JP2005247721A

JP2005247721A - 低下された溶血反応を有する抗菌性ペプチド及びその使用方法

Info

Publication number: JP2005247721A
Application number: JP2004057762A
Authority: JP
Inventors: Shiou Ru Tzeng; 曾秀如; Jya Wei Cheng; 程家維
Original assignee: PACGEN BIOPHARMACEUTICALS Inc
Current assignee: PACGEN BIOPHARMACEUTICALS Inc
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2005-09-15

Abstract

【課題】広範囲の抗菌活性を有するが低い溶血反応を示す、芳香族及びカチオン性残基の独特のパターンを持つ、環状及び短ペプチド（１０個未満のアミノ酸残基）に関する抗菌性ペプチドを提供する。
【解決手段】グラム陽性菌、グラム陰性菌及び多剤耐性病原体に対する広域抗菌活性を目的とする。抗菌性ペプチドは、一般に１０個未満のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列：（Ａ₁Ｘ₁Ａ₂）_N（ここで、Ａ₁は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、Ｘ₁は、トリプファン、フェニルアラニン又はプロリンを表し、Ａ₂は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、Ｎは、１、２又は３を表し、位相幾何学は、環状又は直鎖状を表す）を含む。
【選択図】図１ａ

Description

本発明は、抗菌性ペプチドの分野に関する。詳細には、本発明は、広範囲の抗菌活性を有する芳香族及びカチオン性残基の独特のパターンを持つ、環状及び短ペプチド（１０個未満のアミノ酸残基）を目的とする。本発明の極めて小型のペプチドは、優れた効能を示し、芳香族及びカチオン性残基を有する他の長ペプチドと比較して、低い溶血活性を示す。

従来の抗生物質に耐性のある細菌株の出現は、動物由来の多様な抗菌性ペプチドを含む新規治療薬の調査を促した。抗菌性ペプチドは、植物、昆虫、両生類及び哺乳動物を含む大多数の生体系の固有の宿主防衛機構において主要な役割を果たすことが認められ、細菌、菌類、また特定のウイルスに対しても潜在的な抗生物質活性を有することが知られている。抗菌性ペプチドは、脂質に対して＞９５％の割合で結合して、容易にリン脂質二重層に割り込み、膜の一体性を傷つける。これらは、平面脂質二重層に、小さい、一過性の、伝導性の増加を形成し、細菌の細胞質膜電位勾配を部分的に脱分極する。宿主防衛における抗菌性ペプチドの保護機能が、ショウジョウバエで説得力をもって証明され、そこでは、低下した発現が、細菌の攻撃後の生存率を劇的に低下させている。哺乳動物では、この機能は、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者の肺及び小型のマウスにおける欠陥細菌死滅により示唆されている。哺乳動物で見いだされる抗菌性ペプチドは、システインリッチデフェンシン（α−及びβ−デフェンシン）及び多様なカテリシジンファミリーに分類される。カテリシジンファミリーは、高度に保存された信号配列及びプロレジョン（proregion）（“カテリン”）、並びにＣ末端ドメインに変異性抗菌性配列を含む。カテリシジンのうちの多くは、カチオン性カテリンドメインとカチオン性Ｃ末端ペプチドドメインの間に、特徴的なエラスターゼ切断部位を含む。この部位におけるタンパク質分解プロセスが、ウシ及びプロシン好中球において観察され、殺菌活性を必要とした。アミノ酸成分及び構造に基づき、カテリシジンファミリーは、３群に分類される。第１群は、ＬＬ−３７，ＣＲＡＭＰ、ＳＭＡＰ−２９，ＳＭＡＰ−３７、ＢＭＡＰ−２７及びＢＭＡＰ−２８のような両親媒性α−らせん状ペプチドを含む。第２群は、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、ＰＲ−３９及びインドリシジンをはじめとするＡｒｇ／Ｐｒｏリッチ又はＴｒｐリッチペプチドを含む。第３群は、プロテグリンのようなＣｙｓ含有ペプチドを含む。抗菌性ペプチドは、一般的に、広域活性を有し、微生物感染に対する宿主防御の重要な部分を構成する、低分子量（＜５ｋＤａ）分子であるため、低分子量の抗生化合物を設計する出発点を提供する。更に、これらは、その膜学的活性に密接に関連する特徴である、疎水性領域と電荷領域のクラスターを有する両親媒性構造に折りたたむ傾向があることが知られている。多くの場合、広域抗菌活性を示すが、ペプチドは、種々の程度でヒトの赤血球に対して溶血性であり、それがその治療上の潜在能力を厳しく限定している。

本発明の課題は、第一に一次構造の合成改質により臨床上重要な細菌株に対する活性を有する抗菌性ペプチドを設計すること、第二には、ペプチドの重要な構造的特徴についての幾つかの情報を得ること、を目的とする。改質された一次及び／又は二次構造を有する合成類似対を産生することにより、天然産生ペプチド抗生物質の活性を向上させるか、又は毒性を減少させることが可能であることが結果から示された。本発明は、一般に抗生物質に関し、抗菌活性を示すが、低溶血作用を有する、トリプトファンリッチ配列及びその誘導体を含む新規広域抗菌性ペプチドに関する。簡潔には、本発明は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌、原虫、菌類、並びに外膜ウイルスＨＩＶ−１に対する広域抗菌活性を有する抗生ペプチドを設計することを目的とする。

本発明は、向上した血清適合性及び低下した溶血活性を有する、環状及び短ペプチドを設計することを示す。更に、本発明のペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び多剤耐性病原体に対する広域抗菌活性を目的とする。本発明の抗菌性ペプチドは、一般に１０個未満のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列：（Ａ₁Ｘ₁Ａ₂）_N
（ここで、
Ａ₁は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｘ₁は、トリプファン、フェニルアラニン又はプロリンを表し、
Ａ₂は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｎは、１、２又は３を表し、
位相幾何学は、環状又は直鎖状を表す）を含む。

本発明は、幾つかの利点を提供する。第一には、本発明のペプチドは、１０個未満のアミノ酸残基であり、極めて小型であり、比較的少数のアミノ酸で細胞膜をスパンするには効果的である。第二には、本発明の最良のペプチドが抗生物質耐性菌に対して、医療上重要な菌類に対する活性と組み合わせて、極めて広範囲の活性を実行する。加えて、これらのペプチドは、抗内毒素活性を有し、伝統的な抗生物質と相乗的に作用する。本発明の最も重要なことは、向上した血清適合性を提供することであり、天然由来のプロテグリン及びインドリシジン類似体と比較して、ヒト赤血球に対して極めて低い溶血反応を行うことである。

米国特許第６，３０３，５７５号、米国特許第６，１８０，６０４号、米国特許第５，８２１，２２４号、米国特許第５，５４７，９３９号、米国特許第５，５３４，９３９号、米国特許第５，４５９，３２５号及び米国特許第５，３２４，７１６号で記載されているトリトファンリッチペプチドのように、アミノ酸配列を有する天然由来ペプチドは、全て１０個よりも長い残基をもち、インビボで急激なタンパク質加水分解をうける。インドリシジン類似体は一般にアミノ酸配列Ｉ−Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｗ−Ｐ−Ｗ−Ｘを有し、ここでＸは、１又は２個の選択されるアミノ酸を表す（米国特許第５，５３４，９３９号）。これらの従来記載されているトリプトファンリッチペプチドは、本発明者の抗菌性ペプチドの設計が、広域殺菌活性、向上した選択性及び低い溶血反応を有する環状で短いペプチド（１０個未満のアミノ酸）を目的としているという点で、本発明のものと区物される。

直鎖状抗菌性ペプチドの環化は、選択性及び安定性の観点から幾つかの利点を有する。例えば、（ｉ）折りたたまれていないペプチドは、疎水性相互作用により凝集することがあり、それにより正常の哺乳動物の細胞に非特異的に吸着し、溶解性を低下させる。折りたたまれていない構造を束縛し、したがってアミノ酸の疎水性伸長の暴露を制限すると、疎水性相互作用を限定することができる。更に、これらの束縛は、負に帯電した目標膜との最初の結合における静電相互作用の役割を向上させることができ、したがって哺乳動物の細胞に対する細菌への選択性を実質的に増加させる。(ii)プロテアーゼにより結合及び切断されるため、ペプチドは伸長構造の切断部位に存在しなければならない。したがって短ペプチドの環化は、その硬直し、束縛された構造により、プロテアーゼ活性への接触性が制限されうる。(iii)環化がグラム陰性菌のみに対する活性に影響を及ぼすと思われ、この線に沿った更なる研究が、細菌特異性溶解ペプチドの設計を助けることができる。

本発明のペプチドは、下記の式：
（Ａ₁Ｘ₁Ａ₂）_N
（式中、
Ａ₁は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｘ₁は、トリプファン、フェニルアラニン又はプロリンを表し、
Ａ₂は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｎは、１、２又は３を表し、
位相幾何学は、環状又は直鎖状を表す）により記載することができる。

本発明の殺菌性ペプチドの例：
Ｃｙｃｌｏ−ＫＦＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＦＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＲＦＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＲＦＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＲＦＶ
Ｌｉｎｅａｒ−ＲＦＶ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＦＲ
Ｌｉｎｅａ−ＫＦＲ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＶ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＶ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＲ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＲ
Ｃｙｃｌｏ−ＲＷＶ
Ｌｉｎｅａｒ−ＲＷＶ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＲＲＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＲＲＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＲＲＷＶ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＲＲＷＶ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＩＫＷＲ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＩＫＷＲ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＶＫＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＶＫＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＩＫＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＩＫＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＩＫＷＩＫＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＩＫＷＩＫＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＦＩＫＦＩＫＦＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＦＩＫＦＩＫＦＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＲＲＷＶＲＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＲＲＷＶＲＷＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＩＷＲＶＷＲＲＷＫ
Ｌｉｎｅａｒ−ＩＷＲＶＷＲＲＷＫ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＦＲＲＦＶＲＦＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＦＲＲＦＶＲＦＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＰＲＲＰＶＲＰＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＰＲＲＰＶＲＰＩ
Ｃｙｃｌｏ−ＫＷＩＲＷＶＲＷＩ
Ｌｉｎｅａｒ−ＫＷＩＲＷＶＲＷＩ

ペプチドの設計、合成、精製及び特徴付け
ペプチド類似体及びその名称を表１に示す。全てのアミノ酸は、１文字アミノ酸コードにより表示されている。

全ての直鎖状ペプチドは、標準Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学を手動で使用して、ＰＡＬ樹脂（５−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）吉草酸ＭＢＨＡ樹脂）上で固相ペプチド合成を実施した。樹脂上のＦｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した。カップリング反応は、約１〜１．５時間であり、ニンヒドリン試験で確認した。粗ペプチドを９５％ＴＦＡ開裂混合物と１〜１．５時間混合して、樹脂から切断した。粗ペプチドを、逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製のカラムは、半分取Ｃ１８逆相カラムであった。溶離用の移動相は、プログラムされた勾配を使用して異なる率で混合した、アセトニトリルとＤ．Ｉ．Ｈ₂Ｏの混合物であった（表１）。検出波長は、２２５nm及び２８０nmに設定し、溶離の流量は、４ml/minであった。主要なペプチド生成物は、それぞれのペプチドの分子量を測定するため、ＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分光測定法）により特徴付けた。それぞれのペプチドの純度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。

ペプチドのインビトロ活性の検出
一般的に抗菌剤のインビトロ抗菌活性を、標準ＮＣＣＬＳ細菌阻害アッセイ、又は最小阻害濃度（ＭＩＣ）試験を使用して試験した。ＭＩＣ値は、試験生物の可視成長が阻害され、減退される、ペプチドの最低濃度である。ＭＩＣアッセイで使用される試験生物を表２に示す。

簡潔には、試験生物の一晩培養液を希釈して、Mueller-Hinton培養液（ＭＨＢ）中に約１０⁵コロニーを含有する接種原を製造した。ペプチドストック溶液から、２回連続して希釈したペプチド５０μlの容量を、９６ウエルマイクロタイタープレートで調製し、続いて全てのウエルに、試験生物の希釈培養液を接種した。３７℃で１８時間インキュベートした後、結果を濁度（細胞成長）についてアッセイした。それぞれのペプチドのＭＩＣ値を表３及び図１に示す。ＭＩＣ値は、異なる場合で３回実施し（図２）、中央値を示した。これらの結果から、Ｐａｃ５２１〜５３０がグラム陽性及びグラム陰性菌に対して最大の抗菌活性を示したことが見いだされた。更に、Ｐａｃ５２１〜５３０は、Ｐａｃ３０１〜３１０とよりも大きい抗菌活性を示した。

膜透過化アッセイ
ペプチド変異体の外膜透過化活性は、E. coliの無傷の細胞を使用して、１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）取込アッセイにより測定した。ＮＰＮは、水性環境では弱蛍光するが、疎水環境では、強い蛍光を示す。ＮＰＮは疎水性なので、外膜透過性の程度の直接的な測定法を提供する。E. coliは、一般的な条件下ではＮＰＮをほとんど、又は全く取り込まない。透過化合物（ＥＤＴＡ、ポリミキシンＢ、ネオマイシン又は抗菌性ペプチド）の存在下、ＮＰＮは細菌の外膜に割り込み、その結果蛍光が増加する。簡潔には、一晩培養液１mlを使用して培地５０mlに接種し、３７℃でインキュベートし、振とうした。ＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．６に成長させ、次に細胞を遠心沈殿した（３５００rpm、１０分）。洗浄し、緩衝液に再懸濁して、ＯＤ₆₀₀＝０．５にした。ＯＤ₆₀₀を記録した。細胞（ＯＤ₆₀₀＝０．５）１mlをキュベットに加え、２〜５秒間測定した。ＮＰＮ０．５mM（振とうして混合）２０μlを加え、次に２〜５秒間測定した。１００×所望の最終濃度（振とうして混合）抗生物質１０μlを加え、最大値に達するまで測定した（１〜５分間）。したがって、蛍光はペプチドの濃度により変わる。ＮＰＮ取込の最大増加の５０％をもたらすペプチドの濃度を、Ｐ₅₀として記録した。事実、全てのペプチドが、ＮＰＮ取込アッセイにより証明され、表５及び図２で示されているように、膜と相互作用することができた。

Ｔｒｐ残基の環境の特徴付け
トリプトファンのその環境の極性に対する感受性のため、極性及び結合試験に使用されてきた。蛍光発光スペクトルをＬＳ−５５分光蛍光計〔Perkin-Elmer〕で記録した。測定は、５mmの石英セルを２５℃で使用し、１nmづつ増加させて、３００〜４５０nmで実施した。励起波長を２８０nmに設定し、励起と発光の両方のスリット幅を５nmに設定した。リン酸緩衝液において、一連の抗菌性ペプチドは、３５７nmで最大発光を示した。ＳＤＳの存在下では、輝度の増加に伴い８nmで青色にシフトする最大発光を示した。この結果は、トリプトファン側鎖がより疎水性である環境に移動したことを示した。この試験の結果を図３に示す。

ＣＤ分光法により決定されたペプチドの二次構造
ｄ−１０−ショウノウスルホン酸で較正した後、ＣＤスペクトルをＡＶＩＶ６２ＤＳスペクトロポラロメータ(spectropolarometer)で記録した。全ての測定は、ｐＨ７．２の１０mMリン酸ナトリウム緩衝液中、ペプチド濃度３０μMで、経路の長さが１mmのキュベットを使用して実施した。遠ＵＶスペクトルを、０．５nmの刻み幅及び平均時間１秒を使用して、１９０〜２６０nmの範囲で集めた。リン脂質の不在下では、Ｐａｃ３０１〜３１０及びＰａｃ５２１〜５３０は、不規則構造の特徴を示した（表６）。しかし、構造はＳＤＳの添加により誘発された（図４）。

赤血球溶解
ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）に対する溶血反応について、Ｐａｃ５２１〜５３０を試験した。ＥＤＴＡを有するＲＢＣをＰＢＳ（８００ｇ、１０分間）で３回すすぎ、ＰＢＳに再懸濁した。ＲＢＣを、リン酸緩衝食塩水で１０％に希釈し、それぞれ５０μlをeppendorfに入れた。次にＰＢＳに溶解したペプチドをＲＢＣの１０％溶液５０μlに加え、３７℃で１時間インキュベートした（最終ＲＢＣ濃度５％v/v）。試料を、ＯＤ₅₄₀、８００ｇで１０分間遠心分離した。種々のペプチドの濃縮物を前処理ＲＢＣと共にインキュベートし、溶血率を測定した。結果は、Ｐａｃ５２５が、ＲＢＣに対して他の抗菌性ペプチドよりも相当低い溶血性をもつことを示した（表７、図５）。

Bacillus Substilis ATCC6633 の生存曲線である。 Staphylococcus aureus ATCC9144 の生存曲線である。 E. coli ATCC25922の生存曲線である。 Pac-525で処理（中黒丸）及び-524（中空丸）で処理したPseudomonas aeruginosa ATCC29213の生存曲線である。Ｐａｃ−５２５誘発膜固有透過化及びＮＰＮ取込アッセイ（０μg/ml：中黒四角；１μg/ml：中空丸；２μg/ml：中空四角；３μg/ml：中空四角）による評価である。トリプトファン蛍光は、ＳＤＳ誘導がＰａｃ−５２５の局所環境を変えていることを報告している。Ｐａｃ−５２５Ｐａｃ−５２６の円偏光二色性スペクトルが、リン酸緩衝液（中空丸）又は１０mM ＳＤＳ（中黒丸）で示されている。図はヒト赤血球に対する極めて低い溶血反応を示す（中黒丸：メリッチン；中空丸：Ｐａｃ−５２５；中黒三角：Ｐａｃ−５２７）。

Claims

下記の式：
（Ａ₁Ｘ₁Ａ₂）_N
（式中、
Ａ₁は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｘ₁は、トリプファン、フェニルアラニン又はプロリンを表し、
Ａ₂は、アルギニン、リシン、バリン又はイソレシンを表し、
Ｎは、１、２又は３を表し、
位相幾何学は、環状又は直鎖状を表す）により記載することができる、殺菌活性を有する一群の環状ペプチド。
下記：
ＫＷＲＲＷＩ（配列番号１）
ＫＷＲＲＷＶ（配列番号２）
ＫＷＩＫＷＲ（配列番号３）
ＫＷＶＫＷＩ（配列番号４）
ＫＷＩＫＷＩ（配列番号５）
ＫＷＩＫＷＩＫＷＩ（配列番号６）
ＫＦＩＫＦＩＫＦＩ（配列番号７）
ＫＷＲＲＷＶＲＷＩ（配列番号８）
ＩＷＲＶＷＲＲＷＫ（配列番号９）
ＫＦＲＲＦＶＲＦＩ（配列番号１０）
ＫＰＲＲＰＶＲＰＩ（配列番号１１）
ＫＷＩＲＷＶＲＷＩ（配列番号１２）
からなる群より選択される、請求項１記載のペプチド。
ペプチドが直鎖状又は環状位相幾何学からなる、請求項１〜２記載のペプチド。
ペプチドがＣ末端アミノ酸でアミド化されている、請求項１〜３記載のペプチド。
ペプチドがＮ末端アミノ酸でアセチル化されている、請求項１〜３記載のペプチド。
ペプチドがＣ末端アミノ酸でエステル化されている、請求項１〜３記載のペプチド。
対応するＤアミノ酸に変更されている１個以上のアミノ酸を有する、請求項１〜３記載のペプチド。
請求項１〜７記載のペプチドを担体又は賦形剤と混合して含む組成物。
グラム陰性菌の内毒素を不活性化する方法であって、そのような処置を必要とする被験者に、治療有効量の請求項１〜７記載の抗菌性ペプチドを投与する工程を含む方法。
被験者で微生物若しくはウイルス感染を処置又は予防する方法であって、そのような処置を必要とする被験者に、治療有効量の請求項１〜７記載の抗菌性ペプチドを投与する工程を含む方法。
微生物の成長を阻害する方法であって、そのような処置を必要とする被験者に、治療有効量の請求項１〜７記載の抗菌性ペプチドを投与する工程を含む方法。