CN117756904A - 一种订书肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种订书肽及其制备的方法及其应用，属于多肽药物领域。本发明以直链肽Figainin2:Ac‑FLGAILKIGHALAKTVLPMVTNAFKPKQ‑NH2氨基酸序列作为模板进行订书化修饰，保留关键残基的基础上，以i,i+7方式进行设计，在肽链的非关键残基位置分别以R8和S5替代i和i+7位氨基酸，环合后得到结构稳定的订书肽，其中，F2‑1、F2‑3、F2‑4的螺旋稳定性大幅度提升。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种可以在模板多肽的基础上提高螺旋稳定性以及抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌抗菌活性的订书肽及其应用。
背景技术
自发现青霉素以来，抗生素已经成为重要的抗菌药物，然而抗生素的滥用导致耐药微生物的出现。微生物的耐药性的问题正威胁着人类的生命健康。近年来，在欧洲和美国，每年约有5万人死于耐药性感染；而在中低收入国家，每年有超过21万新生儿由于抗生素耐药性造成的血液感染而死亡。然而目前抗菌药物开发进展缓慢，使得临床抗感染治疗面进入巨大困境。因此，发现新型抗微生物药物的需求日益增加。
抗菌肽(AMPs)是多细胞真核生物先天免疫应答的基本组成部分，作为抗耐药细菌的潜在候选药物已引起了相当广泛的关注。抗菌肽与传统抗生素相比具有明显优势，其不仅具有广谱抗菌活性，对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌等具有抑制活性，还可以减缓耐药性形成，对抗传统抗生素无效的细菌感染，快速查杀靶标。抗菌肽其中很多是纯天然肽，鉴于其结构和功能的限制，再加上蛋白稳定性差，体内生物利用度低，阻碍了其作为潜在治疗药物的进阶之路。那么对已发现的抗菌肽进行结构修饰以增强其抗菌活性和稳定性是最快可以解决这个全球性难题的优解思路。目前的多肽修饰策略中订书化修饰是通过位点特异性插入非肽序列，形成侧链环合的“订书钉”样全碳结构，从而将多肽稳定在具有生物活性的α-螺旋二级结构中，极大改善了药理特征。-
Figainin 2是Mariana S.Castro教授课题组从查科青蛙的皮肤分泌物中分离出一种新的多功能抗菌肽，具有疏水性，良好的热稳定性以及两亲性α-螺旋性，其在50％(v/v)的三氟乙醇(TFE)中为α-螺旋结构。Figainin 2具有较强的抗菌、抗病毒、抗癌和免疫调节活性，其对革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌虫媒病毒和克氏锥虫有抑制作用，且对癌细胞也显示出抗增殖活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提高抗菌活性及稳定性的订书肽。
本发明采取的技术方案是：
一种订书肽，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基4A和11A分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGR8ILKIGHS5LAKTVLPMVTNAFKPKQ；
b)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基8I和15T分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKR8GHALAKS5VLPMVTNAFKPKQ；
c)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基11A和18P分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHR8LAKTVLS5MVTNAFKPKQ；
d)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基13A和20V分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHALR8KTVLPMS5TNAFKPKQ；
e)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基21T和28Q分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHALAKTVLPMVR8NAFKPKS5。
本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列如下表：
表1本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列
上述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用。优选的，所述耐药菌为鲍曼不动杆菌或铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
本发明优点在于：
1、本发明通过对Figainin2(F2-0)进行结构改造得到新的订书肽，使其具有更高的抗耐药菌活性以及α螺旋稳定性，药理实验表明，本发明的订书肽对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均具有抑制活性，在临床耐药菌感染等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。
2、为提高多肽抗耐药菌活性，本专利通过对F2-0进行订书化改造，在保留关键残基的基础上，以i,i+7方式进行设计，在肽链的非关键残基位置分别以R8和S5替代i和i+7位氨基酸，环合后得到结构稳定的订书肽。共合成了5条订书肽(F2-1—F2-5)，筛选得到的多肽提高了抗菌活性，能够对有害耐药细菌产生抑制性的正向调控。其中，F2-1、F2-2、F2-5对鲍曼不动杆菌的抑菌效果有所提升。
3、为提高多肽的稳定性，进行订书化改造，钉肽修饰后的全烃构象锁定对肽链的加固起了一定的作用。其中，F2-1、F2-3、F2-4的螺旋稳定性大幅度提升。
附图说明
为了更清楚说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例和对比例中所需要的附图说明简单介绍，应当理解，以下表示了本发明的实施例和对比例的结果对比和方法验证呈现。图1为本发明订书肽的合成路线图。
图2为F2-0氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-0通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH3CN,55min)。其中，A为F2-0的氨基酸序列，B为F2-0的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％ CH3CN，25min)。C为F2-0的质谱图。
图3为F2-1氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-1通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH3CN，55min)，得到F2-1，分离率为24.4％。其中，A为F2-1的氨基酸序列，B为F2-1的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％ CH3CN，25min)。C为F2-1的质谱图。图4为F2-2氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-2通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH3CN，55min)，得到F2-2，分离率为14.7％。其中，A为F2-2的氨基酸序列，B为F2-2的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％ CH3CN，25min)。C为F2-2的质谱图。图5为F2-3氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-3通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH3CN，55min)，得到F2-3，分离率为14.6％。其中，A为F2-3的氨基酸序列，B为F2-3的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％ CH3CN25min)。C为F2-3的质谱图。
图6为F2-4氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-4通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH3CN，55min)，得到F2-4，分离率为19.6％。其中，A为F2-4的氨基酸序列，B为F2-4的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％ CH3CN，25min)。C为F2-4的质谱图。图7为F2-5氨基酸序列示意图及其表征图谱，F2-5通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH3CN，55min),得到F2-5。其中，A为F2-5的氨基酸序列，B为F2-5的HPLC图谱，分析柱：C18，梯度：10％-90％CH3CN，25min。C为F2-5的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本申请作进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本申请，但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，即所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明一部分实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明范围，而是仅仅是本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，涉及的缩略词解释如下：
Fmoc：芴甲氧羰基；
DCM：二氯甲烷
DCE：1,2-二氯乙烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Oxyme：Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺
S5：2-amino-2-methylhept-6-enoic acid
R8：2-amino-2-methyldec-9-enoic acid
TFA：三氟乙酸
TIPS：三异丙基硅烷
GrubbsⅠ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌
Ac2O：乙酸酐
MS：质谱
HR-Q-TOF-MS：高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。
本发明实施例中涉及的实验材料来源如下：
Fmoc-氨基酸、Rink amide MBHA树脂购自南开合成有限公司；NMP、DIC、Oxyme、TFA、乙腈购自探索平台；DMF、无水乙醚、DCM、DCE、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂上海有限公司
本发明按照模板多肽F2-0:Ac-FLGAILKIGHALAKTVLPMVTNAFKPKQ-NH2氨基酸序列设计并合成5条订书肽。订书肽的结构如表1所示。
实施例1基于Figainin2(F2-0)的订书肽的制备
1、订书肽的合成
如图1所示：
(1)化合物1的制备
取氨基树脂600mg加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡30min使树脂充分溶胀，抽干待用。
加20％哌啶-DMF溶液至树脂中，37℃下振荡5min脱去树脂上的Fmoc保护基团，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂。
(2)化合物2的制备
将序列中首个氨基酸(1mmol)、Oxyme(1mmol)和DIC(200μL)混溶于7mL DMF中，加入到树脂中50℃下振荡60min，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂。
(3)化合物3的制备
重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸(1mmol)、Oxyme(1mmol)和DIC(200μL)溶解于7mL DMF中，然后加入到树脂上，于50℃下振荡反应60min，重复脱除Fmoc保护→缩合→脱Fmoc保护的过程，直至所有氨基酸缩合完成。最后一个氨基酸脱Fmoc保护基团后，加入Ac2O:DIEA:DMF(1:1:8)混合液，并在37℃下震荡30min，抽干，再次加入乙酰化试剂，反应30min,依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂各，抽真空干燥树脂。
(4)化合物4的制备
待树脂完全干燥后，加入GrubbsⅠ(100mg)试剂的1,2-二氯乙烷溶液(10mL)，37℃下震荡反应，反应完成后依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂，抽真空干燥树脂。
(5)目标化合物的制备
首先将树脂洗净抽干，加入TFA:苯酚:H2O:TIPS＝88.75:0.5:0.5:0.25(V/V/V/V)20mL，37℃下振荡3h，过滤，收集滤液。冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，置于通风橱下自然挥干，得粗多肽样品。
2、订书肽样品的纯化
将粗多肽，用乙腈和水的混合溶剂溶解，通过反相制备RP-HPLC纯化，得到纯化后的订书肽纯品产物。分离条件如下：
仪器：岛津LC-20A反相高效液相色谱仪；
色谱柱：UltimateXB-C18，21.2×250mm,5μm；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的水溶液；
步骤与参数：90％-50％B,40min,流速为8mL/min，检测波长214nm和254nm。
实施例2产物的鉴别与结构分析
将实施例1的步骤2所得产物通过反相HPLC进行鉴别，并通过HR-Q-TOF-MS进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的水溶液，梯度洗脱90％-10％ B,25min；流速1.0mL·min-1；检测波长214nm和254nm。经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度>95％，质谱分析结果如图所示。经过解析，得到的订书肽结构见表1。
表1本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列
实施例3本发明订书肽抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌实验
体外抗耐药菌试验：配制固体LB培养基，高压灭菌后铺板并配制LB液体培养基，4℃冰箱备用。将菌液涂布在固体LB培养基上，37℃培养箱中倒置培养过夜；取单克隆，加入3mL液体LB培养基中，37℃，220rpm，恒温摇床中培养6h，使细菌生长至对数期；取1mL菌液，4000rpm离心5min，弃上清，加入PBS，通过OD值调整细菌菌液浓度为2×106CFU/mL。将不同浓度的抗菌肽加入96孔板中，同时将菌液加入96孔板中，37℃培养8h，酶标仪采用595nm检测，重复三次，统计分析MIC值。
结果见表2。
表2本发明订书肽抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌实验结果
表2结果表明，本发明的订书肽可以提高模板多肽的抗耐药菌活性，其中F2-1、F2-2、F2-5抗耐药菌效果有所提高。
以上实施例表明，本发明成功制备得到基于Figainin2(F2-0)的改造订书肽，通过体外抑菌实验，证明合成的订书肽可以抑制致病耐药细菌的生长及繁殖，具有发展成新型抗菌药物的应用前景。
实施例4本发明订书肽提高二级结构分析实验
本发明通过Jasco-1500圆二色谱仪测试多肽的CD值，并根据trRosetta算法搜索预测F2-0及其订书化衍生物的二级结构进行分析证实。将三氟乙醇与纯水以1：1的比例配制成200mL的缓冲液(pH＝7.3)，将Figainin 2及其订书肽溶于缓冲溶液中使多肽在缓冲液中的最终浓度50mM。在检测波长为190-260nm；带宽为1nm；石英比色皿的厚度为1mm；流速为100nm/min的条件下将已经配置好的Figainin 2及其订书肽溶液放于圆二色谱仪器下观测螺旋度数据。所有光谱经减掉空白背景后转换为统一尺寸的摩尔椭圆度。螺旋度计算方法如下：在靠近192nm处会有一个正的谱带，而在222nm和208nm处出现两个负的谱带。根据在208nm和222nm表现的α-螺旋结构特征吸收峰，可以简单地估算α-螺旋的含量，也可通过比较[θ]218/[θ]208以及相对螺旋率(H％)来判定多肽的α-螺旋程度。
结果见表3。
表3本发明订书肽α-螺旋度实验结果
表3结果表明，大多数订书肽的螺旋度大于原肽F2-0，说明钉肽修饰后的全烃构象锁定对肽链的加固起了一定的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种订书肽，其特征在于，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基4A和11A分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGR8ILKIGHS5LAKTVLPMVTNAFKPKQ；
b)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基8I和15T分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKR8GHALAKS5VLPMVTNAFKPKQ；
c)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基11A和18P分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHR8LAKTVLS5MVTNAFKPKQ；
d)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基13A和20V分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHALR8KTVLPMS5TNAFKPKQ；
e)以Figainin2为肽链模板，其中氨基酸残基21T和28Q分别被R8和S5替换并环合即Ac-FLGAILKIGHALAKTVLPMVR8NAFKPKS5。
2.权利要求1所述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用，其特征在于，所述耐药菌为鲍曼不动杆菌。
4.根据权利要求2所述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用，其特征在于，所述耐药菌为铜绿假单胞菌。
5.根据权利要求2所述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用，其特征在于，所述耐药菌为金黄色葡萄球菌。
6.根据权利要求2所述的订书肽在制备抗耐药菌药物中的应用，其特征在于，所述耐药菌为大肠杆菌。
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