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Die
vorliegende Erfindung stellt RANTES-Mutanten mit verringerter pro-entzündlicher
Aktivität,
verstärkter
HIV-unterdrückender
Aktivität
und antagonistischer Aktivität
gegen Wildtyp-Chemokine zur Verfügung.
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Chemokine
sind kleine Proteine, die in entzündliche Mechanismen und in
die physiologische Zirkulation hämopoetischer
Zellen involviert sind. Verschiedene Studien haben die wichtige
Rolle von Chemokinen bei der Rekrutierung von Leukozyten in entzündlichen
und Autoimmunerkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis oder während allergischer
Reaktionen wie Asthma gezeigt (Schall, T. J. The chemokines. In:
The cytokine handbook, A Thompson ed. Academic Press, New York,
1994, S. 419–460).
Zudem wurden kürzlich
einige Chemokine als potente natürliche
Hemmer einer menschlichen Immunschwächevirus (HIV) Infektion identifiziert
(Science 270, 811–1815,
1995). Die Aktivität
der Chemokine ist durch deren Wechselwirkung mit Rezeptoren mit
unterschiedlicher Spezifität
und Expression auf der Zelloberfläche bedingt. Einige dieser
Rezeptoren fungieren als Korezeptoren für das HIV-Virus (Science 272,
872–877,
1996; Science 272, 1955–1958, 1996).
Die unterschiedliche Verwendung solcher Korezeptoren, insbesondere
von CCR5, dem für
RANTES, MIP-1α und
MIP-1β spezifischen
Rezeptor, und CXCR4, dem SDF-1 spezifischen Rezeptor, stellt eine
wesentliche Determinante der biologischen Diversität unter
HIV-Stämmen
dar. HIV-1 Stämme,
die nicht in der Lage sind, kontinuierliche CD4+ T-Zelllinien zu
infizieren, die üblicher
Weise in die virale Übertragung
involviert sind und während
der asymptomatischen Phase der Infektion dominieren, verwenden hauptsächlich CCR5
als einen Korezeptor und sind ohne Variation empfindlich gegenüber der
Hemmung durch CCR5-bindende Chemokine (Nature Med., 3: 1259–1265, 1997).
Das wirksamste dieser Chemokine, RANTES, wird daher für die Entwicklung
von neuen anti-HIV-Therapien untersucht (Nature, 383: 400, 1996).
RANTES ist ein Chemokin, das zu der C-C-Familie gehört und 68
Aminosäuren
lang ist. Seine Sequenz wurde in dem J. Immunol. (1988) berichtet.
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WO
96/17935 offenbart RANTES-Moleküle,
die an dem N-Terminus durch die Addition einer Aminosäure wie
Methionin, Leucin oder Glutamin modifiziert sind, als Antagonisten von
RANTES oder MIP-1α.
Insbesondere wird die Verwendung davon zur Behandlung von Asthma,
allergischer Rhinitis, atopischer Dermatitis, Atheroma-Arteriosklerose
oder rheumatoider Arthritis beschrieben.
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Des
Weiteren offenbaren Elsner J. et al. in dem „European Journal of Immunology,
Bd. 27, 2892–2898 (1997)" und die WO 96/17934
die antagonistische Aktivität
des Met-RANTES-Peptids.
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Die
Verwendung von Wildtyp-RANTES und anderer Chemokine der gleichen
Familie in der Behandlung von allergischen Erkrankungen wurde auch
in der WO 94/07521 und der WO 94/21277 beschrieben.
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WO
97/25350 offenbart disaggregierte Mutanten von MIP-1α oder LD78
mit HIV-unterdrückender
Aktivität,
wohingegen die WO 98113495 menschliche RANTES-Mutanten offenbart,
die nicht in der Lage sind, unter physiologischer Ionenstärke zu aggregieren,
und die eine antivirale Aktivität
aufzeigen. Es wurde nun überraschender
Weise herausgefunden, dass das Hinzufügen von wenigstens einer Aminosäure an den N-Terminus
und/oder die Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in
der N-terminalen Region, die zwischen den Aminosäuren 1 und 11 der reifen Form
des menschlichen Chemokins RANTES vorliegt, und/oder in der „40iger
Schlaufen" Region,
die sich von Thr 43 aus bis Asn 46 verlängert, eine bemerkenswert höhere Wirksamkeit
gegen unterschiedliche HIV-Isolate sowohl in primären mononukleierten
Blutzellen wie auch in Makrophagen, eine verringerte proentzündliche
Aktivität
und eine potente antagonistische Aktivität im Vergleich zu dem Wildtypmolekül bereitstellt.
Insbesondere antagonisieren die Mutanten der Erfindung kompetitiv
Wildtyp-RANTES, MIP-1α oder
MIP-1β und
mit einem vergleichbaren Mechanismus die Wechselwirkung zwischen
dem HIV-Virus und einem Chemokinrezeptor. Eine oder mehrere der
Aminosäuren:
Ser 1, Ser 4, Ser 5, Tyr 3, Asp 6, Tyr 14, Arg 17, Arg 44, Lys 33,
Lys 45 und Arg 46 sind in Bezug auf die menschliche Wildtypform,
die in dem J. Immunol. 141: 1018–1025, 1988, als Referenzmolekül beschrieben
wird, mutiert. Die Aminosäuren
Ser 1, Ser 4, Ser 5, Tyr 3 werden durch neutrale oder hydrophobe
Aminosäuren
ersetzt, Asp 6 wird durch eine positiv geladene Aminosäure, Tyr
14 durch eine hydrophobe aromatische, Arg 17, Lys 33, Arg 44, Lys
45 und Arg 46 werden durch eine weniger große hydrophobe Aminosäure ersetzt.
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Die
folgenden Mutationen werden offenbart: Ser 1 mit Cys, Ser 4 mit
Cys, Ser 5 mit Cys, Tyr 3 mit Ala, Asp 6 mit Arg, Tyr 14 mit Phe,
Arg 17, Lys 33, Arg 44, Lys 45 und Arg 46 mit Ala. Die erste Gruppe
der Mutanten ist durch eine Dreifachmutation gekennzeichnet, ausgewählt aus
a) Ser 1 mit Cys; Ser 5 mit Cys; Asp 6 mit Arg, oder b) Ser 1 mit
Cys; Ser 5 mit Cys; Arg 17 mit Ala oder c) Ser 1 mit Cys; Ser 5
mit Cys; Arg 44 oder Lys 45 oder Arg 46 mit Ala. Eine zweite Gruppe
ist durch eine Doppelmutation gekennzeichnet, ausgewählt aus
a) Ser 1 und Ser 5 mit Cys oder b) Ser 1 und Ser 4 mit Cys oder
c) Ser 1 mit Cys und Arg 44 mit Ala oder d) Asp 6 mit Arg und Arg
44 mit Ala. Die dritte Gruppe ist durch eine Einzelmutation gekennzeichnet,
ausgewählt
aus a) Ser 1 mit Cys, b) Tyr 3 mit Ala, c) Asp 6 mit Arg, d) Tyr
14 mit Phe, e) Arg 17 mit Ala, f) Lys 33 mit Ala, g) Arg 44 mit
Ala, h) Lys 45 mit Ala, i) Arg 46 mit Ala. Des Weiteren können bei
den oben genannten Mutanten bis zu zwei Aminosäuren an den N-Terminus hinzugefügt werden,
die vorzugsweise aus Leu, Ala, Cys oder Trp ausgewählt sind.
Zum Beispiel kann Ser 4 durch Cys ersetzt werden und gleichzeitig
kann ein zusätzliches Cys
an den N-Terminus hinzugefügt
werden. Insbesondere kann die Einzelmutante Cys 1 oder –1, die
eine freie -SH-Gruppe enthält,
ein optimales Substrat für
weitere chemische Modifikationen darstellen.
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Gemäß anderen
Aspekten stellt die Anmeldung Wildtyp-RANTES ohne innere Aminosäuremutationen,
aber eine zusätzliche
Aminosäure
an dem N-Terminus tragend zur Verfügung, die vorzugsweise Cys
ist, wobei diese RANTES-Derivate mit einer anti-HIV- und anti-entzündlichen
Aktivität
ausgestattet sind, und die Verwendung von Wildtyp-RANTES, bei dem
ein Leu an den N-Terminus (Leu (0) RANTES) hinzugefügt ist,
als anti-HiV-Mittel.
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Es
ist möglich,
dass die Eigenschaften von einigen Mutanten gemäß der Erfindung, insbesondere
solcher, die ein oder zwei zusätzliche
Cys tragen, durch strukturelle Modifikationen bedingt durch die
Bildung einer neuen Disulfidbindung bestimmt werden. Unter Berücksichtigung
der Struktur von RANTES (Biochem. 1995, 34: 9307–9314) oder der Struktur von
homologen Molekülen
wie SDF-1 (EMBO J., 16: 6996: 7007, 1997) ist es auch möglich, dass
die N-terminalen oder N-Schlaufenregionen dazu beitragen, die dreidimensionale
Stelle der Wechselwirkung mit dem spezifischen Membranrezeptor zu
bilden.
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Gemäß einem
anderen Aspekt stellt die Anmeldung Peptide, die mit RANTES-Fragmenten
in den N-terminalen, N-Schlaufen- und/oder „40iger Schlaufen"- Regionen korrespondieren, zur Verfügung, wobei
die Peptide die beschriebenen Mutationen enthalten und kompetitiv
Wildtyp RANTES, MIP-1α oder
MIP-1β oder die
Wechselwirkung zwischen einem HIV-Virus und einem Chemokinrezeptor
kompetitiv antagonisieren.
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Gemäß anderen
Aspekten stellt die Erfindung Nukleotidsequenzen zur Verfügung, die
die beschriebenen Mutanten kodieren, die Expressionsvektoren, die
solche Nukleotidsequenzen umfassen, chimäre oder Fusionsproteine, die
eine Sequenz umfassen, die mit den erfindungsgemäßen Mutanten korrespondiert,
und eine Trägersequenz,
zum Beispiel eine Sequenz, die darauf gerichtet ist, die pharmakokinetischen
Eigenschaften von aktiven Peptiden oder Proteinen zu verbessern,
zur Verfügung;
des Weiteren stellt die Erfindung die Verwendung solcher RANTES-Mutanten
als anti-HIV-Mittel sowie als anti-entzündliche, anti-allergische oder
anti-asthmatische Mittel zur Verfügung.
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Unter
dem Begriff „RANTES" ist jegliches Polypeptid,
das zu dem menschlichen RANTES funktionell äquivalent ist, gemeint sowie äquivalente
Proteine, die aus kreuzreaktiven Spezies abgeleitet sind sowie Varianten
und allele Formen davon, die von der Standardsequenz abweichen können, wie
sie in dem J. Immunol. 141: 1018– 1025, 1988, berichtet wird.
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Die
Mutanten der Erfindung können
durch konventionelle Techniken der DNA-Klonierung, Rekombination
und in vitro Expression unter Verwendung geeigneter synthetischer
Oligonukleotide zum Beispiel mit Techniken der positionsgerichteten
Mutagenese oder durch eine DNA-Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt
werden. Die resultierende DNA wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor
für einen
prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt eingeführt. Alternativ
dazu können
Mutanten gemäß den konventionellen Verfahren
der Peptidsynthese hergestellt werden.
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Für die vorgesehenen
therapeutischen Zwecke werden die Mutanten der Erfindung in der
Form geeigneter pharmazeutischer Zusammensetzungen, die gemäß konventionellen
Techniken, die für
Polypeptid- oder Proteinaktive Substanzen geeignet sind, hergestellt
werden, über
die parenterale, sublinguale, intranasale, inhalatorische oder topische
Route der Verabreichung verabreicht werden.
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Die
Menge des zu verabreichenden Polypeptids wird ausreichend sein,
um eine signifikante Hemmung einer HIV-Infektion oder -Replikation
oder die Verringerung von entzündlichen
Reaktionen wie in der rheumatoiden Arthritis oder in degenerativen
Erkrankungen wie der Arteriosklerose oder in allergischen Erkrankungen
wie Asthma, Rhinitis und Dermatitis zu bewirken. Die spezifische
Dosierung wird auf der Basis von klinischen Versuchen bestimmt werden
und wird von einer Anzahl von Faktoren wie den Zuständen, dem
Geschlecht, dem Alter und dem Gewicht des Patienten und der Schwere
der Erkrankung abhängen.
Die Mutanten der Erfindung werden auch in der Vermeidung einer HIV-Infektion
in Individuen verwendet, die potentiell einer Infektion ausgesetzt
sind.
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Des
Weiteren kann die DNA, die solche Mutanten kodiert, die als rekombinante
Proteine in eukaryontischen Wirtszellen hergestellt werden und keine
weitere chemische Modifikation benötigen, in Gentherapievektoren
eingeführt
werden (zum Beispiel solchen, die aus Maus- oder menschlichen Retroviren
wie MuLV oder HIV oder Herpes-Virus, wie HHV-7, oder Adenovirus
abgeleitet sind), die deren Produktion direkt in dem Gewebe ermöglichen,
wo die Behandlung benötigt
wird (d. h. Lymphknoten, Gelenke, etc.).
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Die
folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung in mehr Detail.
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Beispiel 1:
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Klonierung
und Mutagenese der RANTES-Sequenz
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Gesamt-DNA
wurde gemäß konventionellen
Techniken (Manatis) aus menschlichen CD8+ T-Lymphozyten extrahiert,
die durch Absorption mit dem anti-CD8-Antikörper (Sigma C7423), der an
magnetische Kügelchen
gebunden war, aufgereinigt wurden. Die cDNA, die aus der reversen
Transkription unter Verwendung eines Oligo-dTs als Primer resultiert,
wurde für
eine PCR-Reaktion (Polymerasekettenreaktion) mit zwei Oligonukleotidprimern
verwendet, die in der Lage waren, die gesamte Region, die für RANTES
kodiert (434 Bp), zu amplifizieren:
P1 = 5'-ACGAATTCACAGGTACCATGAAGGTCTCCGCG;
P2
= 5'-GTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT.
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Die
Primer wurden so hergestellt, dass sie die Restriktionsschnittstellen
enthalten, die in den P1- und P2-Sequenzen unterstrichen sind, jeweils
EcoRI (P1) am 5' und BamHI
(02) am 3'. Nach
der Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit den EcoR1- und BamH1-Restriktionsenzymen
verdaut, aus dem Gel durch eine QIAEX (Promega) Säule aufgereinigt
und in die pUC18-Vektor-DNA (Promega) erneut ligiert, die in dem
Polylinkerbereich mit den gleichen Enzymen vorverdaut worden war.
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Die
erneut ligierte DNA wurde dann verwendet, um kompetente E. coli
Zellen (JM109) zu transformieren. Nach der Selektion einiger Ampicillin-resistenter
Klone wurde die DNA sequenziert, um die Identität des Inserts zu bestätigen. Plasmid-DNA
wurde zur PCR-Mutagenese gemäß dem Verfahren,
das „überlappende Verlängerung" (Gene, 1991, 67:
70) genannt wird, verwendet. Solch eine Technik ermöglicht die
Herstellung von Einzel- und Mehrfachmutationen in dem gleichen Gen
durch die Verwendung gemeinsamer Primer (die an die Sequenz des
Vektors binden: A, B, C) und einer Serie von Primern, die für verschiedene
Mutationen spezifisch sind. Die Sequenzen der gemeinsamen Primer
sind die folgenden:
Primer A: 5'-CAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGC
Primer
B: 5'-GGATCAGATTTGCAGCGGCCG
Primer
C: 5'-GTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT.
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Für die Herstellung
des pVU5-Plasmids wurde das spezielle Oligo Cys 1 verwendet (5'-GGGTGTGGTGTCCGAGGAATATGGGCAGGCAG). Solch ein Primer
enthält
eine Einzelbasenmutation (C anstatt G), die die Substitution von
Ser mit Cys in Position 1 bestimmt.
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Das
spezielle Oligo Tyr 3 wurde zur Herstellung des pVU14-Plasmids (5'-GTCCGAGGAAGCTGGGGAGGCAGATG) verwendet.
Solch ein Primer führt
eine zwei-Basen-Substitution (GC anstatt TA) ein, die die Substitution
von Tyr mit Ala in Position 3 bestimmt.
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Das
Oligo Cys 1–Cys
5 wurde zur Herstellung des pVU15-Plasmids (5'-GGGTGTGGTGTCGCAGGAATATGGGCAGGCAG)
verwendet, das eine zwei-Basen-Substitution (GC anstatt CG) zusätzlich zu
der Substitution des Primer Cys 1 (C anstatt G) einfügt. Dieses
bestimmt die Doppelsubstitution von Ser mit Cys in den Positionen
1 und 5.
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Das
spezielle Oligo Arg 17 (5'-CACGGGGCAGTGGGGCGGCAATGTAG-GCAAAGC) wurde
zur Herstellung des pVU24 Plasmids verwendet. Solch ein Primer stellt zwei-Basen-Substitutionen
(GC anstatt CG) zur Verfügung,
die die Substitution von Arg mit Ala in Position 17 bestimmen.
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Das
spezielle Oligo Asp 6 (5'-CAGGGTGTGTGGTGCGCGAGGAATATGGGGA) wurde zur
Herstellung des pVU38 Plasmids verwendet. Solch ein Primer produziert
zwei-Basen-Substitutionen (CG anstatt TG), die die Substitution
von Asp mit Arg in Position 6 bestimmen.
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Das
spezielle Oligo Arg 44 (5'-GGCGGTTCTTTTCGGTGACAAAGACGAC) wurde
zur Herstellung des pVU26 Plasmids verwendet. Solch ein Primer stellt
zwei-Basen-Substitutionen (TC anstatt CG) zur Verfügung, die
die Substitution von Arg 44 mit Glu bestimmen. Eine zweite Mutante
für diese
Position (Arg 44-Ala) wurde mit einem neuen Oligo mit der gleichen
Sequenz außer
dem doppelt unterstrichenen T, das durch G substituiert wird, hergestellt.
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Das
spezielle Oligo Lys 45 (5'-CTTGGCGGTTCTCTCGGGTGACAAAGACG) wurde
zur Herstellung des pVU43 Plasmids verwendet. Solch ein Primer produziert
eine Einzelbasensubstitution (C anstatt T, unterstrichen), die die
Substitution von Lys mit Glu in Position 45 bestimmt. Eine zweite
Mutante für
diese Position (Lys 45-Ala) wurde mit einem neuen Oligo mit der
gleichen Sequenz außer
dem doppelt unterstrichenen T, das durch G substituiert wird, hergestellt.
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Das
spezielle Oligo Leu-R wurde zur Herstellung der pVU17 Mutantenherstellung
(5'-ATATGGGGATAAGGCAGATGCAGGAGCGCA) verwendet.
In diesem Primer wird eine 3-Nukleotideinfügung an dem 5'-Ende des Moleküls vor dem
ersten natürlich
vorkommenden Kodon hinzugefügt.
Das Antisensetriplet kodiert für
das zusätzliche
N-terminale Leucin.
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Das
spezielle Oligo Tyr 14 (5'-TGGGCGGGCAATGGCGGCAAAGCAGCAGGG)
wurde zur Herstellung des pVU22 Plasmids verwendet. Solch ein Primer
führt die
Substitution von Tyr 14 mit Phe in Position 14 ein. Eine zweite
Mutante für
diese Position (Tyr 14-Ala)
wurde auch hergestellt.
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Andere
Mutanten wurden unter Verwendung der folgenden Oligos hergestellt:
Oligo
Cys 1–Cys
4: 5'-GGGTGTGGTGTCCGAGCAATATGGGCAGGCAG;
die Substitution von zwei
G mit zwei C (unterstrichen) produziert die Substitution von zwei
Ser (in den Positionen 1 und 4) mit zwei Cys;
Oligo Cys 0–Cys 4:
CCGAGCAATATGGGGAGCAGGCAGATGCAGGAG;
die Substition
von G mit C (unterstrichen) produziert die Substitution von Ser
(in Position 4) mit Cys, wohingegen die Insertion von GCA die Insertion
eines zusätzlichen
Cys in Position 0 produziert;
Oligo Leu-Ala: 5'-ATATGGGGAGGCTAAGGCAGATGCAGGA;
das Einfügen von
6 Nukleotiden (GGCTAA) stromaufwärts
des Kodons von Ser 1 produziert jeweils die Einfügung von Leu und Ala in den
Positionen –1
und 0.
Oligo Tyr 14: 5'-TGGGCGGGCAATGTAGGCAAAGCAGCAGGG;
die
Substitution von A in T (unterstrichen) erlaubt die Substitution
von Tyr 14 in Phe.
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Die
PCR-Produkte wurden aufgereinigt und in den BGIII-BamHI-Position
des pUC18 Vektors kloniert. Die Rekombinanten wurden sequenziert,
um deren Identität
zu bestätigen
und um unerwünschte
Mutationen zu überprüfen, die
während
der Klonierungsprozeduren eingeführt
wurden.
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Beispiel 2
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Expression
und Aufreinigung der rekombinanten Moleküle in Baculovirus
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Das
Baculovirusexpressionssystem ist seit vielen Jahren bekannt. Es
basiert auf der Expressionsmaschinerie des Autographa californica
Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV). In diesem System wird das Gen
von Interesse durch homologe Rekombination unter die Steuerung des
Polyhedringenpromotors gestellt, das ein nicht essentielles Gen
ist, aber in sehr großen
Mengen während
der späten
Phase einer viralen Infektion exprimiert wird.
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Die
Wahl solch eines Systems involviert eine Anzahl von Vorteilen, wobei
die wichtigsten davon: 1) hohe Expressionsmengen; 2) Funktionalität des rekombinanten
Proteins, das korrekt prozessiert und gefaltet ist (die meisten
Modifikationen korrespondieren mit denen, die durch Säugetierzellen
eingeführt
werden); 3) extrazelluläre
Sezernierung bedingt durch das Signalpeptid (O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, „Baculovirus expression
vectors – A
laboratory manual",
Oxford University Press, 1994) sind.
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Um
RANTES und seine Mutanten in diesem System zu exprimieren, wurde
die korrespondierende DNA aus pUC18 ausgeschnitten und in die BamHI-EcoRI
Schnittstelle der pVL 1392 Plasmidpolylinkerregion (Pharmingen)
unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors kloniert. Dieses Plasmid
enthält
auch stromabwärts von
dem einklonierten Insert eine AcNPV Homologieregion zur homologen
Rekombination. Eine kontinuierliche Autographa californica Zelllinie
(SF9, Pharmingen) wurde unter Verwendung der Kalziumphosphatkopräzipitation
mit der DNA der rekombinanten Plasmide und mit der Baculovirus-DNA,
die eine letale Deletion enthält
(BaculoGoldTM DNA, Pharmingen), transfiziert.
Nur eine homologe Rekombination, die zu der Substitution des Polyhedringens
mit der DNA der Mutanten von Interesse führt, stellt lebensfähige virale
Partikel bereit (Gruenwald S, Heitz J, „Baculovirus expression vectors:
procedures and methods manual",
Pharmingen, 1993). Der Überstand
der transfizierten Kulturen wurde dann an dem dritten Tag gesammelt,
verdünnt
und zur Infektion neuer SF9-Kulturen verwendet, wodurch die virale
Stammlinie aus einem einzelnen infektiösen Partikel (Endpunktverdünnung) erhalten
wurde. Wie erwartet werden das RANTES-Protein und seine Mutanten sezerniert
und deren Expressionsmengen können
durch einen kommerziellen ELISA-Test (R&D) untersucht werden. Die virale
DNA wurde aus den potentiellen Rekombinanten extrahiert, wie sie
durch ELISA nachgewiesen wurden, und durch PCR (Cycle Sequencing,
Amersham) sequenziert, um zu bestätigen, dass die Mutationen
auch in der viralen Stammlinie vorgekommen sind. Der ausgewählte virale
Stamm wurde anschließend
wiederholten Zyklen einer Infektion und Amplifikation in SF9-Zyklen
ausgesetzt, um Überstände mit
hohem Titer zu erhalten. Diese Überstände wurden
zur Herstellung von rekombinanten Chemokinen in einem großen Maßstab durch
Infektion einer kontinuierlichen Trichoplusia-Zelllinie (High Five,
Invitrogen) verwendet. Diese Zellen sind zum Wachstum in einem serumfreien
Medium in der Lage, was die folgenden Proteinaufreinigungsprozeduren
vereinfacht. 1,5 × 108-Zellen wurden mit 1,5 × 109 vitalen
viralen Partikeln in einem Endvolumen von 200 ml infiziert. An dem
vierten Infektionstag wurde der Überstand
gesammelt, filtriert (0,45 μ) und
die Mutanten wurden auf Heparinsäulen
aufgereinigt. Nach wiederholtem Waschen mit PBS wurde die Säule mit
PBS + 1,5 M NaCl in 10 ml eluiert. Eine Probe des Eluats wurde einer
Elektrophorese auf Acrylamidgel SDS-PAGE ausgesetzt und mit Coomassie
Blau gefärbt,
wodurch eine 90 %ige Reinheit der rekombinanten Proteine festgestellt
wurde.
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Das
Eluat wurde anschließend
diafiltriert, um die vorhandenen Salze zu entfernen und konzentriert (Centricon,
Ausschluss 3.000, Millipore). Die endgültige Quantifizierung von RANTES
und seinen Mutanten wurde durch einen ELISA-Kit für die quantitative
Bestimmung von RANTES (R&D)
durchgeführt
und durch Western Blot und Kapillarelektrophorese bestätigt.
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Beispiel 3
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Hemmung einer
viralen Infektion
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Die
Fähigkeit
der Mutanten, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurden, zur Hemmung
einer Infektion durch den prototypischen Makrophagen-trophen viralen
Stamm HIV-1BaL wurde in primären
Kulturen von aktivierten, peripheren, mononuklearen Blutzellen (PMBC)
gemessen. Die zur Infektion von PBL und zur Untersuchung der p24
Antigenproduktion verwendete Prozedur wurde bereits in der Literatur
beschrieben (Scarlatti et al., Nature Medicine, 1997). Die Dosis
zur Hemmung der viralen Proliferation um 90 % (ID90) war für pVU15 im
Vergleich zu dem Wildtyp RANTES, das eine ID90 von 96 ng/ml aufweist
(1), erkennbar geringer. Die unterdrückende Aktivität von pVU5,
pVU14, pVU15, pVU24 und pVU38 wurde in einem anderen HIV-Stamm bestätigt, der
aus einem Patienten mit einer asymptomatischen Infektion isoliert
worden war (HIV-1 6366) und nur ein Mal in peripheren mononuklearen
Blutzellen passagiert worden war (2): Wie
bei dem BaL-Stamm war dieses Isolat von der Verwendung des CCR5
Korezeptors (ibid.) abhängig.
Die antivirale Aktivität
der Polypeptide der Erfindung, die als relatives Verhältnis in
Bezug auf das Wildtyp RANTES ausgedrückt wird (ID90 RANTES/ID90
Mutante), wird in der folgenden Tabelle illustriert.
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Tabelle:
Relative antivirale Aktivität
von RANTES Mutanten (mehrfache Verstärkung im Vergleich zum Wildtyp RANTES)
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- *Die antivirale Aktivität
von pVU26- und pVU43-Mutanten wird als relative Verhältnis in
Bezug auf Wildtyp RANTES ausgedrückt
(RANTES ID50/Mutante ID50).
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Beispiel 4
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Pro-entzündliche
Aktivität
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Die
Fähigkeit
der RANTES-Mutanten zur Mobilisierung von intrazellulärem Kalzium,
das durch G-Protein- gekoppelte Rezeptoraktivierung induziert wird,
und die mit der Effizienz der Signalübertragung von verschiedene
Liganden verbunden ist, wurde untersucht.
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Die
Zellen wurden mit Fura-2 für
eine Stunde beladen und durch Mutanten in verschiedenen Konzentrationen
stimuliert. Die Wirkung wurde unter Verwendung eines Fluorimeters
gemessen und als die prozentuale Erhöhung des intrazellulären Kalziums
berechnet. Wildtyp RANTES induzierte eine Dosis-abhängige Kalziummobilisierung
in U87-CD4 Zellen, die CCR5 exprimieren, nicht aber in CCR5-negativen
Zellen, die als Kontrolle verwendet wurden. Unter den getesteten
pVU5, pVU14, pVU15, pVU24, pVU38, pVU26 und pVU43-Mutanten induzierten
nur pVU38, pVU15 und pVU17 keine Kalziummobilisierung. pVU5, pVU14
und pVU43 hatten eine Effizienz, die geringer als die von Wildtyp
RANTES war, wie in der 3 gezeigt wird.
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Die
Fähigkeit
der Polypeptide der Erfindung zur Induzierung einer Chemotaxe von
primären
menschlichen Lymphozyten und Monozyten wurde auch gemessen, wobei
die Fähigkeit
durch verschiedene RANTES-Rezeptoren, insbesondere CCR1, vermittelt
werden kann.
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Die
Monozytenmigration wurde unter Verwendung einer Modifikation der
Boydenkammer (48 Well TranswellTM, Costar)
untersucht. Nach zwei Stunden Inkubation in der Gegenwart von Mutanten
bei verschiedenen Konzentrationen wurde der Filter entfernt und
die gewanderten Zellen wurden mit einem FACS gezählt. Der chemotaktische Index
stellt das Verhältnis
der Anzahl der Zellen, die in der Gegenwart von Mutanten wanderten,
zu denen einer spontanen Wanderung dar. All die Mutanten außer pVU5
und pVU14 induzierten eine Monocytenchemotaxe, jedoch bei hohen
Konzentration im Bereich von 100 bis 500 mg/ml, die pVU38-Mutante zeigte
eine deutlich geringere Effizienz als Wildtyp RANTES (4).
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Somit
lag, während
das Verhältnis
der minimalen chemotaktischen Dosierung zu der 90 %ig HIV-unterdrückenden
Dosierung in PBMC für
die Mutante zwischen 5 und 8 lag, dieses Verhältnis für Wildtyp RANTES zwischen 1,0
und 2,9.
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Beispiel 5
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Antagonistische
RANTES-Wirkung
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Die
Fähigkeit
der Mutante pVU15 und pVU17 zur Antagonisierung der CCR3- und CCR5-Rezeptoraktivierung
durch Wildtyp RANTES wurde in Bezug auf die intrazelluläre Kalziummobilisierung
untersucht.
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Wenn
pVU15 direkt vor dem Wildtypmolekül hinzugefügt wurde, verringerte es die
Reaktion auf Wildtyp RANTES mit einer Dosis-abhängigen Wirkung. In Bezug auf
CCR5 ergab eine Konzentration von 500 ng/ml die höchste Hemmung
der Wildtyp RANTES-Aktivität,
während
in Bezug auf CCR3 die Rezeptordesensibilisierung unvollständig war
(siehe die 5 und 6).
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Das
Fluoreszenzsignal, das durch Änderungen
in dem intrazellulären
Ca++ induziert war, wurde mit einem Fluorimeter
beobachtet.
