CN101155825B - 抗微生物六肽 - Google Patents

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Abstract

本发明包括由交替的2、4和6位的疏水残基(B)、1和3位的亲水带电残基(X)以及5位的萘丙氨酸(Nal)、脂肪族残基或芳香族残基(O)组成的六肽，一般表示为式XBXBOB，其表现出抗各种病原体所致感染的抗微生物活性。这些病原体可包括革兰氏阳性或阴性细菌、耐酸细菌如分枝细菌、寄生物、皮肤真菌或真菌病原体。典型的真菌病原体包括白色念珠菌(Candida albicans)，典型的皮肤真菌包括红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)。本发明的六肽表现出抗真菌活性、抗细菌活性、期望的稳定性，且对接受治疗的哺乳动物没有毒性。

Description

抗微生物六肽
优先权要求 
本申请要求2005年2月9日提交的美国临时申请60/651,270的优先权，该临时申请的完整内容在此引入作为参考。 
发明领域
本发明涉及含表现出期望生物特性的抗微生物六肽的组合物和方法。更具体地说，所述六肽表现出期望的抗真菌活性，并可选地表现出抗细菌活性。具体地说，公开了以下六肽：其在1和3位具有带电(亲水)残基；在2、4和6位具有疏水残基；在5位具有萘丙氨酸、脂肪族残基(例如脯氨酸)或芳香族残基(例如苯丙氨酸)；一般以式XBXBOB表示。通过向这些肽中的某些肽的N-端加入脂质部分可进一步增强活性，尤其是在血清中。另外，在C-端酰胺化似乎增强活性。 
相关技术的描述 
数十年来研究人员一直在开发抗微生物的疗法和药剂。近来，需要新的抗微生物药来治疗数量渐增的抗药性细菌、病毒和真菌感染。 
在科学文献和已颁发专利中均已报告了各种各样的生物活性肽。肽在过去分离自天然来源，最近已成为了结构-功能相关性研究的目标。另外，天然肽已用作合成肽类似物的设计起点。 
肽类抗生素的综述在1997年由R.E.W.Hancock发表(Lancet 349：418-422)。讨论了各种类型肽的结构、功能和临床应用。阳离子型肽类抗生素的其它综述在1998年发表(Hancock，R.E.W.和Lehrer，R.Trends Biotechnol.16：82-88)。这些肽通常为12-45个氨基酸长的阳离 子两性分子。这些肽能穿透细胞膜，导致对微生物因子的防治。1999年R.E.W.Hancock (Drugs 57(4)：469-473；Antimicrobial Agents andChemotherapy 43(6)：1317-1323)论述了宿主防御性阳离子肽的临床潜力。讨论了该类肽的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗癌症和伤口愈合特性。 
有关螺旋抗微生物肽的结构特征及其推测的作用机制的综述也已公开(参见例如Dathe，M.和Wieprecht，T.Biochimica et BiophysicaActa 1462：71-87(1999)；Epand，R.M.和Vogel HJ.Biochimica etBiophysica Acta 1462：11-28(1999))。据认为能够调节活性和选择性的结构参数包括螺旋性、疏水矩、疏水性、亲水/疏水螺旋表面对向角和电荷。 
业已报道了一系列广泛的天然α螺旋肽。本文描述了该领域中许多参考文献中的几个代表性文献。天蚕素是一个分离自昆虫的α-螺旋肽家族。已知天蚕素的抗细菌特性，如美国专利第4,355,104和4,520,016号所述。一般来说发现天蚕素具有抗某些革兰氏阴性细菌的活性。已发现天蚕素对真核细胞不具有活性(Andreu等，Biochemistry24：163-188(1985)；Boman等，Developmental and Comparative Immunol.9：551-558(1985)；Steiner等，Nature 292：246-248(1981))。得自果蝇(Drosophila)和大蚕蛾(Hyalphora)的天蚕素表现出具有抗各种真菌菌株的活性(Ekengren，S.和Hultmark，D.，Insect Biochem.and Molec.Biol.29：965-972(1999))。据报道，得自埃及伊蚊(Aedes aegypti)的天蚕素A与大部分昆虫天蚕素的不同之处在于其没有色氨酸和C端酰胺化(Lowenberger，C.等，J.Biol.Chem.274(29)：20092-20097(1999))。 
蛙属(Rana)蛙在其皮肤中产生一组广泛的抗微生物肽(Goraya，J.等，Eur.J.Biochem.267：894-900(2000))。报道了短至13个氨基酸的肽，并将其分类为多个结构家族。所述序列基本没有或没有显示出与分离自其它属蛙的肽(如爪蟾抗菌肽(magainin)和蛙皮抗菌肽(dermaseptin))有序列同一性。爪蟾抗菌肽是一种23个氨基酸的α-螺 旋肽，分离自非洲蛙有爪蟾蜍(Xenopus laevis)的皮肤(Zasloff，M.Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.84：5449-5453(1987))。 
美国专利第5,962,410号公开了用裂解肽如天蚕素和麻蝇毒素(sarcotoxin)抑制真核病原体以及刺激淋巴细胞和成纤维细胞。提出的各种肽包括天蚕素B、天蚕素SB-37、天蚕素A、天蚕素D、Shiva-1、Lepidopteran、麻蝇毒素1A、麻蝇毒素1B和麻蝇毒素1C。 
Reed，W.A.等，Transgenic Res.6：337-347(1997)报道了生产Shiva-1天蚕素类裂解肽的转基因小鼠。用流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)挑战感染转基因小鼠导致细菌数相对于非转基因小鼠的感染减少。 
与前抗微生物肽(cathelin)相关的23-38个氨基酸的α螺旋肽存在于绵羊、人、牛、猪、小鼠和兔的血液细胞中(Zanetti，M.等，FEBSLett.374：1-5(1995))。 
Giacomette，A.等，(Peptides 20：1265-1273(1999))报道了buforinII、天蚕素P1、indolicidin、爪蟾抗菌肽II、乳链菌肽(nisin)和ranalexin的抗微生物活性。这些肽显示出抗细菌和酵母的可变活性。 
已在体外和体内制备和测定了各种合成肽。例如，美国专利第5,861,478号公开了采用α-螺旋构象的约20-40个氨基酸的合成裂解肽。这些肽有效治疗微生物感染、伤口和癌症。公开的肽包括天蚕素B、SB-37*、LSB-37、SB-37、Shiva 1和10-12、β-纤维蛋白信号肽、Manitou 1-2、Hecate 1-3、Anubis 1-5和8以及Vishnu 1-3和8。 
Baghian，A.等，(Peptides 18(2)：177-183(1997))将Hecate描述为蜂毒溶血肽(melittin)的合成肽类似物。所述肽在其电荷分布方面有差异，但在其两性α-螺旋构象方面没有差异。Hecate抑制单纯疱疹病毒(HSV-1)，但对细胞生长和蛋白合成没有不利影响。 
合成肽D2A21、D4E1、D2A22、D5C、D5C1、D4E和D4B描述于Schwab，U.等，Antimicrob.Agents and Chemotherapy 43(6)：1435-1440(1999)。描述了抗各种细菌菌株的活性。 
Juvvadi，P.等，(J.Peptide Res.53：244-251(1999))制备并测定了由天蚕素和蜂毒溶血肽组成的杂种肽。合成杂种以研究序列、酰胺键方向(螺旋偶极)、电荷、两亲性和疏水性对通道形成能力和抗细菌活性的影响。已提出序列和酰胺键方向是杂种活性的重要结构条件。 
在抗盐性研究中描述了一种26个氨基酸的昆虫天蚕素-蜜蜂蜂毒溶血肽杂种及其类似物(Friedrich，C.等，Antimicrobial Agents andChemotherapy 43(7)：1542-1548(1999))。已发现第二位中的色氨酸残基对活性是关键的。发现序列的适度变化导致肽特性显著改变。 
脯氨酸残基对α-螺旋肽的抗细菌特性的影响业已公开(Zhang，L.等，Biochem.38：8102-8111(1999))。据报道加入脯氨酸改变了膜插入特性，替换单个脯氨酸可将抗微生物肽改变为裂解毒素。 
制备了一系列具有18-30个氨基酸的肽，以便测试序列和电荷改变对抗细菌特性的影响(Scott，M.G.等，Infect.Immun.67(4)：2005-2009(1999))。未发现长度、电荷或疏水性与肽的抗微生物活性之间的显著关联。发现的总的趋势是：较短的肽比较长的肽活性低，但要指出的是，该作用可能会是序列依赖性的。 
制备和测定了一组合成肽“Modellin”，以比较序列和结构关系(Bessalle，R.等，J.Med.Chem.36：1203-1209(1993))。具有疏水性和亲水性相对面的16和17个氨基酸的肽是高度溶血性的和抗细菌的。较小的肽趋向于具有较低生物活性。 
已发现天蚕素-蜂毒溶血肽杂种肽和酰胺化鲽肽保护鲑鱼免遭体内鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染(Jia，X.等，Appl.Environ.Microbiol.66(5)：1928-1932(2000))。渗透泵用于传递连续剂量的任一种肽给所述鱼。 
业已报道了两亲性肽能够增强伤口愈合并刺激成纤维细胞和角质细胞体内生长(美国专利第6,001,805号和5,561,107号)。据报道已制备了表达裂解肽(为与遍在蛋白融合的融合蛋白)的转基因植物(美国专利第6,084,156号)。据报道制备了富含甲基化赖氨酸的裂解肽， 其表现出提升的蛋白水解抗性(美国专利第5,717,064号)。 
受让人Helix BioMedix，Inc.是讲述裂解肽及其使用方法的几个另外的已颁发专利和专利出版物的拥有者。美国专利第6,440,935号描述了具有至少部分地以α-螺旋构象排列的约30个至约40个氨基酸的肽的刺激性和增殖性应用。美国专利第6,303,568号描述了治疗真菌或革兰氏阴性细菌感染动物的方法。所述治疗包括施用诸如天蚕素C-37的肽。美国专利第6,255,282号描述了杀死微生物的方法，包括施用各种肽。所述肽由其构象和序列特性限定。已公开的美国专利申请第20020025918号描述了相似的肽在植物中的应用。已公开的美国专利申请第20030109452号和20030083243号描述了短的生物活性“FLAK”肽及其使用方法。 
有各种专利描述了含短肽的化装品用组合物。例如，美国专利第6,492,326号提出制备和使用含五肽和护肤活性成分的护肤用组合物。 
Strom等，2003(Journal of Medicinal Chemistry 46：1567-1570)描述了主要集中于含化学修饰的非常短的肽(二聚体和三聚体)的抗细菌短肽。还描述了某些六肽。但是，没有测试或论述这些六肽的抗微生物性，或者更具体地说，没有测试或论述这些六肽的任何抗真菌活性。 
Lopez Garcia等，(Int.Journal of Food Microbiol.89：163-170(2003)以及Applied and Environ.Microbiol.68：2453-2460，(2002))描述了合成肽组合文库的筛选，导致鉴别出具有抗作物的植物致病性真菌病原体活性的抗真菌六肽。这些抗真菌肽包含RKT或RKK基序作为前三个残基。抗有临床意义的病原体(包括真菌病原体)的抗微生物活性的测试或论述没有描述。同样，未讨论六肽的稳定性或毒性特性。 
因此，有需要开发具有广谱有效抗微生物活性的肽，所述活性针对多种微生物，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、原生动物、病毒等，尤其是针对真核病原体如真菌。因为真菌病原体是真核的， 所以相对比原核细菌更类似于人宿主，传统上更难以开发没有毒性的针对真核病原体的有效疗法。开发抗真菌肽也是这样的情况。 
另外，抗真菌肽趋向于相对较长(＞15个氨基酸)，因此伴有毒性，还表现出高蛋白酶敏感性、低组织穿透性和高成本。另外，抗微生物肽尽管是局部应用的良好候选药物，但传统上与会伴随系统施用的系统循环不相适。 
发明概述 
本发明提供抗微生物六肽，其包含在1和3位的亲水带电残基(X)；在2、4和6位的疏水残基(B)；以及在5位的萘丙氨酸、脂肪族残基或芳香族残基(O)；其中，所述六肽结构表示为式XBXBOB。 
在某些实施方案中，所述六肽将包含以下的氨基酸，其中X选自精氨酸(R)和赖氨酸(K)；B选自苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)；而O选自萘丙氨酸(Nal)、脯氨酸(P)和苯丙氨酸(F)。 
在其它实施方案中，所述六肽可选自KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：1)、KWRWPW-NH2(SEQ ID NO：2)、KWKWFW-NH2(SEQ IDNO：3)、RWRWPW-NH2(SEQ ID NO：4)、KFKWFW-NH2(SEQ IDNO：6)、RFKWFW-NH2(SEQ ID NO：7)、OCT-KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：55)、OCT-KWKWFW-NH2(SEQ ID NO：56)、KWKWUW-NH2(SEQID NO：62)和KWKWZW-NH2(SEQ ID NO：63)。 
在某些实施方案中，所述六肽是SEQ ID NO：1。 
在其它实施方案中，所述六肽是修饰过的。这些修饰可包括脂质化或酰胺化。 
在其它实施方案中，所述六肽是脂质化的，所述脂质选自庚酸、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十一烷酸、十三烷酸或辛酸。 
在另外的实施方案中，所述六肽选自Hep-KFKWPW-NH2(SEQID NO：69)、Non-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：70)、Lau-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：72)、Myr-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：77)、Pen-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：78)、Und-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：79)、Tri-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：80)、Oct-kfkwpw-NH2(SEQID NO：81)、Lau-kfkwpw-NH2(SEQ ID NO：83)和Oct-KFKWPw-NH2 (SEQ ID NO：84)。 
在另外的实施方案中，所述六肽在水性溶液中是可溶的。 
在某些实施方案中，所述六肽连同药学可接受的载体一起存在于组合物中。在某些实施方案中，所述六肽以治疗有效浓度存在于组合物中。此治疗有效浓度可在约0.0002％至约90％的范围内。在其它实施方案中，所述治疗有效浓度在约0.5％至约10％的范围内。 
在某些实施方案中，所述组合物还包含一种皮下传递系统。在其它实施方案中，所述传递系统可为局部传递系统。局部传递系统可为选自以下的任何形式：化妆品制剂、粉剂、乳剂、洗剂、喷雾剂、软膏、气溶胶、乳膏和泡沫剂。 
在另一个实施方案中，治疗有效量的六肽用于在哺乳动物中治疗或预防真菌或细菌感染。 
本发明提供用于治疗哺乳动物组织的组合物，所述组合物一般包含六肽，所述六肽含在1和3位的带电残基；在2、4和6位的疏水残基；以及在5位的萘丙氨酸、脂肪族残基或芳香族残基；其中，所述六肽结构表示为式XBXBOB。 
在又一个实施方案中，提供用于治疗微生物感染的组合物，所述组合物包含选自以下的六肽：KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：1)、KWRWPW-NH2(SEQ ID NO：2)、KWKWFW-NH2(SEQ ID NO：3)、RWRWPW-NH2(SEQ ID NO：4)、KFKWFW-NH2(SEQ ID NO：6)、RFKWFW-NH2(SEQ ID NO：7)、OCT-KFKWPW-NH2(SEQ  IDNO：55)、OCT-KWKWFW-NH2(SEQ ID NO：56)、KWKWUW-NH2(SEQID NO：62)、KWKWZW-NH2(SEQ ID NO：63)、Hep-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：69)、Non-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：70)、Lau-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：72)、Myr-KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：77)、Pen-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：78)、Und-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：79)、Tri-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：80)、Oct-kfkwpw-NH2(SEQ ID NO：81)、Lau-kfkwpw-NH2(SEQ ID NO：83)和Oct-KFKWPw-NH2(SEQ ID NO：84)。该组合物还可含有一种药物传递系统。 
本发明还提供在哺乳动物中治疗或预防微生物感染的方法，所述方法包括施用治疗有效浓度的至少一种本发明的六肽。在某些实施方案中，所述六肽选自KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：1)、KWRWPW-NH2(SEQ ID NO：2)、KWKWFW-NH2(SEQ ID NO：3)、RWRWPW-NH2(SEQ ID NO：4)、KFKWFW-NH2(SEQ ID NO：6)、RFKWFW-NH2(SEQ ID NO：7)、OCT-KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：55)、OCT-KWKWFW-NH2(SEQ ID NO：56)、KWKWUW-NH2(SEQID NO：62)、KWKWZW-NH2(SEQ ID NO：63)、Hep-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：69)、Non-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：70)、Lau-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：72)、Myr-KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：77)、Pen-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：78)、Und-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：79)、Tri-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO：80)、Oct-kfkwpw-NH2(SEQ ID NO：81)、Lau-kfkwpw-NH2(SEQ ID NO：83)和Oct-KFKWPw-NH2(SEQ ID NO：84)。 
当微生物感染为真菌感染时，这些方法是有用的。当微生物感染为混合的真菌和细菌感染时，这些方法也是有用的。当真菌感染由选自白色念珠菌(Candida albicans)，红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)的真菌引起时，这些方法可特别有用。当细菌感染由选自铜绿假单胞菌(P.aeuroginosoa)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的细菌引起时，这些方法也可以是有用的。 
在又一个实施方案中，本发明提供抑制真菌细胞生长的方法，所述方法包括使所述真菌细胞与至少一种本发明的六肽接触，使得真菌细胞的生长被抑制。在某些实施方案中，所述真菌细胞是植物 病原体，选自芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、芸苔核盘菌(Pyrenopeziza brassicae)、Peronospora destructor和Botrytissquamnosa。 
在再一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物中预防微生物感染的方法，所述方法包括施用治疗有效浓度的六肽，所述六肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。 
在又一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含选自以下的六肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO.79、SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。 
附图描述 
以下附图构成了本说明书的一部分，纳入这些附图是为了进一步论证本发明的某些方面。参考这些附图中的一个或多个连同本文提出的具体实施方案的详述可更好地理解本发明。 
图1显示了SEQ ID NO：1(P0666)的圆二色性图，表明在所述肽与在此情况下由脂质体提供的脂质环境相互作用时的结构变化。 
图2显示了在阴道刺激物中实施的杀菌曲线，表明肽SEQ IDNO：55(P1032)在该环境中杀死细菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus))和酵母(白色念珠菌(C.albicans))。 
图3显示了在80％血清中实施的杀菌曲线，表明了SEQ ID NO.55(P1032)在该环境中杀死金黄色葡萄球菌(S.aureus)的能力。 
图4A和4B图示了萘丙氨酸-1和萘丙氨酸-2的结构，表明了其相似性和其芳香特性。 
图5显示了在10％血清中实施的杀菌曲线，表明脂质化肽SEQ ID NO：55(P1032)在该环境中杀死细菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus))的能力相对于其未脂质化母体SEQ ID NO：1(P0666)增加。 
图6显示了在10％血清中实施的杀菌曲线，表明了与SEQ ID NO：56(P1033)和P50(一种活性17聚体)相比的SEQ ID NO：55(P1032)的活性。 
图7显示了LTA结合测定，表明SEQ ID NO：72(P1148)以和P50(一种活性17聚体)相同的程度结合LTA。 
图8显示了在10％血清中实施的杀菌曲线，表明了与P64(一种传统的阳离子抗微生物肽)相比的SEQ ID NO：55(P1032)的活性。 
图9提供了通过H-NMR测定的SEQ ID NO：1(P0666)的结构，电荷以黑色表示，疏水性以白色表示。 
图10显示了在80％血清环境中实施的杀菌曲线，表明了SEQ ID NO：72(P1148)、SEQ ID NO：83(P1343)、SEQ ID NO：79(P1275)和SEQ ID NO：80(P1276)的活性。 
图11显示了在1mg/m1脂质和10％血清环境中实施的杀菌曲线，表明了与P64(一种传统的阳离子抗微生物肽)相比的SEQ ID NO：55(P1032)的活性。 
序列表描述 
以下的氨基酸序列表构成了本说明书的一部分，纳入这些序列表是为了进一步论述本发明的某些方面。参考这些序列的一个或多个连同本文提出的具体实施方案的详述可更好地理解本发明。 
表1 
氨基酸特征词(feature key)：OCT表示使用标准肽化学经酰胺键向肽加入辛酸。COOH表示C-端未酰胺化；J是氟化苯丙氨酸的符号；U表示1-Nal-OH，而Z表示2-Nal-OH，其中Nal是萘丙氨酸，它是一种非天然氨基酸，为苯丙氨酸和丙氨酸的类似物。脂质用缩写在上文列出，并类似于OCT偶合：myr＝肉豆蔻酸、und＝十一烷酸、pen＝十五烷酸、pal＝棕榈酸、ste＝硬脂酸、lau＝月桂酸、tri＝十三烷酸、cap＝己酸、ole＝油酸、non＝壬酸、hep＝庚酸、aca＝8-氨基辛酸，而deca＝癸酸。氨基酸的小写字母表示D-型残基。 
发明详述 
为了可更完整地理解本文描述的本发明，提出以下的详述。本发明总的来讲涉及含表现出期望生物特性的抗微生物六肽的组合物和方法。 
本发明涉及具有抗一系列抗微生物病原体的抗微生物活性的六肽。这些病原体可包括革兰氏阳性或阴性细菌、耐酸细菌如分枝细菌、寄生物、皮肤真菌或真菌病原体。典型的真菌病原体包括白色念珠菌(Candida albicans)，而典型的皮肤真菌包括红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)。 
此六肽的一个实例是SEQ ID NO：1(P0666)，其具有以下有用且令人惊奇的利益：无系统毒性、对蛋白酶降解的敏感性降低、穿透受感染组织部位(或区域)的能力增加以及生产成本节省。 
术语皮肤真菌不是指具体的真菌，而是指对通常在人和动物中引起皮肤病的一组3个真菌属的常用简略称号。这些真菌属包括表皮癣菌属(Epidermophyton)、毛癣菌属(Trichophyton)和小孢子菌属(Microsporum)。 
关于配制和施用药物的技术细节可见于最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co，Easton Pa.)。尽管期望区域性的局部传递，但存在其它传递方法，例如：口服、胃肠外、气溶胶、肌内、皮下、经皮、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。本发明可在多种载体介质中配制，例如在喷雾剂、气溶胶、水和油型(a water and an oil-type)乳液、油和水型(an oil andwater-type)乳液、面霜或体霜、防晒乳或晒后乳或者其它局部施用载体中配制。 
本文使用的术语“治疗剂”指用于治疗、对抗、缓解、预防或改善患者的不想要的病症或疾病的药剂。在本发明中待治疗的病症包括通常侵袭哺乳动物如人的各种真菌疾病，包括通常由白色念珠菌(Candida albicans)引起的酵母感染，以及通常由红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)引起的皮肤感染，例如足癣。另外，本发明的六肽和包含其的组合物可提供对掺入一般的护肤品和化妆品制剂中有用的特征，所述护肤品和化妆品制剂例如为各种皮肤化妆品、护肤霜、乳液、防晒剂和治疗性洗剂或乳膏剂，如抗痤疮制剂。 
I.肽合成
所有六肽都使用标准Fmoc(9-芴基甲氧羰基)化学法在AdvancedChemTech Apex 396 Multiple Pepetide Synthesizer(肽合成仪)上合成。Apex 396配有40孔反应单元，用于以0.15mmol规模同时生产达40种肽。所述肽可使用标准氨基酸制备为酰胺化序列或游离酸序列。首先清洗树脂，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)预溶胀。对于Rink酰胺或Wang树脂，溶胀时间在3分钟至1小时的范围内。用25％哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基达25分钟。然后彻底清洗树脂，以去除痕量的哌啶。Fmoc氨基酸单体在等摩尔的HOAt或HOBt的DMF溶液中预活化。所述溶液为0.5M浓度。使用HATU PyBop或HBTU作为活化剂，使用2.5-5倍摩尔过量的氨基酸，在使用位阻碱(二异丙基乙胺)的碱性条件下，进行酰胺偶联。偶联时间为1-1.5小时，接着清洗和再偶联，以实现双偶联或三偶联，然后去保护和继续增长肽链。偶联效率使用标准Kaiser测试监测。一旦在树脂上完成了肽合成，如上去除最后的Fmoc基团，留下的序列成为游离碱。脂质作为有机酸使用标准肽化学如上所述连接至N端或侧链胺。 
使用95％三氟乙酸(TFA)和水连同加入的适宜清除剂实现肽与酸不稳定接头的裂解。裂解时间在30分钟至1小时的范围内。立即由裂解单元中取出经裂解的肽，并转移至用于去除TFA的管中。TFA在减压下被去除。然后所述肽准备用于经使用反相C-18柱的HPLC和质谱测定法实施的纯化和分析。一级序列构象和制备型纯化使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)完成。 
本发明的六肽可使用多种氨基酸前体构建。所述肽可为仅含D-、L-或环状(非外消旋的)氨基酸的均一组合物。不考虑立体异构构型，这些氨基酸(本文使用的该术语包括亚氨基酸)的化学结构可基于19或20种天然氨基酸的化学结构：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、脯氨酸(Pro；P)、苯丙氨酸(Phe；F)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。半胱氨酸(Cys；C)被排除在外是为了防止产物中的二硫键问题。本发明的组合物还可为非均一的，例如含D-、L-和/或环状氨基酸。六肽组合物还可含为非天然氨基酸的氨基酸，例如正亮氨酸、高苯丙氨酸、鸟氨酸等。这些非天然氨基酸可选自含氨基和羧酸官能团的化合物，但不可为α氨基酸。 
一些六肽可用不同的氨基酸模拟物或非天然氨基酸修饰，这可提供特别有用的六肽，因为它们趋向于表现出增加的体内稳定性。更具体地说，非关键氨基酸不必限于蛋白中的那些天然氨基酸，例如L-α-氨基酸或其D-异构体，而是还可包括非天然氨基酸，例如氨基酸模拟物，例如D-或L-萘丙氨酸、D-或L-苯甘氨酸、D-或L-2-噻吩基丙氨酸、D-或L-1-，2-，3-或4-芘丙氨酸、D-或L-3-噻吩基丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯丙氨酸、D-p-氟苯基丙氨酸、D-或L-p-联苯基(biphenyl)苯丙氨酸、D-或L-p-甲氧基联苯基苯丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸和D-或L-烷基丙氨酸，其中所述烷基可为取代的或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。六肽稳定性可以多种方式测定。例如，肽酶和各种生 物介质如血浆和血清已用于测试稳定性。参见例如Verhoef等，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11：291(1986)。所述肽的半衰期可使用典型的25％血清(体积/体积)实验方便地测定。 
本领域技术人员会认识到，一旦选择了本发明的六肽，就可对其修饰，以含有功能等同的氨基酸置换，但仍保留相同或相似的抗真菌或抗细菌特征。Kyte和Doolittle(1982)已一般性地论述了赋予蛋白生物功能的氨基酸的亲水指数(hydropathic index)的重要性。这些研究人员和其它人已经发现，某些氨基酸可被其它具有相似亲水指数或得分的氨基酸置换，而仍保留即便不同也相似的生物活性。如下表2所展示的，根据氨基酸的疏水性和电荷特征指定氨基酸的亲水指数。一般认为，氨基酸的相对亲水特征决定了所获蛋白的二级结构，二级结构又限定了蛋白与底物分子的相互作用。同样，在其二级结构不是肽相互作用的主要方面的肽中，氨基酸残基在肽中的位置和特征决定了所述肽在生物系统中具有的相互作用。有人提出，通常可保留生物功能等同物，其中交换所具有的指数值的差值不超过±1-2的氨基酸，更优选差值在±1之内的氨基酸。 
表2 
因此，例如具有+4.5亲水指数的异亮氨酸可被缬氨酸(+4.2)或亮氨酸(+3.8)取代，而仍产生具有相似生物活性的蛋白。或者，在数值范围的另一侧，赖氨酸(-3.9)可被精氨酸(-4.5)置换，诸如此类。 
因此，这些氨基酸置换一般来说基于R基团取代基例如在大小、亲电特征、电荷等方面的相对相似性。一般来说，尽管不仅仅有这些置换，但考虑了各种前述特征的优选置换包括以下置换： 
表3 
A.稳定肽修饰
可对所述六肽实施各种修饰，只要保留需要的抗微生物活性。某些修饰可用于增加所述六肽的固有抗微生物特性。其它修饰可有利于所述六肽的处理。通常可被修饰的肽官能团包括羟基、氨基、胍、羧基、酰胺、苯酚、咪唑环或巯基。这些基团的典型反应包括但不限于用烷基卤将羟基乙酰化。羧基可酯化、酰胺化或还原为醇。碳二亚胺或其它催化剂可用于催化羧基的酰胺化。天冬酰胺或谷氨酰胺的酰胺基可在酸性或碱性条件下被去酰胺化。肽的伯氨基或赖氨酸残基的氨基之类的氨基容易发生乙酰化、烷基化、芳基化或酰胺化反应。酪氨酸的酚基可被卤化或硝化。其中肽的溶解性可被降低的实例包括使带电赖氨酸残基酰化或使天冬氨酸和谷氨酸的羧基乙酰化。 
六肽可缀合至可溶性或不溶性载体分子，以根据需要修饰其溶解性特性和增加六肽在其目标区域中的局部浓度。本发明的六肽组合物还可注射入植物的维管系统中。溶解性载体分子的实例包括聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。不溶性聚合物的实例包括砂或其它硅酸盐或聚苯乙烯、纤维素等。六肽还可被微囊化，以增强其在种子、土壤或植株施用当中的稳定性。植物施用对治疗各种植物 真菌疾病可能特别有用。典型的真菌植物病原体包括以下实例：例如小麦病原体颖枯壳多孢(Stagonospora nodorum)和小麦壳针孢(Septoria tritici)，以及半活体营养病原体，例如刺盘孢属(Colletotrichum)种，特别是豆炭疽病病原体豆刺盘孢(C.lindemuthianum)。其它常见的植物真菌病原体包括诸如芸苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassicicola)、芸苔核盘菌(Pyrenopeziza brassicae)、Peronosporadestructor和Botrytis squamosa的那些病原体。典型地，聚酯微球用于囊化和稳定所述肽。 
B.大规模肽合成
一旦选定了整体使用的具体肽组合物，就在溶液相或固相中实现大规模(达60kg)肽合成。此合成需要仔细选择保护基和缩合法。由诸如Sigma-Aldrich，Inc的化学供应商处可获得具有良好纯度的所有起始材料和试剂。另外，可由诸如Bachem或Novabiochem的供应商处获得氨基酸。通过使用新一代试剂，即HOBt、HOAt、HBTU或HATU，可极大地抑制或消除氨基酸结构单元在偶联条件下的外消旋。连固相法目前都被适宜地开发成以至少10kg/批重复地生产药用肽。 
C.肽在溶液中的大规模合成
溶液相合成使得容易针对基团保护策略、片段选择和片段偶联方法进行设计，以使外消旋最小化。中间体有时可简单地通过结晶技术分离，这可消除对通过柱层析纯化的需求，因此提升了按比例放大的潜力。同时生产的片段的量可在每一步容易地控制。 
D.肽的大规模固相合成
用于固相合成的更高级聚合物的成本通常较高。支持体中有一些不能大量获得。但是，其特性在锚定肽的可及性以及由树脂释放完全被保护、去保护或修饰形式的肽方面起重要作用。由实验室过 渡到生产规模的固相肽合成(SPPS)明显是有利的，原因在于以下事实：整个合成工艺可容易地自动化，合成步骤的效率可监测和优化。生产规模的活化工艺是众所周知的，对环境无害。另外，SPPS允许以生产规模由废弃的滤液直接回收和再循环过量的氨基酸结构单元。 
以下的参考文献在此具体地引入作为参考：Boris Group，“Production of large-scale peptides in solution.”Biochem.Soc.Trans.，18(6)，1299-306；Christian Birr，“The transition to solid-phase productionof pharmaceutical peptides.”Biochem.Soc.Trans.，18(6)，1313-16；和Paul Lloyd-Williams，Fernando Albericio and Ernest Giralt，“Convergentsolid-phase peptide synthesis.”Tetrahedron 49(48)，11065-11133。在要尝试大规模合成本发明的肽组合物的情况下，应遵循在这些参考文献中提及的方法和材料。 
当然，在已确定L-氨基酸肽具有足够抑制性(或者稳定化或者未稳定化)的情况下，有可能按照本领域技术人员众所周知的技术应用重组DNA表达以大规模量来生产这种肽。在生产重组肽的情况下和需要这种肽的稳定性的情况下，可通过使用肽化学领域技术人员已知的技术将D-氨基酸共价连接至一个或另一个或两个末端来保护所述肽，以防止在每个末端的攻击。 
E.肽的微球囊化
可根据待囊化的肽组合物的亲水或疏水性质使用各种微球制备方法。就其提供本文未提到的方法和材料而言，Wang，H.T.等，1991，“Influence of formulation methods on the in vitro controlled release ofprotein from poly(ester)microspheres，”J.of Controlled Release 17：23-25在此具体地引入。 
(1)o/o乳液法。为了有效搅拌，将在此方法中使用TTA-60滴定装置(Radiometer，Copenhagen，Denmark)。将聚(DL-丙交酯/乙交酯， 50∶50，Dupont)(0.5g)溶解在二氯甲烷(3.3ml)中。然后可通过在超声清洗机(Branson 3200，Branson Cleaning Company，Shelton，Conn.)中施加30秒的超声将喷物干燥的肽(25mg)分散在该溶液中。然后可通过带有220号针头的注射器将此悬浮液逐滴地通入到充分搅拌的乳液中，所述悬浮液含硅油(20-30ml)、CH2Cl2(30-40ml)和Span 85(2ml)。然后可将石油醚(30ml)滴加入以上分散液中。然后可继续搅拌2小时。然后过滤以此方式产生的微球，用石油醚清洗，并真空干燥72小时。 
(2)o/w乳液法。喷雾干燥的肽(25mg)、聚(DL-丙交酯/乙交酯，50∶50)(Dupont或Birmingham Polymers)(0.5g)和CH2Cl2(2ml)的超声悬浮液与含油酸钠(0.2g)的水溶液(50ml)一起在TTA-60中滴定装置中乳化5分钟。用旋转蒸发器(l20rpm)以360Torr(1小时，22℃)、160Torr(0.5小时、22℃)以及160Torr和40℃(1小时)去除二氯甲烷。过滤所获得的微球体，用水清洗，于室温真空干燥。 
(3)(w/o)/w乳液法。通过使用探头超声仪(Branson，Danbury，Conn.)以125W和40％工作循环、脉冲模式将肽(2.6mg)的蒸馏水(100ml)溶液与聚(DL-丙交酯/乙交酯，50∶50，Henley Chemical，RG503)的二氯甲烷溶液(0.5g/2ml)一起乳化。该乳液(w/o)将在含0.1％聚乙烯醇的水溶液(50ml，35℃)中用匀浆器(5000rpm，ESGE Handmixer M122，Biospec Products，Bartlesville，Okla)乳化5分钟。在旋转蒸发器上以300Torr和34℃(120rpm)、1小时将二氯甲烷由所获的(w/o)/w乳液中去除。过滤所获得的微球，用水清洗，于室温真空干燥或冻干(Consol4.5，Virtis Co.，Gardiner，N.Y.)。聚合物分子量可通过凝胶渗透层析法测定。微球的粒度可通过扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S-570，Tokyo，Japan)测定。 
还可进行体外肽释放研究。将微球(200mg)悬浮在pH7.2的磷酸缓冲盐水(PBS)(2.5ml)中，并在环境温育振荡器(G-24，NewBrunswick Scientific Co.，Edison，N.J.)中于37℃和100rpm搅拌。在特 定的取样时间(在研究的前4天每天取样，在研究的余下天数每隔一天取样)完全去除缓冲溶液，用新鲜PBS替换。使用Bradford法或其它合适的定量测定检测PBS中的肽含量。 
微囊化的其它方法是已知的，可在某些情况下发现其可用性。参见例如美国专利第4,324,683号。 
II.使用方法
本发明的其它实施方案涉及使用上述六肽的方法。使用方法优选对正常的、未感染的哺乳动物细胞不引起损伤或杀伤。在治疗剂量水平的使用方法优选对正常的、未感染的哺乳动物细胞不引起损伤或杀伤。所述使用方法可包括使用一种六肽，或者可包括使用多种六肽。 
对于本发明而言，“活性成分”指能够抑制靶微生物生长的六肽。靶微生物包括但不限于动物和人的病原体，例如引起酵母感染和各种皮肤感染(如足癣和其它皮肤真菌病症)的那些病原体。靶微生物还可包括那些引起根腐病、猝倒病、系统感染、维管疾病以及植物的某些表面区域感染的真菌。 
A.动物真菌疾病(腐霉属(Pythium)、念珠菌属(Candida))
可以预见，本发明还可用于治疗各种哺乳动物感染。以下的表4显示了各种哺乳动物真菌疾病，所述哺乳动物包括可接受本发明的组合物和方法的动物和人。本发明提供了可用于治疗细菌和/或真菌感染的药物组合物。此药物组合物包含有效量的抗所述微生物剂和药学可接受载体。用本文详细描述的六肽组合物测试本文列出的某些致病生物。药学可接受载体是本领域已知的，公开于美国药典和国家处方集，本发明的六肽可在所述载体中传递。 
表4 
根据设想的具体应用，本发明提供的药物组合物可配制为溶液、混悬剂、胃肠外制剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、喷雾剂、粉剂或片剂、胶囊剂。胃肠外制剂可包含溶媒如特别蒸馏的无热源水、磷酸盐缓冲液或生理盐水。软膏剂、乳膏剂、洗剂和喷雾剂可包含载体，如植物油或矿物油、白矿脂或高分子量醇，即大于C12的醇。片剂或胶囊剂可包含稀释剂(例如乳糖)、粘合剂、润滑剂(例如硬脂酸)和崩解剂(例如玉米淀粉)。 
还提供了治疗患有真菌感染的患者的方法，其包括给所述对象施用有效杀细菌或真菌量的本发明药物组合物。用于治疗或预防粘膜的细菌或真菌感染的施用方式在本领域众所周知。可使含活性成分的乳膏剂、栓剂或溶液剂与感染区域接触。当感染处于外部时，可每日两次将乳膏剂按摩入感染区域和周围区域，直至感染已被根除之后。在需要阴道内使用的情况下，应使用常规涂药器将约5g乳膏剂高位注射入阴道穹窿。此治疗应每日重复两次，直至感染已被根除。或者，可每日一次或两次将阴道栓剂高位插入阴道穹窿，持续治疗，直至感染已被根除为止。 
可能需要配制含有效量的本发明六肽或其组合的常规假牙(denture)胶粘糊剂。典型的浓度在每100g糊剂0.0125％至1.5％重量的抗微生物剂的范围内。以常规方式将约2g糊剂施加于假牙的接触面，然后嵌装入嘴中。此施加应在于假牙清洁剂中过夜浸泡后进行。可通过向约3-3.5g片剂加入有效量的抗微生物剂配制假牙清洁剂。此片剂溶解在水中，产生用于清洁假牙的抗微生物溶液。在优选的使用模式中，在假牙由患者嘴中取出后，将假牙浸泡在此清洁剂中达约8小时至约12小时。如果有需要，还可用本发明的抗微生物剂 配制假牙粘合粉，代替使用假牙粘合剂。 
还可用本发明的一种或多种六肽配制含有效量的活性药剂的口喷雾剂。该材料可作为抗微生物剂以0.25-0.5ml等份每天1-3次被喷雾到各个象限的牙齿和牙龈表面上。对于假牙佩带者来说，可在每日嵌装假牙之前将喷雾剂直接用在假牙表面上。如果有需要，可提供含有效量的所述抗微生物剂的漱口制剂。 
所述抗微生物剂可以有效量使用，包括在系统施用时约1至约500mg/kg宿主重量的范围内的剂量。活性药剂可配制在磷酸缓冲盐溶液中。气溶胶喷雾剂也是已知的，可通过其导入本发明的抗微生物六肽组合物。将抗微生物肽制备为药物组合物的代表性方法可见于美国专利第5,126,257号，该专利全文在此引入作为参考。 
本发明的一个实施方案是使用一种或多种本发明的六肽抑制或杀死微生物细胞(微生物)。所述微生物可为细菌细胞、真菌细胞、原生动物、病毒或病原微生物感染的真核细胞。所述方法一般来说涉及使微生物与一种或多种本发明的六肽接触。接触步骤可在体内、在体外、局部、口服、经皮、系统或本领域技术人员已知的任何其它方法实施。接触步骤优选以足以抑制或杀死微生物的浓度实施。所述六肽的浓度可为至少约0.1μM、至少约0.5μM、至少约1μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约50μM或至少约100μM。使用方法可涉及抑制或杀死微生物，例如细菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝细菌、酵母、真菌、藻类、原生动物、病毒和胞内生物。具体实例包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、衣原体属(Chlamydia)、白色念珠菌(Candida albicans)、酵母属(Saccharomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)或恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。接触步骤可通过系统注射、口服、 皮下、IP、IM、IV注射或通过局部施用来实施。对注射来说，剂量可在以下的任一个浓度之间：约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg和约100mg/kg。接触步骤可对哺乳动物、猫、狗、母牛、马、猪、鸟、鸡、植物、鱼或人实施。 
目前用于抗细菌应用的优选六肽包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：79和SEQ IDNO：80。 
目前用于抗真菌应用的优选六肽包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：79和SEQ IDNO：80。 
目前用于抗细菌和抗真菌应用的优选六肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：79和SEQID NO：80。 
B.六肽与抗真菌剂或抗细菌剂的协同作用
本发明的再一个实施方案涉及加性或协同增强治疗剂活性的方法。该方法可包括制备一种组合物，其中所述组合物包含至少一种本发明的六肽和治疗剂(例如抗生素，诸如青霉素)。备选地，该方法可包括采用与其它治疗剂联用的六肽(或六肽组合物)的联合治疗。所述六肽或六肽组合可为列于表1中的任一种多肽。优选地，所述方法包括施用以下的至少一种六肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83和SEQ IDNO：84。 
例如，如在以下实验中的描述，SEQ ID NO：55(S35-2)与治疗剂 克霉唑一起表现出对唑抗性菌株白色念珠菌(C.albicans)的协同作用。使用分级抑制浓度(fractional inhibitory concentration)(FIC)指数确定抗微生物剂之间的协同作用。在单独的情况下测定抗测试微生物的肽MIC 3次。在等于肽MIC的1/4的恒定量的肽存在下测试2倍连续稀释度的萘啶酮酸或氯霉素。如下计算FIC指数：FIC＝0.25+MIC(组合中的抗生素)/MIC(单独的抗生素)，其中0.25为组合中的肽的MIC与肽自身的MIC的比率。低于0.5的FIC指数被认为是表现出协同作用。 
表5 
所有菌株都是得自Ted White教授(Seattle Biotechnology ResearchInstitute，Seattle)的唑抗性临床分离株。 
表6 
在又一个实例中，SEQ ID NO：55(S35-2)与治疗剂多粘菌素B(PXB)一起表现出对抗药性细菌(例如描述于表7的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的协同作用。表7显示了所述六肽提升常规抗生素如多粘菌素B(PXB)对抗药性细菌(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的杀菌活性的潜力。正如所示，SEQ ID NO：55(S35-2)与多粘菌素B组合展现出协同活性(由FIC指数＜0.5指示)。 
表7 
SEQ ID NO：55(S35-2)与多粘菌素B(PXB)的协同作用 
注释： 
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)H187-野生型 
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)100609-妥布霉素抗性 
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)H401-粘液样临床分离株 
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)M917-多重抗药性临床分离株 
*FIC＝(MIC-NO：55-组合的)/(MIC-NO：55)+(MIC-PXB-组合的)/(MIC-PXB) 
*FIC＜0.5指示协同性 
治疗剂一般可为任意治疗剂，优选为抗生素、抗微生物剂、生长因子、趋化因子、抗微生物剂、溶菌酶、螯合剂或EDTA。优选地， 组合物的活性高于含治疗剂但没有六肽的相同组合物的活性。组合物或联合治疗可在体外、在体内、局部、口服、IV、IM、IP和经皮施用来使用。相比于单独的治疗剂的活性，含治疗剂和六肽的组合物的活性的增强优选为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％或200％。 
一般来说，在独立的基础上对靶有活性的任意六肽优选用于加性地或协同地增加抗该靶的另一种治疗剂的活性。如果几种六肽是已知协同应用的候选物，那么考虑毒性较低的六肽应当更有利。 
本发明的另外的实施方案涉及治疗诊断为囊性纤维化(CF)的患者的方法。CF连同其它作用一起在肺中引起炎症和感染。上述本发明六肽可用于治疗这种经常由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的肺感染。本发明六肽可具有有用的抗微生物特性，该特性应使它们有效治疗CF患者中的肺感染。六肽或六肽组合可通过任意可接受的方法施用给CF患者，所述方法包括吸入或系统传递。六肽或六肽组合可以单剂、多剂施用，或作为连续送递施用。 
本发明的另一个实施方案涉及治疗性传播疾病(STD)的方法。通过施用表1的一种或多种本发明六肽有可能抑制或杀死引起STD的许多真菌物种。这些物种的实例包括白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)和热带念珠菌(C.tropicalis)。本发明的六肽可另外用于抗其它引起STD的因子，包括病毒和细菌。所述六肽可通过任意可接受的方法施用于STD患者，例如局部、口服或系统传递。所述六肽可以单剂、多剂施用，或作为连续送递施用。所述六肽可以任意可接受的形式施用，例如乳膏、凝胶或液体。图2显示了在阴道环境中本发明六肽活性可能性的指示，其中在杀菌曲线中显示了SEQ ID NO：55抗白色念珠菌(C.Albicans)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的活性。 
本发明的组合物还可包括药学或皮肤学可接受的载体。载体的实例包括乳液和凝胶。乳液经常是油相和水相的混合物。所述组合 物还可包含去角质(exfoliant)磨料。所述组合物还可含有稳定剂。所述组合物还可含有控制泡沫的化合物。 
所述组合物还可包括一种或多种额外的护肤活性成分。护肤活性成分的实例包括脱皮活性物、抗痤疮活性物、维生素B3化合物、类视色素(retinoids)(包括视黄醇、视黄醛、视黄醇酯、丙酸视黄酯、视黄酸和棕榈酸视黄酯)、羟酸、自由基清除剂、螯合剂、抗炎剂、局部麻醉剂、晒黑活性物、亮肤剂、抗脂肪剂(anti-cellulite agent)、类黄酮化合物、抗微生物活性物、皮肤愈合剂、抗真菌活性物、法呢醇、植烷三醇、尿囊素、水杨酸、烟酰胺、右泛醇、醋酸生育酚和葡糖胺。 
所述组合物还可包括防晒化合物。防晒化合物的实例包括无机防晒化合物和有机防晒化合物。无机防晒化合物可包括金属氧化物，例如氧化锌、氧化钛和氧化铁。有机防晒化合物可包括辛基甲氧基肉桂酸盐、水杨酸辛酯、对苯二亚甲基二樟脑磺酸、阿伏苯宗和奥克立宁。 
本发明的另一个实施方案涉及使用表1的一种或多种六肽来促进伤口愈合。在某些实施方案中，所述六肽具有抗微生物的高效力，所述微生物包括最经常与伤口感染相关的细菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、化脓性链球菌(S.pyogenes)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。某些六肽还促进伤口愈合和炎症的减轻。所述六肽可以任意可接受的形式施用，例如乳膏、凝胶或液体。所述六肽可以任意可接受的方式施用，例如局部施用或系统施用。 
C.微生物菌株
下表列出了在实施例中使用的各种微生物。 
表8 
D.抗微生物活性
使用如以前所述(Steinberg等，AAC 41：1738，1997)的NCCLS(美国临床实验标准委员会(National Committee for Clinical LaboratoryStabdards))的微量肉汤稀释法的略微修改形式测定目标六肽的MIC(最小抑制浓度)。简而言之，在最合适的溶剂中以10X浓度制备抗微生物剂。对于所述六肽，使用含0.2％牛血清白蛋白作为载体蛋白的0.01％乙酸。通过将来自BAP(血液琼脂)的菌落再悬浮在培养基中并调整悬浮液至匹配0.5 McFarland标准来制备接种物。将悬浮液稀释入新鲜培养基(根据NCCLS对该生物体的推荐)，对细菌获得2×105 至7×105CFU/ml，或对念珠菌获得2×103至7×103CFU/ml。在将100μl等份的微生物悬浮液分装入96孔聚丙烯微量滴定板的每个孔中后，加入11μl的测试化合物。MIC定义为于35℃在16-20小时(细菌)或46-50小时(念珠菌)后防止可见浊度的最低药物浓度。 
在表9中，抗一组扩大范围的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的选定 六肽的MIC显示了其抗特别难对付的临床菌株的有效活性。 
表9 
抗一组扩大范围的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的六肽的MIC 
nd-未测定/未检测 
细菌菌株索引： 
#82：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，烧伤分离株 
#84：MRSA 
#86：表皮葡萄球菌(S.epidermidis)ATCC12228 
#88：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，痰分离株 
#89：金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC29213 
#92：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，抗甲氧苄啶(trimethoporin) 
#93：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，临床分离株 
#13：金黄色葡萄球菌(S.aureus)SAP0017，MRSA 
#12：金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923 
表10 
最小抑制浓度(Mic)/Mg/Ml 
*表示非XBXBOB六肽；ND-未测定/未检测 
SEQ ID NO：5(RWRWRW)和SEQ ID NO：8(RRRWWW)是Strom等，(2003)描述的非XBXBOB六肽。这两种六肽表现出的活性均低于本发明的XBXBOB家族六肽如SEQ ID NO：1(P0666)的活性。认为XBXBOB家族六肽的活性提升至少部分归因于对抗微生物活性有益的某些结构特性。不在XBXBOB式范围内的六肽几乎没有或没有表现出抗微生物活性。对于XBXBOB家族内的最优活性，我们已由结构和活性研究确定：在该模型中优选2位为F和5位为P。我们已证明，2位为F的结构可能是重要的，因为用相似的氨基酸如W置换实际上消除了活性，参见表9中针对SEQ ID NO：47(P1023)的MIC数据。用非天然氨基酸(例如1-萘基-L-丙氨酸(本文称为“U”)，即1-Nal，其在结构上比W更接近F)置换在2位具有F的XBXBOB六肽，产生中间活性(参见表10中针对SEQ ID NO：39(P1030)的数据)。 
E.细菌细胞壁组分脂磷壁酸的结合 
脂磷壁酸(LTA)是革兰氏阳性细菌(包括诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和疮疱丙酸杆菌(P.acnes)的生物体)的常见细胞壁组分。在感染过程中LTA的释放可导致宿主炎症反应介质的释放，这又可导致脓毒病(脓毒性休克)。例如，当注射入动物中时，LTA可激发脓毒性休克的许多特征，包括产生细胞因子、白细胞减少、循环衰竭、多器官功能障碍综合征和死亡。Scott等，(Infect.And Immun.67：6445-6453(1999))表明，阳离子肽(长26-29个残基)结合LTA可降低LTA将细胞为转化炎症反应的能力。如图7所示，六肽可分为两组：(1)不结合LTA的那些肽(SEQ ID NO：55)和(2)确实结合LTA的那些肽(SEQ ID NO：72)。使用Scott等，(Infect.And Immun.67：6445-6453(1999))描述的LTA结合测定，人们可证实(图7)，SEQ ID NO：72以和典型的高电荷α-螺旋两性肽如P50(VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2，SEQ ID NO：88)相同的程度结合LTA。这对于这种短肽是出乎意料的，为某些六肽提供了潜在的治疗价值。相比之下，SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：55不能结合LTA(图7)。 
F.抗疮疱丙酸杆菌(P.Acnes)的活性
生物活性短肽的一种非常有前景的应用是针对皮肤学适应症，例如痤疮。为确定一系列疮疱丙酸杆菌(P.acnes)菌株之间的脂-六肽活性是否一致以及该活性是否与传统的较长抗微生物肽相当，针对SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：81测试该生物体的10种菌株(ATCC菌株)，并与P50相比。结果(表11)表明为等同，在某些情况下相对于较长的高电荷肽有所提升。 
表11 
参考图8，脂质化不仅提升了血清中六肽的活性，其还提升了在模拟人痤疮病灶环境的脂质环境中的活性。人皮脂腺分泌物也叫做皮脂，含角鲨烯、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯和甘油三酯，其中疮疱丙酸杆菌(P.acnes)大滤泡群似乎利用了该环境，并水解某些皮脂脂质。青春期前和青春期的皮脂分泌增加几乎必定涉及青年期痤疮的发病。研究该环境中的SEQ ID NO：55的活性，与一种传统阳离子抗微生物肽P64对比。由于大部分脂质是水不溶性的这一事实，使用盐水中由摩尔比率7∶2∶1的磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇组成的脂质体，并在有或没有血清的情况下评价肽的杀菌动力学。使用的细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)MRSA，在两种情况下测试0.5mg/ml浓度的肽，表明是有效的(图8)。 
III.结构和抗真菌活性因素
A.XBXBOB六肽
表现出抗真菌活性的六肽遵循上式，其中X是带电的(亲水的)，O可为一系列残基，但优选可为萘丙氨酸、脂肪族残基(例如脯氨酸)或芳香族残基(例如苯丙氨酸)，而B是疏水残基。另外，似乎在C-末端酰胺化提升活性，在某些情况下是活性所需的。这些六肽的代表性实例如下： 
SEQ ID NO：1：KFKWPW***最具活性 
SEQ ID NO：2：KWRWPW**有活性 
SEQ ID NO：3：KWKWFW*有活性 
由结构活性关系(SAR)明显可见，在1位和3位的带正电荷残基是期望的抗微生物活性所需的。显然还可看出，在1位和可选的3位赖氨酸(K)可能好于精氨酸(R)。如下文的更详细描述，其它残基组合不提供相同的活性分布。 
由以上表10提出的数据可见，大部分测试的六肽基本没有或没有表现出抗微生物活性。但是，通用结构XBXBOB的所有六肽都表现出某一期望水平的抗微生物活性。总的来说，在XBXBOB六肽家族中，有两个亚组表现出期望活性。 
令人感兴趣的是，某些六肽尤其有活性，被看作是总XBXBOB 家族的亚组1的一部分。特别有活性的代表性六肽是KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO：1)。重要的是，如以下的表12所示，SEQ ID NO：1在血清中也是有效和有活性的。对于亚组1中的六肽，当2位为W时，例如SEQ ID NO：47(1023)；当5位是F时，例如SEQ ID NO：6(0734)；或者当2位氟化时，例如SEQ ID NO：59；或者如果当2位是W而4位和6位被变为F时，例如SEQ ID NO：50(1026)，活性降低。应当指出的是，序列表中的字母“J”表示氟化的苯丙氨酸。 
令人感兴趣的是，将脂质加入亚组1的代表性成员如SEQ IDNO：1中不影响MIC，但显著增加在生物环境如血清中的活性，参见例如SEQ ID NO：55(1032)和表12。所有亚组1六肽的非XBXBOB类似物大部分无活性(参见以下表12的具体实例)。 
XBXBOB六肽家族的另一亚组称为亚组2，活性略低，但表现出其它期望的性状；此亚组2的一个代表性成员是SEQ ID NO：3(KWKWFW-NH2；(0736))。亚组2成员的活性通过增加残基5的芳香族特性而增加，例如，SEQ ID NO：62和63已通过加入1-Nal-OH(在本序列表中称为“U”)(1-萘丙氨酸)或2-Nal-OH(在本序列表中称为“Z”)(2-萘丙氨酸)而得以修饰，参见表10的活性。缩写Nal在本文用于表示1-Nal-OH或2-Nal-OH。 
另外，在某些情况下通过使亚组2六肽成员脂质化而获得中度活性。但是，与SEQ ID NO：55(1032)不同，SEQ ID NO：56(1033)在生物环境中表现得不好。 
在亚组2六肽中，5位的W、2位的F、5位F的氟化以及采用XBXBOB式之外的序列的任意改变一般使活性降低。如果5位是带电残基，则大部分情况下所述肽是相对无活性，例如SEQ ID NO：9(KFKFKF-NH2)、SEQ ID NO：10(KYKYKY-NH2)和SEQ ID NO：23(KWKFKF-NH2)。此论断的一个例外是RWRWRW(SEQ ID NO：5)，但该肽在与最高活性肽如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63的活性相比时表现出非常低的活性。 
最后，如果XBXBOB六肽是非酰胺化的，则其无活性，例如表10中的SEQ ID NO：41-46。 
表12A-B 
尽管一般来说XBXBOB六肽对一系列微生物靶有活性，但并不是所有的六肽都等同地对所有微生物有效。要指出的是，SEQ ID NO：32-33对铜绿假单胞菌(P.auruginosa)、白色念珠菌(C.albicans)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的活性差，如表10和13所示。 
令人感兴趣的是，将脂质加入SEQ ID NO：1(KFKWPW-NH2)，形成在血清中六肽活性增强的SEQ ID NO：55(Oct-KFKWPW-NH2)，如图5-6和表9和12所示。另外，如表9、图2-3和图5-6所示，SEQ ID NO：55有效抗广谱唑抗性临床分离株，例如白色念珠菌(C.albicans)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)。令人感兴趣的是，SEQ ID NO：55在生理环境如阴道模拟培养基和血清中也有活性，如图2-3所示。 
B.SEO ID NO：1 (P0666)的结构研究
使用1mm光程长度的石英比色皿在J-810型分光偏振计(Jasco)上记录了如图1所示的CD光谱。于室温以50nm/分钟的扫描速度和每个样品总共10次扫描，检测190nm-250nm之间的光谱。记录100μg/ml肽浓度在3种环境中的光谱：10mM Tris缓冲液，pH7.5；50％TFE的水溶液；以及在POPC∶POPG(1∶1重量∶重量，2 mM)的脂质体中。在所有情况下，都通过扣除没有肽时溶液组分的光谱获得肽光谱。 
SEQ ID NO：1(P0666)在与脂质体环境相互作用时似乎经历了显著的变化，如图1所示。这与在含50％TFE的缓冲液中观察到的不显著变化相反。在相对短的肽中诱导的特定结构可能对活性具有显著意义。 
当置换某些六肽中的丙氨酸模拟物萘丙氨酸时获得有趣的结果。例如，用1-Nal-OH(在本序列表中称为“U”)(1-萘丙氨酸)置换SEQ ID NO：1中的F降低了SEQ ID NO：1的活性。同样，用2-Nal-OH(在本序列表中称为“Z”，为立体异构体2-萘丙氨酸)置换SEQ ID NO：1中的F也降低了SEQ ID NO：1的活性。但是，用1-Nal-OH(萘丙氨酸)置换SEQ ID NO：3中的F产生增强的活性和一种新的六肽SEQ IDNO：62(KWKWUW-NH2)，其中U为1-Nal-OH。通过用2-Nal-OH(一种不同的萘丙氨酸异构体)置换SEQ ID NO：3中的F也获得相似的结果，产生SEQ ID NO：63(KWKWZW-NH2)，其中Z是2-Nal-OH。推测1-Nal-OH和2-Nal-OH置换在物理上以额外的稠合芳香环形式补充了六肽的体积(bulk)，与取代的苯丙氨酸相比，这又增加了所述结构的疏水性和芳香性。因此，看起来体积和/或疏水性在SEQ ID NO：3和取代的SEQ ID NO：62和63中的5位是重要的，而在SEQ ID NO：1 的2位具有不利作用。 
通过1H-NMR在DPC胶束中测定核心肽KFKWPW-NH2(SEQ IDNO：1)的溶液结构。图9显示了相对于平均值具有最低RMSD(均方根偏差)的结构，电荷用蓝色表示，白色表示疏水性。值得注意的是，肽采用由非常有序的疏水部分和不太有序的电荷区组成的结构。这种两亲性可对肽活性和作用机制具有重要意义。脯氨酸明显在保持疏水结构域中的结构方面起关键作用。 
在开发和研究本发明六肽的过程中，鉴别、评价了许多非XBXBOB六肽的实例，并发现它们基本没有或没有表现出抗微生物活性，这些六肽一般被认为是“无活性的”。无活性的非XBXBOB六肽的代表性实例示于表13。 
表13 
C.酰化的结构活性关系
先前已表明，抗微生物肽的酰化可提升其活性。如Radzishevsky等，(Antimicrob.Agents Chemother.49：2412-2420(2005))所述，该活性提升取决于核心肽、所连脂质的长度，在某些情况下取决于所连脂质的类型。在采用核心肽SEQ ID NO：1时，我们连接了长度由6个碳至18个碳的一系列脂质，包括氨酰基氨基辛酸。连接通过标准肽化学法实施。由该工作证实，涉及抗微生物活性的所连脂质的最佳长度是8-14个碳(表14)。应当指出的是，对SEQ ID NO：76而言加入氨酰基如氨基辛酸并未提升活性，与以Radzishevsky等，(Antimicrob.Agents Chemother.49：2412-2420(2005))描述的该方式修饰的肽相反。 
表14 
应当指出的是，除了MIC数据以外，脂质-六肽还可由其在生物成分如血清存在下杀死细菌的能力来辨别。在这些环境下可见，SEQ ID NO：79(P1275)和SEQ ID NO：83(P1343)均表现得非常好(图10)。该活性作为治疗潜力的指标，由单独的MIC数据不能明显看出。 
D.脂质-六肽的作用机制
抗微生物肽的传统作用机制是其破坏细胞膜的能力。使用代表性肽SEQ ID NO：1(P0666)和SEQ ID NO：55(P1032)，评价六肽和脂质六肽与脂质膜相互作用的能力，其中所述脂质膜由脂质组成，模拟细菌或人细胞。在这些测定中，常规的抗微生物肽(15-40个氨基酸长)通过破坏膜双层引起胞质渗漏而导致细胞死亡来赋予杀伤作用。为确定六肽P0666及其脂质化类似物P1032是否遵循相似的作用机制，对它们进行diSC35荧光去猝灭实验。DiSC35是一种膜电位敏感染料，由供能细胞按照膜电位梯度吸收，集中于细胞膜中，导致猝灭染料荧光。当膜电位被破坏时，染料被释放，不再被猝灭，因此荧光增加。 在此情况下，使用活金黄色葡萄球菌(S.aureus)细菌细胞作为靶生物体。检测各种肽使胞质膜电位去极化的能力，该能力导致diSC35由细胞流失到缓冲液中，相应地荧光增加。与破坏膜的传统肽P50(VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2，SEQ ID NO：88)不同，P0666和P1032均不能引起金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞膜透化。 
在金黄色葡萄球菌(S.aureus)中没有观察到膜破坏，这与脂质体实验产生的数据有良好的关联。构建脂质体，以模拟细菌细胞(POPC∶POPG，3∶1)或真核细胞(POPC∶胆固醇，3∶1)的脂质组成。4μg/ml的六肽或脂质六肽均不能引起从脂质体(POPC∶POPG，3∶1)释放染料(钙荧光素)，与2μg/ml的P50相反。两种六肽即便在128μg/ml也未引起从脂质体(POPC∶胆固醇，3∶1)释放显著量的钙荧光素。 
E.抗性出现
对于新的作用机制，总是应考虑抗性的出现。在半MIC浓度的P1032和P1032d存在下，每日连续地转移MRSA(菌株SAP0017)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)(菌株ATCC 21923)。在连续30次传代后，MIC变化在起始MIC的2倍稀释度之内。这样的抗性被证实是瞬时适应，因为在没有肽的情况下各个抗性菌株的单次传代导致回复至原初MIC。 
纳入以下实施例是为了证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到，实施例中公开的技术符合发明人发现的在本发明实施中良好运行的代表性技术，因此可被认为构成了用于本发明实施的优选方式。但是，根据本发明的公开内容，本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明范围的情况下，可对所公开的具体实施方案中实施许多改变，仍获得同样或相似的结果。 
F.针对皮肤真菌红色毛癣菌(Trvchophvton Rubrum)和须癣毛癣菌(Trvchophvton Mentasrovhvtes)的抗微生物六肽的最小抑制浓度(MIC)评价
为了对比各种抗微生物肽(包括六肽SEQ ID NO：1(P0666))的活性，测定针对皮肤真菌红色毛癣菌(Trychophyton Rubrum)和须癣毛癣菌(Trychophyton Mentasrovhytes)的MIC。所研究样品的浓度分别为2000、1000、500、250和125μg/ml。所使用的培养基是无琼脂的改良型Sabouraud氏培养基。对于100mL改良型Sabouraud培养基：将3g Sabouraud氏葡萄糖肉汤(Difco)混合入100mL去离子水中。用0.1N NaOH将pH调节至7.0。将溶液高压蒸汽灭菌30分钟。将940μL培养基倾倒入带塑料帽的无菌20mL测试管中，令其冷却。 
将50μL盐水加入各20mL的测试管中，以制备所需浓度。对照管由无样品的50μL盐水组成。对于MIC实验，将10μL悬浮在盐水中的生物体加入各20mL的测试管中，轻微涡旋。各个测试管都用Parafilm封口，并于27℃以约100rpm的速度保持在振荡器上。 
每天观察生物体的生长/抑制。在第5天和第10天观察到生物体生长，示于表12。以125ppm重复MIC实验，因为大部分生物体的生长在第5天于250ppm时被抑制。在10天时抗真菌红色毛癣菌(Trychophyton Rubrum)和须癣毛癣菌(Trychophyton Mentasrovhytes)的化合物F1至F10的最小抑制浓度(MIC100)。 
表15 
发现SEQ ID NO：1(P0666KFKWPW-NH2)对红色毛癣菌(T.Rubrum)和须癣毛癣菌(T.Mentasrovhytes)最具活性。在第10天于125ppm仅有些微生长。 
G.毒性测试
为了评价系统施用本发明六肽的潜在毒性作用，通过尾静脉注射将一系列表现出抗真菌活性的肽以20mg/Kg的剂量导入小鼠血液系统中。由以下表13的数据可见，与其它测试肽不同，SEQ ID NO：1(参考名P0666；KFKWPW-NH2)未激发系统毒性。 
表16 
H.细胞毒性研究
1.P01032的体内毒性
测试0.1mg/ml和0.5mg/ml浓度的SEQ ID NO：55(S35-2)样品的细胞毒性，发现在24小时和48小时的测试中无细胞毒性，其中评价了细胞汇合、皱缩、空泡形成和细胞裂解。 
先前的研究已记载了，抗微生物肽P-50(一种17聚体)在减少部分厚伤口表面的金黄色葡萄球菌(S.aureus)细菌污染方面具有预防性利益。SEQ ID NO：55(P-1032)也已显示出相似的体外抗微生物活性。 
相比于P-50评价SEQ ID NO：55(P-1032)的体内抗微生物活性的研究用以下参数进行。所有测试剂都由Helix BioMedix，Inc提供。在该研究中评价两个治疗组： 
I.包含在4％HEC溶液中的1％P-50肽；和 
II.包含在4％HEC凝胶中的1％SEQ ID NO：55(P-1032)肽。 
使用无菌技术将两种测试剂转移至3ml注射器中。在研究期间，将0.5ml的适宜药剂分配至各个伤口。该量以薄层溶液或凝胶覆盖整个伤口表面。测试细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC12600)。这些研究的结果示于表14-16。 
麻醉12只Sprague-Dawley雌性大鼠(250-280g)，准备进行手术。用Brown植皮刀在每只大鼠的背部建立一个1″×1″部分厚度皮肤伤口。每个伤口均用3.1×105/0.05ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)(LOG5.49)污染。让伤口干燥30分钟，然后将动物等分为4个治疗组。各组中的伤口接受0.5ml适宜的测试剂。每个伤口均用透明膜绷带遮盖、用网垫覆盖并用胶带稳固。 
在首次治疗后24小时，麻醉动物，并取下其绷带。用湿润纱布轻轻清洁伤口表面，施加新的等份(0.5ml)局部药剂。再如前所述包扎动物。 
再于48小时时实施绷带更换和再施用局部药剂。因此，每只动物接受了3次局部治疗。 
在手术后72小时，使大鼠安乐死，由伤口中心获得全厚度的8mm钻取活检品。将活检品置于含5ml无菌盐水的预称重管中并再称重，以测定样品重量。使用组织研磨机匀浆活检品，并连续稀释和平板接种，以确定每克组织的细菌数。 
在手术前18小时，通过无菌环将单菌落金黄色葡萄球菌(S.aureus)由原种平板转移至胰胨豆胨肉汤中。将肉汤培养物在37℃水浴中搅拌18小时，然后通过以3200rpm离心10分钟收集细菌。细菌沉淀在无菌0.9％盐水溶液中清洗两次，再通过离心收集入沉淀中。将沉淀重悬浮在2ml无菌盐水中，彻底地混合，产生母液。然后由母液 制备由10-1至10-8范围的一系列1∶10稀释度。使用标准平板接种技术定量母液中的细菌数，随后定量各个1∶10稀释度的细菌数。使用的接种物经计算为3.1×105CFU/0.05ml(LOG5.49)。接种物管保持在冰上，轻轻摇动，临使用前吸入无菌吸管尖头中。 
使用12只雌性Sprague-Dawley大鼠(250-280g)。用氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物肌内麻醉它们。用电剪刀修剪它们背部的毛发，用Nair为皮肤脱毛。使用抗乙醇标记在背部中心画一个1″×1″模板。然后用碘伏(iodophor)擦洗后接70％异丙醇、碘伏溶液和70％乙醇处理皮肤。在移植区域和植皮刀上涂抹Shur-Clens以便润滑。然后使用气动Brown植皮刀取出1″×1″标记区域中的标准部分厚度皮肤移植物(0.015″厚度)。 
在用干燥纱布实现止血后，使用Eppendorf移液器向每个伤口精确地施加0.05ml接种物。让伤口干燥30分钟，然后每个伤口接受0.5ml局部药剂。然后用透明伤口绷带(Teqaderm，3M，St.Paul，MN)包裹每个伤口。用无菌纱布和2个3″布带圆周包套包扎动物。给予它们丁丙诺啡镇痛，由麻醉中复苏，并回到标准圈养和护理状态。 
在手术后24和48小时，通过吸入异氟烷再麻醉所有大鼠，去除其绷带。小心地取下绷带，用无菌纱布吸掉存在的任何液体。然后将0.5ml等份的指定治疗凝胶均匀地涂抹至整个伤口表面，和手术时一样再包扎动物并让其复苏。 
2.伤口外观分析
观察每个伤口的每次包扎变化，评价伤口表面和组织反应。有5个要检查的伤口状态参数： 
i.伤口膜稳固性—用于覆盖伤口的胶粘膜仍完全附着于伤口周围的皮肤吗？ 
ii.伤口表面—伤口表面的确切目测外观怎么样？ 
iii.渗出液的量—在膜下捕捉了多少渗出液？在许多情况下， 累积的渗出液引起膜失去粘性，渗出液将漏出。 
iv.组织反应的严重性—按照1(最小)、2(中等)和3(广泛)的尺度对组织反应程度主观分级。 
v.所涉及组织的百分率—在某些情况下，伤口表面含变性的、易碎的组织，可压着纱布擦去。该测试用于更好地分辨变性组织和粘性渗出液。 
3.细菌计数的评价
在手术后72小时，麻醉大鼠，去除其绷带，由各个伤口的中心取下8mm的全厚度钻取活检品，将其置于含5ml无菌盐水的预称重管中。再称重含样品的管，确定样品重量。匀浆样品，然后连续稀释4次，平板接种在胰胨豆胨琼脂上。过夜温育平板，计数菌落，计算每克组织的细菌计数，并转换为以10为底的对数。计算各组的平均值和标准偏差，使用ANOVA(方差分析)测定3个治疗组之间的任意显著性差异。 
4.术后并发症
所有动物在研究中都存活，无并发症。 
在12个治疗伤口的11个中未检测到细菌(表17-18)。在用1％P-50治疗的1个伤口中，检测到很少的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(表18)。 
5.组织反应
一般来说，对肽SEQ ID NO：55(P-1032)的组织反应是轻微的，而对P-50的组织反应是轻微至中等的(如表19中的结果所示)。 
6.结果概述
1％SEQ ID NO：55(P-1032)的4％HEC溶液似乎提供了与1％P-50相同水平的抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC 12600)的抗微生物作用(表17-18)。 
表17                表18 
表19 
观测注解： 
未密封的膜：Y＝是；-＝不是 
伤口状况：1＝正常；2＝有些部位显示出组织反应；3＝明显的 
变性组织；y＝浅黄色；r＝微红色；b＝褐色 
渗出液的量：-＝没有；S＝少量；L＝大量 
组织反应严重性：1＝最小；2＝中等；3＝大 
本文公开的并要求保护的所有组合物和/或方法和/或过程可按照本文的公开内容制备和实施，无需过多的实验。尽管已就优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，可在不偏离本发明的构思和范围的情况下，对本文描述的组合物和/或方法和方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地说，显然，在化学上和生理上均相关的某些药剂可替代本文描述的药剂，而获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员显而易见的相似替代和修改被认为属于本发明的范围和构思。 

Claims (14)

1.抗微生物六肽，所述抗微生物六肽包含在1和3位的亲水带电残基(X)；在2、4和6位的疏水残基(B)；以及在5位的萘丙氨酸(Nal)、脂肪族残基或芳香族残基(O)；其中，所述六肽结构表示为式XBXBOB；其中所述六肽选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85。
2.权利要求1的六肽，其中所述六肽选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。
3.权利要求1的六肽，其中所述六肽是SEQ ID NO:1。
4.权利要求3的六肽，其中所述六肽用脂质修饰，所述脂质选自庚酸、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、癸酸、十五烷酸、十一烷酸、十三烷酸和辛酸。
5.权利要求1的六肽，其中所述六肽选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84。
6.权利要求1的六肽，其中所述六肽为SEQ ID NO:72。
7.权利要求1的六肽，其中所述六肽为SEQ ID NO:79。
8.权利要求1的六肽，其中所述六肽为SEQ ID NO:85。
9.组合物，所述组合物含权利要求1-8中任一项的六肽和药学可接受的载体。
10.权利要求9的组合物，其中所述六肽在水性溶液中是可溶的。
11.权利要求1-8中任一项的六肽在制备用于治疗或预防微生物感染的药物中的应用，其中感染由细菌或真菌引起。
12.权利要求11的应用，其中微生物感染由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起。
13.权利要求11的应用，其中微生物感染由白色念珠菌(Candida albicans)引起。
14.权利要求1-8中任一项的六肽在制备用于施用于皮肤或皮肤伤口的药物中的应用。
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