JPH07502490A - 殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物、その製造方法、およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物、その製造方法 、およびそれらの使用発明の背景 グラム陰性感染は、特に入院患者および免疫無防備状態の患者における罹患率お よび死亡率の主要な原因である［Ｄｕｍａ、　Ｒ，１，、Ａｍ、Ｊ、　ｏｆ　Ｍ ｅｄ、、　７８　（Ｓｕｐｐｌ、　６Ａ）：　１５４−１６４　（１９８５）、 およびＫｒｅｇｅｒ　Ｂ、　Ｅｌ、　Ｄ、Ｅ、　ＣｒａｖｅｎおよびＷ、ＲｌＭ ｃＣａｂｅ。

Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　６８：　３４４−３５５　（１９８０）　］　。利用可 能な抗生物質が一般に感染の封じ込めにａ効であるとしても、それらはリポ多糖 （ＬＰＳ）に関連する病理生理学的作用を中和するために何かをなすことはない 。

ＬＰＳ、すなわち内毒素は、グラム陰性菌の外膜の主要成分であり、この微生物 が溶菌したときに放出される［Ａｈｅｎｃｐ、　Ｊ、　Ｌ、およびに、Ａ、Ｍｏ ｒｇａｎ、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５０　Ｄ）：　３８０−３８ ８　（１９８４）　］。

抗生物質療法の最中に放出されるＬＰＳは、炎症応答の潜在的な刺激要因である 。イン・ビボにおけるＬＰＳの多くの有害作用は、炎症細胞によって放出される 可溶性伝達物質に起因する［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　Ｄ、　Ｃ，およびＲｌＪ、　Ｕ ｌｅｖｉｃｈ、　Ａｍ、　Ｊ。

Ｐａ１ｈｏ１．、９３　（２）：　５２７−６１７　（１９７８）　］　、　Ｌ ＰＳは、最終的には播種性器管内凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）　、成人呼吸窮迫症候Ｒ（ ＡＲＤＳ）、心臓機能障害、臓器不全（ｏｒｇａｎ　ｆａｉｌｕｒｅ　）　、肝 不全（ヘパトビリアリ（ｈｅｐａｌｏｂｉｌｉａｒｙ　）機能障害）、脳不全（ ｂｒａｉｎ　１ａｉｌｕｒｅ　）　（ＣＮＳ機能障害）、腎不全、多臓器不全（ ｍｕｌｔｉ−ｏｒｇａｎ　ｆｘｉｌｕｒｅ）およびシ３　ツクを招き得る、宿主 炎症細胞による伝達物質の放出を誘発する。

可溶性ＬＰＳは、好中球の走化性の減少、粘着性の増加、カル生成の上昇、補体 に対する表面受容体の調節向上（ｕｐｒｒｇｕｌａｊｉｏｎ）　、および周囲の 媒体への顆粒タンパク質の放出を引き起こす［Ｍｏ＋ｒｉｓｏｎおよび旧ｅｖｉ ｃｈ　（１９７８）　］。

特定の、およびアズール親和性の両区画はＬＰＳに応答して脱顆粒する［Ｂａｎ ｎａｔｙｎｔ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｎ、Ｍ、　Ｈａｒｎｅｔｔ、　Ｋ、Ｙ、Ｌｅｅお よびＷ、Ｄ、Ｒｉｇｇｅｒ、　１．　ＩｎｆｒｃＬ　Ｄｉｓ、、　１５６　（４ ）：　４６９−４７４（１９７７）］。ＬＰＳに応じて放出されたアズール親和 性タンパク質は、宿主にとって信書でもあり、有益でもあり得る。好中球エラス ターゼは、凝固カスケード抑制の要因であるプロテアーゼ阻害剤の脱顆粒を引き 起こす。これは、内毒素血症の潜在的に致命的な結末である播種性血管向凝固の ような凝固障害を招く。アズール親和性顆粒はまた、ミエロペルオキシダーゼの ような殺菌性分子および天然ＢＰＩタンパク質を何している。

内毒素血症は、血中における内毒素、すなわち熱安定細菌性毒素の存在に関与す る状態である。内毒素は、感染に立ち向かう上で有益な炎症応答を誘発するが、 無制御の場合には宿主にダメージを与える。内毒素血症は、肝臓の内毒素結合タ ンパク質の産生を誘発し、白血球からの殺菌性タンパク質の放出を引き起こす。

種々の研究が、従来イン・ビトロにおけるそれらの殺菌活性のみが知られている これらの白血球タンパク質の１つ、すなわちＢＰＩタンパク質が、イン・ビトロ において好中球および単球を刺激する内毒素の能力を阻害し、イン・ビボで与え られた場合に、内毒素もしくは細菌性抗原投与による死を減少させることを示し ている。

単球および好中性顆粒球は、細菌感染に対する宿主防御において鍵となる役割を 果たすと同時に内毒素血症の病理にも関与している。これらの細胞は、細胞内的 に微生物を摂食しかつ殺すと同時に、殺菌、タンパク分解、オプソニン、発熱、 補体活性および組織損傷作用を有する可溶性タンパク質を放出することによって 、イン・ビボおよびイン・ビトロにおいて内毒素に応答もする。

内毒素に刺激された単球によって放出されるサイトカインである腫瘍壊死因子（ ＴＮＦ）は、インφビボにおいて、内毒素の毒性作用のいくつかを模倣する。動 物へのＴＮＦの注入は、発熱、ショックおよびグルコース代謝の改変を引き起こ す。ＴＮＦはまた、好中球の潜在的な刺激因子である。

ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８のような他のサイトカインもまた、ＬＰＳの 病態生理学的作用の幾つかに介在する。

抗生物質療法の改善にもかかわらず、内毒素血症に関わる罹患率および死亡率は 高いままである。抗生物質それ自体はＬＰＳの毒性作用の中和には有効ではない 。したがって、直接的な内毒素中和活性を有する治療の必要性が生じている。

内毒素血症の現在の治療方法では、抗生物質と支援ケアとが用いられている。利 用可能な補助療法のほとんどが、低血圧または発熱のような内毒基のショック症 状を治療するが、内毒素を不活性にはしない。他の療法は、ＬＰＳに対する炎症 宿主応答を阻害する。以下に示すように、現在の療法は、毒性、免疫原性、また は動物モデルどヒトでの試験との間の効能の非再現性により大きな制限がある。

ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）は、最も毒性が高く、生物学的に活性な成分である リピッドＡに結合し、構造的に破壊することが示されている塩基性ポリペプチド 抗生物質である。

ＰＭＢは、イン・ビトロにおける内毒素の好中性顆粒球放出活性化を阻害するこ とか示されており、ヒトにおけるグラム陰性感染に対する潜在的な治療である。

しかしながら、その全身毒性のために、この薬剤は局所製剤としてを除いてその 使用に制限かある。

抗生物質および高−回投与量のメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（ＭＰ ＳＳ）を用いるコンビネーション療法は、イヌを用いたグラム陰性敗血症の実験 モデルにおいて死を妨げることが示されている。全身性敗血症の臨床的な徴候を 示す２２３名の患者の多中心（ｍｕｌｌｉｃｅｎｌｅ＋　）　、二重盲検、プラ セポ対照の臨床研究における、ＭＰＳＳを抗生物質と共に用いる他の研究は、治 療群とブラセボ群とでは死亡率に大差はないと結論付けた。さらに、この研究音 速は、１４日以内の二次感染の消散は、プラセボ群が有意に高いことを見出した 。

内毒素血症の治療に対する比較的新しい試みは、内毒素中和抗体を用いる受動免 疫である。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ５に対する高度免疫ヒト免疫グロブリンは、グラム 陰性菌血症およびショックを有する患者の死亡率を５０％減少させることが見出 されている。他のグループは、マウス、キメラ、およびヒトモノクローナル抗体 を用いた動物モデルにおいて有望な結果を見出している。モノクローナル抗体は 超免疫血清に対する利点、例えばより一貫した薬剤効力およびヒト病原体の伝播 減少を有するものの、ＬＰＳを中和するための免疫グロブリンの投与に関連する 依然として多くの問題を抱えている。免疫グロブリンそれ自身に対する宿主の応 答は、過敏症を招く可能性がある。補体活性化および免疫複合体の沈着に続く組 織の損傷は、敗血症患者において坑内毒素抗体を含む治療を用いる上での他の関 心事である。

ＢＰＩタンパク質は、１９７５年に最初に発見された好中性顆粒球タンパク質で ある［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、、　Ｒ，Ｃ，Ｆｒａｎｓｏｎ、　Ｓ、Ｂｃｃｈｅｒｄ山 、　ＬＳｃｈｍｅｉｄｌ＊ｒ、およびＰ、　Ｅｌｓｂａｃｈ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、Ｉｎｖ！ｓ１．、　５５：３３　（１９７５）　］　。５７ｋＤタンパクであ るＢＰＩタンパク質は、１９７８年にヒト好中球から高度に精製された形で得ら れ、イン・ビトロにおけるリン酸緩衝生理食塩水中でアッセイした際に、膜透過 性を増大させ、グラム陰性細菌に対する殺菌活性を有することが示された［Ｗｅ ｉｓｓ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｒｉｏｔ。

Ｃｌｕｍ、、２５３　（８）：　２６６４−２６７２　（１９７８）　３゜Ｗｓ ｉｓｓう［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４　（２１）：　１１０１０−１１０ １４　（１９７９）　］は、さらにＢＰＩタンパク質がホスホリパーゼＡ２活性 を増大させることを見出しており、これはＢＰＩタンパク質に、そのイン・ビト ロにおける殺菌活性に加えて前炎症活性を示唆するものである。

ウサギＢＰＩタンパク質が１９７９年に精製され（ＥＩＢｂａｃｈら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４　（２］）：　１１０００−１１００９］　、そ の上、ヒト由来のＢＰＩタンパク質と同様の殺菌および透過性増大能を有するこ とが見出され、さらなる研究材料の源を提供している。ウサギおよびヒト由来の 両ＢＰＩタンパク質は、イン・ビトロにおいて、Ｋｌ−莢膜内包（Ｋｌ−ｅｎｃ ｉｐｓｕｌａｊｅｄ　）　Ｅ、　ｃｏｌｉを含む種々のグラム陰性菌に対して有 効であることが見出された［Ｗｅｉｓｓ　ら、１ｎｌｅｃｌｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ ｍｍｕｎ目ｙ　３８　（３）：　１１４９−１１５３．　（＋９８２）　］。

イン・ビトロでのＢＰＩタンパク質の殺菌作用におけるリポ多糖の役割が、１９ ８４年にＷｅｉｓｓらによって提唱された［１゜Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２　（６ ）＋　３１０９−３１１５．　（１９８４）］　。これらの研究者たちは、ＢＰ Ｉタンパク質がグラム陰性菌の外膜に結合し、ＬＰＳの細胞外放出を引き起こし 、かつＬＰＳ生合成を選択的に刺激することを示した。

１９８４年に、ヒト好中球からＢＰＩタンパク質と類似の特性を有するタンパク 質が単離され、カチオン性抗菌タンパク質５７　（ＣＡＰ５７）と命名された［ ５ｈａｆｅｒ、Ｗ、Ｍ、、Ｃ，Ｅ、ＭａｒｊｉｎおよびＪ、ＬＳｐｉｔｚｎａｇ ｅｌ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、　４５：２９　（１９８４）　］。

このタンパク質は、Ｎ−末端アミノ酸配列、アミノ酸組成、分子量および源によ る決定ではＢＰＩタンパク質と同一であった［Ｓｐｍｎａｇｅｆら、Ｂｌｏｏｄ 　７６：８２５−８３４．　１９９０１　。を也のグループ、Ｂｏｖｄｅおよび Ｇｒａｙは、１９８６年に、ＢＰＩタンパク質と仮想的に同一の特性を有する殺 菌性糖タンパク質を報告した［ＢｏｖｄｅおよびＧｒａｙ、Ｉｎ１ｅｃｌｉｏｎ 　ａｎｄ　１ｍｍｕｎ目ｙ５４（１）：１４２−１４８　（１９８６）］。

１９８５年に、Ｏｏｌ　らは、好中球プロテアーゼで開裂した後であっても、Ｂ ＰＩタンパク質はそのイン・ビトロ殺菌活性を保持することを報告した［Ｏｏ　 ｉおよびＥｌｓｂａｃｈ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　３３　（２） ：　５６７Ａ　（１９８５）］　、これは、分子の断片が活性を保持することを 示唆している。ＢＰＩタンパク質の全てのイン・ビトロ殺菌活性および透過性増 大活性は、このタンパク質（７）Ｎ−末端２５ｋＤ断片に存在すル［Ｏｏｉ、　 Ｃ，Ｅ、、ら、１゜８ｉｏ１．　Ｃｔｕｍ、　２６２：　１４８９１　（１９８ ７）］。

ＢＰＩタンパク質が、細菌外膜上の内毒素に関連する構造に結合する証拠は以下 の通りである。（１）ＢＰＩタンパク質の透過性増大活性に対する感受性が、平 滑法と比較して粗面株のＥ、ｃｏｌｉの方が増大する［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、ら、１ 山ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５１：　５９４　（１９８６）］　；　（２）結果として 内毒素構造を改変することになるＰｒｍ　Ａ変異か、ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ ）およびＢＰＩタンパク質の両者の結合を減少させる［Ｆａｒｌｅｙ、　Ｍ、　 Ｍ。

ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５６：　１５３６−１５３９　（１９８７）お よびＦａｒｌｚＹする［Ｆｘｒｌｅｙ　１９８８コ　；並びに（４）　Ｂ　Ｐ　 Ｉタンパク質は、アミノ酸配列相同性および免疫交叉反応性をリポ多糖結合タン パク質（Ｌ　Ｂ　Ｐ）と呼ばれる他の内毒素結合タンパク質と共有する［Ｔｏｂ ｉａｓら、１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、２６３　（２７）：　１３４７９−１ ３４８１（１９８８）　］。

ＬＢＰ−ＬＰＳ複合体は単球上の細胞表面需要体（ＣＤＩ４）に結合し、これは 炎症性サイトカインＴＮＦの合成および放出の増大を招（［Ｓ（ｈｕｍａｎｎら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１４２９−１４３１　］。

このため、ＬＢＰはＬＰＳの免疫刺激活性を促進する。ＢＰＩタンパク質はＬＰ Ｓと結合し、好中球および中球の活性化を阻害する［Ｍａｒｒａ　ら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ。１４４　：　６６２−６６６　（１９９０）　；Ｍａｒｒａおよび ５ｃｏｆｆ、　ｗｏ　９０１０９１８３．　１９９０年８月２３日刊行；Ｃ，１ ，Ｆｉｓｈｅｒ　ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒｙ　５ｂｏｃｋ　３４：　１２０　 （１９９１）］。

Ｇｒａｙらによって、ＢＰＩタンパク質をコードするｃ　ＤＮＡ９５０５−９５ ０６　（１９８９）　］。彼等は、ＢＰＩタンパク質は、開裂可であると報告し た。

グラム陰性菌に結合するＢＰＩタンパク質は、本来的に、ＬＰＳ構造を破壊し、 小さな疎水性分子に対する微生物透過性を変え、かつ細胞の死を引き起こすもの と報告された［Ｗｅ　ｉ　ｓ　ｓら、１．９７８］。さらに最近、これらの同一 著者らは、そのような作用か血清アルブミンの非存在下でのみ起こることを示し ている。ＢＰＩタンパク質は、血清アルブミンの存在下で培養された最近に添加 された場合には殺菌活性を持たず、したがって、アルブミンが遍在するインφビ ボではＢＰＩタンパク質は最近を殺さないことが示唆されるＪＭａｎｎｉｏｎら 、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８５：　８５３−８６０　（１９９０）および Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８６：　６３１６４１］　 。このため、従来、当該分野においては、ＢＰＩタンパク質の有益な作用はイン ・ビトロ殺菌作用に限定されると理解されてい乙。

さらに、ＢＰＩタンパク質は、Ｇｒａｙらにより、可溶形態で好中性顆粒球膜か ら放出される、２５ｋＤａ断片に開裂されるべき膜タンパク質として記述されて いる［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６４　（１６）：　９５０５−９５０９　（１９８９）　］。

実際、ＢＰＩタンパク質は、ＬＰＳに結合し、イン・ビトロおよびインゆビボに おいてＬＰＳの免疫刺激活性および毒性活性を阻害するタンパク質である。した がって、ＢＰＩタンパク質を包含する殺菌性／透過性増大タンパク質は、内毒素 関連障害の治療および予防処置に重要な用途を有している。

さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質は、とりわけ、試料中のＬＰＳの検出お よび定墓測定のための診断手順に、および装置の生物学的試料が接触する表面の 殺菌性／透過性増大タンパク質でのコーティングに重要な用途を有している。

しかしながら、従来の技術は、殺菌性／透過性増大タンパク質を可溶性、活性形 態に安定に保つ十分な方法を提供していない。

この発明は、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する医薬およ び非医薬両組成物、並びにそれを製造する方法を提供することにより、この問題 を処理する。この発明の組成物は、高濃度で安定に保存することが可能である。

この発明は、さらに、この発明の組成物の使用を提供する。

発明の要約 この発明は、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有し、殺菌性／ 透過性増大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物を提供する。脂質担体は 、リポソームまたは非イオン性界面活性剤を含んでい又もよい。

この発明はまた、この発明の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タ ンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件 下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬 剤学的に許容し得る脂質担体を含有し、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担 体中に溶解している医薬組成物を提供する。薬剤学的に許容し得る脂質担体は、 リポソームまたは非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。

この発明は、さらに、この発明の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な 量の殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容しｉ）る脂質担体とを、殺 菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含す る方法を提供する。

この発明は、さらに、試事゛１中のリポ多糖の検出方法であって、試料とこの発 明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／′透過性増人タンパク質１夏合体が形成さ れるよ・）な条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質 複合体を検出し、それにより試料中のリポ多糖を検出することを包含する方法を 提供する。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の世を定量的に測定する方法であって、 試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増人タンパク質複合体 が形成されるような条件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タン パク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的 に測定する方法を提供する。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リボ多糖と複合体 を形成し得るように手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法で あって、この発明の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具 表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するよう な条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体 を形成し得るように移植可能な侵入性装置を殺菌性／透過性増大タンパク質で被 覆する方法であって、この発明の医薬組成物と生物学的試料と接触することが想 定された装置表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が装置表面に 付着するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、リポ多糖を含有する流体を、この流体を患者に投与する前 に浄化する方法であって、流体とこの発明の医薬組成物とを、リポ多糖と含有さ れる殺菌性／透過性増大タンパク質とか複合体を形成するような条件下で接触さ せ、かつ形成された１夏合体を流体から分離し、それにより流体を浄化すること を包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、内毒素関連ショック、内毒素関連播種住血管内凝固、内毒 素関連Ｈ血、内毒素関連血小板減少症、内毒素関連成人呼吸窮迫症候群および内 毒素関連腎不全からなる群より選ばれる疾患に罹患Ｉ−た患名を治療する方法で あって、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパ ク質が患者の有するリポ多糖と結合し得るにｈ゛効な量投与し、それにより患者 を治療することを包含する方法を提供する。

最後に、この発明は、患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者に この発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の何 するリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者における内毒素血 症を予防することを包含する方法を提供する。

色素産生ＬＡＬアッセイにおけるｒＢＰ！タンパク質によるＬＰＳ活性の阻害。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１：Ｂ４　（０−Ｉ　ＥＵ／ｍ　１）を０−１００μｇ ／ｍ　Ｉ　Ｂ　Ｐ　Ｉタンパク質と一緒に３７℃で１時間ブレインキュベートし た後、色素産生カブトガニアメーノく様細胞溶解質（ＬＡＬ）アッセイにおいて 内毒素活性をアッセイした。データは、ｍ１当りの内毒素単位（ＥＵ）表示の内 毒素に対するアッセイ値±ＳＤ（縦軸）、対ＥＵ／ｍ１表示のインキュベーショ ン混合物に添加された内毒素量（横軸）ｐＴ７８ＰＩタンパク質プラスミド構築 体の模式図。

ＢＰＩタンパク質のＣ−末端トランケーション（ｌｒｕｎｃａｌｉｏｎ）である ＢＰＩタンパク質突然変異誘発性プライマー２５ｋＤＰｒｏ　２１２　ＴＧＡの ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。

図４ ＢＰＩタンパク質のＣ−末端トランケーションであるＢＰＩタンパク質突然変異 誘発性プライマー３８ｋＤ　Ｐ　ｒ　ｏ　３３７ＴＧＡのヌクレオチドおよびア ミノ酸配列。

図５ ＢＰＩタンパク質突然変異誘発性プライマーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列 ：ＢＰＩタンパク質のＣ〜末端トランケーションである好ましいＡＴＧ５’　旧 ｎｄｌｌｌ。

開立 ｐ３３７のタンパク配列。

図７ ｐ２１２のタンパク配列。

図８ ｐ　Ａ　ｃ　３７３の模式図。

発明の詳細な説明 この発明は、特には、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する 組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質か脂質担体中に溶解している組 成物を提供する。

ここで用いられる場合には、殺菌性／透過性増大タンノ々り質とは、ｌ）ヒトＢ ＰＩタンパク質およびＢＰＩタンパク質；２）ＢＰＩタンパク質と実質的に同じ アミノ酸配列およびＢＰＩタンパク質の生物学的活性を有する生物学的に活性な あらゆるポリペプチド；３）ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な断片またはＢ ＰＩタンパク質のポリペプチド類似体；および４）生物学的に活性なりＰＩタン パク質の変種を意味し、かつ包含する。この関連において、生物学的に活性とは 、ＬＰＳに対する発熱性応答を阻害し得ることを意味する。この生物学的活性は 、ウサギＵＳＰパイロジエンアッセイにおいて測定することができる。

ここで用いられる場合には、“ヒトＢＰＩタンパク質”または“ＢＰＩタンパク 質”とは、感受性グラム陰性菌の外膜に結合する生来の、もしくは天然の５７ｋ Ｄタンパク質を意味する。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンノ々り質の生物学的に活性な断片”と は、ＢＰＩタンパク質の生物学的活性、および内在するアミノ酸配列を有する、 分子ｆｆ１５７ｋＤ未満のポリペプチドを意味する。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチ ド類似体”とは、ＢＰＩタンノ々り質と実質的に同じアミノ酸配列、およびＢＰ Ｉタンノくり質の生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。ＢＰＩタン／ くり質の生物学的に活性なポリペプチド類似体には、その配列が、ＢＰＩタンパ ク質の配列内のアミノ酸の変化、例えば変異、により、またはＢＰＩタンパク質 配列配列ミ八もしくはカルボキシ−末端、あるいはそれら両者における１以上の アミノ酸の付加により、ＢＰＩタンノくり質の配列から変化するポリペプチドが 含まれる。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な変種”とは 、（１１ＢＰＩタンパク質に内在するアミノ酸配列部分およびＢＰＩタンパク質 に内在しないアミノ酸配列を含み、かつ（２１Ｂ　Ｐ　Ｉタンパク質と実質的に 同じ生物学的活性、すなわち内毒素中和活性を有するポリペプチドを意味する。

ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な変種は、組換えＢＰＩタンパク質であり得 る。

ここで用いられる場合には、“組換えＢＰＩタンパク質”とは、遺伝子工学手法 によって産生されたポリペプチドを意味する。したがって、ＢＰＩタンパク質、 ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド断片、ＢＰＩタンパク質の生 物学的に活性なポリペプチド類似体、およびＢＰＩタンパク質の生物学的に活性 な変種の各々は、組換え体であり得る。

しかしながら、この出願の文脈においては、ＢＰＩタンパク質は組換えＢＰＩタ ンパク質とは同じではなく、後者は、生来の、もしくは天然のポリペプチドとは 幾つかの分子特性、例えばグリコシレージョン・パターンにおいて異なる。

加えて、殺菌性／透過性増大タンパク質は、（１）ＬＰ３のリピッドＡドメイン に特異的に結合し、（２）リピッドＡ結合部位への結合においてＢＰＩタンパク 質と競合し、（３）細胞のＬＰＳ介在刺激を阻害し、かつ（４）殺菌活性を示さ ないタンパク質変種を意味し、かつ包含する。殺菌性／透過性増大タンパク質変 種の例は、図６に示されるタンパク質変種である。殺菌性／透過性増大タンパク 質変種の他の例は、図７に示されるタンパク質変種である。

ここで用いられる場合には、“脂質１１体”は、疎水性タンパク質の沈殿を阻止 することが可能なあらゆる脂肪ＩｊＪ溶物質物質有する液体またはゲルである。

脂質担体はまた、緩衝溶液、塩（例えば、ＮａＣΩ）およびタンパク質担体（例 えば、血清アルブミン）を何し−Ｃいてもよい。さらに、脂質担体は、溶液また はゲルの形態であってもよい。このような脂質担体は、当業者に公知の方法によ り処方される。

ここで用いられる場合には、タンパク質は、タンパク質のモノマーもしくはマル チマー（ｍｕ　Ｉ　ｌ　ｉｍｅ　ｒ）の表面領域か脂質担体と接触している場合 に、脂質担体中に“溶解”している。

溶液から析出するタンパク質は溶解していない。溶解度は２８０ｎｍでの吸光度 によりＡＪす定することがてき、そこでは溶解したタンパク質が２８０ｎｍの光 を吸収し、析出したタンパク質は吸収しない。

この発明の一態様においては、脂質担体はリポソームを含有する。ここで用いら れる場合には、“リポソーム“は、殺菌性／透過性増大タンパク質のような所望 の物質を有するあらゆる膜結合小胞である。リポソームはまた、成分としてコレ ステロールを有していてもよい。

この発明の他の態様においては、脂質担体は、非イオン性界面活性剤を含有する 。ここで用いられる場合には、非イオン性界面活性剤は、脂質可溶性環境におい て池の方法では不溶の物質を懸濁することができるあらゆる非イオン性脂質可溶 性化合物である。非イオン性界面活性剤の例には、これに限定されるものではな いか、（トウイーン８（１（Ｔｗｅｅｎ　８０）もしくはポリオキシエチレンソ ルビタン・モノオレエートとしても知られる）ポリソルベート８Ｌ　Ｂｒ１ｊ、 ポリソルベート８（１゜およびトリトン（Ｔ＋１ｌｏｎ）　（例えば、トリトン ＷＲ−１３３９およびトリトンＡ−２０）か含まれる。

他の態様においては、脂質担体はリン脂質を含有する。リン脂質は、ホスファチ ジルイノシトールもしくはホスファチジルコリンのような天然鼎乳動物リン脂質 であってもよい。

この発明はまた、この発明の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タ ンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透−過性増大タンパク質が溶解するような条 件下で接触させることを包含する方法を提供する。脂質担体にタンパク質を溶解 するための条件は、当業者には公知である。

この発明は、さらに、治療上有効な社の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬 剤学的に許容し得る脂質担体を含有する医薬組成物であって、殺菌性／透過性増 大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物を提供する。

ここで用いられる場合には、′治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質 ”とは、患者に投与された場合に、所望の結果を生じ得る、すなわち内毒素血症 もしくはそれに関連する疾患を治療もしくは予防し得る量を意味する。殺菌性／ 透過性増大タンパク質の治療上有効な足の測定方法は、当業者には公知である。

特には、殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効な量は、患者において、Ｏ ，１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの濃度を達成するに十分な量である。こ の発明の好ましい態様においては、殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効 な量は、患者において、１ｍｇ／ｋｇないし１９ｍｇ／ｋｇの濃度を達成し得る に十分な墓である。

例えば、３５０ｍ　ｇの殺菌性／透過性増大タンパク質は、７０ｋｇの患者にお いて５ｍｇ／ｋｇの濃度を達成するための殺菌性／透過性増大タンパク質の治療 上有効な足である。

ここで用いられる場合には、“薬剤学的に許容し得る担体”とは、内用もしくは 外用のいずれかの医薬品としての使用に適した脂質担体を意味する。このような 担体は、当業者には公知である。

この発明の一態様においては、薬剤学的にＭ’Ｕ容し得る脂質担体はリポソーム を含有する。この発明の他の態様においては、薬剤学的に許容しｉ）る脂質担体 は非イオン性界面活性剤を含有する。

この発明は、さらに、この発明の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な 量の殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容し得る脂質担体とを、殺菌 性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する 方法を提供する。タンパク質を脂質担体に溶解するための条件は、当業者に公知 である。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の検出方法であって、試料とこの発明の 組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるよう な条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体を検 出し、それにより試料中のリポ多糖を検出することを包含する方法を提供する。

タンパク複合体の検出方法は当業者には公知であり、例としては、ＥＬＩＳＡお よびラジオイムノアッセイ技法が含まれる。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の量を定員的に測定する方法であって、 試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体 が形成されるような条件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タン パク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的 に測定する方法を提供する。

タンパク複合体を定員的に測定する方法は当業者には公知であり、例としてはＥ ＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ技法が含まれる。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体 を形成し得るように手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法で あって、この発明の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具 表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するよう な条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

手術用具には、例としては、切断器具、鉗子、吸引装置およびカテーテルが含ま れる。タンパク質が用具表面に付着するであろう条件は、当業者には公知である 。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体 を形成し得るように移植可能な侵入性装置を殺菌性／透過性増大タンパク質で被 覆する方法であって、この発明の医薬組成物と生物学的試料と接触することが想 定された装置表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が装置表面に 付着するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

移植可能な侵入性装置には、例としては、人工関節、保護板、およびネジが含ま れる。タンパク質が移植可能な侵入性装置の表面に付着するであろう条件は、当 業者には公知である。この発明の好ましい態様においては、生物学的試料はヒト の内部区画（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）である。

この発明は、さらに、リポ多糖を含有する流体を、この流体を患者に投与する前 に浄化する方法であって、流体とこの発明の医薬組成物とを、リポ多糖と含有さ れる殺菌性／透過性増大タンパク質とが複合体を形成するような条件下で接触さ せ、かつ形成された複合体を流体から分離し、それにより流体を浄化することを 包含する方法を提供する。

ここで用いられる場合には、リポ多糖を含有する流体を“浄化する”とは、そこ からリポ多糖を除去することを意味する。

ここて用いられる場合には、投与は、静脈内、腹腔内、または当業者に公知の他 のあらゆる投与方法により行なうことができる。

リポ多糖が殺菌性／透過性増大タンパク質と慢合体を形成する条件は、当業者に は公知である。さらに、流体からのリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複 合体の分離は、当業者に公知の適切なあらゆる手段により達成することができる 。

この発明は、さらに、内毒素関連ショック、内毒素関連播種住血管内凝固、内毒 素関連貧血、内毒素関連血小板減少症、内毒素関連成人呼吸窮迫症候群および内 毒素関連腎不全からなる群より選ばれる疾患に罹患した患者を治療する方法であ って、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク 質が患者の有するリポ多糖と結合し得るに有効な墓投与し、それにより患者を治 療することを包含する方法を提供する。

ここで用いられ場合には、投与は、静脈内、腹腔内、または当業者に公知の他の あらゆる投与方法により行なうことができる。

この発明の医薬組成物の、内毒素関連疾患に罹患している患者を治療するに有効 な量は、患者において０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達 成するに十分な墓である。好ましい態様においては、この発明の医薬組成物の、 内毒素関連疾患に罹患している患者を治療するに有効な墓は、患者においてＩｍ ｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに十分な凰である。

最後に、この発明は、患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者に この発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の有 するリポ多糖と結合し得るに有効なｆｆｌ投与し、それにより患者における内毒 素血症を予防することを包含する方法を提供する。

二の発明の医薬組成物の、患者における内毒素血症の予防に有効な侶゛は、患、 ！１においτ０．ｌｒｎｇ／ｋｇないしｌｏｏｍ　ｇ／ｋｇの最終濃度を達成す るに１・分な足である。好ましい態様においては、この発明の医薬組成物の、患 者における内毒素血症の予防に有効な伝は、患者において１ｍｇ／ｋｇないしｌ ０ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに十分な量である。

この発明は、以下の実験の詳細を参考にすることによってより理解されるであろ う。しかしながら、詳述した特定の実験はその後に続く請求の範囲においてより 完全に記述されるこの発明を説明するためだけのものであることは当業者には容 易に認識されるであろう。

た５０ｍＭトリス、ＩＭ　ＮａＣＵ　、ｐＨ７，４中のｒＢＰＩの試料は、ロッ カーΦプラットホーム（ｒｏｃｋｅｔ　ｐｌａｌｌｏｔｍ　）（Ｌａｂｑｕａｋ ｅ　５ｈａｋｅｎ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、４００−Ｊｉｏ　Ｌａｂ　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉｅｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ）を用いて撹拌した場合、３０分以内に沈殿 するであろう。同様の沈殿効率は、ｒＢＰＩ溶液を５分間高撹拌した際に観察さ れる。典型的には、沈殿方法のいずれも収率は約９７％沈殿である。

ｒＢＰ！溶解度に対する異なる試薬の効果５０ｍＭ）リスＩＭＮａＣΩ　ｐＨ７ ，４中の組換えＢＰＩ（１，６ｍ　ｇ／ｍ　１　）を下記溶液中に１０倍に希釈 し、ロッカー・プラットホームを用いて４℃で一晩撹拌した。次いで、各溶液を 視認しｉ）る沈殿について観察した（表１）。

５０　ｍＭ　Ｉ”リスｐａｌ　？、４１００　ｍＭ　ＮａＣ１’　Ｘ５０　ｍＭ 　トリスｐＨ７，４１Ｍ　ＮａＣ１Ｘ５０ｍＭ）リスｐｉ（７，４１０ｍＭ　Ｄ ＴＴ　ｘ５０１］］ＭトリスｐＨ７，４１０ｍＭアスコルビン酸　Ｘ５０ｍＭ） リスｐＨ７，４（アルゴン下）　Ｘ４０　ｍＭクエン酸塩ｐＨ４Ｘ ４０　ｍＭクエン酸塩ｐｎ　５　Ｘ ４０　ｍＭクエン酸塩ｐＨ６Ｘ ４０　ｍＭクエン酸塩ｐｎ　７　Ｘ ４０　ｍＭグリシンｐＨ３− ０１１１、Ｂ４　ＬＰＳ　２００　ｕｇ／ｍｌ（予備インキュベート３０分、＠ ３８°　−ウシ血清アルブミン１００　ｕｇ／ｍｌ　ｘウシ血清アルブミンｌ　 ｍｇ／ｍｌ　ｘｌｏｏ　ｍＭ　アルギニンｐＨ８Ｘ ＬＭアルギニンｐ）ｌ　８　Ｘ ０１０５％トリトンＸ−１１４− Ｘ−沈殿を認める 一＝沈殿を認めず ｍｌ）に添加し、その溶液をロッカー・プラットホームを用いて３０分間撹拌し た。撹拌の前後に、２８０ｎｍでの吸光度により溶解度を測定した（表２）。

０．５ｍＭ）−リドンＸ−１１４９０ ０，１ｍＭ）リドンＸ−１１４５９ ０，００３％　トウイーン８０＃３ ０、０００７九　トウイーン８０３ ５０　ｍ１１１オクチルゲルコンド　２２５　ｍＭオクチルゲルコンド　２９ １２、５　ｍＭオクチルグルコシド　８１６、２５　ｍＭオクチルゲルコンド　 ８０３、］２ｍＭオクチルクルコシド　８３表　２　（続き） １、５６　ｍＭオクチルグルコシド　６４５％　ポリエチレングリコール６００ ０　１０１％　ポリエチレングリコール６０００　２０．２％　ポリエチレング リコール６０００　２２０％エチレングリコール　９ １００　ｍＭ　硫酸アンモニウム　３ ２０％グリセロール　９ ０．２％Ｂｒ＋１３５　１０１ ０．００５％Ｂｒ１ｉ　３５　９７ ０．０５％混合アルキルトリメチルアンモニウム　１０５ブロマイド　０ １Ｍグルコース　０ ＊トウイーン８０＝ポリオキシエチレンソルビタン・モノオシＢｒ１ｊ３５−ポ リエチレングリコールアルキルニーテルトウイーン８０を用い、例２に記載され る通りに、さらなる溶鮮度研究を行なった（表３）。定量は、固相酵素免疫測定 法によった。

１０％　トゥイーン８０　１８７ ０．５％　トウィーン８０　１３７ ０．２５％トウイーン８０８１ ０．１２５％　トゥイーン８０　３０ ０．０６３％　トゥイーン８０８ ０、００３１％　トウイー２８０１ 例４ 脂質担体、すなオっちトウビーン８ｏ中のＢＰＩタンパク質は、内毒素の致死性 からマウスを有効に保護する（表４）。

表４ ＣＤ−１マウスにおけるＢＰＩタンパク質による内毒素の致死性からの保護 （２５ｍｇ／ｋｇ　ＩＶ　（７）ＬＰＳ−０１１１：Ｂ４　）（２４時間での生 存個体／総数） 生理食塩水対照　０１５ 処方＃１：２０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ　ＮａＣｆ）、０．２％トウイーン ８０、ｐＨ６，０ 例５ 色素産生ＬＡＬアッセイにおけるｒＢＰＩによるＬＰＳ活性□ の阻害。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１ｌｌ：Ｂ４　（０−Ｉ　ＥＵ／ｍ　ｌ）を０−１ ００μｇ／ｍｌ　ＢＰＩタンパク質と一緒に３７℃で１時間予備インキュベート した後、色素産生カブトガニアメーバ様細胞溶解質（ＬＡＬ）アッセイにおいで 内毒素活性をアッセイした。データ（図１）は、ｍ１当りの内毒素中位（ＥＵ） 表示の内毒素に対するアッセイ値±ＳＤ（縦軸）、対ＥＵ／ｍ１表示のインキュ ベーション混合物に添加された内毒素量（横軸）を示す。

ＢＰＩタンパク質によるＬＰＳ誘発性ＴＮＦ分泌の阻害フィコール・ハイパツク 勾配を用いてヒト末梢血中球細胞を単離し、発熱源非含有ＨＢＳＳで２回洗浄し 、血清を除いたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０中に５ＸＩ０６／ｍｌで再懸濁した。

この細胞懸濁液の２００ｍ　ｌを、平底９６−ウェル組織培養皿の各ウェルにお いて３７℃で２時間インキュベートした。温ＲＰＭＩＩ６４０で２回洗浄するこ とにより、非粘着細胞を再除去した。ＲＰＭＩ１６４０＋ｌＯ％自己由来不活性 化血清中で細胞を培養した。

粘ｊ３単球細胞を、緩衝液、ＢＰＩタンパク質もしくはポリミキシンＢ　（７９ ００Ｕ／ｍｌ）と共に３７°Ｃで３０分間予備インキュベートしたＥ、ｃｏｌｉ 　０１ｌｌ：Ｂ４　ＬＳＰで刺激した。ＬＳＰ混合物添加の４時間後に上清を回 収した。ＴＮＦαの分泌をＥＬＩＳＡにより定量した。結果を表５に示す。

ＴＮＦ　ｐｇ／ｍｌ ｒＢＰＩ ＬＰＳ　緩衝液　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌ Ｂ／ｍｌ　＆＝Ｊ照　１０００　＋００　１０１０００　１７２８±４１６　５ ２６±４７　１６９４±１３４　２０５２±３２４１００　１３００±１９９　 ６６±７４０７±９９　１４７９±２３２１０　８２６±２１６０±１６　０± １６　０±５６例７ ＬＰＳはＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａ＋ｃｈ、　Ｉｎｃ、、　 Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　ＭＴから購入した；カルシウム、マグネシウムおよびフェ ノールレッドを伴わないハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）は１’１ａｘｅｌｔ ｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＰＩｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｅｎｖｅｒ、　ＰＡがら購入 した；フィコールφバク、パーコールおよびマクロデクス（Ｍａｒ＋ｏｄｅｘ） はＰｈａ＋ｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｌａｗａｙ、　ＮＪから購入し た。ＴＮＦおよび抗ＴＮＦはＥｎ＋ｌｏｇｅｎ、Ｂｏｓｔｏｎ　ＭＡ　、’ｒ１ ら購入した。

Ｂ、アズール顆粒単離および抽出 地方血液銀行より人手したバフィコートから顆粒球を単離した。バフィコートを ＨＢＳＳに３−４×希釈し、６４％パーコールを介する遠心により単核細胞から 顆粒球を分離した。このペレットにジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦ Ｐ）を作用させ、洗浄し、水冷溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ。

ｐＨ６，８、１００ｍＭ　ＫＣΩ　、　３ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｆ）　、　３．　５ ｍＭＭｇＣΩ２）に再￥濁して窒素空洞形成（Ｐａｒｒ　Ｉｎ山ｕｍｅｎｔ　Ｃ ｏ、、　Ｍｏ１ｉｎｅ、ＩＬ　）により破壊した。アズール顆粒を不連続パーコ ール勾配を用いて単離した。このような方法は、当業者には公知である。このア ズール顆粒を集めて＋８０．０ＯＯＸＧて２時間遠心することによりパーコール を除去した。この顆粒を、凍結−解凍を４サイクル行なった後１分間超音波処理 することにより溶解した。溶解した顆粒を、室温で１時間間欠的に高撹拌するこ とにより、等容量のｌｏＯｍＭグリシンｆ中に抽出した。この酸抽出物を、３０ ．０００　Ｘ　Ｇで２０分間および２００．０００　Ｘ　Ｇで３０分間遠心する ことにより浄化した。

Ｃ１好中球単離 健′ｊ：−ホランティア提供者から酸性クエン酸デキストロース抗凝固剤に静脈 血を採り、直ちに氷上に載置した。血液５部を冷マクロデクス１部と混合し、４ °Ｃで１．５−２時間静置した。白血球に富む血漿を冷ＨＢ　Ｓ　Ｓで１×洗浄 し、その後ＨＢＳＳに再懸濁してフィコール・バク上に積層した。無視できない 赤血球汚染か存在する場合には、顆粒球ペレットは低張溶解を受けた。これらの 細胞をＨＢＳＳで２×洗浄し、ＨＢＳＳ＋２％自己由来血漿に再懸濁して、イン キュベーション混合物中ｌＸｌ０６／ｍｌの最終顆粒球濃度を１）だ。

Ｄ、ＢＰＩタンパク質精製 約２ｍｇの粗アズール顆粒抽出物を、流速１ｍ１／分の定速条件（ｉｓｏＣｒａ ｆｉＣｃｏｎｄＨｉｏｎ　）下において、５０ｍＭグリシンおよび１００ｍＭ　 ＮａＣΩ緩衝液、ｐＨ２，０を用い、Ｂｉｏｓｉｆ　（ＴＳＫ−２５０）　（７ ，８ｍｍＸ　６００ｍｍ）高速サイス排除カラムでザイスにより分離した。最も 高いＬ　Ｆ’　Ｓ阻害活性を有するカラム画分は、５７ｋＤ種の大部分を有して いた。これらのＴ　Ｓ　Ｋ両分をプールし、５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５，５を 用いてアクアポア（Ａｑｕａｐｏ＋ｅ）弱陽イオン交換（ＷＣＸ）カラム（２， １ｍｍｘ３０ｍｍ）に流し、２５分間で５０ｍＭクエン酸塩およびＩＭ　ＮａＣ Ω　（緩衝液Ｂ）の０−７５％の勾配に、次いて５分間で７５−１００％緩衝液 Ｂに、流速２００ｍ１／分で溶出し。

た。陽イオン交換から５７ｋＤの物質が回収され、ＳＤＳ　ＰＡＧＥで単一のバ ンドとして現われた。幾つかの実験においては、０．１％ＣＨ３ＣＮ＋　０．１ ％ＴＦＡ中に１２分間置かれたＶｙｄａｃ　ＣＪカラムを用い、２００ｍ　ｌ　 ／分の流速で３０分で行なう逆５ＨＰＬＣにより、ＢＰＩタンパク質をさらに精 製した（Ｒａｉｎｉｎ　ＩｎｓｆｒｕｍｅｎＬ；、Ｅｍｅｒｙｙｉｌｌｅ、　Ｃ Ａ）。

削孔動物細胞中でＢＰＩタンパク質および／またはＢＰＩタンパク質変種を産生 ずるためには、ｃＤＮＡ配列を適切なプラスミドベクターに挿入しなければなら ない。そのような用途に適切なベクターは、ＳＶ４０の複製起点並びに初期およ び後期プロモーター、それに続く多重挿入クローニング部位、それに続くＢ型肝 炎表面抗原遺伝子由来の終結配列を有するｐＳＶ−１である（図２）。このプラ スミド中には、細菌ＤＮＡ復製起点、並びにアンピシリン耐性およびジヒドロフ オレートレダクターゼをコードする遺伝子も含まれている。同様のベクターが、 他の外来遺伝子の発現に用いられている（ＭｃＧｒｏｇａｎら、Ｂｉｏｌｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　６．　１？２−１７７）　。ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍ旧て消 化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸基することによりＤＰＩタンパク質ｃ ＤＮＡ配列を受け入れるためのベクターＤＮＡを調製した。

ｐＳＶ−１に挿入するための幾つかの１３Ｐ、１タンパク質ｃＤＮＡ含何インサ ートを調製した。まず、親プラスミドをＥｃｏＲＩで消化することにより、完全 長のＢＰＩタンパク質をコードするインサートを調製した。これによりＢＰＩタ ンパク質コード配列の一部を含む２つのＤＮＡ断片が得られる。

これら２−）の断ｊ１を調製した５Ｖ−１に共に連結し、得られた組換えクロー ンを正しい向きにある２つのインサートの存在について、制限酵素消化によって スクリーニングした。親ＢＰＩタンパク質インサートＤＮＡからＢＰＩタンパク 質のトランケート体（ｌｙｕｎｃａｌｅｄ　ｆｏｒｒｎ）をコードする２種のｃ ＤＮＡか生成した。この増幅オリゴは、ＢａｍＨＩ　クローニング部位に加えて 、コドン２１２（オリゴ４５９）　（図３）および３３７（オリゴ４６０）　（ 図４）を停止コドンに置換するように設計された。両構築物の５′−末端で、オ リゴ４５８か増幅に際し翻訳開始コドンＡＴＧの直ぐ上流にＨｉｎｄｌ１１部位 を創造するために用いられた（図５）。したがって、各々５５ｋＤ、３８ｋＤお よび２５ｋＤ形態の組換えＢＰＩタンパク質をコードする３種のＢＰＩエンコー ディングインサートが創造され、その各々を調製したベクターＤＮＡに別々に連 結した。

３種の構築物の各々を制限消化分析により確認した後、ＣＨＯ細胞系ＤＵＸＢ１ １細胞に形質導入するに十分な量を調製した。形質導入はりポフエクチンを用い て行ない、１ツられた形質転換細胞を、増量したメトトレキセートの存在下にお いて、標準プロ１へコルを用いて選択した。形質転換プールのいずれかからの上 清もしくはこのプール由来のクローンを、ＥＬＩＳＡにより、内毒素結合活性に ついてアッセイした。

ンパク質および／またはＢＰＩタンパク質変柾を産生させるためには、まずｃＤ ＮＡ配列をｐＡＣ３７３（図８を参照）のような適切なプラスミド発現ベクター に挿入しなければならない。この挿入に適当な制限部位を、標準部位指向変異誘 発法によって創造することができる。適切な発現ベクターに必須の特性には、ｐ ＡＣ３７３のポリへドロン遺伝子プロモーターのような転写プロモーター、バキ ュロウィルス・ゲノムへの組換えを指向するフランキング相同配列が含まれる。

このプラスミドベクター中に存在するポリへドロン遺伝子の一形態のようなポリ アデニル化シグナルは、組換え遺伝子の発現には必要であることもないこともあ る。転写プロモータおよび恐らくはポリアデニル化シグナルを含む調節配列と並 置される、Ｅ、ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーセ遺伝子のようなマーカー遺伝子 は、このベクターに含まれてもよいが、運搬された遺伝子（ｃｏｎｖｅｃｆｅｄ 　ｇｅｎｅ）の発現には必須ではない。そのような目的のための典型的なベクタ ーであるｐＡＣ３７３を図８組換えバキュロウィルスの創造；キメラバキュロウ ィルスを、ＢＰＩタンパク質標的遺伝子（もしくはそれらのトランケーション） 有する発現プラスミドと野生型バキュロウィルスＤＮＡとの間の相同組換えによ り創造する。プラスミドおよび野生型バキュロウィルスＤＮＡをリン酸カルシウ ム法により共沈させ、未感染５ｐｏｄｏｐｔｐｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（ Ｓ　ｆ　９　）昆虫細胞に添加する。形質導入に続く４ないし７日間で、細胞は 細胞変性形態（ｃｙｔｏｐａｌｈｉｃ　ｍｏ「ｐｈｏｌｏｇｙ　）を示し、ウィ ルス感染によって典型的に生成する核閉塞体（ｎｕｃｌｅａｒ　ｏｃｃｌｕｓｉ ｏｎｂｏｄｉｅｓ）を有する。野生型および組換えウィルスの両者を含む細胞非 含有培養培地を回収する。

キメラバキュロウィルスの同定および単離：アガロースで覆われたＳｆ９細胞中 層に対するプラーク精製により、この共形性導入（ｃｏ−ｔ＋ａｎｓｌｅｃｌｉ ｏｎ　）ストックからウィルスのクローン中離対をｉすることかできる。閉塞対 について陰性のプラーク形態から、分析のための候補プラークが同定される。発 現プラスミドかβ−ガラクトシダーゼのようなマーカー遺伝子を存する場合には 、組換えプラークは、アガロース平板培地中の５−ブロモ−４−クロウルー３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ゲル）のような色素産生基質よ り生成する青色によって示される。取り出したプラークをマルチウェルディツシ ュ中の細胞の接種に用いる。得られた細胞溶解物および感染細胞上清を、標準活 性もしくは免疫アッセイを用いて、組換えＢＰＩタンパク質の発現について評価 することができる。陽性ウェルは、野生型の汚染のない純粋組換えウィルススト ックを得るために、さらなるプラーク精製ラウンドを要するかもしれない。

ＢＰＩタンパク質のバッチ生成：増殖のため、Ｓｆ９細胞を、ＥｘＣｗｌｌ　（ Ｊ、　Ｒ，５ｃｉｅｎｌｉｆｉｃ）のような血清非含有低タンパク培地中で適合 させる。細胞を、穏やかに遠心することにより懸濁培養物から集め、細胞当り１ ウイルスプラ一ク形成単位の感染多重性を利用するｍ１当り１，０００万細胞の 濃度の細菌接種物を有する新鮮な培地に再懸濁する。２時間後、この培養物を新 鮮な培地で５倍に希釈し、２ないし３０間インキュベートする。この期間の最後 に、遠心により細胞をベレット化し、ｙＪ８Ｊ整された培地を日収する。この細 胞ノ１゛含有上清から、標準手段により、ＢＰＩタンパク質を精製する。

昆虫細胞由来ＰＮ−Ｉの特徴付け：バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞中 に産生じたＢＰＩタンパク質は、おおよその分子量が５５ｋＤのグリコジル化タ ンパク質である。そのＮ−末端アミノ酸配列は、熟成哺乳動物細胞ＢＰＩタンパ ク質と同じであり、これはシグナル配列の正しい処理を示している。特異的な内 毒素結合活性は、生来のＢＰＩタンパク質と区別できない。

ｐ７７８ＰＩタンパク質プラスミドの構築＝　（図２を参照）ポリメラーゼ−チ ェイン・リアクション（ＰＣＲ）において用いるために、アプライド・バイオシ ステムズ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０Ｂ　ＤＮＡシンセ サイザーを用いてオリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチド は、ＢＰＩタンパク質り、ＮＡの５′および３′末端に、それぞれ、Ｎｄｅ　Ｉ およびＢｘｍ旧制限部位を生成した。加えて、Ｂｉｍ旧制限部位を有する他のオ リゴヌクレオチドが、ＢＰＩタンノくり質ＤＮＡのプロリン−２１２トランケ一 ト体（１＋ｕｎｃａ＋ｅｄ　ｐｒｏｌｉｎｅ−２１２ｖｅｔｓｉｏｎ　）を生成 するために用いられた。

ＰＣＲ反応に続いて、断片を精製し、Ｎｄｅ　ｌおよびＢａｍＨｌで消化した。

プラスミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｘ−１（Ｐ「ｏｍｅｇａより入手）を構築のた めのベクターとして選択した。ｐＧＥＭＥＸ−１は、適正宿主内に置かれた場合 、下流の配列を発現させるために用いることができるＴ７プロモーターを有して いる。このベクターをＢａｍ旧で開裂させ、精製に続いてＮｄｅ　Ｉで部分的に 消化して中−のＮｄｃ　Ｉ部位および単一のＢａｍ旧部位を有するベタクーを生 成させる。この断片を連結し、７１ナノ＼ン（Ｈｘｎａｈａｎ　）形質転換プロ トコルを用いてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ２Ｏ３株を形質転換する。この形質転換 菌を、カルバミシリン（ｃａｒｂａｍｉｃｉｌｌｉｎ　）を含有するＬＢプレー トに塗布し、３７℃で一晩インキユベートした。耐性コロニーを選別し、これを 、ミニ・プラスミド調製品を調製し、かつ適当な制限酵素で消化することにより 分析した。消化物を、１％アガロースゲルおよび５％ＰＡＧＥの両者を用いて分 析した。

発現宿主であるＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ＤＥ３　）株を、ミニ・プラスミ ド調製品１μｍおよび／’％す／％ン形質転換プロトコルを用いて形質転換した 。ＪＭ１０９　（ＤＥ３）は、Ｉ　ＰＴＧで誘発することができるＴ７　ＲＮＡ ポリメラーゼの遺伝子の染色体コピーを何している。この形質転換菌を、カルノ ＜ミシリンを含有するＬＰプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートシた 。

Ｆｉｇυｒｅ２ Ｆｉｇｕｒ＝　３ ＢＰＩのＣ末端トランケーション ２５ＫＯＰｒｏ　２１２　ＴＧＡ ＡＡ、２０５　２１０　２１２ １１ｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｅｒ、 Ｂａｍ　ＨＩＴＡＧ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＴ 　ＴＧＡ　ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＯ’、ｌＰ　３・　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＣ ＡＣＣＧＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＴＡＧＧＣＧＣ５“オリゴ４５９： ５　’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣＣＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＡＴ Ａ　３゜Ｆｉｇｕｒ＝　４ ＡＡ、３３０　３３５　３３７ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｅｒ　 Ｂａｍ　ＨＩＣＣＣＡＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡ　ＧＧ ＡＴＣＣＧＣＧＣＯＭＰ・ ３°ＣＣＧ　ＧＡＡＴＧＧ　ＡＡＧＡＴＧ　ＧＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＣ５ ゜オリゴ４６０・ ５’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　 ＧＣＣ３゜Ｆｉｇｕｒｅ　５ ５°ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ 　ＧＣＣ３’＜、−２Ｃ！：、じ−クトーー〉００ Ｅ＋１国−ｔＡｘｘ＞ｏヘーー〉 ＞　％　０１−Ｉ　Ａψ×〉山Ｑ−リ ＜ｏ”ｒ、ｗ口＋　ｃｑ　ｚ気＜×− Ｅ−４，−＋（１）−ベニｕ＋ｚｈトエ０く＞ｚψ〉〉Ｃｚｚトへ Ｈ＜　Ｌ　（Ｈ：ｌ：　Ｃ１＜　：！：　ｍ　Ａ　Ｑ。

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Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物であって、 殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物。
2. ２．脂質担体がリボソームを含有する請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．脂質担体が非イオン性界面活性剤を含有する請求の範囲第１項記載の組成物 。
4. ４．請求の範囲第１項記載の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タ ンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件 下で接触させることを包含する方法。
5. ５．治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬剤学的に許容し得 る脂質担体を含有する医薬組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂 質担体中に溶解している組成物。
6. ６．薬剤学的に許容し得る脂質担体がリポソームを含有する請求の範囲第５項記 載の組成物。
7. ７．薬剤学的に許容し得る脂質担体が非イオン性界面活性剤を含有する請求の範 囲第５項記載の組成物。
8. ８．請求の範囲第５項記載の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な量の 殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容し得る脂質担体とを、殺菌性／ 透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法 を提供する。
9. ９．試料中のリポ多糖の検出方法であって、試料と請求の範囲第１項記載の組成 物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるような条 件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質復合体を検出し 、それにより試料中のリポ多糖を検山することを包含する方法。
10. １０．試料中のリポ多糖の量を定量的に測定する方法であって、試料と請求の範 囲第１項記載の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が 形成されるような条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパ ク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的に 測定する方法。
11. １１．殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るよ うに手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、請求の 範囲第５項記載の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具表 面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するような 条件下で接触させることを包含する方法。
12. １２．殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るよ うに移植可能な侵入性装置を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であ って、請求の範囲第５項記載の医薬組成物と生物学的試料と接触することが想定 された装置表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が装置表面に付 着するような条件下で接触させることを包含する方法。
13. １３．リポ多糖を含有する流体を、該流体を患者に投与する前に浄化する方法で あって、流体と請求の範囲第５項記載の医薬組成物とを、リポ多糖と含有される 殺菌性／透過性増大タンパク質とが複合体を形成するような条件下で接触させ、 かっ形成された複合体を流体から分離し、それにより流体を浄化することを包含 する方法。
14. １４．内毒素関連ショック、内毒素関連播種性血管内凝固、内毒素関連貧血、内 毒素関連血小板減少症、内毒素開運成人呼吸窮迫症候群および内毒素関連腎不全 からなる群より選ばれる疾患に罹患した患者を治療する方法であって、患者に請 求の範囲第５項記載の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質 が患者の有するリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者を治療 することを包含する方法。
15. １５．患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者に請求の範囲第５ 項記載の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の与す るリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者における内毒素血症 を予防することを包含する方法。