NO330278B1 - Anvendelse av en CC-kjemokinmutant i fremstillingen av en farmasoytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer, farmasoytisk sammensetning omfattende mutantene, trunkert og mutert human RANTES og rekombinant fremgangsmate for fremstilling av samme,DNA-molekyl som koder for dette, ekspresjonsvektor som omfatter DNA-molekylet og vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren - Google Patents
Anvendelse av en CC-kjemokinmutant i fremstillingen av en farmasoytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer, farmasoytisk sammensetning omfattende mutantene, trunkert og mutert human RANTES og rekombinant fremgangsmate for fremstilling av samme,DNA-molekyl som koder for dette, ekspresjonsvektor som omfatter DNA-molekylet og vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren Download PDFInfo
- Publication number
- NO330278B1 NO330278B1 NO20031525A NO20031525A NO330278B1 NO 330278 B1 NO330278 B1 NO 330278B1 NO 20031525 A NO20031525 A NO 20031525A NO 20031525 A NO20031525 A NO 20031525A NO 330278 B1 NO330278 B1 NO 330278B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- rantes
- mutant
- pharmaceutical composition
- expression vector
- dna molecule
- Prior art date
Links
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 19
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 title claims description 14
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 title claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 12
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 title claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 7
- 102000045341 human CCL5 Human genes 0.000 title claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 title claims description 3
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 claims description 90
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 claims description 90
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 32
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 20
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 9
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010023347 Met- RANTES Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 5
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 5
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 4
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 4
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 3
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 3
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009809 T cell chemotaxis Effects 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000010713 partial hind limb paralysis Diseases 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000007809 Boyden Chamber assay Methods 0.000 description 1
- 102100023701 C-C motif chemokine 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 102220573491 C-C motif chemokine 7_K45A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082155 Chemokine CCL18 Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100023487 Lens fiber major intrinsic protein Human genes 0.000 description 1
- 102220553626 Lens fiber major intrinsic protein_R47A_mutation Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 102220608644 Methyl-CpG-binding domain protein 1_R44K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000007396 fibrous gliosis Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 208000027905 limb weakness Diseases 0.000 description 1
- 231100000861 limb weakness Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 108010059339 submandibular proteinase A Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår mutanter av CC-kjemokiner som inneholder minst to mutasjoner i 40-løkken og som, relativ til villtypemolekylet, har en redusert GAG-bindende aktivitet. Det er blitt funnet at slike muterte kjemokiner er effektive til behandling av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer.
Kjemokiner utgjør en familie av små proinflammatoriske cytokiner med leukocyttkjemotaktiske og aktiverende egenskaper. Avhengig av stillingen til de første konserverte cysteinene, kan kjemokinfamilien oppdeles i C-C-, C-X-C- og C-X3-C-kjemokiner (Baggiolini M. et al., Adv Immunol. 1994, 55: 97-179; Baggiolini M. et al., Annu Rev Immunol. 1997, 15: 675-705; Taub D. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4): 355-76).
Mange C-X-C-kjemokiner så som inerleukin-8 (IL-8) er kjemotaktiske for nøytrofiler, mens C-C-kjemokiner er aktive på et utvalg av leukocytter inkludert monocytter, lymfocytter, eosinofiler, basofiler, NK-celler og dendritiske celler.
Det NH2-terminale domenet til kjemokiner er involvert i reseptorbinding og hvor NH2-terminal prosessering enten kan aktivere kjemokiner eller gjøre kjemokiner fullstendig inaktive.
N-terminale varianter av syntetiske C-C-kjemokiner er blitt testet for deres aktivitet som inhibitorer eller antagonister av de naturlig forekommende formene. MCP-1, MCP-3 og RANTES mangler i 8 til 9 NH2-terminale aminosyrer er inaktive på monocytter og er nyttige som reseptorantagonister (Gong JH et al., J Exp Med. 1995, 181(2): 531-40 og Gong JH et al., J Biol Chem. 1996, 271(18): 10521-7).
Utvidelse av RANTES med ett metionin resulterer i en nesten total inaktivering av molekylet og Met-RANTES oppfører seg som en antagonist for det autentiske (Proudfoot AE et al., J Biol Chem. 1996 Feb 2; 271(5): 2599-603).
WO 99/16877 angår aminoterminale trunkerte RANTES som mangler NH2-terminale aminosyrer som tilsvarer aminosyreresiduene 1, 1-2, 1-3 eller 1-4 i den naturlig forekommende RANTES og som har kjemokinantagonistisk aktivitet, så vel som cDNA-sekvenser som koder dem, deres anvendelse i terapi og/eller i diagnose av sykdommer, i hvilke en antagonistisk aktivitet av kjemokinvirkningene er nødvendig. RANTES (3-68) er den foretrukne trunkerte kjemokinantagonisten.
Selv om den kjemotiltrekkende aktiviteten til RANTES og CC-kjemokiner generelt er blitt studert hovedsakelig i sammenheng med de spesifikke cellemembranreseptorene, kan RANTES også interagere med glykosaminglykaner (GAG), meget variable forgrenede sukkergrupper tilsatt posttranslasjonelt til flere proteiner, generisk kalt proteoglykaner (PG). Slike proteiner er til stede på cellemembranen, i den ekstracellulære matriksen og blodstrømmen hvor isolerte GAG også kan være til stede.
Interaksjonen med GAG er et trekk som er felles for mange cellesignaliserende oppløselige molekyler (interleukiner, vekstfaktorer). PG eller isolert GAG kan danne et kompleks med oppløselige molekyler, sannsynligvis med den hensikt å beskytte dette molekylet fra proteolyse i ekstracellulære omgivelser. Det har også blitt foreslått at GAG kan hjelpe til med den korrekte presentasjonen av cellesignaliserende molekyler til deres spesifikke reseptorer og, eventuelt også modulering av målcelleaktivering.
I tilfellet av kjemokiner, synes konsentrasjonen i immobiliserte gradienter på inflammasjonsstedet og følgelig interaksjonen med cellereseptorer og deres aktiveringstilstand å bli modulert av de forskjellige formene av GAG (Hoogewerf AJ et al., Biochemistry 1997, 36(44): 13570-8). Derfor er det blitt foreslått at moduleringen av slike interaksjoner kan representere en terapeutisk tilnærming ved inflammatoriske sykdommer (Schwarz MK and Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 3(4): 407-17) og i HIV-infeksjon (Burns JM et al., Proe Nati Acad Sei U S A 1999, 96(25): 14499-504).
De strukturelle kravene og funksjonelle virkningene av GAG-RANTES-interaksjon har blitt studert i forskjellige modeller. RANTES binder GAG på humane umbilikalveneendotelceller (HUVEC) i mikromolare konsentrasjoner med en affinitet og en spesifitet som er høyere enn andre kjemokiner, så som MCP-1, IL-8 eller MIP-lalfa. Slik interaksjon synes ikke enkelt å være elektrostatisk, men avhenger også av andre parameterer så som lengde og N- og O-sulfatering av GAG (Kuschert GS et al., Biochemistry 1999, 38(39): 12959-68). GAG-defekte cellelinjer kan fremdeles binde kjemokiner, men nærværet av celleoverflate GAG øker i stor grad deres aktivitet på reseptorene når de er i lave konsentrasjoner (Ali s et al., J Biol Chem 2000, 275(16): 11721-7). Andre eksperimenter viste at GAG, heparinsulfat spesielt, letteregjør interaksjon av RANTES med celleoverflaten til makrofager og en påfølgende inhibisjon av HIV-infeksjon, et resultat som er overensstemmende med den velkjente motstanden til disse cellene, uttrykker heparinsulfat dårlig, til antivirale virkninger av RANTES (Oravecz T, et al., J Immunol. 1997, 159(9): 4587-92).
Oppløselige GAG konkurrerer med cellemembran GAG og de kan virke som spesifikke inhibitorer av RANTES-indusert aktiveringsoverflate (Appay V, et al.; Int Immunol 2000, 12(8): 1173-82), eller som undertrykker av HIV-infeksjon (Burns JM, et al.; Proe Nati Acad Sei U S A 1999, 96(25): 14499-504).
Noen struktur-funksjonsundersøkelser forsøkte å identifisere RANTE S-domenet som er ansvarlig for interaksjonen med GAG, ettersom den tradisjonelle konsensussekvensen (BBXB, hvor B er en basisk residu og X kan være ethvert residu) er alt for generisk. Et epitopkartleggingsstudium ble utført ved å bruke et monoklonalt antistoff, dyrket mot rekombinant humant RANTES, som er i stand til å blokkere de antivirale virkningene og mobilisering av intracellulært kalsium mediert av RANTES (Burns JM et al., J. Exp. Med. 1998, 188(10): 1917-27). Denne tilnærmingen gjorde det mulig å definere residuene 55-66 som nødvendige både for slike aktiviteter og for GAG-interaksjon, og støttet at GAG-interaksjon kan ha en komplementær eller atskilt funksjon fra den mediert ved kanoniske reseptorer, som det også ble foreslått i en undersøkelse på RANTES-varianter som har forandrede aggregeringsegenskaper (Appay V et al., J Biol Chem 1999, 274(39): 27505-12).
Regionen 55-66, som representerer det C-terminale alfaheliske segmentet, er homologt til det GAG-bindende domenet i andre kjemokiner, så som IL-8 (Witt DP and Lander AD, Curr. Biol. 1994, 4(5): 394-400), og inneholder et kationisk sete som inneholder lysin og arginin (KKWVR). En slik bindende region er atskilt fra bindingssetet for cellereseptorer som er lokalisert på N-terminalen (Pakianathan DR et al., Biochemistry 1997, 36(32): 9642-8), og inneholder noen residuer involvert i aggregeringen av RANTES-monomerer, selv om slike disaggregerende mutasjoner ikke synes å påvirke interaksjonen med GAG (Czaplewski LG et al., J. Biol. Chem. 1999, 274(23): 16077-84; WO 98/13495).
RANTES inneholder et annet kationisk sete (RKNR) ved residuene 44-47 som er konservert i det GAG-bindende domenet til andre kjemokiner, så som MIP-la (Koopmann W and Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997, 272(15): 10103-9) og MIP-lp (Koopmann W et al., J Immunol. 1999, 163(4): 2120-7).
Humane RANTES-varianter som inneholder enkeltmutasjoner i disse kationiske setene er blitt beskrevet som RANTES-antagonister som har potensielle terapeutiske anvendelser i behandlingen av HIV-infeksjon og inflammatoriske eller allergiske sykdommer (WO 99/33989).
Det er også blitt beskrevet at bare en trippelmutant av RANTES, i hvilke tre residuer i stillingene 44, 45 og 47 er blitt substituert med alanin, har mistet den GAG-bindende evnen (A. Proudfoot et al., Chemokine Gordon Conference, Session I, July 24th, 2000, personlig kommunikasjon).
Det er nå blitt funnet at CC-kjemokiner som inneholder minst to mutasjoner i det kationiske setet av den såkalte "40-løkken" er effektiv i behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer. Dette setet representerer et konservert GAG-bindende motiv i CC-kjemokinene (så som RANTES, MIP-lalfa og MIP-lbeta, MIP-3, MIP-4, HCC1,1309, MCP-2). Alle disse kjemokinmutantene har en redusert GAG-bindende aktivitet sammenlignet med tilsvarende molekyler av villtypen.
Regionen i hvilken minst to mutasjoner bør være til stede i henhold til oppfinnelsen, den såkalte 40-løkken, er angitt for et antall av CC-kjemokiner i figur 1. Særlig har RANTES trippelmutant, i hvilken tre basiske residuer i stillingene 44, 45 og 47 har blitt substituert med alanin, blitt funnet å være aktiv i en dyremodell for behandlingen av multippel sklerose. Denne trippelmutanten av RANTES viste en doserelatert virkning i den murine EAE-modellen og en sammenlignbar effektivitet til referansebehandlingen av med rekombinant IFN-beta. Analoge resultater er blitt funnet med en trunkert RANTES trippelmutant, i hvilke tre residuer i stillingene 44, 45 og 47 har blitt substituert med alanin og som mangler de første to N-terminale aminosyrene. Denne trunkerte RANTES-mutanten (som har aminosyresekvensen angitt i SEKV.ID. NR. 2) er ny og representerer en annen hensikt ved foreliggende oppfinnelse.
Lignende eksperimentelle resultater er også blitt generert i sammenheng med trippelmutanter av MIP-lalfa og MIP-lbeta, som allerede er kjente og som heri er identifisert som MIP-la trippelmutant R18A-R46A-R48A (Koopmann W and Krangel MS., J Biol Chem. 1997, 272(15): 10103-9). MIP-lp trippel 40-mutant K45A-R46A-K48A (Laurence JS, Biochemistry 2001, 40: 4990-4999).
Den kjente teknikken er også beskrevet i WO 00/44408 A2, WO 99/33989 A2 og Graham et al., EMBO Journal, vol. 15, nr. 23, 1996, s- 6506-6515, ISSN 0261-4189.
Betegnelsen "en redusert GAG-bindende aktivitet" betyr at mutantene i henhold til oppfinnelsen har en lavere evne til å binde seg til GAG, det vil si at en lavere prosentandel av hver av disse bindes til GAG (så som heparinsulfat) med hensyn på det tilsvarende villtypemolekylet.
Mer fortrinnsvis er mutanter av human RANTES, i hvilke de tre basiske aminosyrene i posisjonene 44, 45 og 47 i villtypemolekylet er blitt substituert med andre aminosyrer. Slike residuer kan substitueres med små, alifatiske, ikke-polare eller lett polare residuer så som for eksempel Ala, Ser, Thr, Pro og Gly. Alanin er den foretrukne.
RANTES-mutanter som er blitt funnet å være spesielt effektive ved behandlingen av MS er de som har aminosyresekvensene rapportert i henholdsvis SEKV.ID. NR. 2 og SEKV.ID. NR. 3.
En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av CC-kjemokinmutantene som definert ovenfor til å fremstille en farmasøytisk sammensetning for å behandle multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer.
Multippel sklerose (MS) er en langsomt utviklende CNS-sykdom betegnet ved disseminerende flekker av demyelinering i hjernen og ryggmargen som resulterer i multiple og varierte nevrologiske symptomer og tegn, vanligvis med remisjoner og forverring (se The Merck Manual, 16. utgave).
Årsaken er ukjent, men en immunologisk abnormalitet er mistenkt, med få indikasjoner som angir en spesifikk mekanisme. Postulerte årsaker inkluderer infeksjon av et langsomt og latent virus, og myelinolyse ved enzymer. IgG er vanligvis forhøyet i CSF og eleverte titere er også blitt assosiert med et utvalg av virus, inkludert meslinger. Signifikansen av disse funnene og av rapporterte forbindelser med HLA-allotyper og endret antall av T-celler er uklart, ettersom resultatene er noe motstridende. En økt familiær forekomst antyder genetisk sårbarhet; kvinner er noe mer affisert enn menn. Omgivelsesfaktorer synes å være tilstede. Skjønt alder ved igangsettelse generelt er fra 20 til 40 år, har MS blitt koblet til det geografiske området hvor en pasients første 15 år er tilbakelagt. Relokalisering etter 15-års-alderen synes ikke å påvirke risikoen.
Plakk eller øyer av demyelinering med destruksjon av oligodendroglia og perivaskulær inflammasjon blir disseminert gjennom CNS, hovedsakelig i den hvite substansen, med en forkjærlighet for de laterale og bakre strengene (spesielt i de cervicale og dorsale regionene), optiske nerver og periventrikulære områder. Mellomhjernetrakter, pons og cerebellum blir også påvirket og den grå substansen i både cerebellum og margen kan påvirkes.
Cellelegemer og aksoner er vanligvis preservert, spesielt i tidlige lesjoner. Senere kan aksoner ødelegges, spesielt i de lange traktene, og en fibrøs gliosis gir traktene deres "sklerotiske" utseende. Både tidlige og senere lesjoner kan finnes samtidig. Kjemiske forandringer i lipid- og proteinbestanddelene i myelin er blitt vist i og rundt plakk.
Sykdommen er kjennetegnet ved forskjellige plager og funn på CNS-dysfunksjon, med remisjoner og vedvarende tilbakevendende forverringer.
Magnetisk resonnansbilleddannelse (MRI) er den mest sensitive diagnostiske billedteknikken, idet den kan vise mange plakk. Lesjoner kan også være synlige på kontrastforsterkede CT-scan.
Terapeutiske fremskritt i forbindelse med multippel sklerose (MS) har vært langsomme, delvis på grunn av ufullstendig forståelse av lidelsens patogenese. For en behandling som er empirisk basert, inkluderer den viktigste motstanden mot fremgang den meget variable utviklingen av MS, langtidsegenskapen til de mest viktige resultatene og mangelen på objektive markører på behandlingsvirkning, spesielt innenfor en kort periode.
Skjønt patogenesen til MS forblir usikker, fortsetter studiene av den naturlige utviklingen. Objektive resultatmål basert på magnetisk resonnansbilleddannelse (MRI) er blitt utviklet, og mange av fellene i de kliniske forsøkene er nå kjent, noe som har ført til forbedrede forsøksmetoder og forbedret tolking av resultatene.
En "effektiv mengde" betegner en mengde av de aktive ingrediensene som er tilstrekkelig til å påvirke utviklingen og alvorligheten av sykdommen, idet det fører til reduksjon eller remisjon av slik patologi. Den effektive mengden vil avhenge av administrasjonsruten og pasientens tilstand.
En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er de farmasøytiske sammensetningene som inneholder kjemokinmutantene i henhold til oppfinnelsen, i nærværet av en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter, for å behandle MS og/eller andre demyelinerende sykdommer.
"Farmasøytisk akseptabel" er ment å omfatte enhver bærer som ikke interfererer med effektiviteten til den biologiske aktiviteten til den aktive ingrediensen, og som ikke er toksisk overfor verten som den administreres til. For eksempel kan for parenteral administrering de ovenfor aktive ingrediensene formuleres i enhetsdoseform for injeksjon i vehikler så som saltoppløsning, dekstroseoppløsning, serum albumin og Ringers oppløsning.
Ved siden av den farmasøytisk akseptable bæreren, kan sammensetningene i henhold til oppfinnelsen også omfatte små mengder av tilsetninger, så som stabilisatorer, eksipienter, buffere og preserverende midler.
Administrasjonen av en slik aktiv ingrediens kan være intravenøs, intramuskulær eller subkutan. Andre administrasjonsruter, som kan etablere de ønskede blodnivåene av de respektive ingrediensene, er også mulige.
Den optimale dosen av aktiv ingrediens kan egnet være valgt i henhold til administrasjonsruten, pasientens tilstand og egenskaper (kjønn, alder, kroppsvekt, helse, størrelse), utstrekning av symptomer, andre samtidige behandlinger, behandlingsfrekvens og den ønskede effekten. Justering og manipulering av etablerte doseområder er godt innenfor evnen til de med kunnskap på området.
Vanligvis kan en daglig dose med aktiv ingrediens være ca 0,01 til 100 milligram pr kilo kroppsvekt. Vanligvis er 1 til 40 milligram pr kilo pr dag gitt i oppdelte doser eller i forsinket frigjøringsform, effektiv til å oppnå de ønskede resultatene. Andre eller påfølgende administrasjoner kan utføres i en dose, som kan være den samme, mindre enn eller større enn den initielle eller tidligere dosen administrert til individet.
Således gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av en CC-kjemokinmutant som inneholder minst to mutasjoner i det kationiske setet i 40-løkken, og som relativ til villtypemolekylet, har en redusert GAG-bindende aktivitet, til fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer hvor CC-kjemokinet er valgt fra RANTES og MIP-lalfa, og der kjemokinmutanten er RANTES-mutant ifølge SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3 eller MIP-1-alfamutant ifølge SEKV.ID. NR. 4.
Oppfinnelsen gjelder også farmasøytiske sammensetninger for behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer, der sammensetningen omfatter som aktiv ingrediens kjemokinmutanten som definert ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk akseptabel eksipient.
Oppfinnelsen gjelder spesielt også trunkert og mutert human RANTES som har aminosyresekvensen angitt i SEKV.ID. NR. 2, DNA-molekyl som omfatter DNA-sekvensene som koder for det trunkerte og muterte RANTES, ekspresjonsvektor som omfatter DNA-molekylet, vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren, og rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet som har aminosyresekvensen angitt i SEKV.ID. NR. 2, der fremgangsmåten omfatter å dyrke vertcellene ifølge oppfinnelsen i et egnet kulturmedium.
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved hjelp av de følgende eksempler. Eksemplene vil referere til figurene spesifisert nedenfor.
BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1: Den viser en opplinjering av noen eksemplifiserte CC-kjemokiner, opplinjet på nivået til 40-løkken. Dette proteinsegmentet og det kationiske setet som korresponderer til det GAG-bindende motivet er innrammet. Figur 2: Den viser kartet til plasmidet brukt til å klone villtype RANTES og dens mutanter i henhold til eksemplene. Figur 3: Denne viser resultatene av det konkurransebindende assayet til[I25I]-RANTES og mutanter med heparin i heparinkuleassayet. Figur 4: Den rapporterer det konkurranselikevektsbindende assayet til RANTES og trippel 40 RANTES-mutant. Figur 5: Den viser induksjonen av monocytt og av T-cellekjemotakse med RANTES og trippel 40 og 50 RANTES-mutanter. Figur 6: Den viser inhibisjonen av peritoneal cellerekruttering ved den triple 40 RANTES-mutanten. Figur 7: Den viser inhibisjonen av RANTES-indusert peritoneal cellulær rekruttering med trunkert trippel 40 RANTES (3-68) mutant fremstilt i Pichia pastoris. Figur 8: Den viser inhibisjonen av MIP-ip-indusert peritoneal cellulær rekruttering med MIP-lp 40-mutant (K45AR46AK48A). Figur 9: Den viser inhibisjonen av MIP-la-indusert peritoneal cellulær rekruttering med trippel MIP-la-mutant (R18A-R46A-R48A). Figur 10: Den viser inhibisjonen av tioglykolatindusert cellulær rekruttering med trippel 40 RANTES-mutant. Figur 11: Den viser inhibisjonen av igangsettelsen av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt med hele 40 RANTES trippelmutanten i henhold til oppfinnelsen.
EKSEMPLER
1. Materialer og metoder
a) Dannelse av ikke- heparinbindende RANTES- mutanter
Mutagenese av RANTES ble oppnådd med invers polymerase
kjedereaksjonsteknikk. Punktmutasjonene ble innført i en av de to primerne brukt til å hybridiseres til human RANTES kodings sekvens (GenBank nr. NM_002985) i den motsatte orienteringen. For å forbedre effektiviteten til primersammenføyingen (spesielt når multiple mutasjoner ble innført i primerne) ble DNA alkalidenaturert. Det denaturerte DNA ble fortynnet til en konsentrasjon på ca 10 pg/reaksjon for å unngå inkorporering av umutert DNA i transformasjonsreaksjonen.
Aminosyrenummereringene gitt i eksemplene og i beskrivelsene vurderer det modne proteinet, det vil si som å starte med Ser som er aminosyren i posisjon 24 i henhold til sekvenslisten. Derfor, for å ha en perfekt korrespondanse mellom aminosyrenumrene i sekvenslisten og de i eksemplene, skal 23 legges til tallene som finnes i eksemplene eller i beskrivelsen.
Sekvensene til mutagene primere som ble anvendt er som følger og de muterte basene er understreket:
Amplifisering ble utført i en DNA termisk syklusanordning (Perkin-Elmer-Cetus 480) for 35 sykluser ved å bruke pfuturbo® DNA-polymerase (Stratagene). DNA ble ligert og transformert i Top 10 F' kompetent E. co//-celler (Invitrogen). Sekvensen til mutantene ble verifisert ved DNA-sekvensering.
b) Ekspresjon og rensing av villtvpe ( WT) RANTES og RANTES- mutanter i E . coli DNA-fragmentene oppnådd med PCR som forklart ovenfor og som er blitt klonet i
plasmidet pET24d (figur 2), genererer en serie av vektorer. WT eller mutert RANTES kodingssekvens blir klonet inn i 3' til pT7-promotoren, mellom Xbal- og Nhel/ XhoI- setene. Plasmidet inneholder to markørgener (Km og lacl) og et aktivt replikasjonsorigo (Ori fl).
De resulterende vektorene ble brukt til å retransformere BL21(DE23) E. coli-stammen, som tillater sterk proteinekspresjon ved å bruke pT7/LacI-systemet. Proteinekspresjon ble indusert ved tilsetning av 1 mM isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) til kulturen. Celler ble høstet og resuspendert i lysebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 5 mM benzamidin/HCl, 1 mM DTT, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), DNase 20 mg/l). Celler ble ødelagt ved tre passasjer gjennom French Pressure Celleenheten. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 10000 x g i 30 minutter ved 4°C. Inklusjonslegemepelleten som innholdt WT RANTES eller en av RANTES-mutantene ble oppløst i 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, som inneholdt 6 M guanidin/HCl og 1 mM DTT og omrørt i 30 minutter ved 60°C. Oppløsningen ble dialysert mot 3 skiftinger av 1 % eddiksyre. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering på 10000 x g i 30 minutter. Supernatanten som inneholdt WT RANTES eller en av RANTES-mutantene ble lyofilisert.
Det lyofiliserte pulveret ble oppløst i 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, som inneholdt 6 M guanidin/HCl og 1 mM DTT for å oppnå en konsentrasjon på ca 1 mg/ml. Proteinene ble renaturert ved dråpevis fortynning i et volum 10 ganger den til guanidinoppløsningen og 20 mM Tris/HCl, pH 8,0 som inneholdt 0,01 mM oksidert glutation og 0,1 mM redusert glutation. Oppløsningen ble omrørt natten over ved 4°C. Løselig materiale ble fjernet ved sentrifugering 10000 x g i 30 minutter. pH ble justert til 4,5 med eddiksyre og konduktiviteten justert til 20 mS ved fortynning med vann. Oppløsningen ble påført en HiLoad S 26/10-kolonne tidligere ekvilibrert i 20 mM natriumacetat, pH 4,5 og proteinet ble eluert med en lineær 0-2 M NaCl-gradient i den samme bufferen. Fraksjonene som inneholdt WT RANTES eller en av RANTES-mutantproteinene ble samlet, dialysert mot 3 forandringer av eddiksyre og lyofilisert.
De lyofiliserte proteinene ble oppløst i 50 mM Tris/HCl-buffer, pH 9,0. MKKWPR-ledersekvensen som var avledet fra kloningsprosessen ble spaltet fra WT RANTES eller en av RANTES mutantproteinene ved innkubering med endoproteinase Arg-C (1:600 enzym:substrat, vekt/vekt) natten over ved 37°C. De spaltede proteinene ble atskilt fra uspaltet protein ved kationutvekslingskromatografi på en HiLoad S 26/10-kolonne tidligere ekvilibrert i 20 mM natriumacetat, pH 4,5, som inneholdt 6 M urea, og proteiner ble eluert med en lineær 0-2 M NaCl-gradient i den samme bufferen. De spaltede fraksjonene ble samlet og dialysert mot to skiftinger av 1 % eddiksyre, og endelig mot 0,1 % trifluoreddiksyre, og deretter lyofilisert (Edgerton MD et al., sidene 33-40, og Proudfoot AE et al., sidene 75-87 i "Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology 2000, vol. 138, Humana Press). Autentisiteten til WT og RANTES mutantproteiner ble verifisert ved massespektrometri. Med en analog prosedyre har en annen mutant blitt produsert som inneholder en Met, som NH2-terminal utvidelse, så vel som den enkle eller tredobbelte 40 RANTES-mutanten og enkle eller tredoble 50-mutantene.
c) Ekspresjon og rensing av villtvpe ( WT) RANTES og RANTES- mutanter i Pichia pastoris
Den modne tredoble 40 RANTES-mutanten (R44A-K45A-R47A) ble dannet ved å bruke megaprimerbasert PCR-mutagenese (Datta AK, Nucleic Acid Research, 1995, 23(21): 4530-31). Den ble klonet inn i Pichia pastom-ekspresjonsvektoren, pPIC9K, i ramme med S. cerevisiae Mat alfa pre-pro signalpeptid.
Etter sekvenskonfirmasjon, ble plasmidet overført inn i Pichia pastoris vertsstamme ( GSl\ 5( his4) ved elektroporering. His<+->kloner ble screenet for ekspresjonen av RANTES-mutanten. Småskala ekspresjonsstudier ble utført ved å bruke standard prosedyrer som beskrevet i Pichia ekspresjonssett fra Invitrogen (Life Technologies). Kort fortalt ble kulturen ekspandert i et anriket medium ved å bruke glyserol som en karbonkilde, etter hvilken den ble pelletert ned og resuspendert i et medium som inneholder metanol for å indusere ekspresjonen av RANTES-mutantproteinet. Sekresjonen av RANTES-mutanten i mediet ble detektert på Koomassieblåfarget SDS-PAGE.
En klon som skiller ut høye nivåer av RANTES-mutant (ca 500-750 mg/l) ble brukt for oppskalering i store risteflasker. Den gjærede suppen ble sentrifugert ved 5000 rpm og supernatanten ble brukt for rensing.
Proteinet ble renset fra supernatanten ved et enkelt kromatografisk trinn på en heparin sefarosekolonne, ekvilibrert i 0,1 M Tris-HCl og eluert med en lineær gradient av 0-2 M NaCl i den samme bufferen ved å bruke 20 kolonnevolumer. Autentisiteten til proteinet ble verifisert ved massespektrometri og det ble oppdaget at i slike systemer er RANTES-mutanten (R44A-K45A-R47A) slik produsert og også trunkert ved N-terminalen med hensyn på villtypemolekylet, det vil si at den mangler de to første aminosyrene. Mutanten som ble oppnådd på en slik måte er derfor blitt identifisert som trippel 40 RANTES (3-68) mutant (R44A, K45A, R47A) og dens aminosyresekvens er den til SEKV.ID. NR. 2.
d) Heparinbindende assaver
Heparin sefarosekromatografi ble utført ved å bruke 50 u.g WT eller muterte
RANTES-proteiner som ble lastet på en heparin sefarosekolonne ekvilibrert i 25 mM Tris/HCl, pH 8,0 og 50 mM NaCl og eluert med en lineær gradient på 0-2 M NaCl i 25 mM Tris/HCl, pH 8,0.
Heparin sefarosekromatografi ble utført ved å bruke 50 u.g WT eller muterte RANTES-proteiner som ble lastet på en MonoS kationutvekslingskolonne ekvilibrert i 50 mM natriumacetat, pH 4,5. Protein ble eluert med 0-2 M NaCl-gradient.
Konkurransebindende assay ble utført ved å bruke WT RANTES, trippel 50 RANTES-mutant og trippel 40 RANTES-mutant (SEKV.ID. NR. 3, også identifisert heri som "R44A-K45A-R47ARANTES") som ble radiomerket med<I25>I ved Amersham til en spesifikk aktivitet på 2200 mCi/mol. Filterplater som hadde 96 brønner ble oversvømmet med bindingsbuffer (50 mM HEPES, pH 7,2 inneholdende 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl og 0,5 % BSA). Seriefortynninger av heparin i bindingsbufferen ble utført for å dekke konsentrasjonsområdet fra 20 mg/ml til 1 u.g/ml. Assayet ble utført i et totalt volum på 100 ul ved å tilsette 25 ul av heparinfortynningene, 25 ul av 0,5 nM[<1>25I]-kjemokin, 25 ul heparinkuler (0,2^g/ml i vann) og 25 ul bindingsbuffer til hver brønn. Assayene ble utført i triplikat. Platene ble innkubert ved romtemperatur med risting i 4 timer. Filterplatene ble vasket tre ganger med 200 ul vaskebuffer ved å bruke en vakuumpumpe for å fjerne ubundet-merket kjemokin. Deretter ble 50 ul av scintillanten tilsatt til hver brønn og radioaktiviteten telt (1 minutt/brønn). Data ble analysert ved å bruke GraFit-programvare.
e) Likevektskonkurranse reseptorbindende assayer
Assayene ble utført på membraner fra CHO-transfektanter som uttrykker CCR1
eller CCR5 ved å bruke et scintillasjons nærhetsassay (Scintillation Proximity Assay (SPA)) ved å bruke [I25I]-MIP-1 a som spordanner. Konkurrentene ble fremstilt ved seriefortynninger av de umerkede kjemokinene i bindingsbuffer for å dekke området IO"<6->10"12M. Bindingsbufferen som ble anvendt var 50 mM HEPES, pH 7,2 inneholdende 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl og 0,5 % BSA. Hvetekim SPA-kuler (Amersham) ble oppløst i PBS til 50 mg/ml og fortynnet i bindingsbuffer til 10 mg/ml, og den endelige konsentrasjonen i assayet var 0,25 mg/brønn. Membraner preparert fra CHO-celler som uttrykker CCR1 eller CCR5 ble lagret ved -80°C og fortynnet i bindingsbufferen til 80 ^g/rnl. Like volumer av membran og kulelagre ble blandet før assayet ble utført for å redusere bakgrunn. Den endelige membrankonsentrasjonen var 2 ug/ml og den til [125I]-MIP-1 a var 0,1 nM. Platene ble innkubert ved romtemperatur med risting i 4 timer. Radioaktiviteten ble målt og data analysert som beskrevet for det heparinbindende assayet.
f) Kjemotakseassayer
Monocyttkjemotakse ble utført ved å bruke mikro-Boyden kammerassay.
Monocytter ble renset fra buffy coats ved å bruke følgende isoleringsprosedyre: 100 ml buffy coat-oppløsning ble fortynnet med 100 ml PBS, lagt i lag på Ficoll og sentrifugert ved 600 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene som dannet grensesnittet ble innsamlet, vasket to ganger med PBS og resuspendert ved en konsentrasjon på 40-100 x 10<6>/ml i RPMI 1640-medium inneholdende 5 % inaktivert fosterkalveserum (FCS), 2 mM glutamin og 25 mM HEPES, pH 7,2. De ble videre renset fra lymfocyttfraksjonen ved å tilsette IO<6>røde blodceller pr milliliter fra sau, rosettert natten over ved 4°C og separert ved hjelp av en andre Ficoll gradientsentrifugering ved 900 x 6 ved romtemperatur. Monocyttene ble funnet i grensesnittet mellom Ficoll og bufferen, og T-cellene var i pelleten. Monocyttene ble vasket i PBS og resuspendert til 2,5 x 10<6>/ml i RPMI 1640-medium. Renheten ble målt ved forover- sidescatter ved FACS-analyse og ble funnet å være 40-80% avhengig av donoren. Kjemokin som ble fortynnet til et endelig volum på 30 ul, dekkende konsentrasjonsområdet fra 10" -10" Mi RPMI-medium, ble plassert i de lavere brønnene. Et filter med 5 \ im porestørrelse (Neuroprobe) for monocytter og 8 \ im for T-celler ble plassert over de nedre brønnene under sikring at det ikke var noen luftbobler, og systemet ble forseglet. 50 ul av cellesuspensjonen (2,5 x IO<6>celler/ml) i RPMI-medium ble plassert i de øvre brønnene. Kammeret ble innkubert i 30 minutter for monocytter og 1,5 timer for T-celler ved 37°C under O2. Cellene ble deretter kastet, den øvre overflaten av membranen ble skrapet ren for celler, og membranen ble deretter vasket med PBS. Membranen ble fiksert ved nedsenking i MeOH i 1 minutter, lufttørket og farget med Fields A- og B-oppløsninger. Migrerte celler ble telt ved å velge ut tilfeldige områder for hver brønn med 20x objektiv på et standard mikroskop tilpasse med IBAS billedanalyseprogramvare. Dataene ble tilpasset ved å bruke GraFit programvare.
g) Peritonealt cellulært rekrutteringsassay
I et første assay ble cellerekruttering indusert ved intraperitoneal injeksjon av 10^g
av kjemokinet fortynnet i 0,2 ml steril saltoppløsning (LPS-fri NaCl) i hunn BALB/c-mus som var 8 til 12 uker gamle. Kjemokinmutantene (10^g av kjemokinet fortynnet i 0,2 ml steril saltoppløsning) ble administrert 30 minutter før agonistadministreringen. 16 timer senere ble musene ofret ved aerosolisert CO2. Peritoneal utskylling (lavage) ble utført med tre vaskinger med 5 ml PBS, og utskyllingene ble oppsamlet. Cellene ble sentrifugert ved 600 x g i 10 minutter, resuspendert i et endelig volum på 1 ml og de totale frembrakte leukocyttene ble telt med et haemocytometer.
I et andre assay ble cellulær rekruttering indusert ved intraperitoneal injeksjon av 200 ul av en 3 % oppløsning av tioglykolat i destillert vann i hunn BALB/c-mus som var 8 til 12 uker gamle (dag 1). Kjemokinmutanten (10^g av kjemokinet fortynnet i 0,2 ml steril saltoppløsning) ble administrert 30 minutter før tioglykolatadministreringen. Kjemokinmutanten ble administrert daglig deretter i 3 dager (dag 2, 3 og 4). Musene ble ofret på dag 5 med aerosolisert CO2. Peritoneal utskylling ble utført med tre vaskinger med 5 ml PBS, og utskyllingene ble oppsamlet. Cellene ble sentrifugert ved 600 x g i 10 minutter, resuspendert i et endelig volum på 1 ml og de totale frembrakte leukocyttene ble telt med et haemocytometer.
h") Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt ( EAE)
Immuniserinssprosedyre
8 uker gamle C57 BL/6NCrlBR hunnmus som veide 18-22 gram ble immunisert
(dag = 0) ved å injisere s.c. i ryggen av halsen 0,1 ml av en emulsjon som inneholdt 200^g MOG35.55peptid (Neosystem, Strasbourg, Frankrike) i Freunds fullstendige adjuvans (CFA med Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, USA) inneholdende 0,25 mg Mycobacterium tuberculosis. Før s.c. injeksjonen mottok de en 200 ul i.v. injeksjon av 300 ng kikhostetoksin (List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A.) oppløst i PBS i halevenen. På dag 2 ble dyrene gitt en andre i.p. injeksjon av 300 ng kikhostetoksin.
Denne fremgangsmåten resulterer, ved å starte ca fra dag 8-10, i tilsynekomst av en progressiv paralyse som oppstår fra halen og brer seg progressivt opp til forlemmene.
Undersøkelseskonstruksjon
Undersøkelsen omfattet grupper på 10 dyr i hver gruppe. Alle gruppene ble immunisert med MOG35.55peptid i CFA og kikhostetoksin, i henhold til immuniseringsprotokollen.
Gruppe 1: positiv kontrollgruppe dosert med vehikkel alene (PBS) ved i.p. rute.
Gruppe 2: positiv kontrollgruppe dosert med vehikkel alene (PBS) ved s.c. rute.
Gruppe 3: dosert med 10 u.g/mus i.p. av trippel 40 RANTES-mutant.
Gruppe 4: dosert med 1 u.g/mus i.p. av trippel 40 RANTES-mutant.
Gruppe 5: dosert med 10 u.g/mus i.p. av trippel 40 Met-RANTES-mutant.
Gruppe 6: dosert med 1 u.g/mus i.p. av trippel 40 Met-RANTES-mutant.
Gruppe 7: dosert med 10000 U/mus s.c. av mus rekombinant interferon beta (m-IFN-P).
Gruppe 8: dosert med 20000 U/mus s.c. av m-IFN-p.
Vehikkel
PBS ble brukt til å fortynne alle 40 trippel RANTES-mutantene, alle 40 trippel Met-RANTES-mutantene og mIFN-P til passende konsentrasjon.
Administrasionsrute
Trippel 40 RANTES-mutant, trippel 40 Met-RANTES-mutant og m-IFN-p ble administrert daglig ved i.p. rute i administrasjons volumet på 200 ul/mus. Gruppene 1 og 2 ble dosert i.p. med 200 ul/mus med PBS.
Behandlinzsvarizhet
Behandlingen startet for hvert dyr på eksperimentdag 4 (ca 3-5 dager før det vanlige utbruddet av sykdommen) og deretter fortsatt i 14 påfølgende dager (ofring av dyrene på eksperimentdag 18).
Kliniske observasjoner
Med utgangspunkt i dag 5, ble dyrene individuelt undersøkt for nærværet av paralyse ved hjelp av en klinisk score som følger:
0 = ingen tegn på sykdom
0,5 = delvis haleparalyse
1 = haleparalyse
1,5= haleparalyse + delvis unilateral baklemparalyse
2 = haleparalyse + baklemssvakhet eller delvis baklemparalyse 2,5 = haleparalyse + delvis baklemparalyse (senket pelvis)
3 = haleparalyse + fullstendig baklemparalyse
3,5 = haleparalyse + fullstendig baklemparalyse + inkontinens
4 = haleparalyse + baklemparalyse + svakhet eller delvis paralyse av forlemmene
5 = døende eller død
2. RESULTATER
a) Heparinbindende assayer
De rensede RANTES-proteinene mutert i en eller tre posisjoner ble analysert ved
heparinkromatografi og konsentrasjonen av NaCl som var nødvendig for å eluere dem ble sammenlignet med elueringsprofilen til WT RANTES. Siden interaksjonen med heparin er elektrostatisk, ble mutantene også utsatt for
kationutvekslingskromatografi på en MonoS-kolonne. Dette resulterer i et fall i NaCl-konsentrasjonen som er nødvendig for å eluere dem, ettersom mutagenesen har fjernet basiske residuer. Forskjellen i NaCl-konsentrasjonen oppnådd på kationutvekslingskromatografi blir subtrahert fra den oppnådd på heparinkromatografi. Hvis denne verdien er positiv, er en spesifikk interaksjon med heparin identifisert (tabell 1).
Et direkte mål for binding til heparin ble utført med trippel 40 og 50 RANTES-mutanter i et konkurransebindende assay. WT RANTES og mutantene ble jodinert av Amersham og alle hadde den samme spesifikke radioaktiviteten på 2200 mCi/mol. Bare ca 20 % av trippel 40-mutantene ble imidlertid bundet til heparinkulene, med et maksimumstall av cpm på 400 sammenlignet med 22000 cpm for WT RANTES og 50-mutanten (figur 3). Dette viser at disse residuene i 40-løkken, som er blitt mutert, bidrar til størsteparten av den heparinbindende kapasiteten til RANTES. På den annen side, viser dette også at det mulige GAG-bindende motivet i 50-løkken ikke er et "sant" GAG-bindende sete.
b) Likevektskonkurranse reseptorbindende assay
Evnen til trippel 40 og trippel 50 RANTES-mutanter til å konkurrere for [<I25>I] MIP-la for binding til rekombinant CCR1 og CCR5 i membraner fremstilt fra HCO-stabile transfektanter. Det var ingen signifikant forskjell i noen av de enkle mutasjonene på begge reseptorer (resultater ikke vist). Ingen av trippelmutantene viste en forskjell i binding til CCR5 sammenlignet med WT RANTES-proteinet. På CCR1 hadde imidlertid trippel 40-mutanten en 100 gangers reduksjon i affinitet, mens trippel 50-mutanten bare viste et lite (3 gangers) tap av affinitet (figur 4).
c) Kjemotakse assayer
Trippel 40- og trippel 50-mutantene var alle i stand til å indusere
monocyttkjemotakse med aktiviteter som var sammenlignbare med WT RANTES, med unntak av 40-mutanten som bare var i stand til å indusere signifikant kjemotakse ved 1 uM. Trippel 40- og 50-mutantene var imidlertid like kraftige i sin evne til å indusere T-cellekjemotakse (figur 5). Resultatene oppnådd i monocyttkjemotakseassayene tilsvarer godt de oppnådd i de reseptorbindende assayene.
Resultatene oppnådd i monocyttkjemotakseassayene tilsvarer de oppnådd i de reseptorbindende assayene. Tap av aktivitet hos trippel 40 RANTES-mutanten på monocyttkjemotakse tilsvarer tapet av affinitet for CCR1.
d) Peritonealt cellulært rekrutteringsassay
Trippel 40 RANTES-mutanten var ikke i stand til å indusere cellulær rekruttering i
peritoneum ved dosen (10 u.g/mus) som RANTES forårsaker betydelig rekruttering (figur 6).
Videre, hvis 10^g av mutanten blir administrert 30 minutter før administreringen av RANTES, blir cellerekrutteringen indusert ved RANTES inhibert. Derfor produserte avskaffelse av GAG-binding en inhibitor for kjemokinindusert cellerekruttering in vivo.
Analoge resultater er vist i figur 7 med trunkert RANTES (3-68) trippel 40-mutant (produsert i Pichia pastoris), i figur 8 med MIP-ip trippel 40-mutant (K45A-R46A-K48A) og i figur 9 med MIP-la trippel 40-mutant (R18A-R46A-R48A). Cellerekrutteringen stimulert med tioglykolat ble inhibert like bra med trippel 40 RANTES-mutant som vist i figur 10.
e) Eksperimentell autoimmun encefalomvelitt ( EAE)
Trippel 40 RANTES-mutanten viste en doserelatert virkning i den murine EAE-modellen. Proteinet administrert ved både 1 \ ig og 10^g/mus daglig i.p., med start på dag 10 etter den primære immuniseringen med MOG, viste en sammenlignbar effektivitet til referansebehandlingen, rekombinant m-IFN-P (figur 11). Utbrudd av sykdommen ble signifikant forsinket og sykdomsalvorligheten (som vurdert ved arealet under kurven) ble også signifikant redusert. Videre ble gjennomsnittet av maksimum klinisk score oppnådd under eksperimentet også redusert. Den andre mutanten (trippel 40 Met-RANTES-mutant) viste ingen gunstig effekt i det samme eksperimentet.
Våre resultater viser en klart gunstig effekt av behandlingen med hele 40 RANTES trippelmutant som reduserer kliniske tegn på kronisk EAE i mus etter immunisering med MOG. Derfor har trippel 40 RANTES-mutanten en gunstig terapeutisk virkning og kan brukes som behandling ved kronisk demyelinerende sykdommer så som MS.
Den følgende tabell 2 vil klargjøre identiteten av sekvensene rapportert i sekvenslisten og i teksten.
Claims (7)
1. Anvendelse av en CC-kjemokinmutant som inneholder minst to mutasjoner i det kationiske setet i 40-løkken, og som relativ til villtypemolekylet har en redusert GAG-bindende aktivitet, til fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer hvor CC-kjemokinet er valgt fra RANTES og MIP-lalfa, og der kjemokinmutanten er RANTES-mutant ifølge SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3 eller MIP-1-alfamutant ifølge SEKV.ID. NR. 4.
2. Farmasøytisk sammensetning for behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer,karakterisert vedat den omfatter som aktiv ingrediens kjemokinmutanten som definert i krav 1 sammen med en farmasøytisk akseptabel eksipient.
3. Trunkert og mutert human RANTES,karakterisert vedat det har aminosyresekvensen angitt i SEKV.ID. NR. 2.
4. DNA-molekyl,karakterisert vedat det omfatter DNA-sekvensene som koder for det trunkerte og muterte RANTES som angitt i krav 3.
5. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter DNA-molekylet som angitt i krav 4.
6. Vertscelle,karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren som angitt i krav 5.
7. Rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet som angitt i krav 3,karakterisert vedden omfatter å dyrke cellene som angitt i krav 6 i et egnet kulturmedium.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00121665 | 2000-10-04 | ||
| PCT/EP2001/011428 WO2002028419A2 (en) | 2000-10-04 | 2001-10-03 | Chemokine mutants in the treatment of multiple sclerosis |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20031525L NO20031525L (no) | 2003-04-03 |
| NO20031525D0 NO20031525D0 (no) | 2003-04-03 |
| NO330278B1 true NO330278B1 (no) | 2011-03-21 |
Family
ID=8170011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20031525A NO330278B1 (no) | 2000-10-04 | 2003-04-03 | Anvendelse av en CC-kjemokinmutant i fremstillingen av en farmasoytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer, farmasoytisk sammensetning omfattende mutantene, trunkert og mutert human RANTES og rekombinant fremgangsmate for fremstilling av samme,DNA-molekyl som koder for dette, ekspresjonsvektor som omfatter DNA-molekylet og vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7402303B2 (no) |
| EP (1) | EP1326628B1 (no) |
| JP (1) | JP3908165B2 (no) |
| KR (1) | KR100837898B1 (no) |
| CN (1) | CN1285381C (no) |
| AR (1) | AR030854A1 (no) |
| AT (1) | ATE265222T1 (no) |
| AU (2) | AU2002215919B2 (no) |
| BG (1) | BG66137B1 (no) |
| BR (1) | BR0114407A (no) |
| CA (1) | CA2423616C (no) |
| CZ (1) | CZ303409B6 (no) |
| DE (1) | DE60103078T2 (no) |
| DK (1) | DK1326628T3 (no) |
| EA (1) | EA006137B1 (no) |
| EE (1) | EE05174B1 (no) |
| ES (1) | ES2217199T3 (no) |
| HK (1) | HK1062811A1 (no) |
| HR (1) | HRP20030215B1 (no) |
| HU (1) | HUP0302194A3 (no) |
| IL (2) | IL155178A0 (no) |
| MX (1) | MXPA03003008A (no) |
| NO (1) | NO330278B1 (no) |
| PL (1) | PL204231B1 (no) |
| PT (1) | PT1326628E (no) |
| RS (1) | RS50738B (no) |
| SI (1) | SI1326628T1 (no) |
| SK (1) | SK287523B6 (no) |
| UA (1) | UA77950C2 (no) |
| WO (1) | WO2002028419A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200302315B (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005525089A (ja) | 2001-12-17 | 2005-08-25 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | ケモカイン・アンタゴニストとして作用するケモカイン突然変異体 |
| DE60303929T2 (de) * | 2002-04-04 | 2006-08-10 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Chemokin-muntanten mit verbesserter oraler bioverfügbarkeit |
| WO2004062688A2 (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-29 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Use of cc-chemokine mutants against liver diseases |
| DE602004018014D1 (de) * | 2003-10-22 | 2009-01-08 | Serono Lab | Cxcl8-antagonisten |
| AT412785B (de) * | 2003-12-04 | 2005-07-25 | Kungl Andreas J Dr | Gag-bindungsproteine |
| DE60304435T2 (de) * | 2004-01-19 | 2006-08-24 | Ares Trading S.A. | Verfahren zur Reinigung von in Bakterien exprimierten Proteinen |
| GB0412400D0 (en) * | 2004-06-03 | 2004-07-07 | Univ Newcastle | Treatment of inflammatory conditions |
| EP1760110B1 (en) * | 2005-09-03 | 2011-11-02 | Samsung SDI Co., Ltd. | Polybenzoxazine-based compound, electrolyte membrane including the same, and fuel cell employing the electrolyte membrane |
| GB0614755D0 (en) | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Univ Geneve | Cytokine derivatives |
| MX2010001307A (es) | 2007-08-02 | 2010-07-30 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-proteína regulada con la activación, expresada y secretada por los linfocitos t normales y metodos de uso de los mismos. |
| AU2011213559B2 (en) * | 2010-02-08 | 2015-05-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding RANTES, and compositions comprising and methods of using the same |
| CA3101052A1 (en) | 2018-05-28 | 2019-12-05 | ORION Biotechnology Switzerland Sarl | Methods of inhibiting cerebral inflammation |
| WO2022093857A1 (en) * | 2020-10-26 | 2022-05-05 | City Of Hope | Oncolytic virus compositions and methods for the treatment of cancer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5739103A (en) * | 1993-11-12 | 1998-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute | Chemokine N-terminal deletion mutations |
| WO1998006751A1 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Mcp-3, rantes and mip-1alpha receptor antagonists |
| EP0906954A1 (en) * | 1997-09-29 | 1999-04-07 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist |
| DE69832216T2 (de) * | 1997-12-23 | 2006-05-24 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | RANTES-Mutanten und therapeutische Anwendungen davon |
| AU2740900A (en) * | 1999-01-29 | 2000-08-18 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating demyelinating inflammatory disease using ccr1 antagonists |
-
2001
- 2001-03-10 UA UA2003044038A patent/UA77950C2/uk unknown
- 2001-10-03 AT AT01986265T patent/ATE265222T1/de active
- 2001-10-03 PT PT01986265T patent/PT1326628E/pt unknown
- 2001-10-03 PL PL362350A patent/PL204231B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 AU AU2002215919A patent/AU2002215919B2/en not_active Ceased
- 2001-10-03 KR KR1020037004599A patent/KR100837898B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 EP EP01986265A patent/EP1326628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 WO PCT/EP2001/011428 patent/WO2002028419A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-03 EA EA200300439A patent/EA006137B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 HU HU0302194A patent/HUP0302194A3/hu unknown
- 2001-10-03 CA CA2423616A patent/CA2423616C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 DK DK01986265T patent/DK1326628T3/da active
- 2001-10-03 MX MXPA03003008A patent/MXPA03003008A/es active IP Right Grant
- 2001-10-03 EE EEP200300139A patent/EE05174B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 ES ES01986265T patent/ES2217199T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 ZA ZA200302315A patent/ZA200302315B/en unknown
- 2001-10-03 DE DE60103078T patent/DE60103078T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 JP JP2002532243A patent/JP3908165B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 BR BR0114407-3A patent/BR0114407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 AU AU1591902A patent/AU1591902A/xx active Pending
- 2001-10-03 CN CNB018199178A patent/CN1285381C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 CZ CZ20030947A patent/CZ303409B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 US US10/398,457 patent/US7402303B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 SK SK406-2003A patent/SK287523B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 RS YUP-257/03A patent/RS50738B/sr unknown
- 2001-10-03 SI SI200130130T patent/SI1326628T1/xx unknown
- 2001-10-03 IL IL15517801A patent/IL155178A0/xx unknown
- 2001-10-04 AR ARP010104684A patent/AR030854A1/es unknown
-
2003
- 2003-03-20 HR HR20030215A patent/HRP20030215B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-03-28 BG BG107685A patent/BG66137B1/bg unknown
- 2003-04-01 IL IL155178A patent/IL155178A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-04-03 NO NO20031525A patent/NO330278B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-08-02 HK HK04105657A patent/HK1062811A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4233214B2 (ja) | ケモカインアンタゴニストとしてのアミノ末端切除型ｒａｎｔｅｓ | |
| NO330278B1 (no) | Anvendelse av en CC-kjemokinmutant i fremstillingen av en farmasoytisk sammensetning til behandlingen av multippel sklerose og/eller andre demyelinerende sykdommer, farmasoytisk sammensetning omfattende mutantene, trunkert og mutert human RANTES og rekombinant fremgangsmate for fremstilling av samme,DNA-molekyl som koder for dette, ekspresjonsvektor som omfatter DNA-molekylet og vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren | |
| NO332309B1 (no) | Antagonister av CXCRX3-bindene CXC-kjemokiner, samt fremgangsmate for fremstilling derav, DNA molekyler kodende for nevnte antagonister, ekspresjonsvektor, vertcelle, farmasoytisk preparat og anvendelse av nevnte antagonister. | |
| AU2002215919A1 (en) | Chemokine mutants in the treatment of multiple sclerosis | |
| JP2006505243A (ja) | Ｍｃｐタンパク質の新規のアンタゴニスト | |
| AU2002358144B2 (en) | Chemokine mutants acting as chemokine antagonists | |
| AU711573B2 (en) | Short forms of chemokine beta-8 | |
| EP2578603A1 (en) | B cell activating factor antagonist and preparation method and use thereof | |
| US20030138400A1 (en) | Short forms of chemokine beta-8 | |
| JP2006516255A (ja) | 治療薬としてのｆ１１受容体（ｆ１１ｒ）拮抗薬 | |
| JP3621883B2 (ja) | ウイルスがコードするセマフォリンタンパク質受容体ｄｎａおよびポリペプチド | |
| CA2233367A1 (en) | Short forms of chemokine .beta.-8 | |
| MXPA00002881A (en) | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists | |
| MXPA98002380A (en) | Short shapes of bet chemiscino |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS |
|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |