EA006137B1

EA006137B1 - Мутантный хемокин rantes человека и применение мутантных хемокинов для лечения рассеянного склероза

Info

Publication number: EA006137B1
Application number: EA200300439A
Authority: EA
Inventors: Аманда Праудфут; Тимоти Н.К. Уэллс; Мари Коско-Вильбуа
Original assignee: Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2005-10-27
Also published as: ATE265222T1; IL155178A; PT1326628E; UA77950C2; KR100837898B1; KR20030034238A; CA2423616A1; SK287523B6; CN1285381C; CA2423616C; EP1326628A2; DK1326628T3; RS50738B; AR030854A1; CN1477969A; DE60103078D1; AU1591902A; HRP20030215A2; WO2002028419A3; CZ2003947A3

Abstract

Мутантные СС-хемокины, которые содержат по меньшей мере две мутации в катионном сайте петли 40-ых положений аминокислот, как показано на фиг. 1, и которые по сравнению с молекулой дикого типа обладают пониженной GAG-связывающей активностью. В частности, было установлено, что такие мутантные хемокины являются эффективными при лечении рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний. Тройной мутант RANTES представляет соединение, показывающее наилучшие результаты.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к мутантным СС-хемокинам, которые включают по меньшей мере две мутации в петле 40-ых положений аминокислот и которые по сравнению с молекулой дикого типа обладают пониженной САС-связывающей активностью: было установлено, что такие мутантные хемокины эффективны при лечении рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний.

Предпосылки изобретения

Хемокины составляют семейство небольших цитокинов провоспаления с хемотаксическими и активирующими для лейкоцитов свойствами. В зависимости от положения первых консервативных цистеинов семейство хемокинов подразделяется на С-С-, С-Х-С- и С-Х₃-С-хемокины (ВадщоПш М. е! а1., Айу. 1ттипо1. 1994, 55:97-179; Ваддюйш М. е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1. 1997, 15:675-705; ТаиЬ Ό. е! а1. , Су!окше СтоМк Рас!от Кеу. 1996, 7(4):355-76).

Многие С-Х-С-хемокины, такие как интерлейкин-8 (1Ь-8), являются хемотаксическими для нейрофилов, в то время как СС-хемокины активны в отношении различных лейкоцитов, включая моноциты, лимфоциты, эозинофилы, базофилы, ΝΚ-клетки (естественные киллеры) и дендритные клетки.

ИН₂-концевой домен хемокинов участвует в связывании с рецептором, и ИН₂-концевой процессинг может либо активировать хемокины, либо превращать хемокины в полностью неактивные.

Ν-концевые варианты синтетических С-С-хемокинов тестировали на их активность в качестве ингибиторов или антагонистов естественных форм. МСР-1, МСР-3 и ΚΛΝΤΕ8, потерявшие 8-9 ИН₂концевых аминокислот, являются неактивными на моноцитах и пригодны в качестве антагонистов рецепторов (Сопд кН. е! а1., 1. Ехр. Мей. 1995, 181 (2): 631-40 и Сопд ЕН. е! а1., 1. Вю1. Скет., 1996, 271 (18):10521-7).

Увеличение ΚΑΝΤΈ8 на один метионин приводит к почти полной инактивации молекулы, и Ме!ΚΑ.ΝΤΈ8 ведет себя, как антагонист в отношении аутентичного ΚΛΝΤΕ8 (РгоийГоо! А.Е. е! а1., 1. Вю1. Скет., 1996, ЕеЬ. 2; 271 (5):2599-603).

\νϋ 99/16877 относится к усеченному с аминоконца ΚΑ.ΝΤΈ8, у которого отсутствуют ΝΗ₂концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1, 1-2, 1-3 или 1-4 естественного ΚΑ.ΝΤΈ8, и обладающему хемокин-антагонистической активностью, а также к последовательностям ДНК, кодирующим их, их применению для терапии и/или диагностики заболеваний, при которых необходима антагонистическая активность для действия хемокинов. ΚΑΝΤΕ8 (3-68) представляет предпочтительный усеченный антагонист хемокинов.

Несмотря на то, что в целом хемоаттрактантная активность Κ.ΑΝΤΕ8 и СС-хемокинов изучалась в основном в связи со специфическими мембранными рецепторами клеток, ΚΑΝΤΕ8 может также взаимодействовать с гликозаминогликанами (ОАО), широко различающимися, разветвленными группами сахаров, добавляемыми к некоторым белкам после трансляции, обычно называемых протеогликанами (РС). Такие белки находятся на клеточных мембранных, во внеклеточном матриксе и кровотоке, где могут также присутствовать свободные САС.

Взаимодействие с САС является свойством, присущим многим передающим сигнал клетке растворимым молекулам (интерлейкинам, факторам роста). РС или свободные САС могут образовать комплекс с растворимыми молекулами, возможно с целью защитить данную молекулу от протеолиза во внеклеточной среде. Было высказано также предположение, что САС могут помочь в правильной презентации молекул, передающих сигнал клетке, их специфическому рецептору и, в определенных случаях, также модулировать активацию клеток-мишеней.

В случае хемокинов концентрирование в постоянных градиентах в месте воспаления и, следовательно, взаимодействие с рецепторами клеток и их активация, вероятно, модулируется различными формами САС (Нооде\\'егГ А.Е е! а1., ВюскетЩгу 1997, 36(44):13570-8). Следовательно, было высказано предположение, что модуляция таких взаимодействий может представлять терапевтический подход при воспалительных заболеваниях (8ск\таг/ М.К. апй \Vе11к Τ.Ν., Сигг. Орш. Скет. Вю1., 1999 3(4):407-17) и ВИЧ-инфекции (Витк ЕМ. е! а1., Ргос. Иа!1. Асай. 8сЕ И8А, 1999, 96 (25) : 14499-504).

Структурные требования и функциональные эффекты взаимодействия СΑС-Κ.ΑNΤΕ8 изучали на различных моделях. КА№1Е8 связывается с САС на человеческих эндотелиальных клетках пупочной вены (НИУЕСк) в микромолярных концентрациях с аффинностью и специфичностью выше, чем другие хемокины, такие, как МСР-1, 1Ь-8 или М1Р-1альфа. По-видимому, такое взаимодействие является не просто электростатическим, но также зависит от других параметров, таких, как длина и Ν- и Осульфатирование САС (Кикскег! С.8. е! а1., Вюскет1к!ту, 1999 38(39): 12959-68). Клеточные линии с дефицитом САС также могут связываться с хемокинами, но присутствие поверхностных САС на клетке значительно усиливает их активность по отношению к рецепторам, когда они находятся в низких концентрациях (Ак 8. е! а1., 1. Вю1. Скет., 2000, 275 (16) :11721-7). В других опытах было показано, что САС, в частности, гепаринсульфат, способствуют взаимодействию ΚΛΝΤΕ8 с клеточной поверхностью макрофагов и последующему подавлению ВИЧ-инфекции, результат, согласующийся с хорошо известной резистентностью этих клеток со слабой экспрессией гепаринсульфата, к противовирусному действию ΚΛΝΤΕ8 (Огатесх Т. е! а1., 1. 1ттипо1., 1997, 159 (9) :4587-92).

Растворимые САС конкурируют с клеточными мембранными САС и могут действовать в качестве

- 1 006137 специфических ингибиторов индуцированной ΚΆΝΤΕ8 активации поверхности (Аррау V. с1 а1., Ιηΐ. 1ттиио1., 2000, 12 (8):1173-82) или в качестве супрессора ВИЧ-инфекции (Витк ЕМ. е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 1999, 96(25):14499-504).

В некоторых опытах по изучению зависимости структуры-функции была предпринята попытка идентифицировать домен ΚΑΝΤΈ8, ответственный за взаимодействие с ОАО, поскольку традиционная консенсусная последовательность (ВВХВ, где В представляет основный остаток, и X может быть любым остатком) является слишком общей. Провели картирование эпитопа с использованием моноклонального антитела, полученного против рекомбинантного человеческого ΚΑΝΤΈ8, способного блокировать как противовирусное действие, так мобилизацию внеклеточного кальция, опосредуемые ΚΑΝΤΈ8 (Витк ЕМ. е1 а1., 1. Ехр. Меб., 1998, 188 (10) :1917-27). Данный подход позволил определить остатки 55-66, в качестве необходимых как для проявления подобной активности, так и для взаимодействия с ОАО, доказывая, что взаимодействие с ОАО может иметь дополнительную или отличную функцию от таковой, опосредуемой соответствующими рецепторами, как было также предположено при исследовании вариантов КА№ГЕ8, обладающих измененными агрегационными свойствами (Аррау V. е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 1999, 274 (39) :27505-12).

Область 55-66, которая представляет С-концевой альфа-спиральный сегмент, является гомологичной к ОАО-связывающему домену других хемокинов таких, как 1Ь-8 (Л111 И.Р. аиб Ьаибет А.И., Сигг. Вю1., 1994, 4 (5):394-400), и содержит катионный сайт, содержащий лизин и аргинин (ККЛ'УК). Такая связывающая область отличается от связывающего сайта для клеточных рецепторов, находящегося в Νконце (Рак1аиа1йаи Ό.Ρ.. е1 а1., Вюсйет181гу, 1997, 36 (32):9642-8) и включает некоторые остатки, участвующие в агрегации мономеров Κ^ΝΤΕδ, даже несмотря на то, что дезагрегирующие мутации, повидимому, не оказывают влияния на взаимодействие с ОАО (Схар1е\\'8к| Ь.О. е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 1999, 274 (23) :16077-84; ЛО 98/13495).

ΚΑNΤΕ8 включает другой катионный сайт (ΚΚΝΚ) в положениях остатков 44-47, который сохраняется в ОАО-связывающем сайте других хемокинов, таких, как ΜΙΡ-1α (Коортаии Л. аиб Ктаиде1 М.З., 1. Вю1. Сйет., 1997, 272(15):10103-9) и М1Р-1Р (Коортаии Л. е1 а1., 1. 1ттиио1., 1999, 163 (4):2120-7).

Варианты человеческого ΚΑNГΈ8, содержащие единичные мутации в данных катионных сайтах, раскрыты в качестве антагонистов Κ^ΝΤΕδ, обладающих потенциальными терапевтическими применениями при лечении ВИЧ-инфекции и воспалительных или аллергических заболеваний (ЛО 99/33989).

Было также раскрыто, что только тройной мутант КΑNΤΕ8. в котором три остатка в положениях 44, 45 и 47 замещены аланином, потерял способность связываться с ОАО (А. Ртоиб1оо1 е1 а1., Сйетокше Согбои СоиГегеисе, Зеккюи I, 1и1у 24'¹'. 2000, персональное сообщение).

Описание изобретения

В настоящее время установлено, что СС-хемокины, содержащие по меньшей мере две мутации в катионном сайте, так называемой петли 40-ых положений аминокислот, являются эффективными при лечении рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний. Данный сайт представляет консервативный ОАО-связывающий мотив в СС-хемокинах (таких, как КΑNΤΕ8. М1Р-1 альфа и М1Р1бета, М1Р-3, НСС1, Ι309, МСР-2). Все эти мутантные хемокины обладают пониженной способностью связываться с ОАО по сравнению с соответствующими молекулами дикого типа.

Область, в которой должны присутствовать по меньшей мере две мутации по данному изобретению, так называемая петля 40-ых положений аминокислот, указана для ряда СС-хемокинов на фиг. 1. В частности, было установлено, что тройной мутантный Κ.ΑNΤΕ8, в котором три основных остатка в положениях 44, 45 и 47 замещены аланином, активны на моделях животных для лечения рассеянного склероза. Было показано, что данный тройной мутантный Κ.ΑNГΈ8 имеет дозозависимый эффект на мышиной модели ЕАЕ и сравнимую эффективность со стандартным лечением рекомбинантным ΙΕΝ-бета. Аналогичные результаты были получены с усеченным тройным мутантным Κ.ΑNΤΕ8, в котором три остатка в положениях 44, 45 и 47 замещены аланином и в которых отсутствуют 2№концевые аминокислоты. Данный усеченный мутантный КАК^З (обладающий аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ №: 3) является новым и представляет другой объект настоящего изобретения.

Аналогичные экспериментальные доказательства были также получены в отношении тройных мутантных М!Р-1альфа и М!Р-1бета, которые уже известны и которые здесь названы, как тройной мутантный МШ-1О, В18А-В46А-В48А (Коортаии Л. аиб Кгаиде1 М.З., 1. Вю1. Сйет., 1997, 272 (15) : 10103-9) и тройной мутантный по 40-м положениям аминокислот МШ-β К45А-К46А-К48А (Ьаигеисе 1.8., Вюсйет181ту, 2001, 40:4990-4999).

Выражение «пониженная ОАО-связывающая активность» означает, что мутанты по изобретению обладают низкой способностью связываться с ОАО, т.е. низкий процент каждого из данных мутантов связывается с ОАО (такими, как гепаринсульфат) по сравнению с соответствующей молекулой дикого типа.

Более предпочтительными являются мутантные К.ΑNΤΕ8 человека, в котором три основные аминокислоты в положениях 44, 45 и 47 молекулы дикого типа замещены другими аминокислотами. Такие остатки могут быть замещены небольшими алифатическими неполярными или слегка полярными остатка

- 2 006137 ми, такими как А1а, 8ет, Т11Г. Рго и С1у. Алании является предпочтительным.

Было установлено, что мутантными ΒΑΝΤΕ8, особенно эффективными при лечении М8, являются таковые, имеющие аминокислотные последовательности, представленные соответственно 8Ε0 ΙΌ Νο: 2 и 8ΕΟ ΙΌ Νο: 3.

Другим объектом настоящего изобретения является применение мутантных хемокинов, определенных выше, для получения фармацевтической композиции для лечения рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний.

Рассеянный склероз (М8) представляет медленно прогрессирующее заболевание ЦНС, характеризующееся рассеянными бляшками демиелинизации в головном мозге и спинном мозге, приводящее к множественным и различным неврологическим симптомам и признакам, обычно с ремиссиями и обострением (см. Мегск Мапиа1, 16-е издание).

Причина заболевания неизвестна, но в качестве таковой предполагается иммунологическое нарушение при наличии в настоящее время некоторой информации, указывающей на специфический механизм. Высказываемые причины включают заражение медленно развивающимся или латентным вирусом, и миелинолиз под действием ферментов. Уровень 1дО обычно повышен в СМЖ, и увеличенные титры связывали с различными вирусами, включая корь. Значение данных фактов и сообщений о взаимосвязи с НЕА-аллотипами и измененным количеством Т-клеток неясно, поскольку доказательства являются до некоторой степени противоречащими. Повышенная частота заболевания в семьях предполагает наличие генетической предрасположенности: женщины чаще заболевают, чем мужчины. По-видимому, имеются факторы окружающей среды. Несмотря на то, что начало заболевания обычно приходится на возраст между 20-40 годами, М8 связан с географической областью, где пациент проводит первые 15 лет жизни. Перемещение после 15-летнего возраста не изменяет риск возникновения заболевания.

Бляшки или островки демиелинизации с разрушением олигодендроглии и околососудистым воспалением рассеяны по ЦНС, в основном в белом веществе с предрасположением к латеральным и задним столбам (особенно в шейной и дорсальной областях), зрительных нервах и перивентрикулярных областях. Поражаются также пути в среднем мозге, мосте и мозжечке, может быть также поражено серое вещество, как в мозжечке, так и спинном мозге.

Обычно сохраняются тела клеток и аксоны, особенно на ранних стадиях поражения. Позднее, аксоны могут разрушаться, особенно на длинных путях, и фиброзный глиоз придает путям их «склеротический» вид. Одновременно можно обнаружить участки поражения на ранних и поздних стадиях. Были показаны химические изменения в липидных и белковых составляющих миелина в бляшках и вокруг них.

Заболевание характеризуется различными жалобами и признаками дисфункции ЦНС с ремиссиями и постоянно возникающими обострениями.

Ядерно-магнитный резонанс (МШ) является наиболее чувствительным методом диагностики; он может показать много бляшек. Участки поражения также могут быть видимыми при контрастной компьютерной томографии.

Достижения в лечении рассеянного склероза (М8) появляются медленно, частично в результате неполного понимания патогенеза заболевания. Для эмпирического лечения основные препятствия для развития включают в сильной степени разнящееся течение М8, длительную природу наиболее важных результативных мероприятий и отсутствие объективных маркеров эффекта лечения, особенно в короткий срок.

Несмотря на то, что патогенез М8 остается неопределенным, естественная история продолжает изучаться. Были разработаны объективные результативные мероприятия, основанные на данных ядерномагнитного резонанса, и в настоящее время известны многие ошибки при клинических испытаниях, которые привели к улучшенным методам испытаний и лучшей интерпретации результатов.

Другим объектом настоящего изобретения является, следовательно, способ лечения М8 введением эффективного количества мутантного хемокина по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем.

«Эффективное количество» относится к количеству активных ингредиентов, которое достаточно для воздействия на течение и тяжесть заболевания, приводящее к уменьшению или ремиссии такой патологии. Эффективное количество будет зависеть от пути введения и состояния пациента.

Дополнительным объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, включающие мутантные хемокины по изобретению, в присутствии одного или более фармацевтически приемлемых наполнителей, для лечения М8 и/или других демиелинизирующих заболеваний.

«Фармацевтически приемлемый» означает включение любого носителя, который не снижает эффективность биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения вышеуказанные активные ингредиенты можно включить в разовую лекарственную форму для инъекций в растворителях, таких как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Помимо фармацевтически приемлемого носителя, композиции по изобретению могут также включать небольшие количества добавок, таких как стабилизаторы, наполнители, буферы и консерванты.

- 3 006137

Введение такого активного ингредиента может быть внутривенным, внутримышечным или подкожным путем. В настоящее изобретение входят другие пути введения, при которых могут быть получены желаемые концентрации соответствующих ингредиентов в крови.

Оптимальная доза активного ингредиента может быть соответственно выбрана, исходя из пути введения, состояния и характеристик пациента (пола, возраста, массы тела, состояния здоровья, массы), степени выраженности симптомов, другого одновременного лечения, частоты лечения и желаемого эффекта. Корректировка и манипуляции с установленными дозами находятся в компетенции специалистов в данной области.

Обычно суточная доза активного ингредиента может составлять примерно от 0,01 до 100 мг на кг массы тела. Обычно 1-40 мг на кг в день, введенные в раздельных дозах или в форме пролонгированного высвобождения, эффективны для достижения желаемых результатов. Второе или последующие введения можно проводить в дозе, которая является такой же, меньше или выше, чем первоначальная или предшествующая доза, вводимая индивидууму.

Настоящее изобретение описано при обращении к конкретным воплощениям, но содержание описания включает все модификации и замены, которые может проводить специалист в данной области, не отступая от смысла и цели формулы изобретения.

Сейчас изобретение будет описано с помощью следующих примеров, которые никоим образом не следует рассматривать в качестве ограничивающих настоящее изобретение. В примерах будут ссылки на фигуры, представленные здесь ниже.

Описание чертежей

Фиг. 1: представлено выравнивание некоторых примерных СС-хемокинов, выравненных на уровне петли 40-х положений аминокислот. Данный сегмент белка и катионный сайт, который соответствует ОЛО-связывающему мотиву, помещены в рамки.

Фиг. 2 - карта плазмиды, использованной для клонирования ΚΆΝΤΕ8 дикого типа и его мутантов согласно примерам.

Фиг. 3 - результаты анализа конкурентного связывания [¹²⁵Ι]-ΚΆΝΤΕ8 и мутантов гепарином в анализе с гранулами, нагруженными гепарином.

Фиг. 4 - данные анализов конкурентного равновесного связывания ΡΛΝΤΕ8 и тройного мутанта по 40-м положениям аминокислот ΡΛΝΤΕ8.

Фиг. 5 - индукция хемотаксиса моноцитов и Т-клеток под воздействием ΡΛΝΤΕ8 и тройных мутантов по 40-м и 50-м положениям аминокислот ΡΛΝΤΕ8.

Фиг. 6 - ингибирование рекрутмента перитонеальных клеток под воздействием мутанта по 40-м положениям аминокислот ΡΛΝΤΕ8.

Фиг. 7: показано ингибирование индуцированного ΡΛΝΤΕ8 рекрутмента перитонеальных клеток под воздействием усеченного тройного мутанта по 40-м положениям аминокислот Κ.ΆΝΤΕ8 (3-68), полученного в йсЫа райойк.

Фиг. 8 - ингибирование индуцированного ΜΙΡ-1β рекрутмента перитонеальных клеток под воздействием тройного мутанта по 40-м положениям аминокислот ΜΙΡ-1β (К45ЛК46ЛК48Л).

Фиг. 9 - ингибирование индуцированного М1Р-1а рекрутмента перитонеальных клеток под воздействием тройного мутанта по 40-м положениям аминокислот ΜΙΡ-1α (КТ8Л-К.46Л-К.48Л).

Фиг. 10 - ингибирование индуцированного тиогликолятом рекрутмента клеток под воздействием тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΆΝΤΕ8.

Фиг. 11 - подавление начала развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита под воздействием всех тройных мутантов по 40-ым положениям аминокислот ΡΛΝΤΕ8 по изобретению.

Примеры

1. Материалы и методы

а) Получение несвязывающих гепарин мутантов ΡΛΝΤΕ8

Мутагенез ΡΛΝΤΕ8 достигали обратной полимеразной цепной реакцией. Точечные мутации вводили в один из двух праймеров, использованных для гибридизации с человеческой кодирующей последовательностью Κ.ΆΝΤΕ8 (ОепБапк номер доступа ΝΜ-002985) в обратной ориентации. Для того чтобы повысить эффективность отжига праймеров (особенно, когда в праймеры вводили многочисленные мутации), ДНК денатурировали щелочью.

Денатурированную ДНК разбавляли до концентрации примерно 10 пг/реакцию для избежания включения немутантной ДНК в реакцию трансформации.

Нумерация аминокислот, представленная в примерах и описании, касается зрелого белка, т.е. начиная с 8ег, который является аминокислотой в положении 24 в соответствии со списком последовательностей. Следовательно, для того, чтобы иметь правильное соответствие между числом аминокислот в списке последовательностей и таковым в примерах, 23 следует добавить к числам в примерах или описании.

Последовательности использованных мутагенных праймеров являются следующими, и мутантные основания подчеркнуты:

- 4 006137

К44А («меловой)

Б'-ТТТСТСАССССАААОААСССССААС-З':Р1

Я44А (аншсмысловой)

5’-ОАС6АСТОСТООСТТ(Э6А<ЗСАСТТ&-3':Р2

К45А (СИМСЛевОЙ)

Б’-ТТГСТСАССОЗАЗСОААССОССААС-З’:РЗ

К45А (акпсныслоеой)

5’ΌΑΟβΑΟΤ№Τ60ΘπθΘΑΟ€ΑΟΤΤΘ-3':Р4

Е47А (смысловой)

5'-ССАААСААС2£ССААСТСТОТСССА-3'.·Р5

Р47А (анлкиысловой) всостоАСАМСАСОАстсэстбеегпз-з·:ре

Ρ.11Λ К45А Р47А (Ф⁰****⁰* мутант по 40-ым положениям амино тел от, оныоюйой) б'-ТТТВТСАССВСАвСаААСОСССААбТОТеТВССААС-З·-Р7

Яй44А“К45АгК47А (пмйной мутант по 40-ым положениям аминотислот, антисмысловой) ^-(3^0(^07(^70^770(^004077000-3^РВ

К55А (смысловой)

5’- ОССААСССАОА60СОААА7СЗОТ7СОО-3·:Р9

К55А (антисмысловой)

5’^ΑСΑСΑС77ΟеСΟΟΤ7С7ΤΤСΟβС7^ΑС-3^,:РЮ

К56А (СЛЬКЛОВОЙ) 5’- ΑΑΟΟΟΑΟΑΟΑΑΟΟΟΑΤΟΟσϊΎΟΟΟΘΑΟ^*:Р11

К56А (антисмысловой]

5'-ОЗСАСАСАСТТебС<ЗСТТСТТТСеССТ-3':Р12

Р59А (смысловой) δ'-ΑΑΘΑΑΑΤΘΟΘΤΤβΟΕΘΑΘΤΑΟΑΤΟΑΑΟ-ϊ:Р13

К59А (аитисмысповой)

5'-СТСТ666ТГ(Э5САСАСАСТГе<ЗС&3’:Р14

К55А-К56А-Я59А (Ф⁰·**⁰* мутант по 50-ыи положениям аминокислот, смысловой)

5'- СССААСССАСА66СВОСАТбаОТТеССеАаТАСАТС.З··Р15

К55А-К56А-Н59А (тройной мутант по 50-ым лолояинням аминоаислот, ангасмысловой) Б’-АСАСАСТГвбСебПСТТТСеебТСАСАААОАС-З’:Р16

Амплификацию проводили в термоблоке для ДНК (Регкш-Е1тег-Се1и8 480) в течение 35 циклов с использованием ДНК-полимеразы р1и1игЬо®. ДНК лигировали и трансформировали в Тор 10 Е' компетентные клетки Е.со11 Цпуйтодеп). Последовательность мутантов проверяли секвенированием ДНК.

Ь) Экспрессия и очистка ΚΑΝΊΈ8 дикого типа и мутантов ΡΛΝΤΕ8 в Е.со11

Полученные с помощью ПЦР фрагменты ДНК, как пояснено выше, клонировали в плазмиду рЕТ24б (фиг. 2) с получением ряда векторов. Кодирующую последовательность ΒΑΝΤΕ8 дикого типа или мутантного ΒΑΝΤΈ8 клонировали в 3'-положении от промотора рТ7 между ХЬа1- и М1е1/Х1ю1сайтами. Плазмида содержит два маркерных гена (Кт и 1ас1) и активное начало репликации (Οτι 11) .

Полученные векторы использовали для повторной трансформации штамма Е.сой ВЬ21(ПЕ3), в котором достигается высокая экспрессия белка с использованием системы рТ7/Ьас1. Экспрессию белка индуцировали добавлением к культуре 1 мМ изопропил-Р-Э-тиогалактопиранозида (1РТС). Клетки собирали и ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-НС1, рН 8, 10 мМ МдС1₂, 5 мМ бензамидина/НС1, 1 мМ ΌΤΤ, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида (РМ8Е), Э№зы 20 мг/л). Клетки разрушали тремя пропусканиями через французский аппарат для продавливания клеток под давлением. Затем суспензию центрифугировали при 10000 х д в течение 30 мин при 4°С. Осадок тел включения, содержащий ΒΑΝΤΈ8 дикого типа или один из мутантов ΕΑNΤΕ8. солюбилизировали в 0,1М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 6М гуанидина/НС1 и 1 мМ ΌΤΤ, и перемешивали в течение 30 мин при 60°С. Раствор диализовали против 3 смен 1% уксусной кислоты. Нерастворимые вещества удаляли центрифугированием при 10000 х д в течение 30 мин. Супернатант, содержащий ΕΑNΤΕ8 дикого типа или один из мутантов ΒΑΝΤΈ8, лиофилизовали.

Лиофилизованный порошок растворяли в 0,1М Трис/НС1, рН 8,0, содержащем 6М гуанидина/НС1 и 1 мМ ΌΤΤ, для получения концентрации, равной примерно 1 мг/мл. Белки ренатурировали добавлением по каплям в 10х объеме раствора гуанидина раствора 20 мМ Трис/НС1, рН 8,0, содержащего 0,01 мМ окисленного глутатиона и 0,1 мМ восстановленного глутатиона. Раствор перемешивали в течение ночи при 4°С. Нерастворимые вещества удаляли центрифугированием при 10000 х д в течение 30 мин. Значение рН доводили до 4,5 уксусной кислотой и электропроводность доводили до 20 м8 разбавлением водой. Раствор наносили на колонку НЖоаб 8 26/10, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 и белок элюировали линейным градиентом 0-2 М №1С1 в том же буфере. Фракции, содержащие ΒΑΝΤΈ8 дикого типа или один из мутантных белков ΕΑNΤΕ8. собирали, диализовали против 3

- 5 006137 смен уксусной кислоты и лиофилизовали.

Лиофилизованные белки растворяли в 50 мМ Трис/НС1 буфере, рН 8,0. Лидерную последовательность МККК^РК, полученную в результате клонирования, отщепляли от ΡΑΝΤΕ8 дикого типа или одного из мутантных белков ΡΑΝΤΕ8 инкубированием с эндопротеиназой Агд-С (фермент: субстрат 1:600, мас./мас.) в течение ночи при 37°С. Отщепленные белки отделяли от неотщепленного белка катионообменной хроматографией на колонке Н1Ьоаб 8 26/10, предварительно уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5, содержащем 6М мочевины, и белки элюировали линейным градиентом 0-2М №1С1 в том же буфере. Собирали отщепленные фракции и диализировали против двух смен 1% уксусной кислоты и, наконец, против 0,1% трифторуксусной кислоты и затем лиофилизовали (Ебдейоп Μ.Ό. е! а1., рд. 33-40 аиб РгоибГоо! А.Е. е! а1., рд. 75-87, ίη Сйетокше Рго!осо1к, Ме!йобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 2000, νοί. 138, Нитапа Ргекк).

Аутентичность белков дикого типа и мутантного ΚΑΝΤΕ8 проверяли масс-спектрометрией. С использованием аналогичной методики получали другой мутант, который содержал Ме! в качестве удлинения ХН₂-конца, а также единичный или тройной мутанты по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 и единичный или тройной мутанты по 50-ым положениям аминокислот.

с) Экспрессия и очистка ΚΑΝΤΕ8 дикого типа и мутантов ΚΑΝΤΕ8 в РкЫа ракЮпк

Получали зрелый тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΡΑΝΤΕ8 (К.44А-К45А-К.47А) с использованием мегапраймера на основе ПЦР-мутагенеза (Эайа А.К., ШсШс Ас1б. Векеагсй, 1995, 23(21):4530-31). Его клонировали в экспрессирующий вектор РкЫа рак1ог!к. рР1С9К, в рамке считывания с пре-про-сигнальным пептидом Ма! альфа 8. сегетк1ае.

После подтверждения последовательности плазмиду переносили в штамм-хозяин РюЫа ракЮпк О8115(й1к4) электропорацией. Н1к⁺-клоны подвергали скринингу на экспрессию мутанта ΡΑΝΤΕ8. Проводили опыты по экспрессии в небольшом объеме с использованием стандартных методов, как описано в наборе для экспрессии в РюЫа от 1птйгодеп (Ь1£е Τесйηο1οд^ек). Кратко, культуру размножали в обогащенной среде, содержащей глицерин в качестве источника углерода, после чего ее осаждали и ресуспендировали в среде, содержащей метанол для индукции экспрессии мутантного белка ΡΑΝΤΕ8. Секрецию мутантного ΚΑΝΤΕ8 в среде детектировали при окрашивании Кумаси синим после проведения электрофореза в 8Э8-ПАЛГ.

Клон, секретирующий мутантный ΡΑΝΤΕ8 в высокой концентрации (примерно 500-750 мг/л), использовали для размножения в больших встряхиваемых колбах. Бульон после ферментации центрифугировали при 5000 об/мин и супернатант использовали для выделения.

Белок выделяли из супернатанта хроматографией в одну стадию на колонке с гепарин-сефарозой, уравновешенной 0,1 М Трис/НС1, и элюировали линейным градиентом 0-2 М №1С1 в том же буфере с использованием 20 объемов колонки. Аутентичность белка проверяли масс-спектрометрией, и было установлено, что продуцированный в такой системе мутант ΡΑΝΤΕ8 (К.44А-К45А-К.47А), также является усеченным в Ν-конце по сравнению с молекулой дикого типа, т.е. он теряет 2 первых аминокислоты. Следовательно, полученный таким образом мутант идентифицировали как тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΡΑΝΤΕ8 (3-68)(К.44А, К45А, К.47 А), и его аминокислотной последовательностью является 8ΕΟ ГО Ыо: 3.

б) Анализ связывания гепарина

Проводили хроматографию на гепарин-сефарозе с использованием 50 мкг белков дикого типа или мутантного ΚΑΝΤΕ8, которые нагружали на колонку с гепарином-сефарозой, уравновешенную 25 мМ Трис/НС1, рН 8,0 и 50 мМ ШСк и элюировали линейным градиентом 0-2 М №1С1 в 25 мМ Трис/НС1, рН 8,0.

Хроматографию на гепарин-сефарозе проводили с использованием 50 мкг белков дикого типа или мутантного ΚΑΝΤΕ8, которые наносили на катионообменную колонку Мопо8, уравновешенную 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,5. Белок элюировали градиентом 0-2 М №1С1.

Анализ конкурентного связывания проводили с использованием ΚΑΝΤΕ8 дикого типа, тройного мутанта по 50-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 и тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 (последовательность 8ΕΟ ГО По: 2 - также обозначенный здесь, как «К44А-К45АΚ47ΑΚΑΝΤΕ8»), которые были помечены ¹²⁵1 (Атегкйат) с удельной активностью 2200 мкюри/моль.

96-луночные планшеты с фильтром пропитывали буфером для связывания (50 мМ НБРБ8, рН 7,2, содержащем 1 мМ СаС1₂, 5 мМ МдС1₂, 0,15М №1С1 и 0,5% В8А). Проводили серийные разведения гепарина в буфере для связывания в пределах концентраций 20 мг/мл-1 мкг/мл. Анализ проводили в общем объеме 100 мкл с добавлением в каждую лунку 25 мкл разведений гепарина, 25 мкл 0,4 нМ [¹²⁵1]хемокина, 25 мкл гранул, нагруженных гепарином (0,2 мкг/мл в воде) и 25 мкл буфера для связывания. Анализы проводили в трех параллелях. Планшеты инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение 4 ч. Планшеты с фильтром промывали 3 раза 200 мкл буфера для промывания с использованием вакуумного насоса для удаления несвязанного-меченого хемокина. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл сцинтилляционной жидкости и определяли радиоактивность (1 мин/лунку). Данные анализировали с использованием программы ОгаЕй 8оП\гаге.

- 6 006137

е) Анализы равновесного конкурентного связывания с рецептором

Анализы проводили на мембранах от трансфектантов СНО, экспрессирующих ССР 1 или ССВ5, с использованием сцинтилляционного анализа пространственной близости (8РА), применяя в качестве индикатора [¹²⁵1]-М1Р-1а. Конкуренты готовили серийным разведением немеченых хемокинов в буфере для связывания в пределах концентраций 10^-6-10^-12 М. Использованным буфером для связывания был 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,2, содержащий 1 мМ СаС1₂, 5 мМ МдС1₂, 0,15М ЫаС1 и 0,5% В8А. Гранулы А11еа1депп 8РА (Атегакат) солюбилизировали в РВ8 до концентрации 50 мг/мл и разбавляли в буфере для связывания до концентрации 10 мг/мл, и конечная концентрация при анализе составляла 0,25 мг/лунку. Мембраны, полученные из клеток СНО, экспрессирующих ССР1 или ССР5. хранили при -80°С и разбавляли в буфере для связывания до концентрации 80 мкг/мл. Перед постановкой анализа для уменьшения фона смешивали равные объемы исходных растворов мембран и гранул. Конечная концентрация мембран составляла 2 мкг/мл, и концентрация для [¹²⁵1]-М1Р-1а равнялась 0,1 нМ. Планшеты инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение 4 ч. Определяли радиоактивность и данные анализировали, как описано для анализа связывания гепарина.

1) Анализы хемотаксиса

Хемотаксис моноцитов проводили с помощью анализа с использованием камеры микро-Воубеп. Моноциты выделяли из светлого слоя кровяного сгустка с использованием следующей методики выделения: 100 мл раствора светлого слоя кровяного сгустка разбавляли 100 мл РВ8, помещали на Фиколл и центрифугировали при 600 х д в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки, образующие поверхность раздела, собирали, дважды промывали РВ8 и ресуспендировали при концентрации 40-100 х 10⁶/мл в среде РРМ1 1640, содержащей 5% инактивированной фетальной телячьей сыворотки (ЕС8), 2 мМ глутамина и 25 мМ НЕРЕ8, рН 7,2. Затем их выделяли из фракции лимфоцитов добавлением 10⁶овечьих эритроцитов/мл, проводили реакцию розеткообразования в течение ночи при 4°С и отделяли вторым центрифугированием в градиенте Фиколла при 900 х д в течение 20 мин при комнатной температуре. Моноциты обнаруживали на поверхности раздела между Фиколлом и буфером, а Т-клетки находились в осадке. Моноциты промывали РВ8 и ресуспендировали при концентрации 2,5 х 10⁶/мл в среде РРМ1 1640. Чистоту определяли прямым и боковым рассеянием возбужденной флуоресценции сортированных клеток, и она была установлена на уровне 40-80% в зависимости от донора. Хемокины разбавляли до конечного объема 30 мкл, в пределах концентраций 10^-6-10^-12 М в среде РРМ1 вносили в нижние лунки. Над нижними лунками помещали фильтр с размером пор 5 мкм (ЫеигоргоЬе) для моноцитов и 8 мкм для Т-клеток для гарантии отсутствия пузырьков воздуха и систему скрепляли. 50 мкл клеточной суспензии (2,5 х 10⁶ клеток/мл) в среде КРМ1 помещали в верхние лунки. Камеру инкубировали в течение 30 мин для моноцитов и 1,5 ч - для Т-клеток при 37°С в атмосфере О₂. Затем клетки удаляли, верхнюю поверхность мембраны очищали от клеток и затем мембрану промывали РВ8. Мембрану фиксировали погружением в МеОН на 1 мин, высушивали воздухом и окрашивали растворами Е1е1б§ А и В.

Подсчитывали число мигрировавших клеток при произвольном выборе полей зрения для каждой лунки с объективом 20* на обычном микроскопе, снабженным программой 1ВА8. Данные обрабатывали программой СтаЕй.

д) Анализы по рекрутменту перитонеальных клеток

В первом анализе рекрутмент клеток индуцировали внутрибрюшинным введением 10 мкг хемокина, разведенного в 0,2 мл стерильного физиологического раствора (ЫаС1, не содержащий ЬР8), мышам самкам ВАЕВ/е в возрасте 8-12 недель. Мутанты хемокинов (10 мкг хемокина, разбавленного в 0,2 мл стерильного физиологического раствора) вводили за 30 мин до введения агониста. Через 16 ч мышей убивали СО₂ в аэрозоле. Лаваж брюшной полости проводили 3 промываниями по 5 мл РВ8 и промывные фракции собирали. Клетки центрифугировали при 600 х д в течение 10 мин, ресуспендировали в конечном объеме 1 мл и с помощью гемоцитометра подсчитывали общее число извлеченных лейкоцитов.

Во втором анализе рекрутмент клеток индуцировали внутрибрюшинным введением 200 мкл 3% раствора тиогликолята в дистиллированной воде мышам самкам ВАЕВ/е в возрасте 8-12 недель (день 1). Мутант хемокина (10 мкг хемокина, разведенного в 0,2 мл стерильного физиологического раствора) вводили за 30 мин до введения тиогликолята. Мутант хемокина затем вводили ежедневно в течение 3 дней (день 2, 3 и 4). На день 5 мышей убивали СО₂ в аэрозоле. Лаваж брюшной полости проводили 3 промываниями по 5 мл РВ8 и промывные фракции собирали. Клетки центрифугировали при 600 х д в течение 10 мин, ресуспендировали в конечном объеме 1 мл и с помощью гемоцитометра подсчитывали общее число извлеченных лейкоцитов.

й) Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ)

Процедура иммунизации

Мышей самок С57 ВЕ/6ЫСг1ВК. в возрасте 8 недель с массой тела 18-22 иммунизировали (день=0) подкожным введением в заднюю область шеи 0,1 мл эмульсии, содержащей 200 мкг пептида МОС35-55 (Ыеокуйет, ЗйакЬоитд, Франция) в полном адъюванте Фрейнда (СЕА с МусоЬас1етшт Ьи1уг1сит, Όίίεο, Ое(го11, США), содержащем 0,25 мг МусоЬас1егшт 1иЬегси1ощ8. Перед подкожным введением они получали 200 мкл внутривенно 300 нг коклюшного токсина (Εί4 Вю1одюа1 БаЬ., СатрЬе11, СА, США), рас

- 7 006137 творенного в РВ8 в хвостовую вену. На день 2 животным делали вторую в/б инъекцию 300 нг коклюшного токсина.

В результате данной процедуры, начиная примерно с дня 8-10, появлялся прогрессирующий паралич, начиная от хвоста, и прогрессивно восходящий к передним конечностям.

Схема опыта

В опыт входили группы по 10 животных в каждой. Все группы иммунизировали пептидом МОС_35-55 в СРЛ и коклюшным токсином по протоколу иммунизации:

Группа 1: положительная контрольная группа с введением одного растворителя (РВ8) в/б.

Группа 2: положительная контрольная группа с введением одного растворителя (РВ8) п/к.

Группа 3: с введением тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΑ.ΝΤΕ8 в дозе 10 мкг/мышь в/б.

Группа 4: с введением тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 в дозе 1 мкг/мышь в/б.

Группа 5: с введением тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот Μβΐ-ΚΆΝΤΕδ в дозе 10 мкг/мышь в/б.

Группа 6: с введением тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот Μβΐ-ΚΆΝΤΕδ в дозе 1 мкг/мышь в/б.

Группа 7: с введением мышиного рекомбинантного интерферона бета (щ-ΙΡΝ-β) в дозе 10000 Е/мышь п/к.

Группа 8: с введением щ-ΙΕΝ-β в дозе 20000 Е/мышь п/к.

Растворитель

РВ8 использовали для разведения тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8, тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот Μβΐ-ΚΆΝΤΕδ и щ-ΙΕΝ-β до соответствующей концентрации.

Путь введения

Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8, тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΜοΙ-ΚΑΝΤΕ8 и щ-ΙΕΝ-β вводили ежедневно в/б в объеме 200 мкл/мышь. Группам 1, 2 в/б вводили РВ8 из расчета 200 мкл/мышь.

Продолжительность лечения

Лечение каждого животного начинали со дня 4 опыта (примерно за 3-5 дней до обычного проявления заболевания) и затем продолжали в течение 14 последующих дней (животных убивали на день 18 опыта).

Клинические наблюдения

Начиная со дня 5, животных индивидуально обследовали на наличие паралича в баллах по клинике следующим образом:

= отсутствие признаков заболевания

0,5 = частичный паралич хвоста = паралич хвоста

1.5 = паралич хвоста + частичный односторонний паралич задних конечностей = паралич хвоста + слабость задних конечностей или частичный паралич задних конечностей

2.5 = паралич хвоста + частичный паралич задних конечностей (опущенный таз) = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей

3.5 = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей + недержание мочи = паралич хвоста + паралич задних конечностей + слабость или частичный паралич передних конечностей = агония или смерть

2. Результаты

а) Анализы связывания с гепарином

Очищенные белки ΚΑΝΤΕ8, мутантные по одному или трем положениям, анализировали хроматографией с гепарином и концентрацию №С1, необходимую для их элюирования, сравнивали с профилем элюирования ΚΑΝΤΕ8 дикого типа. Поскольку взаимодействие с гепарином является электростатическим, мутанты также подвергали катионообменной хроматографии на колонке Μοηοδ. Это приводило к снижению концентрации №С1, необходимой для их элюирования, поскольку в результате мутагенеза удаляются основные остатки. Разницу в концентрации №С1, полученную при проведении катионообменной хроматографии, вычитали из таковой, полученной при проведении хроматографии с гепарином. Если это значение является положительным, то это указывает на специфическое взаимодействие с гепарином (табл. 1).

Прямое определение связывания с гепарином проводили с тройными мутантами по 40-ым и 50-ым положениям аминокоислот ΚΑΝΤΕ8 в анализе конкурентного связывания. ΚΑΝΤΕ8 дикого типа и мутанты йодировали (Атегайат), и все они имели одинаковую удельную радиоактивность, равную 2200 мкюри/моль. Однако только примерно 20% тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот связывалось с гранулами, нагруженными гепарином, с максимальным числом импульсов в минуту, равным

- 8 006137

4000, по сравнению с 22000 импульсами в минуту для ΚΆΝΤΕ8 дикого типа и мутантом по 50-ым положениям аминокислот (фиг. 3). Это показывает, что данные остатки в петле 40-ых положений аминокислот, которые подвергали мутагенезу, в значительной степени определяют способность ΚΆΝΤΕ8 связываться с гепарином. С другой стороны, это также показывает, что предполагаемый САС-связывающий мотив в петле 50-х положений аминокислот не является «действительным» сайтом САС-связывания.

b) Анализы равновесного конкурентного связывания с рецептором

Оценивали способность тройных мутантов по 40-ым и 50-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 конкурировать с [¹²⁵1]-М1Р-1а за связывание с рекомбинантными ССК1 и ССК5 в мембранах, полученных из стабильных трансфектантов СНО. Достоверное различие отсутствовало при любой из единичных мутаций на обоих рецепторах (результаты не представлены). Ни один из тройных мутантов не показывал различия в связывании с ССР5 по сравнению с белком ΚΑΝΤΕ8 дикого типа. Однако на ССР1 тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот имел 100-кратное снижение аффинности, в то время как тройной мутант по 50-ым положениям аминокислот показывал только небольшую (3-кратную) потерю аффинности (фиг. 4).

c) Анализы хемотаксиса

Все тройные мутанты по 40-ым и 50-ым положениям аминокислот были способны индуцировать хемотаксис моноцитов с активностями, сравнимыми с ΚΑΝΤΕ8 дикого типа, за исключением тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот, который был способен индуцировать существенный хемотаксис только в концентрации 1 мкМ. Однако тройные мутанты по 40-ым и 50-ым положениям аминокислот были равны по их способности индуцировать хемотаксис Т-клеток (фиг. 5).

Результаты, полученные в анализах хемотаксиса моноцитов, хорошо совпадают с полученными в анализах связывания с рецептором. Потеря активности тройного мутанта по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 в отношении хемотаксиса моноцитов соответствуют потере аффинности для ССКТ.

6) Анализы рекрутмента перитонеальных клеток

Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 не был способен индуцировать рекрутмент клеток в брюшную полость в дозе (10 мкг/мышь), в то время как ΚΑΝΤΕ8 вызывает существенный рекрутмент (фиг. 6).

Более того, если мутант в дозе 10 мкг вводили за 30 мин до введения ΚΑΝΤΕ8, рекрутмент клеток, индуцируемый ΚΑΝΤΕ8, подавлялся. Следовательно, потеря САС-связывания давала ингибитор индуцированного хемокинами рекрутмента клеток ίη νίνο.

Аналогичные результаты представлены на фиг. 7 с усеченным (3-68) тройным мутантом по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ8 (полученным в РюЫа раЧогХ), на фиг. 8 с тройным мутантом по 40ым положениям аминокислот ΜΙΡ-1-β (К45А-КТ6А-К48А) и на фиг. 9 с тройным мутантом по 40-ым положениям аминокислот ΜΙΡ-1α (Р18А-В46А-Р48А). Рекрутмент клеток, стимулированный тиогликолятом, также ингибировался тройным мутантом по 40-ым положениям аминокислот ΚΑNΤΕί5, как представлено на фиг. 10.

е) Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ)

Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот КА№1Е8 показывал дозозависимый эффект на модели мышиного ЕАЕ. Было показано, что белок в дозах 1 мкг/мышь и 10 мкг/мышь, вводимый ежедневно в/б, начиная с 10-го дня после первичной иммунизации МОС, проявлял сравнимую эффективность со стандартным лечением рекомбинантным ш-ΙΕΝ-β (фиг. 11). Начало заболевания существенно замедлялось, и тяжесть заболевания (что оценивали по площади под кривой) также значительно снижалась. Кроме того, среднее значение максимального количества баллов по клинике, полученное во время опыта, также снижалось. Другой мутант (тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот Мс1ΚΑNΤΕί5) был не способен проявить положительное воздействие в том же опыте.

Результаты заявителей показывают четкое положительное воздействие при лечении всеми тройными мутантами по 40-ым положениям аминокислот ΚΑNΤΕί5, которые уменьшают выраженность клинических признаков хронического ЕАЕ у мышей после иммунизации МОС. Следовательно, тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот КА№1Е8 имеет положительный терапевтический эффект, и может применяться в качестве лечения при хронических демиелинизирующих заболеваниях, таких как М8.

- 9 006137

Таблица 1. Молярность Ν;·ιί.Ί для элюирования с колонок с гепарином и моно-8 (катионообменной)

Мутация ПАКТЕ5	Гепарин	Моной	АЫаС1^н’^р ³	д_НаС1Мо^г.о-₃	ДДЫаС1
Мутация отсутствует (дикий тип)	0, 80	0, 91
К44А	0, 61	0,82	0,19	0, 09	0, 10
К45А	0, 65	0,97	0,15	0,04	0,11
К47Г	0, 65	0,84	0,15	0, 07	0, 08
К44А-К45А-К47А	0, 47	0,70	0, 33	0,21	0,11
К55А	0,70	0,86	0, 10	0,05	-0, 05
К56А	0, 90	0, 94	-0,10	0, 07	-0,17
К59А	0, 79	0, 85	0,01	0, 06	-0, 05
К55А-К56А-К59А	0, 70	0,75	0,10	0,16	-0, 06

В последующей табл. 2 показана идентичность последовательностей, представленных в перечне последовательностей и в тексте.

Таблица 2

ЗЕО Ιϋ ΝΟ:	ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
1	ΚΑΝΤΕ3 дикого типа (ИТ)
2	Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ3
3	Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ3 (3-68)
4	Тройной мутант ΜΙΡ-1-альфа (К18А-К46А-К48А)
5	Тройной мутант ΜΙΡ-1-бета (К45А-К46А-К48А)
6	Тройной мутант по 50-ым положениям аминокислот ΚΑΝΤΕ3
7	Тройной мутант по 40-ым положениям аминокислот ΜβΡ-ΒΑΝΤΕ3
8	Мутант Р.4 4-ΚΑΝΤΕΞ
9	Мутант Κ45Α-ΚΆΝΤΕ3
10	Мутант Κ47Α-ΚΑΝΤΕ3
11	Мутант Κ55Α-ΚΑΝΤΕ3
12	Мутант Κ56Α-ΚΑΝΤΕ3
13	Мутант Κ59Α-ΚΑΝΤΕ5
14	Праймер Р1
15	Праймер Р2
16	праймер РЗ
17	Праймер Р4
18	Праймер Р5
19	Праймер Р6
20	Праймер Р7
21	Праймер Р8
22	Праймер Р9
23	Праймер РЮ
24	Праймер Р11
25	Праймер Р12
26	Праймер Р13

Праймер Р14

- 10 006137

28	Праймер Р15
29	Праймер Р16
30	ИТ-1309
31	ИТ-М1Р-1-а1рЬа
32	НТтМ1Р-1-Ье£а
33	ИТ-М1Р-4
34	ИТ-М1Р-5
35	ИТ-НСС1
36	ИТ-136512
37	ИТ-МСР-2

ИО465.3Т25 зеотеысе ЫЗТ1НБ <110> ΑΡΒΙΙΕϋ ВЕ8ЕАВСН 5Υ3ΤΕΜ3 М3 ΗΟΪ.ΜΝΟ Ν.ν.

<120> МУТАНТЫ ХЕМОКИНОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА <130> ИО465 <160> 37

<170>	РагепЫп тегз!оп 3.0
<210>	1
<211>	91
<212>	ркг
<213>	ЕвсЬег1сЫа со11
<220>
<221?»	СИГНАЛ
<222>	(1)-.(23)

<400> 1

Мег

Ьуз

УаХ

Зег

А1а

АХа

Ьеи

АХа

Уа1

11а

Ьеи

Не

А1а

ТЬг

А1а

1

5

10

15

Ьеи

Суз

А1а

Рго

А1а

Зег

А1а

Зег

Рхо

Туг

Зег

Азр

ТЬг

Рго

20

25

30

Суз

Су»

РЬе

АХа

Туг

Ие

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

А1а

НХз

11а

Ьу»

35

40

45

С1и

Туг

РЬе

Туг

ТЬг

Зег

Е1у Ьу»

Су»

Зег

Азп

Рго

А1а

Уа1

ν&1

РЬе

50

55

60

Уа1

ТКт

Агд

Ьу»

Азп

Ахд

Б1п

Су»

А1а

Азп

Рго

61и

Ьуз

Тгр

65

70

75

80

Уа1

Агд

Е1и

Туг

На

Азп

Зег

Ьеи

Е1и

мег

Зег

90 <210> 2 <211> 66 <212> РВТ <213> РхсМа Ρββϊοχίβ

<400> 2

Тух

Зег

Зех

Авр

ТЬг

Рго

Су8

Суя

РЬе

А1а

Тух·

Не

А1а Ягд

Рго

1

5

10

15

Ьеи

Рго

Агд

А1а

Ηίβ

Не

Ьуз

С1и

Туг

РЬе

Туг

ТЬг Зег

С1у Ьув

Суз

20

25

30

Зег

Авп

Рго

А1а

ν*!

Уа1

РЬе

Уа1

ТЬг

А1а

Авп

А1а

С1п νβΐ

Суз

35

40

45

А1а

Азп

Рго

С1и

Ьуз

Тхр

Уа1

Агд

61и

Туг

Не

Азп

Зег Ьеи

31и

50

55

60

МеП Зег65 <210> 3

- 11 006137

	ИО465.5Т25
__1>	91
<212>	РРТ
<213>	ЕзоЬегхсЫа со11

<220> <221> <222>	СИГНАЛ ¢1)-. (23)
<400>	3

НеЬ

Ьув УаХ

2ег

А1а

А1а А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Ив

Ьеи

Не

А1а

ТЫ

А1а

1

5

10

15

Ьеи

Суз А1а

Рго

А1а

Зег А1а

Зет

Рго

Туг

Зег

Авр

ТЬг

ТЫ

Рго

20

25

30

Суз

РЬе

А1а

Тух

Х1е А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

А1а

Н13

Не

Ьуз

35

40

45

61и

Тух

РЬе

Туг

ТЬГ

Зег Й1у Ьуз

Суз

Зех

Азп

Рго

А1а

Уа1

РЬе

50

55

60

Уа1

ТЬг

А1а

Азп

А1а С1п

Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

61и

Ьув

Тгр

65

70

75

80

¥а!

Агд

б1и

Туг

Ив

Азп вех

Ьеи

Б1и

МеХ

Зег

90 <210>4 <211* 70 <212> РНТ <213> ЕясЬегГсЫа Со1±

<400> 4

А1а

Зег

Ьеи

А1а

Азр

ТЬх

Рго

ТЬг

А1а

Суз

РЬе

Зег

Тух

ТЬг

1

5

10

15

Зех

А1а

<31п

11е

Рго

61п

Азп

РЬе

Не

А1а

Азр

Туг

РЬе

С1и

ты

Зег

20

25

30

Зег

61п

Суз

Зех

Ьуз

Рго

в1у

Уа1

11е

РЬе

Ьеи

ТЬг

Ьуз

А1а

Вех

А1а

35

40

45

61п

Уа1

Суз

А1а

Авр

Рго

Зег

С1и

Тхр

Уа1

С1л

Ьуз

Тух

Уа1

Зех

50

55

60

Азр

Ьеи

61и

Ьеи

Зег

А1а

70 <210>5 <211>69 <212> РКТ <213> ЕзсЬегЬаЫа Со11 <400> 5

А1а

Рго

МеХ

Б1у

Зех

Азр

Рхо

Рго

ТЬг

А1а

Суз

РЬе

Зег

Тух

ТЬг

1

5

10

15

А1а

Ахд

Ьуз

Ьеи

Рго

Агд

Авп

РЬе

Уа1

¥а1

Азр

Туг

(Ни

ТЫ

Зех

20

25

30

Зег

Ьеи

Суя

Зег

С2п

Рго

А1а

Уа1

РЬе

С1п

ТЬг

А1а

Зех

А1а

- 12 006137 но465.3Т25

40 45

СХп Уа1 Суз А1а Азр Рго Зег <31и Зег Тгр Уа1 СХп В1и Туг УаХ Тус
50	55	60
Азр Ьеи С1и Ьеи Азп
65
<210>	6
<211>	91
<212>	РИТ
<213>	ЕгсЬегХсЫа соН
<220>
<221>	СИГНАЛ
<222>	(1)*. (23)

<400> 6

МеТ

Ьуз

Уа1

Зег

АХа

А1а

АХа

Ьеи

АХа

Уа1

Не

Ьеи

Не

А1а

ТЬг

АХа

1

5

10

15

Ьеи

Суа

АХа

Рго

А1а

Зег

А1а

Зег

Рго

Туг

Зег

Азр

ТЬг

Рго

20

25

30

Суз

РЬе

А1а

Туг

Не

АХа

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

АХа

В1з

Не

Ьуз

35

40

45

61и

Туг

РЬе

Туг

ТЬг

Зег

С1у Ьуз Суз

Зег

Азп

Рго

АХа

УаХ

РЬе

50

55

60

Уа1

ТЬг

Агд

ьуз

Азп

Агд

В1п

Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

С1и

АХа

А1а

Тгр

65

70

75

80

Уа1

А1а

С1и

Туг

Не

Азп

Зег

Ьеи

С1и

мое

Зег

85

90

<210> '7 <211> 92 <212> РКТ <213> ЕзсЬег1сЫа СоХА <400> 7

Мек

Ьуз

Уа1

Зег

АХа

А1а

Ьеи А1а

Уа1

Не

Ьеи

Не

АХа

ТЫ

АХа

1

5

10

15

Ьеи

Суз

А1а

Рго

АХа

Зег

А1а

Мее Зег

Рго

туг

Зег

Азр

ТЫ

20

25

30

Рго

Суя

₽Ье

А1а

Туг

Не

А1а Агд

Рго

Ьеи

РГО

Агд

АХа

ΗΪ3

Ня

35

40

45

Ьуз

01и

Тух

РЬе

Туг

ТЫ

Зег

С1у ьуз

суя

Зег

Азп

Рго

Д1а

Уа1

УаХ

50

55

60

РЬе

Уа1

ТЫ

А1а

Азп

АХа

С1п Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

ехи

ьуз

Ьуз

65

70

75

80

Тгр

УаХ

Агд

С1и

Туг

11е

Азп

Зег Ьеи

Зег

85

99

<210> 8 <2И> 91

- 13 006137

ИО465.3Т25

2> <213>	РКТ ЕзсЬегхсЫа со11
<220> <221>	СИГНАЛ
<222>	(1).. (23)
<400>	в

Ηθί

Ьуз

Уа1

Вег

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Не

Ьеи

11е

А1а

ТЬг

А1а

1

5

10

15

Ьеи

Суз

А1а

Рго

А1а

Зег

А1а

Зег

Рго

ТУГ

Зег

Азр

ТЬг

Рго

20

25

30

Суз

РЬе

А1а

Туг

Пе

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

А1а

Н18

11е

Ьуз

35

40

45

61и

туг

РЬе

Туг

ТЬг

Зег

В1у Ьуз Суз

Зег

Азп

Рго А1а

νβΐ

Уа1

РЬе

50

55

60

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

Азп

Агд

С1п

Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

С1и

Ьуз

Тгр

65

70

75

80

Уа1

Агд

€1и

Туг

Не

Авп

Зег

Ьеи

С1и

Не*

Зег

90 <210>9 <211>91 <212> РКТ <213> ЕзсЪегАсМа со11 <220>

<221>

СИГНАЛ

<222>

(1).

.(23)

<400>

9

Мек

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Не

Ьеи

Не

А1а

ТЬг

А1а

1

5

10

15

ьеи

суз

А1а

Рго

А1а

Зег

А1а

Зег

Рго

Туг

Зег

Азр

ТЬг

Рго

20

25

30

Суз

РЬе

А1а

Туг

11е

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

А1а

Н18

11е

Ьуз

35

40

45

б1и

Туг

РЬе

Туг

ТЬг

Зег

61у Ьув

Суя

Зег

Азп

Рго

А1а

Уа1

Уа!

РЬе

50

55

60

7а1

ТЬг

Агд

А1а

Азп

Агд

61П

Ϋ81

Суз

А1а

Азп

Рго

61и

Ьуз

Тгр

65

70

75

80

Уа1

Агд

С1и

Туг

Не

Лап

Вег

Ьеи

С1и

Мек

Зег

85

90

<210> 10 <211>91 <212> РКТ <213> ЕзсЬегЮЫа со11 <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1) .. (23)

- 14 006137 ио465.3Т25 <400> 10

Мы ьуз Уа1 Зег

А1г(

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Не

Ьеи

Не

А1а

ТЬг

А1а

1

5 ’

10

15

Ьеи Суз А1а Рго

А1а

Зег

А1а

Вех

Рго

Туг

Вех

Зег

Азр

ТЬГ

ТЬг

Рго

20

25

30

Суз Суз РЬе А!а

Туг

11е

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

А1а

В1з

Не

Ьуз

35

40

•

45

<31и Туг РЬе Туг

ТЬг

Зег

С1у

Ьуз

Суз

Зег

Азп

Рго

А1а

Уа!

Уа1

РЬе

50

55

60

Уа1 ТЫ Агд Ьуз

Азп

А1а

61п

Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

81й

Ьуз

Тгр

Б5

70

75

80

Уа! Агд С1и Туг

11е

Азп

Зег

Ьеи

С1и

№Ь

Зег

85

90

<210>

11

<211>

91

<212>

РВ.Т

<213>

ЕзсЬехгсЫа со11

<220>

<221>

СИГНАЛ

<222>

(1)..(23)

<400>

11

Μβΐ ьуз Уа1 Зег

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Не

Ьеи

Не

А1а

ТЫ

А1а

1

5

10

15

Ьеи Суз А1а Рго

А1а

Зег

А1а

Зег

Рго

туг

Зег

зет

Азр

ТЬг

ТЫ

Рго

20

25

30

Суз Сув РЬе А1а

Туг

Не

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Рхо

Агд

А1а

Н1в

Не

Ьуз

35

40

45

С1и Туг РЬе Туг

ТЬг

Зег

61у

Ьуз

Суз

Зег

Азп

Рго

А1а

Уа1

РЬе

50

55

60

Уа! ТЫ Дгд Ьуз

Азп

Агд

В1п

Уа!

Суз

А1а

Азп

Рго

е1и

А1а

Ьуз

Тгр

65

70

75

80

Уа! Агд 61и Туг

Не

Азп

Зег

Ьеи

61и

Мег

Зег

85

90

<210>

12

<211>

91

<212>

РИТ

<213>

ЕзсЬег1сЬ1а со!1

<220>

<221>

СИГНАЛ

<222>

(1)..(23)

<400>

12

МеГ Ьуз Уа1 Зег А1а А1а

А! а

Ьеи

А1а

Уа1

Не

Ьеи

Не

А1а

ТЫ

А1а

10 15

- 15 006137 мо465.3Т25

Суз

А1а

Рго

А1а

бег

А1а Вех

Рго

Тух

Зег

Азр

ТЬх

ТЬг

Рхо

20

25

30

Суз

Суа

РЬе

А1а

ТуТ

Не

А1а Агд

Рго

Ьеи

Рго

Ахд

А1а

Нхв

Не

Ьуз

35

40

45

Б1и

Туг

РЬе

Туг

ТЬх

бег

61у Ьуз

Суз

Зех

Азп

Рго

А1а

Уа1

РЬе

50

55

60

Уа1

ТЬг

Агд

Ьуз

Азп

Агд

С1п Уа1

Суз

А1а

Азп

Рго

С1и

Ьуз

А1а

Тгр

65

70

75

80

Уа1

Агд

С1и

Туг

Не

Азп

бег Ьеи

51и

Μβί

Зег

85

90

<210> 13 <211> 91 <212> РАТ <213> ЕзсЬег1сЫа соН <221> СИГНАЛ <222> (1)..(23) <400> 13

МвХ 1

Ьуз

Уа1

Зег

А1а 5

А1а

Ьеи

А1а

Уа1 10

Не

Ьеи

11е

А1а

ТЬХ 15

А1а

Ьеи

Суз

А1а

Рго 20

А1а

Зег

А1а

зет

Рго 25

Тух

Зех

Азр

ТЬг 30

ТЬх

Рго

Сув

Суз

РЬе 35

А1а

Тух

Не

А1а

Ахд 40

Рхо

Ьеи

Рхо

Ахд

А1а 45

Н1з

Не

Ьуз

61и

Тух 50

РЬе

Тух

ТЬх

Зех

С1у Ьуз 55

Сув

Зех

Азп

Рго 60

А1а

Уа1

РЬе

Уа1 65

ТЬх

Агд

Ьуз

Азп

Агд 70

61п

Уа1

Суз

А1а

Азп 75

Рхо

<31и

Ьуз

Тхр 80

Уа1

А1а

С1и

Тут

11е 85

Азл

вег

Ьеи

С1и

МеЬ 30

Зех

<210> 14 <211> 25 <212> ДНК <213> ВзсЬех1сЫа со11 <400> 14

ЬЗДдЬсассд сааадаассд ссаад <210>15 <211>25 <212> ДНК <213> ЕзсЬехХсШа со!1 <400>15 дасдасбдсб дддЪЬддадс аеЫд <210> 16 <211> 25

- 16 006137

2> <213>	ДНК Езс11ег1сЫа соИ	ИО465.3Т25
<400>	16
ЬТкдйсассс дадсдаассд ссаад		25
<210>	17
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	ВзеЬ«х1сЫа со11
<400>	17
дасдасйдсЬ ддд^Сддадс асЪкд		25
<210>	18
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	ЕзсЬех±сЫа со!1
<400>	18
сдааадаасд сссаадЬдЪд Ъдсса		25
<210>	19
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	ЕвсЬег1сЬ1а со11
<400>	19
ддЬдасааэд асдасЬдсЬд дд+Тд		25
<210>	20
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	ЕзсЬеххсЫа со11
<400>	20
1Ы:дЬсассд садедаасдс ссаад^дЬдЬ	дссаас	36
<210>	21
<211>	27 .
<212>	ДНК
<213>	ЕзсЪег1сЫа со11
<400>	21
дасдасЪдсЪ дддССддадс асМдсс		' 27
<210>	22
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	ЕзсЬег1сЬ1а соЫ
<400>	22
дссаасссад аддсдаааСд ддъСсдд		27
<210>	23
<211>	27
<212>	ДНК

- 17 006137

3>	ЕзскагхсЫа со1х	«0465.ЗТ25
<40О>	23
асасасЬЪдд сдд^ЪсЬЙЪс дддЪдас		27
<210>	24
<211>	27
<212>	ДНК .
<213>	ЕзсЬехЧсЫа со1х
<400	24
аасссадада аддсаЪдддЬ Ъсдддад		27
<210	25
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	Евсйег1сЫа со11
<400>	25
ддоасасаск СддсддЪ+сЬ Ь-ЕсдддЬ		27
<210	26
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	ЕвсЬег1с111а со1Х
<400	26
аадаааЪддд ЪЪдсддад1а саЬсаас		27
<210	27
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	ЕасЬасЛсЫа со11
<400	27
сЪсЛдддЪЪд дсасасас£Ъ ддсд		24
<210	28
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	ЕзсНег1сЫа со11
<400	28
дсоаасссад аддсддсаЪд ддЪЬдсддад	Ъ.аса1е	36
<210	29
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	ЕвсНвгХсЬЛа со11
<400>	29
асасасТЛдд сддЪксЪЪЪс дддкдасааа	дас	33
<210	30
<211>	74
<212>	РКГ
<213>	ЕзсйегЛсМа со11

- 18 006137 ио465.3Т25 <400> 30

Зег 1

Ьуз

бег Мек 01ιί 5

Уа1 Рго

РЬе Зег Агд Суз Суа РЬе Зег РЬе А1а

10

15

С1и

С1п

51и

Не

Рго

Ьеи

Агд

А1а

11е Ьеи

Суз

Туг Агд Азп

ТЬг Зег

20

25

30

Зег

Т1е

Суз

Зег

Авп

С1и

С1у

Ьеи

11е РЬе

Ьуз

Ьеи

Ьуз Агд 61у Ьуз

35

40

45

01и

А1а

Суз

А1а

Ьеи

Азр

ТЬг

Уа1

51у Тгр

Уа1

С1п

Агд Н1з

Агд Ьуз

50 ·

55

60

Мек

Ιιβ«

Агд

Н1з

Суз

Рго

Зег

Ьуз

Агд Ьуз

€5 70 <210>31 <211>70 <212> РКТ <213> ЕзсЪегхсЫа соЫ <400> 31

А1а 1

Зег

Ьеи

А1а

Айа 5

Азр

ТЬг

Рго

ТЬг

А1а 10

Суз

РЬе

Зег

Туг 15

ТЬг

Зег

Агд

С1п

11е 20

РГО

51п

Азп

РЬе

Не 25

А1а

Азр

Туг

РЬе

51и 30

ТЬг

Зег

С1п

Суз 35

Зег

Ьуз

Рго

51у

Уа1 40

Не

РЬе

Ьеи

ТЫ

Ьуз 45

Агд

Зег

Агд

Б1п

Уа1 50

Суз

А1а

Азр

Рго

Зег 55

С1и

Тгр

Уа1

51п 60

Ьуз

Туг

Уа1

Зег

Азр

Ьеи

Й1и

Ьеи

Зег

А1а

70 <210>32 <211> 68 <212> РКТ <213> ЕзсЬегхсЫа со11 <400> 32

Зег

РЬе

Н1в

РЬе

А1а

Азр

Суа

Суз

ТЬг

Зег

Туг Не

Зег

51п

Зег

1

5

Ю

15

Не

Рго

Суз

Зег

Ьеи

Мек

Ьуз

Зег

Туг

РЬе

31и

ТЫ Зег

Зег

61и

Суз

20

25

30

Зег

Ьуз

Рго

б1у

νβΐ

Не

РЬе

Ьеи

ТЫ

Ьуз

51 у Агд

51п

Уа1

Суз

35

40

45

А1а

Ьуз

Рго

Зег

С1у

Рго

С1у

Уа1

С1п Азр

Суз

Мек Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьув

55 60

Рго Туг Зех Не <210> 33 <211> 88

- 19 006137 чо465.8125 2> РКТ <213> БзсЪег1сЫа соН <400> 33

С1п 1

Уа1

С1у

ТЬг

Азп 5

Ьуз

С1и

Ьеи

Суз

Суз 10

Ьеи

Уа1

Тук

ТЬг

Зег 15

Тгр

61в

Не

Рго

61п 20

Ьуз

РЬе

Не

Уа1

Азр 25

Тут

8ег

61и

ТЬг

бег 30

Рго

С1п

Суз

Рго

Ьуз 35

Ьеи

С1у

νβΐ

Не

Ьеи 40

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Агд

С1у 45

Агд

εΐη

Не

Суз

А1а 50

Азр

Рго

Азп

Вуз

Вуз 55

Тгр

Уа1

С1П

Ьуз

Туг 60

Не

бег

Азр

Ьеи

Ьуз

11Й11

Азп

А1а

<2Х0> 34 <21Х> 76 <212> РКТ <213> ЕзсЬегХсЫа СО11

<400> 34

Аар Агд

РЬе

Н13

А1а

ТЫ

Зег

А1а Азр Суз

Суз

Не

Зег

Туг

ТЬг

РГО

1

5

10

15

Агд

Зег

11е

Рго

Суз

Зег

Ьеи

<31и

Зег

Туг

РЬе

61и

ТЬг

АЗП

Зег

20

25

30

61и

Суз

Зег

Ьуз

Рго

С1у

Уа1

Не

РЬе

Ьеи

ТЬг

Вуз Вуз С1у Агд Агд

35

40

45

РЬе

Суз

А1а

Азп

Рго

Зег

Азр

ьуз

С1п

Уа1

С1п

7а1

Суз

МеЪ

Агд

МеЬ

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Азр

ТЬг

Агд

Не

Ьуз

ТЬг

Агд

Ьуз

Азп.

70 75 <210> 35 <211> 74 <212> РКТ <213> ЕзсЬегХсЫа со!1

<400> 35

ТЬГ Ьув

ТЫ

СХи

Зег

Агд

61у

Рго

Туг

И1а

РГО

Зег

61и

Суз

1

5

10

15

Суз РЬе

ТЬг

Туг

ТЫ

Туг Вуз

Не

Рго

Агд

С1п

Агд

Не

МеЪ

Азр

20

25

30

Туг Тух

61и

ТЬг

Азп

Зег

С1п

Суз

Зег

Вуз

Рго

С1у

Не

νβΐ

РЬе

11е

35

40

45

ТЬг Ьуз

Агд

С1у

В1з

Зег

Уа1

Суз

ТЫ

Авп

Рхо

Зег

Азр

Ьуз

Тгр

νβΐ

50

55

60

61п Азр

Туг

Не

Ьуз

Азр

МеЬ

Вуз

61и

Азп

65

70

- 20 006137

ΜΟ465.ΞΤ25

0> <211> <212> <213>	36 96 РКТ ЕвсЬетАсЫа *со!1
<400>	36

Рго Ьув Уа1

Рго

61и

Тгр

Уа1

Азп

ТЬг

Рго

Зег

ТЬг

Суз

Ьеи Ьуз

1

5

10

15

Туг Туг С1и

Ьув

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

Ьеи

Уа1

61у

Тут Агд

Ьуз

20

25

30

А1а Ьеи Агп

Сув

Н1з

Ьеи

Рго

А1а

Т1е

Не

РЬе

Уа1

ТЬг

Ьуз

Агд

Азп

35

40.

45

Агд б!и Уа1

Сув

ТЬг

Азп

Рго

Авп

Азр Азр

Τιρ

Уа1

61П

61«

туг

Не

50

55

60

Ьуз Азр Рго

Азп

Ьеи

рго

Ьеи

Рго

ТЬг

Агд

АвП

Ьеи

Зег

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Ьуз Не Не

ТЬг

А1а

Ьув

Авп

61 у 61п

РГО

61п

Ьеи

Азп

Зет

61п

85

90

95

<210> 37

<211> 76

<212> РКТ

<213> ЕзсЬех1сЫа со И

<400> 37

61л Рго Азр

Зег

Уа1

Зет

Не

Рго

Не

ТЬг

Сув

РЬе

Азп

Уа1

Не

1

5

10

15

Азп Агд Ьуз

Не

Рго

Не

61п

Агд

Ьеи

61и

Зег

Туг

ТЬг

Агд

Не

ТЬг

20

25

30

АЗП Не С1П

Суз

Рго

Ьуз

61и

А1а

Уа1

Не

РЬе

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Агд

61у

35

40

45

Ьув 61и Уа1

Суз

А1а

Азр

Рго

Ьув

С1и

Агд

Тгр

Уа1

Агд Азр

Зег

МеЬ

50

55

60

Ьув Н1з Ьеи

Авр

61п

11»

РЬе

С1п

Авп

Ьеи

Ьуз

Рго

65

70

75

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Применение мутантного СС-хемокина, который содержит по меньшей мере две мутации в катионном сайте петли 40-ых положений аминокислот, как показано на фиг. 1, и который по сравнению с молекулой дикого типа обладает пониженной ОАО-связывающей активностью, для получения фармацевтической композиции для лечения рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний, в котором хемокин выбран из КАКИЕ!?, МШ-1альфа, \ПР-1бет1. МР-3, НСС1, Ι309, Ι35612 и МСР-2.

2. Применение по п.1, в котором мутантный хемокин представляет собой мутантный Κ^ΝΤΕδ.

3. Применение по п.2, в котором мутантный СС-хемокин представляет собой тройной мутантный Κ^ΝΤΕδ, в котором три основные аминокислоты в катионном сайте петли 40-ых положений аминокислот замещены другими аминокислотами.

4. Применение по п.3, в котором три основные аминокислоты в катионном сайте петли 40-ых положений аминокислот замещены аланином, серином, треонином, пролином или глицином.

5. Применение по п.4, в котором мутантный СС-хемокин представляет собой мутантный КΑNΤΕδ с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ №: 2.

6. Применение по п.4, в котором мутантный СС-хемокин представляет собой усеченный и мутантный Κ^ΝΤΕδ с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ №: 3.

7. Применение по п.1, в котором мутантный СС-хемокин представляет собой мутантный МГР-1альфа с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ №: 4.

8. Применение по п.1, в котором мутантный СС-хемокин представляет собой мутантный МГР-1-бета с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ № 5.

9. Фармацевтическая композиция для лечения рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний, включающая в качестве активного ингредиента мутантный хемокин, определенный в п.п.1-8, вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем.

10. Усеченный и мутантный хемокин КΑNΤΕδ человека, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ №: 3.

11. Молекула ДНК, включающая последовательность ДНК, кодирующую усеченный и мутантный

- 21 006137

КАЫТЕ8 по п.10.

12. Экспрессирующий вектор, который включает молекулу ДНК по п.11.

13. Клетка-хозяин, включающая экспрессирующий вектор по п.12.

14. Рекомбинантный способ получения хемокина КАЫТЕ8 по п.10, включающий культивирование в соответствующей питательной среде клеток по п.13, и выделение хемокина.