JP2012524522A - 最適化されたFc変異株 - Google Patents
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Abstract
【課題】
【解決手段】
Description
この変異株は親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加し、Fc領域中にも少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記核酸を含むベクターを提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の他の実施例では、上記宿主細胞を培養して核酸を発現させることから成る、ポリペチド変異株の生産方法を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬品を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は医薬品製造での本発明変異株の使用を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明はFc最適化変異株を識別する方法を提供する。
本明細書および特許請求の範囲でFc領域の残基の数の教え方は非特許文献12(Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991)に記載のKabat et al.,のEUインデックスに従った免疫グロブリン重鎖の教え方である。非特許文献12の内容は本明細書の一部を成す。「KabatでのEUインデックス」とはヒトIgG1 EU抗体の残基の数か方である。
「アミノ酸」とは特定の定義された位置に存在する20の天然または類似の非天然のアミノ酸を意味する。天然のアミノ酸は3文字または1文字暗号で略記できる:
「アミノ酸の変更」とはポリペチドのアミノ酸配列の変化を意味する。この「アミノ酸変更」は「アミノ酸変化」ともよばれ、アミノ酸の置換、挿入および/またはポリペチド配列の欠失を含む。「アミノ酸の置換」または「置換」とは親ポリペチド配列の特定の位置でのアミノ酸を他のアミノ酸と置換することを意味する。例えば、置換N434Sとは位置434でのアスパラギンがセリンと置換した変異ポリペチド、この場合Fc変異株を意味する。「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは親ポリペチド配列の特定位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入G>235-236とは位置235と236の間にグリシンを挿入することを示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは親ポリペチド配列の特定位置のアミノ酸を取り去ることを意味する。例えば、E294delは位置294でのグルタミン酸の欠失を示す。
E. A. Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91 -3242
(1) CPU MODE = ClustalW mp ;
(2) ALIGNMENT = full;
(3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers;
(4) OUTPUT ORDER = aligned;
(5) COLOR ALIGNMENT = no;
(6) KTUP (word size) = default;
(7) WINDOW LENGTH = default ;
(8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ;
(10) PAIRGAP = default;
(11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none;
(12) MATRIX = default;
(13) GAP OPEN = default;
(14) END GAPS = default;
(15) GAP EXTENSION = default;
(16) GAP DISTANCES = default;
(17) TREE TYPE = cladogram;
(18) TREE GRAP DISTANCES = hide
Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598
例えば、Fc領域は既存のアミノ酸突然変異、例えば付加、挿入および/または置換を有することができる。ただし、このミュータントはSPRアッセイに従った解離定数が実施例1のIV.1に記載のSPRアッセイで1microM以下でなければならならず且つ野性-型Fc領域ではない。
上記リストのいくつかのアミノ酸位置、すなわち226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434にはキーとなる重要な位置である。換言すれば、FcRnに高い結合能を示すFc変異株は少なくとも一つのアミノ酸突然変異を上記アミノ酸位置に有する。
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361 , 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389,390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412,414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443、444、445、446、447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起らない。
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される2つのアミノ酸位置での2つの突然変異と
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311 , 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359,360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411 , 412, 414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に起こらない)
(i) 378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434の群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 294, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え型はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に起こらない)
230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G1、298N1、299M1、299A1、299K1、301C1、302A1、303A1、3031、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、401G、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401のA 403T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T、416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N1、394A1、395A1、395S1、396S1、396L1、397A1、397M1、398P1、399N1、400P1、401A1、401G1、403T、404L、408T、411A1、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i) 226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つの突然変異と、
(ii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226G、230S代、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434S、より好ましくは226G、230S、230T、230L、241Lから、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Yおよび434Sから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i) 下記の群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R 230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I, 264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S1 327V1 330V1 342R1 347R1 352S1 361のD1 362R1 362E1 370R1 378V1 378T1 382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N1、416K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i) 下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せ:
250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rの中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
そこにおいて、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/294del 416K1/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yおよび378V/383N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i)下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389 K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315 D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、241のL/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
(i) 下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、
230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315 D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:227L、228R 226G、228L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、362R、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、370R、362E 378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
より多くの好ましい実施例において、親ポリペチドのFc領域は、ヒトIgGサブクラス(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)に由来する。他の好ましい実施例では、親ポリペチドのFc領域は野性-型IgG1 Fc領域(SEQ ID:NO1)、野生型IgG2 Fc領域(SEQ ID:NO2)、野性-型IgG3 Fc領域(SEQ ID:NO3)および野性-型IgG4 Fc領域(SEQ ID:NO4)から成る群の中から選択される。
Debis et al.,2002、Immunological Reviews 190 123-136
Ashkenazi A, Chamow SM. 1997, Curr Opin Immunol.;9(2):195-200
Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, pages 321 -350
以下から成る抗体が、特定の利子のある:
(a) 本発明のFc変異株および免疫グロブリンの可変部から誘導される以下の結合するポリペチド・領域の(b)一つ(すなわち、それは少なくとも一つのCDRから成る):
(i) VL、VHClおよびCH1領域から成っているFab断片、
(ii) VHおよびCH1領域から成っているFd断片、
(iii) 単一の抗体のVLから成っているFv断片およびVH領域;
(iv) CDR領域((v)F(ab)を単離した』)2断片(2つの連結されたFab断片(vi)一つの連鎖Fv分子(scFv)から成っている二価断片)
そこにおいて、
関連する2つの領域が抗原結合部位を形成することができるペプチド・リンカーによって、VH領域およびVL領域は連結される、(vii)bispecificな一つの連鎖Fv そして、(viii)「diabodies」または「triabodies」(多価性または遺伝子融合によって造られるμltispecificな断片)制限的でないこのリスト。
Minibodiesは、CH3領域につながれるscFvから成っている最小にされた抗体のようなタンパク質類である(非特許文献26(ここで引用したものとする)全体として)。
いくらかのケースにおいて、scFvは完全長のFc領域(非特許文献27は、引例によってここでその全部を取り入れた)につながれることができて、また、ヒンジ領域またはそれの断片を含むことができる。
Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061 De Lorenzo et al., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895
これらの抗体は、2(以上)まで異なるテストを結合する。
Diabodiesは、いろいろな公知技術である方法で製作されることができる非特許文献28が、引例によって全体としてここで結合した)、例えば、化学的に、調製されるかまたはハイブリドーマに由来する。
Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449
この種の抗体変異株は、キメラ抗体および/またはヒトらしくなられた抗体であってもよい。
一般に両方とも、「キメラ抗体」、そして、「抗体をヒト化した」複数の生物種から領域を結合する抗体に言及する。
例えば、「キメラ抗体」がヒト外の動物、一般にハツカネズミ(または、いくらかのケースの、ラット)および恒常部から伝統的に可変部から成ってからヒト。
ほとんどの場合、ヒト化された抗体が、キメラ抗体である‖それが、含む最小である
配列は、なしヒト免疫グロブリンから生じた。
一般に、ヒトらしくなられた抗体において、CDRs以外の、全抗体は、ヒト・オリ遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるかまたはヒト抗体にそのCDRs以外内に同一である。
CDRs(どちらがヒト外の生物から始まっている核酸によってコードされるかいくつかまたは全て)が、ヒト抗体可変部のbeta-シート・フレーム・ワークに、抗体をつくるためにグラフトされる、どちらが差し込まれたCDRsによって決定されるか、特異性。
例えば、この種の抗体の生成は特許文献13に記載されている;非特許文献28、非特許文献29に記載されている。ここでそれらの全部において引用したものとする全て。
そして、したがって、典型的に以下から成る:
ヒトFc領域。
ヒトらしくなられた抗体は、また、geneticallyな設計された免疫系を有するハツカネズミを使用して発生されることができる全体としてここで引用したものとする(非特許文献30Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654,)。
いろいろなテクニックおよびヒト外の抗体をヒト化して、作り直す方法は、公知技術である(非特許文献31、そこにおいて、全く引用される引例は、それらの全部の引例によって結合した)。非特許文献31〜非特許文献40には各種のヒト化方法が記載されているが、これらに限定されるものではない。これらの全部において引用したものとする全て。ヒト化またはヒト外の抗体可変部の免疫原性を減らす他の方法は、方法に新しい表をつけることを含むことができる、例えば非特許文献40に記載されているように全体として。ここで引用したものとする。
Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), Jones et al., 1986, Nature 321 :522-525 ; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 ; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 ; He et al., 1998, J. mmunol. 160: 1029-1035 ; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 ; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 ; Gorman et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 -4185 ; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969-973
「充分にヒト抗体」または「完全なヒト抗体」は、完全にヒト・遺伝子から始まっている配列から成っている抗体と称する。
いくらかのケースにおいて、これはここで概説される突然変異を有する人の染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体であってもよい。
あるいは、抗体の成分はヒト、しかし、単一遺伝子に由来しない。
したがって、例えば、1つの抗体からのヒトCDRsは、一つ以上のヒト抗体からの配列(例えば懸垂足場配列)と組み合わせられることができる。
例えば、いろいろなgermline配列は、ヒト抗体またはヒト懸垂足場を形成するために結合されることができる(例えばヒトらしくなられたかキメラの配列ために、その概略については特許文献14に記載されている。その本願明細書に引用したものとする)と同じ全体として。
この種の突然変異は、glycosylates、標識化および共役を含むが、これに限定されるものではない。
によってここで使用して「glycoformを設計した」炭水化物組成(すなわちFc変異株から成っているポリペチドに付けられる共有結合で)定める
そこにおいて、
前記炭水化物組成は、化学的にポリペチド親のそれと異なる。
設計されたglycoformsは、エフェクタ機能を改良するかまたは減らすことに特急列車以外のを含むいろいろな目的に役立ってはならない。
設計されたglycoformsは、異なる配列のいかなるアミノ酸でも取付けられることができる。
好ましい実施例の前記Fc領域のアミノ酸で取付けられるglycoformsアール。
(Potelligentななこと工学[ Biowa社、プリンストン、N.J. ];GlycoMAb?グリコシル化工学技術工学[ Glycart Biotechnology社、Zuerich、スイス])。
Umaa et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Potelligent (登録商標) technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb(登録商標) glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]
技術では周知のように、グリコシル化パターンは、タンパクの両方の配列に依ることができる(例えば特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無、論議された下記)、またはタンパクが生じる宿主細胞または生物。
特定の発現系は、下で論議される。
Nにリンクされたアスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の付着に言及する。
トリ-ペプチド配列N-X-セリンおよびN-X T、
そこにおいて、
Xが、P以外のいかなるアミノ酸でもある、N側鎖への炭化水素部分の酵素の付着のための認識配列である。
したがって、ポリペチドのこれらのtri-peptide配列のどちらでもの存在は、潜在的なグリコシル化サイトをつくる。
Oにリンクされたグリコシル化は、糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの1つの付着と称する、ヒドロキシアミノ酸、最も共通にセリンまたはTに5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンがまた、使われることができるにもかかわらず。
交互が、また、添加によって製造することができる‖または置換、一つ以上のセリンまたは出発することへのT残基が、そばに順番に配列する‖(Oにリンクされたグリコシル化サイトのための)。
容易さのために、所望のアミノ酸に並進するコードンが発生されるように、抗体アミノ酸配列はデオキシリボ核酸レベルにおける変更によって、特に予め選択された塩基で標的ポリペチドをコードするデオキシリボ核酸を変化させることによって好ましくは変えられる。
それらがN-およびO-linkedされたグリコシル化のグリコシル化資格を有する宿主細胞のタンパクの生産を必要としないという点で、これらの手順は有利である。
使われる連結モードに従い、糖は以下に付けられることができる:
(a) RおよびH、
(b) 自由なカルボキシル基、
(c) Cのそれらのような自由なスルフヒドリル基、
(d) セリン、Tまたはヒドロキシプロリンのそれらのような自由な水酸基、
(e) F、YまたはWのそれらのような芳香族残基、または、
(f) グルタミンのアミド基。
これらの方法は、1987年9月11日公開特許文献23および非特許文献48に記載されている。
化学物質脱グリコシルは、合成のtrifluoromethanesulfonicな酸または等価な化合物にタンパクの照射を必要とする。
結鎖糖以外の大部分のすべてのもの糖の開裂のこの治療結果(N- アセチルグルコサミンまたはN- アセチルガラクトサミン)、。その一方で、ポリペチドを手をつけていなくしておくこと。
化学物質脱グリコシルは非特許文献49、非特許文献50に記載されている。
ポリペチド上の炭化水素部分の酵素の開裂は非特許文献51に記載のように、各種endo-およびexo-glycosidasesの使用によって成し遂げられることができる。非特許文献52に記載されているように、潜在的なグリコシル化サイトでのグリコシル化は合成のツニカマイシンの使用によって防がれることができる。
ツニカマイシンが、形成をブロックするタンパク-N- グリコシド・リンケージ。
Hakimuddin et al., 987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 Edge et al., 1981 , Anal. Biochem. 118:131 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105
いくらかのケースにおいて、これらのアールは、抗体合着を考慮した。
用語「標識化基」は、いかなる検出可能な標識も意味する。
いくらかの実施例において、標識化基は、ポテンシャル立体障害を減らすために種々の長さのスペーサ・アームを経た抗体に連結する。
標識化タンパク質類ための種々の方法が、公知技術であって、本発明を実行する際に、使われることができる。
a) タグ。そして、それは、放射性があるか重質同位元素であってもよい;
b) 磁気の標識(例えば磁気の粒子);
c) レドックス活性部分;
d) 光学の触媒酸化;
酵素の基(例えばワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ);
e) biotinylatedされた基;
そして、
f) 第二のリポータによって認識される所定のポリペチド・エピトープ(例えばロイシン・ジッパー一組配列、第二の抗体のための結合部、領域を結合している金属、エピトープタグ、その他)。
蛍光団は、どちらの螢光性の「小分子」蛍光剤でもまたは蛍光剤タンパク質類であることができる。
「標的抗原」によってここで使われる、特異的に与えられた抗体または免疫グロブリンの可変部によって縛られている分子を定める。
標的抗原は、タンパク、炭水化物、リピドまたは他の化学化合物であってもよい。
実質的には、いかなるテスト(例えば膜タンパク質)も、目標とされることができる成るしかし、RhDテストへの特急列車でなく、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71 (トランスフェリン・リセプタ)、CD80、CD86、CTLA-4、CD147、CD160、CD224、リセプタErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4(EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)、VEGF-R1、VEGF-R2、IGF-FM 1つのPIGF-RのErbB科へのそれらの私有物のような生長因子レセプタ、
MHC綱IおよびMHC綱Il分子(例えばHLA-DR、IL-1 Rのようなインターロイキンレセプタ、IL-2Rα)IL-2RβおよびIL-2Rガンマ、IL-6R、Mのようなホルモンレセプタ?llerianの抑制する物質型Ilリセプタ、LDLリセプタ、NKp44L、CXCR4およびCCR5のようなchemokineリセプタ、インテグリン、CD2のような接着分子、ICAM、EpCAM。
膜タンパク質も、GD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16のような腫瘍マーカーを含む、carcinoembrionicなテスト(CEA)、Tn、グリコプロテイン72、PSMA、HMW-MAA。
本発明の抗体は、また、サイトカインに特急列車以外のを含む可溶タンパクを目標とすることができないchemokinesに、成育因子はVEGF-Aが好きである、(たとえばIL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFベータ、TNFα、IFNガンマ)EGF、PIGF、PDGF、IGF、ホルモン、細菌毒素および他のボツリヌス毒素のようなオリ遺伝子、リシン、B.のトキシンanthracis感染防御抗原、B. anthracis致死因子、B. anthacis水腫因子、shigatoxins 1および2(異なるウィルスからのウイルス性テスト)例えばFVIII阻害抗体を含む病原ウイルス(阻害抗体)。
この場合、親ポリペチドは、以下から選択されることができる:EMAB6またはEMAB603(WO2006064121参照)(RITUXIMAB(Rituxan?(IDEC/ジェネンテク/ロシュ)))(特許文献24参照)、例えば、引用したものとする全体として)、HUMAX.ctheta.-CD20(全体として引用したものとする特許文献25に記載されている)AME-133(Molecular Evolutionを加えた)(hA20(Immunomedics社))HumaLYM(Intracel)、そして、PRO70769‖(特許文献26(「免疫グロブリン変異株およびUses Thereof」と名付けられる)全体として引用したものとする)。
最適化されることができる最も好適な性状は、インビボでの半減期である。
増加するインビボでの半減期を表示するために、変異株はより低いpH(例えばエンドソームと関連があるpH)で、増加する結合能をFcRnに示さなければならない例えばpH 6.0より高いpH(例えば7.4.)で減少する親和性を維持すると共に、通常の解除速度以外のエンドソームに増加する結合をFcRnに許す(非特許文献53);
Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180 Gurbaxani et al., 2006, MoI Immunol. 43(9):1462-73)
1つの追加の実施例において、変異株はヒト・アクティブにしているFc.γ.Rのための改良された親和性を所有するために最適化される、好ましくはプロフィルを結合しているFcRnに加えてFc.γ.Rllla。代替の実施例において、変異株はFcRnのための親和性を増やして、ヒトFc.γ.Rのための親和性を増減したために最適化される、特急列車以外のFcγRI、FcγRlla、FcγRllb、FcγRllcおよびFcγRlllbにそれらのallelicな変異を含むことを含まないこと。
他の実施例において、本発明の変異株は、そのポリペチド親と比べて、更に増加するCDC活性を有することができる。
好ましい実施例の前記標的抗原を運ぶ的状赤血球を殺すために用いる抗体変異株アール(例えば癌細胞)。代替の実施例において、変異株はブロックに慣れているか、敵対行動をとるかまたは標的抗原を苦しめる、例えば、バクテリアまたはウィルスのような感染因子またはトキシン(例えば細菌毒素)を中和するために、サイトカインまたはサイトカイン受容体に敵対するための。かわるがわるに好ましい実施例において、変異株はブロックに慣れていて、敵対してまたは標的抗原を苦しめて、標的抗原を運ぶ的状赤血球を殺す。
ガンの例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫(脂肪肉腫を含むこと)を含むが、これに限定されるものではない、神経内分泌腫瘍、中皮腫、schwanoma、髄膜腫、腺癌、メラノーマおよび白血病およびリンパ性悪性。治療されることができる他の条件は、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、Sjorgrenの病気を含むが、これに限定されるものではない、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびallergenic条件、移植片対宿主疾患、など。
(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980が、引例によって全体としてここで結合した)。この種の医薬品組成物は、困っている時の患者を治療することを前もって別になっている。
局所化された出産対完全長の技術(タンパク劣化のための適応)では周知のように、そして、加齢、ボディー重量、公衆衛生、性、食餌、投与の時間と同じ、新しいプロテアーゼ合成の速度条件の医薬品相互作用および厳しさは、必要でもよい、そして、ルーチン実験については当業者によって確かめられる。
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold SPRing Harbor Laboratory Press, New York, 2001 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)
Gordon et a/., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A.;77:7380-4
Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold SPRing Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993) Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292: 154-156 Ryan et aL, 1997 Science; 278: 873 - 876 Cibelli et_a/., 1998 Science, 280 : 1256-1258
次の工程から成っている前記方法:
(i) 核酸の発現によってFc変異株を生産しているFc変異株
(ii)をコードする一組の核酸から成っている核酸ライブラリを発生することは、中で成った‖前記ライブラリ
(iii) 段階(ii)(Fcリガンドに結合することが可能であるそれら)において生じるFc変異株の中で選ぶこと
(iv) Fc変異株の結合する性状を測定することは、Fcリガンドのための1つのFcコントロールの段階(iii)およびそれにおいて選んだ、そして、
(v) Fcリガンドのための増加する結合を表示するFc変異株を選ぶ前記Fcコントロール
ここで使用しているように、そばに、「核酸一次構造を変える」突然変異(例えば挿入、欠失または与えられた核酸一次構造のヌクレオチドの置換)のはじめにを定める。この種の突然変異は、従来技術の周知の方法によって実行されることができる。
これらの方法は、ランダムな突然変異生成、部位特異的突然変異、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成を含むが、これに限定されるものではない。
この種のランダムな突然変異生成は、全体として引用したものとする特許協力条約出願WO0238756に記載されている。それゆえに、ライブラリは1つの一つのRNA依存性DNAポリメラーゼについては発生される副ライブラリの混合または材料にて説明したように、RNA依存性DNAポリメラーゼおよび本出願の例の方法一部の指定された化合によって発生されることができる。
それらも、従来技術に記載されているFc変異株と称する(本出願の第1の一部が関連技術の説明に捧げた上記は、例のために見える)。より好ましくは、約2から約100のプレ最適化された変異株まで、プレ最適化されたFc変異株のプールは、いくつかのポリペチドから成る。
Smith, Science, 1985, 228: 1315
Fc変異株-Fcリガンド錯体を発生すること、そうすると、結合したFc変異株を束縛を解かれたFc変異株から切り離すこと。この分離段階を実行するために、Fcリガンドは、固体担体に有利には固定されることができるかまたは固体担体に段階(iii)のプロセスの間、固定されることが可能でなければならない。この種の手順の例は、本出願の実施例 1に記載されている。段階(iii)が、好ましくは選抜のいくつかの円から成る‖それ‖最も効果的なFcリガンド(実施例 2は、図のために見える)を識別する可能にする。
例えば、当業者は該当するELISAを実行することができる。
その特定の信号が少なくともFc親のそれより強い1.2-倍である場合、変異株は選択される。
該当するELISAアッセイは、単離されたFcにまたは例Ilにて図示したように、ファージに、そして、本出願の例IVにおいて表示されるFcに実行されることができる。
変異株が解離定数を有する場合、3-折り目がそれからそれからFc親のそれを下げて前記変異株段階(v)の選ぶ。
Fc-WiId-型と比較してFcRnに対する結合性が増加するするFc変異株の同定と、その変異株の結合性の特徴付け
I.材料と方法
I.1 ヒトFcRnの発現および精製
バクロウイルス系を使用して可溶性ヒトFcRnの発現を非特許文献62に記載のGTP Technology(Labege、フランス)によって実行した。
Popov et al., MoI. Immunol. 33:521 -530 (1996)
Fcポリペチド(ヒトIgG1重鎖(SEQ番号1) (Poul MA et al., Eur. J. Immunol. 25(7):2005-2009 (1995)に由来するアミノ酸残基226-447(KabatでのEUインデックス)をコードするヒトFcライブラリを標準的なPCRを用いてBamHI/EcoRI断片としてのファージミドベクターpMG58(pMG58_Fc226(図1))にクローンした。このベクターは[図1]に示した。複数の完全にランダム化したライブラリはMUTAGEN(登録商標)(特許文献28)を使用して作った。これは低忠実度のヒトDNAポリメラーゼ(ムターゼ)を用いて標的配列全体に突然変異を均一かつランダムに導入する方法である。
Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007) Emond et al. Protein Eng. Des. SeI. 21 : 267-274(2008)
ヒトFc遺伝子(Fc遺伝子)を5'−プライマMG_619:5'-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGCS−3'(SEQ ID番号5)および3'−プライマMG_621:5'-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(SEQ ID番号6)を使用しているムターゼでダブル複製した(BamHIおよびEcoRI制限サイトには下線を引いた。イタリック部は非特異性テイルに対応する)。0.6.μgの鋳型としてのpMG58_Fc226プラスミド(Mut1ライブラリ用の野生型FcまたはMut2ライブラリ用のFc変異株)と、プライマMG_619およびMG_621(それぞれ25OnM)と、適切な複製緩衝液(下記に詳述)とを含む混合物を95℃で5分間処理した後、直ちに4℃まで冷却してDNA鎖の特性を変性させる。Polβの場合の複製緩衝液は5OmMトリスHCl pH 8.8、1OmM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび1%(v/v)グリセリンである。polη(またはpolηおよびpolι) 場合の複製緩衝液は25mMトリスHCl pH 7.2、5mM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび2.5%(v/v)グリセリンである。変性段階後、突然変異誘発性複製を50μM dATP/dCTP、100μM dTTP/dGTPおよび1μgのpolβまたは100μM dNTPs、1μgのpolη(またはpolηおよびpolι、各1μgのムターゼ)を加えて行った。複製反応は37℃で2時間行った。それから複製生成物を脱塩し、ミクロコムカラム(ミリポア)で濃縮したに濃縮した。
上記で得られた複製生成物はテイルプライマを用いた選択的PCRによって増幅した。プライマ(MG_619およびMG_621)はムターゼによって合成されるDNA断片の特異的増幅ができるように鋳型に非相補であるテイルを用いて設計した。PCR緩衝液(2OmM Tris-HCl pH 8.4、5OmM KCl)、1.5mM MgCl2、10pmolの5'および3'プライマ、200μμM-dNTPsおよび1.25 U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(InvitroGen)を含む混合物に複製生成物画分を加えた。PCRサイクルは以下のとおり:第1サイクル:94℃で2分、64℃で10秒、75℃で30秒、94℃で1分、および30の選択サイクル:94℃で20秒および75℃で30秒。
上記で作った各ライブラリの品質を細胞上のPCRで査定した。Fc遺伝子(5'−プライマ、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'(SEQ ID番号7)および3'−プライマ、5'-TCACGTGCAAAAGCAGCGGC-3'(SEQ ID 番号8)を増幅し、高速シークエンシングした(5'−プライマ、5'-TGATTACGCCAAGCTTGC-3'(SEQ ID 番号9)。各ライブラリからランダムに採った96のクローン配列を(Mut1.4〜Mut1.1、Mut2.2〜Mut2.1)を決定した。最後に、プールしたライブラリMut1の35のクローンとプールしたライブラリMut2の86のクローンもシークエンシングして選択プロセスの前に最終ライブラリの品質を制御した。
Mut1ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり6.3の突然変異であり、これは遺伝子(666nt)当たり4.2の突然変異があることを意味する。これらの突然変異の中で、81.4%は置換でり、16.8%は欠失であり、1.8%は付加であり、最後の2つのカテゴリは遺伝子にフレームシフトをさせる。フレーム中の配列だけを考慮すると、突然変異体頻度は1kb当たり4.0の突然変異であり1遺伝子当たり2.7の突然変異である(遺伝子当たり1〜6つの変化したヌクレオチド)。また、タンパクレベルでライブラリの活性部分を決定することで突然変異の解析をさらに行った。最後に、Mut1ライブラリは28.6%の野生型断片(非変異または、サイレント変異)を発現したクローン、40.0%のフレームからの配列またはストップコードン(非発現)を含むクローン、31.4%の変異した配列(Fc変異株)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均2.3の変化したアミノ酸を有する3.5×106の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を表す。
Mut2ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり4.5の突然変異であり、これは遺伝子当たり3.0つの突然変異に壮途うする。これらの突然変異の96.3%は置換であり、3.2%は欠失であり、0.5%は付加である。フレーム中の配列だけを考慮した場合、突然変異頻度は4.3/kbであり、遺伝子当たり2.9の突然変異である(1遺伝子当たり1〜7つのヌクレオチド変化1)。Mut2ライブラリはタンパクレベルで17.4%の野生型断片(非変化またはサイレント突然変異)を発現するクローンを含み、9.3%のフレームからの配列またはストップコードン(非発現)を含むクローン、73.3%の変化した配列(Fc変異株)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均して1.9の変異aaを有する1.5×107の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を有する。
Fcライブラリを標準的手順(Smith GP, Science 228: 1315 (1985))を使用してファージM13の表面で発現させた。E. Mut1ライブラリ(pMG58ベクター)を含む大腸菌XL1-Blueバクテリアを、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlテトラサイクリンおよび1%(w/v)グルコースを補った60mlの2YTでOD600nm=0.6に達するまで230回転数/分で3O℃で成長させた。それからら細胞を37℃で20分間、M13ヘルパーファージ(M13KO7、Biolabs、バクテリア/ファージ比=1/3)に感染させ、ファージFcの生産を2YT/アンピシリン/グルコース(0.5mM IPTGおよびカナマイシン30μg/ml)中で230回転数/分、26℃で一晩続けた。次の日、ファージを標準プロトコールを使用してPEG6000中に沈澱させ、1mlのリン酸緩衝液(pH6、(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH6.0、P6をよばれる)に再懸濁させ、XL1-Blue細胞を感染させて滴定した。上記の3つの選択戦略を異なる条件を使用して適用し(図2)、1つの戦略に対して選抜を3〜8ラウンド実行した(下記参照)。
固相選抜のために、P6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で4×1011ファージをMaxisorp免疫プレートの8つのウエルで培養した。各ウエルには予め0.5μgのニュートラビジン(neutravidin)、0.5μgのビオチニル化(biotinylated)FcRn(戦略1)または0.5μgのFcRn-p3(戦略2)を塗布し、P6中の5%脱脂乳でブロックした。
37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween 20で20回洗浄し、10OμlのpH7.4のリン酸緩衝液で37℃で2時間、培養溶出した(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH7.4)/ウエル。滴定後、溶出したファージを用いて指数的に増殖したぺXL1-Blueバクテリアを10ml 再感染させ、固体2YT培地/アンピシリン/グルコースに塗布した。次の日、細胞を15%グリセリンを含む2YT培地に掻き取り、凍結し、80℃で保存した。
液相での選択では最初に4×1011のファージを1mlのP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で低攪拌下に室温で1時間、25OnMまたは10OnMのビオチチル化したFcRnで培養した。予めP6中の5%脱脂乳でブロックしたストレプトアビディンで被覆した磁気ビーズ(Dynal)を室温で30分間、ファージに加えた。このファージ−ビーズ錯体を磁石を使用してP6/0.1% Tween 20で15回洗浄した(磁気粒子選鉱機(Dynal))。ファージを室温で2時間、500μlのpH7.4リン酸緩衝液(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH 7.4)中に培養溶出した。ビーズは磁石を用して捨て、上澄中に溶出したファージを集める。滴定後、溶出したファージを用いて10mlの指数的に増殖するXL1-Blueバクテリアを再感染し、その後、固体2YT培地/アンピシリン/グルコース上に塗布した。次の日、細胞を15%グリセリンで2YT培地に掻き取り、凍結し、次の選択ラウンドまで-80℃でストックした。
スクリーニング・プロセス(MS1およびMS2)では、各戦略のために、ラウンド3〜8から、48〜96のクローンを細胞のPCR(l.2-cで説明)後、配列決定した。配列解析は選択したFc変異株を迅速に分析するために内部開発しMilleGen社のソフトウェアAnalyseFcを使用して実行した。Fc変異株はそれを単離した選択ラウンドに従って名前を付けた(Mut1スクリーニング用:戦略1用にはB3A〜B6A、戦略2用にはS3〜S6A、戦略3用にはL3A/B〜L6A-F、Mut2スクリーニング用には戦略1用にC3A〜C8A、戦略2用にT3A 〜T8A、戦略3用にM3A/B)。数(1〜96)はシークエンシング用PCRプレート上の場所を示す。最後に全選択プロセス中に、227の異なる変異クローンをMut1のために単利し、Mut2のために223の異なる変異したクローンを単離した。これら全てのクローンはファージ−ELISAアッセイを使用して特徴付けた。
MS1で単離した改良型のFc-変異株の配列解析から、多数のクローンが類似した突然変異(N434Y、N434S、P230S、P230T ...)を含むことが明らかになった。付随する突然変異の効果をs綺羅かにするために、目標突然変異生成(directed mutagenesis)を行ってこれらの突然変異を除去した。これらの新しいミュータントは親のクローンの名前の後にAまたはBを付けて命名した。61の新しいミュータントをテストした。これらのミュータントは[表1]に示す。ポジティブとみなされるこれらミュータントはファージ−ELISAアッセイでFc−WTより1.2〜2.6-倍高い特異信号を有する(下記参照)。MS2後にヒンジ領域に1つまたは2つの突然変異を加えて、標的突然変異生成によっていくつかの新しいミュータントを構築した(P230SまたはP228LまたはP228RまたはP228L/P230SまたはP228R/P230S)。これらのミュータントは親クローンの名前の後に文字(A〜G)を加えて命名した。24の新しいミュータントをテストし、[表5]に示した。
MS1、MS2で単離した変異株のファージで表された結合特性を、ウエルに塗布したFcRn-p3でELISAテストを用いpH6.0で決定した(図3)。簡単に言うと、ヘルパーファージM13K07に感染させた2YT/アンピシリングルコース中の800μl倍養液中に6-ウエルプレート上で単離したクローンとしてファージFc変異株を作った(パラグラフ3で説明した方法)。26℃で一晩かけて製造したファージを30分間300Ogで遠心分離して上澄中に回収した。この上澄をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20に直接希釈(1/2および1/4)し、予め0.25μgFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プレート上でテストした。37℃で2時間培養の後、ウエルをP6/0.1%Tween-20で3回洗浄し、結合したファージをHRP抗M13抗体(GE Healthcare)で検出した。
5'プライマ5'-CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC-3'(SEQ ID NO:10)
5'プライマ5'-GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTG GTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAG-3'(SEQ ID NO:1 1)
(BamHIおよびEcoRI/制限サイトには下線を引いた。灰色は突然変異コードンに対応する)
MS1(S5A_41)の最高変異株と比較してFcRnに対してより良い結合性を有するMS2のFc変異株を[表5]に示す。
Fc−H変異株と同じFc−WT配列およびMS1およびMS2で単離したFc変異株は、BamHIおよびE.coli制限サイトを使用してpMG58 フアージミド(ファージmid)ベクターからpMG62ベクターにサブクローン(subクローン)し、精製用のC末端6xHisタグとELISAアッセイでの検出用V5タグとを有する可溶性周辺質(periplasmic)発現ができるようにした。組換え型Fcポリペチドの生産はHB2151大腸菌株において実行した(200℃で16時間、0.5mM IPTGで誘導)。精製は標準プロトコルを用いてNi-NTA上で実行し、各ポリペチドの約200-500μgを得た。
IV.1. Fc_WTと比べたS5A 41、S3A 07およびFc−H変異株のFcRn結合特性
IV.1.a ELISAアッセイ
可溶性フォーマットで産生したFc変異株の結合特性をウエルを被覆したFcRn-p3でpH6.0でELISAテストを使用して決定し、Fc−WTと比較した。P6/5%脱脂乳/0.1%Tween-20に連続的に希釈した精製Fc変異株(IIIに記載)をMaxisorp 免疫プレートでテストされた。この免疫プレートは予め0.25.μgのFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6の5%脱脂乳でブロックした。37℃で2時間培養後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗浄し、結合したFc-変異株をHRP抗V5抗体(invitroGen)で検出した(OD450nmの測定)(図5a)。ELISAテストは、S5A_41、MS1の最高変異株およびS3A_07、Fc−H変異株に均等な変異株、Fc−H変異株で実行した。これらのELISAテストによってFc−H、S5A_41、S3A_07がFc−WTと比較してFcRnに対する結合性が改善することを確認した(図5b、図5c、び図5d)。各結合曲線ではFc−WTと比較したFc変異株の結合特性を示すために、曲線の50%飽和でのFc濃度(EC50)の測定値を用いた。得られた比から、S5A_41がFc−H変異株より良い結合剤性を示し、S3A_07がFc−H変異株に匹敵することが確認された(表6)。
Fc変異株と固定されたFcRnとの相互作用をCM5センサーチップ(Biacore, GE Healthcare)を使用したBIAcore X100機器を用いてモニターした。この方法は上記でFc-FcRn相互作用を分析するために記載したものと同様である(Popov S. et al., MoI Immunol. 33(6):521 -530 (1996))。組換え型可溶性FcRnをアミン-カップリング化学を使用したセンサーチップのフローセル2にカップリングさせた。フローセルは0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.1Mの3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル- N-エチルカルボジイミドの1:1混合物で30μl/分の流速3分間慣性化した。組み換えヒトFcRn(10mM酢酸ナトリウム中に5μg/ml、pH 5.0)を10μl/分で2〜8分間、フローセル2に注入し、結果は表面密度を1200〜1300応答単位(RU)となった。表面は1M− エタノールアミン-HCl、pH 8.5を3-分間注入してブロックした。フローセル1はFcRnを含まないコントロール(対照)として使い、同じサンプルフローセルと同様に調整した。このブランクフローセルからのデータをサンプル・データから引いた。
表6は、 (i)ファージELISA、(ii) ELISAおよび(iii) SPRによってFc−WTと比較した変異株S5A_41、S3A_07およびFc−HのFcRn結合能力を示す。全てのケースで変異株S5A_41はFc−WTより大幅に高い能力を示した。
IIIuに記載の方法でMS2のいくつかのFc変異株を作った。各変異株のFcRn結合能力を上記IV.2.bおよびIV.2cに記載の(i)SPRおよび(ii) ELISAによって分析した。
ELISAおよびSPRアッセイから、全てのFc変異株はFcRnに対して野生型Fcより良い結合性を示すことが示され、これはファージFc変異株でのELISAアッセイで得られた全館の結果と一致した。pH=6でのMS2変異株のKd値は5.2〜22.7nMであり、これはFc−WTと比べて親和性が1.3〜5.8倍増加することに対応する。
本発明のFc変異株を得るために導入したアミノ酸変更によってpH 6.0でFcRnへの結合をFc−WTのそれと比較して大幅に増加でき、pH 7.4での結合は極めて低くしたままにすることができると結論できる。
Fc変異株ベースのIgG変異株の製造と、このIgGの生物学的特徴
I. IgG変異株の発現
1.1. ベクター構築
Fc変異株C6A_69;C6A_78;T5A_74;C6A_74;C6A_60およびC6-A66を、YB2/0細胞系での抗CD20特異性を用いたIgGフォーマットで調製した。比較のために、野生型Fc(IgG−WT)をベースにしたIgGも作った。
YB2/0の細胞系の生産性を最大にするために、完全長の重鎖および軽鎖cDNAおよび変異株をコードするFc断片をRattus norvegicusに対するコードン最適化で合成した。暗号スプライシングサイトや制限サイトのような不必要な特徴は除去した。、変数/恒常部結合には制限サイト(Apal)のみが存在する。
Fc変異株はHKCD20-Opti-GAに存在する野生型IgG1Fc断片を適当な変異に代えることで調製した。これをApalとAscl制限サイトの間でクローンした(図8a)。
全ての断片クローニングは従来バクテリアのトランスフォーメーションの古典的な消化/ライゲーション手順で行った。発現構造物は酵素消化にPCRを加え、シークエンシングして確認した。
YB2/0細胞系(ATCC(CRL-1662))の5.106細胞を各発現線形ベクターと一緒にで電気穿孔し、RPMI 1640媒体+5% v/v透析FCS(InvitroGen)中に25,000細胞/mlに希釈し、1ml/ウエルで24-ウエルに分けた。3日後に細胞を回収し、ジエネティシン(geneticin)(Invitrogen)を最終0.5g/L、濃縮MTX(シグマ)を最終25mM、2ml/ウエルで加えることによって選択圧を加えた。11日間の培養後、耐性細胞は各々8つの構造物用(選択されたIgG MS2変異株、IgG−WTのコード用)に集め、DMEM媒体+5% v/v Ultra-lowIgG FCS(InvitroGen)で希釈し、0.9Lの細胞懸濁液の含む2L-ローラボトルの各々を2サイクル/分で培養する。細胞は成長し、死ぬ(4〜5日)。その前に上澄を回収し、低速度遠心して清浄し、容積を減し、Pellicon XL Filter(ミリポア)で限外濾過する。
濃縮した培養上清はをHiTrapプロテインA FFカラム(GE Healthcare)に注入した。結合した抗体はpH 3.0の0.1M−クエン酸ナトリウム緩衝液で溶出させ、各画分を1mlの溶出緩衝液当たり100μlのpH 7.5の1M−トリスを使用して中和した。抗体を含む画分を集め、PBS pH 6.0で透析し、サンプルを滅菌濾過(0.22ナノメートル)し、4℃で保存した。
精製したIgGをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で非還元性および還元性条件下で特徴付けた。クマシー青色染色(Coomassie Blue-stained) ゲルから、全ての突然変異で、IgGは95%以上の均質性で精製され、各IgGに対する特徴的な重鎖および軽鎖バンドが示された([図8]および[図8c])。
FcRnへのIgG変異株の結合特性を (i) ELISAアッセイ、(ii) SPRおよび(iii) 蛍光ラベ化したRituximab(抗CD20IgG)の存在下で先端を切ったFcRnを発現するJurkat-細胞株を用いた結合競合アッセイの3つの別々のテストで決定した。
III.1a 材料および方法
Y2B/Oで産生したIgG変異株の結合特性をウエルに被覆したFcRn-p3でpH6.0でELISAテストを用いて決定した。比較のためにIgG−WTでもELISAアッセイを実行した。
精製したIgG変異株をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween-20を用いて連続的に希釈し、予め0.1μgのFcRn-p3/ウエルで被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プレートでテストした。37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗浄し、結合したIgG変異株をHRP Fab'2ヤギ抗ヒトFab'2(Interchim)で検出した。
各IgG変異株に対して結合したFcRnの百分比をIgG-変異株の濃度(log)に対してプロットした。得られた各結合曲線で、曲線(EC50)の50%飽和に関連するIgG濃度の測定値を決定し、WT-IgGのEC50と比較した。
ELISAテストの結果は、産生したIgG変異株はがWT-IgGと比べて、FcRnに対する結合性か増加することを示している。この事実は結合曲線([図9]参照)およびEC50値から明らかである。
下記の[表9]に示すように、IgG-変異株のEC50は野生型IgGより少なくとも5.8-倍以下低い。最大EC50はC6A_69変異株で得られる。
lll.2.a 材料および方法
IgG−WTおよびIgG変異株の固定したヒト組換え型FcRnとの相互作用をBIAcore X100機器(GE Healthcare)を用いて表面プラスモン共振(SPR)検出によってモニターした。実験のプロトコルはFc変異株(パラグラフIV.2b参照)で親和性を決定するのに使用したものと同様である。
各注入で観測される平衡RUをFc濃度に対してプロットした。平衡Kd値はBIAevaluationソフトウェアに含まれる安定親和性モデルを使用してプロット線の解析によって得た。動力学的パラメータはモデル1:2で解離相と会合層のデータをグローバルフィッテングして決定した。
ヒトFcRnに対するIgG−WTの結合能(Kd値)は78,3nMであった。[表10]に示すように、6つのIgG変異株 Kd値は10.5〜18.8 nMで変動し、これはFcRnへの親和性がpH 6.0でのIgG−WTのそれと比べて4〜7倍増加することを示す。
lll.3.a 材料および方法
IgG−WTおよび変異株のFcRnとの相互作用の能力を評価するために、Dall'Ozzo達が記載の方法(Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos P, Watier H, Thibault G, Cancer Res., 2004 JuI 1 ;64(13):4664-9)の変形法で競合免疫蛍光法アッセイを実行した。
簡単に言うと、IgG−WTおよび変異株をPBS pH6に希釈して最終濃度を0,06〜2mg/mlにし、Alexa-共役 Rituximab(ラベル化Rituximab)の存在下で、50μg/mlの濃度でJurkat FcRn(150000セル)と一緒に培養する。20分後、細胞をフローサイトメトリで分析して、結合したAlexa-共役 Rituximabを定量する。結果は平均蛍光強度(MFI)の百分比で表される。100%は Alexa- Rituximab単独(すなわち競争なし)で得られる平均蛍光強度(MFI)であり、0%はJurkat FcRnがAlexa-共役 Rituximabと一緒に培養されなかった時の測定MFI値である。各実験は3回行った。
コントロール(対照)は(i) ラベル化なしのRituximabまたは(ii)IgG−WTの培養から成る。
[図11]にいくつかの結果を示す。この図では本発明およびJurkatFcRnの各種変異株の結合またはRitixanを上記の「材料および方法」に記載のようにして決定し、平均蛍光強度(MFI)値で表してある。
下記の[表12]に示すように、本発明の変異株で得られるIC50はWT-IgGにで得られるそれに比べておおははに低い。本発明のIgG変異株のIC50の減少度はC6A_66を除いて40〜60-倍である。
FcRnへのIgG変異株の結合特性を特徴付けるために実行した3,の別々のテストは一貫した結果を与えた。全てのケースで本発明のIgG変異株はFcRnに対してIgG野生型のそれと比べて結合性か大きく増加した。
Fcγリセプタを結合するIgG変異株の能と、そのADCCおよびCDC活性をアッセイしてその生物学的機能を完全に特徴付けた。
IV.1a. ELISAアッセイ:固定した組換え型hFcγRIIIAに結合するIgG変異株の結合性
ヒト組換え型FcγRIIIA(F158アロタイプ)をEZ-link NHS-PEOキット(Pierce)でビオチン化し、アッセイ緩衝液(25mMトリス、150mM- NaCl、pH 7.35、0.05% Tween-20、0.1% BSA)中に1μg/mlに希釈し、react-bind(登録商標)ストレプトアビ遺伝子 ELISAプレート(Pierce)上に塗布し、室温で2時間培養した。この培養中に、5μg/mlのIgGと2μg/mlのワサビペルオキシダーゼでラベル化したF(ab')2抗ヒトF(ab')2(Jackson ImmunoResearch)とを室温で2時間混合して、緩衝液中にIgG-F(ab')2抗-F(ab')2錯体が作られる。一連の希釈をした錯体をプレートに加え、室温で2時間穏やかに振盪して培養する。プレートをアッセイ緩衝液で洗浄した後、hFcγRIIIAへ結合した錯体をTMB(Pierce)で検出した。450nmでの吸光度をプレートリーダ(Tecan)を使用して読んだ。
各IgG変異株に対して結合したFcγRIIIA(OD450nmから得られる)の百分比をIgG-変異株の濃度に対してプロットした。
[図10]に示すように、、hFcγRIIIAへのIgG変異株の結合性はhFcγRIIIAと結合しない変異株C6A_66を除いて、IgG−WTのそれと同様である。
天然キラー細(NK細胞)は健康なドナーの抹消血液からMiltenyi社が開発したネガティブ減損法を用いて精製した。ADCCテストでは異なる濃度の抗CD20抗体の存在下で、CD20リセプタを発現するRaji株の標的細胞と一緒にNK細胞を培養する。16時間培養した後、抗CD20抗体が誘導した細胞毒性をクロマトグラフで測定し、溶解した標的細胞が開放した細胞上澄中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と呼ばれる細胞内酵素のレベルを定量する。結果は[図12]に示してある。
特異的リーシス(溶離)の結果、リーシスパーセントが抗体濃度の関数として表される。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)はPRISMソフトウェアを使用して計算した。対照実験は (i) Rituximab、(ii) Y2/0細胞およびLFB-R603中に産生されるWT−IgGを用いて実行した。LFB-R603がADDC機能を有する抗CD20抗体であることは下記文献の記載の通り公知である:de Romeuf et al. in 2004 (de RomeuFc, Dutertre CA, Le Garff-Tavernier M, Fournier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens CK, Beliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Beral H。すなわち、慢性リンパ球白血病細胞はFcγRIIIA/CD16の改良のために選択した抗CD20モノクローナル抗体で能率的に殺される:Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43)。また、特許文献13(国際特許第W02006/064121号公報)にも記載されている。
C6A_69、C6A_60およびC6A_74はIgG−WTと比べてADCC活性が増加する点に注意する必要がある。他の変異株(すなわちC6A_78およびT5A_75)はIgG−WTのそれと同様なADCC活性を有する。
こここでは、標的CD20+Raji株の細胞を、補助ソースとしてのベビー・ウサギ漿液(Cedarlane参照番号CL3441、希釈度1/10)の存在下で、抗CD20抗体の異なる濃度(0〜5000ng/ml)で培養した。37℃で1時間培養後、溶解した標的細胞によって上澄中に開放されたLDHの量をクロマトグラフ (Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit)で測定し、抗体を介した補体依存性細胞毒性を定量した。結果は細胞溶解の百分比で表しした。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)およびEmax(最大細胞溶解百分比)はPRISMソフトウェアを使用して計算した。
[表14]は各変異株で得られたEmaxおよびEC50を示す。CDC活性レベルはIgG変異株によって変化する。C6A_78およびC6A_60はIgG−WTよりかなり高いCDC活性を示す。C6A_69、T5_74およびC6A_66のCDC活性は低い。C6A_74変異株のCDC活性はIgG−WTと同様である。
Y2B/0細胞株が産生する組み換え型の6つの本発明のIgG変異株はIgG−WTと比べてFcRnリセプタに対して結合性が増加する(同じ宿主細胞で同じ条件下で)。
本発明のIgG変異株は、FcgRIIIとに少なくとも同じ結合能を有し、IgG−WTと少なくとも同じADCC活性を有するする(但し、FcgRIIIに対する親和性が悪いC6AA_66は除く)。
IgG変異株は別々のCDC活性を示す。
いくつかの観点から、本発明によるアミノ酸変更によって対応する親IgG(例えばIgG−WT)と少なくとも同様な一つ以上のFcエフェクタ活性を有するし、FcRnに対する結合性が増加したIgG変異株を得ることができる。
別の観点から、本発明のアミノ酸変更によって、例えばCDCまたはADCCのような少なくとも一つの減少したFcエフェクタ活性を有する、FcRnに対する結合性が増加したIgG変異株を得ることができる。
[表15]は本研究のIgG変異株に関する主たる結論を示している。
Claims (13)
- 親ポリペチドに比べてFcRnに対する結合性が増加し、Fc領域に少なくとも2つのアミノ酸の変異を有する、親ポリペチドの変異株であって、上記の少なくとも2つのアミノ酸の変異がFc領域の下記変移から成ることを特徴とする変異株:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸変異と、
(ii) 226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Yおよび434Sから成る群の中から選択され少なくとも1つのアミノ酸変異、
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方であり、(i)の変異は(ii)の変異と同じアミノ酸位置では起こらない) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せを有する請求項1に記載の変異株:226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、2591/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y、
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項2に記載の変異株:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項1または2に記載の変異株:
307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S
(ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である) - 変異株が抗体である請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異株。
- 抗体がIgG抗体である請求項5に記載の変異株。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株含む医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株をコードする単離された核酸。
- 請求項8の核酸を含むベクター。
- 請求項9のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項10の宿主細胞を培養して上記抗体を発現させる請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を作る方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を含む医薬品。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異株の医薬品製造での使用。
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