CN109988213B - 一种用于多肽液相合成载体的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于多肽液相合成载体的化合物及其制备方法和用途，具体公开了作为多肽液相载体的环酮化合物，其结构如式I或II所示：
Figure DDA0001532377730000011
其中，X选自H、F、Cl、Br、I或带有羟基、氨基、羧基、卤素的基团。

Description

一种用于多肽液相合成载体的化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种用于多肽液相合成载体的化合物及其制备方法和用途。
背景技术
多肽合成已经有100多年的历史了，现阶段主要有传统的固相合成方法和液相合成方法。这两类方法都具有不同的缺点。传统液相合成方法反应步骤多、分离方法困难、后处理繁琐，合成周期长等缺点；每次接肽以后都要进行分离纯化或结晶以除去未反应的原料或者反应的副产物，这种操作相当费时而且麻烦，并且由操作带来的损失也很大；为了克服这些缺点，Merrifield于1963年首先发展了固相多肽合成的方法。固相合成的方法可以避免繁琐的分离提纯的步骤，与液相的方法相比具有明显的优越性：(1)多肽合成过程中，肽链连接于不溶性载体上，因此产物肽也是不溶的，易洗涤易过滤；(2)反应中可以加入过量的反应物使反应趋于完全，而过量的试剂和副产物可以通过洗涤和过滤除去；(3)整个反应在同一容器中进行，避免了液相法合成中的多次沉淀、洗涤、分离造成的机械损失，操作简便快捷；(4)操作具有很强的重复性，有利于多肽合成反应的自动化。现阶段多肽合成多采用固相合成方法。但是固相合成需要使用固相载体树脂，目前主要的固相载体树脂有：聚苯乙烯—二乙烯苯交联树脂；聚酰胺树脂；聚乙烯一乙二醇类树脂等。固相法合成多肽由于无法对中间反应步骤进行有效监控、过程中产生的杂质进行有效分离，导致终产物中杂质成分复杂，分离纯化难度较大；由于使用到固相载体，合成规模受到树脂取代度等、树脂粒度、机械性能等因素影响，合成规模一般明显小于液相方法。常用的固相合成树脂通常偶联linker，以方便氨基酸的偶联，其中常见的linker-树脂有wang树脂，氨基树脂、三苯甲基氯树脂。
Figure BDA0001532377710000011
近些年为了改进传统固相合成方法的缺点，科学家们发明了一类采用液相合成和固相载体相结合的方法进行多肽化合物合成。通过设计具有特定结构的液相载体，在液相中进行氨基酸偶联，结合固相合成和液相合成中间体纯化和后处理方法进行多肽合成。这类方法可以大大提高固相合成的生产规模和中间体的纯度。实现多肽合成规模的放大，大大提高生产效率。(Tetrahedron 67(2011)
6633-6643，Org.Lett.17(2015)4264-4267))。现有技术中已经报道过多种液相合成载体，其结构如下所示：
Figure BDA0001532377710000021
由于目前传统的多肽合成方法都存在一些缺点，制约了多肽大规模的生产。现阶段多肽固相合成受合成规模限制，每批次合成规模一般小于1mmol。随着多肽药物的发展多肽需求量逐渐增大，大规模生产多肽成为行业发展的新趋势。发展新的多肽合成方法具有重要的产业化意义。
Figure BDA0001532377710000022
发明内容
为了改进固相合成方法的缺点，发明人发现了一类稠环化合物也可以作为多肽液相载体，用于多肽液相合成。
Figure BDA0001532377710000023
弯曲环酮的载体底物1弯曲环酮的载体底物2直线环酮的载体底物3
因此，本发明一个方面提供了一种作为多肽液相载体的环酮化合物，其结构如式I或II所示：
Figure BDA0001532377710000031
其中，X选自H、F、Cl、Br、I或带有羟基、氨基、羧基、卤素的基团。
在本发明的技术方案中，所述X选自H、F、Cl、Br、I、
Figure BDA0001532377710000032
在本发明的技术方案中，式I化合物优选为
Figure BDA0001532377710000033
Figure BDA0001532377710000034
Figure BDA0001532377710000041
Figure BDA0001532377710000051
在本发明的技术方案中，式II化合物优选为
Figure BDA0001532377710000052
本发明另一个方面提供了一种液相合成载体，其具有如上式I或II所述的结构式。
本发明另一个方面提供了本发明所述的液相合成载体的制备方法，其包括如下步骤：
其中式I化合物制备方法包括以下步骤：
1)以化合物1
Figure BDA0001532377710000061
或化合物2
Figure BDA0001532377710000062
为起始原料进行氢化反应获化合物1a
Figure BDA0001532377710000063
任选地，2)化合物1a与功能性官能团偶联得到液相合成载体。
在本发明的技术方案中，其中步骤1)为化合物1
Figure BDA0001532377710000064
或化合物
Figure BDA0001532377710000065
在还原剂作用下进行回流反应至完全获得1a
Figure BDA0001532377710000066
优选地，所述还原剂选自硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷。
在本发明的技术方案中，其中步骤2)包括以下步骤：
2-1)进行卤代反应；
2-2)偶联功能性官能团；
其中步骤2-1)在N-溴代丁二酰亚胺、过氧化苯甲酰条件下进行反应获得卤代产物；
步骤2-2)步骤2-1)所得卤代产物与化合物5
Figure BDA0001532377710000067
对羟甲基苯酚、对羟乙基苯酚、对羟丙基苯酚、对羟丁基苯酚、对羟戊基苯酚或对羟己基苯酚中的一种在碱性条件下进行偶联。优选地，所述碱性条件为在碳酸钾和DMF条件下。
其中式II化合物制备方法包括以下步骤：
1)以化合物3
Figure BDA0001532377710000068
为起始原料进行氢化反应获化合物3a
Figure BDA0001532377710000069
任选地，2)化合物3a与功能性官能团偶联得到液相合成载体。
在本发明的技术方案中，其中步骤1)为化合物3在还原剂作用下进行回流反应至完全获得3a。优选地，所述还原剂选自硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷。
在本发明的技术方案中，其中步骤2)包括以下步骤：
2-1)进行卤代反应；
2-2)偶联功能性官能团；
其中步骤2-1)在N-溴代丁二酰亚胺、过氧化苯甲酰条件下进行反应获得卤代产物；
步骤2-2)步骤2-1)所得卤代产物与化合物5、对羟甲基苯酚、对羟乙基苯酚、对羟丙基苯酚、对羟丁基苯酚、对羟戊基苯酚或对羟己基苯酚中的一种在碱性条件下进行偶联。优选地，所述碱性条件为在碳酸钾和DMF条件下。
本发明另一个方面提供了式I或式II所示化合物作为液相合成载体的用途。
本发明再一个方面提供了式I或式II所示化合物用于在液相中合成多肽链的用途。
本发明再一个方面提供了一种多肽的合成方法，其以式I或式II所示化合物作为液相合成载体，在式I或式II所示化合物的官能团上依次偶联氨基酸。
在本发明的技术方案中，偶联氨基酸的方法为，以缩合剂剂活化羧基组分，并在碱性条件下与氨基组分进行缩合，脱除氨基保护基，并继续偶联下一氨基酸直至完成多肽，裂解液相合成载体。
在本发明的技术方案中，缩合剂选自EDCI、EDC、DCC、DIC、HATU、HBTU、HOAt、HOBt、PyAOP、PyBOP中的一种或多种。
在本发明的技术方案中，碱性条件由DIEA、NMM、TEA、吡啶、DBU、N-甲基吗啉、三甲基吡啶或二甲基吡啶中的一种或多种提供。
在本发明的技术方案中，氨基保护基脱除条件为碱性条件下脱除，优选以二乙胺和DBU脱除氨基保护基。
在本发明的技术方案中，氨基保护基选自Fmoc或Boc。
在本发明的技术方案中，裂解多肽和液相合成载体条件为TFA:TIS:H2O的组合，优选为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5。
在本发明的技术方案中，式A所示化合物上具有氨基、羧基、羟基、卤素中的一种或多种官能团。
本发明再一个方面提供了一种胸腺法新的合成方法，其以式I或式II所示化合物作为液相合成载体，偶联Fmoc-Asn(Trt)1-OH、脱除氨基保护基、按此方法依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Ac-Ser(tBu)-OH脱除保护基后，裂解液相合成载体，纯化得到胸腺法新。
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CHCl<sub>3</sub> 氯仿
tBu 叔丁基
OtBu 叔丁氧基
EDC.HCl 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
DCM 二氯甲烷
DBLK 20％六氢吡啶/DMF溶液
MsOH 三氟甲磺酸
HOBt 1-羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
DMF N,N-二甲基甲酰胺
Rt 室温
TFA 三氟乙酸
NaBH4 硼氢化钠
MeOH 甲醇
EtOH 乙醇
NaOH 氢氧化钠
Toulene 甲苯
DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCM 二氯甲烷
Hac 醋酸
Fmoc-NH2 9-芴甲氧酰胺
有益效果
1.液相载体用于多肽合成，操作较传统液相合成简便；
2.液相载体用于多肽合成，合成规模大于传统的固相合成；
3.大大减少Fmoc氨基酸的投料量；
4.载体利用率高，Org.Lett.17(2015)4264-4267)和Tetrahedron 67(2011)6633-6643中报道的液相载体分子量为832，只能合成1条肽链；而本发明提到的氨基液相载体化合分子量1234，可以合成4条肽链，平均合成1条肽链的分子量为306。
附图说明
图1为化合物1的质谱谱图，M+Na+。
图2为Wang树脂型液相载体1的质谱谱图。
图3为化合物3的质谱谱图。
图4为氨基型树脂载体2的质谱图。
图5为胸腺法新的质谱谱图。
图6为胸腺法新HPLC谱图。
图7为Wang树脂型载体2质谱图。
图8为氨基型树脂载体1质谱图。
具体实施方式
实施例1Wang树脂型液相载体1的合成
Figure BDA0001532377710000091
1)称取化合物1
Figure BDA0001532377710000092
(制备方法参见博士论文：非IPR富勒烯C36、C48、C60前体的有机合成及表征，2016.05.24公开，厦门大学图书馆)22.4g(100mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(300mL)和甲醇(150mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(13.3g，200mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2C12萃取3遍(3×500mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×500ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×500ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×500ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体1a
Figure BDA0001532377710000101
20.4g，收率98％。
2)将化合物1a
Figure BDA0001532377710000102
20.4克(98mmol)、NBS(N-溴代丁二酰亚胺)83.4克(500mmol)、BPO(过氧化苯甲酰)7.4克(30mmol)和500ml四氯甲烷加入到1L的反应瓶中，加热回流反应，HPLC监控反应，原料反应完即可停止反应。待反应液回至室温后，过滤除去溶剂，用甲醇重结晶得到淡黄色固体化合物1b
Figure BDA0001532377710000103
45.7克，收率89％。
3)取化合物1b
Figure BDA0001532377710000104
45.7克(87mmol)和对羟甲基苯酚51.4克(400mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入DMF(300mL)，搅拌均匀，再加入碳酸钾55.2克(400mmol)。将反应液升温至80℃继续搅拌16小时。HPLC监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌条件下，向反应液中缓慢滴加1mol/L稀盐酸(300mL)，和纯化水(150mL)，滴加完后继续搅拌半小时。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥5小时，得到Wang树脂型液相载体1
Figure BDA0001532377710000105
56.9克，收率95％。实验结果参见图2质谱图。
实施例2Wang树脂型液相载体1的合成方法2(由化合物2合成得到)
Figure BDA0001532377710000111
1)称取化合物2
Figure BDA0001532377710000112
(制备方法参考博士论文非IPR富勒烯C36、C48、C60前体的有机合成及表征，2016.5.24公开厦门大学图书馆)12.2g(54mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(200mL)和甲醇(100mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(4.6g，100mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2C12萃取3遍(3×200mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×200ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×200ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×200ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体1a 10.7g，收率95％。
2)将化合物1a 10.7克(51mmol)、NBS(N-溴代丁二酰亚胺)83.4克(500mmol)、BPO(过氧化苯甲酰)7.4克(30mmol)和500ml四氯甲烷加入到1L的反应瓶中，加热回流反应，HPLC监控反应，原料反应完即可停止反应。待反应液回至室温后，过滤除去溶剂，用甲醇重结晶得到淡黄色固体化合物1b 24.8克，收率93％。
3)取化合物1b 24.8克(47mmol)和对羟甲基苯酚51.4克(300mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入DMF(300mL)，搅拌均匀，再加入碳酸钾41.8克(300mmol)。将反应液升温至80℃继续搅拌16小时。HPLC监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌条件下，向反应液中缓慢滴加1mol/L稀盐酸(300mL)，和纯化水(150mL)，滴加完后继续搅拌半小时。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥5小时，得到Wang树脂型液相载体1 31.4克，收率97％。实验结果与实施例1所得结果的质谱图相同，参见图2。
实施例3Wang树脂型液相载体2的合成
Figure BDA0001532377710000121
1)称取化合物3
Figure BDA0001532377710000122
22.4g(100mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(300mL)和甲醇(150mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(13.3g，250mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2Cl2萃取3遍(3×500mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×500ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×500ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×500ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体3a
Figure BDA0001532377710000123
20.8g，收率99％。
2)将化合物3a
Figure BDA0001532377710000124
20.8克(99mmol)、NBS(N-溴代丁二酰亚胺)83.4克(450mmol)、BPO(过氧化苯甲酰)7.4克(20mmol)和500ml四氯甲烷加入到1L的反应瓶中，加热回流反应，HPLC监控反应，原料反应完即可停止反应。待反应液回至室温后，过滤除去溶剂，用甲醇重结晶得到淡黄色固体化合物3b
Figure BDA0001532377710000131
43.1克，收率83％。
3)取化合物3b
Figure BDA0001532377710000132
43.1克(83mmol)和对羟甲基苯酚63.8克(500mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入DMF(300mL)，搅拌均匀，再加入碳酸钾69.2克(500mmol)。将反应液升温至80℃继续搅拌16小时。HPLC监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌条件下，向反应液中缓慢滴加1mol/L稀盐酸(300mL)，和纯化水(150mL)，滴加完后继续搅拌半小时。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥5小时，得到Wang树脂型液相载体2
Figure BDA0001532377710000133
53.7克，收率94％，实验结果质谱图参见图7。
实施例4氨基树脂型液相载体1的合成
Figure BDA0001532377710000141
1)称取化合物1
Figure BDA0001532377710000142
13.3g(60mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(150mL)和甲醇(150mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(11.9g，180mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2C12萃取3遍(3×300mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×300ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×300ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×300ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体1a
Figure BDA0001532377710000143
11.9g，收率98％。
2)将化合物1a
Figure BDA0001532377710000151
11.9克(58.8mmol)、NBS(N-溴代丁二酰亚胺)83.7克(470mmol)、BPO(过氧化苯甲酰)7.4克(30mmol)和500ml四氯甲烷加入到1L的反应瓶中，加热回流反应，HPLC监控反应，原料反应完即可停止反应。待反应液回至室温后，过滤除去溶剂，用甲醇重结晶得到淡黄色固体化合物1b
Figure BDA0001532377710000152
28.7克，收率93％。
3)取化合物1b
Figure BDA0001532377710000153
28.7克(54.7mmol)和化合物5
Figure BDA0001532377710000154
85.3克(330mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入DMF(500mL)，搅拌均匀，再加入碳酸钾45.5克(330mmol)。将反应液升温至80℃继续搅拌16小时。HPLC监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌条件下，向反应液中缓慢滴加1mol/L稀盐酸(300mL)，和纯化水(150mL)，滴加完后继续搅拌半小时。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥5小时，得到类白色化合物2a
Figure BDA0001532377710000155
64.1克，收率95.0％。
4)称取化合物2a
Figure BDA0001532377710000161
64.1g(51.9mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(300mL)和甲醇(150mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(17.4g，300mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥8小时，得到白色化合物固体63.9g，收率98％。
5)称取步骤4)得到化合物63.9(51.5mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入甲苯(400mL)，搅拌均匀，再依次加入甲烷磺酸(27.8克，300mmol)、Fmoc-NH2(66.8克,300mmol)。将反应液升温至110℃继续搅拌3小时。将反应液冷却至室温，加入碳酸钠(31.8g,300mmol)，然后旋蒸除去溶剂。向残余物中加入甲醇(400mL)和甲苯(100mL)，升温至90℃，搅拌溶清。将反应液自然冷却至室温析晶。过滤。滤饼用甲醇和乙腈混合溶剂(1:1，100mL)冲洗，50℃真空干燥5小时，得到白色固体化合物98.2g，收率90％。白色固体即为氨基树脂型载体1
Figure BDA0001532377710000171
实施例5氨基树脂型液相载体1的合成(以化合物2进行合成)
Figure BDA0001532377710000172
与实施例4的方法相同，区别仅在于采用化合物2
Figure BDA0001532377710000173
作为起始原料，称取化合物2
Figure BDA0001532377710000174
12.2g(54mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(200mL)和甲醇(100mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(4.6g，100mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(450mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2C12萃取3遍(3×200mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×200ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×200ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×200ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体1a
Figure BDA0001532377710000181
10.7g，收率95％。
实施例6氨基树脂型液相载体2的合成
Figure BDA0001532377710000182
1)称取化合物3
Figure BDA0001532377710000191
9.2g(41mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(100mL)和甲醇(100mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(3.8g，100mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(200mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，CH2C12萃取3遍(3×200mL)，合并有机相，再依次加0.05mol/L HCl溶液洗(2×200ml)，饱和NaHCO3溶液洗涤2遍(2×200ml)，饱和NaCl溶液洗1遍(1×200ml)，最后用无水Na2SO4干燥。将有机相浓缩，采用二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶得到白色化合物固体3a
Figure BDA0001532377710000192
8.5g，收率99％。
2)将化合物3a
Figure BDA0001532377710000193
8.5克(40.6mmol)、NBS(N-溴代丁二酰亚胺)56.9克(320mmol)、BPO(过氧化苯甲酰)2.4克(10mmol)和300ml四氯甲烷加入到500ml的反应瓶中，加热回流反应，HPLC监控反应，化合物3a反应完即可停止反应。待反应液回至室温后，过滤除去溶剂，用甲醇重结晶得到淡黄色固体化合物3b 19.4克，收率91％。
3)取化合物3b 19.4克(36.9mmol)和化合物5
Figure BDA0001532377710000194
51.6克(200mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入DMF(500mL)，搅拌均匀，再加入碳酸钾27.6克(200mmol)。将反应液升温至80℃继续搅拌16小时。HPLC监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌条件下，向反应液中缓慢滴加1mol/L稀盐酸(200mL)，和纯化水(500mL)，滴加完后继续搅拌半小时。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥5小时，得到类白色化合物3
Figure BDA0001532377710000201
43.7克，收率96％。
4)称取化合物3c 43.6g(35.4mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入THF(100mL)和甲醇(100mL)，搅拌均匀。将反应液升温至60℃后，缓慢加入硼氢化钠(6.8g，180mmol)，加完后保持温度继续搅拌4小时。TLC(乙酸乙酯：正己烷＝1:2，紫外灯显色)监控反应。原料消耗完后，将反应液冰浴冷却至10℃以下。在充分搅拌的条件下，缓慢滴加1mol/L稀盐酸(100mL)，滴加完后，减压浓缩除去THF，向剩余反应液加入纯化水(300mL)，并用1mol/L稀盐酸调pH值至5-7。过滤，滤饼依次用纯化水(100mL)和甲醇(100mL)冲洗。在60℃条件下真空干燥8小时，得到白色化合物固体42.9g，收率98％。
5)称取步骤4)得到化合物42.9(34.7mmol)加入1L三口烧瓶内，然后向反应瓶中加入甲苯(200mL)，搅拌均匀，再依次加入甲烷磺酸(18.6克，200mmol)、Fmoc-NH2(44.6克,200mmol)。将反应液升温至110℃继续搅拌3小时。将反应液冷却至室温，加入碳酸钠(21.9g,200mmol)，然后旋蒸除去溶剂。向残余物中加入甲醇(400mL)和甲苯(100mL)，升温至90℃，搅拌溶清。将反应液自然冷却至室温析晶。过滤。滤饼用甲醇和乙腈混合溶剂(1:1，100mL)冲洗，50℃真空干燥5小时，得到白色固体化合物68.5g，收率93％。白色固体即为氨基树脂型载体2
Figure BDA0001532377710000202
质谱结果参见附图4.
实施例7氨基型树脂活化
称取氨基树脂型化合物268.5g(32.3mmol)加入1L三口烧瓶内，向反应瓶中加入甲苯(200mL)和乙醇(200mL)，搅拌均匀，再加入氢氧化钠(5.9g,150mmol)。将反应液升温至110℃继续搅拌16小时。向反应液中依次加水(300mL)、正己烷(200mL)乙酸乙酯(200mL)，搅拌15分钟后，过滤。滤饼用纯化水(200mL×2)洗涤两次，得到的滤液静置分层后收集有机相，将有机相在45℃条件下浓缩至干。将滤饼与浓缩后残余物合并，用甲醇与乙腈混合溶剂(1:1，200mL)打浆两次。过滤，滤饼在45℃条件下真空干燥5小时，得到白色固体化合物活化氨基树脂型载体2
Figure BDA0001532377710000211
39.1克,收率98％。白色固体化合物可以直接用于接肽。
实施例8Wang树脂型载体1用于合成多肽
Figure BDA0001532377710000221
特定肽Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn1-COOH(胸腺法新肽序)的合成。
偶联第一个氨基酸(Fmoc-Asn(Trt)1-OH)
称取Wang树脂型载体1(10.4g,15mmol)加入250mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(100mL)，再依次加入HOBt(9.8g.72mmol)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(43.1g,72mmol)、DMAP(0.9g.8mmol)。搅拌溶清。加入EDC·HCl(13.9g,72mmol)，在室温条件下继续搅拌3小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，反应液在30℃条件下，减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入甲醇(60mL)，搅拌2小时。过滤，滤饼用甲醇(20mL×3)冲洗三次。将滤饼在40℃条件下真空干燥5小时，得到化合物A 43.1g,收率95％)。
偶联第二个氨基酸(Fmoc-Glu2(OtBu)-OH)
称取化合物A(43.1g,14.2mmol)加入100mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(50mL)，搅拌溶清，再加入DBU(9.9g，65mmol)。将反应液冰浴冷却至5℃以下，缓慢滴加二乙胺(9.5g,130mmol)，控温不超过5℃。滴加完后，将反应液升至室温继续搅拌2小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，将反应液在30℃条件下减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入乙腈(20mL)，搅拌30分钟。过滤，滤饼用甲醇(10mL×2)冲洗两次。将滤饼在40℃条件下真空干燥2小时，得到类白色固体29.7克，收率99％。
将上述固体加入100mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(20mL)，再依次加入HOBt(9.5g,70mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(30.8g,70mmol)。搅拌溶清。将反应液冷却至0℃。加入EDC·HCl(19.2g,100mmol)，在0-10℃条件下继续搅拌3小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，反应液在30℃减条件下，减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入甲醇(20mL)，搅拌2小时。过滤，滤饼用甲醇(10mL×3)冲洗三次。将滤饼在40℃条件下真空干燥3小时，得到化合物B。
重复Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联反应条件，按照肽序依次偶联完Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Ac-Ser(tBu)-OH得到连有肽的载体化合物P 238.7克，合成收率81％。
将上述的白色固体化合物P(238g)加入裂解液中(TFA:EDT:TIS:H2O＝91:3:3:3，1000mL)，室温搅拌2小时。然后将反应液缓慢倒入冰冻乙醚(5L)中，搅拌30分钟后，冰箱中静置1小时。离心，用乙醚(50mL×3)洗涤三次。得到的沉降物在30℃条件下干燥2小时，再用甲醇(10mL)打浆2小时，过滤，滤饼弃去，滤液40℃旋干后得到白色固体(144.1g，纯度90.2％，裂解收率99％)。经HPLC制备得到精肽101.8克，纯度99.5％以上，最大单杂小于0.1％，总收率54.1％。
实施例9氨基树脂型载体2用于合成多肽
Figure BDA0001532377710000251
肽序Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn1-COOH(胸腺法新肽序)的合成。
称取活化了的氨基树脂(实施例7中得到的树脂)2(18.5克，15mmol)加入到500mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(200，再依次加入HOBt(9.8g.72mmol)、Fmoc-Asp-OtBu(29.6g,72mmol)。搅拌溶清。加入EDC·HCl(13.9g,72mmol)，在室温条件下继续搅拌3小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，反应液在30℃条件下，减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入甲醇(60mL)，搅拌2小时。过滤，滤饼用甲醇(20mL×3)冲洗三次。将滤饼在40℃条件下真空干燥5小时，得到化合物A51.6克97％)
偶联第二个氨基酸(Fmoc-Glu2(OtBu)-OH)
称取化合物A(43.1g,14.5mmol)加入100mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(50mL)，搅拌溶清，再加入DBU(10.2g，70mmol)。将反应液冰浴冷却至5℃以下，缓慢滴加二乙胺(9.5g,130mmol)，控温不超过5℃。滴加完后，将反应液升至室温继续搅拌2小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，将反应液在30℃条件下减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入乙腈(20mL)，搅拌30分钟。过滤，滤饼用甲醇(10mL×2)冲洗两次。将滤饼在40℃条件下真空干燥2小时，得到类白色固体38.6克，收率99％。
将上述固体加入100mL三口烧瓶内，向反应瓶中加入氯仿(20mL)，再依次加入HOBt(9.5g,70mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(30.8g,70mmol)。搅拌溶清。将反应液冷却至0℃。加入EDC·HCl(19.2g,100mmol)，在0-10℃条件下继续搅拌3小时。TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应。反应完全后，反应液在30℃减条件下，减压浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入甲醇(20mL)，搅拌2小时。过滤，滤饼用甲醇(10mL×3)冲洗三次。将滤饼在40℃条件下真空干燥3小时，得到化合物B。
重复Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联反应条件，按照肽序依次偶联完Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、、Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Ac-Ser(tBu)-OH得到连有肽的载体化合物P 249.8克，合成收率83％。
将上述的白色固体化合物P(249.3g)加入裂解液中(TFA::EDT:TIS:H2O＝91:3:3:3，1000mL)，室温搅拌2小时。然后将反应液缓慢倒入冰冻乙醚(5L)中，搅拌30分钟后，冰箱中静置1小时。离心，用乙醚(50mL×3)洗涤三次。得到的沉降物在30℃条件下干燥2小时，再用甲醇(10mL)打浆2小时，过滤，滤饼弃去，滤液40℃旋干后得到白色固体(144.1g，纯度90.2％，裂解收率99％)。经HPLC制备得到精肽108.3克，纯度99.5％以上，最大单杂小于0.1％，总收率59.6％。
专利CN 103497245中报道的固相合成方法总收率42％，合成规模只有5.2克精肽。无论从合成规模和收率采用液相载体合成具有明显优势。具有很大的工业化优势。

Claims (14)

1.一种作为多肽液相合成载体的环酮化合物，其结构如式I或II所示：
Figure FDA0003204396980000011
具体为：
Figure FDA0003204396980000012
Figure FDA0003204396980000013
Figure FDA0003204396980000021
2.权利要求1所述环酮化合物的制备方法，其中式I化合物制备方法包括以下步骤：
1)以化合物1
Figure FDA0003204396980000022
或化合物2
Figure FDA0003204396980000023
为起始原料进行氢化反应获化合物1a
Figure FDA0003204396980000024
2)化合物1a与功能性官能团偶联得到多肽液相合成载体的环酮化合物。
3.根据权利要求2所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)为化合物1
Figure FDA0003204396980000025
或化合物2
Figure FDA0003204396980000026
在还原剂作用下进行回流反应至完全获得1a
Figure FDA0003204396980000027
4.根据权利要求3所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，所述还原剂选自硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷。
5.根据权利要求2所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)包括以下步骤：
2-1)进行卤代反应；
2-2)偶联功能性官能团。
6.根据权利要求5所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤2-1)在N-溴代丁二酰亚胺、过氧化苯甲酰条件下进行反应获得卤代产物。
7.权利要求1所述环酮化合物的制备方法，其中式II化合物制备方法包括以下步骤：
1)以化合物3
Figure FDA0003204396980000031
为起始原料进行氢化反应获化合物3a
Figure FDA0003204396980000032
2)化合物3a与功能性官能团偶联得到多肽液相合成载体的环酮化合物。
8.根据权利要求7所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)为化合物3在还原剂作用下进行回流反应至完全获得3a。
9.根据权利要求8所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，所述还原剂选自硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷。
10.根据权利要求7所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)包括以下步骤：
2-1)进行卤代反应；
2-2)偶联功能性官能团。
11.根据权利要求10所述的环酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤2-1)在N-溴代丁二酰亚胺、过氧化苯甲酰条件下进行反应获得卤代产物。
12.权利要求1所述的环酮化合物作为多肽液相合成载体的用途。
13.一种多肽的合成方法，其特征在于，以权利要求1所述的环酮化合物作为液相合成载体，在所述的环酮化合物的官能团上依次偶联氨基酸。
14.一种胸腺法新的合成方法，其以权利要求1中式I或式II所示化合物作为液相合成载体，偶联Fmoc-Asn(Trt)1-OH、脱除氨基保护基，按此方法依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Ac-Ser(tBu)-OH、脱除保护基后，裂解液相合成载体，纯化得到胸腺法新。
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