WO2017018595A1 - 이중 스테이플화된 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중 스테이플화된 신규 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 이중 스테이플화된 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 또는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 스테이플을 이중으로 도입함으로써 펩타이드를 나선형의 이차구조로 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 또한, 단백질분해효소는 나선형의 펩타이드를 기질로서 인식하지 못하므로 스테이플에 의해 이차구조가 나선형 형태로 안 정화된 펩타이드는 단백질분해효소에 대해 높은 안정성을 가질 수 있다. 더욱이, 스테이플화를 통해 얻어진 나선형 구조에서 소수성인 스테이플의 반대 위치에는 양전하를 띠는 아미노산이 배치되어 양극성 나선구조를 형성하는바, 자연에 존재하는 많은 항균 펩타이드와 같이 세균의 세포막 파괴에 의한 항균작용을 나타낼 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있고, 이외에 항암용 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

이중 스테이플화된 펩타이드 및 이의 용도

본 발명은 이중 스테이플화된 신규 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 이중 스테이플화된 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 또는 항암용 조성물에 관한 것이다.

페니실린이 발견된 이후 수많은 항생제들이 개발되어 인류의 보건향상에 크게 이바지 하였다. 하지만 항생제에 대한 내성균의 출현은 기존 항생제를 쉽게 무력화시켜 왔으며, 새로운 기전으로 활성을 나타내는 항생제의 개발을 끊임없이 요구하고 있다. 새로운 항생제 개발에 대한 노력은 내성균 출현 속도를 따라잡기엔 역부족이었으며, 따라서 새로운 항생제 개발에 대한 연구를 포기하는 제약회사들이 많아지면서 항생제에 대한 내성은 현재 더욱 심각한 사회문제로 대두되고 있다.

한편, 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)는 외부 감염인자에 대하여 1차적인 보호 작용을 나타내는 물질로서 인간을 비롯한 거의 모든 생명체에서 발견되며, 광범위한 항균작용 뿐만 아니라 항암작용, 항염증작용 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 생체막의 파열을 유도함으로써 활성을 나타내는 항균 펩타이드의 대다수는 나선형의 이차구조(helical secondary structure) 형태로 생체막에 작용하는 것으로 알려져 있으며, 대부분 세균 생체막과의 효과적인 상호작용을 위해 나선구조 한 면은 소수성의 아미노산 잔기가, 다른 면에는 양전하를 띠는 아미노산 잔기가 주로 존재하는 양극성 나선구조(amphipathic helix)를 갖는다.

기존의 항생제가 세균의 생체 내 분자를 표적으로 하여 내성이 쉽게 생기는데 반해, 이들 항균 펩타이드의 대다수는 생체막에 작용하여 생체막의 파열을 유도함으로써 그 활성을 나타내는데 이러한 기전은 내성이 생길 여지가 매우 작기 때문에 항균 펩타이드는 항생제 내성에 대처할 수 있는 차별화된 항생제로서 그 잠재력이 매우 크다고 할 수 있다.

하지만 자연에 존재하는 항생 펩타이드는 여러 특성 때문에 임상학적 이용에 한계가 있는 단점이 있다. 즉, 대부분의 천연 항생 펩타이드는 아미노산 20개 이상의 긴 서열을 가지고 있는데, 이 서열을 짧게 한 유도체 대부분은 활성을 잃게 되며, 이는 짧은 서열의 펩타이드의 경우 효과적으로 나선형 구조를 유지하기가 어렵기 때문인 것으로 여겨진다. 드물게 짧은 서열을 가진 유도체가 활성을 유지하는 경우가 보고되고 있기는 하지만 대부분 체내에서 단백질 분해효소에 의해 쉽게 파괴되어 생체이용률이 매우 낮아 실제로 의약품으로 사용되기엔 많은 제약이 따르는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 단백질 분해효소에 안정하면서도 생체막 파괴라는 독특한 기전으로 내성에 대처할 수 있는 항생 또는 항암물질에 대하여 연구 노력한 결과, 15개의 짧은 아미노산 서열로 이루어지면서 해당 펩타이드를 이중으로 스테이플화하여 단백질 분해효소에 대해 안정적이면서 우수한 항균 또는 항암 활성을 갖는 펩타이드를 제조하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 이중 스테이플화된 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 항균 또는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 15개의 아미노산 서열로 이루어지고, N 말단에서 2번째의 아미노산 위치와 6번째 아미노산 위치 및 9번째의 아미노산 위치와 13번째 아미노산 위치가 탄화수소로 스테이플화(stapling)된 이중 스테이플화 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 N 말단에서 1번째, 4번째, 7번째, 8번째, 11번째, 12번째 및 15번째 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 양전하를 띠는 아미노산일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 탄화수소는 옥트-4-에닐기일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 N 말단 및/또는 C 말단에 링커에 의해 화합물이 연결될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 병원성 세균, 바이러스, 병원성 효모 또는 진균에 대해 항생효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 병원성 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 그람 음성균은 대장균 (Escherichia coli), 쉬겔라 디센타리에 (Sigella dysentariae), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae) 또는 녹농균(pseudomonas aeruginose)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 병원성 효모 또는 진균은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스퍼질러스 휴미거투스 (Aspergillus humigatus), 사카로마이세스 세리비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)일 수 있다.

본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환 또는 암 치료방법을 제공한다.

본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드의 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환 또는 암 치료 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 스테이플을 이중으로 도입함으로써 펩타이드를 나선형의 이차구조로 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 또한, 단백질분해효소는 나선형의 펩타이드를 기질로서 인식하지 못하므로 스테이플에 의해 이차구조가 나선형 형태로 안정화된 펩타이드는 단백질분해효소에 대해 높은 안정성을 가질 수 있다. 더욱이, 스테이플화를 통해 얻어진 나선형 구조에서 소수성인 스테이플의 반대 위치에는 양전하를 띠는 아미노산이 배치되어 양극성 나선구조를 형성하는바, 자연에 존재하는 많은 항균 펩타이드와 같이 세균의 세포막 파괴에 의한 항균작용을 나타낼 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있고, 이외에 항암용 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 펩타이드의 스테이플화 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 양극성 나선구조를 갖는 이중 스테이플화된 펩타이드의 구조를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 펩타이드의 스테이플화 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 2-1에서 1차 디자인된 펩타이들의 구체적인 서열구성을 나타낸 것이다.

도 5는 실시예 2-2에서 2차 디자인된 펩타이들의 구체적인 서열구성을 나타낸 것이다.

도 6은 실시예 2-3에서 3차 디자인된 펩타이들의 구체적인 서열구성을 나타낸 것이다.

도 7 및 도 8은 실시예 2에서 디자인된 펩타이드들의 HPLC (high-performance liquid chromatography)를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드(Ac-DS-14W)와 대조군(Ac-SS-14W 및Ac-UM-14W)과의 구조를 CD(Circular dichroism)를 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드(Ac-DS-14W, Ac-DS-12W, Ac-DS-5W 및 Ac-DS-3W)의 구조를 CD(Circular dichroism)를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드(Ac-DS-5W, H-DS-5W 및 Su-DS-5W)의 구조를 CD(Circular dichroism)를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드의 단백질 분해효소에 대한 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 단백질 분해효소에 안정하면서도 생체막 파괴라는 독특한 기전으로 내성에 대처할 수 있는 항생 또는 항암물질에 대하여 연구 노력한 결과, 15개의 짧은 아미노산 서열로 이루어지면서 해당 펩타이드를 이중 스테이플화하면 양극성 나선구조(amphipathic helix)를 가짐으로써 단백질 분해효소에 대해 안정적이면서 현저히 우수한 항균 또는 항암 활성을 가짐을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이중 스테이플화된 펩타이드로서, 15개의 아미노산 서열로 이루어지고, N 말단에서 2번째의 아미노산 위치와 6번째 아미노산 위치 및 9번째의 아미노산 위치와 13번째 아미노산 위치가 탄화수소로 스테이플화(stapling)된 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서, "스테이플화 (stapling)"란 펩타이드에 탄화수소의 교차-결합을 도입하여 펩타이드의 α나선형의 이차구조를 안정화시킬 수 있는 기술로서, 펩타이드의 스테이플화는 도 1의 모식도에 나타내었다.

본 발명의 펩타이드의 스테이플화는 탄화수소에 의할 수 있다. 탄화수소는 포화 또는 불포화일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 40의 탄소수로 구성될 수 있으며, 단일결합, 이중결합 또는 삼중결합이 각각 독립적으로 1 내지 40개일 수 있다. 바람직하게는 상기 탄화수소의 탄소수가 8개인 경우, 이중결합이 4번 탄소 자리에 위치할 수 있으며 (옥트-4-에닐), 가장 바람직하게 상기 탄화수소는 옥트-4-에닐 (oct-4-enyl)기이다.

단백질의 스테이플화를 위하여, 예를 들면, 펩타이드 서열 중 임의의 위치(i)와 그로부터 C 말단 쪽으로 4번째 위치(i+4)에 (S)-α-methyl, α-petenylglycine (S5) 아미노산을 갖는 펩타이드를 합성한 후, 이 두 개의 아미노산의 잔기를 Grubbs 1세대 촉매를 이용한 복분해반응으로 교차-결합시킨다.

본 발명에서 교차결합된 스테이플을 도입하는 위치는 어느 하나의 아미노산 위치와 그로부터 4번째 뒤의 아미노산 위치가 탄화수소로 스테이플화 (stapling)될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2번째의 아미노산 위치와 6번째 아미노산 위치 및 9번째의 아미노산 위치와 13번째 아미노산 위치가 스테이플화된 것일 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 나선을 안정화시키는 효과를 극대화하기 위하여, N 말단 및/또는 C 말단에 링커에 의해 화합물이 연결되거나 아세틸화 또는 아마이드화를 시킬 수도 있다.

본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 스테이플을 이중으로 도입함으로써 펩타이드를 나선형의 이차구조로 효과적으로 안정시킴과 동시에, 스테이플화를 통해 얻어진 나선형 구조에서 소수성인 스테이플의 반대 위치(예컨대, N 말단에서 1번째, 4번째, 7번째, 8번째, 11번째, 12번째 또는 15번째)에 양전하를 띠는 아미노산을 배치하여 양극성 나선구조를 형성할 수 있다(도 2 참조). 이때, 배치할 수 있는 아미노산으로는 바람직하게는 라이신(Lys) 또는 알지닌(Arg)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 경우에 따라서는 다른 아미노산이 치환될 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드의 항균 활성을 확인한 결과, 스테이플화를 하지 않거나 및 단일 스테이플화 펩타이드 대조군과 비교할 때, 특히 그람 양성균에 대하여 유의적으로 증가된 항균활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 5 참조).

따라서, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 예컨대 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환의 예방, 억제, 개선 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 기능성 식품 조성물, 식품 첨가제, 식품 보존제, 소독제, 살균 세정제 등의 용도로 사용될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

이에, 본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "항균"이란, 병원성 세균, 바이러스, 병원성 효모 또는 진균의 생장을 억제할 수 있는 활성을 의미한다. 상기 병원성 세균은 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물로서, 그람 양성균 및 그람 음성균을 포함할 수 있다. 예컨대, 그람 양성균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus), 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)등을 포함하고, 그람 음성균은 대장균 (Escherichia coli), 쉬겔라 디센타리에 (Sigella dysentariae), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae) 또는 녹농균(pseudomonas aeruginose) 등을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 세균은 항생제 내성 세균일 수도 있다. 또한, 상기 병원성 효모 및 진균은 병원성을 가지는 효모 및 진균으로서, 이에 제한되지는 않으나, 그 예로, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스퍼질러스 휴미거투스 (Aspergillus humigatus), 사카로마이세스 세리비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)등을 포함할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 병원성 세균에 의한 감염성 질환은 콜레라균에 의한 콜레라; 적리균에 의한 세균성 적리; 백일해균에 의한 백일해; 장티푸스균에 의한 장티푸스; 디프테리아균에 의한 후두디프테리아, 비(鼻)디프테리아; 페스트균에 의한 선(腺)페스트, 폐(肺)페스트; 용혈성 연쇄구균에 의한 성홍열, 단독(丹毒), 패혈증, 피부화농증; 결핵균에 의한 폐결핵, 관절결핵, 신장결핵, 결핵성 수막염; 살모넬라균 및 장염 비브리오 등에 의한 세균성 식중독일 수 있다. 또한, 상기 병원성 효모 및 진균에 의한 감염성 질환은 크립토코커스증(cryptococcosis), 칸디다증(candidasis), 피부사상균증(Dermatophytosis), 표재성 피부 곰팡이증(superficial mycoses), 뇌수막염, 뇌농양, 뇌종양, 히스토플라즈마증(Histoplasmosis), 뉴모시스티스 폐렴 또는 아스퍼질러스증(aspergillosis)일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 동물 사료용 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때, 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 게, 새우, 대하 등의 갑각류를 포함하는 절지동물, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 돼지, 소, 염소 등의 포유류일 수 있다.

본 발명의 동물 사료용 조성물은 이중 스테이플화된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품 등을 더 포함할 수 있으며, 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수도 있다.

본 발명의 동물 사료용 조성물에 포함되는 항균 조성물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에게 적절하게 선택될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 기능성 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때 상기 기능성 식품 조성물은 식중독 등과 같은 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 식품 보존제 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때 식품 보존제는 식품류의 보존성을 증강시키기기 위한 목적으로 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드에 식품학적으로 허용되는 용매 또는 희석제를 추가로 첨가하여 제조할 수 있다. 본 발명의 식품 보존제 조성물은 식품의 제조 공정시 원료와 함께 배합하거나 별도의 수용성 현탁액으로 제조하여 첨가할 수도 있다. 또한, 본 발명의 식품 보존제를 사용하여 대상 식품을 침지시키거나 본 발명의 식품 보존제를 대상 식품에 분무할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 살균 세정제 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때 상기 살균 세정제는 주방용 또는 식품용으로 사용될 수 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 살균 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택된 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 살균 세정제 등 다른 유효성분이나 색소, 계면활성제, 방부제 등의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 살균 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있으며, 제품화를 위하여 포장을 위해 통상의 방법을 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 소독제의 형태로 사용될 수 있으며, 이때 상기 소독제는 유효성분인 이중 스테이플화된 펩타이드를 그대로 사용하거나 적합한 농도가 되도록 피부학적 및 약리학적으로 허용되는 희석제 또는 용매로 희석하여 제조할 수 있다. 본 발명의 소독제는 생물체의 표면 바람직하게는, 포유동물의 피부 가장 바람직하게는 인간의 피부에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 소독제는 무생물체의 표면 예를 들면, 나무, 금속, 유리, 세라믹, 플라스틱, 종이 및 천의 표면에 사용될 수 있다. 본 발명의 소독제는 침지, 면봉, 분무 및 브러싱을 포함하는 방법을 사용하여 상기 생물체 또는 무생물체의 표면에 처리할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 소독제는 상처표면, 수술 전 피부소독, 수술기구의 소독, 도관 소독 등의 용도로 병원과 일반 가정에서 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항균 조성물은 화장료 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때, 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양 화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 α나선 형태의 펩타이드의 2차 구조를 안정적으로 유지함으로써, 생물학적으로 안정화된 형태인바, 효과적인 항암효과를 기대할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 발명에서 암의 종류로는 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하고 약제학적으로 포함되는 담체를 더 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 분석방법

1-1. 시약준비

상업적으로 이용가능한 용매 및 시약을 매뉴얼에 따라 이용하였다. 모든 Fmoc-protected α-아미노산(Okeanos Tech Co.Ltd.로부터 구입한 Fmoc-(S)-α-메틸, α-펜틸글라이신 제외), 1-[(1-(cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) -dimethylamino-morpholino)]-uranium hexafluorophosphate (COMU), 및 Rink Amide MBHA 수지는 NovaBiochem 으로부터 구입하였다. 피페리딘(Piperidine), N-methyl-2-pyrrolidinone (NMP), dimethylformamide (DMF), N,N-diisopropylethylamine (DIEA), Grubbs 1세대 catalyst (bis(tricyclohexylphosphine)benzylidine ruthenium (IV) dichloride), 1,2-dichloroethane (DCE), triisopropylsilane (TIS), 및 trifluoroacetic acid (TFA)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

1-2. 원편광 이색성 (Circular dichroism)

펩타이드를 25 mM의 인산칼륨 완충액(pH 6.5)에 용해시켰고 상기 농도를 280nm(트립토판에 대한 흡광계수, λ₂₈₀ = 5690cm^{- 1})에서 흡수 분광기에 의해 측정하였다. 온도 조절기를 갖는 Chirascan HP 이중 극성 원평광 이색성 스펙트럼 상에서 하기 표준 측정 파라미터를 사용하여 원편광 이색성 스펙트럼을 수집하였다: 1 nm step resolution, 3 accumulations, 0.5초 반응, 1 nm 대역폭, 및 0.1 cm 경로 길이. 모든 스펙트럼은 배경 (background)을 제외한 후, 몰 타원율 (molar ellipticity)의 등분 눈금 (uniform scale)으로 전환하였고, 곡선은 표준 파라미터로 평탄화하였다.

1-3. 항균 분석

항균 분석은 표준 브로스 미량희석법 (broth microdilution method)을 이용하여 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC) 값을 측정함으로써 수행하였다. 항균 활성에 사용된 균주로는 3개의 그람-양성 균주 (Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p, Staphylococcus epidermis ATCC 12228) 및 6개의 그람-음성 균주 (Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentariae ATCC 9752, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Klebsiella pneumonia ATCC 10031, Proteus mirabilis ATCC 25933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)를 이용하였고, 상기 균주들을 2 ml LB (Luria-Bertani) 브로스에 접종하고 밤새 37 ℃에서 배양하였다.

펩타이드를 증류수(distilled water)에 용해시키고, 펩타이드 용액을 96 웰 둥근 바닥 마이크로타이트 플레이트에 0.2 ㎍/mL 내지 200 ㎍/mL로 2 배 희석하여 준비하였다. 펩타이드 용액과 박테리아 접종물을 LB 브로스를 사용하여 희석하였다. 박테리아 현탁액(10⁶ 내지 10⁸ 콜로니-형성 단위(CFU, colony-forming unit)/ml)을 펩타이드-함유 웰에 첨가하여 배양하였다. 37℃에서 24시간동안 배양 후, 웰의 최소억제농도 (MIC)를 분석하였고, 이때 MIC는 세포의 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 펩타이드 농도로 정의하였다. 실험은 2회 실시하였다. 한편, 모든 박테이라 균주는 KCTC (Korean Collection of Type Culture)의 KRIBB (Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea)으로부터 분양받았다.

1-4. 용혈 분석

펩타이드를 PBS에 용해시켰다. 연속으로 희석된 펩타이드 10 μl (최종 농도 0.8-200 μM)을 190 μl의 인간 적혈구 세포(10% v/v in PBS)의 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 원심분리 후, 상청액을 PBS로 10배 희석하고, 405nm에서 각 용액에 대한 흡광도를 측정하였다. 0.2 % 트리톤 X-100로 처리 한 혈액 현탁액을 100 % 용혈을 위한 대조군으로 사용하였다. 용혈의 백분율은 하기 식을 사용하여 결정 하였다.

1-5. 트립신 분해 분석( Trypsin digestion assay)

트립신 용액(0.5 μM, sigma)이 함유된 digestion buffer(0.1 M NH₄HCO₃ buffer, pH 8.0) 25 μl를 펩타이드 용액(80 μM) 250 ㎕에 첨가하여 펩타이드 기질/트립신 효소의 비율이 1,600:1이 되도록 하였다. 상기 혼합액을 상온에서 600rpm의 속도로 빠르게 교반시키며 반응시켰으며, 혼합 후 각각 0, 10, 20, 30, 및 60분 후에 상기 혼합액 40 μl씩을 취하여 트리플루오로아세트산 2 μl로 반응을 중화시켰다. 반응 결과, 남은 펩타이드 기질 및 가수분해된 생성물을 280 nm에서 LC-based peak detection으로 정량화하였고, 각 실험을 2번씩 수행하였다.

실시예 2. 펩타이드 디자인

2-1. 1차 디자인

15개의 짧은 서열로 이루어진 펩타이드를 디자인하기 위하여 하기와 같이 펩타이드를 고안하였다.

나선형의 이차구조로 효과적인 안정화를 갖게 하기 위하여, N 말단에서 2번째의 아미노산 위치와 6번째 아미노산 위치 및 9번째의 아미노산 위치와 13번째 아미노산 위치에 (S)-α-methyl, α-petenylglycine 아미노산을 갖는 펩타이드를 합성한 후, 상기 아미노산의 잔기를 Grubbs 1세대 촉매를 이용한 metathesis 반응으로 cross-link시켜 해당 위치의 아미노산이 oct-4-enyl staple로 연결되게 하였다(도 3 참조). 이차구조를 나선형으로 안정화하기 위해 도입된 oct-4-enyl staple은 소수성이기 때문에, 양극성 나선구조를 형성하기 위해, staple 반대 위치(N 말단에서 1번, 4번, 7번, 8번, 11번 및 15번 위치)에 양하전을 띠는 라이신(lysine)기를 도입하였다. 소수성과 친수성 표면 중간에 위치하게 되는 3번, 5번, 10번, 12번 위치에는 펩타이드 나선형 형성에 도움이 된다고 알려진 알라닌(alanine)기를 도입하였다. 마지막으로 14번 위치에는 트립토판(tryptophan)기를 도입하였고, 이는 양극성 나선구조를 갖는 항균펩타이드의 소수성과 친수성 표면 중간에 tryptophan이 존재하게 되면 세균의 세포막과의 결합에 도움이 된다고 알려져 있기 때문이다.

한편, 비교를 위해서 스테이플이 하나만 있는 유도체(Ac-SS-14W)와 스테이플이 없는 유도체(Ac-UM-14W)도 디자인하였고, 이에 따라 디자인된 펩타이드들의 구체적인 서열구성을 도 4에 나타내었다.

2-2. 2차 디자인

상기 실시예 2-1에 의해 1차 디자인된 이중 스테이플화된 펩타이드의 유도체를 디자인하였다. 보다 구체적으로, N 말단에서 3번, 5번 또는 12번 위치에 알라닌(alanine)기 대신 트립토판(tryptophan)기를 치환하였고, N 말단에 아세틸기를 도입 또는 제거하거나 숙시닐(succinyl)기를 도입하기도 하였다. 이에 따라 디자인된 펩타이드들의 구체적인 서열구성을 도 5에 나타내었다.

2-3. 3차 디자인

상기 실시예 2-2에 의해 2차 디자인된 이중 스테이플화된 펩타이드의 유도체를 디자인하였다. 보다 구체적으로, N 말단에서 7번 또는 8번 위치에 라이신(lysine)기 대신 글리신(Glycine)기 또는 아스파라진(Asparagine)기를 치환하였고, N 말단에 아세틸기를 도입 또는 제거하거나 숙시닐(succinyl)기를 도입하기도 하였다. 이에 따라 디자인된 펩타이드들의 구체적인 서열구성을 도 6에 나타내었다.

실시예 3. 펩타이드 제조

3-1. 펩타이드 합성

실험을 위하여 상기 실시예 2에서 디자인된 도 4 내지 도 6의 펩타이드를 합성하였다. 모든 펩타이드는 0.6 mmol/g의 충진 수용능력(loading capacity)을 갖는 Rink 아마이드 MBHA 수지 상에서 Fmoc 화학 기술을 이용하여 제조하였다. 사용 전, 건조된 수지 (50 mg, 30 μmol)를 10분 동안 NMP에서 팽윤시켰다. NMP에서 25% 피페리딘을 처리하여 Fmoc 보호기를 제거한 후(2 x 10 분), NMP에서 5 당량(equiv.)의 Fmoc-protected 아미노산, 10 당량의 DIEA 및 활성화제로 COMU(4.75 당량)를 사용하여 30분 동안 아미노산을 커플링(couling)하였다(4.75 당량). Fmoc-(S)-α-메틸과 α-펜틸글라이신의 커플링은 아미노산 (3 당량), COMU (2.85 당량), 및 DIEA (6 당량)을 사용하여 2시간 동안 수행되었다. 각각의 커플링 또는 탈보호(deprotecting) 반응 후, 수지를 디클로로메탄 (DCM) (1 x 2 min), NMP (1 x 2 min), DCM (1 x 2 min), 및 NMP (1 x 2 min)로 세척하였다.

3-2. 펩타이드 복분해반응 (Metathesis) 및 정제

곁사슬(side chain)이 보호된 펩타이드인, 수지가 결합된 N-Fmoc의 고리-닫힘형 복분해 반응(Ring-closing metathesis; RCM)을 상온에서 2시간 동안 탈가스된 DCE에서 20 mol%의 Grubbs 1세대 촉매를 사용하여 수행하였다. 반응 용액을 배수한 후, 가교 결합 반응이 완료되기 위해 신선한 Grubbs 1세대 촉매를 사용하여 RCM 반응을 반복하였다. 상기 반응은 수지 부분 표본 (aliquot)으로부터 수득한 펩타이드의 분해 후, 액체 크로마토그래피-질량분석기(liquid chromatography-mass spectrometry; LC/MS)를 사용하여 모니터링하였다. 반응 용액을 배수한 후, 수지를 DCE (dichloroethane) (3 x 2 분)를 이용하여 세척하고, DCM (3 x 2 분)으로 다시 세척하였다. 최종 Fmoc-탈보호 반응 후, N-말단의 아미노기를 45분 동안 NMP 내에서 30 당량의 아세트산 무수물 및 60 당량의 DIEA를 이용하여 처리하였다. 수지를 DCM (3 x 2 분) 및 DMF (3 x 2 분)를 이용하여 세척하였고 진공 상태에서 하룻밤 동안 건조시켰다. 펩타이드를 탈보호시켰고 TFA/TIS/물 (95/2.5/2.5)의 혼합물을 첨가함으로써 수지로부터 2시간 동안 분해하였고 1:1의 n-펜텐(pentane) 및 디에틸 에테르(diethyl ether) 혼합용매를 첨가함으로써 침전시켰다. 첨전물을 원심분리기로 수집하였고, 아세토나이트릴 및 물의 1:1 혼합물에 용해시키고, 필터링을 통해 수지를 제거하였다. 생성물을 Zorbax C18 칼럼(Agilent, 5㎛, 9.4 x 250 mm)을 이용한 역상 HPLC (high-performance liquid chromatography)에 의해 정제하였고(도 7 및 도 8 참조) 이후 LC/MS (Liquid chromatography/mass spectrometry)(Agilent, API4000)로 정제하였다. 펩타이드 농도는 280nm에서 트립토판 잔기의 흡광도를 모니터링 하면서 결정되었다.

Ac-UM-14W. C₇₂H₁₂₇N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 792.00, 측정값 792.20.

Ac-SS-14W. C₈₀H₁₃₅N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 860.06, 측정값 860.40.

Ac- DS -14W. C₈₈H₁₄₃N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 900.9, 측정값 900.50.

Ac- DS -12W. C₈₈H₁₄₃N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 900.9, 측정값 900.40.

Ac- DS -5W. C₈₈H₁₄₃N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 900.9, 측정값 900.45.

Ac- DS -3W. C₈₈H₁₄₃N₂₃O₁₇[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 900.9, 측정값 900.40.

Su - DS -5W. C₉₁H₁₄₅N₂₃O₁₈[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 928.62, 측정값 929.40.

H- DS -5W. C₈₇H₁₄₁N₂₃O₁₅[M+2H]^{2 +}/2에 대한 ESIMS m/z 계산값 879.09, 측정값 879.35.

실시예 4. 이중 스테이플 펩타이드의 구조 확인

상기 1-2에 기재된 방법을 통해 상기 실시예 2에 의해 디자인된 펩타이드들의 구조를 확인하였다.

먼저, 실시예 2-1에 의해 디자인된 본 발명에 따른 펩타이드(Ac-DS-14W)와 스테이플이 하나만 있는 유도체(Ac-SS-14W) 및 스테이플이 없는 유도체(Ac-UM-14W)의 구조를 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 스테이플화 펩타이드(Ac-DS-14W)는 매우 높은 helical content를 나타내어 상기 펩타이드들 중 나선형성이 가장 잘 이루어짐을 확인할 수 있었다. 208과 222 nm에서 CD 강도의 비율에 따라 doubly-stapled 펩타이드의 나선 형성이 가장 견고한 것으로 나타났다. 한편, 스테이플이 없는 유도체(Ac-UM-14W)의 경우는 라이신 잔기의 양이온 곁사슬 사이의 잠재적인 정전 반발 때문에 나선형 구조를 갖지 않고 거의 random coil 형태로 존재하는 반면, 스테이플이 하나만 있는 유도체(Ac-SS-14W)는 208과 222 nm 근처의 2개의 최소 스펙트럼 및 190nm 근처에서 최대 스펙트럼 형태의 전형적인 알파 나선의 CD 스펙트럼을 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 탄화수소 스테이플이 매우 효과적으로 나선을 안정화시킴을 알 수 있었다.

다음으로, 상기 Ac-DS-14W와 실시예 2-2에서 디자인된 본 발명에 따른 펩타이드 중 트립토판 위치를 달리하여 디자인한 Ac-DS-12W, Ac-DS-5W 및 Ac-DS-3W의 구조를 확인하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Ac-DS-12W는 Ac-DS-14W와 비교하여 감소된 나선 형성을 보인 반면, Ac-DS-5W의 경우 현저히 증가된 나선 형성을 보임을 확인할 수 있었다.

다음으로, 실시예 2-2에서 디자인된 본 발명에 따른 펩타이드 중 N 말단의 캡핑(capping)을 달리한 Ac-DS-5W, H-DS-5W 및 Su-DS-5W의 구조를 확인하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 펩타이드들은 Su-DS-5W가 조금 증가된 나선도를 보이고 H-DS-5W의 경우 나선도(helicity)가 약간 감소하였지만 전체적으로 Ac-DS-5W과 유사한 나선도를 보임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 이중 스테이플화된 펩타이드의 항균 활성 확인

상기 1-3에 기재된 방법을 통해 상기 실시예 2에 의해 디자인된 펩타이드들의 항균 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드들은 그람 양성균에 대해서 스테이플이 없는 유도체(Ac-UM-14W) 및 스테이플이 하나만 있는 유도체(Ac-SS-14W)에 비하여 현저히 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 한편, 그람음성균에 대해서는, Ac-SS-14W와 비교할 때, 다소 미약한 항균력을 나타내었지만, H-DS-5W의 경우에는 Ac-SS-14W보다도 우수한 항균활성을 나타내었다.

entry/code		Gram (+)			Gram (-)
		B.s.	S.a.	S.e.	E.c.	S.d.	S.t.	K.p.	P.a.
1	Ac-UM-14W	>200	>200	>200	>200	>200	>200	>200	>200
2	Ac-SS-14W	25	9.4	75	3.1	18.8	>200	18.8	100
3	Ac-DS-14W	1.6	4.8	3.1	25	25	100	200	100
4	Ac-DS-12W	1.6	3.1	4.8	50	50	200	100	100
5	Ac-DS-3W	3.1	4.8	4.8	25	50	100	100	200
6	Ac-DS-5W	1.6	1.6	1.6	18.8	25	37.5	37.5	25
7	Su-DS-5W	1.6	1.6	1.6	12.5	50	>200	25	50
8	H-DS-5W	1.6	1.6	1.6	3.1	12.5	6.3	12.5	6.3

실시예 6. 이중 스테이플화된 펩타이드의 적혈구 용혈 활성 확인

상기 1-4에 기재된 방법을 통해 상기 실시예 2에 의해 디자인된 펩타이드들의 용혈 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드 Ac-DS-14W, Ac-DS-12W, Ac-DS-5W 및 Ac-DS-3W의 경우에는 서로 유사한 수준으로 다소 높은 용혈활성을 보였으나, H-DS-5W의 경우 낮은 용혈활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

entry/code		Hemolysis, %
		25 μM	12.5 μM
1	Ac-UM-14W	<1	<1
2	Ac-SS-14W	<1	<1
3	Ac-DS-14W	38.8	22.1
4	Ac-DS-12W	42.5	25.3
5	Ac-DS-3W	42.5	28.9
6	Ac-DS-5W	38.5	22.0
7	Su-DS-5W	32.6	19.5
8	H-DS-5W	25.5	13.5

실시예 7. 이중 스테이플화된 펩타이드의 단백질 가수분해에 대한 안정성 확인

트립신(trypsin)은 라이신과 아르기닌처럼 양전하를 띠는 아미노산의 카복실기 쪽을 절단하는 단백질 분해효소인바, 상기 1-5에 기재된 방법을 통해 본 발명에 따른 펩타이드들의 단백질분해효소에 대한 안정성을 확인하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, Ac-UM-14W는 트립신에 의해 완전히 분해되었고, Ac-SS-14W의 경우에는 처리 후 10분 이내에 73% 정도가 가수분해 된 반면, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드(Ac-DS-14W)의 경우에는 트립신을 처리하고 60분 후 펩타이드의 85% 이상이 그대로 남아있어 트립신에 의한 가수분해에 매우 높은 안정성을 가짐을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 단백질분해효소에 대해 높은 안정성을 가질 뿐만 아니라, 양극성 나선구조를 형성함으로써 자연에 존재하는 많은 항균 펩타이드와 같이 세균의 세포막 파괴에 의한 항균작용을 나타낼 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 이중 스테이플화된 펩타이드는 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있고, 이외에 항암용 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (14)

15개의 아미노산 서열로 이루어지고, N 말단에서 2번째의 아미노산 위치와 6번째 아미노산 위치 및 9번째의 아미노산 위치와 13번째 아미노산 위치가 탄화수소로 스테이플화(stapling)된 이중 스테이플화된 펩타이드.

제1항에 있어서,

상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 N 말단에서 1번째, 4번째, 7번째, 8번째, 11번째, 12번째 및 15번째 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 양전하를 띠는 아미노산인 것을 특징으로 하는, 이중 스테이플화된 펩타이드.

제1항에 있어서,

상기 탄화수소는 옥트-4-에닐기인 것을 특징으로 하는, 이중 스테이플화된 펩타이드.

제1항에 있어서,

상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 N 말단 및/또는 C 말단에 링커에 의해 화합물이 연결되는 것을 특징으로 하는, 이중 스테이플화된 펩타이드.

제1항에 있어서,

상기 이중 스테이플화된 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 이중 스테이플화된 펩타이드.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물.

제6항에 있어서,

상기 조성물은 병원성 세균, 바이러스, 병원성 효모 또는 진균에 대해 항생효과를 나타내는 것을 특징으로 하는, 조성물.

제7항에 있어서,

상기 병원성 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제8항에 있어서,

상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) 인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제8항에 있어서,

상기 그람 음성균은 대장균 (Escherichia coli), 쉬겔라 디센타리에 (Sigella dysentariae), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae) 또는 녹농균(pseudomonas aeruginose)인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제7항에 있어서,

상기 병원성 효모 또는 진균은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스퍼질러스 휴미거투스 (Aspergillus humigatus), 사카로마이세스 세리비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중 스테이플화된 펩타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중 스테이플화된 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환 또는 암치료방법.

병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환 또는 암을 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중 스테이플화된 펩타이드의 사용.

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