CZ2003947A3

CZ2003947A3 - Zkrácený a mutovaný lidský chemokin

Info

Publication number: CZ2003947A3
Application number: CZ2003947A
Authority: CZ
Inventors: Amanda Proudfoot; Timothy N. C. Wells; Marie Kosco-Vilbois
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2003-11-12
Also published as: HK1062811A1; PT1326628E; UA77950C2; PL362350A1; JP3908165B2; CN1285381C; ATE265222T1; AU1591902A; KR100837898B1; KR20030034238A; EE200300139A; HRP20030215A2; DE60103078T2; MXPA03003008A; DK1326628T3; SK4062003A3; WO2002028419A2; EE05174B1; SI1326628T1; RS50738B

Description

Oblast techniky

Předkládaný’ vynález se zabývá mutantami CC chemokinů, které obsahují nejméně dvě mutace ve 40. smyčce a které, relativně k divokému typu molekuly, mají redukovanou vazebnou aktivitu GAG: ukazuje se, že takovéto mutované chemokiny jsou účinné při léčbě sklerosy multiplex a/nebo jiných demyelinizačnich onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Chemokiny tvoří třídu malých prozánětlivých cytokinů s leukocyty s chemotaktickými a aktivujícími vlastnostmi. V závislosti na umístění prvních konzervovaných cysteinů, může být třída chemokinů rozdělena na chemokiny C-C, C-X-C a C-X₃-C (Baggiolini M a spol., Adv. Immunol. 1994, 55:97-179; Baggiolini M. a spol., Annu Rev Immunol. 1997, 15:675-705; Taub

D. a spol., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4):355-76).

Mnoho C-X-C chemokinů, jako interleukin-8 (IL-8), je chemotaktických pro neutrofíly, zatímco C-C chemokiny jsou aktivní na různé leukocyty, které zahrnují monocyty, lymfocyty, eosinofily, basofily, NK buňky a dendritické buňky.

NH₂-terminální oblast chemokinů se účastní ve vazbě na receptor a NH₂ -terminální zpracování může bud' aktivovat chemokiny nebo je učinit kompletně inaktivní.

N-terminální varianty syntetických C-C chemokinů byly zkoušeny pro svoji aktivitu jako inhibitory nebo antagonisté přirozeně se vyskytujících forem. MCP-1, MCP-3 a RANTES, postrádající 8 až 9 NH₂-terminální aminokyseliny, jsou inaktivní na monocyty a jsou užitečné jako antagonisté • · . · . · · · ······· ·· ·· receptorů ( Gong JH a spol., J Exp Med. 1995, 181(2):631-40 a Gong JH a spol., J Biol Chem. 1996, 271(18):10521-7).

Prodloužení RANTES jedním methioninem vede ve skoro kompletní inaktivaci molekuly a Met-RANTES se chová jako antagonista pro autentický RANTES (Proudfoot AE a spol., J Biol Chem. 2. února 1996,-271(5):2599-603).

WO 99/16877 se zabývá aminoterminálními zkrácenými RANTES, které postrádají NH₂-terminální aminokyseliny, které odpovídají zbytkům aminokyselin 1, 1-2, 1-3 nebo 1-4 přirozeně se vyskytujících RANTES a které mají antagonistické účinky pro chemokiny. Dokument se týká také kódových sekvencí pro aminoterminální zkrácené RANTES, týká se jejich užití v terapii a/nebo diagnose nemocí, u kterých je požadován antagonistický účinek pro chemokiny. RANTES ((3-68) je výhodným zkráceným antagonistou chemokinů.

I když chemicky atraktivní účinnost RANTES a CC chemokinů byla obecně zkoumána zejména ve spojeni se specifickou membránou receptorů, může RANTES také vzájemně reagovat s glykosaminoglykany (GAGs), vysoce variabilními rozvětvenými cukernými skupinami přidanými post-translačně k některým proteinům, které jsou obecně nazývané proteoglykany (PGs). Takovéto proteiny jsou přítomny na buněčné membráně, v mezibuněčné hmotě a v krevním oběhu, kde mohou být také přítomny izolované GAGs.

Interakce s GAGs je obecná vlastnost mnoha rozpustných molekul signálních pro buňky (interleukiny, růstové faktory). PGs nebo izolované GAGs mohou tvořit komplex s rozpustnými molekulami, pravděpodobně za účelem ochrany takovýchto molekul před proteolýzou v extracellulárním prostředí. Bylo uvažováno, že GAGs mohou pomáhat správnému dodání molekul signálních buněk *· ·· » ···· • · • · · · • · ···· ··· k jejich specifickým receptorům a eventuelně také mohou GAGs modulovat činnost cílových buněk.

V případě chemokinů jsou koncentrace imoblizovaných gradientů v místě zánětu a následně interakce s receptory buněk a jejich aktivační stav patrně modulovány různými formami GAGs(Hoogewerf AJ a spol., Biochemistry 1997, 36(44):13570-8). Tudíž bylo předpokládáno, že modulace takovýchto interakcí může představovat terapeutický přístup u zánětlivých onemocnění (Schwarz MK a Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 3(4):407-17) a u HIV infekce (Bums JM a spol. Proč Nati Acad Sci USA 1999, 96 (25) :14499-504) .

Strukturální požadavky a funkční účinky spojení GAGRANTES byly zkoumány v různých modelech. RANTES váže GAGs na endoteliální buňky lidské pupeční žíly (HUVECs) v mikromolekulárních koncentracích s afinitou a vyšší specifičností než jiné chemokiny, jako MCP-1, IL-8 nebo MIPlalpha. Taková spojení se nejeví jednoduše elektrostatická, ale také závisí na dalších parametrech jako je délka a N-sulfatace a O-sulfatace GAGs (Kuschert GS a spol, Biochemistry 1999, 38(39):12959-68). Defektivní buněčné linie GAGs ještě mohou vázat chemokiny, ale přítomnost povrchu buněk GAGs značně zvyšuje jejich účinnost na receptory pokud jsou v nízkých koncentracích (Ali S a spol., J. Biol Chem 2000, 275(16):117217). Další pokusy ukazují, že GAGs, zejména heparin-sulfát, usnadňují spojení RANTES s povrchem buněk makrofágů a následnou inhibici infekce HIV. Což je výsledek, který je konzistentní se známým odporem těchto buněk, u nichž nesnadno dochází k expresi heparin-sulfátu pro antivirové účinky RANTES (Oravecz T a spol., J. Immunol. 1997, 159(9):4587-92).

Rozpustné GAGs se dostávají do kompetice s buněčnou membránou GAGs a mohou působit jako specifické inhibitory aktivace povrchu vyvolanou RANTES (Appay V. a spol; Int Immunol ·· ····

2000, 12(8):1173-82), nebo mohou působit jako potlačovatelé infekce HIV (Burns JM a spol; Proč Nati Acad Sci U S A 1999,96(25) :14499-504) .

Některé studie struktury-funkce se snažily identifikovat oblast RANTES odpovědnou za spojení s GAGs, jelikož odpovídající sekvence (BBXB, kde B je hlavní zbytek a X může být některý zbytek) je příliš generická. Studie s mapováním epitopu byla provedena za použití monoklonálních protilátek zvýšených proti rekombinantním lidským RANTES, schopným zamezovat obojímu- antivirovým účinkům a mobilizaci intracelulárního vápníku zprostředkovanou RANTES (Burns JM a spol., J Exp. Med. 1998, 188(10):1917-27). Tento přístup umožnil definovat zbytky 55-66 nezbytné jak pro činnosti tak pro interakci GAG, uvádějící důvody, že interakce GAG může mít doplňkovou nebo odlišnou funkci zprostředkovanou některými receptory, jak také uvedeno ve studii na variantách RANTES s upravenými vlastnostmi agregace /Appay V a spol., J Biol chem 1999, 274 (39) :27505-12) .

Oblast 55-66, která představuje segment C-terminální alfa-šroubovice, je shodná s GAG vázající oblast jiných chemokinů, jako je IL-8(Witt DP a Lander AD, curr. Biol. 1994, 4(5):394-400), a obsahuje kationtové místo, které obsahuje lysin a arginin (KKWVR). Taková vazebná oblast je odlišná od vazebného místa pro buněčné receptory, které je umístěno v Nzakončení, (Pakianathan DR a spol., Biochemistry 1997, 36(32):9642-8) a obsahuje některé zbytky zahrnuté v agregaci monomerů RANTES, dokonce ačkoliv takové desagregující mutace neovlivňují účinek interakce s GAGs (Czaplewski LG a spol., J. Biol. Chem. 1999, 274 (23) :16077-84;WQ 98/13495) .

RANTES obsahuje jiné kationtové místo (RKNR) ve zbytcích 44-47, které je konservováno v oblasti GAGs vázající jiné chemokiny, jako je Mip-la(Koopmann W a Krangel MS, 3.Biol.

•0 0···

Chem. 1997, 272(15):10103-9) a MIP-Ιβ (Koopman W a Spol., 3 Immunol. 1999, 163(4):2120-7).

Varianty lidského RANTES, které obsahují jedinou mutaci v kationtových místech, byly popsány jako antagonisté RANTES mající potenciálně terapeutická použití při léčení infekce HIV a při léčení zánětlivých nebo alergických onemocnění (WO 99/33989).

Ukázalo se také, že pouze trojitá mutanta RANTES, ve které tři zbytky v poloze 44, 45 a 47 byly nahrazeny alaninem, má ztracenou schopnost vázat GAG (A.Proudfoot a spol., Chemokine Gordon Conference, Session I, 24. července 2000).

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že CC chemokiny, které obsahují nejméně dvě mutace v kationtovém místě takzvané „40. smyčky, jsou účinné v léčení sklerózy multiplex a/nebo jiným demyelinizačních onemocnění. Toto místo představuje konzervované motif, schopné vazby na GAG u CC chemokinů (jako RANTES, ΜΙΡ-lalfa a ΜΙΡ-lbeta, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309, MCP2) . Všechny tyto mutanty chemokinů mají redukovanou vazebnou činnost GAG ve srovnání s divokými typy odpovídajících molekul.

Oblast, ve které budou přítomny nejméně dvě mutanty, podle vynálezu, takzvaná 40. smyčka, je označená pro řadu chemokinů na obr. 1. Zejména trojitá mutanta RANTES, ve které byly nahrazeny alaninem tři basické zbytky v poloze 44, 45 a 47, vykazovala účinnost na živočišném modelu pro léčení sklerosy multiplex. Tato trojitá mutanta RANTES vykazuje účinek závislý na dávce u myšího modelu EAE a srovnatelnou účinnost k referenčnímu léčení s rekombinatním IFN-beta. Analogické výsledky byly získány se zkrácenou trojitou mutantou RANTES, ve které byly nahrazeny alaninem tři zbytky v poloze 44, 45 a 47 a ·· ···« které postrádají první 2 N-terminální aminokyseliny. Tato zkrácená mutanta RANTES (mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 3) je nová a představuje další předmět vynálezu.

Podobný experimentální důkaz byl vytvořen ve spojení s trojitými mutantami ΜΙΡ-lalfa a ΜΙΡ-lbeta, které jsou již známy a které jsou zde označované jako MIP-1(X trojitá mutanta R18A-R46A-R48A (Koopman W a Krengel MS., J. Biol Chem. 1997, 272(15):10103-9) a jako MIP-Ιβ trojitá 40.mutanta K45A-R46AK48A (Laurence JS, Biochemistry 2001, 40:4990-4999).

Výrazem „redukovaná vazebná činnost GAG se míní, že mutanty, podle vynálezu, mají nižší schopnost vázat GAGs, tj . nižší procento každé z mutant váže GAGs (jako heparinsulfát) vzhledem k odpovídajícímu divokému typu molekuly.

Výhodnější jsou mutanty lidského RANTES, ve kterých tři basické zbytky aminokyselin v poloze 44, 45 a 47 divokého typu molekuly byly nahrazeny jinými aminokyselinami. Takové zbytky mohou být nahrazeny s malými alifatickými nepolárními nebo slabě polárními zbytky, jako je například Ala, Ser, Thr, Pro a Gly. Nejvýhodnější z nich je alanin.

Mutanty RANTES, které byly zjištěny jako zejména účinné v léčení MS, jsou takové mutanty které mají sekvencí aminokyselin jak je uvedeno SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO: 3.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je užití mutant chemokinů, jak jsou výše definovány, k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení sklerosy multiplex a/nebo jiných demyelínizačnich onemocnění.

Sklerosa multiplex (MS) je pomalu postupující onemocnění CNS, charakterizované diesminovanými ložisky demyelínizace v mozku a míše, vedoucí v mnohočetné a různé neurologické • 4

44·· • 4 4444 *

4 44

4 4

44 symptomy a příznaky, obvykle s remisemi a exacerbacemi (viz The Merck Manual, šestnácté vydání).

Příčina je neznámá, ale předpokládá se imunologická abnormalita s několika klubky nyní udávajícími specifický mechanismus. Předpokládané příčiny zahrnují infekci pomalými latentními viry a myelinolysu enzymy. Obvykle je zvýšeno IgG v GSF a bývají zvýšené titry spojené s různými viry, které zahrnují virus spalniček. Význam těchto objevů s uváděnými spojeními s alotypy HLA a změněným množstvím T buněk je nejasný, ježto důkazy jsou poněkud sporné. Zvýšený rodinný výskyt předpokládá genetickou vnímavost; ženy jsou poněkud častěji postiženy než muži. Ukazují se být přítomny i faktory zevního prostředí. Ačkoliv v začátku onemocnění je věk od 20 do 40 let, MS byla spojena s geografickou oblastí, kde pacient strávil prvních 15 let. Znovu zjištění po 15ti letech věku nemění riziko.

Plaky nebo ostrůvky demyelinizace s destrukcí oligodendroglií a perivaskulární zánět jsou diseminovány v CNS, především v bílé hmotě, s predilekcí pro laterální a zadní provazce (zejména v cervikálních a dorsálních oblastech), optické nervy a periventrikulární oblasti. Trakty v mezimozku, pontu a mozečku jsou také postiženy a může být postižena šedá hmota v mozku a míše.

Těla buněk a axony jsou obvykle chráněny, zejména u časných poškození. Později mohou být axony poškozeny, zejména v dlouhých traktech a fibrosní gliosa uděluje traktům jejich „sklerotický vzhled. Obojí, časné i pozdní poškození, může být zjištěno současně. Chemické změny v lipidových a proteinových složkách myelinu jsou dokázány v plácích a kolem plaků.

φφ ···

·· ···· φφφ φφ ·· φ φ φ · φ · ·· φ · φφφφ φφ·

Onemocnění je charakterizováno různými postiženími a projevy dysfunkce CNS, s remisemi a stále se opakujícími exacerbacemi.

Nejvíce citlivou diagnostickou zobrazovací technikou je magnetická rezonance (MRI); může ukazovat mnoho plaků. Poškození také mohou být viditelná na CT se zvýšeným kontrastem.

Terapeutické pokroky u sklerosy multiplex (MS) vznikají pomalu, částečně proto, že není kompletně známá patogeneze Pro empirickou léčbu zahrnují hlavní překážky onemocněni postupu vysoce variabilní průběh MS, dlouhodobý charakter nej důležitějších výsledných měření a nedostatek objektivních znaků účinku léčby, zejména v krátkém období.

Ačkoliv patogeneze MS zůstává nejistá, skutečný původ je dále zkoumán. Byla vypracována objektivní výsledná měření, založená na magnetické rezonanci (MRI) a řada nebezpečí klinických pokusů, které vedly ke zdokonaleným způsobům a lepší interpretaci výsledků, je neznámá.

Dalším předmětem, podle vynálezu, je tudíž způsob léčení MS podáváním účinného množství mutant chemokinů, podle vynálezu, spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.

„Účinné množství se týká množství účinných složek, které je schopné ovlivnit průběh a závažnost onemocnění, vedoucí k redukci remisí takové patologie. Účinné množství bude záviset na způsobu podávání a stavu pacienta.

Dalším předmětem, prostředky pro léčbu onemocnění, obsahující v přítomnosti jedné pomocných látek.

nebo více farmaceuticky přijatelných podle vynálezu, jsou farmaceutické

MS a/nebo jiných demyelinizačních mutanty chemokinů, podle vynálezu, ·♦·♦ • · «4 4·*·

4

4 44 • 4 4 4 4 • 4 4 4 ·

4 4 «4 4

4 « · · ,, Farmaceuticky přijatelný se rozumí, že je zahrnut některý nosič, který neinterferuje s účinností biologické aktivity účinné složky a který je netoxický pro hostitele, kterému je podáván. Například, pro parenterální podávání, mohou být výše uvedené účinné složky zpracovány v dávkovači formě pro injekce v nosném prostředí jako je fysiologický roztok chloridu sodného, roztok dextrózy, sérum albuminu a Ringerův roztok.

Mimoto farmaceuticky přijatelné nosiče, prostředky, podle vynálezu, mohou také obsahovat malé množství pomocných látek, jako jsou stabilizátory, pomocné prostředky, pufry a konzervační látky.

Podávání takovýchto účinných složek může být intravenosní, intramuskulární nebo podkožní cestou. Jiné způsoby podávání, které mohou vytvářet požadované krevní hladiny, pokud se týká složek, jsou zahrnuty ve vynálezu.

Optimální dávka účinné složky může být vhodně vybrána podle způsobu podávání, stavu pacienta a vlastností pacienta (pohlaví, věk, tělesná hmotnost, zdraví, rozměry), rozsahu symptomů, souběžných léčení, frekvence léčení a požadovaného účinku. Úprava a manipulace stanovených dávkovačích rozmezí jsou plně ve. způsobilosti ošetřujících lékařů.

Obvykle může být denní dávka účinné složky kolem 0.01 až 100 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti. Obvykle je účinné k získání požadovaných výsledků 1 až 40 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti a den podávané v rozdělených dávkách nebo ve formě s postupným uvolňováním. Další nebo následující podávání mohou být provedena v dávce, která je stejná, menší nebo větší než počáteční dávka nebo předcházející dávka podávaná pacientovi.

Φ· ·*φ φ φ * φφ ·Φ·Φ t « ♦ ··♦ φφ • φ · • φ φφ • · φ φ

φ φ · φ

ΦΦ φ φ φ φφφ φ

φ φ

» φ

Předkládaný vynález byl popsán v souvislosti ke specifickým provedením, avšak podle obsahu popisu je možno uskutečnit řadu modifikací a substitucí, které uskuteční každý odborník , aniž by se odchýlil od smyslu vynálezu.

Vynález bude nyní popsán cestou nelimitujících příkladů.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Představuje srovnání některých příkladů CC chemokinů, vyrovnaných v hladině 40. smyčky. Tento proteinový segment a kationtové místo, které odpovídá motifu, schopnému vazby na GAG, jsou v rámečku.

Obrázek 2: Ukazuje mapu plasmidu, použitého ke klonování divokého typu RANTES a jeho mutant, podle příkladů.

Obrázek 3: Ukazuje výsledky Kompetitivní vazné zkoušky (^12SI)-RANTES a mutant heparinu ve zkoušce s kuličkami s obsahem heparinu.

Obrázek 4: znázorňuje Kompetitivní zkoušku na rovnovážný stav RANTES a trojité 40. mutanty RANTES.

Obrázek 5: Ukazuje indukci monocytů a chemotaxe T buněk prostřednictvím RANTES a trojité 40. a 50. mutanty RANTES.

Obrázek 6: ukazuje inhibici příjmu peritoneálních buněk trojitou 40. mutantou RANTES.

Obrázek 7: znázorňuje inhibici RANTES indukovanou příjmem peritoneálních buněk zkrácenou trojitou 40. mutantou RANTES (368), produkovanou v Pichia pastoris.

Obrázek 8: znázorňuje inhibici ΜΙΡ-Ιβ indukovanou příjmem peritoneálních buněk prostřednictvím MIP-Ιβ trojité 40.mutanty (K45A-R46A-K48A).

ΑΑ AAAA A ·

A AA·

Obrázek 9: ukazuje inhibici MIP-la indukovanou příjmem peritoneálních buněk prostřednictvím MIP-1(X trojité mutanty (R18A-R46A-R48A).

Obrázek 10: znázorňuje inhibici thioglykolátu indukovanou příjmem buněk prostřednictvím trojité 40. mutanty RANTES.

Obrázek 11: ukazuje inhibici začátku experimentální autoimunitní encefalomyelitis prostřednictvím všech 40. trojitých mutant RANTES, podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

1.Materiály a metody

a) Tvorba mutant RANTES bez vazby na heparin

Mutagenese RANTES byla dosažena inversní PCR-technikou. Bodové mutace byly vloženy do jednoho nebo dvou primerů použitých k hybridizaci kódové sekvence lidských RANTES v opačném pořadí (GenBAnk acc., No. NM 002985) . Za účelem zlepšení účinnosti navázání primeru (zejména pokud byly do primerů vloženy mnohočetné mutace) byla DNA denaturována basemi. Denaturovaná DNA byla zředěna na koncentraci přibližně 10 pg na reakci, aby nedošlo k zařazení nemutované DNA do transformační reakce.

Číslování aminokyselin, udané v příkladech a popisu, bere v úvahu zralý protein, to znamená začíná Ser, kterým je aminokyselina v poloze 24 podle popsané sekvence. Tudíž, aby byla výborná shoda mezi čísly aminokyselin v seznamu a v příkladech, je nutné přidat 23 k číslům v příkladech nebo v popisu.

Sekvence mutagenních primerů použitých jak následuje a sekvence mutovaných basí jsou podtrženy:

• · · ···· ·· ···· · ··· · · • · · · ·· ··· · • · · · · · ··· £2 ···· ··· ·· ·· ··

R44A(negativní)

5'-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3' : Pl

R44A(pozitivní)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3 : P2

K45A(negativní)

5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3': P3

K.45A (pozitivní)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3 ' : P4

R47A(negativní)

5'-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3' : P5

R47A(pozitivní)

5'-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG- 3 ' : P 6

R44A-K45A-R47A(trojitá 4O.mutanta, negativní) ' -TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC - 3 : P7

R44A-K45A-R47A (trojitá 40. mutanta, pozitivní)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3 ' : P8

K55A(negativní)

5'-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3 ' : P9

K55A(pozitivní)

5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3' : P10

K56A(negativní)

5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3 ' : Pil

K56A(pozitivní)

5'-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3' : P12

R5 9A(negat ivní) ' -AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC - 3 ' : P13

R59A(pozitivní)

-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3 ' : P14

K55A-K56A-R59A(trojitá 50. mutanta, negativní) ' -GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3 ' :

K55A-K56A-R59A(trojitá 50.mutanta, pozitivní)

P15

4 44 • · 4444 444

4444444 44 44 44 44

5-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3 : P16

Amplifikace byla vytvořena v DNA termálním cyklickém zářízení(Perkin-Elmer-Cetus 480) pro 35 cyklů za použití pfuturbo® DNA polymerázy(Stratagene). DNA byla spojena a transformována do Top 10F'příslušných buněk E. coli (Invitrogen). Sekvence mutant byla ověřena sekvencí DNA.

b)Exprese a purifikace divokého typu (WT)RANTES a mutant RANTES v E.coli.

Fragmenty DNA se získají PCR, jak objasněno výše a klonují se do plasmidů pET24d (obr.2) tvořícího řadu vektorů.

WT nebo kódovací sekvence mutovaného RANTES se klonuje do 3zakončení promotoru PT7 mezi místy působení Xbal a Nhel/Xhol.

Plasmid obsahuje dva markerové geny (Km a lacl) a účinný začátek cyklu (Ori fl).

Výsledné vektory se použijí k opětné transformaci BL21(DE3) kmenu E-coli, která umožňuje silnou expresi proteinu za použití systému PT7/Lacl. Exprese proteinu se indukuje přidáním 1 mM isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) ke kultuře. Buňky se oddělí a opět suspendují v pufru pro lysu (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl₂, 5 mM benzamidinu/HCl, 1 mM DTT,

0.1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu (PMSF), Dnase 20 mg/1). Buňky se rozruší třemi průchody přes tlakovou jednotku French Pressure Cell unit. Poté se suspenze centrifuguje při 10,000 x g za 30 min. při 4°C. Usazenina inklusních tělísek, obsahující WT RANTES nebo jednu z mutant RANTES, se rozpustí v 0.1 M Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 6M guanidinu/HCl a 1 mM DTT a míchá se po dobu 30ti minut při 60°C. Roztok se dialyzuje proti 3 podílům 1% kyseliny octové. Nerozpustné složky se odstraní centrifugací při 10,000 x g za 30 minut. Supernatant obsahující WT RANTES nebo jednu z mutant RANTES se lyofilizuje.

• · · * · ·· ···· · · ·· • · · · · · · ·· • · · · · · · · · · • ··· · · · · · a

Lyofilizovaný prášek se rozpustí v 0.1 M Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 6M guanidinu/HCl a lmM DTT za vzniku koncentrace přibližně 1 mg/ml. Proteiny se renaturují ředěním po kapkách na 10ti násobný objem roztokem guanidinu v 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, obsahujícím 0.01 mM oxidovaného glutathionu a 0.1 mM redukovaného glutathionu. Roztok se míchá přes noc při 4°C. Nerozpustné složky se odstraní centrifugací 10,000 x g za 30 minut. Kyselinou octovou se pH udržuje na 4.5 a vodivost se udržuje na 20 ms ředěním s vodou. Roztok se aplikuje do sloupce HiLoad S 26/10 především udržováním v 20 mM octanu sodném, pH 4.5 a protein se promyje lineárním gradientem 0-2'M NaCl ve stejném pufru. Frakce, obsahující WT RENTES nebo jeden z proteinu mutanty RRANTES, se spojí, opět se dialyzují proti třem podílům kyseliny octové a lyofilizují se.

Lyofilizované proteiny se rozpustí v 50 mM Tris/HCl pufru, pH 8,0. Vedoucí sekvence MKKKWPR, odvozená od klonovacího postupu, se rozštěpí z WT RANTES nebo z některého z proteinů mutanty RANTES přes noc při teplotě 37°C inkubací s endoproteinázou Arg-C (1:600 enzym:substrátu, procenta hmotnostní). Rozštěpené proteiny se oddělí od nerozštěpených proteinů chromatografií na kationtoměniči na sloupci HiLoad. S 26/10 předtím v rovnovážném stavu ve 20 mM octanu sodného, pH 4,5,obsahujícím 6 M urey, a proteiny se promyjí s lineárním gradientem 0-2M NaCl ve stejném pufru. Rozštěpené frakce se spojí a dialyzují proti dvěma podílům 1% kyseliny octové a nakonec proti 0.1% kyselině trifluoroctové a poté se frakce lyofilizují (Edgerton MD a spol., str. 33-40 a Proudfoot AE a spol., str. 75-87, v „Chemokine Protocols, Methods in Molecular Biology 2000, vol. 138, Humana Press) .

Pravost WT a proteinů mutanty RANTES se ověří hmotovou spektrometrií. Analogickými postupy se produkují další mutanty, které obsahují Met jako extenzi NH₂-konce, zrovna tak jako • · · · · · jednoduché nebo trojité 40. mutanty RANTES a jednoduché nebo trojité 50. mutanty RANTES.

c)Exprese a purifikace divokého typu (WT) RANTES a mutant RANTES v Pichia pastoris

Zralá trojitá 40. mutanta RANTES (R44A-K45A-R47A) se vytvoří užitím megaprimeru založeném mutagenezí PCR (Datta AK, Nucleic Acid Research 1995, 23(21):4530-31). Trojitá 40. mutanta RANTES se klonuje do vektoru pro expresi Pichia Pastoris, pPIC9K, v rámci s Mat alfa pre-pro signálního peptidu S. cerevisiae.

Po ověření sekvence se plasmid přemístí elektroporací do hostitelského kmene Pichia Pastoris GS115(his4). His positivní klony se třídí pro expresi mutanty RANTES. Sledování exprese v malém měřítku se provede použitím standardních postupů popsaných v Pichia Expression Kit z Invitrogen (Life Technologies). Stručně, kultura se rozvine v obohaceném nosném prostředí za použití glycerolu jako zdroje uhlíku, poté se kultura usadí a opět suspenduje v nosném prostředí, které k indukci exprese proteinu mutanty RANTES obsahuje metanol. Sekrece mutanty RANTES v nosném prostředí se prokáže na SDSPAGE při barvení modří Coomassie.

Pro přeneseni do velkých třepacích lahví se použije klon tvořící vysoké hladiny mutanty RANTES (přibližně 500-750 mg/1). Fermentované živné prostředí se centrifuguje při 5,000 otáčkách za minutu a supernatant se použije pro purifikaci.

Protein se čistí ze supernatantu jednoduchou chromatografií na sloupci sepharosy s heparinem, v rovnovážném stavu v 0.1 M Tris-HCl a promytém s lineárním gradientem 0-2 M NaCl ve stejném pufru za použití 20ti objemů sloupce. Pravost proteinu se ověří hmotovou spektrometrií. Bylo zjištěno, že • » ·· ·· · ·· · • · * · · · · • · · · · · · v takovémto systému takto vytvořená mutanta RANTES(R44A-K45AR47A) je také zkrácena v N-konci vzhledem k divokému typu molekuly, to znamená, že chybí první 2 aminokyseliny. Takto získaná mutanta byla tudíž určena jako trojitá 40. mutanta (R44A, K45A, R47A) RANTES (3-68) a její sekvence aminokyselin odpovídá SEQ ID NO:3.

d)Zkoušky vazby heparinu

Chromatografie heparinu na sepharosu se provede za použití 50 pg WT nebo proteinů mutovaného RANTES, které jsou naplněny do sloupců sepharosy s heparinem v rovnovážném stavu v 25 mM Tris/HCl, pH 8,0 a 50 mM NaCl a jsou promyty s lineárním gradientem 0-2 M NaCl v 25 mM Tris/HCl, pH 8.0.

Chromatografie heparinu na sepharosu se provede za použití 50 pg WT nebo proteinů mutovaného RANTES, které jsou naplněny do Mono S sloupce kationtoměniče v rovnovážném stavu v 50 mM octanu sodného, pH 4.5. Protein se promyje s 0-2 M gradientem NaCl.

Zkouška na kompetitivní vazbu se provede s použitím WT RANTES, trojité 50. mutanty RANTES a trojité 40. mutanty RANTES (SEQ ID NO: 2 - také zde označenou jako „R44A-K45A-R47ARANTES) , která je radioaktivně značená s ¹²⁵I při specifické účinnosti 2200 mCi/mol. Filtrační plotny s 96 vyhloubeními se napustí vazebným pufrem (50 mM HEPES, pH 7.2, obsahující 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ , 0.15 M NaCl a 0.5% BSA) . Sérií ředění heparinu ve vazebném pufru se dosáhne rozmezí koncentrací od 20 mg/ml až 1 pg/ml. Zkouška se provede v celkovém objemu lOOpl přidáním 25 pl roztoků heparinu, 25 pl 0.4 nM (¹²⁵i)-chemokinu, 25p kuliček heparinu (0.2pg/ml ve vodě) a 25 pl vazebného pufru do každého vyhloubení. Zkoušky se provedou třikrát. Plotny se inkubují při teplotě místnosti s mícháním po dobu 4 hodin. Filtrační plotny se k odstranění nevázaného značeného chemokinu promyjí třikrát • · • · s 200 μΐ promývacího pufru za použití vakuového čerpadla. Poté se do každého vyhloubení přidá 50 μΐ scintilační kapaliny a spočítá se radioaktivita (1 min/vyhloubení) . Údaje se analyzují za použití Softwaru-GraFit.

e) Zkoušky na kompetitivní rovnovážnou vazbu na receptor

Zkoušky se provedou za použití metody SPA (Scintillation Proximity Assay) s použitím (¹²⁵i) -mip-1(x jako značení na membránách z CHO po transfekci, u nichž dochází k expresi CCR1 nebo CCR2. Kompetitory se připraví sérií ředění neznačených chemokinů ve vazebném pufru k pokrytí rozmezí 10'⁶-10'¹² M. Použitý vazebný pufr je 50 mM HEPES, pH 7.2, obsahující 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ , 0.15 M NaCl a 0.5% BSA. Kuličky pro SPA z pšeničných klíčků (Amersham) se rozpustí v PBS na 50 mg/ml a zředí se ve vazebném pufru na 10 mg/ml. Konečná koncentrace je ve zkoušce 0.25 mg/vyhloubení. Membrány připravené z CHO buněk expresí CCR1 nebo CCR2 se skladují při -80°C a zředí se ve vazebném pufru na 80 pg/ml . Odpovídající objemy membrány a zásobních kuliček se před vykonáním zkoušky pro redukci pozadí míchají. Konečná koncentrace membrán je 2g/ml a konečná koncentrace (¹²⁵i)-MiP-loc je 0.1 nM. Plotny se inkubují při teplotě místnosti s mícháním po dobu 4 hodin. Radioaktivita se měří a údaje se analyzují jak popsáno ve zkoušce vazby na heparin.

f) Zkoušky chemotaxe

Chemotaxe monocytů byla provedena za použití zkušební komůrky micro-Boyden. Monocyty se vyčistí z barevného povlaku za použití následujícího izolačního postupu: 100 ml roztoku barevného povlaku se zředí 100 ml PBS, navrství se na Ficoll a centrifuguje se při 600 x g po dobu 20ti minut při teplotě místnosti. Buňky, které tvoří dělící plochu se seberou, promyjí se dvakrát s PBS a opět se suspendují při koncentraci 40-100x ·· ··«· ·· ·· ·· >··· ··· · ♦ · · · · · • »·· · · ·· · · ·

10⁶/ml v nosném prostředí RPMI 1640, obsahujícím 5% inaktivovaného zárodečného telecího séra (FCS), 2 mM glutaminu a 25 mM HEPES, pH 7.2. Buňky se dále čistí od frakce lymfocytů přidáním 10⁶ ovčích červených krvinek/ml, zpracovaných přes noc při 4°C na rosety, a oddělí se druhým gradientem Ficoll za odstředění při 900 x g po dobu 20ti minut při teplotě místnosti. Monocyty se nalézají na dělící ploše mezí Ficoll a pufrem a T buňky jsou v usazenině. Monocyty se promyjí v PBS a opět se suspendují v 2.5 x 10⁶/ml v nosném prostředí RPMI 1640. Čistota se měří přímým a bočním rozptylem FACS analýzou a zjistilo se, že 40-80% je v závislosti na donoru. Chemokiny se zředí na konečný objem 30 μΐ, pokrytí rozmezí koncentrace 10'^s10'¹² M v nosném prostředí RPMI se umístí do nižších vyhloubení. Filtr s velikostí pórů 5 pm pro monocyty (Neuroprobe) a 8 pm pro T buňky, zajištující, že nebudou vzduchové bubliny a že systém nebude neprodyšně uzavřen, se umístí nad nižší vyhloubení. Padesát mikrolitrů buněčné suspenze (2.5 x 10^sbuněk/ml) v nosném prostředí RPMI se umístí v horních vyhloubeních. Komora se inkubuje po dobu 30ti minut pro monocyty a 1,5 hodiny pro T buňky při 37°C pod kyslíkem. Buňky se odloží, horní povrch membrány buněk se očistí a membrány se promyjí PBS. Membrány se fixují ponořením do MeOH po dobu 1 minuty, suší se na vzduchu a obarví se Fieldovým roztokem A a B. Migrující buňky se spočítají volbou náhodných polí pro každé vyhloubení 20ti násobně zvětšeny na standardním mikroskopu, který je vybavený analyzátorem obrazu IBAS. Údaje se získají za použití softwaru-Gra-Fit.

g) Zkoušky peritoneálního přijmu buněk

V první zkoušce se příjem buněk indukuje intraperitoneální injekcí íopg chemokinů ředěných v 0.2-ml sterilního izotonického roztoku chloridu sodného (NaCl-prostý LPS) do samičích BALB/c myši 8 až 12 týdnů starých. Mutanty

4444

4 4 4 4 · * · · · 4 · 4 44

4444 4 444 4 4 4 chemokinů (10 pg ředěných chemokinů V 0.2 ml sterilního roztoku chloridu sodného) se podává 30 minut před podáním agonisty. O šestnáct hodin později se myši usmrtí plynným CO₂. Peritoneální laváž se provede 3 promytími s 5 ml PBS a laváže se slijí. Buňky se centrifugují při 600 x g po dobu 10ti minut, opět se suspendují v konečném objemu 1 ml a celkové leukocyty se zjistí spočítáním za použití hernacytometru.

Ve druhé zkoušce se příjem buněk indukuje intraperitoneální injekcí 200 μΐ 3% roztoku thioglykolatu v destilované vodě do samičích BALB/c myší 8 až 12 týdnů starých (den 1). Mutanty chemokinů (10 pg ředěných chemokinů v 0.2 ml sterilního roztoku chloridu sodného) se podává 30 minut před podáním thioglykolátu. Mutanty chemokinů se potom podávají denně po dobu 3 dnů (den 2, 3 a 4) . Myši se v den 5 usmrtí plynným CO₂. Peritoneální laváž se provede 3 promytími s 5 ml PBS a laváže se slijí. Buňky se centrifugují při 600 x g po dobu 10ti minut, opět se suspendují v konečném objemu 1 ml a celkové leukocyty se zjistí spočítáním za použití hernacytometru.

h) Experimentální autoimunní encefalomyelitis (EAE)

Postup imunizace

Samičky myší C57 BL/6NCrlBR 8 týdnů staré s hmotností 1822 gramů byly imunizovány (den=0) injekcí s.c. v zadní části krku 0.1 ml emulse, která obsahovala 200pg MOG₃₅_5₅peptidu (Neosystem, Strasbourg, Francie) v úplném Freundově pomocném prostředku (CFA s Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, U.S.A.), obsahujícím 0.25 mg Mycobacterium tuberculosis. Před s.c. injekcí bylo podáno 200 μΐ i.V· injekce do ocasní žíly s 300ng toxinu pertusse (List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A.) ředěného v PBS. V den 2 byla zvířatům podána druhá i.p. injekce s 300 ng toxinu pertuse.

·· φφφφ

Φ Φ · 1 · · Φ · · ♦ • · · · ♦ · · · · • · · · · φφφ φ · · • ········· · φ φ ΦΦΦ· φφφφ

ΦΦΦΦΦΦ φφ φφ φφ φφ

Výsledky postupu, začínají přibližně ode dne 8-10 objevením se progresivní paralýsy, vycházející z ocasu a postupující ascendentně k předním končetinám.

Plán pokusu

Pokus zahrnuje skupiny-každou po 10ti zvířatech. Všechny skupiny byly imunizovány s MOG₃₅__S5peptidem v CFA a toxinem pertuse podle následujícího imunizačního protokolu:

Skupina 1: positivní kontrolní skupina, které bylo podáváno samotné nosné prostředí (PBS) i.p. cestou.

Skupina 2: positivní kontrolní skupina, které bylo podáváno samotné nosné prostředí (PBS) s.c. cestou.

Skupina 3: podáváno i.p. 10 yg trojité 40. mutanty RANTES/myš..

Skupina 4: podáván i.p. lyg trojité 40. mutanty

RANTES/myš.

Skupina	5 :	podáváno i.p. 10 yg	trojité 40. mutanty Met-
RANTES/myš.
Skupina	6 :	podáván i.p. lyg	trojité 40.mutanty Met-
RANTES/myš.
Skupina	7 :	podáváno s.c. 10,000	IJ myšího rekombinantního
interferonu beta	(rn-IFN-P)/myš.
Skupina	8 :	podáváno s.c. 20,000	U rn-IFN-P/myš.

Nosné prostředí

PBS bylo použito k ředění všech 40.trojitých mutant RANTES, všech 40.trojitých mutant Met-RANTES a m-IFN-β k příslušným koncentracím.

444 • 4 · · · · 4 4 4 4 •44 · 4 4 · 44

4·· 4 · · · 4 4 • · ···· · 4 4 • 44 ··· ·4 ·· ·· 44

Způsoby podávání

Trojitá 40. mutanta RANTES, trojitá 40. mutanta Metrantes a m-iFN-β byly podávány denně i.p.cestou v objemech 200 μΐ/myš. Skupina 1, 2 dostávala 200pl PBS/myš.

Doba trvání léčení

Léčení pro každé zvíře začínalo 4. den pokusu (přibližně 3-5 dní před obvyklým objevením se nemoci) a poté léčení pokračovalo 14 následujících dní ( zvířata byla usmrcena v 18. den pokusu)

Klinická sledování

Počínaje 5. den byla zvířata individuálně zkoušena na přítomnost paralýzy prostřednictvím následujícího klinického hodnocení:

0= nejsou známky onemocnění

0.5= částečná paralýza ocasu

1= paralýza ocasu

1.5= paralýza ocasu + částečná unilaterální paralýza zadní končetiny

2= paralýza ocasu + ochablost zadní končetiny nebo částečná paralýza zadní končetiny

2.5= paralýza ocasu + částečná paralýza zadní končetiny (snížená pánev)

3= paralýza ocasu + kompletní paralýza zadní končetiny

3.5= paralýza ocasu + kompletní paralýza zadní končetiny + inkontinence ·· 9999 09 99 AA AAAA

9 9 · · · · · * « • ··· 0 9 99 0 9 · • ········ A A • · · · · · 9 * 9 9

ΑΑΑ· 900 09 ·· 00 09

4= paralýza ocasu + paralýza zadní končetiny + ochablost nebo částečná paralýza přední končetiny

5= umírání nebo smrt

2.Výsledky

a) zkoušky vazby heparinu

Čištěné proteiny RANTES, mutované v jedné nebo ve třech polohách, byly analyzovány heparinovou chromatografií a koncentrace NaCL, potřebná k jejich promytí, byla srovnána s profilem promývání WT RANTES. Jelikož interakce s heparinem je elektrostatická, mutanty byly podrobeny chromatografii na kationtoměniči na sloupci MonoS. To má za následek pokles koncentrace NaCl, která je požadovaná pro eluci, vzhledem k tomu, že mutagenese odstranila basické zbytky. Rozdíl v koncentraci NaCl, získané chromatografií na kationtoměniči, je odečten od výsledku, který se získal heparinovou chromatografií. Jestliže je hodnota pozitivní, je prokázána specifická interakce s heparinem. (Tabulka 1) .

Přímé měření vazby na heparin bylo provedeno s trojitou 40. a 50. mutantou RANTES ve zkoušce na kompetitivní vazbu. WT RANTES a mutanty byly jódovány a všechny měly stejnou specifickou radioaktivitu 2,200 mCi/mol. Nicméně pouze přibližně 20% trojité 40. mutanty se navázalo na kuličky heparinu, s maximálním počtem 4,000 impulsů za minutu ve srovnání s 22,000 impulsy za minutu pro WT RANTES a 50. mutantu (obrázek 3) . To ukazuje, že tyto zbytky ve 40. smyčce, které jsou mutovány, přispívají k větší vazebné kapacitě heparinu pro RANTES. Na druhé straně, to také ukazuje, že domnělý motif vázající GAG není v 50. smyčce „skutečným vazebným místem GAG.

b) Zkoušky na kompetitivní rovnovážnou vazbu na receptor

0« 0000 00 0* 00 0000 400 000* *0 0

0000 0 000 0 0 0 0 000 00 *0* 0 *

0 0000 00*0 0000 «00 00 00 00 00

Schopnost trojité 40. a trojité 50. mutanty RANTES je účastnit se kompetice o ( I

CCR1 a CCR5 transfektantů. z jednotlivých nezaznamenány) v membránách Není zde mutací na

MlP-la pro vazbu na rekombinantní připravených z CHO stabilních významný rozdíl v některé obojích receptorech (výsledky

Žádná z trojitých mutant nevykazuje rozdíl ve vazbě na CCR5 ve srovnání s proteinem WT RANTES. Nicméně, na CCR1 měla trojitá 40. mutanta RANTES 100 násobnou redukci afinity, kde trojitá mutanta RANTES vykazuje pouze malou (3 násobnou) ztrátu afinity (Obr. 4).

c) Zkoušky chemotaxe

Trojité 40. a trojité 50. mutanty byly všechny schopné indukovat chemotaxi monocytů ve srovnání s činností WT RANTES, vyjma trojité 40. mutanty, která byla pouze schopna indukce významné chemotaxe v ιμΜ. Nicméně trojité 40. a 50.mutanty byly stejně účinné ve své schopnosti indukovat chemotaxi T buněk (Obr.5).

Výsledky získané ve zkouškách chemotaxe monocytů se dobře shodují s těmi výsledky, které byly získány ve zkouškách vazby na receptor. Ztráta účinnosti trojité 40. mutanty RANTES na chemotaxi monocytů odpovídá ztrátě afinity pro CCR1.

d) Zkoušky peritoneálního příjmu buněk

Trojitá 40. mutanta RANTES nebyla schopna indukce příjmu buněk do peritonea v dávce (10 pg/myš), při nichž RANTES způsobují podstatný příjem ( Obr. 6).

Kromě toho, jestliže je podáváno 10 pg mutanty 3 0 minut před podáním RANTES, je příjem 'buněk indukovaný RANTES inhibován. Tudíž zrušení vazby GAG vytvářelo in vivo inhibitor příjmu buněk, indukovaného chemokiny.

• ta ·· ta· ··«· ta ta·· · ta ·· ta · · · · · » • · « · · « ta·* ··· ·· ·· ·· ··· · «« ···· ·· · ta · · • ·· ta ·· ··

Analogické výsledky jsou znázorněny na obr. 7 se zkrácenou trojitou 40. mutantou RANTES (3-68)(produkovanou v Pichia pastoris), na obr. 8 s MIP-Ιβ trojitou 40. mutantou (K45A-R46A-K48A) a na obr. 9 s MiP-la trojitou 40. mutantou (R18A-R46A-R48A). Příjem buněk stimulovaný thioglykolátem byl inhibován zrovna tak dobře trojitou 40. mutantou RANTES, jak znázorněno na obr. 10.

e) Experimentální autoimunitní encefalomyelitis

Trojitá 40. mutanta RANTES ukazuje účinek závislý na dávce na modelu myší EAE. Protein, podávaný denně i.p. v dávkách i pg a 10 pg/myš počínaje 10. den po primární imunizaci s MOG, vykazoval srovnatelnou účinnost s referenčním léčením rekombinantním m-iFN-β (Obr 11). Začátek onemocnění byl významně opožděný a závažnost onemocnění (jak stanoveno oblastí pod křivkou) byla také významně snížena. Kromě toho, průměr maximálního klinického hodnocení, dosaženého během pokusu, byl také snížen. Jiná mutanta (trojitá 40. mutanta Met-RANTES) nedosáhla žádných užitečných účinků ve stejném pokusu.

Tyto výsledky ukazují čistě užitečný účinek léčení se všemi 40. trojitými mutantami RANTES, které redukují klinické známky chronické EAE u myší po imunizaci s MOG. Mimoto, trojitá 40. mutanta RANTES má užitečný terapeutický účinek a může být použita jako léčivo u chronických demyelinizačních onemocnění jako je MS.

Tabulka 1. Molarita NaCl pro elucí z heparinu a sloupců MonoS(kationtoměnič)

Mutace RANTES	Heparin	MonoS	ANaCl^Hep'^s	ANaCl^Mono’^s	AANaCl
No(WT)	0-80	0.91	-	—	—

·· ·«»· *t 94 ·· · 9 9 9 9 9 9 4 ·

499 9 9 99 4 4 9

444 44 499 9 9

9 9 9 4 4 4 9 4 4

9499 444 44 44 44 44 • ·· ·

R44A	0.61	0.82	0.19	0.09	0.10
K45A	0.65	0.97	0.15	0.04	0.11
R47A	0.65	0.84	0.15	0.07	0.08
R44A- K45A-R47A	0.47	0.70	0.33	0.21	0.11
K55A	0.70	0.86	0.10	0.05	-0.05
K56A	0.90	0.94	-0.10	0.07	-0.17
R59A	0.79	0.85	0.01	0.06	-0.05
K55A- K56A-R59A	0.70	0.75	0.10	0.16	-0.06

Následující tabulka 2 bude vyjasňovat identitu sekvencí uvedených v Seznamu sekvencí a během textu.

Tabulka 2

SEQ ID NO:	Popis sekvence
1	Divoký typ(WT)RANTES
2	Trojitá 40. mutanta RANTES
3	Trojitá 40. mutanta RANTES(3-68)
4	Trojitá MIP-1-alfa mutanta(R18A-R46A-R48A)
5	Trojitá MIP-1-beta mutanta(K45A-R46A-K48A)
6	Trojitá 50.mutanta RANTES

9999

9 9

9 9 9

99 ·* · ··· ·« • · · · · 9 · • ··· · 9 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999 999 99 99

7	Trojitá 40. mutanta Met-RANTES
8	R44A-mutanta RANTES
9	K45A-mutanta RANTES
10	R47A-mutanta RANTES
11	K55A-mutanta RANTES
12	K56A-mutanta RANTES
13	R59A-mutanta RANTES
14	Primer Pl
15	Primer P2
16	Primer P3
17	Primer P4
18	Primer P5
19	Primer P6
20	Primer P7
21	Primer P8
22	Primer P9
23	Primer P10
24	Primer Pil
25	Primer P12
26	Primer P13

·· 0000 • » · • · 0 00

• 0 0« • 0 0 0

0 00

0 0 0 « 0 0 0

00

27	Primer P14
28	Primer P15
29	Primer P16
30	WT-I309
31	WT-MIP-l-alfa
32	WT-MIP-l-beta
33	WT-MIP-4
34	WT-MIP-5
35	WT-HCC1
36	WT-I36512
37	WT-MCP-2

Zastupuje

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Užití mutanty CC chemokinů pro přípravu farmaceutického prostředku v léčení sklerosy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění, ve kterém chemokin je vybrán z RANTES, MIP-lalfa, ΜΙΡ-lbeta, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309, 135612 a MCP-
2 a kde mutanta CC chemokinů obsahuje nejméně dvě mutace na kationtovém místě 40. smyčky, jak znázorňuje obr. 1, a která vzhledem k divokému typu molekuly má redukovanou vazebnou aktivitu GAG.

Užití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutanta RANTES.
3. Užití, podle nároku 2, ve kterém mutantou chemokinů je trojitá mutanta RANTES, která má tři basické aminokyseliny v kationtovém místě 40. smyčky nahrazené jinými aminokyselinami.

Užití, podle nároku 3, ve kterém aminokyseliny v kationtovém místě 40. nahrazeny alaninem, serinem, threoninem, glycinem.

tři basické smyčky jsou prolinem nebo
5. Užití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutovaný RANTES se SEQ ID NO:3.
6. Užití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutanta RANTES se SEQ ID:2.
7. Užití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutanta MIP-1-alfa se SEQ ID N0:4.
8. Užití, podle nároku 1, ve kterém mutantou chemokinů je mutanta MIP-1-beta se SEQ ID NO:5.

99 9999 ·**· • 9 » • 999

9999 999
9. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje jako účinnou látku mutantu chemokinů, podle nároku 1 až 8, spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou, pro léčení sklerózy multiplex a/nebo jiných demyelinizačních onemocnění.
10. Zkrácený a mutovaný lidský RANTES, který má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO:2.
11. Molekula DNA, která obsahuje kódovací sekvenci DNA pro zkrácený a mutovaný RANTES, podle nároku 10.
12 . Vektor pro expresi, který obsahuje molekulu DNA, podle nároku 10.
13. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, ž e obsahuje vektor pro expresi, podle nároku 12.
14. Způsob rekombinace pro přípravu polypeptidů, vyznačující se tím že obsahuje kulturu buněk v příslušném nosném prostředí, podle nároku 13.