無くなる様な場合に、親
ポリペチドの代替として有利な用途があり、または、長い半減期活性を必要とする慢性ま
たは長期的な病気の治療で使用される。
物での使用できる。好ましい実施例では、抗体変異株は標的抗原、例えば癌細胞を運ぶ標
的細胞を殺すのに用いられる。別の実施例では、変異株は標的抗原、例えば細菌毒素をブ
ロックし、抗体化させ、刺激(agonize)する、例えばサイトカインまたはサイトカイン受
容体抗体化させ、刺激(agonize)したり、バクテリアまたはウィルスのような感染因子ま
たはトキシンを中和させする。好ましい実施例では、本発明変異株は標的抗原抗体化、刺
激し、標的抗原を運ぶ細胞を殺す。
れる。「患者」とはヒトおよびその他の動物を含み、好ましくは哺乳類であり、最も好ま
しくはヒトである。「抗体関連疾患」または「抗体応答異常」または「状況」または「病
気」とは本発明の変異株含む医薬組成物の投与によって改良できる異常を意味する。この
抗体関連疾患には自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症疾患、神経病、痛覚、肺の病気
、血液疾患、線維症(fibrotic)およびガンを含む腫瘍・腫瘍疾患が含まれるが、これら
に限定されるものではない。
的状況を言う。ガンの例は癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、脂肪肉腫を含む肉腫、神経内分泌
腫瘍、中皮腫、神経鞘腫(schwanoma)、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、白血病およびリン
パ性悪性を含むが、これらに限定されるものではない。治療可能な他の疾患にはリウマチ
様関節炎、若年性慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン(Sjorgr
en)病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびアレルギー疾患、移植片
対宿主疾患等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
た処方は所望純度を有するポリペチド変異株に必要に応じて用いる生理的に許容されるま
たは薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を混合し、凍結乾燥品または水溶液
の形にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A
. Ed., 1980参照)。この医薬組成物を必要とする患者の治療に使用できる。
与効果を生じる供与量を意味する。正確な供与量は治療の目的に応じて公知の方法を使用
して当業者が確認できる。供与量は体重1kg当たり0.001〜100mgまたはそれ以上にするこ
とができる。例えば0.1、1.0、10または50mg/kg体重であり、好ましくは1〜10mg/kg体重
である。周知のように、投与量はタンパク劣化、全身局所デリバリー、新プロテアーゼ合
成速度、加齢、ボディー重量、公衆衛生、性、食餌、投与時間、医薬相互作用等を考えて
調整する必要があり、それは当業者がルーチン実験で確認できる。
局所投与、経皮(例えばゲル、サルブ、化粧水、クリーム等)、経筋、腹腔内、肺内、経
眼投与を含む医薬品の種々の方法で投与できる。
、他の生物製剤と同時投与したり、て照射治療、外科、その他と同時に行うことができる
。
とにある。大抵の場合、親ポリペチドをコードするDNAは利用でき、入手できる。従っ
て、当該変異株は公知の各種方法を用いて親ポリペチドをコードするDNAを変えること
で作ることができる。そうした方法には部位特異的突然変異、ランダム突然変異生成、P
CR突然変異生成およびカセット突然変異生成が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。アミノ酸の置換は部位特異的突然変異によって行うのが好ましい(例えば、Zoll
er and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Aca
d. Sci USA 82:488を参照)。
方法手合成できる。
明の実施例では、変異配列(例えばIgG変異株配列)を構成メンバ配列をコードする核
酸を作るのに用い、それを宿主細胞にクローンして、発現させ、必要に応じて、分析する
ことができる。実際に、周知の手順を使用して実行できる。そうした方法は非特許文献5
3および非特許文献54に記載されている。これらの内容は本発明の一部を成す。
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold SPRing Harbor Laboratory Press, New York, 2001 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)
一般に、発現ベクターは制御配列または調節配列に連結し、機能的に配置されたタンパク
、選択マーカーおよび/または追加沃素を含む。本発明の変異株(例えばIgG変異株)
は核酸でトランスホームされた宿主細胞、好ましくはそのタンパクの発現を誘発または誘
導可能な条件下で変異株をコードする核酸を含んで、発現ベクターを培養して作ることが
できる。各種のホスト細胞系、例えば、哺乳動物細胞、バクテリア、昆虫細胞およびイー
ストを使用できる。例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能なATCC細
胞系カタログに記載の各種哺乳動物細胞系を使用できる。
n にATCC番号CRL-1662で寄託)、SP2/0、YE2/0、1R983F、Namalwa、PERC6、CHO細胞株、
特にCHO-K-1、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CHO-Lecl3、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat
、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、KGH6、NSO、SP0/2-Ag 14、P3X63Ag8.653、C127
、JC、LA7、ZR-45-30、hTERT、NM2C5、UACC-812等があるがこれらに限定されるものでは
ない。外部核酸を宿主細胞に入れる方法はも周知で、使用する宿主細胞によって変化する
。本発明の好ましい実施例では、変異株はYB2/0細胞で発現され、抗CD20抗体または抗RhD
抗体である。
植物で作ることができる。トランスジェニックな非ヒト動物は受精卵に所望の遺伝子を直
接注入することによって得ることができる(非特許文献55)。
Gordon et al., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A.;77:7380-4
または鳥等を含む。所望遺伝子を有するトランスジェニックな非ヒト動物は所望遺伝子を
胎生期幹細胞に入れ、会合キメラ方法または注入キメラ方法によって動物を調製すること
で得られる(非特許文献56、非特許文献57)。胎生期幹細胞の例はハツカネズミの胎生
期幹細胞 (非特許文献58)、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、鳥、ウシ等を含む。また、ト
ランスジェニックな非ヒト動物は細胞核を取り除いた卵子に所望遺伝子を導入した細胞核
を移入するクローン法を使用して調製することができる(非特許文献59)。
Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold SPRing Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993) Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292: 154-156 Ryan et aL, 1997 Science; 278: 873 - 876 Cibelli et_al., 1998 Science, 280 : 1256-1258
して、動物中で異なる分子を形成し、増殖し、動物からポリペチド変異株を回収すること
で作ることができる。。ポリペチド変異株を乳汁(動物の卵子等)に形成させ、増殖させ
て作ることもできる。
べてFcリガンドに対する結合性が増加した変異株であるFc変異株を同定する方法を提
供することにある。本発明方法は下記の工程から成る:
(i) Fc変異株をコードする一組の核酸から成る核酸ライブラリを作り、
(ii) 前記ライブラリに含まれる核酸の発現によってFc変異株を生産し、(iii) 段階(ii
)で作ったFc変異株の中でFcリガンドに結合可能ものを選択し、
(iv) 段階(iii)で選択したFc変異株およびFcリガンドのための1つのFcコントロー
ル(対照)の結合特性を測定し、
(v) Fcコントロールと比較して、Fcリガンドに対する結性が増加したFc変異株を選
択する。
リはFc変異株をコードするDNAの塩基配列を有する。
おじか、それより高いものおよび公知のFc変異株から成る群の中から選択される。
されない。
の塩基配列を変えることによって作ることができる。「核酸配列を変える」とは突然変異
、例えば所望核酸配列のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を意味する。この種の突然
変異は従来周知の方法で実行できる。これらの方法にはランダムな突然変異生成、部位特
異的突然変異、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成を含むが、これに限定され
るものではない。
スにしたランダムな突然変異生成によってライブラリを作る。このランダム突然変異生成
法は特許文献27に記載されており、その内容は本明細書の一部を成す。すなわち、本明
細書の材料と方法の項で説明するように、1つのRNA依存性DNAポリメラーゼまたは
RNA依存性DNAポリメラーゼの組合せを用いてライブラリを作ることができる。
imized)されたFc変異株のプールのDNAの塩基配列を変えることで作られる。ランダム
突然変異生成を使うのが好ましい。予備最適化されたFc変異株は少なくとも一つのアミ
ノ酸突然変異を有し、野生型Fcと比較してFcリガンドに対する結合性か増加したFc
変異株である。予備最適化されたFc変異株は野生型Fcと比べて1〜4つのアミノ酸突
然変異を有するのが好ましい。この予備最適化されたFc変異株は野生型Fcの突然変異
によって作られるライブラリのスクリーニングで得ることができる。また、従来技術に記
載のFc変異株でもよい(例えば、本明細書の関連技術で説明のもの)。予備最適化され
たFc変異株のプールは複数のポリペチド、好ましくは約2から約100の予備最適化された
変異株を含むのが好ましい。
選択することが可能になる。本明細書の[表5]にはこの種のライブラリのスクリーニン
グから選択された最高のFc変異株の結合能が示してある。
る。好ましい実施例ではFcライブラリが標準手順(非特許文献61)を使用したファー
ジの発現(ファージ表示)で作られる。
Smith, Science, 1985, 228: 1315
異株から分離することで実行できる。この分離段階を実行するために、Fcリガンドをは
固体担体に固定するか、段階(iii)のプロセス中、固体担体に固定可能でなければならな
い。この種の手順の例は本出願の実施例 1に記載されている。段階(iii)は最も効果的な
Fcリガンド見つけるために複数の選抜ラウンドから成るのが好ましい(実施例を参照)
。
評価する。例えば、当業者は該当するELISAを実行することができる。特定信号が少
なくとも親Fcのそれより1.2-倍強い場合の変異株を選択する。該当するELISAアッ
セイは単離されたFcまたは実施例Ilおよび実施例IVに示すようにファージに表示された
Fcに対して実行できる。
ン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)実験を使用して解離定数を決定することが
できる。段階(v)では変異株が親Fcの解離定数の3倍を有する場合に、その変異株を
選択する。
Fc-WiId-型と比較してFcRnに対する結合性が増加するFc変異株の同定と、その
変異株の結合性の特徴付け
I. 材料と方法
I.1 ヒトFcRnの発現および精製
バクロウイルス系を使用して可溶性ヒトFcRnの発現を非特許文献62に記載のGTP
Technology(Labege、フランス)によって実行した。
Popov et al., MoI. Immunol. 33:521 -530 (1996)
コードン1-290)をコードするα鎖相補DNAにタグを付けた。誘導体のα-鎖およびβ2
ミクログロブリン鎖はP10およびpolyhedrineプロモータの下にpFastBacDualにクローンし
た。非オチニル化(biotinylated)したバージョンのFcRn(FcRn-biot)はFluoR
eporter(登録商標)Biotin-XX Protein Labeling Kit F2610(分子プローブ)を用い、
メーカのプロトコルに従って化学的カップリングで作った。さらに、β2ミクログロブリ
ン鎖を含み、α-連鎖がファージp3タンパクおよびCVDEタンパクのアミノ末端部に溶合し
た融合タンパクも作った(FcRn-p3)。IgG-セファロースおよびIMAC精製段階後に
純度が90%以上の純粋なタンパクが得られた。
Fcポリペチド(ヒトIgG1重鎖(SEQ番号1) (Poul MA et al., Eur. J. Immunol.
25(7):2005-2009 (1995)に由来するアミノ酸残基226-447(KabatでのEUインデッ
クス)をコードするヒトFcライブラリを標準的なPCRを用いてBamHI/EcoRI断片としての
ファージミドベクターpMG58(pMG58_Fc226(図1))にクローンした。このベクターは
[図1]に示した。複数の完全にランダム化したライブラリはMUTAGEN(登録商標)(特許
文献28)を使用して作った。これは低忠実度のヒトDNAポリメラーゼ(ムターゼ)を
用いて標的配列全体に突然変異を均一かつランダムに導入する方法である。
olηおよびpolι)を使用した。これらのヒトポリメラーゼは公知の方法(非特許文献6
2、63)で製造し、精製した。
Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007) Emond et al. Protein Eng. Des. SeI. 21 : 267-274(2008)
ヒトFc遺伝子(Fc遺伝子)を5’−プライマMG_619:5’-AGTACTGACTCTACCTAGGAT
CCTGCCCACCGTGC−3’(SEQ ID番号5)および3’−プライマMG_621:5’-ACTGCTCGATGT
CCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3’(SEQ ID番号6)を使用しているムターゼでダブル複製し
た(BamHIおよびEcoRI制限サイトには下線を引いた。イタリック部は非特異性テイルに対
応する)。0.6.μgの鋳型としてのpMG58_Fc226プラスミド(Mut1ライブラリ用の野生
型FcまたはMut2ライブラリ用のFc変異株)と、プライマMG_619およびMG_621(それぞ
れ25OnM)と、適切な複製緩衝液(下記に詳述)とを含む混合物を95℃で5分間処理した後
、直ちに4℃まで冷却してDNA鎖の特性を変性させる。Polβの場合の複製緩衝液は5Om
MトリスHCl pH 8.8、1OmM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび1%(v/v)グリセリンである
。polη(またはpolηおよびpolι) 場合の複製緩衝液は25mMトリスHCl pH 7.2、5mM-MgCl
2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび2.5%(v/v)グリセリンである。変性段階後、突然変異誘発
性複製を50μM dATP/dCTP、100μM dTTP/dGTPおよび1μgのpolβまたは100μM dNTPs、1
μgのpolη(またはpolηおよびpolι、各1μgのムターゼ)を加えて行った。複製反応
は37℃で2時間行った。それから複製生成物を脱塩し、ミクロコムカラム(ミリポア)で
濃縮した。
上記で得られた複製生成物はテイルプライマを用いた選択的PCRによって増幅した。プ
ライマ(MG_619およびMG_621)はムターゼによって合成されるDNA断片の特異的増幅が
できるように鋳型に非相補であるテイルを用いて設計した。PCR緩衝液(2OmM Tris-HCl p
H 8.4、5OmM KCl)、1.5mM MgCl2、10pmolの5'および3'プライマ、200μμM-dNTPsおよ
び1.25 U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(InvitroGen)を含む混合物に複製生成物画
分を加えた。PCRサイクルは以下のとおり:第1サイクル:94℃で2分、64℃で10秒、75℃
で30秒、94℃で1分、および30の選択サイクル:94℃で20秒および75℃で30秒。
素で消化し、pMG58ベクターにクローンした。ライゲーション混合物を電気競合性(electr
ocompetent)のE. coll XL1-Blue細胞にトランスホームし、100μg/mlのアンピシリンおよ
び1%(w/v)グルコースを補った固体2YT培地(16g/5g lペプトン、10g/l酵母エキス、5g
/l NaCl、15g/l寒天)に塗布した。成長後、コロニー数を求め、ライブラリの寸法を見積
り、各ライブラリ当たり96クローンをランダムにPCRし、高速DNA塩基配列決定した。1
5%グリセリンを含む2YT培地に細胞を掻き取り、凍結し、-80℃に維持した。
リを構築した。第1のライブラリは3.2×106クローンを含む野生型Fc遺伝子上でのpolβ
を使用して得た(Mut1.1と呼ぶ)。この第1のライブラリのDNAを用い、polβ(3.8×1
06クローン(Mut1.2))およびpolηおよびi(3.0×106クローン(Mut1.3))をそれぞれ
使用して第2および第3のライブラリを作った。この2累積複製段階戦略で突然変異率を
増やすことができる。第4のライブラリは野生型Fc遺伝子(1.0×106クローン、Mut1.4
)のみでポリメラーゼηで作った。最後に、これらの4つのライブラリを正比例で混合し
て、1.1×107の異なるクローンを表すMut1とよばれる最終ライブラリを得る。
ァージELISAでFcRn-接合性を改良した42の単一変異またはダブル変異体のDN
Aプールを用いて2つのライブラリを構築した。第1のライブラリはpolβ(1.9×107クロ
ーン、Mut2.1)で得られ、第2のライブラリはpolη(1×106クローン、Mut2.2)で得られ
た。最後に、これらの2つのライブラリを正比例で混合して2×107の異なるクローンを表
すMut2とよばれる最終ライブラリを得た。
上記で作った各ライブラリの品質を細胞上のPCRで査定した。Fc遺伝子(5'−プライ
マ、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'(SEQ ID番号7)および3'−プライマ、5'-TCACGTGCAAA
AGCAGCGGC-3'(SEQ ID 番号8)を増幅し、高速シークエンシングした(5'−プライマ、
5'-TGATTACGCCAAGCTTGC-3'(SEQ ID 番号9)。各ライブラリからランダムに採った96の
クローン配列を(Mut1.4〜Mut1.1、Mut2.2〜Mut2.1)を決定した。最後に、プールしたラ
イブラリMut1の35のクローンとプールしたライブラリMut2の86のクローンもシークエンシ
ングして選択プロセスの前に最終ライブラリの品質を制御した。
子に適応させたMilleGen社のMutanalyse4)(Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82、
2007)を使用して分析した)。この解析から突然変異は全遺伝子に沿ってランダムに分布し
、「ホットスポット」は無いことが確認された。
Mut1ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり6.3の突然変異であり、これ
は遺伝子(666nt)当たり4.2の突然変異があることを意味する。これらの突然変異の中で
、81.4%は置換でり、16.8%は欠失であり、1.8%は付加であり、最後の2つのカテゴリ
は遺伝子にフレームシフトをさせる。フレーム中の配列だけを考慮すると、突然変異体頻
度は1kb当たり4.0の突然変異であり1遺伝子当たり2.7の突然変異である(遺伝子当たり
1〜6つの変化したヌクレオチド)。また、タンパクレベルでライブラリの活性部分を決
定することで突然変異の解析をさらに行った。最後に、Mut1ライブラリは28.6%の野生型
断片(非変異または、サイレント変異)を発現したクローン、40.0%のフレームからの配
列またはストップコードン(非発現)を含むクローン、31.4%の変異した配列(Fc変異
株)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均2.3の変化し
たアミノ酸を有する3.5×106の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を表す。
Mut2ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり4.5の突然変異であり、これ
は遺伝子当たり3.0つの突然変異に壮途うする。これらの突然変異の96.3%は置換であり
、3.2%は欠失であり、0.5%は付加である。フレーム中の配列だけを考慮した場合、突然
変異頻度は4.3/kbであり、遺伝子当たり2.9の突然変異である(1遺伝子当たり1〜7つ
のヌクレオチド変化1)。Mut2ライブラリはタンパクレベルで17.4%の野生型断片(非変
化またはサイレント突然変異)を発現するクローンを含み、9.3%のフレームからの配列
またはストップコードン(非発現)を含むクローン、73.3%の変化した配列(Fc変異株
)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均して1.9の変異a
aを有する1.5×107の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を有する。
Fcライブラリを標準的手順(Smith GP, Science 228: 1315 (1985))を使用してファー
ジM13の表面で発現させた。E. Mut1ライブラリ(pMG58ベクター)を含む大腸菌XL1-Blue
バクテリアを、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlテトラサイクリンおよび1%(w/v)
グルコースを補った60mlの2YTでOD600nm=0.6に達するまで230回転数/分で3O℃で成長さ
せた。それからら細胞を37℃で20分間、M13ヘルパーファージ(M13KO7、Biolabs、バクテ
リア/ファージ比=1/3)に感染させ、ファージFcの生産を2YT/アンピシリン/グルコー
ス(0.5mM IPTGおよびカナマイシン30μg/ml)中で230回転数/分、26℃で一晩続けた。次
の日、ファージを標準プロトコールを使用してPEG6000中に沈澱させ、1mlのリン酸緩衝液
(pH6、(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH6.0、P6をよばれる)に再懸濁
させ、XL1-Blue細胞を感染させて滴定した。上記の3つの選択戦略を異なる条件を使用し
て適用し(図2)、1つの戦略に対して選抜を3〜8ラウンド実行した(下記参照)。
固相選抜のために、P6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で4×1011ファージをMaxisorp免疫
プレートの8つのウエルで培養した。各ウエルには予め0.5μgのニュートラビジン(neu
travidin)、0.5μgのビオチニル化(biotinylated)FcRn(戦略1)または0.5μg
のFcRn-p3(戦略2)を塗布し、P6中の5%脱脂乳でブロックした。
37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween 20で20回洗浄し、10OμlのpH7.4
のリン酸緩衝液で37℃で2時間、培養溶出した(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム
5OmM、pH7.4)/ウエル。滴定後、溶出したファージを用いて指数的に増殖したぺXL1-Blue
バクテリアを10ml 再感染させ、固体2YT培地/アンピシリン/グルコースに塗布した。次の
日、細胞を15%グリセリンを含む2YT培地に掻き取り、凍結し、80℃で保存した。
液相での選択では最初に4×1011のファージを1mlのP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で低
攪拌下に室温で1時間、25OnMまたは10OnMのビオチチル化したFcRnで培養した。予めP
6中の5%脱脂乳でブロックしたストレプトアビディンで被覆した磁気ビーズ(Dynal)を
室温で30分間、ファージに加えた。このファージ−ビーズ錯体を磁石を使用してP6/0.1%
Tween 20で15回洗浄した(磁気粒子選鉱機(Dynal))。ファージを室温で2時間、500
μlのpH7.4リン酸緩衝液(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH 7.4)中に
培養溶出した。ビーズは磁石を用して捨て、上澄中に溶出したファージを集める。滴定後
、溶出したファージを用いて10mlの指数的に増殖するXL1-Blueバクテリアを再感染し、そ
の後、固体2YT培地/アンピシリン/グルコース上に塗布した。次の日、細胞を15%グリセ
リンで2YT培地に掻き取り、凍結し、次の選択ラウンドまで-80℃でストックした。
スクリーニング・プロセス(MS1およびMS2)では、各戦略のために、ラウンド3
〜8から、48〜96のクローンを細胞のPCR(l.2-cで説明)後、配列決定した。配列解析は
選択したFc変異株を迅速に分析するために内部開発しMilleGen社のソフトウェアAnalys
eFcを使用して実行した。Fc変異株はそれを単離した選択ラウンドに従って名前を付
けた(Mut1スクリーニング用:戦略1用にはB3A〜B6A、戦略2用にはS3〜S6A、戦略3用には
L3A/B〜L6A-F、Mut2スクリーニング用には戦略1用にC3A〜C8A、戦略2用にT3A 〜T8A、戦
略3用にM3A/B)。数(1〜96)はシークエンシング用PCRプレート上の場所を示す。最後
に全選択プロセス中に、227の異なる変異クローンをMut1のために単利し、Mut2のために2
23の異なる変異したクローンを単離した。これら全てのクローンはファージ−ELISA
アッセイを使用して特徴付けた。
MS1で単離した改良型のFc-変異株の配列解析から、多数のクローンが類似した突
然変異(N434Y、N434S、P230S、P230T ...)を含むことが明らかになった。付随する
突然変異の効果をs綺羅かにするために、目標突然変異生成(directed mutagenesis)を
行ってこれらの突然変異を除去した。これらの新しいミュータントは親のクローンの名前
の後にAまたはBを付けて命名した。61の新しいミュータントをテストした。これらのミュ
ータントは[表1]に示す。ポジティブとみなされるこれらミュータントはファージ−E
LISAアッセイでFc−WTより1.2〜2.6-倍高い特異信号を有する(下記参照)。M
S2後にヒンジ領域に1つまたは2つの突然変異を加えて、標的突然変異生成によってい
くつかの新しいミュータントを構築した(P230SまたはP228LまたはP228RまたはP228L/P23
0SまたはP228R/P230S)。これらのミュータントは親クローンの名前の後に文字(A〜G)
を加えて命名した。24の新しいミュータントをテストし、[表5]に示した。
MS1、MS2で単離した変異株のファージで表された結合特性を、ウエルに塗布した
FcRn-p3でELISAテストを用いpH6.0で決定した(図3)。簡単に言うと、ヘルパ
ーファージM13K07に感染させた2YT/アンピシリングルコース中の800μl倍養液中に6-ウ
エルプレート上で単離したクローンとしてファージFc変異株を作った(パラグラフ3で
説明した方法)。26℃で一晩かけて製造したファージを30分間300Ogで遠心分離して上澄
中に回収した。この上澄をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20に直接希釈(1/2および1/4)し、
予め0.25μgFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp
免疫プレート上でテストした。37℃で2時間培養の後、ウエルをP6/0.1%Tween-20で3回
洗浄し、結合したファージをHRP抗M13抗体(GE Healthcare)で検出した。
c−WT)およびポジティブ対照と比較するテストを行った。ポジティブ対照(Fc−H
変異株という)はダブル突然変異体T250Q/M428Lで、FcRnに対する親和性が改良され
たものと記載されいる(x28, Hinton PR et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (20
04))。この変異株を突然変異コードンと制限サイトとを有する下記の2つの長いオリゴヌ
クレオチドを用いて標的なPCRプロトコルでジェネレートした:
5'プライマ5'CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC
CCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC-3'(SEQ ID NO:10)
3'プライマ5'GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCAT
GCAGCACGGAGCATGAGAAG-3'(SEQ ID NO:11)
(BamHIおよびEcoRI/制限サイトには下線を引いた。灰色は突然変異コードンに対応する
)
平均して3.2-倍強い特定の信号(突然変異/Fc−WT比)を有し、テストした227のFc
-変異株の中で、73の変異株が比/Fc−WT>3.2を示した。これはFcRnに対してF
c−H変異株変異株より強い結合をすることを意味する(表2)。単一ポイントアミノ酸
突然変異を有するMS1からのポジティブ変異株は野生型Fcより約1.2-倍〜3.5-倍強い
特定信号を有する(表1参照)。
じELISAプレート上で比較するにはFc−WT信号とFc変異株の信号との相違が大
き過ぎるためFc−H変異株およびMS1(S5A_41)中に単離した最高のFc変異株と比
較した。テストした223のFc変異株の中で209のFc変異株はFc−Hより良く(比/F
c−H>1.1)、39のFc変異株はMS1中に単離した最高のFc変異株より良かった。
各変異株をFc−WTと比較するために、各変異株の比/Fc−HにMS1中に求めたF
c−H(= 3.2)の比/Fc−WTを掛けて予想比/Fc−WTを計算した(比/Fc−
WT=3.2×比/Fc−H)(表3)。
ロセスおよびMS2プロセスで単離された。これらの282のFc変異株の配列解析から分
子全体に115の異なる位置で突然変異を含んでいることが明らかになった(表4)。
30、F241、V264、T307、N315、A330、Q342、Q362、A378、E382、N389、P396、V397、N421
およびN434。特に、下記の4つの位置はより優先して突然変異される最も重要な位置とみ
なされる:V264、N315、A378およびN434(図4)。
MS1(S5A_41)の最高変異株と比較してFcRnに対してより良い結合性を有するM
S2のFc変異株を[表5]に示す。
Fc−H変異株と同じFc−WT配列およびMS1およびMS2で単離したFc変異株
は、BamHIおよびE.coli制限サイトを使用してpMG58 フアージミド(ファージmid)ベクタ
ーからpMG62ベクターにサブクローン(subクローン)し、精製用のC末端6xHisタグとE
LISAアッセイでの検出用V5タグとを有する可溶性周辺質(periplasmic)発現ができ
るようにした。組換え型Fcポリペチドの生産はHB2151大腸菌株において実行した(200
℃で16時間、0.5mM IPTGで誘導)。精製は標準プロトコルを用いてNi-NTA上で実行し、各
ポリペチドの約200-500μgを得た。
合特性
IV.1. Fc_WTと比べたS5A 41、S3A 07およびFc−H変異株のFcRn結合特性
IV.1.a ELISAアッセイ
可溶性フォーマットで産生したFc変異株の結合特性をウエルを被覆したFcRn-p3
でpH6.0でELISAテストを使用して決定し、Fc−WTと比較した。P6/5%脱脂乳/0.
1%Tween-20に連続的に希釈した精製Fc変異株(IIIに記載)をMaxisorp 免疫プレート
でテストされた。この免疫プレートは予め0.25.μgのFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6
の5%脱脂乳でブロックした。37℃で2時間培養後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗
浄し、結合したFc-変異株をHRP抗V5抗体(invitroGen)で検出した(OD450nmの測定)
(図5a)。ELISAテストは、S5A_41、MS1の最高変異株およびS3A_07、Fc−H変
異株に均等な変異株、Fc−H変異株で実行した。これらのELISAテストによってF
c−H、S5A_41、S3A_07がFc−WTと比較してFcRnに対する結合性が改善すること
を確認した(図5b、図5c、び図5d)。各結合曲線ではFc−WTと比較したFc変異株の
結合特性を示すために、曲線の50%飽和でのFc濃度(EC50)の測定値を用いた。得られ
た比から、S5A_41がFc−H変異株より良い結合剤性を示し、S3A_07がFc−H変異株に
匹敵することが確認された(表6)。
Fc変異株と固定されたFcRnとの相互作用をCM5センサーチップ(Biacore, GE Healt
hcare)を使用したBIAcore X100機器を用いてモニターした。この方法は上記でFc-Fc
Rn相互作用を分析するために記載したものと同様である(Popov S. et al., MoI Immuno
l. 33(6):521 -530 (1996))。組換え型可溶性FcRnをアミン-カップリング化学を使用
したセンサーチップのフローセル2にカップリングさせた。フローセルは0.1MのN-ヒドロ
キシスクシンイミドと0.1Mの3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル- N-エチルカルボジイ
ミドの1:1混合物で30μl/分の流速3分間慣性化した。組み換えヒトFcRn(10mM酢酸
ナトリウム中に5μg/ml、pH 5.0)を10μl/分で2〜8分間、フローセル2に注入し、結果
は表面密度を1200〜1300応答単位(RU)となった。表面は1M− エタノールアミン-HCl、p
H 8.5を3-分間注入してブロックした。フローセル1はFcRnを含まないコントロール(
対照)として使い、同じサンプルフローセルと同様に調整した。このブランクフローセル
からのデータをサンプル・データから引いた。
1% Tween-20)で希釈し、それを平衡結合実験でランニング緩衝液として使用した。全て
の測定は25℃で、一般に1〜200nMのFc断片濃度で10μl/分の流速で実行した。
を用いた。センサーグラム(Sensorgrams)を作り、BIAevaluationソフトウェア(バージ
ョン3.1)を使用して分析した。各注入毎に観測された平衡RUをFc濃度に対してプロッ
トした。BIAevaluationソフトウェアに含まれる安定状態親和性モデルを使用してプロッ
ト線を解析することによって平衡Kd値を得た。得られたるKd比から、S5A_41がFc−H変
異株よりよい結合性であることと、S3A_07がFc−Hに匹敵することが確認された(表6
)。
表6は、 (i)ファージELISA、(ii) ELISAおよび(iii) SPRによってFc
−WTと比較した変異株S5A_41、S3A_07およびFc−HのFcRn結合能力を示す。全て
のケースで変異株S5A_41はFc−WTより大幅に高い能力を示した。
合特性
IIIuに記載の方法でMS2のいくつかのFc変異株を作った。各変異株のFcRn結
合能力を上記IV.2.bおよびIV.2cに記載の(i)SPRおよび(ii) ELISAによって分析
した。
MS2変異株で得られた結果を示す。なお、上記で得られたELISA−ファージの結果
も示してある。
ELISAおよびSPRアッセイから、全てのFc変異株はFcRnに対して野生型F
cより良い結合性を示すことが示され、これはファージFc変異株でのELISAアッセ
イで得られた全館の結果と一致した。pH=6でのMS2変異株のKd値は5.2〜22.7nMであり
、これはFc−WTと比べて親和性が1.3〜5.8倍増加することに対応する。
でテストした各Fc変異株に対してpH=6でELISAアッセイを実行した時の0.8〜1.0
の範囲のOD450nmを与える濃度でELISAアッセイを実行した。実験的条件とIV.I.aに
記載のものである。[表8]はこのELISAアッセイを実行するのに使用した各Fc変
異株の濃度を示す。
れたFcRnに結合したFc変異株の量に関係する(HRP抗V5抗体で結合したFc変異株
を検出)。OD450 nmでの特異的信号が高い程、FcRnに対するFc-変異株の結合はよ
り強い。
る。予想した通り、pH 7,4でのFcRnに対するFc変異株の結合性はpH 6.0での結合と
比較すると弱い。
本発明のFc変異株を得るために導入したアミノ酸変更によってpH 6.0でFcRnへの
結合をFc−WTのそれと比較して大幅に増加でき、pH 7.4での結合は極めて低くしたま
まにすることができると結論できる。
Fc変異株ベースのIgG変異株の製造と、このIgGの生物学的特徴
I. IgG変異株の発現
1.1. ベクター構築
Fc変異株C6A_69;C6A_78;T5A_74;C6A_74;C6A_60およびC6-A66を、YB2/0細胞系で
の抗CD20特異性を用いたIgGフォーマットで調製した。比較のために、野生型Fc(I
gG−WT)をベースにしたIgGも作った。
YB2/0の細胞系の生産性を最大にするために、完全長の重鎖および軽鎖cDNAおよび
変異株をコードするFc断片をRattus norvegicusに対するコードン最適化で合成した。
暗号スプライシングサイトや制限サイトのような不必要な特徴は除去した。変数/恒常部
結合には制限サイト(Apal)のみが存在する。
で野生型重鎖をクローンして、中間の構造物HCD20-Opti-GAにした。次に、最適化した軽
鎖をSpelとXbal制限サイトの間でクローンして、野性型抗CD20抗体の発現のための最終構
造物HKCD20-Opti-GA(以下、IgG−WTという)にした。
Fc変異株はHKCD20-Opti-GAに存在する野生型IgG1Fc断片を適当な変異に代える
ことで調製した。これをApalとAscl制限サイトの間でクローンした(図8a)。
全ての断片クローニングは従来バクテリアのトランスフォーメーションの古典的な消化
/ライゲーション手順で行った。発現構造物は酵素消化にPCRを加え、シークエンシング
して確認した。
YB2/0細胞系(ATCC(CRL-1662))の5.106細胞を各発現線形ベクターと一緒にで電気穿
孔し、RPMI 1640媒体+5% v/v透析FCS(InvitroGen)中に25,000細胞/mlに希釈し、1m
l/ウエルで24-ウエルに分けた。3日後に細胞を回収し、ジエネティシン(geneticin)(I
nvitrogen)を最終0.5g/L、濃縮MTX(シグマ)を最終25mM、2ml/ウエルで加えること
によって選択圧を加えた。11日間の培養後、耐性細胞は各々8つの構造物用(選択された
IgG MS2変異株、IgG−WTのコード用)に集め、DMEM媒体+5% v/v Ultra-low
IgG FCS(InvitroGen)で希釈し、0.9Lの細胞懸濁液の含む2L-ローラボトルの各々
を2サイクル/分で培養する。細胞は成長し、死ぬ(4〜5日)。その前に上澄を回収し、
低速度遠心して清浄し、容積を減し、Pellicon XL Filter(ミリポア)で限外濾過する。
濃縮した培養上清はをHiTrapプロテインA FFカラム(GE Healthcare)に注入した。結
合した抗体はpH 3.0の0.1M−クエン酸ナトリウム緩衝液で溶出させ、各画分を1mlの溶出
緩衝液当たり100μlのpH 7.5の1M−トリスを使用して中和した。抗体を含む画分を集め
、PBS pH 6.0で透析し、サンプルを滅菌濾過(0.22ナノメートル)し、4℃で保存した。
精製したIgGをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で非還元性および還元性条件下
で特徴付けた。クマシー青色染色(Coomassie Blue-stained) ゲルから、全ての突然変異
で、IgGは95%以上の均質性で精製され、各IgGに対する特徴的な重鎖および軽鎖バ
ンドが示された([図8]および[図8c])。
FcRnへのIgG変異株の結合特性を (i) ELISAアッセイ、(ii) SPRおよび
(iii) 蛍光ラベ化したRituximab(抗CD20IgG)の存在下で先端を切ったFcRnを発
現するJurkat-細胞株を用いた結合競合アッセイの3つの別々のテストで決定した。
III.1a 材料および方法
Y2B/Oで産生したIgG変異株の結合特性をウエルに被覆したFcRn-p3でpH6.0でE
LISAテストを用いて決定した。比較のためにIgG−WTでもELISAアッセイを
実行した。
精製したIgG変異株をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween-20を用いて連続的に希釈し、予め0.
1μgのFcRn-p3/ウエルで被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プ
レートでテストした。37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗浄し
、結合したIgG変異株をHRP Fab'2ヤギ抗ヒトFab'2(Interchim)で検出した。
各IgG変異株に対して結合したFcRnの百分比をIgG-変異株の濃度(log)に対
してプロットした。得られた各結合曲線で、曲線(EC50)の50%飽和に関連するIgG濃
度の測定値を決定し、WT-IgGのEC50と比較した。
ELISAテストの結果は、産生したIgG変異株はがWT-IgGと比べて、FcRn
に対する結合性か増加することを示している。この事実は結合曲線([図9]参照)およびE
C50値から明らかである。
下記の[表9]に示すように、IgG-変異株のEC50は野生型IgGより少なくとも5.8-倍
以下低い。最大EC50はC6A_69変異株で得られる。
lll.2.a 材料および方法
IgG−WTおよびIgG変異株の固定したヒト組換え型FcRnとの相互作用をBIAc
ore X100機器(GE Healthcare)を用いて表面プラスモン共振(SPR)検出によってモ
ニターした。実験のプロトコルはFc変異株(パラグラフIV.2b参照)で親和性を決定す
るのに使用したものと同様である。
各注入で観測される平衡RUをFc濃度に対してプロットした。平衡Kd値はBIAevaluatio
nソフトウェアに含まれる安定親和性モデルを使用してプロット線の解析によって得た。
動力学的パラメータはモデル1:2で解離相と会合層のデータをグローバルフィッテングし
て決定した。
ヒトFcRnに対するIgG−WTの結合能(Kd値)は78,3nMであった。[表10]に示
すように、6つのIgG変異株 Kd値は10.5〜18.8 nMで変動し、これはFcRnへの親和
性がpH 6.0でのIgG−WTのそれと比べて4〜7倍増加することを示す。
は主として会合キネティクス(kon値)の増加によるものである。すなわち、変異株konを
WT-konで割った比は13〜23で、これはFcRnに対する変異株の親和性の大きな増加を示
している。WTに対するIgG変異株のKoffof値の増加は2〜4で、これは会合に比べて解
離が弱いことを示す。
lll.3.a 材料および方法
IgG−WTおよび変異株のFcRnとの相互作用の能力を評価するために、Dall'Ozz
o達が記載の方法(Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos
P, Watier H, Thibault G, Cancer Res., 2004 JuI 1 ;64(13):4664-9)の変形法で競合
免疫蛍光法アッセイを実行した。
簡単に言うと、IgG−WTおよび変異株をPBS pH6に希釈して最終濃度を0,06〜2mg/m
lにし、Alexa-共役 Rituximab(ラベル化Rituximab)の存在下で、50μg/mlの濃度でJur
kat FcRn(150000セル)と一緒に培養する。20分後、細胞をフローサイトメトリで分
析して、結合したAlexa-共役 Rituximabを定量する。結果は平均蛍光強度(MFI)の百分
比で表される。100%は Alexa- Rituximab単独(すなわち競争なし)で得られる平均蛍光
強度(MFI)であり、0%はJurkat FcRnがAlexa-共役 Rituximabと一緒に培養されな
かった時の測定MFI値である。各実験は3回行った。
コントロール(対照)は(i) ラベル化なしのRituximabまたは(ii)IgG−WTの培養
から成る。
0%阻害を与える各テストしたIgGの濃度(IC50)を決定した。このアッセイの一般的
な説明は下記特許文献12(フランス特許第FR 2 894 983号公報)にも記載されている。
[図11]にいくつかの結果を示す。この図では本発明およびJurkatFcRnの各種変異
株の結合またはRitixanを上記の「材料および方法」に記載のようにして決定し、平均蛍
光強度(MFI)値で表してある。
下記の[表12]に示すように、本発明の変異株で得られるIC50はWT-IgGにで得られ
るそれに比べて大幅に低い。本発明のIgG変異株のIC50の減少度はC6A_66を除いて40〜
60-倍である。
FcRnへのIgG変異株の結合特性を特徴付けるために実行した3,の別々のテスト
は一貫した結果を与えた。全てのケースで本発明のIgG変異株はFcRnに対してIg
G野生型のそれと比べて結合性か大きく増加した。
Fcγリセプタを結合するIgG変異株の能と、そのADCCおよびCDC活性をアッセイし
てその生物学的機能を完全に特徴付けた。
IV.1a. ELISAアッセイ:固定した組換え型hFcγRIIIAに結合するIgG変異株の
結合性
ヒト組換え型FcγRIIIA(F158アロタイプ)をEZ-link NHS-PEOキット(Pierce)でビ
オチン化し、アッセイ緩衝液(25mMトリス、150mM- NaCl、pH 7.35、0.05% Tween-20、0
.1% BSA)中に1μg/mlに希釈し、react-bind(登録商標)ストレプトアビ遺伝子 ELIS
Aプレート(Pierce)上に塗布し、室温で2時間培養した。この培養中に、5μg/mlのIgG
と2μg/mlのワサビペルオキシダーゼでラベル化したF(ab')2抗ヒトF(ab')2(Jackson Imm
unoResearch)とを室温で2時間混合して、緩衝液中にIgG-F(ab')2抗-F(ab')2錯体が作ら
れる。一連の希釈をした錯体をプレートに加え、室温で2時間穏やかに振盪して培養する
。プレートをアッセイ緩衝液で洗浄した後、hFcγRIIIAへ結合した錯体をTMB(Pierce
)で検出した。450nmでの吸光度をプレートリーダ(Tecan)を使用して読んだ。
各IgG変異株に対して結合したFcγRIIIA(OD450nmから得られる)の百分比をIg
G-変異株の濃度に対してプロットした。
[図10]に示すように、、hFcγRIIIAへのIgG変異株の結合性はhFcγRIIIAと結
合しない変異株C6A_66を除いて、IgG−WTのそれと同様である。
天然キラー細(NK細胞)は健康なドナーの抹消血液からMiltenyi社が開発したネガテ
ィブ減損法を用いて精製した。ADCCテストでは異なる濃度の抗CD20抗体の存在下で、CD20
リセプタを発現するRaji株の標的細胞と一緒にNK細胞を培養する。16時間培養した後、
抗CD20抗体が誘導した細胞毒性をクロマトグラフで測定し、溶解した標的細胞が開放した
細胞上澄中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と呼ばれる細胞内酵素のレベルを定量する。
結果は[図12]に示してある。
特異的リーシス(溶離)の結果、リーシスパーセントが抗体濃度の関数として表される
。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)はPRISMソフトウェアを使用して計算し
た。対照実験は (i) Rituximab、(ii) Y2/0細胞およびLFB-R603中に産生されるWT−I
gGを用いて実行した。LFB-R603がADDC機能を有する抗CD20抗体であることは下記文献の
記載の通り公知である:de Romeuf et al. in 2004 (de RomeuFc, Dutertre CA, Le Ga
rff-Tavernier M, Fournier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens
CK, Beliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Ber
al H。すなわち、慢性リンパ球白血病細胞はFcγRIIIA/CD16の改良のために選択した抗
CD20モノクローナル抗体で能率的に殺される:Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43
)。また、特許文献13(国際特許第W02006/064121号公報)にも記載されている。
機能を示している。全てのIgG変異株は、C6A_66変異株を除いて、ADCC活性を示す。C6
A_66変異株はADCC活性がなく、それはFcγRIIIに対する極めて低い親和性と一致してい
る。
C6A_69、C6A_60およびC6A_74はIgG−WTと比べてADCC活性が増加する点に注意する
必要がある。他の変異株(すなわちC6A_78およびT5A_75)はIgG−WTのそれと同様な
ADCC活性を有する。
こここでは、標的CD20+Raji株の細胞を、補助ソースとしてのベビー・ウサギ漿液(Ce
darlane参照番号CL3441、希釈度1/10)の存在下で、抗CD20抗体の異なる濃度(0〜5000n
g/ml)で培養した。37℃で1時間培養後、溶解した標的細胞によって上澄中に開放されたL
DHの量をクロマトグラフ (Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit)で測
定し、抗体を介した補体依存性細胞毒性を定量した。結果は細胞溶解の百分比で表しした
。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)およびEmax(最大細胞溶解百分比)はPR
ISMソフトウェアを使用して計算した。
[表14]は各変異株で得られたEmaxおよびEC50を示す。CDC活性レベルはIgG変異株
によって変化する。C6A_78およびC6A_60はIgG−WTよりかなり高いCDC活性を示す。C
6A_69、T5_74およびC6A_66のCDC活性は低い。C6A_74変異株のCDC活性はIgG−WTと同
様である。
Y2B/0細胞株が産生する組み換え型の6つの本発明のIgG変異株はIgG−WTと比
べてFcRnリセプタに対して結合性が増加する(同じ宿主細胞で同じ条件下で)。
本発明のIgG変異株は、FcgRIIIとに少なくとも同じ結合能を有し、IgG−WT
と少なくとも同じADCC活性を有する(但し、FcgRIIIに対する親和性が悪いC6AA_66は除
く)。
IgG変異株は別々のCDC活性を示す。
いくつかの観点から、本発明によるアミノ酸変更によって対応する親IgG(例えばI
gG−WT)と少なくとも同様な一つ以上のFcエフェクタ活性を有するし、FcRnに
対する結合性が増加したIgG変異株を得ることができる。
別の観点から、本発明のアミノ酸変更によって、例えばCDCまたはADCCのような
少なくとも一つの減少したFcエフェクタ活性を有する、FcRnに対する結合性が増加
したIgG変異株を得ることができる。
[表15]は本研究のIgG変異株に関する主たる結論を示している。
Ashkenazi A、Chamow SM. 1997、Curr Opin Immunol.;9(2):195-200
(i) VL、VHClおよびCH1領域から成るFab断片、
(ii) VHおよびCH1領域から成るFd断片、
(iii) 単一抗体のVLおよびVH領域から成るFv断片、
(iv) 単離したCDR領域、
(v)F(ab')2断片、2つの互いに連結されたFab断片から成る二価断片
(vi)抗原結合部位を形成することができるペプチド・リンカーによって結合されたVH領域とVL領域とを有する単一鎖Fv分子(scFv)、
(vii)二特異的(bispecific)な単鎖Fv、
(viii)遺伝子融合によって得られる「diabodies」または「triabodies」、多価または多特異的(miltispecific)な断片。
しかし、これらに限定されるものではない。
Claims (13)
- 親ポリペチドに比べてFcRnに対する結合性が増加し、Fc領域に少なくとも2つのアミノ酸の変異を有する、親ポリペチドの変異株であって、上記の少なくとも2つのアミノ酸の変異がFc領域の下記変移から成ることを特徴とする変異株:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸変異と、
(ii) 226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Yおよび434Sから成る群の中から選択され少なくとも1つのアミノ酸変異、
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方であり、(i)の変異は(ii)の変異と同じアミノ酸位置では起こらない) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せを有する請求項1に記載の変異株:226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、2591/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y、
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項2に記載の変異株:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項1または2に記載の変異株:
307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 変異株が抗体である請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異株。
- 抗体がIgG抗体である請求項5に記載の変異株。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株含む医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株をコードする単離された核酸。
- 請求項8の核酸を含むベクター。
- 請求項9のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項10の宿主細胞を培養して上記抗体を発現させる請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を作る方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を含む医薬品。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異株の医薬品製造での使用。
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