CN112791191B

CN112791191B - 一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物及其应用

Info

Publication number: CN112791191B
Application number: CN202110152455.5A
Authority: CN
Inventors: 李瑞芳; 贺松林; 黄亮; 张贝贝
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112791191A

Abstract

本发明公开了一种新型广谱抗MDR病原菌抗菌肽辛酸偶联物SAMP‑A4‑C8的结构式。该抗菌肽辛酸偶联物为在抗菌肽SAMP‑A4氨基端偶联辛酸获得的SAMP‑A4的类似物，其结构为：COOH‑IRRRLLRV‑NHCO‑(CH₂)₆‑CH₃。本发明是一种对革兰氏阳性多药耐药细菌、热带念珠菌和新型隐球菌具有广谱抑制作用、不具有溶血性、抵抗胰蛋白酶水解、具有血清稳定性、酸碱稳定性和高温稳定性的新型抗菌肽辛酸偶合物。该抗菌肽辛酸偶合物为临床抗菌药物研究提供了一种新型先导物。

Description

一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物及其应用。

背景技术

近年来，由于抗生素滥用，在感染类疾病中，分离出的耐药菌株不断增多。多药耐药(MDR)病原微生物的出现，对新型、病原微生物不易产生耐药性的临床抗生素的需求越来越迫切。因此，尽快研究和开发新型、高效、低毒、病原菌不易对其产生耐药性的抗菌药物具有重要意义。

抗菌肽是动物机体天然免疫系统的重要组成部分。与传统抗生素主要是通过抑制某一生物合成途径(如细胞壁、蛋白质)发挥作用不同，大多数抗菌肽通过多途径、多靶点的作用机制抑制或杀死病原菌。抗菌肽独特的作用机制，致使微生物不易产生耐药性(FordeE,et al.Molecules,2015,20(1):1210-1227；王欢等，细胞与分子免疫学杂志，2015，31(1):137-139)。因此，抗菌肽用来治疗人和动物的疾病在临床上有着极大潜力，可能是解决病原菌耐药性的最佳选择。目前，抗菌肽已成为多个领域的研究热点。

抗菌肽血清学稳定性差、易被蛋白酶降解，限制了其临床开发。脂肪酸修饰是提高抗菌肽稳定性的重要措施。但脂肪酸链长度对抗菌肽溶血毒性有关。因此，发现新型高效、低毒抗菌肽，研究化学修饰脂肪酸链长度对其稳定性和毒性的影响，获得最佳抗菌肽修饰脂肪酸链，为抗菌肽药物的开发奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物，采用固相化学合成技术制备得到抗菌活性高、抗MDR病原微生物、生物安全性高、抵抗蛋白酶水解的新型抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8，即COOH-IRRRLLRV-NHCO-(CH₂)₆-CH₃。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物，所述抗菌肽的氨基酸序列为IRRRLLRV(SEQ ID NO.1)，所述抗多药耐药抗菌肽辛酸偶联物的结构式为COOH-IRRRLLRV-NHCO-(CH₂)₆-CH₃，化学结构为：

优选地，所述抗菌肽的氮端与辛酸偶联的方式为通过辛酸上的-CO-OH与抗菌肽上的-NH₂酰胺化反应生成。

本发明还提供了所述的新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物在制备抗菌药物中的应用。

优选地，所述细菌为抗细菌或抗真菌。

优选地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、链球菌、单增李斯特菌或肠球菌中的至少一种。

优选地，所述真菌为热带念珠菌或新型隐球菌中的至少一种

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开的一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物，具有如下有益效果：

(1)本发明提供的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8具有抵抗蛋白酶水解、耐高温、酸碱稳定性好，可用于多种多药耐药细菌，具有广谱高效抗菌活性；具有抗多药耐药革兰氏阳性病原菌活性，具有低溶血活性；具有高血清稳定性；具有抵抗胰蛋白酶水解。

(2)本发明是一种广谱、高效、安全、具有血清稳定性和抵抗胰蛋白酶水解的抗MDR病原菌多肽辛酸衍生物。本发明的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8对所测的多种MDR菌和念珠菌均有很强的抑制作用，且99.9％抑菌浓度均<10μg/mL。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中采用最小抑菌浓度法测定了SAMP-A4-C8抗MDR菌谱；通过溶血活性实验研究了SAMP-A4-C8的溶血活性；采用最小抑菌浓度判断SAMP-A4-C8血清稳定性、温度稳定性、酸碱稳定性和胰蛋白酶稳定性。抗菌肽SAMP-A4-C8目前在国内外均未见报道。用此方法获得的抗菌肽SAMP-A4-C8有望为动物多药耐药病原微生物感染提供良好的候选药物。本发明的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8具有广谱高效抗菌活性；具有抗多药耐药革兰氏阳性病原菌活性，具有低溶血活性；具有高血清稳定性；具有抵抗胰蛋白酶水解。本发明实施例中，Fmoc：芴甲氧羰基。

实施例1

本实施例提供了抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的制备方法，具体包括以下内容：

在Fmoc保护系统的固相合成中，首先将Rink Amide AMResin(1g)装在反应器中，加入6mL二氯甲烷溶胀12小时，20％哌定溶液去保护；将C端第一个氨基酸Fmo-Ile-OH(5eq)与反应器中的去保护Rink Amide-AM Resin混合，在HOBU/DIC(5eq)催化下反应2.5小时。Kaiser检测，在110℃加热1min观察不变蓝。20％哌定溶液去除N端Fmoc保护，然后按照给定的氨基酸序列，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH依次偶联，由C端逐个向N端延伸，最后一个氨基酸Fmoc-Val-OH偶联完成后，用20％哌定溶液去除N端Fmoc保护，加入正辛酸(5eq)和HOBU/DIC(5eq)反应2.5小时。Kaiser检测，在110℃加热1min观察不变蓝，辛酸与抗菌肽偶联反应完成。最后用87.5％三氟乙酸、2.5％1,3-间苯二甲醚、2.5％三异丙基硅烷、2.5％H2O、5％茴香硫醚和7.5％苯酚组成的切割液，将多肽从固相载体上切下来，收集切割液，冰乙醚洗沉淀2～3次，去尽上清，吹干沉淀，得到抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8粗品。

HPLC纯化的具体方法为：

用5mL离心管称取200mg多肽粗品，加入去离子水和乙腈各1mL，使多肽完全溶解，再需用0.22μm有机滤膜过滤至干净进样瓶中。使用岛津LC-20AR系列高效液相色谱进行HPLC纯化多肽，具体条件设置为：使用C18(柱规格：20×250mm粒径5μm)；柱箱温度为室温；流动相使用超纯水和乙腈；检测波长214nm；流速为10mL/min；其中流动相A相为乙腈，B相为含0.1％TFA的超纯水，流动相A:流动相B＝40:60。将收集到的溶液冷冻干燥，收集纯品后置于-20℃保存。

实施例2

本实施例提供了实施例1制得的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的抗菌谱测定，具体包括以下内容：

1)称量和溶解SAMP-A4-C8。配制PBS溶液，设第一列初始浓度500μg/mL，则需配制2mg/mL的SAMP-A4-C8母液。用20mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液溶解SAMP-A4-C8，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

2)使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100μL 20mmol/L pH7.0的PBS缓冲液。

3)用移液枪吸取100μL SAMP-A4-C8母液(2mg/mL)至96孔板第一列的每个孔中。

4)反复吹吸板中第一列的溶液6～8次，混匀，不要溅起。

5)从第一列吸取100μL加入到第二列，反复吹吸混合6～8次，然后再吸取100μL至第三列。重复此步骤至第十列。

6)第十列吸取出的100μL丢弃，不要加入第11列，第11列为阴性对照孔。

7)分别将100μL菌悬液按顺序加入96孔板的第1列至11列，并反复吹吸6～8次，混匀。注意不要将菌悬液添加到第12列。第12列为空白对照孔。

8)静置孵育96孔板，37℃条件下孵育16h。

9)每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃置20min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于570nm处测OD值。

抑菌率(％)＝[(OD570(样品)–OD570(空白)]/[OD570(阴性)–OD570(空白)]×100％。

MIC100定义为：使抑菌率达到99.9％时的抗菌肽SAMP-A4-C8最低浓度。

10)每个实验重复三次。

结果见表1。由结果可知，抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8对所测的几种MDR菌和两株念珠菌均有很强的抑制作用，99.9％抑菌浓度均<10μg/mL。

表1抗菌肽SAMP-A4-C8抗病原菌最小抑菌浓度

结果表明：抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8对MDR金葡9、松鼠葡萄球菌P254、链球菌SC181、单增李斯特、肠球E1478F和金黄色葡萄球菌(质控)为代表的多药耐药革兰氏阳性细菌具有很强的抑菌作用。另外，对两个具有较高临床意义的真菌热带念珠菌和新型隐球菌也具有很好的作用。

实施例3

本实施例提供了实施例1制得的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的溶血性测定，具体包括以下内容：

将新鲜采集的健康志愿者的血液离心后，红细胞沉淀用生理盐水洗涤三次，制备终浓度为2％HRBCs悬浮液。将100μL经二倍梯度稀释的SAMP-A4-C8(0～500μg/mL)依次加入到96孔板中。在每个孔中加入100μL2％HRBCs，并于37℃孵育30min。从各孔中吸取100μL上清液，转移至新的96孔板中，采用酶标仪在540nm波长下测定吸光度，计算溶血率。用1％TritonX-100处理的红细胞作为阳性对照(100％溶血)；未经SAMP-A4-C8处理的红细胞作为阴性对照(无溶血)。计算溶血率的方程式如下：

溶血百分率(％)＝[(样品A540–阴性对照A540)/(阳性对照A540–阴性对照A540)]×100％

将能够引起5％溶血的最小浓度，定义为抗菌肽最小溶血浓度(MHC)。结果表明，抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的MHC为474.93μg/mL(表2)，远远高于所测其对MDR菌金葡9、链球菌SC181、单增李斯特菌、肠球E1478F和金黄色葡萄球菌(质控)的MIC100值，表明SAMP-A4-C8生物安全性高。

表2抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8最小溶血浓度

将SAMP-A4-C8的MHC与MIC100的比值称为治疗指数(treatment index,TI)。抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8所测病原菌的TI见表3。TI越大，SAMP-A4-C8治疗该病原菌感染的安全性越大。结果表明，SAMP-A4-C8具有很高的生物安全性。

表3抗菌肽SAMP-A4-C8对各种病原菌的治疗指数

实施例4

本实施例提供实施例1制得的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的抗病原菌生物膜形成，具体包括以下内容：

将对数生长期的念珠菌用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释至浓度为2×106CFU/mL；将对数生长期的耐药细菌用BHI培养基稀释至浓度为2×105CFU/mL。将100μL经倍比稀释的SAMP-A4-C8溶液(终浓度0.5-8倍MIC100)依次加入到96孔板中。然后加入100μL菌液，并于37℃共同培养24h。弃去培养基，用无菌PBS溶液洗涤3次。加入100μL 99％甲醇固定15min，吸去后干燥。加入100μL 0.1％结晶紫染色5min，用去离子水冲洗掉多余的污渍。加入120μL 95％乙醇对染色液进行溶解。之后用移液枪反复吹打吸取100μL混合液至新的96孔板中，并用酶标仪在600nm处测定吸光度。未经SAMP-A4-C8处理的菌液作为阴性对照，每组实验设三个重复组。

抑制率(％)＝[(1-OD600(样品)/OD600(阴性)]×100％。

抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8抑制99.9％病原菌生物膜形成的最小浓度如表4所示。由实验结果可知，抗菌肽SAMP-A4-C8在最小有效浓度条件下，不仅抑制病原菌生长，同时能够抑制病原菌生物膜的形成，防治其黏附在组织表面。

表4抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8抑制病原菌生物膜形成最小浓度(μg/mL)

实施例5

本实施例提供实施例1制得的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8的血清稳定性和抵抗胰蛋白酶水解能力，具体包括以下内容：

MIC100被用作评估抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8对胰蛋白酶水解、血浆、外部温度和外部pH的稳定性的参考。胰蛋白酶浓度设计为(6、8、10和12μg/mL)；血浆浓度设计为50％；孵育温度设定为50℃、70℃、90℃；采用不同pH(1、4、6、9)的PBS缓冲液进行pH稳定性测定。将抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8在上述溶液中孵育1h，然后将实验环境因子恢复至对照。通过MIC100实验评价抗菌肽辛酸偶联物的稳定性。

结果(表5)表明，抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8具有很强的抵抗胰蛋白酶水解能力、血清稳定性、酸碱稳定性和高温稳定性。

表5抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8小抑菌浓度

综上所述，本发明的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8具有广谱高效抗菌活性；具有抗多药耐药革兰氏阳性病原菌活性，具有低溶血活性；具有高血清稳定性；具有抵抗胰蛋白酶水解。本发明是一种广谱、高效、安全、具有血清稳定性和抵抗胰蛋白酶水解的抗MDR病原菌多肽辛酸衍生物。本发明的抗菌肽辛酸偶联物SAMP-A4-C8对所测的多种MDR菌和念珠菌均有很强的抑制作用，且99.9％抑菌浓度均<10μg/mL。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种新型高效抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Ile Arg Arg Arg Leu Leu Arg Val

1 5

Claims

1.一种抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物，其特征在于，所述抗多药耐药抗菌肽辛酸偶联物的结构式为COOH-IRRRLLRV-NHCO-(CH₂)₆-CH₃，化学结构为：

2.根据权利要求1所述的一种抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物，其特征在于，所述抗菌肽的氮端与辛酸偶联的方式为通过辛酸上的-CO-OH与抗菌肽上的-NH₂酰胺化反应生成。

3.一种权利要求1-2任一项所述的抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物在制备抗菌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物的应用，其特征在于，所述抗菌为抗细菌或抗真菌。

5.根据权利要求4所述的一种抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、链球菌、单增李斯特菌或肠球菌中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的一种抵抗蛋白酶水解抗多药耐药菌的抗菌肽辛酸偶联物的应用，其特征在于，所述真菌为热带念珠菌或新型隐球菌中的至少一种。