CN116332777A - 二芳基苯甲胺类化合物、制备及作为载体合成多肽的应用 - Google Patents

二芳基苯甲胺类化合物、制备及作为载体合成多肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及二芳基苯甲胺类化合物、制备及作为载体合成多肽的应用，涉及多肽合成领域以及抗菌领域。本发明提供了二芳基苯甲胺类化合物作为可溶性载体在液相合成多肽链中的应用，其作为起始模板试剂依次偶联氨基酸构建多肽链并最终在温和条件下脱除该模板的方法本发明提供的多肽合成方法兼具固相和液相合成的优点，可以减少生产成本、简化提纯过程、实现高效大规模工业化生产；提供的两亲性抗菌肽序列长度短、组成简单且具有高效的广谱抗菌活性，在多肽化学和抗菌领域具有良好的前景和应用价值。

Description

二芳基苯甲胺类化合物、制备及作为载体合成多肽的应用
技术领域
本发明涉及多肽合成领域以及抗菌领域，更具体地，涉及二芳基苯甲胺类化合物、制备及作为载体合成多肽的应用，并且涉及一种两亲性抗菌肽，其序列设计和制备。
背景技术
近年来，由于传统抗生素靶标单一且长期广泛使用，导致多重耐药菌进化速度的加快，使得许多细菌产生耐药性。此外，目前抗生素的成本正在增加，新抗生素的开发速度远远落后于新型耐药细菌的出现速度。因此，迫切需要开发高效、低毒、不诱导细菌耐药的抗菌药物。
其中，抗菌肽作为天然免疫系统的重要组成部分，在过去的二十年里引起了众多研究者的关注。抗菌肽的主要杀菌机制为：通过静电作用接近细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出而死亡。这种快速的膜溶解机制使得抗菌肽作用于多个靶点，具有广谱抗菌活性，减少了产生耐药菌株的可能，有望成为新一代高效抑菌药物。但天然抗菌肽存在序列长，合成成本高；抗菌活性相对较低；易被蛋白酶降解等问题。为了弥补天然抗菌肽的这些缺点，保留并优化抗菌肽的有利特性，设计能够人工化学合成的序列简单的两亲性抗菌肽，为新型抗菌肽的研发应用提供了巨大帮助。
多肽的化学合成主要分为两条途径：固相合成和液相合成。在多肽化学的早期发展阶段，多肽合成反应一般都是在液相中进行的，但是传统的液相合成方法分离提纯困难、后处理繁琐。于是，在1963年，美国著名生物化学家Robert Bruce Merrifield提出在固相树脂上进行多肽合成。固相多肽合成方法有效的避免了液相多肽合成繁琐的分离提纯步骤，具有明显的优越性：(1)多肽合成过程中，多肽链连接于聚合物树脂上，得到的产物多肽是不溶的，易洗涤过滤；(2)反应过程中过量的试剂和副产物可以通过洗涤和过滤除去；(3)整个反应在同一容器中进行，避免了多次沉淀、洗涤以及分离造成的损失，操作简便；(4)操作具有强重复性。
然而，固相合成法也存在着一些问题：(1)合成多肽的序列短，当肽链残基超过50个时，肽链的合成就会受到一定程度的制约；(2)合成时间长；(3)合成效率和纯度低，成本高。随着氨基酸数量的增加，合成效率逐步下降，非目标多肽含量逐步增加，目标多肽的纯度逐步降低，后续的纯化和重复性愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵，多肽合成成本高，还不能完全满足作为商业化生产的要求。
近年来，为了改进传统固相合成方法的缺点，科学家们发明了一类采用固相和液相合成相结合的方式进行多肽的合成。通过设计具有特定结构的可溶性载体，在液相中进行氨基酸偶联，结合了固相和液相合成中间体纯化和后处理方法进行多肽合成，大大提高了多肽的生产规模和纯度，实现了大规模生产。
鉴于上述问题，本发明提供了一种操作简便、收率较高的液相多肽合成方法以及一类序列较短、组成简单的两亲性抗菌肽。主要解决目前多肽合成中分离纯化步骤多、耗时长，生产成本高的问题，以及提供一种解决细菌耐药性的手段。在多肽合成和治疗细菌感染性疾病方面有着重要作用。
发明内容
本发明提供了二芳基苯甲胺类化合物及其制备方法，原料简单易得、成本低，制备步骤温和、简单。使用该载体作为多肽链起始端，可以实现困难氨基酸的偶联，并且存在提纯简单、成本低、产量高的优势，最终得到C端酰胺化的多肽链。以解决现有技术中多肽合成中分离纯化步骤多、耗时长，生产成本高的技术问题。
根据本发明第一方面，提供了一种二芳基苯甲胺类化合物，所述二芳基苯甲胺类化合物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0004086693520000031
其中，R为C12～C22的烷基链。
根据本发明另一方面，提供了所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，反应式如下：
Figure BDA0004086693520000032
其中，R为C12～C22的烷基链，X为卤素；
所述制备方法包括以下步骤：
a、将式1所示的物质溶解，加入取代反应试剂RX和缚酸剂进行取代反应，生成化合物2；
b、将化合物2、还原剂和助溶剂加入溶剂中，进行还原反应后生成化合物3；
c、将化合物3溶解，加入取代反应试剂氨基甲酸乙酯和催化剂，进行取代反应后生成化合物4；
d、将化合物4溶解，加入碱液和助溶剂，进行水解反应后生成式Ⅰ所示的化合物。
优选地，步骤a中，所述缚酸剂为无水碳酸钾、无水碳酸钠、吡啶、二异丙基乙胺和三乙胺中的一种或两种以上的混合物；溶剂为DMF、DMAc、DMSO、THF、NMP和甲苯中的一种或两种以上的混合物；化合物1、取代反应试剂RX与缚酸剂的物质的量之比为1.0：(4.0～4.5)：(6.0～8.0)，取代反应温度为70～100℃，取代反应时间为16～20小时。
优选地，步骤b中，所述还原剂为硼氢化钠、氢化铝锂或硼烷，溶剂为THF、甲苯、二甲苯中的一种或多种的混合物；化合物2与还原剂的物质的量之为1.0：(4.5～5.0)，还原反应的温度为60～80℃，还原反应时间为4～6小时；
优选地，步骤c中，所述催化剂为甲烷磺酸，溶剂为THF、甲苯和二甲苯中的一种或多种的混合物；化合物3、取代反应试剂氨基甲酸乙酯与催化剂的物质的量之比为1.0：(2.0～2.5)：(0.2～0.5)，取代反应温度为100～120℃，取代反应时间3～6小时。
优选地，步骤d中，所述碱液为氢氧化钠，溶剂为THF、甲苯、二甲苯中的一种或多种的混合物，助溶剂为甲醇或乙醇，化合物4与水解反应试剂的物质的量之比为1.0：(7.0～7.5)，水解反应温度为100～120℃，水解反应时间为16～20小时。
根据本发明另一方面，提供了所述二芳基苯甲胺类化合物作为可溶性载体在液相合成多肽链中的应用。
优选地，所述应用具体为：以式Ⅰ所示的化合物为可溶性载体，以活化剂活化羧基组分，并在碱性条件下与氨基酸通过缩合剂进行缩合，脱除氨基保护基团，并且继续偶联下一氨基酸直至完成多肽的合成，最终裂解载体，得到不含起始端载体且N端酰胺化的多肽链。
根据本发明另一方面，提供了一种两亲性抗菌肽，所述两亲性抗菌肽的氨基酸序列为(AB)n，其中n为3～6的整数，A为阳离子型亲水氨基酸，B为疏水氨基酸；
优选地，所述多肽链为两亲性抗菌肽序列(AB)n，其中n为3～6的整数，A为阳离子型亲水氨基酸，B为疏水氨基酸；
优选地，所述阳离子型亲水性氨基酸为赖氨酸、精氨酸或组氨酸；疏水氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸或色氨酸。
根据本发明另一方面，提供了所述的两亲性抗菌肽在制备抗菌药物中的应用；
优选地，所述药物能杀灭的细菌为粪肠球菌、金色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌；所述药物能杀灭的真菌为白色念珠菌。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明提供的二芳基苯甲胺类化合物，其所用的原料简单易得，成本低。其作为可溶性载体在液相合成中合成多肽，其作为起始模板试剂依次偶联氨基酸构建多肽链并最终在温和条件下脱除该模板。相比于传统固相合成法合成多肽具有以下优势：①该合成方法中的所有反应在溶液中进行，为均相反应，节约反应原料、反应速度快、易于通过TLC技术检测反应终点，既降低了成本又节约了时间；②每步反应结束后，加入不良溶剂即可将过量反应物洗掉同时使产物析出，提纯方法简便，结合固相与液相合成路线的优点。
(2)本发明提供的一类两亲性抗菌肽，该抗菌肽序列较短、组成简单，包含亲水性的阳离子型氨基酸和疏水型氨基酸。合成成本低且具有高效广谱抗菌活性，在治疗细菌感染领域具有良好应用前景。由此解决现有抗菌肽序列复杂、合成成本高昂、抗菌活性较差等问题。
附图说明
图1为本发明式Ⅰ所示的化合物的合成路线。
图2为本发明合成多肽链的合成路线。
图3为本发明一些实施例抗菌肽的最小杀菌浓度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的作为液相多肽合成载体的二芳基苯甲胺类化合物，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0004086693520000061
其中，R选自C12～C22脂肪链。
在本发明的一些具体实施方案中，化合物结构如式Ⅱ所示：
Figure BDA0004086693520000062
该载体式Ⅱ所示化合物，分子式C61H109NO4，分子量为920.55，命名为BDPMA。
本发明提供液相多肽合成载体的制备方法，以式1所示化合物为原料，经取代反应、还原反应，再经取代反应和水解反应等步骤制得。
Figure BDA0004086693520000071
式1所示化合物，分子式C13H10O5，分子量246.22。
式Ⅰ所示化合物的合成路线如附图1所示。
包括以下步骤：
a)将式1所示的化合物、1-溴代十二烷、无水碳酸钾加入溶剂DMF中，进行取代反应后生成化合物2即式2表示的化合物；其中反应温度为80～90℃；
所述步骤(a)的后处理工艺为：向反应得到的式2所示的化合物经缓慢加入盐酸水溶液和水沉淀，再经水和甲醇洗涤、过滤、干燥即得。
b)将式2所示的化合物溶于溶剂THF和甲苯中，少量多次加入硼氢化钠，进行还原反应后生成化合物3即式3表示的化合物；其中反应温度为60～70℃；
所述步骤(b)的后处理工艺为：向反应得到的式3所示的化合物缓慢加入盐酸水溶液淬灭，脱溶后再加入盐酸水溶液和水调节pH值沉淀，最后通过水和甲醇洗涤、过滤、干燥即得。
c)将式3所示的化合物、氨基甲酸乙酯、甲基磺酸溶于溶剂甲苯中，进行取代反应后生成化合物4即式4表示的化合物；其中反应温度为110～120℃；
所述步骤(c)的后处理工艺为：将反应得到的式4所示的化合物经缓慢加入无水碳酸钠除去催化剂，脱溶后加入甲醇洗涤、过滤、干燥即得。
d)将式4所示的化合物和NaOH溶于甲苯和少量乙醇中，进行水解反应后生成化合物Ⅲ即式Ⅲ表示的化合物；其中反应温度为100～110℃；
所述步骤(d)的后处理工艺为：将反应得到的式Ⅲ所示的化合物经水、正己烷和乙酸乙酯的混合溶液萃取，再经水洗涤，最后通过水和甲醇过滤、干燥即得。
作为本发明的一种优选方案，步骤a)中，所述的缚酸剂包括无水碳酸钾、无水碳酸钠、吡啶、二异丙基乙胺、三乙胺中的一种或者两种以上的混合物；所述取代反应试剂a包括卤代烷烃RX中的一种或者两种以上的混合物，R是C12～C22脂肪链，X是卤素；所述溶剂为DMF、DMAc、DMSO、THF、NMP、甲苯中的一种或两种以上的混合物；
步骤a)中，式1所示物质、取代反应试剂与缚酸剂的摩尔比为1.0:4.0～4.5:6.0～8.0，取代反应温度为70～100℃，取代反应时间为16～20小时。
作为本发明的一种优选方案，步骤b)中，所述的还原剂包括硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷；所述的溶剂包括THF、甲苯、二甲苯中的一种或两种以上的混合物；式2所示化合物与还原剂的摩尔比为1.0:4.5～5.0，还原反应的温度为60～80℃，还原反应时间为4～6小时。
作为本发明的一种优选方案，步骤c)中，所述取代反应试剂为氨基己酸乙酯，催化剂为甲烷磺酸；所属的溶剂包括THF、甲苯、二甲苯中的一种或两种以上的混合物；式3所示化合物、取代反应试剂b与催化剂的摩尔比为1.0:2.0～2.5:0.2～0.5，取代反应温度为100～120℃，取代反应时间3～6小时。
作为本发明的一种优选方案，步骤d)中，所述水解反应试剂为氢氧化钠；所述溶剂包括THF、甲苯、二甲苯中的一种或两种以上的混合物；所述助溶剂包括甲醇、乙醇中的一种或两种的混合物；式4所示化合物与水解反应试剂的摩尔比为1.0:7.0～7.5，水解反应温度为100～120℃，水解反应时间为16～20小时。
化合物Ⅱ的合成路线为：
Figure BDA0004086693520000091
取式1化合物2.0g(8.1mmol)和1-溴代十二烷9.2g(36.6mmol)，加入500mL三颈烧瓶内，并向烧瓶内加入100mL DMF，搅拌溶解，再加入无水碳酸钾8.0g(56.9mmol)，升温至80℃回流反应16小时。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冰水浴冷却。在充分搅拌下，向反应液中缓慢加入1mol/L盐酸100mL和50mL水，继续搅拌15min固体析出后过滤，滤饼依次用水、甲醇冲洗。在40℃条件下真空干燥6小时，得到白色固体化合物7.1g，收率95.4％。
取式2化合物7.1g(7.7mmol)，加入200mL三颈烧瓶内，并向烧瓶内加入100mL THF和5mL甲醇，升温至60℃搅拌溶解，再向烧瓶中少量多次加入硼氢化钠1.4g(36.4mmol)，60℃条件下回流反应6小时。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冰水浴冷却。在充分搅拌的条件下，向反应液中逐滴加入1mol/L盐酸20mL，滴加完毕后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入80mL水，并用1mol/L的盐酸调节pH至5～7。悬浊液再经充分搅拌15min，过滤，滤饼依次用水和甲醇冲洗。在40℃条件下真空干燥6小时，得到白色固体化合物6.9g，收率97.5％。
取式3化合物6.9g(7.5mmol)、氨基甲酸乙酯1.4g(15.1mmol)和甲烷磺酸0.4g(3.8mmol)，加入200mL三颈烧瓶内，并向烧瓶内加入100mL甲苯，升温至110℃回流反应5小时。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冷却至室温，加入无水碳酸钠0.5g(5.0mmol)，减压浓缩除去甲苯。向剩余物中加入100mL甲醇和25mL甲苯，升温至90℃，搅拌充分溶解。将反应液自然冷却至室温析出晶体。过滤，滤饼用甲醇冲洗。在40℃条件下真空干燥6小时，得到黄色固体化合物7.0g，收率94.2％。
取式4化合物7.0g(7.1mmol)和氢氧化钠2.0g(51.1mmol)，加入200mL三颈烧瓶内，并向烧瓶内加入90mL甲苯和60mL乙醇，充分搅拌溶解，升温至100℃回流反应16小时。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冷却至室温。冷却后，加入90mL水、60mL正己烷和60mL乙酸乙酯，萃取静置分层，将水层丢弃，有机层用90mL水洗涤2次，然后减压浓缩除去溶剂。再向剩余物中加入50mL水和50mL乙腈，充分搅拌15min形成悬浊液。过滤，滤饼用水和乙腈冲洗。在40℃条件下真空干燥6小时，得到黄色固体化合物6.0g，收率91.1％。白色固体即为化合物Ⅱ，化合物Ⅱ为氨基树脂型可溶性疏水的液相载体。
按照本发明的第二个目的，提供了一种液相多肽合成的方法，以式Ⅰ为原料，依次偶联氨基酸，脱保护，制得C端酰胺化的多肽链，裂解。
合成路线如附图2所示。
多肽链液相合成包括如下步骤：
1)偶联氨基酸：
在本发明的技术方案中，式Ⅰ所示的化合物和氨基酸摩尔比为1:1.1～1.5，缩合剂包括EDC、DCC、DIC、HATU、HBTU、HOAt、HOBt、PyAOP、PyBOP中的一种或者两者以上的混合物，其中优选为HOBt/HBTU(1.5～2.0equiv)；
在本发明的技术方案中，碱性条件由DIPEA、TEA、DBU、吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶中的一种或两种以上的混合物提供，其中优选为DIPEA(3.0～4.0equiv)；
所用溶剂包括DCM、CHCl3、THF，其中优选为DCM。
2)脱Fmoc：
在本发明的技术方案中，脱保护试剂包括哌啶、4-甲基哌啶、DBU、二乙胺，其中优选为4-甲基哌啶；所用溶剂包括DCM、CHCl3、THF，其中优选为DCM；4-甲基哌啶与DCM的体积比为1:9。
3)裂解：
在本发明的技术方案中，裂解多肽和液相合成的载体条件为TFA:TIS:H2O的组合，优选为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(体积比)。
按照本发明的第三个目的，提供了一种两亲性抗菌肽，该抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为(AB)n，其中，n为3～6的整数，A为亲水性阳离子型氨基酸，B为疏水型氨基酸。
作为本发明的一种优选方案，所述阳离子型氨基酸为赖氨酸、精氨酸或组氨酸；所述疏水型氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸或色氨酸。
在本发明的技术方案中，所述两亲性抗菌肽的合成方法，采用可溶性二芳基苯甲胺类化合物作为载体通过上述液相合成路线来完成。
下表为本发明所用试剂：
Figure BDA0004086693520000111
Figure BDA0004086693520000121
实施例1
两亲性抗菌肽结构式为RARARA-NH2，上述载体用于(RA)3序列多肽合成：
Figure BDA0004086693520000131
1)Fmoc-Ala-BDPMA(第一个氨基酸的偶联)：
取化合物Ⅲ2.0g(2.2mmol)，加入250mL三颈烧瓶内，向烧瓶内加入30mL DCM，充分搅拌溶解。取HOBt(0.59g，4.4mmol)、HBTU(1.67g，4.4mmol)和Fmoc-Ala-OH(0.78g，2.5mmol)，加入5mL DMF溶解上述缩合剂和氨基酸，配制得到混合溶液。将该混合溶液加入烧瓶内，再加入1.54mL DIPEA(8.8mmol)，升温至60℃回流反应10min。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冷却至室温，减压浓缩除去DCM。向剩余物加入30mL乙腈，充分搅拌15min形成悬浊液。过滤，滤饼用乙腈和甲醇洗涤。在40℃条件下真空干燥6小时，得Fmoc-Ala-BDPMA。
2)H-Ala-BDPMA(脱Fmoc)：
将上述产物加入250mL三颈烧瓶内，加入10％的4-甲基哌啶/DCM的混合溶液(体积比)30mL，充分搅拌溶解，40℃下反应20min。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，减压浓缩除去DCM。向剩余物加入30mL乙腈，充分搅拌15min形成悬浊液。过滤，滤饼用乙腈和甲醇洗涤。在40℃条件下真空干燥6小时，得H-Ala-BDPMA。
3)Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-BDPMA(第二个氨基酸的偶联)：
将上述产物H-Ala-BDPMA加入250mL三颈烧瓶内，向烧瓶内加入30mL DCM，充分搅拌溶解。取HOBt(0.59g，4.4mmol)、HBTU(1.67g，4.4mmol)和Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.62g，2.5mmol)，加入5mL DMF溶解上述缩合剂和氨基酸，配制得到混合溶液。将该混合溶液加入烧瓶内，再加入1.54mL DIPEA(8.8mmol)，升温至60℃回流反应10min。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，将反应液冷却至室温，减压浓缩除去DCM。向剩余物加入30mL乙腈，充分搅拌15min形成悬浊液。过滤，滤饼用乙腈和甲醇洗涤。在40℃条件下真空干燥6小时，得Fmoc-Arg(Pbf)-Ile-BDPMA。
4)重复2～3进行第3、4、5、6、7、8个氨基酸的偶联和脱保护，得到多肽链NH2-Arg(Pbf)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-BDPMA。
5)裂解：
将上述偶联、脱保护完毕的化合物加入250mL三颈烧瓶中，向烧瓶中加入30mLTFA、TIS和H2O的混合溶液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)，室温搅拌反应3小时。TLC监测反应终点，原料耗尽反应结束后，减压浓缩除去溶剂。将剩余物以体积比1：3滴加入异丙醚中，充分搅拌15min形成悬浊液。过滤，滤饼用异丙醚洗涤。在40℃条件下真空干燥6小时，得产品H-Arg-Ala-Arg-Ala-Arg-Ala-NH2。
实施例2至实施例12合成过程中的条件、参数如表1所示，除了表中给出的条件、参数设定外，其他未说明的条件、参数、制备方法等均与实施例1保持一致。
实施例2～12如下表：
Figure BDA0004086693520000141
Figure BDA0004086693520000151
最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)是评估抗菌剂抗菌性能的重要参数。上述两亲性抗菌肽抗菌活性的测定：首先将实施例1中制备的抗菌肽配制为浓度为4096μg/mL的储存液以备使用。其次，通过二倍稀释法评估抗菌肽对于革兰氏阴性菌沙门氏菌、革兰氏阳性菌粪肠球菌以及真菌白色念珠菌的抑菌性能。
测试步骤如下：
1)将所述细菌复苏、活化，并配制成浓度为2×106CFU/mL的菌悬液备用；
2)取无菌96孔板，先向每一孔加入100μL的LB细菌基础培养基；
3)向第一孔加入100μL浓度为4096μg/mL的抗菌肽，混匀。从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀。再从第二孔吸取100μL加入第三孔，以此类推，最后一孔吸取100μL弃去。此时各孔抗菌肽的浓度为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4μg/mL；
4)再向每一孔中加入100μL配制好的2×106CFU/mL的菌悬液，此时菌悬液浓度为1×106CFU/mL，各孔抗菌肽的浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/mL；
5)阴性对照为200μL的LB培养基、阳性对照为100μL的LB培养基以及100μL的菌悬液；
6)将接种好的96孔板放置37℃培养箱进行培养，24h后通过酶标仪测试OD600处的吸光度，得到抑制菌株生长的抗菌肽的最低浓度。
7)根据最小抑菌浓度配制一系列浓度梯度的抗菌肽备用。取无菌96孔板，先向每一孔加入100μL的LB细菌基础培养基，按照浓度梯度向不同孔加入不抗菌肽，混匀后吸取100μL弃去。
8)将接种好的96孔板放置37℃培养箱进行培养，24h后用培养液稀释，并接种于LB琼脂培养基上，再于37℃培养箱培养16-18h后，计数菌落形成单位(CFUs)。设置仅有细菌悬液不含药物的LB琼脂培养板为对照组。以杀菌率为99％的培养板浓度作为最小杀菌浓度(MBC)。图3为本发明实施例1-12所得阳离子抗菌肽的杀菌浓度检测图。可以看出抗菌肽对革兰氏阴性菌(沙门氏菌)、革兰氏阳性菌(粪肠球菌)和真菌(白色念珠菌)均表现出良好的杀灭效果，其中实施例1仅在低浓度50μg/ml即可杀灭上述细菌和真菌。
实施例1～12的两亲性抗菌肽的最小杀菌浓度如下表：
Figure BDA0004086693520000161
Figure BDA0004086693520000171
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种二芳基苯甲胺类化合物，其特征在于，所述二芳基苯甲胺类化合物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0004086693510000011
其中，R为C12～C22的烷基链。
2.如权利要求1所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，其特征在于，反应式如下：
Figure FDA0004086693510000012
其中，R为C12～C22的烷基链，X为卤素；
所述制备方法包括以下步骤：
a、将式1所示的物质溶解，加入取代反应试剂RX和缚酸剂进行取代反应，生成化合物2；
b、将化合物2、还原剂和助溶剂加入溶剂中，进行还原反应后生成化合物3；
c、将化合物3溶解，加入取代反应试剂氨基甲酸乙酯和催化剂，进行取代反应后生成化合物4；
d、将化合物4溶解，加入碱液和助溶剂，进行水解反应后生成式Ⅰ所示的化合物。
3.如权利要求2所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述缚酸剂为无水碳酸钾、无水碳酸钠、吡啶、二异丙基乙胺和三乙胺中的一种或两种以上的混合物；溶剂为DMF、DMAc、DMSO、THF、NMP和甲苯中的一种或两种以上的混合物；化合物1、取代反应试剂RX与缚酸剂的物质的量之比为1.0：(4.0～4.5)：(6.0～8.0)，取代反应温度为70～100℃，取代反应时间为16～20小时。
4.如权利要求2所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述还原剂为硼氢化钠、氢化铝锂或硼烷，溶剂为THF、甲苯、二甲苯中的一种或多种的混合物；化合物2与还原剂的物质的量之为1.0：(4.5～5.0)，还原反应的温度为60～80℃，还原反应时间为4～6小时。
5.如权利要求2所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述催化剂为甲烷磺酸，溶剂为THF、甲苯和二甲苯中的一种或多种的混合物；化合物3、取代反应试剂氨基甲酸乙酯与催化剂的物质的量之比为1.0：(2.0～2.5)：(0.2～0.5)，取代反应温度为100～120℃，取代反应时间3～6小时。
6.如权利要求2所述二芳基苯甲胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤d中，所述碱液为氢氧化钠，溶剂为THF、甲苯、二甲苯中的一种或多种的混合物，助溶剂为甲醇或乙醇，化合物4与水解反应试剂的物质的量之比为1.0：(7.0～7.5)，水解反应温度为100～120℃，水解反应时间为16～20小时。
7.如权利要求1所述二芳基苯甲胺类化合物作为可溶性载体在液相合成多肽链中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：以式Ⅰ所示的化合物为可溶性载体，以活化剂活化羧基组分，并在碱性条件下与氨基酸通过缩合剂进行缩合，脱除氨基保护基团，并且继续偶联下一氨基酸直至完成多肽的合成，最终裂解载体，得到不含起始端载体且N端酰胺化的多肽链。
9.一种两亲性抗菌肽，其特征在于，所述两亲性抗菌肽的氨基酸序列为(AB)n，其中n为3～6的整数，A为阳离子型亲水氨基酸，B为疏水氨基酸；
优选地，所述多肽链为两亲性抗菌肽序列(AB)n，其中n为3～6的整数，A为阳离子型亲水氨基酸，B为疏水氨基酸；
优选地，所述阳离子型亲水性氨基酸为赖氨酸、精氨酸或组氨酸；疏水氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸或色氨酸。
10.如权利要求9所述的两亲性抗菌肽在制备抗菌药物中的应用；
优选地，所述药物能杀灭的细菌为粪肠球菌、金色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌；所述药物能杀灭的真菌为白色念珠菌。
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