PT1515990E - Antagonistas de quimiocinas cxc de ligação ao cxcr3 - Google Patents

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Marie Kosco-Vilbois
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Description

1
DESCRIÇÃO "ANTAGONISTAS DAS QUIMIOCINAS CXC DE LIGAÇÃO AO CXCR3" A invenção relaciona-se com a estrutura e as propriedades de antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 e em particular da CXCL11 humana.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As quimiocinas são proteínas pró-inflamatórias segregadas de pequenas dimensões (70-130 aminoácidos) envolvidas principalmente na migração direccional e activação de células, especialmente na extravasação de leucócitos do sangue para locais no tecido que necessitam do recrutamento destas células (Baggiolini M et al., 1997; Fernandez EJ e Lolis E, 2002) .
Dependendo do número e da posição das cisteínas conservadas na sequência, as quimiocinas são classificadas em quimiocinas C, CC, CXC e CX3C. Um conjunto de receptores da membrana celular, todos eles receptores acoplados à proteína G hepta-helicoidal, são os parceiros de ligação que permitem que as quimiocinas exerçam a sua actividade biológica nas células alvo, as quais apresentam combinações específicas de receptores dependendo do seu estado e/ou tipo. Os efeitos fisiológicos das quimiocinas resultam de um sistema complexo e integrado de interacções concorrentes: os receptores possuem frequentemente especificidades de ligando sobreponíveis, pelo que um único receptor pode ligar várias quimiocinas, assim como uma única quimiocina pode ligar vários receptores.
Geralmente as quimiocinas são produzidas no sítio de uma lesão, inflamação ou outra alteração do tecido de um 2 modo parácrino ou autócrino. No entanto, a migração e activação específica de tipos de células nos processos inflamatórios e imunes não é a única actividade das quimiocinas, e existem outras actividades fisiológicas, tal como a hematopoiese ou angiogénese, que parecem ser reguladas por algumas destas proteínas.
Apesar de existirem inconvenientes potenciais na utilização de quimiocinas como agentes terapêuticos (tendência para agregar e ligação promíscua, em particular), as quimiocinas oferecem a possibilidade de intervenção terapêutica em estados patológicos associados a tais processos, em particular através da inibição de quimiocinas específicas e dos seus receptores com o objectivo de impedir o recrutamento e activação excessivos de células, em particular de leucócitos (Proudfoot A, 2000; Baggiolini M, 2001; Haskell CA et al., 2002).
Entre os receptores de quimiocinas, o CXCR3 (também conhecido como Receptor 9 Acoplado à Proteína G ou GPR9) é um receptor da membrana que é extremamente expressado em células T activadas por IL-2 (por exemplo em linfócitos T CD4+ CD8+), células Assassinas Naturais, células B e (a níveis mais baixos e/ou de um modo restringido pelo ciclo celular) noutros tipos de células não hematopoiéticas, tais como neurónios, células da glândula mamária e células tubulares proximais. A peculiaridade do CXCR3 é que, contrariamente aos outros receptores de quimiocinas, ele exibe um número reduzido de ligandos de quimiocina CXC específicos (CXCLs): CXCL9 (também conhecido como Monocina Induzida pelo Interferão Gama, MIG, Membro 9 da Subfamília B de Citocinas 3
Pequenas Induzidas, ou SCYB9), CXCL10 (também conhecido como Proteína 10 Induzida pelo Interferão Gama, IP-10, Membro 10 da Subfamilia B de Citocinas Pequenas Induzidas, ou SCYB10) e CXCLll (também conhecido como Quimioatractor Alfa de células T induzidas pelo Interferão, I-TAC, Proteína 9 Induzida pelo Interferão Gama, IP-9, H174, beta-Rl, Membro 11 da Subfamilia B de Citocinas Pequenas Induzidas, ou SCYBll).
Estas três quimiocinas não só têm uma afinidade na gama dos nanomolar para o CXCR3 como também partilham de outras particularidades importantes: entre as suas sequências existem muitos aminoácidos conservados, todos eles carecem do motivo "ELR" na extremidade amino, todos eles são induzidos pelo Interferão gama e todos eles parecem ter uma função relevante não só na migração de leucócitos (células Thl) relacionados não só com a inflamação e autoimunidade mas também na rejeição de enxertos e isquemia. Estas actividades têm sido demonstradas em modelos animais, tais como ratinhos "knock-out" e ratinhos tratados com anticorpos específicos para a quimiocina ou o receptor. Por exemplo, a administração de anticorpos dirigidos contra os domínios extracelulares do CXCR3 ou contra os seus ligandos, resulta na inibição específica das respostas inflamatórios mediadas por este receptor (WO 01/72334; WO 01/78708; WO 02/15932). A técnica antecedente apresenta muitas evidências sobre o mecanismo molecular associado à interacção entre o CXCR3 e os seus ligandos, e sobre a sua importância para a fisiologia humana. Quando comprado com as CXCL9 e CXCI10, a CXCLll parece ser o indutor mais potente da activação, internalização e da migração transendotelial mediada pelo 4 CXCR3 nos leucócitos humanos e de ratinhos (Cole K et ai., 1998; Lu B, et al. 1999, Sauty A et al., 2001). A actividade ou a expressão destas moléculas pode estar consideravelmente regulada positivamente e modulada em relação a vários estados patológicos, como demonstrado em modelos animais ou amostras clinicas associadas à rejeição de enxertos (Meyer M et al., 2001), tuberculose (Sauty A et al., 1999), doença do transplante da artéria coronária (Kao J et al., 2003), replicação do HIV-1 (Lane BR et al., 2003), diabetes de tipo 1 (Frigerio S et al., 2002), ulceração do epitélio intestinal (Sasaki S et al., 2002), injecção microbiana (Cole A et al., 2001), reacções granulomatosas sarcóide (Agostini C et al., 1998), lesões ateroscleróticas (Mach F et al., 1999), esclerose múltipla (Sorensen T et al., 1999; WO02/098346), cancro (Trentin L et al., 1999; Robledo MM et al., 2001), doenças cutâneas (WO 02/43758; Flier J et al., 2001), nefropatias (Romagnani P et al., 1999), doenças tiróides (Romagnani P et al., 2002), lesões cerebrais ou da espinal medula (WO 03/006045) e muitas outras doenças autoimunes ou inflamatórias.
Além disso também foi observado que a proliferação de células endoteliais pode ser modulada pela interacção entre o CXCR3 e os seus ligandos (Luster A et al., 1995; Romagnani P et al., 2001). As quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 mostram uma actividade angiostática nas células endoteliais, a qual pode ser inibida por anticorpos anti-CXCR3, sugerindo uma relação estreita entre a activação deste receptor e a regulação do ciclo celular, pelo menos no endotélio.
Estudos sobre as relações estrutura-actividade indicam que as quimiocinas têm dois sitios principais de interacção 5 com os seus receptores, a região amino-terminal flexível e a ansa conformacionalmente rígida subsequente à segunda cisteína. Pensa-se que as quimiocinas se ligam aos receptores por meio da região ansa e julga-se que este contacto facilite a ligação da região amino-terminal que resulta na activação do receptor. Esta importância da região amino-terminal também foi demonstrada testando quimiocinas naturais e sintéticas nas quais este domínio está modificado ou encurtado. Este processamento, após digestão proteolítica, mutagénese ou modificação química de aminoácidos, pode activar ou tornar estas moléculas completamente inactivas, produzindo compostos com actividade agonista e/ou antagonista (US 5 739 103; WO 02/59301) .
Estas observações sugerem que a regulação do recrutamento de leucócitos durante as reacções inflamatórias ou imunes se baseia numa combinação de tais efeitos agonista e antagonista, como foi demonstrado para as quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 e muitas outras quimiocinas (Loetscher P e Clark-Lewis I, 2001; Lambeir A et al., 2001). Deste modo, as quimiocinas com modificações específicas na região amino-terminal são consideradas como tendo potencial terapêutico para doenças inflamatórias e autoimunes (Schwarz e Wells, 1999).
Como muitas outras moléculas de sinalização celular solúveis (interleucinas, factores de crescimento), as quimiocinas apresentam interacções fisiológicas não só com os receptores celulares mas também com os glicosaminoglicanos (GAGs), embora com afinidades variadas. Estas moléculas carregadas negativamente são formadas por repetições de dissacáridos (tais como heparina, sulfato de 6 condroitina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano e ácido hialurónico) e ocorrem naturalmente nas superfícies celulares, na matriz extracelular ou na circulação. Elas podem estar presentes em formas isoladas ou ligadas a proteínas (proteoglicanos, ou PGs) após a adição pós-tradução de GAGs nos resíduos de serina.
As quimiocinas, assim como as outras proteínas de ligação com GAG, têm resíduos básicos (principalmente Arginina e Lisina) acumulados em pequenas fracções da sua sequência que são adequados para este efeito mas tais motivos estão estruturados de modo diferente para cada quimiocina ou grupo de quimiocinas extremamente homólogas. Alguns destes sítios de ligação com GAG foram associados a consensos específicos, tais como os motivos BBXB (em que B representa um resíduo básico e X qualquer outro resíduo) ou outros arranjos (Kuschert G et al., 1999; Proudfoot A et al., 2001). A consequência principal desta interacção é a agregação das quimiocinas, um estado que se julga proporcionar uma protecção contra a proteólise, assim como um mecanismo para a libertação controlada e geradora de gradientes das quimiocinas, que participa no reconhecimento e na apresentação das quimiocinas aos receptores como oligómeros (Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999). A interacção com os GAGs e a formação destes gradientes foi claramente demonstrada para muitas quimiocinas, tendo sido medida a afinidade relativa. Por conseguinte também foi sugerido que a modulação de tais interacções podia representar uma abordagem terapêutica nas doenças inflamatórias (Ali S et al., 2001; Patel D et al., 2001) . 7
Os meios para se conseguir um efeito terapêutico com base nas interacções GAGs-quimiocinas conhecidos na técnica envolvem a produção de análogos de GAGs que modulem a interacção entre os GAGs e as quimiocinas endógenos (WO 94/20512), a utilização de heparanase para eliminar os GAGs (WO 97/11684), a administração de complexos de quimiocina-GAGs (WO 99/62535), a modificação dos domínios de ligação de GAGs com polímeros (WO 02/04015) ou a substituição de resíduos envolvidos na actividade de ligação ao GAG (WO 02/28419) .
Apesar de terem sido realizados estudos extensivos nalgumas quimiocinas está bem estabelecido que não é possível antecipar, com base na homologia de sequência com quimiocinas possuindo similaridade limitada ou motivos conhecidos da proteína de ligação ao GAG, quais os resíduos básicos específicos que têm de ser modificados com substituições não conservadoras para conferir ligação ao GAG, uma vez que existe uma diversidade estrutural significativa dos domínios de ligação ao GAG entre a família de proteínas de quimiocina (Lortat-Jacob H et al., 2002). Também são conhecidos na técnica métodos para detectar ou identificar ligandos, inibidores ou promotores de CXCR3 (US 6 140 064). No entanto, nenhuma destas abordagens pode ser de facto aplicada para gerar e estudar CXCL9, CXCL10 ou CXCLll deficiente na ligação aos GAG. Os requisitos estruturais para interacção com os GAGs, nem a sua estrutura tridimensional, são conhecidos para o CXCR3 e para os seus ligandos. Não existe qualquer descrição na técnica antecedente de quais possam ser os resíduos destas quimiocinas envolvidos na ligação ao GAG, nem de quais 8 possam ser os efeitos in vivo resultantes da sua substituição não conservadora em proteínas mutantes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Determinou-se que resíduos básicos específicos na extremidade carboxilo de uma quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 humana (CXCLll) são responsáveis pela interacção com os glicosaminoglicanos (GAGs). A eliminação destes resíduos básicos por substituição não conservadora (por exemplo, por Alaninas) leva à produção de mutantes de CXCLll possuindo não só uma tendência consideravelmente reduzida para interactuar com os GAGs mas também uma actividade antagonista in vivo sobre a CXCLll. Tais evidências podem ser exploradas para utilizar mutantes de CXCLll e das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 muito semelhantes (CXCL10 e CXCL9), como antagonistas das quimiocinas naturais correspondentes. Os compostos preparados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para bloquear a actividade das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 em células que expressem o CXCR3, proporcionando deste modo composições terapêuticas para serem utilizadas no tratamento de doenças relacionadas com a migração excessiva de células T activadas, tais como rejeição de enxertos e doenças autoimunes (artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes de tipo 1), cancro, infecção pelo HIV-1 e doenças que necessitem de um aumento da vascularização, tal como doença cardíaca isquémica. 9
Outras particularidades e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: (A) sequências de aminoácidos da CXCLll humana madura (CXCL11-WT; SEQ ID NO: 1) e dos mutantes gerados com base nesta sequência, que foram expressados e testados como se descreve nos Exemplos (os aminoácidos alterados estão a cheio e sublinhado; SEQ ID NO: 2-5). A numeração baseia-se na sequência humana madura, a qual carece de um péptido de sinalização com 21 aminoácidos. (B) Alinhamento da sequência com as formas maduras das seguintes quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3: CXCLll de ratinho (mCXCLll; N° de entrada da SWISSPROT Q9JHH5; SEQ ID NO: 8), CXCLll humana (hCXCLll; N° de entrada da SWISSPROT 014625; SEQ ID NO: 1), CXCL10 humana (hCXCLlO; N° de entrada da SWISSPROT P02778; SEQ ID NO: 6) e CXCL9 humana (hCXCL9; N° de entrada da SWISSPROT Q07325; SEQ ID NO: 7). Os residuos a cheio e sublinhados na sequência CXCLll humana foram mutagenizados em Alanina nas diversas variantes apresentadas nos Exemplos (resíduos 5, 6, 8, 46, 49, 52, 57, 59, 62, 66, 67, 70 e 71) . Os outros resíduos básicos na CXCLll humana e todos os resíduos na CXCLll de ratinho, CXCL10 humana e CXCL9 humana estão sublinhados. Os resíduos de cisteína e básicos conservados entre as quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 humanas estão indicados na linha dentro da caixa por baixo do alinhamento, respectivamente, como C e B. A numeração baseia-se nas sequência humanas maduras, as quais carecem de um péptido de sinalização incluindo os 21 (mCXCLll, hCXCLll e hCXCLlO) ou 22 (hCXCL9) aminoácidos N-terminais. A forma madura da 10 mCXCLll, hCXCLll e hCXCLlO é mostrada na sua totalidade, enquanto a forma madura da hCXCL9 tem mais 25 aminoácidos na extremidade carboxilo.
Figura 2: gráfico representando os resultados do ensaio de ligação à heparina realizado com [3H]-heparina, comparando a actividade da CXCLll-WT e dos mutantes de CXCL11 indicados na gama microMolar.
Figura 3: gráfico representando os resultados no ensaios de competição de ligação ao receptor no equilíbrio realizado monitorizando a percentagem de [125I] -CXCL11 deslocada das membranas de células HEK que expressam o CXCR3, após a adição de CXCLll-WT e dos mutantes de CXCLll indicados na gama de concentração pico-/microMolar.
Figura 4: gráfico representando os resultados do ensaio de quimiotaxia realizado em células Ll.2 que expressam o CXCR3 utilizando CXCLll-WT ou os mutantes de CXCLll indicados.
Figura 5: gráfico que resume os resultados do ensaio de recrutamento de células peritoneais, realizado em ratinhos Balb/C fêmea utilizando CXCLll-WT ou os outros mutantes de CXCLll indicados, comparativamente a um controlo de tampão de soro fisiológico. O nível de significância estatística está representado com o número de asteriscos.
Figura 6: gráfico que resume os resultados sobre a capacidade da CXCL11-3B3 para inibir o recrutamento celular induzido pela CXCLll-WT (ambas administradas na quantidade 11 de 10 μς). Administrou-se soro fisiológico ou CXCL11-3B3 30 minutos antes da administração de CXCL11-WT.
Figura 7: gráfico que resume os resultados no ensaio de hipersensibilidade de contacto retardada utilizando soro fisiológico, como um controlo, ou CXCL11-3B3 a uma dose de 0,5 mg/kg. O efeito é medido em termos de volume de dilatação da orelha nos dias seguintes ao tratamento (D5, D6, D7, etc.) com um paquímetro com parafuso.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO O objectivo principal da presente invenção é proporcionar novos antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 consistindo de mutantes deficientes na ligação aos GAG destas quimiocinas nos quais um ou mais dos resíduos básicos conservados na extremidade carboxilo foram eliminados por substituições não conservadoras. Em particular, os mutantes de CXCLll, CXCL10, ou CXCL9 possuindo propriedades antagonistas são aqueles nos quais pelo menos um dos resíduos básicos seguintes escolhidos de entre 46, 62, 66 e 70, como numerados na sequência da CXCLll humana madura, está substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina.
Os resíduos básicos que podem ser adicionalmente mutados em mutantes preferidos são os conservados em uma ou mais quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 específicas (nas quimiocinas humanas ou ao longo das espécies) e/ou os adjacentes aos resíduos básicos conservados. Os mutantes múltiplos são preferencialmente gerados substituindo pelo menos dois resíduos básicos conservados consecutivos de um 12 modo não conservador, mas na presente invenção são descritas outras combinações possíveis. 0 actual pedido de patente proporciona dados in vivo e in vitro sobre as actividades de ligação e antagonista de novos mutantes de CXCLll recombinantes nos quais combinações específicas de resíduos básicos foram substituídas de modo não conservador por Alaninas. Estas evidências, combinadas com o conhecimento da sequência e das propriedades de outras quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 extremamente conservadas, sugerem que o sítio básico conservado específico pode não só desempenhar uma função geral na actividade biológica destas quimiocinas mas também pode ser modificado, de acordo com a presente invenção, para se obter um conjunto de moléculas possuindo propriedades antagonistas contra a quimiocina natural.
Numa forma de realização principal, os antagonistas da CXCLll humana consistem de mutantes da CXCLll humana em que pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina, : 49, 52, 57, 59, 67 ou 71. Mais preferencialmente, os mutantes de CXCLll têm uma das combinações seguintes de resíduos básicos, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), substituídas por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 13 13 a) b) c) d) 57, 59, 46, em conjunto com 49 e/ou 52; 62, em conjunto com 57 e/ou 59; 66 e 70, em conjunto com 67 e/ou 71; ou 62 e 66, em conjunto com um ou mais dos seguintes: 67, 70 ou 71.
Os Exemplos descrevem mutantes incluídos na definição da combinação (a), (b) ou (c), enquanto a combinação (d) inclui dois resíduos básicos conservados consecutivos, em conjunto com os resíduos básicos adjacentes.
Finalmente, os resíduos básicos de CXCL11 que podem ser adicionalmente mutados são aqueles conservados noutra quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 e/ou através das espécies (tal como ratinho). Consequentemente, noutros mutantes de CXCLll preferidos pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ id No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico, ou Asparagina: 5, 6, 8, 17, 20, 26 ou 38.
Numa outra forma de realização principal, os antagonistas da CXCL10 humana consiste de mutantes da CXCL10 humana em que pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ou 75. Mais preferencialmente, os mutantes de CXCL10 têm uma das combinações seguintes de 14 resíduos básicos, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), substituídas por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico,
Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: a) 46 e 52, em conjunto com 47, 48 ou 51; b) 59 e 62; c) 66 e 70, em conjunto com 74 e/ou 75; ou d) 62 e 66, em conjunto com 59 e/ou 70.
Finalmente, os resíduos básicos de CXCL10 que podem ser adicionalmente mutados são os conservados noutra quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 e/ou através das espécies (tal como ratinho). Consequentemente, noutros mutantes de CXCL10 preferidos pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 5, 8, 22, 26 ou 38.
Numa outra forma de realização principal, os antagonistas da CXCL9 humana consistem de mutantes da CXCL9 humana em que o resíduo básico 6 7, numerado com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina. Mais preferencialmente, os mutantes de CXCL9 têm uma das combinações seguintes de resíduos básicos, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), 15 substituída por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: a) 62, em conjunto com 66 e/ou 67; b) 66 e 67; ou c) 66 e 70, em conjunto com um ou mais dos seguintes: 67, 74 ou 75.
Finalmente, os resíduos básicos de CXCL9 que podem ser adicionalmente mutados são os conservados noutra quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 e/ou através das espécies (tal como ratinho). Consequentemente, noutros mutantes de CXCL9 preferidos pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico, ou Asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ou 38. O aminoácido que substitui o resíduo básico é preferencialmente um aminoácido pequeno, não polar como Alanina ou Glicina, mas são apropriados outros aminoácidos, desde que eles possuam uma carga e dimensão que sejam compatíveis com a ligação aos GAG e, ao mesmo tempo, interfiram pouco com outras propriedades da proteína. Os aminoácidos adequados para as substituições são Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina. Os antagonistas da CXCLll humana possuindo substituições de Alanina na combinação de resíduos básicos como definidos na presente invenção (fig. IA) têm a sequência descrita como CXCL11-2B3 (SEQ ID NO: 3), CXCL11-3B3 (SEQ ID NO: 4) ou CXCL11-4B4 (SEQ ID NO: 5). 16
Os exemplos mostram como estes mutantes de CXCLll são deficientes na ligação à heparina e actuam como antagonistas da quimiocina natural correspondente, sendo a CXCL11-3B3 particularmente eficaz. A frase "Mutantes deficientes na ligação aos GAG" ou "mutantes deficientes na ligação à heparina" significa que os mutantes têm uma menor aptidão para se ligar aos GAGs nos ensaios descritos na presente invenção (isto é, liga-se a GAGs como a heparina uma menor percentagem de cada um destes mutantes relativamente à molécula natural correspondente).
No sentido do presente pedido, as "quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3" são as quimiocinas não ELR humanas mostradas na figura 1B: CXCLll humana (também conhecida como H174, Quimioactractor Alfa de células T Induzidas pelo Interferão, I-TAC, ou proteína 9 induzida pelo Interferão gama), CXCL10 humana (também conhecida como ip-10 ou proteína 10 induzida pelo Interferão gama), CXCL9 humana (também conhecida como MIG ou monicina induzida pelo Interferão gama). Esta definição inclui ainda os ortólogos mamíferos destas sequências (tal como a CXCLll de ratinho, mostrada na Fig. 1B).
Tendo em consideração a técnica antecedente não existe nenhuma indicação que as combinações indicadas acima do aminoácido básico na extremidade carboxilo da CXCLll defina um sítio de ligação de GAGs/heparina e que a substituição não conservadora destes resíduos origine moléculas possuindo actividade antagonista na molécula natural correspondente. Além disso, dado o carácter conservador de alguns dos resíduos básicos incluídos nestas combinações 17 entre as quimiocinas de ligação ao CXCR3 humanas conhecidas (CXCL10 e CXCL9) pode inferir-se que os antagonistas destes grupos de quimiocinas podem ser obtidos pela substituição não conservadora de resíduos correspondentes aos caracterizados funcionalmente para a CXCLll humana no presente pedido de patente. Por conseguinte, a presente invenção proporciona mutantes de proteínas de ligação ao CXCR3 que contêm uma combinação das mutações definidas acima, e os quais actuam como antagonistas para as quimiocinas naturais correspondentes. Os compostos preparados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para bloquear a actividade de quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 em células que expressem o CXCR3, proporcionado deste modo composições terapêuticas para serem utilizadas no tratamento de doenças relacionadas com a produção excessiva ou não controlada de quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3, tais como distúrbios autoimunes ou rejeição de enxertos, ou para contrabalançar os seus efeitos agonistas.
Outros objectos da presente invenção são moléculas alternativas com base na estrutura e actividade dos antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 da presente invenção.
Uma primeira classe de moléculas alternativas é representada pelos mutantes activos antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 definidos acima. Estas proteínas deveriam manter, ou até mesmo potenciar, as propriedades agonistas dos mutantes exemplificados no presente pedido de patente. 18
Esta categoria de moléculas inclui análogos naturais ou artificiais da referida sequência, em que foram adicionados, eliminados ou substituídos um ou mais resíduos de aminoácido, desde que eles apresentem a mesma actividade biológica caracterizada na presente invenção em níveis compráveis ou mais elevados, como determinado por meios conhecidos na técnica e descritos nos Exemplos abaixo. Por exemplo, mutantes específicos podem ter um ou mais aminoácidos adicionados, eliminados ou substituídos na região amino-terminal conhecida como afectando a ligação ao receptor. Em particular, estas mutações podem envolver um ou mais dos primeiros nove aminoácidos da quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 humana madura posicionados na região amino-terminal, imediatamente antes do motivo CXC conservado (fig. 1B) . Tais moléculas podem conter, eventualmente, um ou mais aminoácidos mutados obtendo-se uma variante possuindo uma menor tendência para agregação, como foi demonstrado para outras quimiocinas (WO 98/13495).
De acordo com a presente invenção, as alterações preferidas nestes mutantes activos são geralmente conhecidas como substituições "conservadoras" ou "seguras", e envolvem resíduos não básicos. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas com aminoácidos possuindo propriedades químicas suficientemente semelhantes, para conservar a estrutura e a função biológica da molécula. É evidente que também podem ser feitas inserções ou delecções de aminoácidos nas sequências acima definidas sem se alterar a sua função, particularmente se as inserções ou delecções envolverem apenas poucos aminoácidos, por exemplo, menos do que dez, e preferencialmente menos do que três, e não eliminarem ou 19 deslocarem aminoácidos que são críticos para a conformação funcional de uma proteína ou um péptido. A literatura proporciona muitos modelos nos quais se pode efectuar a selecção de substituições conservadoras de aminoácidos com base em estudos estatísticos e físico-químicos sobre a sequência e/ou a estrutura da proteína natural (Rogov SI e Nekrasov AN, 2001) . Experiências de concepção de proteínas mostraram que a utilização de subconjuntos específicos de aminoácidos pode produzir proteínas que podem sofrer enrolamento e serem activas, auxiliando à classificação de substituições "sinónimas" de aminoácidos as quais podem ser mais facilmente acomodadas na estrutura da proteína, e que podem ser utilizadas para detectar homólogos e parálogos funcionais e estruturais (Murphy LR et al., 2000). Os grupos de aminoácidos sinónimos e os grupos de sinónimos mais preferidos são os definidos no Quadro I.
Os mutantes activos produzidos por substituições feitas com base nestes ensinamentos, assim como os mutantes activos em que foram eliminados ou adicionados um ou mais aminoácidos, estão entre os objectos da presente invenção, isto é, os novos mutantes de quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 possuindo más propriedades de ligação ao GAG e actividade agonista nas quimiocinas de ligação ao CXCR3 correspondente, comparável às dos mutantes inicialmente seleccionados, ou até mesmo melhorada se possível. Compostos semelhantes podem resultar da aplicação de técnicas de mutagénese convencional ao ADN de codificação, de tecnologias combinatórias ao nível da sequência de codificação de ADN (tal como arranjo combinatório de ADN, apresentação/selecção de fagos) ou de estudos de concepção 20 auxiliados por computador, seguido de validação em relação às actividades desejadas como descrito na técnica antecedente e nos Exemplos abaixo.
Uma segunda classe de moléculas alternativas da invenção é representada pelos antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 compreendendo uma das sequências de aminoácidos como definidas acima e uma sequência de aminoácidos pertencente a uma sequência proteica que não a correspondente à quimiocina CXC de ligação ao CXCR3. Esta última sequência heteróloga deveria proporcionar propriedades adicionais sem diminuir significativamente a actividade agonista ou melhorar as propriedades de ligação ao GAG. Exemplos de tais propriedades adicionais são um procedimento de purificação mais fácil, um maior tempo de semivida nos fluidos orgânicos, uma unidade de ligação adicional, a maturação por meio de uma digestão endoproteolitica ou localização extracelular. Esta última particularidade é de particular importância para definir um grupo especifico de proteínas de fusão ou quiméricas incluídas na definição acima uma vez que ela permite que as moléculas definidas como antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 neste pedido de patente se localizam no espaço onde não só é facilitado o isolamento e purificação deste polipéptidos, mas também onde interactuam naturalmente as quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 e o seu receptor. A concepção das unidades, ligandos e grupos de ligação, assim como os métodos e estratégias para a construção, purificação, detecção e utilização das proteínas de fusão são amplamente discutidas na literatura (Nilsson J et al., 1997; "Applications of chimeric genes 21 and hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137) . Outras sequências de proteínas que podem ser utilizadas para qerar os antagonistas da presente invenção são escolhidas entre os domínios extracelulares da proteína ligada à membrana, região constante de imunoglobulina, domínios de multimerização, proteínas extracelulares, proteínas contendo péptidos de sinalização, proteínas contendo sinais de exportação. A escolha de uma ou mais destas sequências para serem fundidas ao mutante deficiente na ligação ao GAG da quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 é funcional à utilização específica e/ou protocolo de purificação do referido agente.
Pode preparar-se conjugados ou complexos úteis dos antagonistas da presente invenção, utilizando moléculas e métodos conhecidos na técnica da interacção com o receptor ou outras proteínas (marcações radioactivas ou fluorescentes, biotina), eficácia terapêutica (agentes citotóxicos) ou melhoramento dos agentes em termos de eficácia de administração do fármaco, tal como polietileno glicol e outros polímeros naturais ou sintéticos (Pillai O e Panchagnula R, 2001). No último caso, os antagonistas podem ser produzidos após uma modificação dirigida de um resíduo apropriado, na sequência natural ou mutada numa posição interna ou terminal. A literatura proporciona exemplos de tecnologias para gerar quimiocinas modificadas ou conjugadas com polímeros (WO 02/04015; WO 02/20033; WO 02/02132). Pode ligar-se qualquer resíduo para ligação, desde que ele possua uma cadeia lateral adequada para fixação do polímero (isto é, a cadeia lateral de um aminoácido portador de um grupo 22 funcional, por exemplo, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteina, histidina, etc.)· Alternativamente, pode substituir-se um residuo nestas posições por um aminoácido diferente possuindo uma cadeia lateral adequada para fixação do polimero. De igual modo, as cadeias laterais dos aminoácidos codificados geneticamente podem ser modificadas quimicamente para fixação do polimero ou pode utilizar-se aminoácidos não naturais com grupos funcionais apropriados na cadeia lateral. A fixação do polimero pode ser não só à cadeia lateral do aminoácido natural numa posição especifica do antagonista ou à cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural que substitui o aminoácido natural numa posição especifica do antagonista, mas também a um hidrato de carbono ou outra unidade que está ligada à cadeia lateral do aminoácido na posição alvo.
Os polímeros adequados para estes efeitos são biocompativeis, nomeadamente, eles são não tóxicos para os sistemas biológicos, sendo conhecido um grande número desses polímeros. Estes polímeros podem ser de natureza hidrófoba ou hidrófila, biodegradáveis, não biodegradáveis ou uma combinação destes. Estes polímeros incluem polímeros naturais (tais como colagénio, gelatina, celulose, ácido hialurónico), assim como polímeros sintéticos (tais como poliésteres, poliortoésteres, polianidridos). Exemplos de polímeros não degradáveis hidrófobos incluem polidimetilsiloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetilenos, polietilenos, poli(cloretos de vinilo), e poli(metacrilatos de metilo). Exemplos de polímeros não degradáveis hidrófilos incluem poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(álcool vinílico), poli(N-vinilpirrolidona), polialquilenos, poliacrilamida e 23 copolímeros destes. Os polímeros preferidos compreende como unidade estrutural básica o óxido de etileno, tal como polietileno glicol (PEG). 0 método de fixação preferido utiliza uma combinação de síntese de péptidos e ligação química. Vantajosamente, a fixação de um polímero solúvel em água será através de um grupo de ligação biodegradável, especialmente na região amino-terminal de uma proteína. Esta modificação actua no sentido de proporcionar a proteína numa forma precursora (ou "pró-fármaco"), que, após degradação do grupo de ligação liberta a proteína sem a modificação pelo polímero.
Os antagonistas da invenção podem ser preparados por qualquer procedimento conhecido na técnica, incluindo tecnologias relacionadas com ADN recombinante e tecnologias de síntese química.
Outro objecto da invenção são as moléculas de ADN compreendendo as sequências de ADN que codificam os antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 descritos acima, incluindo sequências de nucleótidos substancialmente iguais. "Sequências de nucleótidos substancialmente iguais" inclui todas as outras sequências de ácidos nucleicos que, em virtude da degeneração do código genético, também codificam as sequências de aminoácidos dadas. Ainda um outro objecto da invenção são vectores de expressão que compreendem os ADN anteriores, células hospedeiras transformadas com tais vectores e o processo de preparação dos antagonistas descritos acima, compreendendo a cultura destas células transformadas e recolha das proteínas expressadas. Quando o vector expressa os antagonistas como uma proteína de fusão com proteínas 24 contendo péptidos extracelulares, sinais de exportação ou péptidos de sinalização, os antagonistas da quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 podem ser segregados para o espaço extracelular e podem ser mais facilmente colhidos e purificados a partir das células cultivadas tendo em perspectiva o seu processamento adicional ou, alternativamente, as células podem ser utilizadas ou administradas directamente.
Estes objectos da invenção podem ser conseguidos combinando a descrição proporcionada no presente pedido de patente sobre as antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3, com o conhecimento das técnicas correntes de biologia molecular. Muitos livros e artigos de revisão proporcionam ensinamentos sobre o modo de clonar e produzir proteinas recombinantes utilizando vectores e células hospedeiras Procariotas e Eucariotas, tais como alguns títulos da série "A Practical Approach" publicada pela Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001) . A sequência de ADN que codifica as proteínas da invenção pode ser inserida e ligada a vectores epissomais ou não-/homologamente integrantes adequados, os quais podem ser introduzidos nas células hospedeiras apropriadas por quaisquer meios adequados para as transformar (transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção directa, etc.). Os factores de importância na selecção de um plasmídeo ou vector virai particular incluem: a facilidade com que as células 25 recipientes podem conter o vector, poder ser reconhecida e seleccionada das células recipientes que não contêm o vector; o número de cópias do vector que são desejadas num hospedeiro particular; e se é desejável ser-se capaz de "transferir" o vector entre células hospedeiras de espécies diferentes.
Os vectores deverão permitir a expressão da proteína isolada ou de fusão contendo o antagonista da invenção na célula hospedeira Procariota ou Eucariota sob o controlo das sequências reguladoras de arranque/finalização da transcrição, as são escolhidas para serem constitutivamente activas ou induzidas na referida célula. Pode isolar-se uma linha celular substancialmente enriquecida em tais células para proporcionar uma linha celular estável.
Para hospedeiros Eucariotas (por exemplo células de levedura, insecto ou mamífero) pode utilizar-se sequências reguladoras transcricionais e tradutoras dependendo da natureza do hospedeiro. Elas podem ser de fontes virais, tais como adenovírus, vírus do papiloma bovino, vírus Símio ou semelhantes, nos casos em que os sinais reguladores estão associados a um gene particular o qual tem um nível elevado de expressão. São exemplos o promotor TK do vírus Herpes, o promotor precoce SV40, o promotor do gene gal4 da levedura, etc. Pode seleccionar-se sinais reguladores de arranque da transcrição que permitam a repressão e activação para que se possa modular a expressão dos genes. As células que foram transformadas de modo estável pelo ADN introduzido podem ser seleccionadas introduzindo também um ou mais marcadores que permitam seleccionar as células hospedeiras que possuam um vector de expressão. 0 marcador também pode proporcionar fototrofia a um hospedeiro 26 auxotrópico, resistência a biocidas, por exemplo antibióticos, ou metais pesados tal como cobre, ou semelhantes. 0 gene marcador seleccionável pode estar directamente ligado às sequências de adn do gene a ser expressado ou ser introduzido na mesma célula por co-transfecção. Também podem ser necessários elementos adicionais para síntese óptima das proteínas da invenção.
As células hospedeiras podem ser Procariotas ou Eucariotas. São preferidos os hospedeiros Eucariotas, por exemplo células de mamíferos, tais como células humanas, de macaco, ratinho e de Ovário de Hamster Chinês (CHO), porque eles proporcionam modificações pós-tradução das moléculas de proteína, incluindo dobramento correcto ou glicosilação em sítios correctos. As células de levedura também podem realizar modificações pós-tradução do péptido incluindo glicosilação. Existe um número de estratégias de ADN recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e um número elevado de cópias de plasmídeos que podem ser utilizados para a produção das proteínas desejadas em levedura. A levedura reconhece sequências líder nos produtos de genes de mamíferos clonados e segrega péptidos portadores de sequências líder (isto é, pré-péptidos).
Exemplos de tecnologias de síntese química são a síntese em fase sólida e a síntese em fase líquida. Como uma síntese em fase sólida, por exemplo, o aminoácido correspondente à extremidade carboxilo do péptido a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos e através da repetição alternada de reacções, uma em que os aminoácidos com os seus grupos amina e grupos funcionais da cadeia lateral protegidos com grupos de protecção adequados são condensados um a um por 27 ordem a partir da extremidade carboxilo para a extremidade amina, e uma em que os aminoácidos ligados à resina ou o grupo de protecção dos grupos amino dos péptidos são libertados, prolonga-se a cadeia do péptido. Os métodos de sintese em fase sólida são classificados em termos gerais em método tBoc e método Fmoc, dependendo do tipo de grupo de protecção utilizado. Os grupos de protecção tipicamente utilizados incluem tBoc (t-butoxocarbonilo), Cl-Z (2-clorobenziloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenziloxicarbonilo), Bzl (benzilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benziloxicarbonilo) e C12-Bzl (2,6-diclorobenzilo) para os grupos amino; N02 (nitro) e Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para os grupos guanidino); e tBu (t-butilo) para os grupos hidroxilo). Após a sintese do péptido desejado, submete-se o mesmo à reacção de desprotecção e remove-se do suporte sólido. Esta reacção de remoção do péptido pode ser realizada com fluoreto de hidrogénio ou ácido tri-fluorometanossulfónico para o método Boc e com TFA para o método Fmoc. Na literatura são descritas quimiocinas totalmente sintéticas (Brown A et al., 1996). A purificação dos antagonistas sintéticos ou recombinantes da invenção pode ser realizada por qualquer um dos métodos conhecidos para este efeito, isto é, qualquer procedimento convencional envolvendo extracção, precipitação, cromatografia, electroforese ou semelhantes. Um outro procedimento de purificação que pode ser utilizado de preferência para purificar a proteina da invenção é a cromatografia de afinidade utilizando anticorpos monoclonais ou grupos de afinidade, que ligam a proteina 28 alvo e os quais são produzidos e imobilizados numa matriz de gel contida dentro da coluna. As preparações impuras contendo as proteínas são passadas através da coluna. A proteína será ligada à coluna pela heparina ou pelo anticorpo específico enquanto as impurezas passam através da mesma. Depois de lavar, a proteína é eluída do gel por uma alteração no pH ou força iónica. Alternativamente pode utilizar-se HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). A eluição pode ser realizada utilizando um solvente à base de água-acetonitrilo geralmente utilizado para a purificação de proteínas. A invenção inclui preparações purificadas dos compostos da invenção. Preparações purificadas, como aqui utilizado, refere-se às preparações que são pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 5%, em peso seco dos compostos da invenção.
Outro objecto da presente invenção é a utilização de antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 como medicamentos, em particular como substâncias activas em composições farmacêuticas (e formuladas em combinação com veículos, excipientes, estabilizantes, adjuvantes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis) para tratar ou prevenir doenças relacionadas com uma actividade indesejável das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 que conduz a uma migração e activação excessiva de leucócitos que expressam os seus receptores, tais como doenças autoimunes e inflamatórias, assim como cancro ou infecções bacterianas/virais. Exemplos não restritivos de tais doenças são os seguintes: artrite, artrite reumatóide (RA), artrite psoriática, osteoartrite, lúpus eritematoso sistémico (SLE), esclerose sistémica, esclerodermia, polimiosite, glomerulonefrite, fibrose, fibrose e inflamação hepática ou pulmonar, doenças alérgicas ou de 29 hipersensibilidade, dermatite, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), doença inflamatória do intestino (IBD), doença de Crohn, colite ulcerosa, esclerose múltipla, choque séptico, infecção pelo HIV, rejeição de enxertos e inflamação vascular relacionada com aterosclerose.
Tendo em consideração a técnica antecedente que descreve a actividade agonista especifica das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3, os antagonistas da presente invenção podem ser utilizados como substâncias activas em composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de doenças que necessitem de um aumento da vascularização, como ocorre em estados patológicos tais como doença arterial isquémica, acidente vascular cerebral e cicatrização retardada de feridas. A estimulação do crescimento de novos vasos sanguíneos resultante do antagonismo de factores angiostáticos pode auxiliar no tratamento destas patologias estabelecendo uma circulação apropriada.
Um outro objecto da presente invenção é uma composição farmacêutica contendo, como substância activa, um antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 nas formas definidas acima: proteínas, assim como ADN que as codificam ou células que as expressam. 0 processo para a preparação de tais composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a migração e activação excessivas de leucócitos, ou de doenças que necessitam de um aumento da vascularização, compreende a combinação deste antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. 30
Um outro objecto da presente invenção é também o método para tratar ou prevenir qualquer uma das doenças supramencionadas compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 da presente invenção.
As composições farmacêuticas podem conter, para além do antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3, portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados, veículos e aditivos biologicamente compatíveis que sejam adequados para serem administrados a um animal (por exemplo, soro fisiológico) e compreendendo eventualmente auxiliares (como excipientes, estabilizantes, adjuvantes ou diluentes) que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. Tais composições podem ser eventualmente combinadas com uma outra composição terapêutica que actua sinergicamente ou de um modo coordenado com o antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 da invenção. Por exemplo, observou-se propriedades sinérgicas semelhantes com os antagonistas da CC-quimiocina associados à ciclosporina (WO 00/16796). Alternativamente, a outra composição pode basear-se num composto conhecido como sendo terapeuticamente activo contra a doença especifica (por exemplo, IFN-beta para a esclerose múltipla, receptores de TNF solúveis para a artrite reumatóide).
As composições farmacêuticas podem ser formuladas de qualquer modo aceitável para satisfazer as necessidades do modo de administração. Por exemplo, a utilização de biomateriais e outros polímeros para administração do fármaco, assim como as técnicas e modelos diferentes para 31 validar um modo de administração específico são descritos na literatura (Luo B e Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade das substâncias activas que é suficiente para afectar o curso e a gravidade da doença, levando à redução ou remissão dessa patologia. A quantidade eficaz dependerá da via de administração e do estado do doente. "Farmaceuticamente aceitável" destina-se a abranger qualquer portador, que não interfira com a eficácia da actividade biológica da substância activa e que seja não tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, as substâncias activas acima podem ser formuladas numa forma de dosagem unitária para injecção em veículos tais como soro fisiológico, solução de dextrose, albumina de soro e solução de Ringer. Os portadores também podem ser seleccionados de amido, celulose, talco, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cal, sílica gel, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno glicol, água, etanol e vários óleos, incluindo os de origem no petróleo, ou de origem animal, vegetal ou sintética (óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo).
Qualquer modo de administração aceite pode ser utilizado e determinado pelos especialistas na técnica para estabelecer os níveis desejados das substâncias activas no sangue. Por exemplo, a administração pode ser efectuada por várias vias parentéricas tais como subcutânea, intravenosa, 32 intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, e pelas vias intranasal, transdérmica, rectal, oral ou bucal. As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser administradas em formas de dosagem de libertação prolongada ou controlada, incluindo injecções de implante, bombas osmóticas e semelhantes, para a administração prolongada do polipéptido a uma taxa predeterminada, preferencialmente em formas de dosagem unitária adequadas para administração única de dosagens precisas. A administração parentérica pode ser por injecção de "bolus" ou por perfusão gradual ao longo do tempo. As preparações para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis, as quais podem conter agentes auxiliares ou excipientes conhecidos na técnica, e podem ser preparadas de acordo com métodos de rotina. Além disso pode administrar-se suspensões dos compostos activos na forma de suspensões oleosas para injecção apropriadas. Os solventes ou veiculos lipófilos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácido gordo sintéticos, por exemplo, oleato de etilo ou triglicéridos. As suspensões aquosas para injecção que podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes. As composições farmacêuticas incluem soluções adequadas para serem administradas por injecção e contêm desde cerca de 0,01 até 99,99 por cento, preferencialmente desde cerca de 20 até 75 por cento de composto activo em conjunto com o excipiente. As composições que podem ser administradas por via rectal incluem supositórios. 33
Entende-se que a dosagem administrada dependerá da idade, género, estado de saúde e peso do destinatário, tipo de tratamento concorrente, se algum, frequência de tratamento e da natureza do efeito desejado. A dosagem será ajustada ao indivíduo, como é compreendido e determinável por um especialista na técnica. A dose total necessária para cada tratamento pode ser administrada em doses múltiplas ou numa única dose. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada sozinha ou conjuntamente com outros agentes terapêuticos orientados para a patologia ou orientados para outros sintomas da patologia. Geralmente uma dosagem diária da substância activa está compreendida entre 0,01 até 100 miligrama por quilograma de peso corporal por dia. Normalmente 1 até 40 miligrama por quilograma por dia dado em doses divididas ou numa forma de libertação prolongada é eficaz para se obter os resultados desejados. A segunda administração e as administrações subsequentes podem ser efectuadas a uma dosagem, que é igual, menor ou maior do que a dose inicial ou precedente administrada ao indivíduo.
Os Exemplos referir-se-ão às Figuras especificadas abaixo.
EXEMPLOS
Exemplo 1: caracterização in vitro das propriedades de ligação à heparina dos mutantes de CXCLll
Materiais e Métodos
Expressão dos mutantes da CXCLll humana. 34
Gerou-se mutantes da CXCL11 humana por mutagénese de PCR in vitro da sequência de ADN que codifica a CXCLll humana (I-TAC; N° de entrada da SWISSPROT 014625), e em particular a forma madura, correspondente ao segmento 22-94 da molécula precursora, contendo 73 aminoácidos (CXCLll-WT; fig. 1; SEQ ID NO: 1).
As aglomerações de mutações pontuais associadas a cada proteína mutante (CXCL11-1B3, SEQ ID NO: 2; CXCL11-2B3, SEQ ID NO: 3; CXCL11-3B3, SEQ ID NO: 4; CXCL11-4B4, SEQ ID NO: 5; figura IA) foram introduzidas na sequência de codificação da CXCLll-WT utilizando um ou dois passos de PCR de 25 ciclos (Pwo ADN polimerase à prova de leitura; Boehringer-Mannheim). A cadeia molde foi um plasmídeo baseado no vector comercial pET-24d (Novagen), no qual a sequência da CXCLll humana madura é expressada como uma proteína de fusão possuindo uma etiqueta (MKKKWP) amino-terminal seguida de um sítio de clivagem pela Caspase 8 (LETD). Os fragmentos de ADN com 0,3 Kb resultantes obtidos por PCR foram digeridos com BspHI e Xhol, e subclonados num plasmídeo pET-24d vazio entre os sítios Xhol e Ncol. A CXCLll-WT e todas as proteínas mutantes, que carecem de uma metionina de partida na forma madura, podem ser produzidas como proteínas contendo 73 resíduos sem quaisquer outros resíduos adicionais, uma vez que a etiqueta amino-terminal é eliminada utilizando digestão endoproteolítica com Caspase 8. A CXCLll-WT e as proteínas mutantes foram expressadas e testadas de acordo com métodos conhecidos na técnica ("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 138, Humana Press, 2000). Todas as construções foram obtidas e controladas por tecnologias correntes de biologia 35 molecular (mutagénese e amplificação por PCR, sequenciação do ADN, digestão por restrição) e depois mantidas na estirpe TG1 de E. coli durante o processo de clonagem. As sequências de codificação foram escolhidas para se ter uma utilização óptima do codão para expressão em E. coli (Kane JF et al., 1995) .
Os plasmídeos à base de pET-24d que codificam a CXCL-11-WT ou um dos seus mutantes foram transferidos para células de E. coli BL21 (DE3) pLysS competentes, nas quais foi induzida a expressão da proteína através da adição de isopropil-P-D-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM à cultura. Colheu-se as células 3,5 horas após indução e ressuspendeu-se em tampão de lise (Tris/HCl 50 mM pH 8, MgCl2 10 mM,
Benzamidina/HCl 5 mM, DTT 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, Dnase 20 mg/L). As células foram destruídas por três passagens através da unidade French Pressure Cell. Centrifugou-se então a suspensão a lO.OOOxg durante 60 minutos a 4 °C. Solubilizou-se o sedimento de inclusão contendo CXCL-WT ou uma das proteínas mutantes (a uma concentração menor do que 1 mg/ml) em Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0, contendo Guanidina/HCl 6M e DTT 1 mM, e agitou-se durante 30 minutos a 60 °C. As proteínas foram renaturadas por diluição gota a gota num volume 10 vezes o da solução de guanidina de Tris/HCl 0,1M, pH 8,0 contendo 0,01 mM de glutationa oxidada e 0,1 mM de glutationa reduzida. Agitou-se a solução dum dia para o outro a 4 °C. Ajustou-se então o pH até 4,5 com ácido acético, e diminuiu-se a condutividade até 20 miliSiemens por diluição com água. Aplicou-se a solução a uma coluna de troca catiónica (SP Sepharose) previamente equilibrada com acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) e eluiu-se a proteína com um gradiente linear de 0 até 2 M de NaCl no mesmo tampão. 36
Juntou-se as fracções contendo a proteína de interesse e submeteu-se a diálise contra 3 mudanças de ácido acético a 1%. 0 material insolúvel foi eliminado por centrifugação a lO.OOOxg durante 30 minutos e o sobrenadante liofilizado. A sequência líder amino-terminal comum à CXCLll-WT e a todas as proteínas mutantes (MKKKWPLETD) foi clivada com caspase 8 utilizando o procedimento seguinte. Dissolveu-se as proteínas liofilizadas em 15-20 ml H20 e aplicou-se a coluna PD-10 previamente equilibradas com tampão de clivagem com Caspase 8 (15% de glicerol, NaCl 150 mM, Tris 25 mM pH 7,5, EDTA 2 mM) . Após a incubação das proteínas com a enzima proteolítica (1:100, enzima:substrato, p/p) durante 4-5 horas à temperatura ambiente, ajustou-se o pH da solução de clivagem até 4,5 e reduziu-se a condutividade a 1-2 miliSiemens por diluição com ureia 6M (a reacção foi repetida duas ou três vezes se necessário). Separou-se as proteínas clivadas da proteína não clivada por cromatografia de troca catiónica numa coluna SP Sepharose previamente equilibrada em acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) contendo ureia 6 M, e eluiu-se as proteínas com um gradiente de NaCl desde 0 até 2 Molar no mesmo tampão. Juntou-se as fracções clivadas e dialisou-se contra três mudanças de ácido acético a 1%, liofilizou-se, solubilizou-se em ácido trifluoroacético a 0,1% e finalmente liofilizou-se novamente para armazenagem a longo prazo. A identidade de todas as proteínas assim expressadas foi verificada por espectrometria de massa e a pureza por Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC).
Construção de linhagens celulares que expressam de modo estável o CXCR3 humano. 37
Clonou-se o CXCR3 humano a partir de ARN total extraído de leucócitos isolados do líquido sinovial da artrite reumatóide pela Reacção em Cadeia da Polimerase de Transcrição Inversa (RT-PCR) utilizando iniciadores baseados na sequência de ARNm da CXCR3 humana a cobrir toda a sequência de codificação (N° do Genbank X95876; nucleótido do 69 até ao 1175) . Todos os reagentes para as reacções de RT-PCR estão comercialmente disponíveis (Trizol™ e Superscript™ de Life Technologies; oligodTi5 de Promega) e foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Subclonou-se o produto de PCR com 1,1 kb resultante no vector de expressão de células de mamífero pCDNA3.1zeo (Invitrogen) para criar pZeo-CXCR3.
Transfectou-se células HEK293/EBNA humanas e L1.2 com ADN de plasmídeo purificado para o pZeo-CXCR3 por precipitação com fosfato de cálcio utilizando um Estojo de Transfecção com Fosfato de Cálcio (Life Technologies) e seleccionou-se os clones positivos utilizando Zeocina (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A expressão da CXCR3 foi confirmada por análise FACS (Triagem de Células Activada por Fluorescência) de clones individuais utilizando um anticorpo monoclonal comercial contra a CXCR3 humana marcada com um fluoróforo FITC (R&D Systems; n° de catálogo MAB160) e por um ensaio de ligação de radioligando no equilíbrio (ver abaixo).
Ensaios cromatográficos da CXCLll-WT e dos seus mutantes
Carregou-se a CXCLll-WT, ou cada um dos seus mutantes, numa coluna Sepharose de Heparina (utilizando 50 micrograma 38 de proteína) ou numa coluna de troca catiónica SP Sepharose (utilizando 50 micrograma de proteína). Em ambos os casos a coluna foi equilibrada em Tris/HCl 50 mM, pH 7,5 e NaCl 50 mM e a proteína eluída com um gradiente linear de NaCl 0-2M no mesmo tampão.
Ensaio de ligação da CXCLll-WT e dos seus mutantes à heparina.
Incubou-se diluições em série de CXCLll-WT ou dos seus mutantes em Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato (PBS), a cobrir a gama de 0,02-30 μΜ, com 2,5 pg/ml de [3H]-heparina durante 1 hora a 37 °C. Transferiu-se, em triplicado, 20 μΐ de cada amostra para uma placa P81 Unifilter de 96 poços (Whatman Inc) munida com um filtro de fosfato de celulose. Lavou-se a placa três vezes com 200 μΐ de PBS utilizando uma bomba de vácuo para eliminar heparina marcada não ligada. Adicionou-se fluido de cintilação (50 μΐ) a cada poço e contou-se a radioactividade (1 minuto/poço) num contador beta. Os dados foram analisados utilizando o suporte lógico Prism® (GraphPad).
Ensaios de competição de ligação ao receptor no equilíbrio
Os ensaios foram realizados em membranas de células HEK que expressam de modo estável o CXCR3 utilizando um Ensaio de Cintilação de Proximidade (SPA), com [125I]-CXCL11 como marcador. A CXCLll (I-TAC humana recombinante; Peprotech) marcada radioactivamente foi gerada e testada de acordo com o fornecedor de [ I] (Amersham; actividade específica de 2200 mCi/mole), também para verificar os 39 clones de HEK e Ll.2 que expressam a CXCR3 revelados positivamente durante a análise FACS.
Preparou-se competidores por diluição em série (gama desde 10“6 até 1CT12 M) da CXCLll não marcada, ou um dos seus mutantes, no tampão de ligação (HEPES 50 mM pH 7,2, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 0,15 M e 0,5% de Albumina de Soro Bovino). Solubilizou-se esferas SPA de gérmen de trigo (Amersham) em PBS até 50 mg/ml e diluiu-se no tampão de ligação até 10 mg/ml, sendo a concentração final no ensaio de 0,25 mg/poço. Conservou-se as membranas celulares que expressam o CXCR3 a -80 °C e diluiu-se no tampão de ligação a 20 μg/ml. Misturou-se volumes iguais das soluções-mães de membrana e das esferas antes de se realizar o ensaio para reduzir o ruido de fundo. A concentração final de membranas foi de 5 μg/poço e a da [125l]-CXCLll foi de 0,05 nM. Incubou-se as placas à temperatura ambiente com agitação durante 4 horas. Contou-se a radioactividade (1 minuto/poço) num contador beta. Analisou-se os dados de amostras em triplicado utilizando o suporte lógico Prism® (GraphPad).
Resultados
Expressou-se a CXCLll humana em quatro formas mutantes para identificar a sequência e as propriedades de variantes que não se ligavam à heparina. Os alvos das mutações foram quatro aglomerações de residuos básicos e incluiu-se em cada proteína mutante pelo menos um resíduo básico conservado em todas as quimiocinas de ligação ao CXCR3 (fig. D.
Expressou-se a forma madura da CXCLll humana (CXCLll-WT) e das quatro proteínas mutantes correspondentes em E 40 coli, (fig. IA). Uma primeira proteína mutante, CXCL11-1B3, contém três substituições de Alanina a eliminar um aglomerado básico na região amino-terminal da CXCLll-WT (Lisina 5, Arginina 6 e Lisina 8). Uma segunda proteína mutante (CXCL11-2B3) contém três substituições de Alanina a eliminar um aglomerado básico adjacente ao resíduo 50 da CXCLll-WT (Lisina 46, Lisina 49 e Arginina 52). Uma terceira proteína mutante (CXCL11-3B3) contém três substituições de Alanina a eliminar um aglomerado básico adjacente ao resíduo 60 da CXCLll-WT (Lisina 57, Lisina 59 e Arginina 62) . Finalmente, uma quarta proteína mutante (CXCL11-4B4) contém quatro substituições de Alanina a eliminar um aglomerado básico adjacente ao resíduo 70 da CXCLll-WT (Lisina 66, Lisina 67, Arginina 70 e Lisina 71).
Os efeitos das substituições nas propriedades das proteínas mutantes da CXCLll-WT foram testados, em primeiro lugar, por cromatografia em heparina e cromatografia de troca catiónica. A comparação dos perfis de eluição neste meios cromatográficos proporciona uma indicação qualitativa da contribuição das interacções electrostáticas não específicas devido aos aminoácidos básicos para as propriedades de ligação à heparina (Proudfoot A et al., 2001) . Como se mostra no Quadro III, a diferença na concentração de NaCl de eluição entre a CXCLll-WT e cada proteína mutante é calculada na coluna de troca catiónica (MonoS) e na coluna de heparina. Os valores obtidos na coluna MonoS são depois subtraídos do obtido nas colunas de heparina. Se o valor resultante for positivo, isto indica que os resíduos mutados contribuem para a interacção com a heparina. A partir desta análise concluiu-se que os resíduos mutados na CXCL11-1B3 não contribuem para a ligação à heparina, enquanto os mutados nas CXCL11-2B3, 41 CXCL11-3B3 e CXCL11-4B4 estão envolvidos no reconhecimento específico de GAGs.
Em seguida realizou-se uma medição directa da ligação à heparina utilizando heparina tritiada e diluição em série dos mutantes de CXCLll-WT recombinante (fig. 2). Separou-se os complexos marcados radioactivamente resultantes da [3H] — heparina não marcada fazendo contactar a reacção com filtros de fosfato de celulose, os quais são capazes de reter eficientemente proteínas, permitindo desse modo uma avaliação directa da quantidade de heparina ligada. Este ensaio mostrou que a CXCL11-1B3 tem propriedades de ligação à heparina semelhantes às da CXCLll-WT, enquanto todos os outros mutantes exibiram propriedades de ligação à heparina reduzidas (até 50% menos de ligação à heparina), confirmando os resultados obtidos utilizando ensaios cromatográficos (Quadro III). Estas evidências são de interesse particular uma vez que a aglomeração básica mutada em CXCL11-1B3 está organizada como um motivo (bbxb) muito mais semelhante a outros motivos de ligação à heparina tal como o da RANTES (Proudfoot A et al., 2001), confirmando a observação sobre a diversidade estrutural digna de nota e a má predictibilidade dos sítios de ligação aos GAG nas quimiocinas (Lortat-Jacob H et al., 2002).
Finalmente, realizou-se um ensaio de competição de ligação ao receptor no equilíbrio para comparar as propriedades das proteínas mutantes na ligação do receptor CXCR3 específico (fig. 3) . Misturou-se amostras contendo uma quantidade constante de CXCLll comercial, marcada radioactivamente com diluições em série de CXCLll-WT, ou de uma das proteínas mutantes, e incubou-se então com membranas preparadas a partir de células que expressam o 42 CXCR3. Embora a proteína mutante de ligação à heparina CXCL11-1B3 apresente uma redução de mais de duas ordens de magnitude (mudando de sub-nanomolar para sub-micromolar) na afinidade para o CXCR3, as outras proteínas mutantes mostram apenas uma queda limitada na afinidade para o CXCR3, permanecendo na gama nanomolar (redução de uma ordem de magnitude ou menos). Por conseguinte, a afinidade para o receptor é essencialmente retida em mutantes da extremidade carboxilo da CXCLll-WT deficientes na ligação à heparina, enquanto as mutações na extremidade amino afectam especificamente a ligação ao receptor, uma particularidade que surge como claramente distinta.
Exemplo 2: Ensaio com base em células para a caracterização de uma proteína mutante da CXCLll deficiente na ligação à heparina
Materiais e métodos
Ensaio de quimiotaxia 0 ensaio foi realizado utilizando linhagem de células de linfoma pré-B (células L1.2), transfectadas com um plasmídeo que permite a expressão de CXCR3 nestas células e microplacas de 96 poços (ChemoTX System, Neuroprobe).
Cultivou-se células Ll.2 que expressam CXCR3 (ver a descrição acima) em meio RPMI-1640 contendo 5% de soro fetal de vitelo inactivado (FCS), L-glutamina, HEPES 25 mM, B-Mercaptoetanol 0,05 mM e 0,8 mg/ml de Geneticina G418. No dia anterior ao ensaio, adicionou-se 5 mM de ácido n-butírico ao meio de cultura. Recolheu-se as células por centrifugação a 600xg à temperatura ambiente e ressuspendeu-se a uma concentração de lxl06/ml em meio RPMI 43 1640 contendo 5% de FCS inactivado sem vermelho de fenol. Verificou-se a expressão do receptor por análise FACS utilizando um anticorpo anti-CXCR3 marcado com um fluoróforo FITC, como se descreveu atrás.
Diluiu-se em série proteínas mutantes CXCL11 recombinantes (gama desde 10“6 até 1CT12 M) em 30 μΐ de meio RPMI sem vermelho de fenol e colocou-se nos poços inferiores e colocou-se um filtro (8 pm de tamanho de poro) sobre os mesmos, garantindo que não existem bolhas de ar retidas, antes de se selar o sistema. Colocou-se células L1.2 que expressam CXCR3 (25 μΐ de uma suspensão de células a 2,5xl04 células/ml no mesmo meio) nos poços superiores. Incubou-se a câmara durante 4 horas a 37 °C, sob 5% de C02. Rejeitou-se então a suspensão de células dos poços superiores e retirou-se o filtro. Transferiu-se as células nos poços inferiores para uma placa de 96 poços preta e congelou-se durante pelo menos lha -80 °C. Descongelou-se a placa e adicionou-se 200 μΐ/poço de uma mistura de um corante CyQUANT /tampão de lise celular (Molecular Probes) para enumerar o número de células que migrou. Contou-se a fluorescência com um leitor de placas Victor2 wallac. Os dados foram analisados utilizando o suporte lógico Prism® (GraphPad).
Resultados
As propriedades das proteínas mutantes da CXCLll-WT foram testadas utilizando-se de um ensaio à base de células. Os resultados obtidos num ensaio de quimiotaxia em células L1.2 modificadas para expressar o CXCR3 correspondem bem com os obtidos no ensaio de ligação ao receptor descrito acima. De acordo com a sua baixa 44 afinidade para o CXCR3, o mutante CXCL11-1B3 foi incapaz de recrutar células Ll.2 que expressam o CXCR3 (fig. 4). Os outros três mutantes foram menos activos do que a CXCLll-WT, mas foram ainda capazes de induzir uma resposta mensurável neste ensaio de quimiotaxia.
Exemplo 3: Ensaio com base em animais para a caracterização de uma proteína mutante de CXCL11 deficiente na ligação à heparina.
Materiais e métodos
Recrutamento celular peritoneal
Sensibilizou-se ratinhos Balb/C fêmea com 8 até 12 semanas de idade no dia 0. Todos os ratinhos receberam 5 injecções subcutâneas (4x50 μΐ em cada membro e 1x100 μΐ na nuca) de CPG-ODN 10 nM (Microsynth) misturado com 100 μρ de Ovalbumina (Sigma, Grade V) em PBS estéril. Após uma semana, induziu-se o recrutamento celular nos ratinhos Balb/C por injecção intraperitoneal de 10 μg (0,5 mg/Kg) de proteína CXCLll recombinante diluída em 0,2 ml de soro fisiológico estéril, sem lipopolissacáridos (0,9%). Quando as propriedades dos mutantes de CXCLll foram avaliadas, administrou-se as quantidades indicadas da proteína, diluídas em 0,2 ml da mesma solução estéril 30 minutos antes da administração do agonista. Sacrificou-se os ratinhos por aplicação C02 em aerossol 4 horas mais tarde, e efectuou-se a lavagem peritoneal com 5 ml de PBS três vezes. Juntou-se as lavagens e centrifugou-se a 1500xg durante 5 minutos, e ressuspendeu-se as células sedimentadas num volume final de 1 mililitro. Contou-se o 45 número total de leucócitos induzidos para cada amostra com um hemacitómetro.
Ensaio de Hipersensibilidade de Contacto Retardada
Efectuou-se o teste de dilatação da orelha de ratinho para medir a hipersensibilidade de contacto como descrito (Garrigue JL et al., 1994). Abreviadamente, pré-anestesiou-se ratinhos por via tópica aplicando 25 μΐ de uma solução de 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB; Sigma Chemical Co.) a 0,5% em acetona/azeite (4:1) ao abdómen barbeado. Cinco dias depois, aplicou-se 20 μΐ de DNFB a 0,2% no mesmo veiculo nas orelhas do lado direito, e veiculo sozinho às orelhas do lado esquerdo. Tratou-se os ratinhos diariamente desde o Dia 5 até ao 9 com uma administração intraperitoneal de 0,5 mg/kg de CXCL11-3B3 ou de veiculo sozinho no grupo de controlo. O primeiro tratamento foi administrado 1 hora antes da prova terapêutica com DNFB. Mediu-se a espessura da orelha com um paquímetro com parafuso (Mitutoyo Corp.) e estimou-se a dilatação da orelha subtraindo o valor antecedente à prova terapêutica do valor posterior à prova terapêutica, e subtraindo ainda qualquer dilatação detectada na orelha contralateral inoculada com veículo.
Resultados
Obteve-se mais evidências das propriedades in vivo das proteínas mutantes da CXCLll-WT fazendo uso de dois modelos animais.
Um primeiro ensaio foi um ensaio de recrutamento celular peritoneal (fig. 5). Uma vez que o CXCR3 é expressado em células Thl activadas, os ratinhos foram sensibilizados antes do ensaio com CpG-ODN para induzir uma 46 resposta das Thl. De acordo com a sua actividade fraca como proteína de ligação ao CXCR3 e a sua incapacidade para recrutar células in vitro, o mutante CXCL1-1B3 foi incapaz de recrutar células in vivo quando administrado no peritoneu. Tanto o CXCL11-2B3 como o CXCL11-4B4 apresentaram uma actividade fraca, mas o CXCL11-3B3 não foi capaz de induzir o recrutamento (fig. 5).
Testou-se em seguida a capacidade deste último mutante para inibir a CXCLll-WT in vivo (fig. 6). 0 CXCL11-3B3 não apresenta quaisquer propriedades de recrutamento por si só, mas tem propriedades agonistas consideráveis em relação à CXCLll-WT, no que se refere à indução de recrutamento celular no peritoneu, quando administrado anteriormente à mesma dose (10 pg/ratinho). Por conseguinte, a abrogação da ligação à heparina na CXCLll produz um antagonista capaz de inibir in vivo o recrutamento celular induzido pela CXCLll.
Finalmente, testou-se as propriedades de CXCL11-3B3 num modelo de inflamação cutânea, o ensaio de hipersensibilidade de contacto retardada. Esta inflamação cutânea específica para o hapteno é mediada por células I e gera uma dilatação mensurável após inocular ratinhos com o sensibilizador de contacto 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB) como hapteno. A dilatação induzida foi significativamente menor nos ratinhos tratados com uma administração intraperitoneal de CXCL11-3B3, quando comparada com o efeito observado em ratinhos tratados com veículo sozinho, ao longo do período de tratamento (fig. 7).
Dado os resultados obtidos nos exemplos da presente invenção, podem ser concebidos novos antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 com base nas 47 constatações deste pedido de patente, em particular mutantes da CXCLll humana, CXCL10 humana e CXCL9 humana deficientes na ligação à heparina contendo substituições únicas ou múltiplas dos aminoácidos básicos conservados na extremidade carboxilo, e, eventualmente, de outros residuos básicos conservados em uma ou mais quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 especificas e/ou um ou mais dos residuos básicos que lhe são adjacentes.
As propriedades de moléculas alternativas descritas no presente pedido podem ser testadas por qualquer um dos métodos descritos acima, ou fazendo uso de outras abordagens de validação conhecidas na técnica, como extensivamente revistas na literatura ("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 138, Humana Press, 2000; "Chemokine Receptors", Methods in Enzymology vol. 288, Academic Press, 1997). 48
QUADRO I
Aminoácido Grupo Sinónimo Grupos Sinónimos Mais Preferidos Ala Gly, Thr, Pro, Ala, Ser Gly, Ala Arg Asn, Lys, Gin, Arg, His Arg, Lys, His Asn Glu, Asn, Asp, Gin Asn, Gin Asp Glu, Asn, Asp, Gin Asp, Glu Cys Ser, Thr, Cys Cys Gin Glu, Asn, Asp, Gin Asn, Gin Glu Glu, Asn, Asp, Gin Asp, Glu Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Gly, Ala His Asn, Lys, Gin, Arg, His Arg, Lys, His Ile Phe, Ile, Vai, Leu, Met Ile, Vai, Leu, Met Leu Phe, Ile, Vai, Leu, Met Ile, Vai, Leu, Met Lys Asn, Lys, Gin, Arg, His Arg, Lys, His Met Phe, Ile, Vai, Leu, Met Ile, Vai, Leu, Met Phe Trp, Phe, Tyr Tyr, Phe Pro Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Pro Ser Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Thr Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Trp Trp, Phe, Tyr Trp Tyr Trp, Phe, Tyr Phe, Tyr Vai Met, Phe, Ile, Leu, Vai Met, Ile, Vai, Leu 49
QUADRO II
Aminoácido Grupo Sinónimo Ala D-Ala, Gly, Aib, B-Ala, Acp, L-Cys, D-Cys Arg D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-.Met, D-Ile, Orn, D-Orn Asn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Asp D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Cys D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Gin D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Glu D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln Gly Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, .beta.-Ala, Acp Ile D-Ile, Vai, D-Val, AdaA, AdaG, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leu D-Leu, Vai, D-Val, AdaA, AdaG, Leu, D-Leu, Met, D-Met Lys D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn Met D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Vai, D-Val Phe D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, ou 5-fenilprolina, AdaA, AdaG, cis-3,4, ou 5-fenilprolina, Bpa, D-Bpa Pro D-Pro, ácido L-I-tioazolidina-4-carboxílico, D- ou ácido L-l-oxazolidina-4-carboxílico Ser D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys Thr D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Vai, D-Val Tyr D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His Vai D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met, AdaA, AdaG 50
QUADRO III
Proteína Cromatografia em Heparina Cromatografia em MonoS Diferença entre a Heparina e a MonoS [NaCl] Concentração de eluição [NaCl] Diferença da CXCL11-WT [NaCl] Concentração de eluição [NaCl] Diferença da CXCL11-WT [NaCl] CXCL11-WT 0, 77 M - 1, 08 M - -0,31 M CXCL11-1B3 0, 72 M 0,05 M 0, 85 M 0, 23 M -0,18 M CXCL11-2B3 0, 64 M 0,13 M 0, 97 M 0, 11 M 0,02 M CXCL11-3B3 0, 44 M 0,33 M 0, 85 M 0, 23 M 0,10 M CXCL11-4B4 0, 62 M 0,15 M 1, 14 M -0,06 M 0,22 M 51
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<210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Phe Pro Met Phe Lys Arg Oly Arg Cys Leu Cvs He Gly Pro Gly Vai í 5 10 * 15
Lys Ala Vai Lys Va! Ala Asp He Glu Lys Ala Ser lie Met. Tyr Pro 20 ’ 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys lie Glu Vai líe lie Thr Leu Lys Glu Asn 35 40 45
Lys Gly G).n Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gin Afa Arg Leu Ile 50 55 60 lie Lys lys Val Glu Arg Lys Asn Phe 65 " * 70 <210> 2 <211> 73 54
<212> PRT <213> construção sintética <400> 2
Phe Pro Met Phe Ala Ala Gly Ala Cys Leu Cys lie Giy Pro Gly Vai 1 5 10 15
Lys Ala Vai Lys Vai Ala Asp He Glu Lys Ala Ser íle Met Tyr Pro 20 * 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys íle Glu Vai íle íle Thr Leu Lys Gíu Aso 35 40 ' 45
Lys Gly Gin Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gin Ala Arg Leu lie 50 55 60 íle Lys Lys Vai Glu Arg Lys Asn Phe 65 J 70
<210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> construção sintética <400> 3
Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly Vai 15 10 15
Lys Ala Vai Lys Vai Ala Asp Ile Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro 20 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Vai Ile Ile Thr Leu Ala Glu Asn 35 40 45
Ala Gly Gin Ala Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gin Ala Arg Leu Ile 50 55 60 íle Lys Lys Vai Gíu Arg Lys Asn Phe 65 70 <210> 4 55
<211> 73 <212> PRT <213> construção sintética <400> 4
Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly Vai 15 10 15
Lys Ala Vai Lys Vai Ala Asp lie Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro 20 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Vai Ile Ile Thr Leu Lys Glu Asn 35 40 45
Lys Gly Gin Arg Cys Leu Asn Pro Ala Ser Ala Gin Ala Ala Leu Ile 50 55 60
lie Lys Lys Vai Glu Arg Lys Asn Phe 65 70 <210> 5 <211> 73 <212> PRT <213> construção sintética <400> 5
Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly Vai 15 10 15
Lys Ala Vai Lys Vai Ala Asp Ile Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro 20 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Vai Ile Ile Thr Leu Lys Glu Asn 35 40 45
Lys Gly Gin Arg Cys Leu Asn Pro .Lys Sei* Lys Gin Ala Arg Leu Ile "50 ’ 55' 60 lie Ala Ala Vai Glu Ala Ala Asn Phe 65 70 56
< 210 > 6 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6
Vai Pro Leu Ser Arg Thr Vai Arg Cys Thr Cys He Ser He Ser Asn i 5 10 15
Gin Pro Vai Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Gl« He 11ε Pro Ala 20 25" 30
Ser Gin Phe Cys Pro Arg Vaí Glu lie He Ala Thr Meí Lys Lys Lys 35 40 45
Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala He Lys Asn Leu 50 55 * 60
Leu Lys Ala Vai Ser Lys Glu Mei Ser Lys Arg Ser Pro 65 ’ 70 75
<210> 7 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Thr Pro Vai Vaí Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys He Ser Thr Asn Gin } 5 10 15
Gly Thr He Hls Leu Gin Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gin Phe Ala Pro 20 25 30 57
Ser Pro Ser Cys Glu Lys íle Glu HS/Sie Ala Thr Leu Lys Asn Glv 35 40 * 45
Vai Gin Thr Cys Leu Asn Pro Àsp Ser Ala Asp Vai Lys Glu Leu He 50 55 60
Lys Lys Trp Glu Lys Gin Vai Ser Gin Lys Lys Lys Glu Lys Asn Gly 65 ’ 70 75 *80
Lys Lys His Gin Lys Lys Lys Vai Leu Lys Vai Arg Lys Ser Gin Arg 85 90 95
Ser Arg Gin Lys Lys Thr Thr 100
<210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 8
Phe Leu Met Phe Lys Gin Gly Arg Cys Leu Cys lie Gly Pro Gly Met 1 5 10 15
Lys Ala Vai Lys Met Ala Glu lie Glu Lys .Ala Ser Vai He Tyr Pro 20 25 30
Ser Asn Gly Cys Asp Lys Vai Glu Vai lie Vai Thr Met Lys Ala His 35 40 45
Lys Arg Gin Arg Cys Leu Asp Pro Arg Ser Lys Gin Ala Arg Leu lie 50 55 60
Met Gin Ala lie Glu Lys Lys Asn Phe Leu Arg Arg Gin Asn Met 65 70 75
Lisboa, 10 de Maio de 2007.

Claims (28)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Antagonistas de quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 consistindo de mutantes de CXCL11, CXCL10 ou CXCL9 nos quais pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições do alinhamento com a CXCL11 humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 46, 62, 66 e 70.
2. Antagonistas da reivindicação 1 em que a quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 é a CXCL11 humana e pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 49, 52, 57, 59, 67 ou 71.
3. Antagonistas da reivindicação 2 em que uma das combinações seguintes de resíduos básicos, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está substituída por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: a) 46, em conjunto com 49 e/ou 52; b) 62, em conjunto com 57 e/ou 59; c) 66 e 70, em conjunto com 67 e/ou 71; ou 2 d) 62 e 66, em conjunto com um ou mais dos seguintes: 57, 59, 67, 70 ou 71.
4. Antagonistas da reivindicação 2 ou 3 em que pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições do alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 5, 6, 8, 17, 20, 26 ou 38.
5. Antagonistas da reivindicação 1 em que a quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 é a CXCL10 humana e pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ou 75.
6. Antagonistas da reivindicação 5 em que uma das combinações seguintes de resíduos básicos, numerados com base nas posições do alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está substituída por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: a) 46 e 52, em conjunto com 47, 48 ou 51 ; b) 59 e 62 ; c) 66 e 70, em conjunto com 74 e/ou75 ; ou 3 d) 62 e 66, em conjunto com 59 e/ou 70.
7. Antagonistas da reivindicação 5 ou 6 em que pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base nas posições do alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 5, 8, 22, 26 ou 38.
8. Antagonistas da reivindicação 1 em que a quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 é a CXCL9 humana e o resíduo básico 67, numerado com base nas posições de alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina.
9. Antagonistas da reivindicação 8 em que uma das combinações seguintes de resíduos básicos, numerados com base nas posições do alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está substituída por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: a) 62, em conjunto com 66 e/ou 67; b) 66 e 67 ; ou c) 66 e 70, em conjunto com um ou mais dos seguintes: 67, 74 ou 75.
10. Antagonistas da reivindicação 8 ou 9 em que pelo menos um dos resíduos básicos seguintes, numerados com base 4 nas posições do alinhamento com a CXCLll humana madura, como se mostra na Figura 1B (SEQ ID No: 1), está adicionalmente substituído por Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Prolina, Ácido Glutâmico, Glutamina, Ácido Aspártico ou Asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ou 38.
11. Antagonistas das reivindicações 1 até 10 em que os resíduos básicos estão substituídos por Alanina ou Glicina.
12. Antagonistas da reivindicação 11 consistindo da sequência de CXCL11-2B3 (SEQ ID NO:3), CXCL11-3B3 (SEQ ID NO: 4) ou CXCL11-4B4 (SEQ ID NO: 5).
13. Antagonistas das reivindicações 1 até 11 em que foram adicionados, eliminados ou substituídos um ou mais aminoácidos pertencentes aos nove primeiros aminoácidos do domínio amino-terminal da quimiocina CXC de ligação ao CXCR3 humana madura.
14. Antagonistas das reivindicações 1 até 13 em que foram mutados um ou mais aminoácidos para diminuir as propriedades de agregação do referido antagonista.
15. Antagonistas das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 compreendendo as antagonistas das reivindicações 1 até 14, e uma sequência de aminoácidos pertencente a uma sequência de proteína que não a correspondente à quimiocina CXC de ligação ao CXCR3.
16. Antagonistas da reivindicação 15, compreendendo uma sequência de aminoácidos pertencente a uma ou mais 5 destas sequências de proteína: domínios extracelulares da proteína ligada à membrana, região constante da imunoglobulina, domínios de multimerização, proteínas extracelulares, proteínas contendo péptidos de sinalização, proteínas contendo sinais de exportação.
17. Antagonistas das reivindicações 1 até 16, em que o referido antagonista está na forma de conjugado ou complexo activo com uma molécula escolhida entre etiquetas radioactivas, biotina, etiquetas fluorescentes, agentes citotóxicos ou agentes de administração de fármacos.
18. Moléculas de ADN compreendendo as sequências de ADN que codificam os antagonistas das reivindicações 1 até 16 .
19. Vectores de expressão compreendendo as moléculas de ADN da reivindicação 18.
20. Célula hospedeira transformada com um vector da reivindicação 19, em que a célula hospedeira não é uma célula embrionária humana.
21. Utilização de qualquer um dos antagonistas das reivindicações 1 até 17, do ADN das reivindicações 18 ou 19 ou das células da reivindicação 20, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a migração e a activação excessivas de leucócitos. 6
22. Utilização da reivindicação 21 em que a doença é uma doença inflamatória, uma doença autoimune ou uma infecção.
23. Utilização da reivindicação 22 em que a doença é esclerose múltipla, artrite reumatóide, infecção pelo HIV-1, diabetes de tipo I ou rejeição de enxertos.
24. Utilização de qualquer um dos antagonistas das reivindicações 1 até 17, do ADN das reivindicações 18 ou 19, ou das células da reivindicação 20, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças que necessitam de um aumento da vascularização.
25. Utilização da reivindicação 24 em que a doença é uma doença cardíaca isquémica.
26. Utilização de qualquer um dos antagonistas das reivindicações 1 até 17, do ADN das reivindicações 18 ou 19, ou das células da reivindicação 20, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de cancro.
27. Processo de preparação dos antagonistas das reivindicações 1 até 14, compreendendo a cultura das células transformadas da reivindicação 20 e a colheita das proteínas expressadas.
28. Composição farmacêutica contendo um antagonista das quimiocinas CXC de ligação ao CXCR3 das reivindicações 7 1 até 17, o ADN das reivindicações 18 ou 19, ou as células da reivindicação 20, como substância activa. Lisboa, 10 de Maio de 2007.
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