JP6279543B2

JP6279543B2 - Ｈｂ−ｅｇｆ／ｅｇｆｒ経路の活性化に関連する疾患の処置のためのジフテリア毒素のｒドメイン由来のｈｂ−ｅｇｆ阻害物質

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Publication number: JP6279543B2
Application number: JP2015501031A
Authority: JP
Inventors: ジレ，ダニエル; ヴィリエ，ブノワ; ピシャール，シルヴァン; マイル，ベルナール; サンソン，アラン
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-19
Publication date: 2018-02-14
Anticipated expiration: 2033-03-19
Also published as: DK2828285T3; WO2013140335A1; EP2828285B1; US9758552B2; TR201810352T4; FR2988393A1; ES2679168T3; US20150051146A1; JP2015512382A; EP2828285A1; FR2988393B1

Description

本発明は、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関与する疾患の処置および診断用に有用な、HB-EGF(ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子)を阻害するジフテリア毒素のＲドメイン由来のリガンド組換えタンパク質に関する。

HB-EGFは、前駆体膜タンパク質、プロHB-EGF(これは、天然のジフテリア毒素受容体である)の形で生物の細胞の表面にて発現される増殖因子である。
ジフテリア毒素(DT)は、フラグメントＡ(Ｎ末端)とフラグメントＢ(Ｃ末端)とで構成される535アミノ酸(配列番号１)の外毒素である。フラグメントＡは、触媒ドメイン(ＣまたはDTA/DT-A;残基１から193)を含み、フラグメントＢは、移動ドメイン(Ｔ;Ｎ末端;残基202から378)および細胞受容体結合ドメイン(ＲまたはDTR;Ｃ末端;残基379〜386から535)を含む。DTは、そのＲドメインとプロHB-EGFとの結合により細胞の表面と結合する。フラグメントＡとフラグメントＢとの間のタンパク質切断によるDTの活性化の後に、Ｔドメインは、フラグメントＡが細胞質に移動することを可能にする。細胞質に一旦入ると、フラグメントＡが有する触媒ドメインは、EF2伸長因子を不活性化することによりタンパク質合成を遮断し、よって細胞死を引き起こす。DTの自然および合成変異体の研究は、DTとプロHB-EGF受容体との結合が、DTRの残基S508 (S508F)または領域K516〜F530のループの残基(K516A、K516E、F530A、F530SおよびS525F)の置換により廃止されるが、Ｃ末端の４残基(残基E532〜S535; Shenら, J. Biol. Chem., 1994, 269, 29077〜29084)の欠失によっては廃止されないことを示している。さらに、CRM197とよばれる、G52E変異を含むDTの天然変異体は、触媒活性が大きく低減している(Gianniniら, N.A.R., 1984, 12, 4063〜4069)。

HB-EGFが関与する炎症プロセス中に、プロHB-EGF膜タンパク質はプロテアーゼにより切断され、HB-EGFが分泌タンパク質の形で細胞表面から遊離される。これは、次いで、自己分泌または傍分泌の様式で、EGF受容体ファミリー(EGFRファミリーまたはEGFR)のErbB1 (HER1またはEGFR)およびErbB4 (HER4)サブユニット(生物の実質的に全ての組織で発現される)と結合する。HB-EGFの他に、少なくとも10のEGFRリガンド、すなわちEGF、TGF-アルファ、アンフィレギュリン、ベータセルリン、エピゲン(epigen)、エピレギュリンならびにニューレギュリン-１、-２、-３および-４がある。これらのリガンドのどれか１つによるEGFRの刺激を決定するのは、場所の関係である。

プロHB-EGFの発現の増加および/またはHB-EGFの遊離に伴うHB-EGF/EGFR経路の活性化は、以下のような多くの病的状態の原因である有害な細胞増殖を導く:
- 急速進行性糸球体腎炎(RPGN)、この疾患の間に、糸球体腎臓細胞(有足細胞)の増殖は、腎臓破壊を導く(Fengら, J. Clin. Invest., 2000, 105, 341〜350; Bolleeら, Nat. Med., 2011, 17, 1242〜1250)、
-卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、子宮癌(子宮腺癌)、膀胱癌、胃癌、皮膚癌(悪性黒色腫)、脳癌(膠芽腫)および肺癌を含むがん(Yotsumotoら, Biochem Biophys Res Commun, 2008, 365, 555〜561; Miyamotoら, Adv. Exp. Med. Biol., 2008, 622, 281〜295; Miyamotoら, Anticancer Res., 2009, 29, 823〜830; Fuら, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1999, 96, 5716〜5721; Tsujiokaら, Anticancer. Res., 2010, 30, 3107〜3112)、
- 脳挫傷に伴う血管攣縮(Chanselら, FASEB J., 2006, 20, 1936〜1938)、
- 心肥大(Asakuraら, Nat. Med., 2002, 8, 35〜40; Hamaokaら, J. Biochem., 2010, 148, 55〜69)、
- 平滑筋細胞過形成(Miyagawaら, J. Clin. Invest., 1995, 95, 404〜411; Hamaokaら, J. Biochem., 2010, 148, 55〜69)、
- 肺高血圧症 (Powellら, Am. J. Pathol., 1993, 143, 784〜793; Hamaokaら, J. Biochem., 2010, 148, 55〜69)、
- 糖尿病網膜症および
- 動脈再狭窄。

関与する疾患の数が増加しているので、HB-EGFは、治療の標的になっている。現在、２つのタイプの分子、すなわちEGFR阻害物質およびHB-EGF阻害物質が、EGFR上のHB-EGFの活動を遮断するために利用可能である。HB-EGFによるEGFR活性化(HB-EGF/EGFR経路)に関与する病的状態を処置するために用いることができる可能性があるこれらの分子は、しかし、いくつかの大きな問題点を有する。

EGFR阻害物質
２つのタイプのEGFR阻害物質を、HB-EGFによるEGFR刺激を遮断するために理論的に用いることができる:エルロチニブのようなEGFRに対して作用する可逆的チロシンキナーゼ阻害物質、およびセツキシマブのようなEGFRを指向する抗体(CiardielloおよびTortora, N. Engl. J. Med., 358, 1160〜1174; WO 2008/053270)。
しかし、EGFRのチロシンキナーゼ(小分子)またはEGFR自体(モノクローナル抗体)に作用するこれらの分子は、HB-EGF/EGFR経路に特異的でない。なぜなら、これらがその刺激の起源に関係なく、それを活性化するリガンドとは独立して、かつそのリガンドに関係なくEGFRの活性化を遮断するからである。特異性が欠如しているので、EGFR阻害物質は、著しい副作用を生じる。例えば、エルロチニブおよびセツキシマブのそれぞれについて報告されている以下の副作用を挙げることができる:好中球減少症、血小板減少症、貧血、浮腫、悪心、嘔吐、頭痛、掻痒症および筋骨格痛;発熱、悪寒戦慄、じんま疹、掻痒症、発疹、低血圧症、気管支痙攣、呼吸困難、浮腫、錯乱、アナフィラキシーショックならびに心停止。

さらに、HB-EGFにより刺激されるEGFRは腎臓糸球体中の有足細胞により発現され、糸球体ろ過閾値はおよそ68 kDaであることに鑑みると、抗体は、RPGNの場合にそれらの標的に到達するには大きすぎる(150 kDa)。同様に、固形腫瘍への抗体の浸透は、そのサイズにより制限される。

HB-EGF阻害物質
マウスでは、プロHB-EGF遺伝子のノックアウトは、誘導されるRPGNの誘因を妨げるので(Bolleeら, Nat. Med., 2011, 17, 1242〜1250)、このことにより、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関与する病的状態の処置のためのHB-EGFおよびプロHB-EGFを阻害するリガンドを開発することの利点が正当化される。
現在、HB-EGFによるEGFR刺激を遮断するために利用できる可能性がある２つのタイプのHB-EGF阻害物質が存在する: HB-EGFを指向する抗体(WO 2009/040134; WO 2011/21381; WO 2009/72628; EP 2221374; EP 2281001; EP 2093237; EP2078731; EP 2039704; WO 2008/053270)およびCRM197 (US 7 700 546; US 2006/0270600)。

HB-EGFを指向する抗体は、HB-EGF/EGFR経路の活性化のみを遮断するのでEGFR阻害物質よりも特異的であるが、これらは、それらの過剰なサイズに関連する、抗EGFR抗体と同様の問題点を有する。
CRM197は、EGFRとの結合を遮断できるHB-EGFの天然リガンドである。これは、現在、卵巣癌と闘うために、HB-EGFを遮断する臨床試験において用いられている(Koshikawaら, Cancer Sci., 2011, 102, 111〜116; Tsujiokaら, Anticancer Res., 2011, 31, 2461〜2465)。
しかし、CRM197は、残存毒性、サイズ、親和性、免疫原性および抗原性の点で問題点を有する。

CRM197の残存毒性は、野生型ジフテリア毒素のものより10⁶倍低い(Kageyamaら, J. Biochem., 2007, 142, 95〜104)。しかし、これは、無視できない。なぜなら、野生型毒素は、霊長類細胞培養における50％致死量(LD50)が５pMで、非常に強力であるからである。CRM197は、よって、マイクロモル(μM)用量で毒性である。このことは、高用量でヒトに投与されるならば、危険性を示し得る(Kageyamaら, J. Biochem., 2007, 142, 95〜104)。
CRM197は、58 kDaの分子量を有し、糸球体ろ過閾値を通過するのが困難である。よって、これは、組織浸透が治療有効性についての重要な因子であるRPGNまたはその他の病的状態、例えば固形腫瘍を処置するために用いることができない。
CRM197は、HB-EGFについて中程度の親和性を有する(Kd = 27 nM; Brookeら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 248, 297〜302)。この親和性は、良好な治療抗体のものよりも低い。

CRM197は、非常に免疫原性である。これは、ジフテリア毒素とは１残基(G52E)だけ異なる。よって、これは、ジフテリア毒素の全てまたは該変異がＴエピトープに影響するならばほぼ全てのCD4Ｔエピトープを有する。偶然にも、西洋人個体群はジフテリア毒素に対してワクチン接種されている。CRM197を用いて患者を処置することは、追加ワクチン接種をすることに等しい。１回目の注射ほど早期に、CRM197は、メモリーCD4Ｔ細胞の再活性化を引き起こすことができ、循環抗体の産生を再刺激できる。CRM197の１回目の投与の数日後に、これらの抗体はタンパク質を中和し、処置の効果をなくす。

CRM197は、ジフテリア毒素の本質的に全てのＢエピトープを有するので、非常に抗原性が高い。西洋人個体群はジフテリア毒素に対してワクチン接種されているので、著しい割合の個体が、１回目の投与ほど早期にCRM197を中和できる循環抗体を有する。このことにより、治療効果を得るためには大量のCRM197を用いなければならず、副作用(毒性、アナフィラキシーショックなど)の危険性がかなり増加する。
その結果、CRM197と比較してサイズがより小さく、HB-EGFに対するよりよい親和性を有し、抗原性、免疫原性および毒性が低減された新しいHB-EGF阻害物質を得ることに対する必要性が真に存在する。

現在までに、形質転換細胞から組換えタンパク質を抽出するために洗浄剤またはカオトロピックもしくは変性剤を用いずに、高収率で直接組換え形の単離DTRドメインを産生することは可能でない。
実際に、単離DTRドメインの構造を安定化し、形質転換細菌からのこのドメインの抽出および精製を改善するために、DTRドメインをタンパク質(グルタチオンＳトランスフェラーゼ、GST)またはタンパク質ドメイン(エス・アウレウス(S. aureus)プロテインＡに由来するZZドメイン(Lobeckら, Infect. Immun., 1998, 66, 418〜423; Shenら, J. Biol. Chem., 1994, 269, 29077〜29084)に融合させることが必須である。さらに、DTRの領域516〜530のループの変異体は、GST-DTR融合を用いて産生されている。これらのDTR変異体は、プロHB-EGF受容体と結合できない(Shenら, 1994)。

上記の２つの場合では、大腸菌（E. coli）において産生される組換えタンパク質は、単離DTRドメインではなく、GST-DTRまたはZZ-DTR融合タンパク質である。GST-DTR融合タンパク質の場合、産生収率は月並みであり、形質転換細菌から融合タンパク質を抽出するために洗浄剤(１% Triton X-100)の使用が必須である。さらに、治療用タンパク質を産生するために融合パートナーを除去しなければならず、このことにより、製造プロセスがさらにより複雑になり、さらにより収率が低減する。

本発明者らは、融合パートナー配列を有さない単離DTRドメインの変異体を構築した。単離DTRドメインのこれらの変異体は、プロHB-EGFおよびHB-EGFに対する親和性を有して、小さいサイズ(およそ17500 Da)の可溶性組換えDTRタンパク質の形で大量に直接発現される。これらのDTR変異体は、驚くべきことに、CRM197と比較して抗原性および免疫原性が低減されるとともに著しく親和性が増加した改良組換えDTRタンパク質を産生するように改変されている。

その結果、本発明の主題は、ジフテリア毒素のＲドメインに相当する配列番号１のアミノ酸配列の残基380から535と少なくとも70%の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、前記配列が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＤおよびＥからなる群より選択される別のアミノ酸での前記Ｒドメインの残基Y380、P382、Q387、P388および/またはL390の少なくとも１、好ましくは少なくとも２の置換を含み、前記配列が、前記ＲドメインのＮまたはＣ末端の端にて、ジフテリア毒素のＴドメインもしくはＣドメインおよびＴドメインの配列、ならびに前記Ｒドメインの安定性もしくは精製を改善できるタンパク質もしくはタンパク質ドメインの配列を有さない、HB-EGFを阻害するリガンドである組み換えタンパク質である。

本発明は、以下の利点を有するHB-EGFおよびプロHB-EGFのリガンドである治療用組換えタンパク質を提供する:
- これは、野生型の形のDTR_WTと比較して、溶解性が大きく増加している。残基Y380、P382、Q387、P388および/またはL390の少なくとも１、好ましくは少なくとも２を異なる親水性、極性または荷電アミノ酸残基で、上で定義したように置換することは、水性溶液中のDTR タンパク質の溶解性をかなり増加させることができる。よって、本発明による組換えタンパク質は、洗浄剤またはカオトロピックもしくは変性剤を用いることなく、宿主細胞から抽出および精製できる。これと比較して、同じ発現系で産生される野生型DTRタンパク質(DTR_WT)は、不溶性であり、治療用に適合する洗浄剤を用いて可溶化されない。DTR_WTタンパク質は、0.5%のサルコシルまたはドデシル硫酸ナトリウムの存在下で可溶化されるが、これらは、この濃度では治療用に適合しない洗浄剤である;
- これは、DTR_WTよりも、組換え形で産生するのがより容易である。これは、Ｒドメインの安定性または精製を改善するための融合パートナーを用いずに直接産生される。これは、標準的な発酵手順に従って大腸菌で、折り畳まれた可溶形で、かつ最終精製後に大量に(最適化していない実験室条件下で数十mg/l-培養物)産生される;

- これは、HB-EGFおよびプロHB-EGFに対する親和性が、CRM197のものよりも少なくとも10倍大きい。驚くべきことに、野生型DTRタンパク質(DTR_WT)は、HB-EGFおよびプロHB-EGFに対する親和性がCRM197のものよりも２倍低いが、本発明による変異体DTRタンパク質は、CRM197のものよりもHB-EGFおよびプロHB-EGFに対する親和性がかなり高い。DTR1、DTR3およびDTR8とよばれるタンパク質は、それぞれ、親和性が、CRM197のものよりも60、300および1400倍高い。このことは、DTR8を、同じ治療効果のためにCRM197よりもかなり低い用量で用いることができることを意味する。その結果、生物の他のタンパク質またはリガンドとの低い親和性での結合の存在と全般的に関連する副作用の危険性が、CRM197と比較してかなり低減される。この相互作用は、１pM程度の低い用量で用いることにより排除されるが、これはDTR8の場合にそうである;
- これは、CRM197およびDTR_WTと比較して免疫原性が低減されている。DTR_WTにおいて同定される26のＴエピトープのうち10は、部位特異的変異誘発によりDTR8タンパク質から欠失している(９の免疫優性エピトープのうち７つを含む);

- これは、CRM197およびDTR_WTと比較して抗原性が大きく低減している。ジフテリア毒素に対してワクチン接種された個体の血清は、前記毒素の触媒ドメインを優先的に認識する。このドメインは、CRM197分子中に存在し、本発明による変異DTRタンパク質中に存在しない。さらに、本発明による変異DTRタンパク質は、DTR_WTを認識するワクチン接種された対象者の抗体によりDTR_WTと同様には認識されない;
- これは、市販のEGFR阻害物質(治療用抗体および小分子)よりもかなり特異的に、HB-EFGによるEGFR (ErbB1およびErbB4)活性化の経路を遮断するので、その結果、副作用の危険性がより少ない可能性がある;
- これは、サイズが小さい。配列番号２〜９のタンパク質は、158アミノ酸の配列およびおよそ17500 DaのMWを有し、すなわち、CRM197のものよりも3.4倍小さく、HB-EGF経路を遮断するために臨床プロトコールにおいて現在用いられている抗HB-EGF抗体のものよりも8.8倍小さいサイズを有する。そのサイズが小さい結果として、本発明による組換えタンパク質は、HB-EGF経路の活性化に関連する病的状態、特にRPGNまたは卵巣癌の処置においてより効果的である。なぜなら、これは、組織、特に腫瘍中により容易に拡散し、腎臓糸球体中に浸透できるからである。

さらに、HB-EGFおよびプロHB-EGFに対するその親和性が高いので、本発明によるタンパク質は、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関与する疾患の診断のために用いることもできる。

定義
- 本出願において、用語「DTR」または「DTRドメイン」は、野生型ジフテリア毒素のアミノ酸配列(配列番号１)の残基380〜385から531〜535に相当するジフテリア毒素のＲドメインを意味することを意図する。
- 「DTRタンパク質」との表現は、単離DTRドメインを含む、すなわちそのＮまたはＣ末端の端にて、ジフテリア毒素のＴドメインもしくはＣドメインおよびＴドメインの配列、ならびに前記Ｒドメインの安定性もしくは精製を改善できるタンパク質もしくはタンパク質ドメインの配列を有さない組換えタンパク質のことをいう。さらに、Ｒドメインの精製は、これが組換えタンパク質の形で産生されることに鑑みて、前記ドメインの抽出および精製を含む。

- 上で定義される少なくとも１、好ましくは少なくとも２の置換を含む本発明による組換えタンパク質は、この置換を含まない野生型DTR組換えタンパク質(DTR_WT)に対向して、変異体DTRタンパク質、変異DTRタンパク質またはDTR_nタンパク質(ここで、ｎは整数である)という。
- アミノ酸は、一文字コードを用いて示す。
- 参照配列と比較したアミノ酸配列の類似性は、２つの配列を、それらの間で最大の対応が得られるように整列させたときに同一または保存的置換により異なるアミノ酸残基のパーセンテージに従って評価する。同一残基のみを考慮して同一残基のパーセンテージを決定する場合、参照配列に対する前記アミノ酸配列の同一性について言及する。本発明の目的のために、「タンパク質のアミノ酸配列の保存的置換」との表現は、同様の化学的または物理的特性(サイズ、電荷または極性)を有し、タンパク質の生物活性に対して有害な影響を有さない別の天然または合成アミノ酸で、あるアミノ酸を置換することを意味することを意図する。よって、タンパク質の２つのアミノ酸配列は、１アミノ酸の置換、または前記タンパク質の生物活性に対して有害な影響を有さない位置にて少数のアミノ酸(５未満)の欠失および/もしくは挿入により互いに異なるならば、類似する。パーセンテージ類似性または同一性は、当業者により、配列比較ソフトウェア、例えばBLASTソフトウェアシリーズのもの(Altschulら, NAR, 1997, 25, 3389〜3402)を用いて算出できる。BLASTプログラムは、デフォルトパラメータを用いて、配列番号１のアミノ酸配列の残基380から535からなる比較ウィンドウにおいて実行される。

- そうでないと示さない限り、用語「HB-EGF」は、HB-EGFの膜前駆体(プロHB-EGF)および分泌形の両方のことをいう。
- HB-EGFを阻害するリガンドの活性とは、プロHB-EGFと結合し、HB-EGFと結合する能力、および様々な測定可能な生物学的現象の阻害のことをいい、生物学的現象は、例えば以下のものである:
- ヒトまたはサル細胞、例えばベロ細胞に対するジフテリア毒素の毒性の影響の阻害、
- EGFRのErbB1および/またはErbB4サブタイプを発現する細胞上でのHB-EGFの増殖活性、ならびにHB-EGF依存性である細胞、例えばEGFR遺伝子を遺伝子導入したネズミリンパ球系株化細胞Ba/F3の増殖の阻害。

本発明による組換えタンパク質は、そのＮまたはＣ末端の端にて以下の配列の１つを有さない単離DTRドメインを含む: (１) ジフテリア毒素のＴドメインまたはＣドメインおよびＴドメインの配列、ならびに(２) DTRドメインの安定性を改善できる融合パートナーの配列、例えばグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(GST)の配列、または形質転換された細菌からのDTRドメインの抽出および精製を改善できる配列、例えばエス・アウレウスプロテインＡに由来する免疫グロブリン結合ドメイン(ZZドメイン)の配列

本発明による組換えタンパク質は、全般的に、配列番号１の配列の残基380から535まで延びる単離DTRドメインを含み、上で定義するように、残基Y380、P382、Q387、P388および/または L390の１以上、好ましくは少なくとも２の、親水性、極性または荷電アミノ酸残基での置換を含む。しかし、これは、Ｎ末端の端が配列番号１の配列の381位から385位にあり、Ｃ末端の端が配列番号１の配列の531位から534位にある、わずかにより短い単離DTRドメインも含んでよい。DTRのＮ末端配列が381位または382位にある場合、本発明による組換えタンパク質は、残基P382、Q387、P388および/またはL390の少なくとも１の置換を含む。DTRのＮ末端配列が383位、384位または385位にある場合、本発明による組換えタンパク質は、残基Q387、P388および/または L390の少なくとも１の置換を含む。

本発明による組換えタンパク質は、場合によって、そのN-terにてメチオニン(Ｍ)ならびに/または DTRドメインのＮおよび/もしくはＣ末端にてさらなる配列を含む。実際に、前記組換えタンパク質の前駆体は、翻訳後修飾により切断できるＮ末端メチオニンを含むので、成熟組換えタンパク質には該メチオニンが存在しない。
治療用のために、本発明によるタンパク質は、(１)１〜10アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、好ましくは１または２アミノ酸の配列、前駆体の配列および場合によってメチオニン(Ｍ)で始まる成熟タンパク質の配列、例えばMG配列と、(２)上で定義する変異DTRドメインとから連続的になる。このような治療用タンパク質は、およそ145〜200アミノ酸、好ましくはおよそ145〜175アミノ酸、好ましくはおよそ160アミノ酸の小さいサイズである。

診断用のために、本発明によるタンパク質は、特に、適当なシグナルを測定することにより検出できるペプチドトレーサで標識される。ペプチドトレーサは、特に、抗体により認識されるタグ、蛍光タンパク質、または少なくとも１のテクネチウム99原子と結合するペプチドである。標識は、タンパク質のN-terまたはC-terの位置にあり、すなわち、DTRドメインのN-terまたはC-terの端にそれぞれ直接またはペプチドスペーサにより融合される。このようなタンパク質は、およそ145〜500アミノ酸、好ましくはおよそ145〜300アミノ酸、好ましくはおよそ145〜200アミノ酸のサイズである。

本発明は、１以上のアミノ酸残基、ペプチド結合または組換えタンパク質の端のレベルでの任意の改変の導入による、以前のものに由来する改変組換えタンパク質を包含するが、但し、前記改変タンパク質がHB-EGFおよびプロHB-EGFに関して良好な親和性および阻害活性を保持することを条件とする。当業者に知られる従来の方法によりタンパク質に導入されるこれらの改変は、非限定的な様式で、以下のものを含む:合成アミノ酸 (Ｄアミノ酸またはアミノ酸類似体)でのアミノ酸の置換;反応性官能基、特に側鎖Ｒのレベルでの化学基(脂質、オリゴ糖または多糖)の付加;ペプチド結合(-CO-NH-)、特にレトロ型もしくはレトロ-インバーソ型(-NH-CO-)の結合を介するもの、またはペプチド結合以外の結合の改変;環化;ペプチドもしくは興味対象のタンパク質との融合(遺伝子工学による)または興味対象の分子、特に標識物質もしくはシグナルを測定することにより検出可能なトレーサとのカップリング(化学結合による)。

前記タンパク質の有利な実施形態によると、これは、Y380K、Y380E、P382T、Q387E、Q387K、P388T、L390TおよびL390Nからなる群より選択される少なくとも１の置換を含む。
ある有利な構成によると、前記置換は、Y380K、Y380E、Q387K、Q387EおよびL390Tからなる群より選択される。好ましくは、前記置換は、Y380K、Q387EおよびL390Tからなる群より選択される。

別の有利な構成によると、前記タンパク質は、少なくとも２または３の前記置換を含む。
好ましくは、前記タンパク質は、少なくとも置換Y380KおよびL390T、Y380KおよびQ387E、Y380EおよびL390T、またはY380EおよびQ387K、好ましくは少なくとも置換Y380KおよびL390T、またはY380KおよびQ387Eを含む。例えば、前記タンパク質は、以下の置換の組み合わせの１つを含む: Y380KおよびL390T; Y380K、Q387EおよびL390T; Y380K、Q387E、P388TおよびL390T; Y380K、Q387E、P382TおよびL390T; Y380E、Q387K、P382TおよびL390T。好ましくは、これは、配列番号２〜６の配列の１つを含むかまたはそれからなるタンパク質である。
好ましくは、前記タンパク質は、少なくとも置換Y380KおよびL390Tを含む。例えば、前記タンパク質は、配列番号２〜５の配列の１つを含むかまたはそれからなる。
さらにより好ましくは、前記タンパク質は、置換Y380K、Q387EおよびL390Tを含む。例えば、前記タンパク質は、配列番号３〜５の配列の１つ、好ましくは配列番号３の配列を含むかまたはそれからなる。

前記タンパク質の別の有利な実施形態によると、これは、さらに、置換A395Tを含む。この置換を加えることにより、可溶性タンパク質の収率がさらに増加する。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号７の配列を含む。DTR1とよばれるこのタンパク質は、置換Y380K、Q387E、L390TおよびA395Tを含む。DTR1タンパク質のHB-EGF結合親和性は、CRM197のものと比較して60倍、0.5%のサルコシル洗浄剤を用いて可溶化されるDTR_WTタンパク質と比較して130倍増加する。

前記タンパク質のまだ別の有利な実施形態によると、これは、置換F389Yおよび/またはG510Aの少なくとも１つを含む。これらの置換のうちの１つを加えることにより、DTRタンパク質のHB-EGF結合親和性が増加する。さらに、これら２つの置換の組み合わせは、単一置換を用いて得られる増加と比較して、HB-EGF結合親和性のさらなる増加をもたらす。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号８の配列を含むかまたはそれからなる。DTR3とよばれるこのタンパク質は、置換Y380K、Q387E、L390T、A395T、F389YおよびG510Aを含む。HB-EGFに対するDTR3タンパク質の親和性は、DTR1のものと比較して５倍増加し、CRM197のものと比較して300倍増加する。

前記タンパク質の別の有利な実施形態によると、これは、N399K、V452T、T517E、V483Q、H492E、S494K、T436HおよびE497Dからなる群より選択される少なくとも１つの置換も含む。前記タンパク質は、有利には、前記置換の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つを含む。
好ましくは、前記タンパク質は、置換N399K、V452T、T517E、V483Q、H492EおよびS494Kを含む。これらの変異により、DTR_WTにおいて同定される26のCD4Ｔエピトープのうち10を欠失できた。これらの10のエピトープは、DTR_WTの免疫優性エピトープであると予測される９エピトープのうちの７つを含む。得られるタンパク質がCD4型の免疫応答、すなわち抗体産生応答を誘導する能力は、よって、DTR_WTのものと比較してかなり低減される。著しいことにそして予期せぬことに、DTRの免疫原性を低減することを意図する６つの変異を加えることは、HB-EGFに対するその親和性を増加することに貢献した。

好ましくは、前記タンパク質は、配列番号９の配列を含むかまたはそれからなる。DTR8とよばれるこのタンパク質は、置換Y380K、Q387E、L390T、A395T、F389Y、G510A、N399K、V452T、T517E、V483Q、H492EおよびS494Kを含む。これは、17458 Daの分子量を有する。
HB-EGFに対するDTR8タンパク質の親和性は、DTR3のものと比較して３倍、CRM197のものと比較して1400倍増加する。さらに、DTR8は、分泌HB-EGFとの結合およびHB-EGF/EGFR経路の阻害の点でCRM197よりも少なくとも300倍効果的である。
DTR8タンパク質の抗原性は、CRM197のものと比較して大きく低減されている。実際に、DTに対してワクチン接種(義務的ワクチン接種)された成体に存在する抗体のほとんどは、DTの触媒ドメインを指向する。驚くべきことにそして予期せぬことに、DTR8タンパク質の抗原性は、DTR1のものと比較して、そして、よってDTR_WTのものと比較して低減されている。

本発明によるタンパク質は、さらなる置換、特にDTRドメインの表面にある残基の置換をさらに含んで、その抗原性をさらに低減してよい。

前記タンパク質の別の有利な実施形態によると、これは、配列番号１の配列の残基380から535と少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%を有するアミノ酸配列を含む。前記タンパク質のある有利な構成によると、これは、配列番号１の配列の残基380から535と少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%、85%または90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

前記タンパク質の別の有利な実施形態によると、これは、検出可能なトレーサで標識される。タンパク質を標識するための手段および技術は、当業者に公知であり、直接的または間接的に行うことができる放射活性、磁性または蛍光標識を含む。直接標識物質は、特に、放射性同位体、例えばトリチウム(³Ｈ)、ヨウ素(¹²⁵Ｉ)およびテクネチウム(^99mTc)、または発光(放射線発光、化学発光、生物発光、蛍光またはリン光)化合物、例えば蛍光体、例えば非限定的な様式で、AlexaFluor(登録商標)、FITCおよびシアニン３、ならびに蛍光タンパク質、例えばGFPおよびその誘導体である。間接標識物質は、特に、酵素および特異的抗体により認識されるエピトープタグを含む。標識は、特に、(１)蛍光体を、反応性基、例えばリジン残基の反応性アミン上にグラフト化し、(２)反応性基(遊離システイン)を、化学合成または組換え生成により組み込み、次いで、この基を用いて蛍光体をグラフト化し、(３)蛍光体を、ＮまたはＣ末端の位置に化学合成により直接組み込み、(４)蛍光タンパク質または酵素を、融合タンパク質の産生により直接組み込むことにより行われる。このように標識されたタンパク質は、特に、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患のインビトロもしくはインビボ(イメージングによる)での診断用の試薬として、またはこの活性化経路の研究ツールとして用いられる。DTRタンパク質は、テクネチウム(^99mTc)または蛍光トレーサの共有的カップリングにより直接標識できる。蛍光トレーサは、特に、DTRタンパク質のリジン残基の１つにカップリングされる。

本発明の組換えタンパク質は、選択された宿主中でのタンパク質の発現を可能にする調節エレメントと機能的に連結された、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、宿主細胞に移し、これを、前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する方法により産生できる。産生されるタンパク質を、次いで、回収して精製する。用いる精製方法は、当業者に既知である。得られる組換えタンパク質は、細胞可溶化物または抽出物からまたは培養培地上清から、個別または組み合わせて用いられる方法、例えば分画、クロマトグラフィー法または特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いる免疫親和性技術により精製できる。得られる組換えタンパク質は、可溶性である。

本発明の主題は、前記組換えタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドでもある。前記ポリヌクレオチドは、有利には、本発明のタンパク質が産生される宿主細胞中での発現のために最適化されたコード配列を含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１２または１４の配列を含む(これらの配列は、大腸菌での発現のために最適化され、それぞれDTR1、DTR3およびDTR8組換えタンパク質をコードする)。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に既知の従来の化学合成または分子生物学的方法を用いて調製されたDNAまたはRNAである。

本発明の主題は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えクローニングおよび/または発現ベクターでもある。好ましくは、前記ベクターは、本発明のタンパク質の発現を、前記タンパク質の産生のために用いられる宿主細胞において可能にする調節配列(プロモーター、エンハンサー、開始コドン(ATG)、停止コドン、転写終結配列)に機能的に連結された前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。複製または組み込みベクター、特にプラスミドまたはウイルスベクターであるこのベクターは、当業者が通常用いる方法に従って調製される。

本発明の主題は、上で定義する組換えベクターを用いて一過的または安定的に改変された宿主細胞でもある。これらの細胞は、上で定義する組換えベクターを、原核または真核宿主細胞に、当業者に既知の標準的な方法、例えばエレクトロポレーションを用いて導入することにより得ることができる。宿主細胞の例は、特に、哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌、例えば大腸菌および酵母を含む。

本発明の主題は、上で定義する少なくとも１の組換えタンパク質または１の組換え発現ベクターと、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物でもある。
医薬組成物は、上で定義するHB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患に対して治療効果を得るために、有効量のタンパク質またはベクターを含む。全般的に、およそ0.1μgからおよそ100 mg、好ましくは10μgから10 mgまでの範囲の治療有効量を成人に投与できる。医薬的に許容される賦形剤は、従来用いられているものである。組成物は、選択される投与に適切なガレヌス製剤の形(forme galenique) :注射用滅菌溶液、散剤、錠剤、ゲル、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤または坐剤であり、これらは、標準的なプロトコールに従って調製される。投与は、皮下、筋内、静脈内、皮内、腹腔内、経口、舌下、直腸、膣、鼻内、または吸入により、または経皮的な塗布によるものであってよい。

本発明による医薬組成物の投与の形態、投与計画およびガレヌス製剤の形は、当業者による通常の方式で、特に、患者(一般的にヒト個体、場合によって非ヒト哺乳動物)に適する治療的処置を確立するために通常考慮される基準、例えば年齢、体重、患者の全般的な状態の重篤度、処置に対する耐容性および観察される副作用に従って決定できる。

本発明の主題は、医薬品としての上で定義する組換えタンパク質でもある。
本発明は、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患の処置において用いるための上で定義する組換えタンパク質にも関する。
本発明の主題は、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患の処置を意図する医薬品を調製するための、上で定義する組換えタンパク質の使用でもある。

本発明の主題は、上で定義する医薬組成物を個体に投与することを含む、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患を処置するための方法でもある。投与は、上で定義する適当な形態および適当な割合に従って行われる。
好ましくは、上記の疾患は、急速進行性糸球体腎炎(RPGN)、がん、特に卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、子宮癌(子宮腺癌)、膀胱癌、胃癌、皮膚癌(悪性黒色腫)、脳癌(膠芽腫)および肺癌、脳挫傷に伴う血管攣縮、心肥大、平滑筋細胞過形成、肺高血圧症、糖尿病網膜症ならびに動脈再狭窄からなる群より選択される。

本発明の主題は、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患のインビトロまたはインビボ診断のための、上で定義する標識タンパク質の使用でもある。
本発明は、生体試料を、上で定義する標識タンパク質と、前記標識タンパク質とHB-EGFおよび/またはプロHB-EGFとの間の特異的複合体の形成を可能にする条件下で接触させることと、前記標識タンパク質/HB-EGF複合体を、任意の適当な手段により検出することとを含む、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患のインビトロ診断のための方法にも関する。
生体試料は、特に、生検試料(腎臓、腫瘍、平滑筋、心臓、肺、血管、網膜)、血清試料または尿試料である。

本発明の主題は、インビトロまたはインビボでのHB-EGFの検出のための、上で定義する標識タンパク質の使用でもある。
本発明の主題は、少なくとも以下の：
分析される細胞を、上で定義する標識タンパク質と接触させる工程と、
標識された細胞および/または細胞外媒体を任意の適当な手段により検出する工程と
を含む、インビトロおよびインビボでHB-EGFを検出する方法でもある。
この方法により、生理的もしくは病的状態の下での、または内因性もしくは外因性刺激に応答してのHB-EGF の組織発現プロフィールを決定することができる。特にリアルタイムでの哺乳動物の体内(細胞イメージング)でのインビボHB-EGF検出は、前記タンパク質を前記哺乳動物に投与する(非経口注射、経口投与)先行する工程を含む。ヒトにおけるインビボHB-EGF検出を用いて、HB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患を診断できる。
HB-EGFを含有する細胞および細胞外媒体の標識は、特に、当業者に既知の任意の技術(蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、ガンマグラフィー、磁気共鳴画像法)により検出可能な蛍光もしくは放射活性標識、または磁性標識である。

本発明の主題は、上で定義する標識タンパク質を含む、上で定義する診断または検出方法を行うためのキットでもある。
上記の構成に加えて、本発明は、添付の図面を参照して本発明の主題の例示的な実施形態に言及する以下の記載から明らかになるその他の構成も含む。添付の図面においては、以下のとおりである。

DTR_WTよりも可溶性のDTRタンパク質を産生するためのR1ライブラリーのスクリーニングにより選択される５クローンの可溶性および不溶性画分の変異(Ａ)および分析(Ｂ)を表す。全てのクローンは、可溶性である。最良のクローンは1D6クローンである。 1D6クローンにより産生されるDTRタンパク質(ここではG1という)の溶解性に対するA395TおよびN399D変異の影響を示す。最良のクローンは、A395T変異を含有する。 (Ａ)DTR1の用量を増加することによる、ベロ細胞に対する漸増用量のジフテリア毒素の毒性の影響の阻害、および、(Ｂ)等式log(EC₅₀−１) = K_dlog(Ｂ) (式中、EC₅₀は、50%毒性を与えるジフテリア毒素の濃度であり、Ｂは、阻害物質DTR1の濃度である)に従ってHB-EGFについてのDTR1のKdを評価するためのシルド回帰(regression de Schild)を表す。 10^-9Ｍの濃度での各DTR1変異体(ここではG2という)による、ベロ細胞に対する10^-11Ｍの濃度でのジフテリア毒素の毒性の影響の阻害を表す。 (Ａ)DTR8の用量を増加することによる、ベロ細胞に対する漸増用量のジフテリア毒素の毒性の影響の阻害、および、(Ｂ)等式log(EC₅₀−１) = K_dlog(Ｂ) (式中、EC₅₀は、50%毒性を与えるジフテリア毒素の濃度であり、Ｂは、阻害物質DTR8の濃度である)に従ってHB-EGFについてのDTR8のKdを評価するためのシルド回帰を表す。漸増用量のDTR8(Ａ)およびCRM197(Ｂ)による、EGFRを発現し、その増殖がHB-EGF依存性であるBa/F3細胞に対する漸増用量のHB-EGFの増殖性の影響の阻害を表す。 20名の健常ドナーの血清中に存在する抗体による、CRM197、ジフテリア毒素ドメインＣ(Ｃ)およびドメインＴ(Ｔ)、DTR1およびDTR8タンパク質の認識を表す。力価は、バックグラウンドノイズを減じた後に、ELISAアッセイにおける5000任意単位の蛍光シグナルを与える血清希釈として定義される。≦20の力価は、バックグラウンドノイズに相当し、よって、測定可能な抗体結合が存在しないことに相当する。30の力価を、弱い抗体応答と、中程度または強い応答とを区別するために任意に設定した。

実施例１：材料および方法
１) DTR_WTタンパク質およびその変異体の遺伝子配列のクローニング、発現および精製
天然毒素の配列Y380〜S535をカバーするジフテリア毒素のDTRドメインをコードする遺伝子配列が、本研究の出発点であった。全ての遺伝子配列は、大腸菌での発現のために最適化した後に、以前に決定されたタンパク質配列に従ってGeneart社により合成された。これらの配列を、pET28a(+)ベクター(Novagen)中に、NcoIおよびSalI制限部位にてクローニングした。NcoI部位の存在により、組換えタンパク質のＮ末端の端に相当する非天然コドンＭおよびＧが生じる。配列番号１６の配列は、158アミノ酸の野生型DTRタンパク質(DTR_WT)をコードする最適化されたヌクレオチド配列であり、これは、残基ＭおよびＧの後に天然ジフテリア毒素の残基Y380からS535が続く。変異体をコードする最適化されたヌクレオチド配列および可溶形のDTRタンパク質は、表Ｉに示すように、変異されたアミノ酸をコードする最適化されたコドンで、変異される各コドンを置き換えることにより、配列番号１６の配列から導く。

DTR_WTタンパク質の発現を、大腸菌BL21(DE3)細菌において、Terrific Broth培地中で、50μg/mlのカナマイシンの存在下で37℃にて行った。タンパク質の誘導は、１mMのイソプロピルβ-Ｄ-１-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えることにより行う。細菌を、5000ｇにて45分間の遠心分離により回収し、20 mMのリン酸ナトリウム、500 mM NaCl、0.25 mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、リゾチーム(0.25 mg/ml)、pH８の緩衝液中で、細胞破砕機(Constant Systems)を通過させることにより溶解した。タンパク質を含有する封入体を、0.1Ｍ Tris-HCl、pH８中に８Ｍの尿素を含有する溶液中で可溶化した。タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーにより、５ml HiTrap(商標)SPカラム(GE Health Care Life Sciences)で、0.1Ｍ Tris-HCl、pH８中の８Ｍ尿素と、0.1Ｍ Tris-HCl、pH８中の８Ｍ尿素、１Ｍ NaClとの間の緩衝液勾配により精製し、次いで、２ステップの透析、すなわち最初は20 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、１mMシステイン/８mMシスチン、0.5%サルコシル、pH８の緩衝液に対して、次いで20 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、0.5%サルコシル、pH８の緩衝液に対して透析することにより折り畳んだ。

DTRタンパク質の変異体および可溶形の発現は、大腸菌BL21(DE3)細菌において、2YT培地中で、50μg/mlのカナマイシンの存在下で行った。37℃にて２時間20分の培養の後に、タンパク質の誘導を、１mMのIPTGを加えることにより行う。次いで、30℃にて４時間30分の後に、細菌を、5000ｇにて30分間の遠心分離により回収し、ベンゾナーゼ(6.25Ｕ/ml)、pH 7.8を補った20 mMリン酸ナトリウム、0.25 mM PMSF、２mM MgCl₂の緩衝液中で、細胞破砕機(Constant Systems)により溶解した。溶解混合物中に溶解しているタンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーにより、５ml HiTrap(商標)SPカラムで、20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.8と20 mMリン酸ナトリウム、１Ｍ NaCl、pH 7.8 (GE)との間の勾配により精製し、20 mMリン酸ナトリウム、500 mM NaCl、pH 7.8の緩衝液中で−20℃にて貯蔵した。

２) 可溶性変異体の選択のためのスクリーニング
合成により生成し、pET28a(+)プラスミドにクローニングした３つのDTR配列ライブラリーを、大腸菌BL21(DE3)株(Geneart)に遺伝子導入した。各ライブラリーについて、クローンを、２枚または４枚の96ウェルプレートにおいて、選択抗生物質および発現誘導物質(IPTG)の存在下にて培養培地中で継代培養した。増殖後に、細菌を、Lysonase(商標)(Novagen)を加えたBugbuster(商標)溶液(0.5×最終濃度) (Novagen)を用いて溶解した。プレートを2700ｇにて４℃で20分間遠心分離した後に、封入体の存在について、ウェルごとにペレットのサイズにより評価し、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル上で溶解上清を分析し、クーマシーブルー染色することにより可溶性タンパク質画分を同定した。

３) ジフテリア毒素の毒性の阻害によるDTRタンパク質の活性についての試験
ベロ細胞(ATCC CCL-81(商標))を、96ウェルCytostar-T(商標)シンチレーションプレート(Perkin Elmer)に、ウェルあたり50000細胞で、２mMのグルタミン、１%のペニシリン/ストレプトマイシン溶液、１%の非必須アミノ酸溶液および10%の胎仔ウシ血清を補ったDMEM培地(ダルベッコの改変イーグル最少必須培地)中に播種した。様々な濃度のジフテリア毒素(Sigma)を２重に加えた。これらの条件を、試験するアンタゴニスト: DTR_WT、変異体DTRまたはCRM197タンパク質(Sigma)の存在下で反復した。37℃、５%CO₂雰囲気で22時間のインキュベーションの後に、培養培地を、１μCi/ウェルの¹⁴[Ｃ]-ロイシン(GE Health Care Life Sciences)を含有するロイシンフリー培地で置き換えた。37℃、５%CO₂雰囲気で５時間のインキュベーションの後に、細胞に取り込まれた放射活性を、粘着フィルムで覆ったプレートをMicroBeta(登録商標)装置(Wallac)中に入れることによりカウントした。

４) HB-EGFの増殖活性の阻害によるDTRタンパク質の活性についての試験
この試験は、実験室においてEGFR遺伝子を遺伝子導入したマウスリンパ球系株化細胞Ba/F3(Palacios, RおよびSteinmetz, M., Cell, 1985, 81, 727〜734)を用いる。この系統は、その増殖がHB-EGFまたはアンフィレギュリンに依存する。細胞を、96ウェルNunclon(商標)プレート(Nunc)に、ウェルあたり10000細胞で、２mMのグルタミン、１%のペニシリン/ストレプトマイシン溶液、１%の非必須アミノ酸溶液および10%の胎仔ウシ血清を補ったRPMI(ロズウェルパーク記念研究所)1640培地中に播種した。様々な濃度のHB-EGFまたはアンフィレギュリンを２重に加えた。これらの条件を、試験するアンタゴニスト:変異体DTRまたはCRM197タンパク質の存在下で反復した。37℃、５%CO₂雰囲気で24時間のインキュベーションの後に、１μCi/ウェルの³[Ｈ]-チミジン(GE Health Care Life Sciences)を各ウェルに加えた。37℃、５%CO₂雰囲気で５時間のインキュベーションの後に、細胞をガラス繊維フィルタ(フィルタマットＡ、Wallac)上に、Tomtec(登録商標)装置を用いて吸引した。フィルタを乾燥させた後に、シンチレーション液の入った密閉袋の中にフィルタを入れ、細胞に取り込まれた放射活性を、MicroBeta(登録商標)装置(Wallac)でカウントした。

５) DTRタンパク質のCD4Ｔエピトープの同定
DTRタンパク質のCD4Ｔエピトープの同定は、白人表現型において優勢なHLA-DRB1分子に関して拘束されるDTR特異的CD4Ｔリンパ球系統により認識されるDTRペプチドの分析により行う。用いたプロトコールは、以下の改変を除いて、WO 2010/076413に以前に記載されたものである: (1)DTR特異的CD4Ｔリンパ球系統は、ドナーCD4Ｔリンパ球を、オーバーラップするDTRペプチドのプールを載せた自己成熟樹状細胞と共培養することにより産生し、(2)産生される系統の特異性は、CD4Ｔリンパ球系統を産生するために用いたペプチドプール(DTRについての系統の特異性を確かめるため)、または該プールのあるペプチド(各系統の特異性を決定するため)のいずれかを載せた自己末梢血単核細胞(PBMC)を用いるELISPOT-IFN-γアッセイにより分析する。

ａ) PBMCからのCD4Ｔリンパ球の単離
異なる年齢および異なるHLA-DRB1表現型の７名のドナーを、これらの全てのドナーが白人表現型において優勢な８のHLA-DRB1分子(HLA-DR1; HLA-DR3; HLA-DR4; HLA-DR7; HLA-DR11; HLA-DR13; HLA-DR15; HLA-DR8)を発現するように選択した。各ドナーのCD4Ｔリンパ球を、製造者(Myltenyi Biotech)により定義される標準的な手順に従う抗CD4抗体とカップリングした磁性ビーズを用いるカラム上での磁性選別により98%を超える精製の程度で末梢血単核細胞(PBMC)から単離した。

ｂ) DTR特異的CD4Ｔリンパ球系統の産生および特徴決定
DTR配列全体をカバーする25のオーバーラップする15アミノ酸ペプチドを合成した(Intavis Bioanalytical Instruments)。

ペプチドを、３つのプールに群分けした：
- プール１：ペプチド１〜８
- プール２：ペプチド９〜16
- プール３：ペプチド17〜25。

各プールをインビトロで用いて、研究のために選択したドナーからのCD4Ｔリンパ球を繰り返し独立して感作した。ペプチドのプールあたり最小限で30の共培養ウェルを作製する。まず、CD4Ｔリンパ球系統とよばれる、刺激の間に用いたペプチドプールを認識できる感作したCD4Ｔ細胞を、ペプチドプールを載せた自己PBMCを抗原提示細胞として用いるELISPOT-IFN-γアッセイにより選択する。次に、最初の分析中に選択されたCD4Ｔ系統により特異的に認識されるペプチドを、プールのそれぞれのペプチドを別々に載せた自己PBMCを抗原提示細胞として用いるELISPOT-IFN-γアッセイにより同定する。抗原(単離ペプチドまたはペプチドプール)認識特異性は、(1)バックグラウンドノイズ(抗原の非存在下、すなわちPBMCのみ)と比較した、抗原(PBMC + ペプチド)に応答してIFN-γを産生するCD4 T リンパ球の数の間の比が２より大きく、(2)バックグラウンドノイズを一旦減じて、抗原の存在下で最小限の数が30スポットであることにより定義される。

６) DTRタンパク質の抗原性の評価
各ステップにて、インキュベーションを、以下の３つの条件のいずれかの下で行った：37℃にて１時間または20℃にて２時間または４℃にて16時間。試験したタンパク質(CRM197、触媒ドメイン、移動ドメイン、DTR1およびDTR8)を、1.7×10^-8Ｍの濃度にてPBS緩衝液、pH 7.4中に溶解して、96ウェルMaxisorp(商標)プレート(Nunc)に吸着させた。ウェルを、PBS中で３%のウシ血清アルブミン(BSA) (Sigma)の溶液を用いて飽和させた。0.05%のTween 20を含有するPBS緩衝剤の溶液で４回洗浄した後に、健常ドナーの血清を、0.2%のBSAおよび0.05%のTween 20を含有するPBS緩衝液で1/20、1/200または1/2000に希釈した後にウェル中で２重にインキュベートした。0.05%のTween 20を含有するPBS緩衝剤の溶液で４回洗浄した後に、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG抗体(Sigma)を、0.2%のBSAおよび0.05%のTween 20を含有するPBS溶液で1/200に希釈した後にウェル中でインキュベートした。0.05%のTween 20を含有するPBSの溶液で４回洗浄した後に、試験を、50 mM炭酸塩、１mM MgCl₂、pH 9.8の緩衝液で希釈した0.1 mMの４-メチルウンベリフェリルホスフェート(Sigma)溶液中で20℃にて30分間インキュベートすることにより可視化した。ウェルの蛍光(450 nmでの発光)を、Victor蛍光光度計(Wallac)で、365 nmでの励起により測定した。

試験する前に、血清を20℃にて１日静置し、10000ｇにて10分間遠心分離し、次いで、0.003%のチメロサールを加えた後に４℃または−20℃にて貯蔵した。

実施例２：DTRタンパク質の溶解性の改善
大腸菌で発現されるDTR_WTタンパク質は、不溶性の封入体中に蓄積される。タンパク質は、0.5%のサルコシルまたはドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのみ取得、可溶化および精製できるが、これらの洗浄剤は、これらの濃度では治療用に適合しない。他の可溶化分子(Tween-80、白糖、アルギニン)の使用は、成功しなかった。タンパク質を可溶化するためにカオトロピック剤、例えば尿素または塩化グアニジンを用い、その後に様々な折り畳み緩衝液に対して透析することによっても、可溶性の機能的タンパク質を得ることができない。完全ジフテリア毒素配列に対するDTR切断部位の影響についても研究した。残基A379、Y380、S381、P382、G383、H384またはK385で開始する形のDTRは、洗浄剤の非存在下で全て不溶性であった。

DTRタンパク質の溶解性を増加するために用いた方策は、タンパク質の表面に存在する疎水性残基を、極性または荷電親水性残基で変異することであった。これは、タンパク質の表面の疎水性残基は、低い溶解性および凝集する傾向の原因である可能性があるからである。導入する変異を、分子モデリングに基づいて同定した。タンパク質の構造に対する変異が与える可能性がある影響を、表IIIに示す。

３つのDTR DNA配列ライブラリーを合成により調製した(表IV)。各ライブラリーは、分子モデリングデータに従って選択した４または５コドンが変異した配列を含有した。各ライブラリーは、コード配列の同じ領域で変異したコドンに相当した。配列は、可能性のある変異を、モデリングデータに従う許容できる可能性がある親水性残基に限定するように、変異するコドンの部分的縮重度を含有した(位置あたり１、２または３の可能性のある変異)。野生型コドンを保持する可能性は、そのＮ末端の位置が耐容性であると考えられたY380以外(これは、比較的、非常に束縛されない)は、試験した位置が変異に耐えられない場合に(表IV)維持した。

DNAライブラリーの遺伝子導入の後に、得られた細菌コロニー(それぞれは、所定の変異組み合わせに相当する)を、DTRタンパク質の可溶性変異体形を産生する能力について分析した。このために、３つのライブラリーに由来する740クローン(予測される多様性(各ライブラリーについて41の異なるクローン)の85%である)を、96ウェルプレートで継代培養し、タンパク質発現誘導条件下で培養し、遠心分離し、次いで溶解溶液中で溶解した。遠心分離の後に、各クローンにより発現されたタンパク質の溶解性を、ウェルの底にある、可能性がある封入体のペレットについて観察し、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動とクーマシーブルー染色により上清を分析することにより評価した(図１)。

コロニーの分析により、ペレット(封入体に相当するペレット)が存在しないか、またはペレットのサイズが低減されており、かつ溶解上清中に大量のタンパク質があるクローンを選択した。R1ライブラリーだけが、可溶性DTRを産生するクローンを生じることができたが(図１)、このようなクローンは５つあった。1D3、1D6、2C8、5G5および1H3とよばれるこれらのクローンは、それぞれ配列番号２〜６のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。全てのクローンは、実施例１に記載する方法に従う精製の後に可溶性であった。30℃での発現の後に最大量の可溶形のDTRを得ることを可能にするG1ともよばれる1D6クローンは、変異: Y380K/Q387E/L390Tを有した。

モデリングアプローチにより、R1ライブラリー中にない２つのさらなる変異: A395TおよびN399Dが提案された。これらの２つの変異を1D6クローン(またはG1クローン)にそれぞれ導入して、可溶化効果の増加について検索したところ、A395T変異がそれに当てはまった(図２)。
合わせると、DTR1とよばれる最も可溶性のDTRタンパク質(配列番号７)は、変異: Y380K/Q387E/L390T/A395Tを有する。
このことは、その他のDTR変異が、大腸菌におけるその溶解性および産生をさらに改善し得るという事実を排除しない。

DTR1タンパク質のHB-EGF結合活性を、ジフテリア毒素によるベロ細胞の中毒を阻害する能力、つまり毒素とプロHB-EGFとの結合を阻害する能力により評価した。結果は、DTR1が、ジフテリア毒素によるベロ細胞の中毒を用量依存的な様式で阻害することを示す(図３)。DTR1の阻害効果を、CRM197、1D6クローンおよび0.5%のサルコシル中で可溶化したDTR_WTのものと比較した。３つの相互作用についてシルド回帰により推定されるKd値は、以下の値である。

装置のチップ上にHB-EGFを固定化し、移動画分中にDTR1を注入して、会合および解離定数を測定するBiacore実験により、CRM197の推定Kdが確認でき、DTR1についてかなりより高いKdが示された。しかし、解離の遅さにより、BiacoreではDTR1の解離定数を正確に測定できない。残りの研究において、変異体の親和性は、細胞毒性およびシルド回帰により推定した。

実施例３：DTRタンパク質の結合部位の改善
HB-EGFとの相互作用におけるジフテリア毒素の構造(Louieら, Mol. Cell., 1997, 1, 67〜78)により、２つのタンパク質の間の界面を分析できる。インシリコ分子モデリング実験と組み合わせたこの構造分析により、HB-EGFに対するタンパク質の親和性を増加するために、DTR結合部位における10の変異を選択できた。これらの変異は、２つのタンパク質の間の水素結合、塩橋および/またはファンデルワールス接触の形成を促進することにより相互作用のエンタルピーを増加することを意図した。選択した変異がタンパク質の構造に与える可能性がある影響を、表VIに示す。

変異を、DTR1タンパク質に、部位特異的変異誘発により導入した(表VII)。

タンパク質を大腸菌で発現させた。これらは、実施例１に記載する細胞毒性試験に従って、プロHB-EGFとのジフテリア毒素の結合を阻害する能力について試験した。図4Aは、ベロ細胞に対するジフテリア毒素の毒性を阻害する各変異体の能力を示す。結果は、F389YおよびG510A変異体だけが、ジフテリア毒素の毒性を著しく阻害することを示す。DTR1にこれら２つの変異を導入することにより、累積的な効果が得られる(図4B)。
F389YおよびG510A変異を有するDTR1タンパク質に相当する最も活性な変異体を、DTR3と称した(配列番号８)。そのHB-EGF結合親和性を、実施例２に記載するように、漸増量のDTR3がベロ細胞に対する漸増量のジフテリア毒素の毒性の影響を阻害する能力により評価した。阻害曲線のEC50値からのシルド回帰により推定されるKdを、表VIIIに示す。

この値は、DTR3がHB-EGFに対する親和性を有し、その親和性が、CRM197よりも少なくとも300倍大きく、DTR1よりも５倍大きいことを示唆する。

実施例４：主要CD4Ｔエピトープの排除によるDTRタンパク質の免疫原性の低減
DTR_WTの配列全体をカバーする25のオーバーラップするペプチドが特異的CD4Ｔリンパ球を活性化する能力を、異なる年齢および異なるHLA-DRB1表現型の７名の健常ドナーの血液から精製したCD4Ｔリンパ球および樹状細胞を用いるインビトロ免疫化実験において、ELISPOTにより試験した。

結果は、DTR_WTタンパク質に対する免疫応答が、タンパク質の60%をカバーする５つのエピトープ領域を優勢に指向し、該領域に対しては、ドナーの少なくとも71%、すなわち研究した７名のうち５名のドナーが応答する(表IX)：
- L₄₂₇-L₄₄₁領域(ペプチド９)、これに対する特異的CD4Ｔリンパ球は、研究したドナーの全てについて、高い程度で検出された(スクリーニングした230系統のうち51系統、すなわち22%)、
- H₃₉₁-Q₄₁₁ / S₄₅₁-D₄₆₅ / S₄₇₅-N₅₀₂領域(それぞれペプチド３-４、13および17-18-19)、これに対しては、全体的に、特異的CD4Ｔ細胞が、ドナーの86% (すなわち６名のドナー/７名)について、上記の領域よりもわずかにより穏やかな程度で検出された(20から30の特異的CD4Ｔリンパ球系統、すなわち8.5から13%)、ならびに
- S₅₀₆-H₅₂₀領域(ペプチド22)、これに対する特異的CD4Ｔ細胞は、ドナーの71%について、８%の程度で検出された。

５エピトープ領域が同定されたので、HLA-II分子とのこれらの結合を低減するためのこれらのエピトープの変異を構想できる。ProPredサーバ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて、DTR_WTのこれらの５つの領域内で、個体群において最も一般的な８つのHLAクラスII対立遺伝子と結合できる配列を予想した(表Ｘ)。DTR1の変異した配列に用いた同じ分析により、DTRの溶解性を改善するために導入した変異が、タンパク質の免疫原性を低減したことが示される(領域378-403について予想されるエピトープ)。実際に、DRB1_0301と結合すると予想されるエピトープは消失し、DRB1_0401と結合すると予想されるエピトープのうちの１つは、その閾値の増加、すなわちHLA分子についての予想される親和性の低減を経験する。

HLAクラスII分子と結合すると予想される配列の繋留残基の予想により、可能性のあるＴエピトープを排除することを意図する、表Ｘに太字で示す一連の変異を提案できた。これらの変異は、タンパク質の不安定化の可能性を回避するように選択されたが、このことは、分子モデリングによりインシリコで試験した。HB-EGF結合部位に影響するいずれの変異も除外した。タンパク質の構造に対する、提案される変異が与える可能性がある影響を表XIに示す。

表XIIに示す変異を個別にまたは組み合わせて、モデリングデータに従ってDTR3タンパク質の配列に導入し、次いで、組換えタンパク質の産生もその生物活性も変化させない場合に変異を徐々に蓄積した。変異体の生物活性は、ベロ細胞に対するジフテリア毒素の毒性の阻害により試験した。

これらの実験により、以下の変異を連続的に保持できた: N399K、V452T、T517E、V483Q、H492E、S494K、T436HおよびE497D。
DTR3に由来し、N399K、V452T、T517E、V483Q、H492EおよびS494K変異を蓄積するタンパク質は、DTR8と称する(配列番号９)。これは、17458 DaのMWを有する。これらの変異により、DTR_WTにおいて同定される26のCD4Ｔエピトープのうち10を排除できた(表XIII)。

これらの10エピトープは、DTR_WTの免疫優性エピトープであると予想される９エピトープのうちの７つを含む。得られたタンパク質DTR8がCD4型の免疫応答を誘導する、すなわち抗体を産生する能力は、よって、野生型の形でのDTR_WTのものと比較してかなり低下している。

DTR8は、DTR3よりも６つ多くの変異を含有する。任意の変異または変異組み合わせはタンパク質の機能を損なうことができるので、HB-EGFに対するDTR結合親和性に対するこれらのさらなる変異の影響を評価する必要がある。DTR8タンパク質のHB-EGF結合活性を、ジフテリア毒素によるベロ細胞の中毒を阻害するその能力、よってプロHB-EGFとの毒素の結合を阻害するその能力により評価した。結果(図５)は、DTR8が、用量依存的な様式でジフテリア毒素によるベロ細胞の中毒を阻害することを示す。DTR8の阻害効果を、CRM197、0.5%のサルコシル中で可溶化したDTR_WT、DTR3およびDTR1のものと比較した(図３)。４つの相互作用についてシルド回帰により推定されるKd値は、以下の値である(表XIV)。

著しいことにかつ予期せぬことに、DTRの免疫原性を低減することを意図する６つの変異を加えることは、HB-EGFに対するその親和性を増加することに貢献した。全体として、DTR8は、CRM197よりもおよそ1400倍のHB-EGFに対する親和性を有する。

DTR8タンパク質のHB-EGF結合活性も、EGFR遺伝子を遺伝子導入し、その増殖がHB-EGFに依存するBa/F3株化細胞において、EGFRとのHB-EGFの結合を阻害するその能力により評価した。結果(図６)は、DTR8が、HB-EGF依存性細胞の増殖を用量依存的な様式で阻害することを示す。DTR8の阻害効果を、CRM197のものと比較した(図６)。結果は、同等の阻害効果を得るために、少なくとも300倍多くのCRM197が必要であることを示す。したがって、DTR8は、溶液中でのHB-EGFとの結合の点で、CRM197よりも少なくとも300倍効果が高い。

結論として、これらの結果は、DTR8タンパク質が、細胞の表面にてプロHB-EGF分子と(図５)、かつ溶液中でHB-EGFと(図６)結合でき、それらの生物活性を遮断できることを示す。相互作用についてのKd値の推定は、DTR8が、HB-EGFとの結合の点でCRM197よりも1400倍強力であることを示唆する。

実施例５：DTR1およびDTR8タンパク質の抗原性の評価
西洋人個体群は、ジフテリア毒素に対してワクチン接種されている。DTR8型の治療用タンパク質を用いる処置により利益を受ける可能性がある個体は、よって、前記タンパク質に対して反応できる抗体を有する可能性がある。20名の健常ドナーの血清がジフテリア毒素(その変異形CRM197で)およびその様々なドメイン(触媒(Ｃ)、移動(Ｔ)およびDTR (可溶性変異形DTR1で))を認識する能力を、ELISAによりDTR8タンパク質と比較した(図７)。≦20の抗体力価は、アッセイのバックグラウンドノイズに相当し、よって認識が存在しないことに相当する。30の力価閾値を、弱い応答または強い応答を示す血清を区別するために任意に設定した。

結果(図７)は、16/20のドナーがジフテリア毒素に対する抗体を有することを示す。14/20のドナーは、中程度から強い抗体応答を示す。しかし、個別に考慮した各血清に存在する抗体の大部分は、毒素のＣドメインを指向する(図７)。実際に、12の血清は、閾値を超える応答を示し(中程度から強い応答)、４つの血清は、閾値未満の応答を示す(弱い応答)。可溶形のＲドメイン(DTR1)に対する血清の反応性を考慮するならば、15/20の血清がＲドメインを認識する。しかし、７つの血清だけが閾値を超える応答を示す(中程度から強い応答)。著しいことに、DTR8タンパク質は、DTR1よりもドナーの血清による認識が著しく低い。実際に、３/20の血清がDTR8に対して中程度から強い反応性を示し、２つの血清が弱い反応性を示す(図７)。

結論として、これらの結果は、DTR8タンパク質の抗原性が弱く、CRM197のものと比較してかなり低下していることを示す。この抗原性は、最小数の変異を有する可溶形のDTRに相当するDTR1タンパク質のものと比較しても低減している。言い換えると、HB-EGFに対するその親和性を増加させ、その免疫原性を低減させるためにDTRに導入した変異は、その抗原性をかなり低減することに貢献している。

Claims

ジフテリア毒素のＲドメインに相当する配列番号１のアミノ酸配列の残基380から535と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、前記配列が、少なくとも置換Y380KおよびL390T、またはY380EおよびL390Tを含み、前記配列が、前記ＲドメインのＮまたはＣ末端の端にて、ジフテリア毒素のＴドメインもしくはＣドメインおよびＴドメインの配列、ならびに前記Ｒドメインの安定性もしくは精製を改善できるタンパク質もしくはタンパク質ドメインの配列を有さない、HB-EGFを阻害するリガンドである組換えタンパク質。
少なくとも置換Y380K、Q387EおよびL390Tを含む請求項１に記載のタンパク質。
置換A395Tをさらに含む請求項１または２に記載のタンパク質。
置換F389Yおよび/またはG510Aの少なくとも１つも含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
N399K、V452T、T517E、V483Q、H492E、S494K、T436HおよびE497Dからなる群より選択される少なくとも１の置換も含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
置換N399K、V452T、T517E、V483Q、H492EおよびS494Kを含む請求項５に記載のタンパク質。
配列番号２〜９のアミノ酸配列の１つを含むかまたはそれからなる請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
検出可能なトレーサで標識された請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
放射活性同位体または蛍光体で標識された請求項８に記載のタンパク質。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
配列番号１０、１２または１４のヌクレオチド配列の１つを含む請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えクローニングおよび/または発現ベクター。
請求項１２に記載のベクターで改変された細胞。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１の組換えタンパク質または請求項１２に記載の組換え発現ベクターと、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
急速進行性糸球体腎炎、がん、脳挫傷に伴う血管攣縮、心肥大、平滑筋細胞過形成、肺高血圧症、糖尿病網膜症および動脈再狭窄からなる群より選択されるHB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患の処置において用いるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
急速進行性糸球体腎炎、がん、脳挫傷に伴う血管攣縮、心肥大、平滑筋細胞過形成、肺高血圧症、糖尿病網膜症および動脈再狭窄からなる群より選択されるHB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患の処置において用いるための、請求項１２に記載の組換え発現ベクター。
急速進行性糸球体腎炎、がん、脳挫傷に伴う血管攣縮、心肥大、平滑筋細胞過形成、肺高血圧症、糖尿病網膜症および動脈再狭窄からなる群より選択されるHB-EGF/EGFR経路の活性化に関連する疾患のインビトロ検出を補助するための、請求項８または９に記載の標識タンパク質の使用。