CN108101992B - 与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用 - Google Patents
与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用。本发明是通过将人抗体IgG恒定区CH2结构域中与FcRn存在相互作用的螺旋区附近氨基酸进行突变后获得。相对于野生型的CH2结构域，本发明突变体具备较好的稳定性和抗聚集能力，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；与FcRn的pH依赖性结合得到了增强，为以其为骨架发现新型单域抗体药物奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用。
背景技术
单克隆抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗方面，如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性单克隆抗体药物的研发与临床应用，主要因为它具有如下优势：对人体毒副作用小；具备天然的效应功能同时对靶标高度的特异。因此，越来越多的单克隆抗体被批准用于临床。
随着抗体研究的不断深入，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，有些甚至能够口服用药。
抗体Fc片段的CH2结构域也是小型化抗体的一个重要改造方向。由于其是Fc片段的一部分，因此包含有与FcRn结合的部分位点。目前已知，与FcRn的pH依赖性结合是IgG具有较长血浆半衰期的一个重要因素。
CH2的稳定性较弱，需要进行优化。通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)(图1)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。
新生的Fc受体——母源IgG向乳中分泌和被新生动物摄取均需要通过胞转作用穿越上皮细胞屏障,这个过程需要一种具有转运功能的受体即新生儿Fc受体(FcRn)的参与。在生理pH为7.4时,FcRn不与IgG结合,但是在内涵体酸性pH6～6.5的条件下，FcRn与IgG Fc区的亲和力从纳摩尔到微摩尔不等,对pH的依赖性受到IgG的CH2-CH3铰链区组氨酸残基及与FcRn表面氨基酸残基相互作用的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用，可显著提高与FcRn的pH依赖性结合，从而保证其在体内具有更长的血浆半衰期，从而大大增强了以CH2结构域为骨架的新型单域抗体药物在体内应用的效果。
为实现上述目的，本发明提供了一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体，它是以人抗体IgG恒定区CH2结构域突变体m01s为骨架，将m01s氨基酸序列中的第14位、第15位、第17位、第19位、第21位、第70位的氨基酸进行突变，构建突变CH2结构域骨架的多肽及蛋白质文库，然后以重组人FcRn蛋白为靶标，进行流式细胞分选获得。
上述方案中，能够实现抗原筛选的多肽及蛋白质文库都可以用于本发明，如噬菌体展示文库、酵母展示文库等，优选地，所述多肽及蛋白质文库为酵母展示文库。
优选地，所述与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体，是以人抗体IgG恒定区CH2结构域突变体m01s为骨架，其m01s氨基酸序列中的第14位为苯丙氨酸、第15位为精氨酸、第17位为甘氨酸、第19位为色氨酸、第21位为缬氨酸、第70位为精氨酸。
优选地，所述与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体，其氨基酸序列为SeqID No.3，命名为m01sHLEm1；可选地，基因序列为Seq ID No.4。
本发明还提供了上述与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)对人抗体IgG恒定区CH2结构域突变体m01s中第14、15、17、19、21、70这6个位点的氨基酸进行突变；
(2)构建突变CH2结构域骨架的多肽及蛋白质文库，以重组人FcRn蛋白为靶标，进行流式细胞分选；
(3)对分选出的克隆进行表达纯化，获得与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体。
本发明还揭示了上述与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体在制备Fc融合蛋白中的应用以及在制备单克隆抗体中的应用。
本发明是在m01s的基础上，将人抗体IgG恒定区CH2结构域中与FcRn存在相互作用的螺旋区附近氨基酸进行了突变，突变位点包括第14、15、17、19、21、70位的氨基酸。其中筛选获得的突变体m01sHLEm1，通过CD、分子筛、荧光检测仪、紫外分光光度计、ELISA等方法对m01sHLEm1的二级结构、存在形式、稳定性、抗聚集性进行了鉴定，用野生型CH2结构域进行对照。ELISA实验证明m01sHLEm1确实能够以pH依赖的方式与FcRn结合，且自身的CH2结构域结构并没有被破坏。
本发明的有益效果：
1)相对于野生型的CH2结构域，其具备较好的稳定性和抗聚集能力，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本。
2)其与FcRn的pH依赖性结合得到了增强，为以其为骨架发现新型单域抗体药物奠定了良好的基础。
附图说明
图1为m01sHLEm1与m01s骨架蛋白的溶液存在形式的分子筛检测图。
图2为m01sHLEm1与m01s骨架蛋白和anti-CH2抗体的亲和力对比图。
图3为m01sHLEm1与m01s骨架蛋白在不同的pH条件下和FcRn的结合活力对比图。
图4为m01sHLEm1与Fab、IgG、Fc对FcRn的pH依赖的结合力对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：构建酵母展示文库
以m01s骨架的碱基序列为模板(其基因序列为Seq ID No.2、氨基酸序列为Seq IDNo.1)，通过定点突变与随机突变相结合的方式，按照已有文献(Chao G,et al.,NatProtoc.,2006)，构建酵母展示文库。
实施例2:流式细胞分选
以可溶表达的重组人FcRn蛋白为靶标，通过流式细胞分选的方式，将可与FcRn结合的酵母细胞分选出来，扩大培养后进行下一轮的流式分选，最终四轮筛选后，对多克隆的酵母进行流式分析，对富集的克隆进一步鉴定，鉴定得到突变体，命名为m01sHLEm1。
m01sHLEm1的氨基酸序列为Seq ID No.3，基因序列为Seq ID No.4。
实施例3：原核表达及纯化m01sHLEm1骨架蛋白
将富集的克隆，通过PCR扩增出目的片段，即m01sHLEm1碱基序列，再通过限制性内切酶sfi I将目的片段和pCom空载进行酶切，回收酶切好的目的片段和空载，在T4连接酶作用下，将目的片段与空载16℃连接过夜。
构建好待表达克隆后，将重组质粒转到大肠杆菌HB2151感受态细胞中，用SB培养基进行蛋白的表达。
利用镍柱对原核表达的m01sHLEm1蛋白进行纯化，利用SDS-PAGE对不同咪唑的洗脱液进行检测，根据考马斯亮蓝染色结果对m01sHLEm1蛋白洗脱液进行超滤浓缩与换液。
实施例4：分子筛检测m01sHLEm1与m01s骨架蛋白的溶液存在形式
在AKTA中，利用SuperdexTM 75 10/300GL分子排阻柱对纯化后的m01sHLEm1与m01s骨架蛋白进行检测，整个过程均在PBS缓冲体系下进行。分子排阻柱检测结果如图1，发现m01sHLEm1蛋白也以稳定的单体形式存在。
实施例5：ELISA测定m01sHLEm1、m01s骨架蛋白和anti-CH2抗体的结合
步骤如下：
1、包被：用2ug/ml的anti-CH2抗体蛋白包被costar 96half wells板子，贴上保鲜膜，4℃冰箱过夜。
2、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
3、封阻：向反应板中每孔加入100ul 3％脱脂奶粉(37℃，2h)。
4、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
5、检样：将m01sHLEm1、m01s骨架蛋白稀释到PBS缓冲溶液中，终浓度为20ug/ml，并按照1：4稀释度进行梯度稀释，将稀释好的骨架蛋白分别加到对应的孔中，每孔50ul，然后将板子贴保鲜膜静置于37℃培养箱2小时。
6、洗涤：同步骤4。
7、加HRP酶标抗体：加入anti-flag单抗，每孔50ul(1：1500稀释)，然后静置于37℃培养箱2小时。
8、洗涤：同步骤4。
9、显色：每孔加入50ulABTS反应底物，室温避光处理15min后检测。
10、检测：用酶标仪器检测OD405
结果如图2所示，通过ELISA实验，测定了m01sHLEm1蛋白与突变前m01s骨架蛋白和商业化抗体Mouse-Anti-Human CH2Antibody的结合情况，发现与突变前骨架相比，其亲和力有所下降，但仍可以结合，这也从侧面反映m01sHLEm1突变体蛋白保持了天然的CH2结构域构象。
实施例6：ELISA测定m01sHLEm1、m01s骨架蛋白和FcRn的结合
步骤：
1、包被：用2ug/ml的FcRn蛋白包被costar 96half wells板子，贴上保鲜膜，4℃冰箱过夜。
2、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
3、封阻：向反应板中每孔加入100ul 3％脱脂奶粉(37℃，2h)。
4、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
5、检样：将m01sHLEm1、m01s骨架蛋白稀释到不同pH(pH6.0,pH7.4)的PBS缓冲液，终浓度为500nM，并按照1：3稀释度进行梯度稀释，将稀释好的骨架蛋白分别加到对应的孔中，然后将板子贴保鲜膜静置于37℃培养箱2小时。
6、洗涤：同步骤4，分别用不同pH的PBS溶液洗三次。
7、加HRP酶标抗体：加入anti-flag单抗，每孔50ul(1：1500稀释)，然后静置于37℃培养箱2小时。
8、洗涤：同步骤6
9、显色：每孔加入50ulABTS反应底物，室温避光处理15min后检测。
10、检测：用酶标仪器检测OD405
结果如图3所示，通过ELISA实验，测定m01sHLEm1骨架与m01s骨架在不同的pH条件下与重组人FcRn蛋白的结合情况，发现m01sHLEm1骨架相比于突变前的m01s骨架，能够更有效的与FcRn pH依赖性结合(即pH6.0时结合，pH7.4时不结合)。
实施例7：ELISA测定m01sHLEm1、IgG、Fc和Fab与FcRn的结合
步骤：
1、包被：用2ug/ml的FcRn蛋白包被costar 96half wells板子，贴上保鲜膜，4℃冰箱过夜。
2、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
3、封阻：向反应板中每孔加入100ul 3％脱脂奶粉(37℃，2h)。
4、洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
5、检样：将m01sHLEm1、IgG、Fc和Fab蛋白稀释到不同pH(pH6.0,pH7.4)的PBS缓冲液，终浓度为1000nM，并按照1：2稀释度进行梯度稀释，将稀释好的蛋白分别加到对应的孔中，然后将板子贴保鲜膜静置于37℃培养箱2小时。
6、洗涤：同步骤4，分别用不同pH的PBS溶液洗三次。
7、加HRP酶标抗体：根据不同的蛋白加入不同的HRP标记的二抗，每孔50ul，然后静置于37℃培养箱2小时。
8、洗涤：同步骤6
9、显色：每孔加入50ulABTS反应底物，室温避光处理15min后检测。
10、检测：用酶标仪器检测OD405。
结果如图4示，通过ELISA实验进一步验证了m01sHLEm1与Fab、IgG、Fc对FcRn pH依赖的结合力的不同。
序列表
<110> 武汉班科生物技术股份有限公司
<120> 与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用
<130> 2017
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
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<211> 309
<212> DNA
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tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180
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1.一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体，其特征在于：所述与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体的氨基酸序列为Seq ID No.3。
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-
2017
- 2017-12-31 CN CN201711496451.9A patent/CN108101992B/zh active Active
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Also Published As
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