NO332309B1 - Antagonister av CXCRX3-bindene CXC-kjemokiner, samt fremgangsmate for fremstilling derav, DNA molekyler kodende for nevnte antagonister, ekspresjonsvektor, vertcelle, farmasoytisk preparat og anvendelse av nevnte antagonister. - Google Patents

Abstract

Nye antagonister av CXCR3-bindende CXCkjemokiner og spesielt humant CXCLI I kan oppnås gjennom dannelsen av mutanter av slike kjemokiner hvori bindingen til glykosaminoglykaner (GAG'er) er svekket som følge av ikke-konservative substitusjoner av aminosyrer involvert i denne interaksjonen. Forbindelser fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å blokkere aktiviteten til CXCR3-bindende CXCkjemokiner på CXCR3-uttrykkende celler og derved tilveiebringe terapeutiske preparater for anvendelse i behandlingen eller forebyggingen av sykdommer relatert til overdreven aktivert T-cellemigrering, slik som ved transplantatavstøtning og autoimmune sykdommer, og av sykdommer med behov for økt vaskularisering, slik som ischemisk hjertesykdom.

Description

Oppfinnelsen angår struktur og egenskapene ved antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner, og spesielt humant CXCL11.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kjemokiner er utskilte proinflammatoriske proteiner med små dimensjoner (70-130 aminosyrer) som for det meste er involvert i den retningsbestemte migreringen og aktiveringen av celler, spesielt ekstravasjonen av leukocytter fra blodet til vevslokaliteter med behov for å rekruttere disse cellene (Baggiolini M et al, 1997, Fernandez EJ og Lolis E, 2002).

Avhengig av antallet og posisjonen til de konserverte cysteinene i sekvensen klassifiseres kjemokinene i C-, CC-, CXC- og CXaC-kjemokiner. En serie cellemembranreseptorer, alle heptaheliske G-proteinkoplede reseptorer er bindingspartnere som tillater at kjemokinene utøver sin biologiske aktivitet på målcellene som presenterer spesifikke kombinasjoner av reseptorer avhengig av deres tilstand og/eller type. De fysiologiske virkningene av kjemokiner er et resultat av et kompleks og integrert system medvirkende interaksjoner: reseptorene har ofte overlappende ligandspesifisitet slik at en enkel reseptor kan binde forskjellige kjemokiner så vel som at et enkelt kjemokin kan binde forskjellige reseptorer.

Vanligvis fremstilles kjemokiner ved skadesetet, inflammasjonssetet eller andre vevsendringer på en parakrin eller autokrin måte. Celletypespesifikk migrering og aktivering i inflammatoriske prosesser og immunprosesser er imidlertid ikke den eneste aktiviteten til kjemokiner, men andre fysiologiske aktiviteter, slik som hematopoese eller angiogenese, synes å være regulert gjennom noen av disse proteinene.

Selv om det er potensielle ulemper ved å anvende kjemokiner som terapeutiske midler (tendens til å aggregere og broket binding spesielt) gir kjemokinene muligheten for terapeutisk intervensjon i patologiske tilstander assosiert med slike prosesser, spesielt ved hemming av spesifikke kjemokiner og deres reseptorer med det mål å forhindre overdreven rekruttering og aktivering av celler, spesielt leukocytter (Proudfoot A, 2000; Baggiolini M, 2001; Haskell CA et al, 2002).

Blant kjemokinreseptorene er CXCR3 (også kjent som G-proteinkoplet reseptor 9 eller GPR9) en membranreseptor som uttrykkes i stor grad i IL-2-aktiverte T-celler (f.eks. CD4+ CD8+ T-lymfocytter), naturlige dreperceller, B-celler og (i lavere nivåer og/eller på en cellesyklusbegrenset måte) i andre ikke-hemopotiske celletyper, slik som nerver, melkekjertelceller og proksimale rørceller.

Det særegne ved CXCR3 er at, ulikt andre kjemokinreseptorer, viser denne et redusert antall spesifikke CXC-kjemokinligander (CXCL'er): CXCL9 (også kjent som monikinindusert gjennom gammeinterferon, MIG, lite induserbar cytokinunderfamilie B-medlim 9, eller SCYB9), CXCL10 (også kjent som interferon-gamma-induserbart protein 10, IP-10, lite induserbar cytokinunderfamilie B medlem 10, eller SCYB10), og CXCL11 (også kjent som interferon-induserbar T-celle-alfa chemoatraktant, I-TAC, interferon-gamma-induserbart protein 9, IP-9, H174, beta-Rl, lite induserbart cytokinunderfamilie B-medlem 11 eller SCYB11).

Disse tre kjemokinene har ikke bare en affinitet i nanomolarområdet for CXCR3, men deler andre viktige trekk: mange aminosyrer er konserverte i deres sekvens, alle mangler "ELR"-motivet ved den aminosyreterminale enden, de induseres alle av gamma-interferon og alle synes å ha en viktig rolle ikke bare i leukocytt (Thl-celle)-migrering i forhold til ikke bare inflammasjon og autoimmunitet, men også med hensyn til transplantatavstøtning og ischemi. Disse aktivitetene har blitt demonstrert i dyremodeller, slik som "knock-out"-mus og mus behandlet med antistoffer spesifikke for kjemokinet eller reseptoren. Administreringen av antistoffer rettet mot de ekstracellulære domenene til CXCR3, eller mot dets ligander, resulterer f.eks. i den spesifikke inhiberingen av de inflammatoriske responsene mediert gjennom denne reseptoren (WO 01/72334; WO 01/78708; WO 02/15932).

I den kjente teknikk finnes det mange bevis på den molekylære mekanismen assosiert med interaksjonen mellom CXCR3 og dets ligander, og dets viktighet for human fysiologi. Ved sammenligning med CXCL9 og CXC110, synes CXCL11 å være den kraftigste induserende faktor for CXCR3-mediert aktivering, internalisering og transendotelmigrering i menneske- og museleukocytter (Cole K et al, 1998; Lu B, et al. 1999, Sauty A et al, 2001). Aktiviteten eller ekspresjonen av disse molekylene kan være betraktelig oppregulert og modulert i forhold til ulike patologiske tilstander, som vist i dyremodeller eller kliniske prøver assosiert med transplantatavstøting (Meyer M et al, 2001), tuberkulose (Sauty A et al., 1999), transplantert konronart hjertearteriesykdom (Kao J et al., 2003), HIV-1-replikasjon (Lane BR et al, 2003), type 1-diabetes (Frigerio S et al, 2002), sårdannelse i intestinal epitelium (Sasaki S et al, 2002), mikrobiell infeksjon (Cole A et al, 2001), sarkoid granulomatosereaksjoner (Agostini C et al., 1998), aterosklerotiske lesjoner (Mach F et al, 1999), multiple skleroser (Sorensen T et al., 1999; WO 02/098346), kreft (Trentin L et al., 1999; Robledo MM et al, 2001), hudsykdommer (WO 02/43758; Flier J et al., 2001), nefropatier (Romagnani P et al, 1999), tyroidsykdommer (Romagnani P et al, 2002), hjerne- eller ryggmargsskader (WO 03/006045), og mange andre autoimmune eller inflammatoriske sykdommer.

Videre er det også blitt observert at prolifereringen av endotelceller kan påvirkes av interaksjonen mellom CXCR3 og dets ligander (Luster A et al., 1995; Romagnani P et al, 2001). CXCR3-bindendeCXC-kjemokiner viser en angiostatisk aktivitet på endotelceller som kan inhiberes ved hjelp av anti-CXCR3-antistoffer, hvilket antyder et nøye forhold mellom aktiveringen av denne reseptoren og cellesyklusreguleringen, i det minste i endotelium.

Studier av strukturaktivitetsforhold indikerer at kjemokiner har to hovedseter for interaksjon mellom deres reseptorer, den fleksible aminoterminale regionen og den rigide konformasjonsloopen som etterfølger det andre cysteinet. Kjemokinene antas å festes til reseptorene ved hjelp av løkkeregionen og denne kontakten antas å lette bindingen av den aminoterminale regionen som resulterer i reseptoraktivering. Viktigheten av den aminoterminale regionen er også demonstrert gjennom testing av naturlige og syntetiske kjemokiner hvori dette domenet er modifisert eller forkortet. Denne prosessen, etter proteolytisk fordøying, mutagenese eller kjemisk modifisering av aminosyrer, kan enten aktivere eller gjøre disse molekylene fullstendig inaktive og danner forbindelser med agonistisk og/eller antagonistisk aktivitet (US 5 739 103; WO 02/59301).

Disse observasjonene antyder at reguleringen av leukocyttrekruttering gjennom inflammatoriske eller immunreaksjoner er basert på en kombinasjon av slike agonistiske og antagonistiske virkninger, som vist for de CXCR3-bindende CXC kjemokinene og mange andre kjemokiner (Loetscher P and Clark-Lewis I, 2001; Lambeir A et al., 2001). Kjemokinene med spesifikke modifikasjoner i den aminoterminale regionen antas følgelig å ha terapeutisk potensial for inflammatoriske og autoimmune sykdommer (Schwarz og Wells, 1999).

Som mange andre cellesignaliserende løselige molekyler (interleukiner, vekstfaktorer) viser kjemokiner fysiologiske interaksjoner ikke bare med cellereseptorer men også med glykosaminoglykaner (GAG'er), selv om dette er med varierende affiniteter. Disse negativt ladede molekylene er dannet av disakkaridrepeterende enheter (slik som heparin, kondroitinsulfat, heparansulfat, dermatansulfat og hyaluronsyre) og naturlig forekommende på celleoverflater, i den ekstracellulære matriks eller i sirkulasjonen. De kan være tilstede i isolerte former eller bundet til proteiner (proteoglykaner eller PG'er) etter den posttranslasjonelle tilføringen av GAG'er ved serinrester.

Kjemokiner, som de andre GAG-bindende proteinene, har basiske rester (hovedsakelig arginin og lysin) samlet i korte porsjoner i sin sekvens som er egnet for dette formålet men slike motiverer strukturert på forskjellig måte for hvert kjemokin eller gruppe av svært homologe kjemokiner. Noen av disse GAG-bindende setene har blitt satt i sammenheng med spesifikke konsensuser, slik som BBXB-motivet (hvor B representerer en basisk rest og X enhver annen rest) eller andre arrangementer (Kuschert G et al., 1999; Proudfoot A et al, 2001).

Hovedkonsensusen for denne interaksjonen er aggregeringen av kjemokinene, en tilstand som antas å tilveiebringe en beskyttelse for proteolyse, så vel som en mekanisme for den kontrollerte og gradientgenererte frigjøringen av kjemokinene, deltagelsen i gjenkjenningen og i presenteringen av kjemokiner på reseptorene som oligomerer (Hoogewerf AJ et al, 1997; Kuschert G et al, 1999). Interaksjonen med GAG'er og dannelsen av disse gradientene er klart demonstrert for mange kjemokiner og den relative affiniteten er målt. Derfor er det blitt foreslått at også moduleringen av slike interaksjoner kan representere en terapeutisk tilnærming i inflammatoriske sykdommer (Ali S et al, 2001; Patel D et al, 2001).

Midler for å oppnå en terapeutisk effekt på basis av kjente GAG-kjemokininteraksjoner involverer dannelsen av GAG'er-analoger som modulerer interaksjonen mellom endogene GAG'er og kjemokiner (WO 94/20512), anvendelsen av heparanase for å eliminere GAG'er (WO 97/11684), administreringen av kjemokin-GAG'er-komplekser (WO 99/62535), modifiseringen av GAG'er-bindende domene med polymerer (WO 02/04015), eller substitusjonen av rester involvert i GAG-bindende aktivitet (WO 02/28419).

Selv om utstrakte studier er blitt utført på enkelte kjemokiner er det vel etablert at dette ikke er mulig å utnytte på basis av sekvenshomologien med kjemokiner med begrenset likhet eller kjente GAG-bindende proteinmotiver hvor spesifikke basiske rester må modifiseres med ikke-konservative substitusjoner for å svekke GAG-binding siden det er en signifikant strukturell diversitet av GAG-bindende domener blant kjemokinproteinfamilien (Lortat-Jacob H et al, 2002). Fremgangsmåter for å påvise eller identifisere ligander, inhibitorer eller promotorer av CXCR3 er også kjent (US 6 140 064). Imidlertid kan ingen av disse tilnærmingene faktisk anvendes for å danne og studere GAG-bindende defekte CXCL9, CXCL10 eller CXCL11. Strukturelle krav for interaksjonen med GAG'er, verken deres tredimensjonale struktur, er kjent for CXCR3 og for dets ligander. Det er ingen beskrivelse i den kjente teknikk og ved hvilke av restene i disse kjemokinene som er involvert i GAG-binding, så vel som de in vivo-virkninger som er et resultat av deres ikke-konservative substitusjon i mutante proteiner.

Sammendrag av oppfinnelsen

Det har blitt funnet at spesifikke basiske rester i den karboksylterminale enden til et humant CXCR3-bindende CXC-kjemokin (CXCL11) er ansvarlig for interaksjonen med glykosaminoglykaner (GAG'er).

Elimineringen av disse basiske restene ved hjelp av ikke-konservative substitusjoner (f.eks. med alaniner) medfører dannelsen av CXCL11-mutanter som ikke bare har en betraktelig redusert tendens til å binde GAG'er, men også en in vivo-antagonistisk virkning på CXCL11. Slike bevis kan utnyttes for å anvende mutanter av CXCL11 og de mest lignende CXCR3-bindende CXC-kjemokinene (CXCL10 og CXCL9), som antagonister til de korresponderende naturlige kjemokinene. Forbindelser fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å blokkere aktiviteten til CXCR3-bindende CXC-kjemokiner på CXCR3-uttrykkende celler og derved tilveiebringe terapeutiske preparater for anvendelse i behandlingen av sykdommer relatert til overdreven aktivert T-cellemigrering, slik som transplantatavstøtning og autoimmune sykdommer (reumatoid artritt, multippel sklerose, type 1-diabetes), eller kreft, av HIV-1-infeksjon og av sykdommer med behov for økt vaskularisering, slik som iskemisk hjertesykdom.

Nærmere bestemt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner bestående av mutanter av CXCL11, CXCL10 eller CXCL9 hvori i det minste én av de basiske restene, nummerert som sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 46, 62, 66 og 70.

I følge en utførelsesform tilveiebringes antagonister der CXCR3-bindende CXC-kjemokin er humant CXCL11 og i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1) i tillegg er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 49, 52, 57, 59, 67 eller 71.

I følge en annen utførelsesform tilveiebringes antagonister der én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. l)er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: a) 46, sammen med 49 og/eller 52; b) 62, sammen med 57 og/eller 59;

c) 66 og 70, sammen med 67 og/eller 71; eller

d) 62 og 66, sammen med én eller flere av de følgende: 57, 59, 67, 70 eller 71.

I følge enda en annen utførelsesform tilveiebringes antagonister der i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), i tillegg er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 5, 6, 8, 17,20, 26 eller 38.

Enda en annen utførelsesform gjelder antagonister der CXCR3-bindende CXC-kjemokin er humant CXCL10 og i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), i tillegg er substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 47, 48, 51, 52, 59, 74 eller 75.

En ytterligere utførelsesform tilveiebringer antagonister der én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 46 og 52, sammen med 47, 48 eller 51; b) 59 og 62;

c) 66 og 70, sammen med 74 og/eller 75; eller

d) 62 og 66, sammen med 59 og/eller 70.

Det tilveiebringes videre også som en utførelsesform antagonister der i det minste

én av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 8, 22, 26 eller 38.

I følge enda en annen utførelsesform tilveiebringes antagonister der CXCR3-bindende CXC-kjemokiner er humant CXCL9 og basisk rest 67, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin.

I følge ytterligere en utførelsesform tilveiebringes antagonister der én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 62, sammen med 66 og/eller 67;

b) 66 og 67; eller

c) 66 og 70, sammen med én eller flere av de følgende: 67, 74 eller 75.

Videre tilveiebringes i følge en utførelsesform antagonister der hvori i det minste én

av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 6, 8, 25, 28 eller 38.

I følge ytterligere en utførelsesform tilveiebringes antagonister der de basiske restene er substituert med alanin eller glysin, så som antagonister som har sekvensen CXCL11-2B3 (SEKV. ID nr. 3), CXCL11-3B3 (SEKV. ID nr. 4), eller CXCL11-4B4 (SEKV. ID nr. 5).

I enda en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes antagonister der én eller flere av de aminosyrer som er tilført, deletert eller substituert tilhører de første ni aminosyrene i det aminoterminale domenet til humant modent CXCR3-bindende CXC-kjemokin.

I enda en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes antagonister der én eller flere aminosyrer er mutert for å redusere aggregeringsegenskapene til nevnte antagonist.

I enda en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokin omfattende antagonistene ifølge oppfinnelsen, og en aminosyresekvens som tilhører en proteinsekvens som er forskjellig fra det korresponderende CXCR3-bindende CXC-kjemokin.

I enda en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes antagonister omfattende en aminosyresekvens tilhørende én eller flere av proteinsekvensene: ekstracellulære domener av membranbundet protein, immunoglobulinkonstant region, multimeriseringsdomener, ekstracellulære proteiner, signalpeptidinneholdende proteiner, eksportsignalinneholdende proteiner.

I følge en siste utførelsesform av antagonistene i følge oppfinnelsen tilveiebringes antagonister der nevnte antagonist er i form av aktivt konjugat eller kompleks med et molekyl valgt blant radioaktive merker, biotin, fluorescensmerker, cytotoksiske midler eller medikamentleveringsmidler.

Videre tilveiebringes DNA-molekyler omfattende DNA-sekvensene kodende for antagonistene ifølge oppfinnelsen, samt ekspresjonsvektorer omfattende nevnte DNA-molekyler. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en vertscelle transformert med en vektor ifølge oppfinnelsen, hvori vertscellen ikke er en human embryocelle.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse av antagonisten, DNA-molekyler eller vertcelle i følge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandlingen eller forebyggingen av sykdommer relatert til overdreven leukocyttmigrering og aktivering, eller der det er et behov for en økt vaskularisering, eller for behandlingen eller forebyggingen av kreft.

I følge enda et aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av antagonister ifølge oppfinnelsen, omfattende å dyrke de transformerte cellene ifølge oppfinnelsen, og samle de uttrykte proteinene.

Endelig tilveiebringes et farmasøytisk preparat inneholdende en antagonist av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner, DNA-molekyl, eller cellene ifølge oppfinnelsen som aktiv ingrediens.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen er tydelig fra den følgende detaljerte beskrivelse.

Beskrivelse av figurene

Fig. 1: (A) Aminosyresekvenser for modent humant CXCL11 (CXCL11-VT; SEKV. ID nr. 1) og mutantene dannet på basis av denne sekvensen som har blitt uttrykt og testet som beskrevet i eksemplene (muterte aminosyrer er i fet skrift og understreket; SEKV. ID nr. 2-5). Nummereringen er basert på den modne humane sekvensen som mangler et 21 aminosyrer langt signalpeptid. (B) Sammenstilling av sekvensen vanlig for den modne formen av de følgende CXCR3-bindende CXC-kjemokinene: muse CXCL11 (mCXCLll; SWISSPROT Acc. nr. Q9JHH5; SEKV. ID nr. 8), menneske CXCL11 (hCXCLll; SWISSPROT Acc. nr. 014625; SEKV. ID nr. 1), menneske CXCL10 (hCXCL 10; SWISSPROT Acc. nr. P02778; SEKV. ID nr. 6), og menneske CXCL9 (hCXCL9; SWISSPROT Acc. nr. Q07325; SEKV. ID nr. 7). Fete og understrekede rester i human CXCL11-sekvens har blitt mutagenisert til alanin i ulike varianter presentert i eksemplene (restene 5, 6, 8, 46, 49, 52, 57, 59, 62, 66, 67, 70 og 71). De andre basiske restene i humant CXCL11, og alle de basiske restene i CXCL11 fra mus, CXCL10 fra menneske og CXCL9 fra menneske er understreket. Cysteiner og basiske rester som er konservert blant humane CXCR3-bindende CXC-kjemokiner er indikert i bokslinjen under sammenstillingen, henholdsvis som C og B. Nummereringen er basert på den modne humane sekvensen som mangler et signalpeptid inkludert de N-terminale aminosyrene 21 (mCXCLl 1, hCXCLl 1 og hCXCLlO) eller 22 aminosyrer (hCXCL9). Den modne formen av mCXCLll, hCXCLll og hCXCLlO synes fullstendig mens den modne formen av hCXCL9 har 25 flere aminosyrer ved karboksylenden.

Fig. 2: Graf som representerer resultatene fra heparinbindingsanalysen utført med [<3>H]-heparin, for sammenligning av aktiviteten til CXCL11-VT og de indikerte CXCL11-mutantene i mikromolarområdet. Fig. 3: Graf som representerer resultatene av likevektkonkurransereseptorbindings-analysen utført ved monitorering av prosenten av [<I25>I]-CXCL11 fjernet fra membraner av CXCR3-uttrykkende HEK-c eller etterfulgt av tilsettingen av CXCL11-VT og av de indikerte CXCL 11-mutanter i pico-/mikromolarkonsentra-sjonsområdet. Fig. 4: Graf som representerer resultatene av kjemotakseanalysen utført på CXCR3-uttrykkende Ll,2-celler ved anvendelse av CXCL11-VT eller de indikerte CXCL11-mutantene. Fig. 5: Graf som sammenfatter resultatene av den peritoneale cellerekrutterings-analysen utført på Balb/C-hunnmus ved anvendelse av CXCL 11-VT eller de andre indikerte CXCL 11-mutantene sammenlignet med en kontroll med saltoppløsnings-buffer. Det statistiske signifikansnivået er representert med antallet stjerner. Fig. 6: Graf som sammenfatter resultatene av CXCL11-3B3 sin evne til å hemme cellulær rekruttering indusert gjennom CXCL11-VT (begge administrert i mengder på 10 u,g). Saltoppløsning eller CXCL11-3B3 ble administrert 30 min. forut for administrering av CXCL11-VT. Fig. 7: Graf som sammenfatter resultatene av forsinket kontakthypersensitivitets-analyse ved anvendelse av saltoppløsning, som en kontroll, eller CXCL11-3B3 ved

en dose på 0,5 mg/kg. Virkningen måles i form av øresvellingsvolum i dagene etter behandlingen (D5, D6, D7, osv.) med et tykkelsesgradert mål.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Hovedformålet ved den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe nye antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner bestående av GAG-bindingsdefekte mutanter av disse kjemokinene hvori én eller flere av de konserverte basiske restene i karboksylterminal ende er eliminert ved hjelp av ikke-konservativ substitusjon. Mutanter av CXCL11, CXCL 10 eller CXCL9 med antagonistiske egenskaper er spesielt de hvor i det minste én av de følgende basiske aminosyrene valgt blant 46, 62, 66 og 70, som nummerert etter sekvensen av humant modent CXCL11, er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin.

Basiske rester som i tillegg kan muteres i foretrukne mutanter er de som er konservert i én eller flere spesifikke CXCR3-bindende CXC-kjemokiner (i humane kjemokiner eller over andre arter), og/eller de som omgir disse konserverte basiske rester. Multiple mutanter dannes fortrinnsvis ved å substituere i det minste to etterfølgende konserverte basiske rester på en ikke-konservert måte, men andre mulige kombinasjoner er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende patentsøknaden tilveiebringer in vivo- og in vitro-data på bindingen og antagonistiske aktiviteter av nye rekombinante CXCL 11-mutanter hvori spesifikke kombinasjoner av basiske rester ble ikke-konservativt substituert med alaniner. Disse bevisene, kombinert med kunnskapen om sekvensen og egenskapene til andre svært konserverte CXCR3-bindende CXC-kjemokiner antyder at spesifikke konserverte basiske seter ikke bare spiller en generell rolle i den biologiske aktiviteten til disse kjemokinene, men at de kan modifiseres i henhold til den foreliggende oppfinnelse for å oppnå en serie molekyler med antagonistiske egenskaper mot det naturlige kjemokin.

Det beskrives antagonister av human CXCL11 av mutanter av humant CXCL11 hvori i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11 ytterligere er substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 49, 52, 57, 59, 67 eller 71. Mer foretrukket har CXCL 11-mutantene én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 46, sammen med 49 og/eller 52; b) 62, sammen med 57 og/eller 59;

c) 66 og 70, sammen med 67 og/eller 71; eller

d) 62 og 66, sammen med én eller flere av følgende: 57, 59, 67, 70 eller 71.

Eksemplene beskriver mutanter inkludert i definisjonene av (a), (b) eller (c)-kombinasjonen mens (d)-kombinasjonen inkluderer to etterfølgende konserverte basiske rester sammen med omliggende basiske rester.

Endelig er de basiske rester i CXCL11 som ytterligere kan muteres de som er konservert i et annet CXCR3-bindende CXC-kjemokin og/eller på kryss av arter (slik som mus). Derfor er andre foretrukne CXCL 11-mutanter de med i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, ytterligere substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 6, 8, 17, 20, 26 eller 38.

Det beskrives antagonister av humant CXCL 10 av mutanter av humant CXCL 10 hvori i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert på basis av humant modent CXCL 10, ytterligere er substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 47, 48, 51, 52, 59, 74 eller 75. Nærmere bestemt har CXCLlO-mutanter én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert etter sekvensen til humant modent CXCL11, substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 46 og 52, sammen med 47, 48 eller 51; b) 59 og 62;

c) 66 og 70, sammen med 74 og/eller 75; eller

d) 62 og 66, sammen med 59 og/eller 70.

Endelig kan basiske rester i CXCL 10 ytterligere muteres og er de som er konservert

i andre CXCR3-bindende CXC-kjemokin og/eller på kryss av arter (slik som mus). Andre foretrukne CXCLlO-mutanter er derfor de hvor i det minste én av de følgende basiske rester, nummerert på basis av humant modent CXCL11, ytterligere substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, mitamin, aspartinsyre eller aspargin: 5, 8, 22, 26 eller 38.

Ytterligere beskrives antagonister av humant CXCL9 av mutanter av humant CXCL9 hvori basisk rest 67, nummerert på basis av humant modent CXCL11-sekvens, ytterligere er substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin. Mer foretrukket har CXCL9-mutantene én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert på basis av sekvensen til humant modent CXCL11, substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 62, sammen med 66 og/eller 67;

b) 66 og 67; eller

c) 66 og 70, sammen med én eller flere av de følgende: 67, 74 eller 75.

Endelig er de basiske restene i CXCL9 som kan ytterligere muteres de som er

konserverte i andre CXCR3-bindende CXC-kjemokiner og/eller på kryss av arter

(slik som mus). Andre foretrukne CXCL9-mutanter har derfor i det minste én av de følgende basiske rester, nummerert på basis av sekvensen til humant modent CXCL11, ytterligere substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 6, 8, 25, 28 eller 38.

Aminosyren som erstatter den basiske resten er fortrinnsvis en ikke-polar, liten aminosyre slik som alanin eller glysin, men andre aminosyrer er passende forutsatt at de har en ladning og dimensjon som er ikke-kompatibel med GAG-binding og, samtidig, påvirker lite andre egenskaper ved proteinet. Aminosyrer egnet for substitusjonene er alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin. Antagonister av humant CXCL 11 som har alaninsubstitusjoner i kombinasjon med basiske rester som beskrevet i den foreliggende oppfinnelse (fig. IA) har sekvensen beskrevet som CXCL11-2B3 (SEKV. ID nr. 3), CXCL11-3B3 (SEKV. ID nr. 4) eller CXCL11-4B4 (SEKV. ID nr. 5). Eksemplene viser hvordan disse CXCL 11-mutantene er heparinbindingsdefekte og virker som antagonister av det korresponderende naturlige kjemokin, hvor CXCL11-3B3 er spesielt effektivt.

Ordet "GAG-bindende defekte mutanter" eller "heparinbindende defekte mutanter" betyr at mutantene har en liten evne til å binde GAG'er i analysene beskrevet i den foreliggende oppfinnelse (dvs. en lavere prosent av disse mutantene, med hensyn til det korresponderende villtypemolekyle, binder til GAG'er slik som heparin).

I den foreliggende oppfinnelse er "CXCR3-bindende CXC-kjemokiner" de humane ikke-ELR-kjemokinene som vist i fig. IB: humant CXCL11 (også kjent som H174, interferoninduserbar T-celle-alfa-kjemoattraktant, I-T AC, eller interferon-gamma-indusert protein 9), humant CXCL10 (også kjent som IP-10 eller interferon gamma-indusert protein 10), humant CXCL9 (også kjent som MIG eller interferon gamma-indusert monokin). Denne definisjonen inkluderer så vel pattedyrortologer av disse sekvensene (slik som mus CXCL11, vist i fig. IB).

I lys av den kjente teknikk er det ingen indikasjon på at de ovenfor nevnte kombinasjoner av basiske aminosyrer i karboksylterminal ende til CXCL11

definerer et GAG'er-heparinbindingssete og at de ikke-konserverte substitusjonene av disse restene til molekyler som har antagonistaktivitet mot det korresponderende naturlige molekyl. Gitt den konserverte graden til enkelte basiske rester inkludert i disse kombinasjonene blant kjente humane CXCR3-bindingskjemokiner (CXCL10 og CXCL9) kan det videre trekkes den slutning at antagonistene av denne gruppen kjemokiner kan oppnås ved hjelp av ikke-konservativ substitusjon av rester svarende til de som er funksjoneltkarakterisertfor humant CXCL 11 i det foreliggende patent. Derfor tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse mutanter av CXCR3-bindingsproteiner som inneholder en kombinasjon av mutasjonene beskrevet ovenfor og som virker som antagonister for de korresponderende naturlig

forekommende kjemokinene. Forbindelser fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å blokkere aktiviteten til CXCR3-bindende CXC-kjemokiner på CXCR3-uttrykkende celler og derved tilveiebringe terapeutiske preparater for anvendelse i behandlingen av sykdommer relatert til overdreven eller ukontrollert produksjon av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner, slik som autoimmune sykdommer eller transplantatavstøtning eller for å motvirke deres angio statiske virkninger.

Ytterligere formål ved den foreliggende oppfinnelse er alternative molekyler basert på strukturen og aktiviteten til antagonistene av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner ifølge den foreliggende oppfinnelse.

En første klasse av alternative molekyler er representert ved aktive mutanter av de CXCR3-bindende CXC-kjemokinantagonistene definert ovenfor. Disse proteinene bør opprettholde og selv forsterke de antagonistiske egenskapene til mutantene eksemplifisert i det foreliggende patent.

Denne kategorien molekyler inkluderer naturlige eller kunstige analoger av nevnte sekvens, hvori én eller flere aminosyrerester er tilført, deletert eller substituert, forutsatt at de viser den samme biologiske aktivitetenkarakteriserti den foreliggende oppfinnelse ved sammenlignbare eller høyere nivåer, som bestemt ved hjelp av kjente midler og beskrevet i eksemplene nedenfor. F.eks. kan spesifikke mutanter ha én eller flere aminosyrer som er tilført, deletert eller substituert i den aminosyreterminale regionen kjent for å påvirke reseptorbinding. Spesielt kan disse mutasjonene involvere én eller flere av de første ni aminosyrene i det modne humane CXCR3-bindende CXC-kjemokinet posisjonert i den aminoterminale regionen, rett før det konserverte CXC-motivet (fig. IB). Slike molekyler kan eventuelt inneholde én eller flere aminosyrer som er blitt mutert for oppnåelse av en variant med en redusert aggregeringstendens som vist for andre kjemokiner (WO 98/13495).

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er de foretrukne endringene i disse aktive mutantene vanligvis kjent som "konservative" eller "sikre" substitusjoner og involverer ikke-basiske rester. Konservative aminosyresubstitusjoner er de hvor aminosyrene har tilstrekkelig like kjemiske egenskaper, for å kunne konservere strukturen og den biologiske funksjonen til molekylet. Det er klart at innsetting og delesjon av aminosyrer også kan gjøres i den ovenfor nevnte sekvensen uten å endre deres funksjon, spesielt dersom innsettingene eller delesjonene kun involverer noen få aminosyrer, f.eks. under ti, og fortrinnsvis under tre, og ikke fjerner eller forflytter aminosyrer som er kritiske for den funksjonelle konformasjonen av et protein eller et peptid.

Litteraturen tilveiebringer mange modeller for hvordan seleksjonen av konservative aminosyresubstitusjoner kan utføres på basis av statistisk og fysiokjemiske studier av sekvensen og/eller strukturen til det naturlige protein (Rogov SI og Nekrasov AN, 2001). Proteindesigneksperimenter har vist at anvendelsen av spesifikke undersett av aminosyrer kan fremstille sammenleggbare og aktive proteiner ved hjelp av klassifiseringen av "synonyme"-aminosyresubstitusjoner som kan være enklere tilpasset i proteinstruktur og som kan anvendes for å påvise funksjonelle og strukturelle homologer og paraloger (Murphy LR et al, 2000). De synonyme aminosyre gruppene og mer foretrukket synonyme grupper er de som er definert i tabell 1.

Aktive mutanter fremstilt gjennom substitusjon gjort på basis av denne læren, så vel som aktive mutanter hvori én eller flere aminosyrer ble eliminert eller tilført er blant formålene ved den foreliggende oppfinnelse, dvs. nye mutanter av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner med dårlig GAG-bindingsegenskaper og antagonistisk aktivitet på korresponderende CXCR3-bindende kjemokiner, sammenlignbar med de til de initialt valgte mutanter, og til og med forbedret om mulig. Lignende forbindelser kan være et resultat av konvensjonell mutageneseteknikk på den kodende DNA, fra kombinatoriske teknologier på det kodende DNA-sekvensnivået (slik som DNA-"shuffling", fagdisplay/seleksjon), eller fra dataassisterte designstudier, etterfulgt av validering for ønskede aktiviteter som beskrevet i den kjente teknikk og i eksemplene nedenfor.

En annen klasse alternative molekyler ifølge oppfinnelsen er representert gjennom antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner omfattende én av aminosyresekvensene som definert ovenfor og en aminosyresekvens tilhørende en proteinsekvens som er forskjellig fra det korresponderende CXCR3-bindende CXC-kjemokinet. Denne sistnevnte heterologe sekvensen bør tilveiebringe ytterligere egenskaper uten å svekke signifikant antagonistaktiviteten eller forbedre GAG-bindende egenskaper. Eksempler på slike ytterligere egenskaper er en enklere renseprosedyre, en lengre halveringstid i kroppsvæsker, en ytterligere bindingsenhet, modningen ved hjelp av en endoprotolytisk fordøying eller ekstracellulær lokalisering. Sistnevnte trekk er av spesiell viktighet for definering av en spesifikk gruppe fusjons- eller kimerproteiner inkludert i den ovenfor nevnte definisjonen siden den tillater at molekylene definert som CXCR3-bindende CXC-kjemokinantagonister i dette patent og blir lokalisert i rommet der ikke bare isoleringen og rensingen av disse polypeptidene er fasilitert, men også hvor CXCR3-bindende CXC-kjemokiner og deres reseptorer naturlig reagerer.

Design av enhetene, ligandene og "linkerne", så vel som fremgangsmåter og strategier for konstruksjonen, rensingen, påvisningen og anvendelsen av fusjonsproteiner er nøye diskutert i litteraturen (Nilsson J et al, 1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137). Ytterligere proteinsekvenser som kan anvendes for å danne antagonister ifølge den foreliggende oppfinnelse er valgt blant ekstracellulære domener av membranbundne proteiner, immunglobulinkonstant region, multimeriseringsdomener, ekstracellulære proteiner, signalpeptidinneholdende proteiner, eksportsignalinneholdende proteiner. Valget av én eller flere av disse sekvensene som skal fuseres til den GAG-bindende defekte mutanten av CXCR3-bindende CXC-kjemokin er funksjonell for spesifikk anvendelse og/eller renseprotokoll for nevnte middel.

En tredje klasse alternative molekyler ifølge oppfinnelsen er representert gjennom peptidetterligninger ("mimetics", også kalt "peptidomimetics") av de beskrevne mutanter av CXCR3-bindende kjemokiner, hvori peptidets eller polypeptidets natur har blitt kjemisk modifisert på nivået til aminosyresidekjeder, aminosyrekiralitet og/eller peptidryggrad. Disse endringene er ment å tilveiebringe antagonister med forbedret fremstilling, kraft og/eller farmakokinetiske egenskaper.

Når peptidet utsettes for kløyving av peptidaser etter injeksjon i individet er et problem kan erstatningen av en spesifikk sensitiv peptidbinding med en ikke-kløyvbar peptidetterligning tilveiebringe et peptid som er mer stabilt og som følgelig er mer anvendelig som et terapeutisk middel. På lignende måte kan erstatningen av en L-aminosyrerest være en standardmåte å oppnå at peptidet blir mindre sensitivt for proteolyse og endelig mer lignende organiske forbindelser andre enn peptider. Også anvendelig er aminosyreterminale blokkeringsgrupper slik som t-butyloksykarbonyl, acetyl, succinyl, metoksysuccinyl, suberyl, adipyl, azelayl, dansyl, benzyloksykarbonyl, fluorenylmetoksykarbonyl, metoksyazelayl, metoksyadipyl, metoksysuberyl og 2,4-dinitrofenyl. Mange andre modifikasjoner som tilveiebringer økt kraft, forlenget aktivitet, renseenkelhet og/eller økt halveringstid er kjent i teknikkens stand (WO 02/10195; Villain M et al, 2001).

Foretrukne alternativer "synonyme" grupper for aminosyrederivater som er indusert i peptidetterligninger er de som definert i tabell II. En ikke-uttømmende liste av aminosyrederivater inkluderer også aminoisobutyrsyre (Aib), hydroksyprolin (Hyp), l,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-COOH, indolin-2-karboksylsyre, 4-difluorprolin, L-tiazolidin-4-karboksylsyre, L-homoprolin, 3,4-dehydroprolin, 3,4-dihydroksyfenylalanin, sykloheksylglysin og fenylglysin.

Med "aminosyrederivat" menes en aminosyre eller aminosyrelignende kjemisk enhet andre enn de 20 genetisk kodede naturlig forekommende aminosyrene. Spesielt kan aminosyrederivater inneholde substituerte eller ikke-substituerte alkylenheter som kan bli lineære, forgrenede eller sykliske og som kan inkludere én eller flere heteroatomer. Aminosyrederivatene kan dannes de novo eller oppnås fra kommersielle kilder (Calbiochem-Novabiochem AG, Sveits; Bachem, USA).

Ulike metodologier for å inkorporere unaturlige aminosyrederivater i proteiner, ved anvendelse både av in vitro- og in vivo-translasjonssystemene, for å undersøke og/eller forbedre proteinstruktur og funksjon beskrevet i litteraturen (Dougherty DA, 2000). Teknikken for syntesen og utviklingen av peptidetterligninger så vel som ikke-peptidetterligninger, som også er kjent i teknikkens stand (Sawyer TK, 1997; Hruby VJ og Balse PM, 2000; Golebiowski A et al, 2001).

Polypeptidene og peptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være i andre alternative former som er foretrukket ifølge den ønskede fremgangsmåten for anvendelse og/eller produksjon, f.eks. som aktiv fraksjon, forløper, salter eller derivater.

Uttrykket "aktiv" betyr at slike alternative forbindelser bør opprettholde de funksjonelle trekkene til CXCR3-bindende CXC-kjemokinmutanter ifølge den foreliggende oppfinnelse og bør være vel så farmasøytisk akseptabel og anvendelig.

Uttrykket "fraksjon" henviser til ethvert fragment av polypeptidkjeden til forbindelsen per se, alene eller i kombinasjon med beslektede molekyler eller rester bundet til dette, f.eks. rester av sukre eller fosfater. Slike molekyler kan være et resultat også fra andre modifikasjoner som ikke normalt endrer primærsekvensen f.eks. in vivo eller in vitro-kjemisk derivatisering av peptider (acetylering eller karboksylering), de som er dannet ved å modifisere fosforyleringsmønstre (introdusere fosfotyrosin, fosfoserin eller fosfotreoninrester) eller glykosylering (ved å eksponere peptidet for enzymer som påvirker glykosyleringen f.eks. pattedyrglykosylering eller deglykosyleringsenzymer) av et peptid i løpet av dets syntese og bearbeiding eller i ytterligere bearbeidingstrinn.

Forløperen er forbindelser som kan omdannes til forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse gjennom metabolske og enzymatiske prosesser forut eller etter administreringen til cellene eller til kroppen.

Uttrykket "salter" henviser til både salter av karboksylsyrer og syreaddisjonssalter av aminosyregrupper til peptidene, polypeptidene eller analogene derav, ifølge den foreliggende oppfinnelse. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved hjelp av kjent teknikk og inkluderer uorganiske salter f.eks. natrium-, kalium-, ammonium-, jern- eller sinksalter og lignende, og salter med organiske baser som for dem med f.eks. aminer, slik som trietylamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og lignende. Syreaddisjonssalter inkluderer f.eks. salter med mineralsyre slik som f.eks. hydroklorsyre eller svovelsyre og salter med organiske syrer slik som f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Alle slike salter bør ha vesentlig lik aktivitet for peptidene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen og deres analoger.

Uttrykket "derivater" som anvendt heri henviser til derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene som er tilstede på aminosyreenhetenes sidegrupper eller på amino-/eller karboksyendegruppene ifølge kjente fremgangsmåter. Slike derivater inkluderer f.eks. estere eller alifatiske amider av karboksylgruppene og N-acylderivatene av frie aminogrupper eller O-acylderivatene av frie hydroksylgrupper og er dannet med acylgrupper som f.eks. alkanoyl- eller aroylgrupper.

Anvendelige konjugater eller komplekser av antagonister ifølge oppfinnelsen kan dannes ved anvendelse av kjente molekyler og kjente fremgangsmåter for interaksjon med reseptor eller andre proteiner (radioaktive eller fluorescensmerker, biotin), som øker den terapeutiske effektiviteten (cytotoksiske midler) eller forbedrer midlene i form av medikamentleveringseffektivitet, slik som polyetylenglykol og andre naturlige eller syntetiske polymerer (Pillai O og Pancagnula R, 2001). I sistnevnte tilfelle kan antagonistene fremstilles ved å følge en seterettet modifikasjon av en passende rest i den naturlige eller muterte sekvensen ved en indre eller endeposisjon.

Litteraturen gir eksempler på teknologier for å danne polymermodifiserte eller konjugerte kjemokiner (WO 02/04015; WO 02/20033; WO 02/02132). Enhver rest kan anvendes for binding, forutsatt at de har en sidekjede som kan bindes til polymer (dvs. sidekjeden til en aminosyre som bærer en funksjonell gruppe, f.eks. lysin, aspartinsyre, glutaminsyre, cystein, histidin, etc). Alternativt kan en rest ved disse setene erstattes med en ulik aminosyre med en sidekjede som kan binde polymer. Sidekjedene for de genetisk kodede aminosyrene kan også modifiseres kjemisk for polymerbinding, eller unaturlige aminosyrer med passende funksjonelle grupper på sidekjedene kan anvendes. Polymerbinding trenger ikke bare å være på sidekjeden til aminosyrene som naturlig forekommer i en spesifikk posisjon til antagonisten eller til sidekjeden til en naturlig eller unaturlig aminosyre som erstatter aminosyren som naturlig forekommer i en spesifikk posisjon i antagonisten men kan også være en karbohydratenhet eller en annen enhet som er bundet til sidekjeden til aminosyren ved målposisjonen.

Polymerer som er egnet for formålene er biokompatible, dvs. de er ikke-toksiske for biologiske systemer og mange slike polymerer er kjent. Slike polymerer kan være hydrofobe eller hydrofile av natur, biodegraderbare, ikke-biodegraderbare eller en kombinasjon derav. Disse polymerene inkluderer naturlige polymerer (slik som kollagen, gelatin, cellulose, hyaluronsyre), så vel som syntetiske polymerer slik som polyestere, polyortoestere, polyanhydrider). Eksempler på hydrofobe, ikke-degraderbare polymerer inkluderer polydimetylsiloksaner, polyuretaner, polytetrafluretylener, polyetylener, polyvinylklorider og polymetylmetakrylater. Eksempler på hydrofile ikke-degraderbare polymerer inkluderer poly(2-hydroksyetylmetakrylat), polyvinylalkohol, poly(N-vinylpyrrolidon), polyalkylener, polyakrylamid, og kopolymerer derav. Foretrukne polymerer omfatter en etterfølgende repeterende etylenoksidenhet, slik som polyetylenglykol (PEG).

Den foretrukne fremgangsmåten for binding omfatter en kombinasjon av peptidsyntese og kjemisk ligering. Bindingen av en vannløselig polymer vil fordelaktig være gjennom en biodegraderbar linker, spesielt ved den aminoterminale regionen til et protein. Slike modifikasjoner gir proteinet en forløper (eller "forløpermedikament")-form som ved degradering av linkeren frigjør proteinet uten polymermodifikasjon.

Antagonistene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av enhver kjent fremgangsmåte, inkludert rekombinant DNA-relaterte teknologier og kjemiske synteseteknologier.

Et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse er DNA-molekylene som omfatter DNA-sekvensen som koder for antagonistene av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner beskrevet ovenfor, inkludert nukleotidsekvensene som er vesentlig like. "Nukleotidsekvenser som er vesentlig like" inkluderer alle andre nukleinsyresekvenser som følge av den degenererte genetiske kode også koder for den gitte aminosyresekvensen. Enda et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse er ekspresjonsvektorer som omfatter de ovenfor angitte DNA'er, vertsceller transformert med slike vektorer og fremgangsmåten for fremstillingen av antagonistene beskrevet ovenfor, omfattende å dyrke disse transformerte cellene og samle de uttrykte proteinene. Når vektoren uttrykker antagonistene som et fusjonsprotein med ekstracellulære, eksportsignal- eller signalpeptidinneholdende proteiner kan CXCR3-bindende CXC-kjemokinantagonister utskilles i det ekstracellulære rom og kan enklere samles og renses fra de dyrkede cellene i form av ytterligere bearbeiding eller alternativt så kan cellene anvendes direkte eller administreres.

Disse formålene ved oppfinnelsen kan oppnås ved å kombinere beskrivelsen tilveiebragt gjennom den foreliggende patentsøknaden rettet på antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner med kunnskapen om kjente molekylære biologiske teknikker. Mange bøker og oversiktsartikler tilveiebringer læren om å klone og fremstille rekombinante proteiner ved anvendelse av vektorer og prokaryote eller eukaryote vertsceller, slik som titlene i serienee "A Practical Approach", publisert ved Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).

DNA-sekvensen som koder for proteinene ifølge oppfinnelsen kan settes inn og ligeres i en egnet episomal eller ikke-/homolog integreringsvektor som kan introduseres i en passende vertscelle ved hjelp av egnede midler for å transformere disse (transformasjon, transfeksjon, konjugering, protoplastfusjon, elektroporering, kalsiumfosfatpresipitering, direkte mikroinjeksjon, osv.). Viktige faktorer i utvelgelsen av et spesifikt plasmid eller en virusvektor inkluderer: hvor enkelt mottakereellene som inneholder vektoren kan gjenkjennes og selekteres fra de mottakercellene som ikke inneholder vektoren; antallet kopier av vektoren som er ønsket i en spesifikk vert; og hvorvidt det er ønskelig å være i stand til å overføre/sende ("shuttle") vektoren mellom vertsceller av forskjellige arter.

Vektorene bør tillate ekspresjonen av det isolerte eller fusjonerte proteinet inkludert antagonisten ifølge oppfinnelsen i den prokaryote eller eukaryote vertscellen under kontrollen av transkripsjonsinitierings-, termineringsregulerende sekvenser som velges slik at de er konstitutivt aktive eller induserbare i nevnte celle. En cellelinje vesentlig beriket på slike celler kan deretter isoleres og tilveiebringe en stabil cellelinje.

For eukaryote verter (dvs. gjær, insektceller og pattedyrceller) kan forskjellige transkripsjonene og translasjonelle regulatoriske sekvenser anvendes avhengig av vertens natur. De kan utledes fra viruskilder, slik som adenovirus, bovint papillomavirus, simianvirus eller lignende hvor de regulatoriske signalene er assosiert med et spesifikt gen som har et høyt ekspresjonsnivå. Eksempler er TK-promoteren fra herpesvirus, SV40 tidlig promoter, gjær promoteren fra gal4-genet, osv. Transkripsjonsinitieringsregulerende signaler kan velges slik at represjon og aktivering tillates slik at ekspresjonen av genene kan moduleres. Cellene som har blitt stabilt transformert gjennom det introduserte DNA kan velges ved også å introdusere én eller flere markører som tillater seleksjon av vertsceller som inneholder ekspresjonsvektoren. Markøren kan også gi fototrofi til en auksotrop vert, biosidresistens, f.eks. antibiotika, eller tungmetaller slik som kopper eller lignende. Det selekterbare markørgenet kan enten være direkte bundet til DNA-gensekvensene som skal uttrykkes eller introduseres i den samme cellen ved hjelp av kotransfeksjon. Ytterligere elementer kan også være nødvendig for optimal syntese av proteiner ifølge oppfinnelsen.

Vertsceller kan være enten prokaryote eller eukaryote. Foretrukne eukaryote verter, f.eks. pattedyrceller, slik som menneske-, ape-, muse- og kinesiske hamstereggstopp (CHO)-celler er foretrukket fordi de tilveiebringer post-translasjonell modifisering av proteinmolekylene, inkludert korrekt folding eller glykosylering ved korrekte seter. Gjærceller kan også utføre post-translasjonelle peptidmodifiseringer inkludert glykosylering. Et antall rekombinante DNA-strategier eksisterer som utnytter sterke promotersekvenser og høyt kopiantall av plasmider som kan utnyttes for fremstillingen av de ønskede proteinene i gjær. Gjær gjenkjenner ledersekvensen i klonede mammalske genprodukter og utskiller peptider som bærer ledersekvenser (dvs. prepeptider).

Eksempler på kjemiske synteseteknologier er fastfasesyntese og væskefasesyntese. I en fastfasesyntese finnes f.eks. aminosyren svarende til den karboksyterminale enden av peptidet som skal syntetiseres til en støtte som er uløselig i organiske løsningsmidler og gjennom alternerende reaksjonsrepetisjon kondenseres én etter én, hvori aminosyrene med deres aminogrupper og sidekjedefunksjonelle grupper er beskyttet med passende beskyttelsesgrupper fra den karboksyterminale enden til aminoterminal ende, og hvor aminosyrene bundet til resinet eller den beskyttende gruppen av aminogruppene til peptidene frigjøres, hvor peptidkjeden forlenges på denne måten (?). Fast fasesyntesemetoder er stort sett klassifisert gjennom tBoc-metoden og Fmoc-metoden avhengig av typen beskyttelsesgruppe som anvendes. Vanlig anvendte beskyttelsesgrupper inkluderer tBoc (t-butoksykarbonyl), Cl-Z (2-klorbenzyloksykarbonyl), Br-Z (2-brombenzyloksykarbonyl), Bzl (benzyl), Fmoc (9-fluorenylmetoksykarbonyl), Mbh (4,4'-dimetoksydibenzhydryl), Mtr (4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl), Trt (trityl), Tos (tosyl), Z (benzyloksykarbonyl) og C12-Bzl (2,6-diklorbenzyl) for aminogrupper; N02 (nitro) og Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl) for guanidingruppene); og tBu (t-butyl) for hydroksygruppene). Etter syntese av det ønskede peptidet utsettes dette for avbeskyttelsesreaksjon og kuttes fra den faste støtten. Slik peptidkuttingsreaksjon kan utføres med hydrogenfluorid eller trifluormetansulfonsyre for Boc-metoden og met TFA for Fmoc-metoden. Totalt syntetiske kjemokiner er beskrevet i litteraturen (Brown A et al, 1996).

Rensing av de syntetiske eller rekombinante antagonistene ifølge oppfinnelsen kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst kjent fremgangsmåte for dette formålet, dvs. enhver konvensjonell fremgangsmåte som involverer ekstraksjon, presipitering, kromatografi, elektroforese eller lignende. En ytterligere renseprosedyre som kan anvendes for å rense proteinet ifølge oppfinnelsen er affinitetskromatografi ved anvendelse av monoklonale antistoffer eller affinitetsgrupper som binder målproteinet og som er fremstilt og immobilisert på en gelmatriks inneholdt inne i en kolonne. Urene preparater inneholdende proteinene passeres gjennom kolonnen. Proteinet vil bindes til kolonnen gjennom heparin eller ved hjelp av de spesifikke antistoffene mens urenhetene vil passere gjennom. Etter vasking elueres proteinet fra gelen ved en endring i pH eller ionestyrke. Alternativt kan HPLC (høytrykks væskekromatografi) anvendes. Elueringen kan utføres ved anvendelse av et vann-acetonitrilbasert løsningsmiddel som vanligvis anvendes for proteinrensing. Oppfinnelsen inkluderer rensede preparater av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Rensede preparater som anvendt heri viser til preparatene som er i det minste 1 vekt%, fortrinnsvis i det minste 5 vekt% av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av CXCR3-bindende CXC-kjemokinantagonister som medikamenter, spesielt som de aktive ingrediensene i farmasøytiske preparater (og formulert i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere, eksipienter, stabilisatorer, adjuvanser eller fortynningsmidler) for behandling eller forebygging av sykdommer relatert til en uønsket aktivitet av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner som medfører en overdreven migrering og aktivering av leukocytter som uttrykker deres reseptorer, slik som autoimmune og inflammatoriske sykdommer, så vel som kreft eller bakterielle/virale infeksjoner. Ikke-begrensende eksempler på slike sykdommer er følgende: artritt, reumatoid artritt (RA), psoriatisk artritt, osteoartritt, systemisk lupuserytematosus (SLE), systemisk sklerose, skleroderma, polymyosititt, glomerulonefrititt, fibrose, lever- eller lungefibrose og inflammasjon, allergi eller hypersensitivitetssykdommer, dermatitt, astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom, sårdannende kolitt, multippel sklerose, septisk sjokk, HIV-infeksjon, transplantatavstøtning og vaskulær inflammasjon relatert til aterosklerose.

I lys av den kjente teknikk som beskriver den spesifikke angiostatiske aktiviteten til CXCR3-bindende CXC-kjemokiner kan antagonisten ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes som aktive ingredienser i farmasøytiske preparater for behandlingen eller forebyggingen av sykdommer med behov for en økt vaskularisering, hvilket er tilfelle i patologiske tilstander slik som iskemisk arteriesykdom, slag og forsinket sårheling. Stimuleringen av ny blodårevekst som et resultat av antagonisering av angiostatiske faktorer kan hjelpe behandlingen av disse sykdommene ved å gjenopprette en tilstrekkelig sirkulasjon.

Et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse er farmasøytiske preparater som inneholder, som aktiv ingrediens, en antagonist av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner i formene som definert ovenfor: proteiner, peptidetterligninger, derivater, forløpere, så vel som DNA kodende for eller celler som uttrykker disse. Fremgangsmåten for fremstillingen av slike farmasøytiske preparater for behandlingen eller forebyggingen av sykdommer relatert til overdreven leukocyttmigrering og aktivering, eller sykdommer med behov for en økt vaskularisering, omfatter kombineringen av disse antagonistene av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Antagonistene, DNA molekylene og vertscellene i følge oppfinnelsen kan anvendes til fremstilling av farmasøytiske midler anvendelig ved behandling eller forebygging av enhver av de ovenfor nevnte sykdommene ved administrering av en effektiv mengde av en antagonist av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner ifølge den foreliggende oppfinnelse.

De farmasøytiske preparatene kan i tillegg til antagonisten av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner, omfatte egnede farmasøytisk akseptable bærere, biologisk kompatible vesikler og additiver som er egnet for administrering til et dyr (f.eks. fysiologisk saltvann) og som eventuelt omfatter hjelpestoffer (slik som eksipienter, stabilisatorer, adjuvanser eller fortynningsmidler) som letter bearbeidingen av de aktive forbindelsene til preparater som kan anvendes farmasøytisk. Slike preparater kan eventuelt kombineres med andre terapeutiske preparater som viser synergisk eller på en koordinert måte med CXCR3-bindende CXC-kjemokinantagonistene ifølge oppfinnelsen. F.eks. har lignende synergistiske egenskaper til CXC- kjemokinantagonister blitt demonstrert i kombinasjon med syklosporin (WO 00/16796). Alternativt kan det andre preparatet være basert med en forbindelse som er kjent for å være terapeutisk aktiv mot den spesifikke sykdom (f.eks. IFN-beta for multippel sklerose, løselige TNF-reseptorer for reumatoid artritt).

De farmasøytiske preparatene kan formuleres på en hvilken som helst måte for å møte behovene til administreringsmåten. F.eks. er anvendelsen av biomaterialer og andre polymerer for medikamentlevering, så vel som ulike teknikker og modeller for å validere en spesifikk administreringsmåte beskrevet i litteraturen (Luo B og Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al, 2001).

En "effektiv mengde" henviser til en mengde av de aktive ingrediensene som er tilstrekkelig for å påvirke forløpet og alvorlighetsgraden til sykdommen, medfører reduksjonen eller ettergivelsen av slik patologi. Den effektive mengden vil avhenge av administreringsruten og tilstanden til pasienten.

"Farmasøytisk akseptabel" er ment å omfatte enhver bærer som ikke påvirker effekten av den biologiske aktiviteten til den aktive ingrediensen og som ikke er toksisk for verten som den skal administreres til. F.eks. kan de ovenfor nevnte aktive ingrediensene formuleres i enhetsdoseringsform for parenteral administrering ved injeksjon i vesikler slik som saltvann, dekstroseløsning, serumalbumin og Ringers løsning. Bærere kan også velges fra stivelse, cellulose, talkum, glukose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kalk, silikagel, magnesiumstearat, natriumstearat, glyserolmonostearat, natriumklorid, tørket skummet melk, glyserol, propylenglykol, vann, etanol og ulike oljer, inkludert de av petroleum-, dyre-, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse (peanøttolje, soyabønneolje, mineralolje, sesamolje).

Enhver akseptert administreringsmåte kan anvendes og bestemmes av fagmannen på området for å etablere de ønskede blodnivåer av de aktive ingrediensene. F.eks. kan administrering skje gjennom ulike parenterale ruter slik som subkutane, intravenøse, intradermale, intramuskulære, intraperetoneale, intranasale, transdermale, rektale, orale eller bukale ruter. De farmasøytiske preparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også administreres i forsinkede eller kontrollerte frigjøringsdoseringsformer, inkludert depotinjeksjoner, osmotiske pumper og lignende for forlenget administrering av polypeptidet ved en på forhånd bestemt hastighet, fortrinnsvis i enhetsdoseringsformer egnet for enkel administrering av presise doser.

Parenteral administrering kan skje gjennom bolusinjeksjon eller ved gradvis perfusjon over tid. Preparater for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner som kan inneholde hjelpemidler eller eksipienter som er kjent i teknikkens stand og kan fremstilles ifølge rutinemetoder. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene som passende oljeinjeksjonssuspensjoner administreres. Egnede lipofile løsningsmidler eller vesikler inkluderer fettaktige oljer, f.eks. sesamolje eller syntetiske fettsyreestere, f.eks. etyloleat eller triglyserider. Vandige injeksjonssuspensjoner som kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen inkluderer f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde stabiliserende midler. Farmasøytiske preparater inkluderer egnede løsninger for administrering ved injeksjon og inneholder fra omtrent 0,01-99,99 %, fortrinnsvis fra omtrent 20-75 % av aktiv forbindelse sammen med eksipienten. Preparater som kan administreres rektalt inkluderer stikkpiller.

Det skal forstås at den administrerte dosen vil avhenge av alderen, kjønnet, helsen og vekten til mottakeren, type løpende behandling om noen, behandlingsfrekvens og den ønskede effektens natur. Dosen vil være tilpasset til det individuelle individ, som forståelig kan bestemmes av fagmannen på området. Den totale krevde dosen for hver behandling kan administreres ved flere doser eller i én enkelt dose. Det farmasøytiske preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres alene eller sammen med andre terapeutiske midler rettet mot tilstanden, eller rettet mot andre symptomer ved tilstanden. En vanlig daglig dose av aktiv ingrediens er mellom 0,01-1000 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Vanligvis gis 1-40 mg/kg/dag i delte doser eller i forsinket frigjøringsform for effektivt å oppnå de ønskede resultater. Andre og påfølgende administreringer kan utføres ved en dose, som er lik, mindre enn eller større enn den initiale og tidligere administrerte dose til individet.

Den foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet med henvisning til de spesifikke utførelsesformer men innholdet av beskrivelsen omfatter alle modifikasjoner og substitusjoner utført av fagmannen på området uten å avvike fra betydningen og formålene ved kravene.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet gjennom de følgende eksempler som ikke skal tolkes på noen måte begrensende for den foreliggende oppfinnelse. Eksemplene vil henvise til figurene spesifisert nedenfor.

EKSEMPLER

Eksempel 1: In vitro-karakterisering av de heparinbindende egenskapene til CXCLll-mutanter

Materialer og fremgangsmåter

Ekspresjon avhumane CXCLll- mutanter.

Humane CXCL 11-mutanter ble dannet ved hjelp av in vitro-PCR-mutagenese av DNA-sekvensen som koder for human CXCL11 (I-TAC; SWISSPROT Acc. nr. 014625), og spesielt for den modne formen svarende til segmentet 22-94 av forløpermolekylet, inneholdende 73 aminosyrer (CXCL11-VT; fig. 1; SEKV. ID nr. 1).

Samlingen av punktmutasjoner assosiert med hvert mutein (CXCL11-1B3, SEKV. ID nr. 2; CXCL11-2B3, SEKV. ID nr. 3; CXCL11-3B3, SEKV. ID nr. 4; CXCL11-4B4, SEKV. ID nr. 5; fig. IA) ble introdusert i den kodende sekvensen til CXCL11-VT ved anvendelse av én eller to PCR-trinn på 25 sykluser ("proof reading Pwo DNA-polymerase"; Boehringer-Mannheim). Templaten var et plasmid basert på den kommersielle vektoren pET-24d (Novagen) hvori sekvensen til modent humant CXCL11 uttrykkes som et fusjonsprotein med en aminoterminal ende (MKKKWP) etterfulgt av et kaspase-8-kløyvesete (LETD). De resulterende 0,3 Kb DNA-fragmentene oppnådd ved hjelp av PCR ble fordøyd med BspHI og Xhol og igjen klonet inn i et tomt pET-24d-plasmid mellom Xhol og Ncol-setene. CXCL11-VT og alle muteinene mangler startkodonet for metionin i den modne formen og kan fremstilles som proteiner inneholdende 73 rester uten noen andre ytterligere rester siden den aminoterminale enden elimineres ved anvendelse av kaspase-8-endoproteolyttisk fordøying.

CXCL 11-VT og muteinene ble uttrykt og testet ifølge kjente fremgangsmåter ("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 138, Humana Press, 2000). Alle konstruktene ble oppnådd og kontrollert ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker (PCR-mutagenese og amplifisering, DNA-sekvensering, restriksjonsfordøying) og deretter opprettholdt i TG 1-stammen av E. coli i løpet av kloningsprosessen. De kodende sekvensene ble valgt for en optimal kodonbruk for ekspresjon i E. coli (Kane JF et al., 1995).

De pET-24d-baserte plasmidene kodende for CXCL-11-VT eller én av dets mutanter ble overført i BL21 (DE3) pLysS-kompetente E. co//-celler, hvori proteinekspresjon ble indusert ved tilsetting av 1 mM isopropyl-P-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) til kulturen. Celler ble høstet 3,5 timer etter induksjon og igjen suspendert i lysbuffer (50 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM MgCb, 5 mM benzamidin/HCl, 1 mM DTT, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) Dnase 20 mg/l). Celler ble nedbrutt gjennom tre passasjer gjennom "French Pressure Cell unit". Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved lOOOOx g i 60 min. ved 4°C. Inklusjonslegemepelletten inneholdende CXCL-VT eller én av dets mutanter ble løst (ved en konsentrasjon lavere enn 1 mg/ml) i 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, inneholdende 6 M guanidin/HCl og 1 mM DTT, og rørt i 30 min. ved 60°C. Proteinene ble renaturert ved dråpevis fortynning i et volum 10 ganger den til guanidinløsningen på 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0 inneholdende 0,01 mM oksidert glutation og 0,1 mM redusert glutation. Løsningen ble rørt over natt ved 4°C. Deretter ble pH justert til 4,5 med eddiksyre og ledningsevnen senket til 20 milliSiemens ved fortynning med vann. Løsningen ble påført til en kationbytterkolonne (SP-sefarose) tidligere ekvilibrert i 50 mM natriumacetat (pH 4,5) og protein ble eluert med en lineær gradient fra 0-2 M NaCl i den samme bufferen. Fraksjonene inneholdende proteinet av interesse ble samlet og dialysert mot tre endringer i 1 % eddiksyre. Uløselig materiale ble fjernet ved hjelp av sentrifugering ved lOOOOx g i 30 min. og supernatanten ble lyofilisert.

Den aminoterminale ledersekvensen kjent for CXCL11-VT og alle muteinene (MKKKWPLETD) ble kløyvet med kaspase-8 ved anvendelse av den følgende prosedyren. De lyofiliserte proteinene ble løst i 15-20 ml H2O og påført PD-10-kolonner som tidligere var ekvilibrert med kaspase-8-kløyvebuffer (15 % glyserol, 150 mM NaCl, 25 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA). Etter inkuberingen av proteinene med det proteolytiske enzymet (1:100, enzym: substrat, vekt/vekt) i 4-5 timer ved romtemperatur ble pH i kløyveløsningen justert til 4,5 og ledningsevnen senket til 1-2 milliSiemens ved fortynning med 6 M urea (reaksjonen ble repetert to eller tre ganger om nødvendig). De kløyvede proteinene ble separert fra ukløyvet protein ved hjelp av kationbyttekromatografi på en SP-sefarosekolonne tidligere ekvilibrert i 50 mM natriumacetat (pH 4,5) inneholdende 6 M urea, og proteiner ble eluert med en NaCl-gradient fra 0-2 molar i den samme bufferen. De kløyvde fraksjonene ble samlet og dialysert mot tre endringer av 1 % eddiksyre, lyofilisert, løst i 0,1 % trifluoreddiksyre og endelig lyofilisert igjen for langtids lagring.

Identiteten til alle proteinene uttrykt på denne måten ble bekreftet ved hjelp av massespektrometri og renheten ved hjelp av høytrykksvæskekromatografi (HPLC).

Konstruksjon av cellelinjer som stabilt uttrykker humant CXCR3.

Humant CXCR3 ble klonet fra totalt RNA ekstrahert fra reumatoide artritt synoviumisolerte leukocytter ved hjelp av revers transkripsjonspolymerasekjede-reaksjon (RT-PCR) ved anvendelse av primere basert på den humane CXCR3-mRNA-sekvensen som dekker hele den kodende sekvensen (Genbank nr. X95876; nukleotid fra 69-1175). Alle reagensene for RT-PCR-reaksjonene var kommersielt tilgjengelige (Trizol™ og Superscript™ fra Life Technologies;oligodT]5fra Promega) og ble anvendt i henhold til forhandlerens instruksjoner. Det resulterende 1,1 kb PCR-produktet ble igjen klonet inn i pattedyrcelleekspresjonsvektoren pCDNA3.1zeo (Invitrogen) for å danne pZeo-CXCR3.

Humane HEK293/EBNA- og Ll,2-celler ble transfektert med renset plasmid-DNA for pZeo-CXCR3 ved hjelp av kalsiumfosfatpresipitering ved anvendelse av et kalsiumfosfattransfeksjonssett (Life Technologies) og positive kloner ble utvalgt ved anvendelse av Zeocin (Invitrogen) i henhold til forhandlerens protokoll. Ekspresjonen av CXCR3 ble bekreftet ved hjelp av FACS (fluorescensaktivert cellesortering)-analyse av individuelle kloner ved anvendelse av et kommersielt monoklonaltantistoff mot humant CXCR3 merket med et FITC-fluorofor (R&D systems; kat.nr. MAB160), og ved hjelp av et radioligandlikevektsbindingsassay (se nedenfor).

Kromatografiske assay av CXCL 11- VT og dets mutanter

CXCL 11-VT eller hver av dets mutanter ble fylt på enten en heparin-sefarosekolonne (ved anvendelse av 50 mikrogram protein) eller en SP-sefarose kationbyttekolonne (ved anvendelse av 50 mikrogram protein). I begge tilfellene ble kolonnen ekvilibrert i 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 og 50 mM NaCl og proteinet ble eluert med en lineær gradient på 0-2 M NaCl i den samme bufferen.

Heparinbindingsassay av CXCL 11- VT og dets mutanter.

Serie fortynninger av CXCL11-VT eller av dets mutanter i fosfatbufret

saltoppløsning (PBS) som dekker området 0,02-30 u,M, ble inkubert med 2,5 ug/ml [<3>H]-heparin i 1 time ved 37°C. Triplikater av 20 \ i\ av hver prøve ble overført til en 96 brønners P81 Unifilterplate (Whatman Inc.) tilpasset med et cellulosefosfatfilter. Platen ble vasket tre ganger med 200 \ il PBS ved anvendelse av en vakuumpumpe for å fjerne ubundet merket heparin. Scintillasjonsvæsken (50 \\ X) ble tilsatt til hver brønn og radioaktivitet telt (1 min./brønn) i en beta-teller. Data ble analysert ved anvendelse av Prism® programvare (GraphPad).

Likevekstkonkurransereseptorbindingsanalyse

Analysen ble utført på membraner fra HEK-celler som stabilt uttrykker CXCR3 ved anvendelse av en scintillasjonstilnærmingsanalyse (Scintillation Proximity Assay, SPA), med [<125>I]-CXCL11 som spor. Radiomerket CXCL11 (rekombinant humant I-TAC; Peprotech) ble dannet og testet i henhold til [<I25>I]-leverandøren (Amersham; spesifikk aktivitet på 2200 mCi/mol), også for å sjekke etter CXCR3-uttrykkende HEK ogLl,2-kloner som positivt farges i løpet av FACS-analysen.

Konkurrenter ble fremstilt gjennom seriefortynninger (som strekker seg fra IO"<6>til IO"<12>M) av det umerkede CXCL11 eller én av dets mutanter, i bindingsbufferen (50 mM HEPES pH 7,2, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl og 0,5 % bovint serumalbumin). Hvetefrø-SPA-kuler (Amersham) ble løst i PBS til 50 mg/ml og fortynnet i bindingsbufferen til 10 mg/ml og den endelige konsentrasjonen i analysen var 0,25 mg/brønn. Cellemembraner som uttrykker CXCR3 ble lagret ved -80°C og fortynnet i bindingsbufferen til 20 u,g/ml. Like volumer membran og kuleløsning ble blandet før utføring av analysen for å redusere bakgrunn. Den endelige membrankonsentrasjonen var 5 u,g/brønn og konsentrasjonen av [<I25>I]-CXCL11 var 0,05 nM. Platene ble inkubert ved romtemperatur med røring i 4 timer. Radioaktivitet ble talt (1 min./brønn) i en betateller. Data fra triplikatprøver ble analysert ved anvendelse av Prism® programvare (GraphPad).

Resultater

Humant CXCL11 ble uttrykt i fire muterte former for å identifisere sekvensen og egenskapene til ikke-heparinbindende varianter. Målet for mutasjonene var fire samlinger av basiske rester, og i det minste én basisk rest konservert i alle CXCR3-bindende kjemokiner var inkludert i hvert mutein (fig. 1).

Den modne formen av humant CXCL11 (CXCL11-VT) og de korresponderende fire muteinene ble uttrykt iE. coli (fig. IA). Et første mutein, CXCL11-1B3, inneholder tre alanin-substitusjoner som eliminerer en basisk samling ved aminoterminal ende til CXCL11-VT (lysin 5, arginin 6 og lysin 8). Et andre mutein (CXCL11-2B3) inneholder tre alaninsubstitusjoner som eliminerer en basisk samling som omgir rest 50 i CXCL11-VT (lysin 46, lysin 49 og arginin 52). Et tredje mutein (CXCL11-3B3) inneholder tre alanin-substitusjoner som eliminerer en basisk samling rundt rest 60 i CXCL11-VT (lysin 57, lysin 59 og arginin 62). Endelig inneholder et fjerde mutein (CXCL11-4B4) fire alaninsubstitusjoner som eliminerer en basisk samling rundt rest 70 i CXCL11-VT (lysin 66, lysin 67, arginin 70 og lysin 71).

Virkningene av substitusjonene på CXCL11-VT-muteinegenskapene ble først testet ved hjelp av heparin- og kationbyttekromatografi. Sammenligning av elueringsprofilene på slikt kromatografisk medium tilveiebringer en kvalitativ indikasjon på bidraget til ikke-spesifikke elektrostatiske interaksjoner som følge av basiske aminosyrer til heparinbindingsegenskaper (Proudfoot A et al., 2001). Som vist i tabell III beregnes forskjellen i elueringskonsentrasjon av NaCl mellom CXCL11-VT og hvert mutein på kationbytte (MonoS)-kolonne og på heparin-kolonne. Verdiene oppnådd som MonoS-kolonne trekkes så fra den oppnådd for heparinkolonner. Dersom de resulterende verdiene er positive indikerer dette at muteinrestene bidrar til interaksjonen med heparin. Fra denne analysen synes det som at restene mutert i CXCL11-1B3 ikke bidrar til bindingen til heparin, mens de mutert i CXCL11-2B3, CXCL11-3B3 og CXCL11-4B4 er involvert i den spesifikke gjenkjenningen av GAG'er.

Et direkte mål på binding til heparin ble deretter utført ved anvendelse av tritert heparin og serieforsynninger av de rekombinante CXCL11-VT-mutantene (fig. 2). De resulterende radiomerkede kompleksene ble separert fra ubundet [<3>H]-heparin ved å bringe reaksjonen i kontakt med cellulosefosfatfiltere som effektivt kan bibeholde proteiner og derfor tillater en direkte evaluering av mengden bundet heparin. Denne analysen viser at CXCL11-1B3 har heparinbindende egenskaper som ligner de til CXCL 11-VT, mens de andre mutantene viser reduserte heparinbindingsegenskaper (opptil 50 % mindre bundet heparin) som bekrefter de oppnådde resultatene ved anvendelse av kromatografiske analyser (tabell III). Disse bevisene er av spesiell interesse fordi de muterte basiske samlingene i CXCL11-1B3 er arrangert som et motiv (BBXB) som er mye likere andre kjente heparinbindende motiver slik som RANTES (Proudfoot A et al, 2001), som bekrefter observasjonen om den bemerkelsesverdige strukturelle diversiteten og dårlige forutsigbarheten til GAG-bindingsseter i kjemokiner (Lortat-Jacob H et al, 2002).

En likevektskonkurrerende reseptorbindingsanalyse ble til slutt utført for å sammenligne egenskapene til muteinene med hensyn til bindingen av den spesifikke CXCR3-re sep toren (fig. 3). Prøver inneholdende en konstant mengde radiomerket kommersielt CXCL11 ble blandet med seriefortynninger av CXCL 11-VT, eller én av muteinene og deretter inkubert med membraner fremstilt fra CXCR-uttrykkende HEK-celler. Mens de heparinbindende muteinene CXCL11-1B3 viser en reduksjon på mer enn en to gangers størrelsesorden (endres fra under nanomolar til under mikromolar) i affiniteten for CXCR3 viser de andre muteinene kun et begrenset fall i affinitet for CXCR3 som forblir i nanomolarområdet (reduksjon i størrelsesorden én eller mindre). Affiniteten for reseptoren er derfor vesentlig bibeholdt i heparinbindingsdefekte CXCL 11-VT karboksyterminalmutanter mens mutasjoner i aminoterminalen påvirker spesielt reseptorbinding, et trekk som klart er distinkt.

Eksempel 2: Cellebasert analyse for karakteriseringen av heparinbindingsdefekte CXCLll-muteiner

Materialer og metoder

Kiemotakseanalyse

Analysen ble utført ved anvendelse av pre-B-lymfomcellelinjen (Ll,2-celler), transfektert med et plasmid som tillater ekspresjonen av CXCR3 i disse cellene og 96-brønners mikroplater (ChemoTX system, Neuroprobe).

CXCR3-uttrykkende Ll,2-celler (se beskrivelsen ovenfor) ble dyrket i RPMI-1640 mediet inneholdende 5 % inaktivert føtalt kalveserum (FCS), L-glutamin, 25 mM HEPES, 0,05 mM B-merkaptoetanol og 0,8 mg/ml Geneticin G-418. Dagen før analysen ble 5 mM n-butyrsyre tilført kulturmediet. Cellene ble samlet ved hjelp av sentrifugering ved 600x g ved romtemperatur og igjen suspendert ved en konsentrasjon på 1 x 10<6>/ml i RPMI 1640-mediet inneholdende 5 % inaktivert FCS uten fenolrødt. Reseptorekspresjonen ble undersøkt ved hjelp av FACS-analyse ved anvendelse av et anti-CXCR3-antistoff merket med en FITC-fluorofor som beskrevet ovenfor.

De rekombinante CXCL 11-muteinene ble seriefortynnet (i området fra IO"<6>til IO"12 M) i 30 \ il RPMI-mediet uten fenolrødt og overført til de lavere brønnene og et filter (8 u,m porestørrelse) ble plassert over disse for å forsikre at det ikke var noen fangede luftbobler før systemet ble forseglet. CXCR3-uttrykkende Ll,2-celler (25 \ il av en cellesuspensjon ved 2,5 x IO<4>celler/ml i det samme mediet) ble plassert i de øvre brønnene. Kammeret ble inkubert i 4 timer ved 37°C under 5 % CO2. Cellesuspensjonen ble deretter fjernet fra de øvre brønnene og filteret ble fjernet. Cellene i de lavere brønnene ble overført til en svart 96-brønners plate og fyst i det minst i 1 time ved -80°C. Platen ble tint og 200^l/brønn av en CyQUANT farge/cellelysebufferblanding (Molecular Probes) ble tilsatt for å telle opp antallet celler som hadde migrert. Fluorescensen ble telt med en Victor2 Wallac plateleser. Dataene ble analysert ved anvendelse av Prism®-programvare (GraphPad).

Resultater

Egenskapene til CXCLll-VT-muteinene ble testet ved å anvende en cellebasert analyse. De oppnådde resultatene i en kjemotakseanalyse i Ll,2-celler modifisert slik at de uttrykker CXCR3 svarer godt til de oppnådd i reseptorbindingsanalysen beskrevet ovenfor. I henhold til dets lave affinitet for CXCR3 var CXCL11-1B3-mutant ikke i stand til å rekruttere L1,2/CXCR3-uttrykkende celler (fig. 4). De andre tre mutantene var mindre aktive enn CXCL11-VT, men var fortsatt i stand til å fremkalle en målbar respons i denne chemotakseanalysen.

Eksempel 3: dyrebasert analyse for karakteriseringen av heparinbindingsdefekte CXCLll-muteiner

Materialer og metoder

Peritoneal cellulær rekruttering

Balb/C-hunnmus på 8-12 uker ble sensibilisert på dag 0. Alle musene mottok 5 subkutane injeksjoner (4 x 50 ul i hvert lem og 1 x 100 ul i nakkeskinnet) på 10 nM CpG-ODN (Microsynth) blandet med 100 u,g Ovalbumin (Sigma, Grade V) i sterilt PBS. Etter en uke ble cellulær rekruttering indusert i Balb/C-musen gjennom intraperetoneal injeksjon av 10 u,g (0,5 mg/kg) rekombinant CXCL 11-protein fortynnet i 0,2 ml steril, lipopolysakkaridfri saltoppløsning (0,9 %). Når egenskapene til CXCL11-mutantene ble testet ble de angitte mengdene protein, fortynnet i 0,2 ml av den samme sterile løsningen, administrert 30 min. forut for agonistadministreringen. Mus ble ofret ved lufttilført CO24 timer senere og peritoneal skylling ble utført med 5 ml PBS tre ganger. Skyllingene ble samlet og sentrifugert ved 1500x g i 5 min. og de pelleterte cellene ble igjen suspendert i et endelig volum på 1 ml. Det totale antallet fremkalte leukocyttene for hver prøve ble telt med et hemacytometer.

Forsinket kontakttype sensitivitetsanalyse

Museøresvellingstesten for å måle kontakttypesensitivitet ble utført som beskrevet (Garrigue JL et al, 1994). Kort fortalt ble mus på forhånd sensibilisert topisk ved å påføre 25 ul 0,5 % 2,4-dinitrofluorbenzen (DNFB; Sigma Chemical Co.)-løsning i aceton/olivenolje (4:1) på den barberte buken. Fem dager senere ble 20 ul 0,2 % DNFB i den samme vesikkelen påført på det høyre øret og vesikkelen alene på det venstre øret. Mus ble behandlet daglig fra dag 5 til dag 9 med en intrapitoneal administrering av enten 0,5 mg/kg CXCL11-3B3 eller kun vesikkel i kontrollgruppen. Den første behandlingen ble administrert 1 time forut for DNFB-utfordringen. Øretykkelse ble målt med et tykkelsesgradert måleinstrument (Mitutoyo Corp.), og øresvelling ble estimert ved å trekke fra verdien før utfordring fra verdien etter utfordring, og ved ytterligere å trekke fra enhver svelling påvist i det vesikkelutfordrede kontralatereale øret.

Resultater

Ytterligere bevis for in vivo-egenskapene til CXCL11-VT-muteinet ble oppnådd ved å anvende de to dyremodellene.

En første analyse var en peritoneal cellulær rekrutteringsanalyse (fig. 5). Siden CXCR3 uttrykkes på aktiverte Th 1-celler ble mus sensibilisert forut for analysen med CpG-ODN for å indusere en Th 1-respons. I henhold til dets dårlige aktivitet som CXCR3-bindingsprotein og dets manglende evne til å rekruttere celler in vitro var CXCL11-1B3-mutanten ikke i stand til å rekruttere celler in vivo når denne ble administrert inn i peritoneum. Både CXCL11-2B3 og CXCL11-4B4 viste svak aktivitet, mens CXCL11-3B3 var ikke i stand til å fremkalle rekruttering (fig. 5).

Sistnevnte mutants evne til å hemme CXCL11-VT in vivo ble deretter testet (fig. 6). CXCL11-3B3 viser ingen rekrutteringsegenskaper i seg selv, men betraktelig antagonistiske aktiviteter over CXCL11-VT med hensyn til cellulær rekrutteringsinduksjon i peritoneum, når det ble administrert før ved den samme dosen (10 u,g/mus). Opphevelsen av heparinbinding i CXCL11 produserer derfor en antagonist som er i stand til å hemme den cellulære rekrutteringen indusert av CXCL 11 in vivo.

Egenskapene til CXCL11-3B3 ble endelig testet i en hudinflammasjonsmodell, den forsinkede kontakthypersensitivitetsanalysen. Denne haptenspesifikke hudinflammasjonen medieres av T-celler og genererer en målbar svelling etter at mus blir utfordret med kontaktsensibilisatoren 2,4-dinitrofluorbenzen (DNFB) som hapten. Den induserte svellingen var signifikant lavere i mus behandlet med en intraperitoneal administrering av CXCL11-3B3 sammenlignet med den effekten som var observert i mus behandlet med vesikkel alene, gjennom behandlingsperioden (fig. 7).

Gitt de oppnådde resultatene i eksemplene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan nye antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner fremstilles på basis av funnene i denne patentsøknaden, spesielt heparinbindende defekte mutanter av human CXCL11, human CXCL 10 og human CXCL9 inneholdende enkle eller flere substitusjoner av de konserverte basiske aminosyrene i den karboksyterminale enden og eventuelt av andre basiske rester konservert i én eller flere spesifikke CXCR3-bindende CXC-kjemokiner og/eller én eller flere basiske rester rundt disse.

Egenskapene til alternative molekyler beskrevet i den foreliggende søknad kan testes ved hjelp av enhver kjent fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, eller ved å anvende andre kjente valideringstilnærminger, som f.eks. omtalt i litteraturen ("Chemokine Protocols", Methods in Moleculra Biology vol. 138, Humana Press, 2000; "Chemokine Resceptors", Methods in Enzymology vol. 288, Academic Press, 1997).

REFERANSER

Agostini C, et al. J Immunol, 161:6413-6420, .1998.

Ali S et al., Biochem J , 358:737-745, 2001.

Baggiolini M et al., Annu Rev Immunol, 15:675-705,1997.

Baggiolini M, J Intern Med, 250: 91-104,2001.

Brown A et al., J Pept Sei, 2:40-46,1996.

Cleland JL et al., Curr Opin Biotechnol, 12: 212-9,2001.

Cole K, et al. J Exp Med, 187:2009-2021,1998.

Cole A, et al. J Immunol, 167:623 -627,2001.

Dougherty DA, Curr Opin Chem Biol, 4:645-52, 2000.

Femandez EJ and Lolis E, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 42:469-499,2002.

Flier J et al., J Pathol, 194: 398^05,2001.

Frigerio S et al., Nat Med, 8:1414-20, 2002.

Garrigue JL et al., Contact Dermatitis, 30: 231-237,1994.

Golebiowski A et al., Curr Opin Drug Discov Devel, 4:428-34,2001.

Haskell CA et al., Curr Opin Invest Drugs, 3 399^*55, 2002.

Hoogewerf AJ et al., Biochemistry, 36:13570-13578,1997.

Hruby VJ and Balse PM, Curr Med Chem, 7: 945-970, 2000.

Kane JF, Curr Opin Biotechnol, 6:494-500,1995.

Kao J et al., Circulation, 107:1958-61,2003.

Kuschert G et al., Biochemistry, 38:12959-12968,1999.

Lambeir A, et al. J Biol Chem, 276:29839-29845,2001.

Lane BR et al., Wology, 307:122-34,2003.

Loetscher P and Clark-Lewis I, J Leukoc Biol, 69: 881 -884,2001.

Lortat-Jacob H et al.. Proe Nati Acad Sei U S A, 99:1229-1234,2002.

Lu B, et al., Eur J Immunol, 29: 3804-3812,1999.

Luo B and Prestwich GD, Exp Opin Ther Patents, 11:1395-1410,2001.

Luster A et al., J Exp Med, 182:219-231,1995.

Mach F et ai., J Clin invest 104:1041 -1050,1999.

Meyer M, et al. Eur J Immunol, 31: 2521-2527,2001.

Murphy LR et al., Protein Eng, 13: 149-52,2000.

Nilsson J et al., Protein Expr Purif, 11:1-16,1997.

Patel D et al., Clin Immunol, 99:43-52,2001.

Pillai O and Panchagnula R, Cur Opin Chem Biol, 5:447-451,2001

Proudfoot A, et al. Immunol Rev, 177:246-256,2000.

Proudfoot A, et al. J Biol Chem 276:10620-10626,2001.

Robledo MM et al., J Biol Chem, 276:45098-105,2001.

Rogov Sl and Nekrasov AN, Protein Eng, 14:459-463,2001.

Romagnani P et al., J Am Soc Nephrol, 10: 2518-2526,1999.

Romagnani P et al., J Clin Invest, 107: 53-63,2001.

Romagnani P et al., Am J Pathol, 161: 195-206,2002.

Sasaki S et al., Eur J Immunol, 32:3197-205,2002

Sauty A, et al. J Immunol, 162: 3549-3558,1999.

Sauty A, et al. J Immunol, 167:7084-7093,2001.

Sawyer TK, in "Structure Based Drug Design", edited by Veerapandian P, Marcel

Dekker Inc., pg. 557-663,1997.

Schwarz MK and Wells TN, Curr Opin Chem Biol, 3: 407-417,1999.

Sorensen T et al., J Clin Invest, 103: 807-815,1999.

Trentin L et al., J Clin Invest, 104:115-121, 1999.

Villain M et al., Chem Biol, 8: 673-679,2001.

Claims (28)

1. Antagonister av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner bestående av mutanter av CXCL11, CXCL 10 eller CXCL9 hvori i det minste én av de basiske restene, nummerert som sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 46, 62, 66 og 70.

2. Antagonister ifølge krav 1, hvori CXCR3-bindende CXC-kjemokin er humant CXCL11 og i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1) i tillegg er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 49, 52, 57, 59, 67 eller 71.

3. Antagonister ifølge krav 2, hvori én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1) er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: a) 46, sammen med 49 og/eller 52; b) 62, sammen med 57 og/eller 59; c) 66 og 70, sammen med 67 og/eller 71; eller d) 62 og 66, sammen med én eller flere av de følgende: 57, 59, 67, 70 eller 71.

4. Antagonister ifølge kravene 2 eller 3, hvori i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), i tillegg er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 5, 6, 8, 17, 20, 26 eller 38.

5. Antagonister ifølge krav 1, hvori CXCR3-bindende CXC-kjemokin er humant CXCL10 og i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert i forhold til sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), i tillegg er substituert til alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre og asparagin: 47, 48, 51, 52, 59, 74 eller 75.

6. Antagonister ifølge krav 5, hvori én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 46 og 52, sammen med 47, 48 eller 51; b) 59 og 62; c) 66 og 70, sammen med 74 og/eller 75; eller d) 62 og 66, sammen med 59 og/eller 70.

7. Antagonister ifølge krav 5 eller 6, hvori i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 8, 22, 26 eller 38.

8. Antagonister ifølge krav 1, hvori CXCR3-bindende CXC-kjemokiner er humant CXCL9 og basisk rest 67, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin.

9. Antagonister ifølge krav 8, hvori én av de følgende kombinasjoner av basiske rester, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: a) 62, sammen med 66 og/eller 67; b) 66 og 67; eller c) 66 og 70, sammen med én eller flere av de følgende: 67, 74 eller 75.

10. Antagonister ifølge et av kravene 8 eller 9, hvori i det minste én av de følgende basiske restene, nummerert ifølge sekvensen til humant modent CXCL11, som vist i Figur IB (SEQ ID No. 1), ytterligere er substituert med alanin, glysin, serin, treonin, prolin, glutaminsyre, glutamin, aspartinsyre eller asparagin: 5, 6, 8, 25, 28 eller 38.

11. Antagonister ifølge krav 1-10, hvori de basiske restene er substituert med alanin eller glysin.

12. Antagonister ifølge krav 11, hvori nevnte antagonister har sekvensen CXCL11-2B3 (SEKV. ID nr. 3), CXCL11-3B3 (SEKV. ID nr. 4), eller CXCL11-4B4 (SEKV. ID nr. 5).

13. Antagonister ifølge krav 1-12, hvori én eller flere av de aminosyrer som er tilført, deletert eller substituert tilhører de første ni aminosyrene i det aminoterminale domenet til humant modent CXCR3-bindende CXC-kjemokin.

14. Antagonister ifølge krav 1-13, hvori én eller flere aminosyrer er mutert for å redusere aggregeringsegenskapene til nevnte antagonist.

15. Antagonist av CXCR3-bindende CXC-kjemokin omfattende antagonistene ifølge krav 1-14, og en aminosyresekvens som tilhører en proteinsekvens som er forskjellig fra det korresponderende CXCR3-bindende CXC-kjemokin.

16. Antagonister ifølge krav 15, omfattende en aminosyresekvens tilhørende én eller flere av proteinsekvensene: ekstracellulære domener av membranbundet protein, immunoglobulinkonstant region, multimeriseringsdomener, ekstracellulære proteiner, signalpeptidinneholdende proteiner, eksportsignalinneholdende proteiner.

17. Antagonister ifølge krav 1-16, hvori nevnte antagonist er i form av aktivt konjugat eller kompleks med et molekyl valgt blant radioaktive merker, biotin, fluorescensmerker, cytotoksiske midler eller medikamentleveringsmidler.

18. DNA-molekyler omfattende DNA-sekvensene kodende for antagonistene ifølge krav 1-16.

19. Ekspresjonsvektorer omfattende DNA-molekylene ifølge krav 18.

20. Vertscelle transformert med en vektor ifølge krav 19, hvori vertscellen ikke er en human embryocelle.

21. Anvendelse av antagonisten ifølge krav 1-17, av DNA ifølge krav 18 eller 19 eller av cellene ifølge krav 20, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandlingen eller forebyggingen av sykdommer relatert til overdreven leukocyttmigrering og aktivering.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvori sykdommen er en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom eller en infeksjon.

23. Anvendelse ifølge krav 22, hvori sykdommen er multippel sklerose, reumatoid artritt, HIV-1-infeksjon, type 1-diabetes eller transplantatavstøtning.

24. Anvendelse av antagonister ifølge krav 1-17, av DNA ifølge krav 18 eller 19, eller av cellene ifølge krav 20, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandlingen eller forebyggingen av sykdommer der det er et behov for en økt vaskularisering.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvori sykdommen er iskemisk hjertesykdom.

26. Anvendelse av antagonister ifølge krav 1-17, DNA ifølge krav 18 eller 19, eller av cellene ifølge krav 20, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandlingen eller forebyggingen av kreft.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av antagonister ifølge krav 1-14, omfattende å dyrke de transformerte cellene ifølge krav 20, og samle de uttrykte proteinene.

28. Farmasøytisk preparat inneholdende en antagonist av CXCR3-bindende CXC-kjemokiner ifølge krav 1-17, DNA ifølge krav 18 eller 19, eller cellene ifølge krav 20, som aktiv ingrediens.