CN116510033A - 一种抗肿瘤的ppc药物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种抗肿瘤的PPC药物及其制备方法与应用，属于抗肿瘤技术领域。为了解决高细胞毒性多肽CTP3毒性太大，靶向性差的技术问题。本发明提供一种抗肿瘤的PPC药物，将抗肿瘤的肽与靶向肽通过连接物连接获得的。本发明的PPC药物，对比原型CTP3，具有靶向性，增强药物定向杀伤肿瘤细胞的能力，并且对肿瘤细胞的抑制能力更佳；采用本发明的Linker，将靶向多肽与CTP3有效连接，降低了CTP3的毒性，更利于给药，同时解决了药物传递问题，二硫键接头在细胞内断裂释放出药物，提高了生物利用度。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤技术领域，具体涉及一种抗肿瘤的PPC药物及其制备方法与应用。
背景技术
高细胞毒性多肽CTP3是由哈尔滨吉象隆生物技术有限公司自主设计的多肽，其公开在专利一种杀灭肿瘤细胞的多肽及其应用(公开号是CN114133429A)中，主要存在毒性太大，且没有靶向性。高细胞毒性多肽CTP3虽然代谢快，但是仍会破坏体内正常细胞，对人体有伤害。
发明内容
本发明的目的是为了解决高细胞毒性多肽CTP3毒性太大，靶向性差的技术问题。
本发明提供一种抗肿瘤的PPC药物，将抗肿瘤的肽与靶向肽通过连接物连接获得的。
进一步地限定，抗肿瘤的肽的序列如下所示KLLKKLLKKLLKKLLKK-NH2。
进一步地限定，所述连接键为可断裂的二硫键。
进一步地限定，所述可断裂的二硫键的结构为
进一步地限定，所述靶向肽为c[C(RGD)nC]，n≥2的正整数。
进一步地限定，靶向肽为c[Cys-Asp-Gly-Arg-Arg-Gly-Asp-Cys]，c[Cys-(Arg-Gly-Asp)n-Cys]，靶向肽中功能重复的单元结构为当n＝2时，靶向肽结构为/>
进一步地限定，抗肿瘤的PPC药物的结构为
本发明提供上述的抗肿瘤的PPC药物在制备杀灭肿瘤细胞中的应用。
进一步地限定，所述肿瘤细胞为人非小细胞肺癌细胞、人原位胰腺腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人胰腺癌细胞和人脑胶质瘤细胞。
有益效果：本发明的PPC药物，对比原型CTP3(KLLKKLLKKLLKKLLKK)，具有靶向性，增强药物定向杀伤肿瘤细胞的能力，并且对肿瘤细胞的抑制能力更佳；采用本发明的Linker，将靶向多肽与CTP3有效连接，降低了CTP3的毒性，降低对正常细胞的破坏力，更利于给药，同时解决了药物传递问题，二硫键接头在细胞内断裂释放出药物，提高了生物利用度。
CTP3是高毒性的多肽，对细胞杀伤没有选择性，即正常细胞与癌细胞均可杀伤，因此无法成药，所以本发明，在CTP3的基础上，增加可断裂的靶向肽，降低其毒性，使其在人体内不破坏正常细胞，同时，靶向肽使其在指定部位聚集，进入癌细胞后，连接臂断裂，CTP3再现高毒性，杀灭癌细胞。所以，CTP3改构后的新化合物可作为药物来研究与使用。
附图说明
图1为本发明中PPC(JP-001-A6)的HPLC图谱；
图2为在细胞系PANC-1和A549中，JP-001-A6在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；
图3为在细胞系MIA-PaCa-2中，JP-001-A6在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；
图4为在细胞系U251中，JP-001-A6在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；
图5为PANC-1、A549中，JP-001-A6在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图。
具体实施方式
本发明实施例中涉及的英文缩合所对应的中文名称见下表
合成SPDP-COOH(3-(2-吡啶二硫代)丙酸)
称取2,2-二硫二吡啶33.75g于圆底烧瓶中，加入270ml乙醇搅拌溶解，并加入3.6ml冰乙酸，称8.11g巯基丙酸用180ml乙醇稀释后滴加至反应液，30min内滴加完毕，室温反应5h。
真空浓缩除去溶剂，用柱层析分离纯化，流动相二氯甲烷：乙醇＝3:2，(3％冰乙酸)，得到目标收集液。真空浓缩，萃取除去冰乙酸，真空浓缩得12.52g SPDP-COOH。结果如图1所示。
合成Mpa-CTP3
树脂脱Fmoc保护
称替代度为0.55mmol/g的RA树脂18.23g(合成规模10mmol)于反应容器中，加适量DMF溶胀1h后抽滤。加入适量体积分数为25％的哌啶/DMF溶液反应5min后抽滤，再次加入适量脱保护液反应15min后抽滤；
氨基酸偶联
称量Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g，HOBT 4.05g加入适量DMF溶解，加入DIC4.6ml为缩合剂投入至反应中，室温反应2h。重复脱保护-偶联-脱保护，剩余保护氨基酸按照合成规模摩尔算的3倍量计算，偶联得到肽树脂。
树脂切割
按照TFA:EDT:水＝95:2.5:2.5的比例配制切割液，向肽树脂中加入适量切割液，室温条件下反应2h，抽滤，用甲基叔丁基醚析出、洗涤、干燥得到粗肽。
粗肽纯化
经HPLC纯化，流动相体系为乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液，梯度：37％—57％乙腈)纯化，收集纯度大于95％纯化、冻干得到约10.22g Mpa-CTP3。
合成SPDP-c[CDGRRGDC]-OH
制作Fmoc-Cys(Acm)-CTC resin
称替代度1.14mmol/g的CTC树脂26.33g，加适量DMF溶胀。称氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH 37.32g用适量的DMF/DCM混合溶液溶解，加入DIEA 30ml搅拌后加至树脂中，室温条件下反应5h，加入26ml甲醇，封闭反应1h。DMF洗涤3次，甲醇洗涤3次，干燥制作Fmoc-Cys(Acm)-CTC resin 32.06g，测替代度0.60mmol/g；
偶联氨基酸
称取25.06g Fmoc-Cys(Acm)-CTC resin，按照与MPa-CTP3相同的方法合成Fmoc-Cys(Acm)-Asp(OtBu)-Gly-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-CTC resin肽树脂；
固相环化
向树脂中加入适量的浓度为50g/L的碘/DMF/甲醇混合溶液，室温条件下反应2h，反应结束后，用DMF洗涤完毕，再用抗坏血酸钠溶液洗涤至无碘残留，得到含二硫键的全保护肽树脂并脱除Fmoc保护基。
偶联SPDP-COOH
称量9.67g SPDP-COOH，4.86g HOBt加入适量DMF溶解，加入5.6ml DIC加入至树脂中，室温条件下反应2h得到肽树脂。
肽树脂裂解
按照TFA:Tis:水＝95:2.5:2.5的比例配制切割液，向肽树脂中加入适量切割液，室温条件下反应2h，抽滤，用甲基叔丁基醚析出、洗涤、干燥得到粗肽。
粗肽纯化
通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液(梯度：17％—37％乙腈)纯化，冻干得到5.2g SPDP-c[CDGRRGDC]-OH。
Mpa-CTP3与SPDP-c[CDGRRGDC]-OH的二硫键交换反应
将3.35g SPDP-c[CDGRRGDC]-OH用适量DMF溶解，加入1.93ml DIEA，搅拌状态下向反应液中加入7.75g Mpa-CPT的DMF溶液，液相监测反应结束。将反应液用水稀释后，通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液(梯度：37％—57％乙腈)纯化，使用乙腈和0.02％乙酸水溶液(梯度：30％-80％乙腈)转盐，冻干得到5.21gc[CDGRRGDC]-Mpa-S-S-Mpa-CTP3(代号JP-001-A6)。
实施例1.制备PPC药物
1.PPC药物的结构：
2.制备方法：
(1)对巯基丙酸进行化学改造，获得可以与自由巯基形成二硫键的连接化合SPDP-COOH。(2)本发明通过全固相合成法合成CTP3肽树脂，然后在肽链的N端连上巯基丙酸，裂解后的粗肽通过液相制备纯化获得Mpa-CTP3，其N端具备裸露巯基。
(3)本发明通过全固相合成法合成靶向肽肽树脂，然后在树脂上用碘环化，得到环化后的靶向肽肽树脂。并将SPDP-COOH偶联至靶向肽肽树脂上，裂解后的粗肽通过液相制备纯化获得SPDP-c[CDGRRGDC]-OH。
(4)Mpa-CTP3与SPDP-c[CDGRRGDC]-OH通过二硫键交换反应，获得本发明的PPC药物。上述方案所述巯基丙酸改造技术路线如下：
巯基丙酸与二硫二巯基吡啶溶解在溶剂中，在醋酸条件下反应，经柱层析纯化后，浓缩后得到SPDP-COOH所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、二氯甲烷，作为优选选择乙醇所述柱层析纯化流动相为二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，其中优选二氯甲烷、乙醇。
上述技术方案中所述Mpa-CTP3肽序：Mpa-KLLKKLLKKLLKKLLKK-NH2
上述技术方案中所述Mpa-CTP3化学结构如下：
上述技术方案中所述Mpa-CTP3制作技术路线如下：
采用全固相合成法，以RA树脂为固相载体，采用Fmoc-保护氨基酸，重复脱Fmoc保护-偶联-脱Fmoc保护合成肽树脂。肽树脂经切割，沉淀析出得的粗肽经HPLC纯化，冻干后得到Mpa-CTP3。上述方案中，RA树脂取代度优选0.2-1.0mmol/g，优选的取代度为0.4-0.7mmol/g。上述方案所述固相合成法为：树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联。
上述方案中所述脱Fmoc保护方法是用体积分数25％的哌啶/DMF溶液(脱保护液)，重复脱两遍Fmoc操作，第一次操作时间为5～10min，第二次反应时间为15～25min。优选第一次5min，第二次15min。
上述方案中所述偶联，偶联缩合剂选择HOBt/DIC、TBTU/DIEA、HOBt/TBTU/DIEA、PyBop/DIEA中的一种，优选HOBt/DIC。所述缩合剂的投料量为合成摩尔数的2-5倍，优选3-4倍。所述Fmoc保护氨基酸投料量为合成摩尔数2-5倍，优选3-4倍。所述切割方法使用TFA、EDT、水的混合溶液：TFA体积比为80％-98％，EDT为1％-10％，水为1％-10％，优选TFA:EDT:水＝95:2.5:2.5裂解所述时间为0.5-3h，优选2h。所述经HPLC纯化，流动相乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液(梯度：37％—57％乙腈)纯化，收集纯度大于95％部分，浓缩，冻干。
上述方案所述SPDP-c[CDGRRGDC]-OH技术路线如下：
采用全固相合成法，以CTC树脂为固相载体，制作Fmoc-Cys(Acm)-CTC resin，采用Fmoc-保护氨基酸，重复脱Fmoc保护-偶联-脱Fmoc保护合成肽树脂。在树脂上固相环化二硫键，再连接SPDP-COOH得到的肽树脂经切割，沉淀析出得的粗肽经HPLC纯化，冻干后得到SPDP-c[CDGRRGDC]-OH。上述方案中，CTC树脂取代度优选0.5-1.5mmol/g，优选的取代度为0.8-1.2mmol/g。上述方案所述Fmoc-Cys(Acm)-CTC resin制作方法是在DIEA条件下加入Fmoc-Cys(Acm)-OH的DMF溶液，反应时间2～7h，优选5h。上述方案所述固相合成法在Mpa-CTP3所述范围内所述固相环化需要加入氧化剂，氧化剂选择碘/DMF溶液或碘/甲醇溶液或碘DMF/甲醇混合液，浓度为20～100g/L，优选40～60g/L所述环化时间为0.5～3h，优选1～2h，所述切割方法使用TFA、Tis、水的混合溶液：TFA体积比为80％-98％，Tis为1％-10％，水为1％-10％，优选TFA:Tis:水＝95:2.5:2.5裂解所述时间为0.5-3h，优选2h。
Mpa-CTP3与SPDP-c[CDGRRGDC]-OH的二硫键交换反应技术路线如下：
Mpa-CTP3与SPDP-c[CDGRRGDC]-OH在碱性条件下，通过二硫键交换制作PPC，在经过制备液相纯化获得化合物PPC(c[CDGRRGDC]-Mpa-S-S-Mpa-CTP3，代号JP-001-A6)。所述碱性条件包括DMF、DIEA、Et3N、NMM，碳酸氢钠中的一种或混合溶液，作为优选，选择DMF与DIEA的混合溶液。
利用以下实验验证实验效果：
实验1：确认CTP3的急性毒性，半数致死量，初步确定给药的安全剂量
一、实验目的：确认CTP3的急性毒性，初步确定给药的安全剂量
二、实验原理：医学上通常以半数致死量(LD50)来衡量.通过对实验动物进行动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在1周的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定供试材料的急性毒性作用。
三、实验对象：小鼠
四、实验器材和药品：蒸馏水，生理盐水(0.9％)，注射器(1ml)，量筒(10ml)，小烧杯(50、100ml)
五、实验步骤
1.将称重后(体重在17～23g间)的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组3只。
2.将不同浓度的供试品溶液0.1ml腹腔注射于实验组小鼠。
3.记录注射后7天各组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。
六、给药剂量：
10mg/只、6mg/只、5mg/只、3mg/只、2mg/只、1mg/只、0.4mg/只
七、评价方法：
注射后动物反应观察指标如表1所示：
表1
八、结果如表2所示：
表2
剂量如表3所示：
表3
细胞毒性肽CTP3的急毒状态：竖毛、抽搐、呼吸困难、运动能力降低，萎靡，体重减轻，后肢运动失常。
九、结论：小鼠的半数致死量在0.4-1.0mg/只。
实验2：
一、实验目的：确认JP-001-A6与CTP3的急性毒性差异
二、实验操作同上
三、给药剂量：按CPT3的急性毒性试验给药剂量进行折算：CTP3半数致死量的给药剂量：0.4～1.0mg/只(20mg/只)，对应物质的量为：0.19～0.48mmol，剂量如表4所示。
表4
四、供试品配制如表5：CTP3的给药剂量，等摩尔量的折算成JP-001-A6的给药量。
表5
| 名称 | 浓度 | 给药量 | 折算给药量 |
| JP-001-A6 | 11.54mg/ml | 0.1ml | 57.7 mg/kg |
五、实验结果(JP-001-A6)如表6所示：
表6
六、结论：
1.JP-001-A6毒性较原型CTP3降低，通过细胞药效试验进一步筛选。
2.57.7mg/kg无死亡,炸毛，体重下降，拉稀。
实验3：
一、实验目的：进一步确认JP-001-A6的半数致死量
二、实验操作同上
三、给药量：
在实验2初测的基础上，提高给药量如表7所示：
表7
| 样品名称 | 重量(mg) |
| JP-001-A6 | 1.25(纯肽) |
四、供试品配制如表8所示：
表8
| 名称 | 浓度 | 给药量 |
| JP-001-A6 | 21.2mg/ml | 0.15ml |
五、实验结果如表9所示：
表9
剂量如表10所示：
表10
五.结论
JP-001-A6在实验2初测的基础上提高了给药剂量，小鼠采用40g组别，2只死亡，半数致死量应不低于62.76mg/kg，根据此剂量，多次给药毒性试验的给药剂量应低于62.76mg/kg。
体外药效试验：
一、试验所用细胞系
A549：人非小细胞肺癌细胞
BxPC-3：人原位胰腺腺癌细胞(胰体癌细胞)
MIA PaCa-2：人胰腺癌细胞(胰尾癌细胞)
PANC-1：人胰腺癌细胞(胰头癌细胞)
U251：人脑胶质瘤细胞
二、试验方法
设置三个浓度，分别为H、M、L如表11所示。
表11
| 浓度 | JP-001-A6 |
| L低浓度(ug/ml) | 12.5 |
| M中浓度(ug/ml) | 24.9 |
| H高浓度(ug/ml) | 74.8 |
试验对照组：不加药物正常培养的细胞。
试验步骤：
1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔，5000细胞/孔),将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％CO2)；
2.培养过夜后测定第0天OD值；
3.将加药组的正常培养基弃掉，换有待测药物的培养基，将培养板放在培养箱中培养(37℃,5％CO2)；
4.根据时间依次测定第一天至第三天的OD值(每孔扣入10μL CCK8溶液)
5.将培养板在培养箱內孵育3小时。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度
三、试验及结果
同一药物对不同细胞作用三天的效果(a)试验细胞：PANC-1和A549表12所示和图2所示：
表12
JP-001-A6-H对两种细胞的抑制效果最明显；JP-001-A6-M对两种细胞均有较强的抑制作用。(b)试验细胞：MIA-PaCa-2表13和图3所示所示：
表13
JP-001-A6在高浓度下对MIA细胞呈现出抑制效果，中、低浓度下对MIA细胞几乎无抑制效果。
(c)试验细胞：U251结果如表14和图4所示：
表14
JP-001-A6在高浓度下对U251细胞有明显的抑制作用；中、低浓度下所表现出的抑制效果较弱。
(d)试验细胞：PANC-1、A549结果如表15和图5所示：
表15
JP-001-A6在H、M、L浓度下对两种细胞系均存在明显的抑制作用。
Claims (9)
1.一种抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，将抗肿瘤的肽与靶向肽通过连接物连接获得的。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，抗肿瘤的肽的序列如下所示KLLKKLLKKLLKKLLKK-NH2。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，所述连接键为可断裂的二硫键。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，所述可断裂的二硫键的结构为
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤的PPC药物物，其特征在于，所述靶向肽为c[C(RGD)nC]，n≥2的正整数。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，靶向肽为c[Cys-Asp-Gly-Arg-Arg-Gly-Asp-Cys]，靶向肽的结构为
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤的PPC药物，其特征在于，抗肿瘤的PPC药物的结构为
8.权利要求1-7任一项所述的抗肿瘤的PPC药物在制备杀灭肿瘤细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人非小细胞肺癌细胞、人原位胰腺腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人胰腺癌细胞和人脑胶质瘤细胞。
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