CN116217669A - 一种可以提高广谱抗菌活性的订书肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可以提高广谱抗菌活性的订书肽及其制备方法和应用。本发明以氨基树脂为载体，按照模板Chem‑KVL：Ac‑KVLGRLVKVLGRLV‑NH2氨基酸序列在DIC‑Oxime缩合体系中，通过Fmoc固相合成法，合成得到肽链，其间在保留关键氨基酸残基的基础上，于特定位置以S5代替原有氨基酸，连接在树脂上直链肽在GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后从树脂上切下得到目标订书肽。本发明的方法简单易行，纯度大，产率高。进一步的实验证实，本发明的订书肽能够显示出非常显著的广谱抗菌活性，包括对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌的活性，在医药方面，可以作为优秀的抗菌素替代品，在体内外的抗菌治疗中具有潜在的应用价值。

Description

一种可以提高广谱抗菌活性的订书肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多肽药物领域，具体地说，是关于一种可以提高广谱抗菌活性的订书肽及其制备方法和应用。
背景技术
细菌广泛存在于人与自然中，在各种致病菌侵入人体，并且集体抵抗力低下的情况下，均可能导致细菌感染性疾病的发生。例如急性肠胃炎、肺炎、毛囊炎等，严重时还可能感染坏疽性深脓包病等。为了保证人类的健康、提高生活质量，大量抗菌药物被开发并且应用到临床治疗细菌感染性疾病中。其中抗菌肽在临床中的使用较为广泛，抗菌肽是一种从昆虫、高等植物、哺乳动物、细菌真菌等生物中发现并分离，经诱导而产生抗菌活性的一类碱性多肽物质，其对细菌有着广谱高效的杀菌活性。但大多数抗菌肽都存在稳定性较差、耐药性较强等方面的用药困难问题。当前，解决抗菌肽临床用药困难，提高体内稳定性已经成为研究的热点之一。
现有的研究表明，通过结构修饰、基因融合等方法可使得一些抗菌肽的临床用药性提高、副作用减少。而其中的一种修饰手段是在固相合成肽链的过程中引入两个含有α-甲基，α-烯基的非天然氨基酸，在环化剂的催化作用下发生烯烃复分解反应环化构成稳定α-螺旋结构构象的全碳支架，进而合成订书肽，订书修饰后的多肽明显增加了与靶标的亲和力，并且细胞渗透性也有显著提高。订书修饰技术不仅能够使得抗菌肽对体内蛋白酶更加稳定，还可以提高活性，增加临床用药度。目前Staple技术已经是一种能够有效提高活性、增加蛋白稳定性及稳固多肽肽链结构的策略，其已经广泛地应用于药物化学中以进行疾病干预。但临床上依然存在耐药性和用药副作用等问题，应用全碳骨架形成侧链环合结构改造多肽来稳定α-螺旋肽的活性构象，即订书肽(stapled peptide)，成为克服这些困难的最直接最有效方法。
中文专利CN113651874A，公开日2021.11.16，公开了一种具有抑制念珠菌生长繁殖作用的订书肽及其制备方法和应用，以氨基树脂为载体，按照直连肽模板Aurein1.2：Ac-GLFDIIKKIAESF-NH2氨基酸序列在DIC-Oxime缩合体系中，通过Fmoc固相合成法，合成得到肽链，并且在保留关键氨基酸残基的基础上，在特定位置用S5代替原有的氨基酸，连接在树脂上直链肽在GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后，从树脂上切下得到目标订书肽。而本申请发明人在现有技术披露的众多信息及文献报道中注意到，以抗菌活性闻名的人趋化蛋白是一种无活性的前体蛋白，有163个氨基酸残基，可广泛表达于多种上皮细胞中，在免疫细胞的趋化作用、调节脂肪细胞的分化和代谢功能以及葡萄糖代谢功能中起重要作用。在人趋化蛋白中，发现了一个具有7个残基的短肽在串联重复序列(Chem-KVL)后，可具有强大的广谱抗菌活性，它在整个蛋白质中拥有最高密度的疏水残基和带正电荷的残基。
在本专利中，设计将这个串联重复的短肽(Chem-KVL)进行订书修饰，使其结构更加稳定。在肽链的关键残基位置以S5分别替代i和i+4位氨基酸，环合后得到结构稳定的订书肽。而目前关于本发明制备的具有广谱抗菌的订书肽及及其制备方法和应用还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种及其制备方法和应用。
本发明的第二个目的是，提供所述订书肽的用途。
本发明的第三个目的是，提供所述订书肽的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种订书肽，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中10L和14V被S5替换并环合；
b)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中9V和13L被S5替换并环合；
c)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中7V和11G被S5替换并环合；
d)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中6L和10L被S5替换并环合；
e)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中5R和9V被S5替换并环合；
f)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中3L和7V被S5替换并环合。
g)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中2V和6L被S5替换并环合。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述订书肽在制备抗菌药物中的应用。
所述订书肽在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等有害细菌中的应用。
为实现上述的第三个目的，本发明采用的技术方案是：
所述的订书肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在缩合剂的作用下分别使C端首个氨基酸与固相载体偶联；
(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
(4)重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S5分别替代i和i+4位氨基酸；
(5)最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
(6)在环合剂作用下使i和i+4位S5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
(7)使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
作为一例优选例，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：32％B洗脱0～5min，32％B～56％B、5～60min；流速为20ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中采用的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，活化剂为DIC，以NMP为溶剂，所述氨基酸、Oxyme、DIC、NMP的比例为1:1:1:6(mol/mol/mol/ml)或1:0.9:0.9:6(mol/mol/mol/ml)。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中固相合成时，树脂的载样量为0.49mmol/g。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中偶联反应的温度为50～60℃，更优选为55℃；偶联反应的时间为20-30min，更优选为20min。
作为本发明的另一优选例，步骤(2)中，所述脱保护试剂为Oxyme、哌啶及DMF的混合溶液，比例为71：1：4(m/v/v)。
作为本发明的另一优选例，步骤(2)中，脱Fmoc保护是采用保护试剂作用5min后，再次作用5min；脱除Fmoc基团的反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，S5后所接的第一个氨基酸反应时间为1h并按相同条件重复反应一次再进行下一步操作。
作为本发明的另一优选例，步骤(5)中，使用的乙酰化试剂为吡啶与醋酸酐的混合液，投料比为1：1(v/v)。
作为本发明的另一优选例，步骤(5)中，所述的乙酰化是采用树脂在乙酰化试剂中反应20min；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合剂为GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂载样量：GrubbsⅠ试剂：二氯乙烷＝0.3：58：6(mmol/mg/ml)。
作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合是树脂在环合试剂中震荡两次，每次2h；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，所述切割试剂为TIPS、H2O、苯酚和TFA的混合溶液，体积比为2：5：5：88；所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1：10mL/mg。
作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，切割的温度为20～30℃，更优选为25℃；切割的时间为4h。
本发明优点在于：
1、本申请发明人基于丰富的研究经验，认识到Chem-KVL的订书肽可能具有更高抗菌活性的作用，实验证实了其可显著提高对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制活性，在临床细菌感染等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。
2、本发明以氨基树脂为载体，按照模板Chem-KVL：
Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2氨基酸序列在DIC-Oxime缩合体系中，通过Fmoc固相合成法，合成得到肽链，其间在保留关键氨基酸残基的基础上，于特定位置以S5代替原有氨基酸，连接在树脂上直链肽在GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后从树脂上切下得到目标订书肽，所得化合物经纯化后，采用HPLC及MS等光谱进行表征分析。该方法简便易行，所得订书肽纯度大于98％，产率高。
附图说明
附图1为本发明订书肽示意图。
附图2为本发明订书肽的合成路线图。
附图3-4为纯化后的目标化合物高效液相色谱图
附图5为纯化后的化合物Chem-KVL的质谱图；Chem-KVL:HR-Q-TOF-MS m/z calcdfor C74H139N23O15 1591.0720；found[M+H]+＝1592.0916，[M+2H]2+＝796.0541，[M+3H]3+＝531.0494。
附图6为纯化后的化合物SCL-1的质谱图；SCL-1:HR-Q-TOF-MS m/z calcd forC77H141N23O151629.1210；found[M+H]+＝1630.1064,[M+2H]2+＝815.0547,[M+3H]3+＝543.7047。
附图7为纯化后的化合物SCL-2的质谱图；SCL-2:HR-Q-TOF-MS m/z calcd forC77H141N23O151629.1210；found[M+2H]2+＝815.0576,[M+3H]3+＝543.7087。
附图8为纯化后的化合物SCL-3的质谱图；SCL-3:HR-Q-TOF-MS m/z calcd forC81H149N23O151685.2290；found[M+2H]2+＝843.5945,[M+3H]3+＝562.7212。
附图9为纯化后的化合物SCL-4的质谱图；SCL-4:HR-Q-TOF-MS m/z calcd forC76H139N23O151615.0940；found[M+H]+＝1616.0992,[M+2H]2+＝808.0532,[M+3H]3+＝539.0575。
附图10为纯化后的化合物SCL-5的质谱图；SCL-5:HR-Q-TOF-MS m/zcalcd forC77H140N20O15 1585.0920；found[M+H]+＝1586.0966,[M+2H]2+＝793.5519,[M+3H]3+＝529.7158。
附图11为纯化后的化合物SCL-6的质谱图；SCL-6:HR-Q-TOF-MS m/zcalcd forC77H141N23O15 1629.1210；found[M+H]+＝1630.1160,[M+2H]2+＝815.0624,[M+3H]3+＝544.0552。
附图12为纯化后的化合物SCL-7的质谱图；SCL-7:HR-Q-TOF-MS m/zcalcd forC77H141N23O15 1629.1210；found[M+H]+＝1630.1160,[M+2H]2+＝815.0621,[M+3H]3+＝544.0563。
具体实施方式
本发明按照模板Chem-KVL：Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2(SEQ IDNO:1)氨基酸序列设计并合成7条订书肽。各订书肽具体如图1所示。
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例，涉及的缩略词解释如下：
Fmoc：芴甲氧羰基；DCM：二氯甲烷；DCE：二氯乙烷；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；Oxyme：Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime；DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺；NMP：N-甲基吡咯烷酮；S5：2-amino-2-methylhept-6-enoic acid；TFA：三氟乙酸；TIPs：三异丙基硅烷；GrubbsⅠ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌。
实施例中涉及的实验材料来源如下：
氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。
实施例1提高Chem-KVL的订书肽的制备
1、订书肽的合成
订书肽的合成如附图2所示。
(1)化合物1的制备
取氨基树脂204mg(载样量为0.49mmol·g-1)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20min使树脂充分溶胀，抽干待用。
加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyme)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(2)化合物2的制备
将序列中首个氨基酸(0.5mmol)、Oxyme(71mg，0.5mmol)和DIC(77.5μL，0.5mmol)混溶于6ml NMP中，加入到树脂中60℃下振荡20min(S5后的一个氨基酸反应1h，重复反应1次)，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(3)化合物3的制备
重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸(0.5mmol)、Oxyme(71mg)和DIC(77.5μl)混溶于6mLNMP，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。最后一个氨基酸脱保护后，加入吡啶：乙酸酐(1：1)混合液6ml在25℃下震荡20min，依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次后，抽真空干燥树脂。
(4)化合物4的制备
待树脂完全干燥后，加入GrubbsⅠ(58mg)试剂的二氯乙烷溶液(6mL)，25℃下震荡反应两次，每次2h，反应完成后依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次，抽真空干燥树脂。
(5)目标化合物的制备
将树脂洗净抽干，加入TIPS：苯酚H2O：TFA＝2：5：5：88(V/V/V)10mL，常温下振荡4h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，继续用冰乙醚反复洗涤离心三次，氩气吹干得订书肽粗品。
2、目标订书肽的纯化
将粗肽用乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。分离条件如下：
仪器：Pre-HPLC SD-1VARIAN高效液相色谱仪；
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ(250×20mml.D，S-5μm，12nm；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液；
步骤与参数：32％B洗脱0～5min，32％B～56％B、5～60min；流速为20ml/min，进样量为5mL，检测波长214nm。
实施例2产物的鉴别与结构分析
将实施例1的步骤2所得产物通过HPLC进行鉴别以及HR-Q-TOF-MS(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，梯度洗脱(0～5min，流动相B：5％；5-30min，流动相B：5％～65％)；流速15.0mL·min-1；检测波长214nm和254nm，进样量20μl。经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度>98％(见图3-4)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图5-12所示。
实施例3抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌实验
抗菌活性试验：抑菌活性通过多肽的MIC值确定。取S.aureusATCC 25923菌株、P.aeruginosa ATCC 27853菌株、E.coliATCC 25922菌株及A.baumannii ATCC 17978菌株，接种至TSA平板，于37℃恒温培养箱倒置培养18-24h。再从平板上挑取适宜数量的纯菌落于3mL CAMHB培养基中，充分涡匀后，取60μL 0.5McF值的菌液加到CAMHB培养基至9mL(即稀释150倍)。充分涡匀后得到1×106个菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)/mL待接种菌液。除空白对照孔外，每孔接种待测菌液50μL，空白对照孔加入CAMHB培养基50μL，每个多肽的终浓度为64、32、16、8、4、2μg/mL，菌液浓度为5×105CFU/mL。待测菌液在15min内完成接种，于37℃培养箱中培养18h，次日读板记录MIC值。
结果见表1，表明本发明制备的订书肽可以提高原肽的抗菌活性，其中SCL-4、SCL-7效果最为突出。
表1为抑菌活性实验结果图
Figure BDA0004008526050000081
以上实施例表明，本发明成功制备得到基于Chem-KVL的订书肽，且证明了该订书肽可以显著抑制有害细菌的生长及繁殖，具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种订书肽，其特征在于，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中10L和14V被S5替换并环合；
b)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中9V和13L被S5替换并环合；
c)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中7V和11G被S5替换并环合；
d)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中6L和10L被S5替换并环合；
e)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中5R和9V被S5替换并环合；
f)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中3L和7V被S5替换并环合；
g)以Ac-KVLGRLVKVLGRLV-NH2为肽链模板，其中2V和6L被S5替换并环合。
2.权利要求1所述的订书肽在制备抗菌药物中的应用。
3.权利要求1所述的订书肽在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等有害细菌中的应用。
4.权利要求1所述的订书肽的制备方法，其特征在于，所述的制备包括以下步骤：
(1)在缩合剂的作用下分别使C端首个氨基酸与固相载体偶联；
(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
(4)重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S5分别替代i和i+4位氨基酸；
(5)最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
(6)在环合剂作用下使i和i+4位S5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
(7)使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：32％B洗脱0～5min，32％B～56％B、5～60min；流速为20ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，活化剂为DIC，以NMP为溶剂，所述氨基酸、Oxyme、DIC、NMP的比例为1:1:1:6(mol/mol/mol/ml)或1:0.9:0.9:6(mol/mol/mol/ml)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的脱保护试剂为Oxyme、哌啶及DMF的混合溶液，比例为71：1：4(m/v/v)。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的乙酰化试剂为吡啶与醋酸酐的混合液，投料比为1：1(v/v)。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的环合剂为GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂载样量：GrubbsⅠ试剂：二氯乙烷＝0.1：58：6(mmol/mg/ml)。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的切割试剂为TIPS、H2O、苯酚和TFA的混合溶液，体积比为2：5：5：88，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1：10mL/mg。
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