JP2014515748A - ＢＣＬ９の安定化されたαへリックスを使用した、癌における調節解除されたＷｎｔシグナル伝達の標的化 - Google Patents

Abstract

本発明は、治療薬として使用するための、ＢＣＬ９ ＨＤ２へリックスの炭化水素ステープリングによって構造的に拘束されたペプチドを提供する。本発明はさらに、本発明の構造的に拘束されたペプチドの使用のための方法およびキットを提供する。本発明は、少なくとも一部には、炭化水素ステープルされたヘリックスペプチドが、タンパク質分解、酸および熱に対する優れた安定性を示し、ペプチドの天然へリックス構造を回復し、対応する非修飾ペプチドと比較して卓越した薬物動態特性を有し、ならびにインビトロ、インセルロおよびインビボでβ−カテニンに結合して、ＢＣＬ９／β−カテニン相互作用を阻害し、それにより調節解除されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を妨げ、ヒトの癌を含む様々なヒト疾患における治療効果のために極めて有効であることを明らかにする、本明細書で提供される結果に基づく。

Description

本願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／４７５，９３２号の優先権を主張する。

連邦により支援された研究開発の下でなされた発明の権利への宣言
本発明の一部分は、許諾番号１ Ｒ０１ ＣＡ１５１３９１−０１（Ｒ．Ｄ．Ｃ）の下に国立衛生研究所によって支援された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。

古典的Ｗｎｔ経路は、胚発生および成体組織のホメオスタシスの両方に必要とされる厳密に調節された受容体媒介性シグナル伝達ネットワークの鍵となる成分である、β−カテニンの構成的レベルおよび細胞内局在を調節する。刺激されていない正常細胞では、β−カテニンをリン酸化する分解複合体を形成してリン酸化β−カテニンをプロテオソーム分解の標的にする、大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子（ＡＰＣ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）およびアキシンに、β−カテニンが結合する。フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）受容体および低密度リポタンパク質受容体（ＬＲＰ５およびＬＲＰ６）へのＷｎｔリガンドの結合は、ＧＳＫ３β／ＡＰＣ／アキシン複合体の活性を阻害し、非リン酸化β−カテニンが核内移行を経てその転写作用を及ぼすことを可能にする。核内β−カテニンは、転写因子のリンパ系エンハンサー因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ファミリーと結合して、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤ１などの細胞増殖、移動および生存遺伝子の発現を誘導する。通常、この転写経路は、Ｗｎｔリガンドがそれらの受容体から離れたときに停止する。しかし、ＡＰＣおよびアキシンにおける様々な機能喪失突然変異ならびにβ−カテニン自体の活性化突然変異は、β−カテニンが分解複合体を免れ、核内で存続して、発癌性転写を駆動することを可能にする。

キイロショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）では、β−カテニンの転写活性はさらに２つの補因子、ＢＣＬ９およびピゴパスに依存する。ＴＣＦ、β−カテニン、ＢＣＬ９およびピゴパスからなる四成分複合体の形成は、β−カテニン依存性Ｗｎｔ転写活性を増強する。ヒトＢＣＬ９遺伝子は、前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者からｔ（１；１４）（ｑ２１；ｑ３２）転座をクローニングすることによって最初に同定された。ＢＣＬ９遺伝子が存在する染色体１ｑ２１遺伝子座の増幅は広範囲のヒト癌型において認められ、腫瘍の進行、生存率低下および臨床転帰不良に結び付いてきた。ごく最近、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンによる挿入突然変異誘発がＢＣＬ９においてヒットを同定した。結腸直腸癌（ＣＲＣ）では、ＡＰＣおよびβ−カテニンにおける確立された突然変異が癌表現型を促進するが、多発性骨髄腫（ＭＭ）においてはそのような突然変異は報告されておらず、Ｗｎｔ活性化はその代わりにＢＣＬ９によって駆動され、このβ−カテニン補因子を真正な癌遺伝子として示唆する。ＢＣＬ９の過剰発現は、それ以来、ヒト腫瘍の大きなサブグループにおいて同定されているが、腫瘍が由来する正常細胞対応物では発現されない。ＢＣＬ９が媒介するβ−カテニン転写活性の増強は、上皮表現型の喪失と間葉様機能の獲得を促進することにより、腫瘍細胞の細胞増殖、移動、浸潤および転移能を増大させる。インビボでｓｈＲＮＡが誘導するＢＣＬ９の下方調節は、Ｗｎｔ標的であるｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＣＤ４４およびＶＥＧＦの発現を抑制し、それに対応して腫瘍細胞量、転移および宿主の血管新生応答を低減することによりＣＲＣおよびＭＭを有する異種移植マウスの生存率を上昇させる。これらの癌の著しいＢＣＬ９依存性および上皮腫瘍の約３０％におけるＢＣＬ９の発現は、ＢＣＬ９／β−カテニンタンパク質の相互作用を標的とするための説得力のある論理的根拠を提供する。重要な点として、Ｂｃｌ９ヌルマウスは明らかな疾患表現型を有さず、ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の薬理学的遮断が比較的非毒性であり得ることを示唆する。

Ｗｎｔ経路は、脊椎動物および無脊椎動物における胚発生および成体組織のホメオスタシスの両方に必要とされる厳密に調節された受容体媒介性シグナル伝達系からなり、古典的および非古典的Ｗｎｔ経路を含む。古典的Ｗｎｔシグナル伝達カスケードのいくつかの成分は、結腸直腸癌、肝細胞癌、乳癌、子宮内膜癌およびＭＭを含む広範囲の一般的なヒト癌において腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）または癌遺伝子のいずれかとして機能することが示されている。さらに、古典的Ｗｎｔ経路は、病理過程（例えば糖尿病）だけでなく正常過程（例えば創傷治癒）の調節にも関係づけられてきた。これらの所見は、この経路の発癌との関連性ならびに癌治療、創傷治癒、血管新生および糖尿病のための潜在的標的としてのＷｎｔシグナル伝達成分のさらなる検討の必要性を強調する。

Ｗｎｔシグナル伝達をブロックするためにＢＣＬ９のＨＤ２ドメインの炭化水素ステープルペプチド（ＢＣＬ９のステープルされたαへリックスまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９）を設計し、作製することが本発明の１つの目的である。β−カテニンへの安定化されたαへリックスペプチドの直接結合がβ−カテニン／ＢＣＬ９相互作用、Ｗｎｔ転写活性および下流標的の発現を妨げることを明らかにすることも本発明の目的である。そのような機構は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９を用いた癌細胞の治療の方法をもたらし、Ｗｎｔ／β−カテニン駆動性癌における腫瘍細胞の増殖、移動、腫瘍誘導性血管新生、腫瘍細胞量、脱分化（上皮間葉転換［ＥＭＴ］）および転移の阻害を生じさせる。

本発明は、構造的に拘束された、プロテアーゼ抵抗性および細胞透過性ＢＣＬ９ αへリックスペプチド、ならびに治療薬および予防薬としてのこれらのペプチドの使用の方法を提供する。そのような構造的に拘束されたペプチドは、タンパク質分解、酸および熱に対する優れた安定性を示し、対応する非修飾ペプチドと比較して卓越した薬物動態特性を有する。本発明のペプチドは、少なくとも１つの炭化水素ステープルで安定化されるが、２、３またはそれ以上の炭化水素ステープルを含むことができる。複数の炭化水素ステープルを含むことは、２０またはそれ以上のアミノ酸長であるαへリックスペプチドに特に適する。炭化水素ステープルは、相互作用面上のアミノ酸残基がＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインのらせん構造の安定化により適切に方向づけられることを可能にする。

１つの態様では、本発明は、少なくとも１つの炭化水素ステープルまたはステッチを含む、ＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン（ＢＣＬ９−ＨＤ２）の構造的に拘束されたペプチドを提供する。

１つの実施形態では、該ペプチドは、β−カテニンと相互作用するアミノ酸からなる相互作用面を含む。

別の実施形態では、相互作用面は約３から約２０個のアミノ酸を含む。

ある実施形態では、相互作用面は４から１５個のアミノ酸を含む。

様々な実施形態では、相互作用面は、β−カテニンに結合するＢＣＬ９−ＨＤ２のへリックス面に４０％またはそれ以上の同一性を含み、ここで相互作用面は、ＢＣＬ９残基Ｇｌｎ−３５５、Ｈｉｓ−３５８、Ａｒｇ−３５９、Ｓｅｒ−３６２、Ｌｅｕ−３６３、Ｌｅｕ−３６６、Ｉｌｅ−３６９、Ｇｌｎ−３７０、Ｌｅｕ−３７３およびＰｈｅ−３７４、またはその保存的置換体を含む。

さらに他の実施形態では、相互作用面は、β−カテニンに結合するＢＣＬ９−ＨＤ２のへリックス面に５０％から９０％の同一性を含み、ここで相互作用面は、ＢＣＬ９残基Ｇｌｎ−３５５、Ｈｉｓ−３５８、Ａｒｇ−３５９、Ｓｅｒ−３６２、Ｌｅｕ−３６３、Ｌｅｕ−３６６、Ｉｌｅ−３６９、Ｇｌｎ−３７０、Ｌｅｕ−３７３およびＰｈｅ−３７４、またはその保存的置換体を含む。

別の実施形態では、相互作用面はαへリックスの１つの面である。

様々な実施形態では、へリックスの１つの面は、アミノ酸の１、２、３または４の隣接する積層柱を含み、ここでアミノ酸の積層柱は、１回転当たり３．６個のアミノ酸を有するαへリックスにおいて位置ａ、ｄおよびｇ；位置ｂおよびｅ；または位置ｃおよびｆによって規定され、ここでアミノ酸は、連続的および順次に位置ａ〜ｇが割り当てられ；並びに、１回転当たり３個のアミノ酸を有する３_１０へリックスにおいて位置ａおよびｄ；位置ｂおよびｅ；または位置ｃおよびｆによって規定され、ここでアミノ酸は、連続的および順次に位置ａ〜ｆが割り当てられ；またはそのホモログによって規定される。

他の実施形態では、本発明は、ＢＣＬ９−ＨＤ２のアミノ酸３５１から３７４、配列番号１
（ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＱＴＬＲＤＩＱＲＭＬＦ）
に約２０％から１００％の配列相同性を有する構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここでペプチドは、１から５の炭化水素ステープルを含む。

他の実施形態では、本発明は、ＢＣＬ９−ＨＤ２のアミノ酸３５１から３７４、配列番号１
（ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＱＴＬＲＤＩＱＲＭＬＦ）
に約５０％から１００％の配列相同性を有する構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここでペプチドは、１から５の炭化水素ステープルを含む。

様々な実施形態では、炭化水素ステープルまたはステッチは、１またはそれ以上の天然または非天然アミノ酸の間に位置する。

ある実施形態では、炭化水素ステープルまたはステッチはオレフィンメタセシス反応によって形成される。

別の実施形態では、非天然アミノ酸は、以下：

から選択される。

様々な実施形態では、構造的に拘束されたペプチドは、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内に１から５のステープルまたはステッチを含む。

他の実施形態では、１つのステープルまたはステッチは、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する。

ある実施形態では、別のステープルまたはステッチは、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する。

様々な実施形態では、任意の他のステープルまたはステッチは、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する。

別の実施形態では、本発明は構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここで１つの炭化水素ステープルは、ステープルスキャニングによりＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の例示的な位置に存在し、反復される：

ある実施形態では、本発明は構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここで２つの炭化水素ステープルは、ステープルスキャニングによりＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の例示的な位置に存在し、反復される：

別の実施形態では、本発明は構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここで１またはそれ以上の炭化水素ステープルまたはステッチは、ステープルスキャニングによりＢＣＬ９ ＨＤ９ドメイン内の以下の例示的な位置のいずれかに存在し、反復される：

様々な実施形態では、本発明は、１から４個の付加的な炭化水素ステープルをさらに含む、構造的に拘束されたペプチドを提供する。

他の実施形態では、本発明は構造的に拘束されたペプチドを提供し、ここで付加的な炭化水素ステープルは、ステープルスキャニングによりＢＣＬ９ ＨＤ２ドメイン内の以下の例示的な位置のいずれかに存在し、反復される：

請求項２の一部において、位置３５１から３７４のアミノ酸配列は以下から選択される：

別の態様では、本発明は、上述したペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明はさらに、単位剤形としての医薬担体中の本発明のペプチドを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを投与することを含む、被験者において古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを投与することを含む、被験者においてＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合を阻害する方法を提供する。

１つの実施形態では、ＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合の阻害は、本発明の構造的に拘束されたペプチドによってもたらされる。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを被験者に投与することを含む、被験者においてＢＣＬ９／β−カテニン結合によって媒介される疾患または障害を治療する方法を提供する。

１つの実施形態では、被験者は、ＢＣＬ９／β−カテニン相互作用またはＷｎｔシグナル伝達の阻害剤を必要とすると同定された。

別の実施形態では、疾患は、癌、腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞の脱分化および転移、腫瘍の移動、腫瘍誘導性血管新生、癌幹細胞の化学療法抵抗性ならびに増殖性疾患であるか、または創傷治癒、血管新生もしくは糖尿病に関係する。

本発明は、例えば被験者において、本発明の構造的に拘束されたペプチドを治療有効量で被験者に投与することによる、癌の改善または治療のための方法を提供する。該方法は、被験者を、癌の改善もしくは治療を必要とすると同定すること、または癌の予防、改善もしくは治療のために被験者を観測することの１またはそれ以上をさらに含み得る。ある実施形態では、本発明は癌の改善または治療の方法を提供し、ここで、被験者はＢＣＬ９／β−カテニンの調節を必要とすると同定される。

さらなる実施形態では、疾患は、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、脳の癌、腎癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、骨の癌、胃癌、乳癌、膵癌、神経膠腫、膠芽腫、肝細胞癌、乳頭状腎癌、頭頸部扁平上皮癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫および固形腫瘍である。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを被験者に投与することを含む、被験者において癌を治療する方法を提供する。

１つの実施形態では、被験者は、癌を治療するために古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害剤を必要とすると以前に同定されたことがある。

別の実施形態では、疾患は、創傷治癒、血管新生または糖尿病に関係する。

他の実施形態では、被験者は、付加的な治療薬、放射線または化学療法を投与される。

さらなる実施形態では、付加的な治療化合物は抗癌化合物である。

別のさらなる実施形態では、本発明の化合物と付加的な治療薬を同時にまたは連続的に投与する。

他の実施形態では、本発明の化合物と付加的な治療薬を結合する（すなわち二官能性化合物）。

ある実施形態では、被験者はヒトである。

別の態様では、本発明は、本発明の構造的に拘束されたペプチドおよび癌を治療するのに使用するための指示書を含むキットを提供する。

別の態様では、本発明は、ＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合を阻害する化合物を同定する方法であって、本発明のペプチドをβ−カテニンと接触させる段階および次に本発明のペプチドとβ−カテニンとの間の相互作用を分断する低分子または化合物をスクリーニングする段階を含む方法を提供する。

本発明の他の実施形態は、以下で提供される開示に基づいて理解される。

ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの設計、合成および特性付け。ａ．β−カテニンの表面溝に直接係合する、ＢＣＬ９のαへリックスＨＤ２ドメインは、炭化水素ステープリングによって鋳型に構造的安定化をもたらした。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９ Ａ〜Ｃを、ＨＤ２ドメインの非相互作用表面上の天然残基を、オレフィンメタセシス反応に供された場合対応するステープルペプチドを生じる、オレフィン非天然アミノ酸で置換することによって作製した。修飾されていない鋳型ペプチド（ＢＣＬ９ ＨＤ２）も作製した。ｃ．ＣＤ分析は、非修飾鋳型ペプチドと比較してＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの著明なαへリックス安定化を明らかにした。ｄ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびβ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）は、抗ＦＩＴＣおよび抗β−カテニンプルダウンアッセイの両方により、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９処理したＣｏｌｏ３２０細胞の溶解物から共沈した。ＴＣＬ、全細胞溶解物。ｅ〜ｆ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびβ−カテニンのどちらも、共焦点顕微鏡検査および細胞分画分析によって観測されたようにＣｏｌｏ３２０細胞の核に選択的に局在する。ｇ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢのＨ３５８ＤおよびＲ３５９Ｅ逆極性突然変異体は、ＣＤ分析により、野生型ＳＡＨと比較して同様の高いパーセントのαへリックス性を示した。ｈ．点突然変異誘発はＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９／β−カテニンの共免疫沈降を低減させ、Ｒ３５９Ｅ誘導体は最も有効な陰性対照として働いた。ｉ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびそのＲ３５９Ｅ対照は、Ｃｏｌｏ３２０による用量当量の細胞取込みを示す。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは天然のβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体を破壊し、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写を抑制する。ａ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＢＣＬ９およびＢ９Ｌとβ−カテニンの結合を用量応答的に阻止したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）による細胞処理は影響を及ぼさなかった。ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌからのβ−カテニンの解離は、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂとβ−カテニンの共免疫沈降と相関した。ｂ．Ｃｏｌｏ３２０細胞にＴＯＰ−ＦＬＡＳＨをトランスフェクトし、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドと共にインキュベートして、ルシフェラーゼ活性に関して検定し、それをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照に基準化した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＷｎｔ依存性レポーター活性を阻害したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は阻害しなかった。誤差バーは、三重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。ｃ．ｑＰＣＲ分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃおよびアキシン２の抑制を明らかにしたが、ＧＡＰＤＨの抑制は示さなかった。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は影響を及ぼさなかった。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは細胞の増殖、血管新生および移動をブロックする。ａ〜ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理は、２４時間目に［^３Ｈ］チミジン取込みによって観測されたように、Ｃｏｌｏ３２０および結腸直腸原発腫瘍（ＣＣＰＴ）の増殖を低減した。^＊、Ｐ＜０．０１。ｃ〜ｄ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、Ｗｎｔ３Ａ順化培地（Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ）および多発性骨髄腫原発腫瘍（ＭＭＰＴ）の存在下または不在下でＭＭ１Ｓ細胞の増殖を同様に低下させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は低下させなかった。^＊、Ｐ＜０．０１。ｅ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、７２時間目にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって評価したときＣｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞の生存能に影響を及ぼさなかった。ｆ．それに対応して、ウェスタン分析によって観測されたように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはカスパーゼ３またはＰＡＲＰを活性化しなかった。ｇ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理は、ＥＬＩＳＡによって測定されたようにＣｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞によるＶＥＧＦ分泌を低下させた。^＊、Ｐ＜０．００１。ｈ．ＨＵＶＥＣを、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドと共にインキュベートしたＣｏｌｏ３２０またはＭＭ１Ｓ細胞から収集した上清で培養し、５時間目に高倍率視野当たりに形成された管（黒色の矢印）の数を顕微鏡検査によって分析した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはインビトロで毛細管様の管形成をブロックした。^＊、Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）。ｉ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、マトリゲルボイデンチャンバーを使用して観測されたようにＣｏｌｏ３２０細胞の移動をブロックした。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は影響を及ぼさなかった。^＊、Ｐ＜０．０１。ビヒクル、０．５％ＤＭＳＯ；ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド、５μΜ。誤差バーは、三重に実施した実験についての平均±標準偏差である。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはインビボで腫瘍の増殖、血管新生および転移を阻害する。ａ．腹腔内ＧＦＰ陽性Ｃｏｌｏ３２０細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのコホート（ｎ＝６）を、ビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに合計６回にわたって腹腔内投与して処置した。全身イメージングおよび剖検は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処置したマウスにおける腫瘍量および肝転移の減少を明らかにしたが、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置動物では減少を示さなかった。ｂ．肝臓の組織学的分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスにおける腫瘍浸潤およびＣＤ４４陽性率の低下を明らかにした。ｃ．各実験群（ｎ＝６）についての実質内結節の総数は、５ｍｍ間隔で肝切片を検査することによって定量化した場合、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスにおいて著明に減少した。誤差バーは平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。ｄ〜ｅ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置は、腫瘍血管定量および抗ＣＤ３４免疫染色によって評価した場合、同様に血管新生を阻害した。誤差バーは平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０００１（ｎ＝６）。ｆ〜ｇ．ＧＦＰ陽性ＩＮＡ−６細胞が存在するヒト骨片を担持するＳＣＩＤ−ｈｕマウスのコホート（ｎ＝５）に、一日おきに合計１０分回用量にわたってビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を局所的に注入した。腫瘍量を、腫瘍細胞の注入後の指示されている日にｓｈｕＩＬ−６Ｒ血清レベルによって（ｆ）、および３３日目に犠死させた後に蛍光全身イメージングによって（ｇ）評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置は、骨片蛍光の低下に反映されたように、ｓｈｕＩＬ−６Ｒ産生および腫瘍量を有意に抑制した。ｈ．組織学的分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの骨片中のＩＮＡ−６細胞の実質的な低減を明らかにし、腫瘍細胞は骨に限局された。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置マウスでは、腫瘍細胞は骨片の外側に移動し、隣接する軟組織（黒色の矢印）を浸潤した。ｉ．血管定量および抗ＣＤ３４免疫染色によって観測されたように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスでは腫瘍内血管新生が抑制された。 ＢＣＬ９の安定化されたαへリックスを使用した、癌におけるＷｎｔ転写活性の標的化。調節解除されたＷｎｔシグナル伝達は広範囲のヒト癌の病因の基礎となるが、経路を破壊する標的化療法の開発はいまだ課題のままである。β−カテニンは古典的Ｗｎｔ経路の中心的エフェクターであり、細胞の増殖、移動および血管新生に関与するｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＶＥＧＦおよびＣＤ４４などの遺伝子の発現を活性化する。ＢＣＬ９はβ−カテニン媒介性転写のための重要なコアクチベータであり、腫瘍において高発現されるが起源細胞では高発現されず、病的β−カテニン活性を選択的に阻害する可能性を提示する。ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の構造を手引きとして、ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の標的化破壊を通して癌におけるＷｎｔシグナル伝達をブロックするためにＢＣＬ９の安定化されたαへリックス（ＳＡＨ−ＢＣＬ９）を作製した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９はＷｎｔ転写活性およびＷｎｔ／β−カテニン転写標的の発現を低下させ、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞の増殖、移動、浸潤および血管新生を妨げた。 ＢＣＬ９は広範囲の腫瘍において過剰発現される。ａ．結腸癌（ｎ＝２３）、乳癌（ｎ＝２２）、肺癌（ｎ＝３２）、肝癌（ｎ＝２９）および卵巣癌（ｎ＝３２）からの組織マイクロアレイに関して実施した免疫組織化学試験は、多種多様な腫瘍における高レベルのＢＣＬ９発現を明らかにした。高レベルまたは低レベルのＢＣＬ９免疫染色を有する腫瘍の代表的な例を示す。ｂ．免疫化ＢＣＬ９ペプチド（Ａｂｃａｍ）を使用したブロッキング実験を製造者のプロトコールに従ってヒト結腸直腸癌標本に関して実施し、ＢＣＬ９抗体の特異性を明らかにした。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの同等の細胞取込み。ａ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチドは、ステープルペプチドに関して以前に実証されたエネルギー依存性エンドサイトーシス取込み機構と一致して（Ｂｅｒｎａｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２９，２４５６−７（２００７）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））、Ｃｏｌｏ３２０細胞において同等の温度依存性取込みを示す。ｂ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチドは、Ｃｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞による同等の細胞取込みを示す。 ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニンに選択的に係合し、非ＢＣＬ９結合パートナーとのその相互作用を妨げない。ａ．重要な点として、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン標的化はＢＣＬ９／β−カテニン複合体の破壊に選択的であり、ＭＣＦ７細胞溶解物からのＥ−カドヘリンの抗β−カテニン共免疫沈降には影響を及ぼさない。ｂ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢでのＭＣＦ７細胞の処理、次いで細胞溶解物に関して実施した抗ＦＩＴＣプルダウンは、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂとβ−カテニンとの間の選択的相互作用を明らかし、ＩκＢαおよびアクチンなどの無関係なタンパク質の共免疫沈降を示さなかった。ＳＡＨ−ＢＣＬ９結合界面の単一Ｒ３５９Ｅ点突然変異誘発はβ−カテニンの共免疫沈降を排除し、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドの特異性をさらに確認した。ＭＣＦ７細胞は容易に検出可能なレベルのＥ−カドヘリンタンパク質を含むので、β−カテニン／Ｅ−カドヘリン相互作用を観測するためにＭＣＦ７細胞をこのアッセイで使用した。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写の抑制はＢＣＬ９の発現上昇によって用量応答的に逆転される。ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨおよびｐｃＤＮＡ−ＢＣＬ９をトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞をビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド（５μΜ）で処理し、２４時間目にデュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるレポーター活性の抑制は、ＢＣＬ９タンパク質発現を上昇させることにより用量応答的に逆転され、β−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂに基づく阻害の的確な特異性を強調した。^＊Ｐ＜０．０１。ＨＣＴ１１６細胞を、その比較的低いレベルの内因性ＢＣＬ９発現のゆえにこのアッセイで使用した。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢによるＷｎｔ特異的転写レポーター活性の阻害。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、Ｃｏｌｏ３２０細胞においてＴＣＦ調節配列（７ｘＴｄＧ）の転写制御下でｄＧＦＰ発現を用量応答的にブロックした。これに対し、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）での処理は皆無かそれに近い影響しか及ぼさなかった。 ＶＥＧＦはＢＣＬ９の直接の転写標的である。ａ．抗ＴＣＦ−４、β−カテニンおよびＢＣＬ９抗体を使用したＣｏｌｏ３２０細胞のクロマチン免疫沈降分析（ＣｈＩＰ）は、ｃ−Ｍｙｃと同様に、ＶＥＧＦプロモーターがＷｎｔ／β−カテニン／ＢＣＬ９転写複合体の標的であることを明らかにした。陰性対照には、ＩｇＧを用いたＣｈＩＰおよびＶＥＧＦプロモーターの非特異的な上流領域に対するプライマーの使用が含まれた。ｂ．対照ｓｈＲＮＡまたはＢＣＬ９ ｓｈＲＮＡベクターをレンチウイルスで形質導入したＣｏｌｏ３２０細胞に、ＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトした。デュアルルシフェラーゼアッセイ系を用いてレポーター活性を検定し、結果を各々の試料についてウミシイタケの値に基準化した。ＢＣＬ９ノックダウンはＶＥＧＦプロモーターにおける転写活性を有効に低下させた。^＊、Ｐ＜０．００１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９処置マウスにおける結腸粘膜および骨髄の正常な外観。ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドで処置した実験マウスから単離した結腸粘膜および骨髄組織のＨ＆Ｅ染色は、すべての組織標本にわたって毒性の証拠を示さなかった。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＩＮＡ−６多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する。ａ．ウェスタン分析によって検出した、ＭＭ１ＳおよびＩＮＡ−６細胞におけるＢＣＬ９およびβ−カテニンタンパク質の発現。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（５μＭ）に２４時間曝露したＩＮＡ−６細胞は、チミジン取込みによって測定した場合、ビヒクル処理細胞およびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処理細胞と比較して有意に低い増殖を示した。^＊、Ｐ＜０．００１。誤差バーは、三重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。 オレフィンメタセシスによって炭化水素ステープルペプチドを作製するためにペプチド鋳型に挿入された非天然オレフィンアミノ酸の例。 １箇所で、２箇所で、および連続的にステープルされたＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチドの例。Ｘ、ステープリングアミノ酸；Ｂ、ノルロイシン。ステープルスキャンは、ＢＣＬ９ ＨＤ２構築物の最適に安定化されたαへリックスを同定するためのペプチド配列に沿った異なるステープル組成物およびそれらの異なる位置の反復生成および試験を容易に可能にする。 ＢＣＬ９のαへリックスＨＤ２ドメインの残基３５１から３７４の三次元構造。β−カテニンと接触するＢＣＬ９ ＨＤ２相互作用面のこれらのアミノ酸残基を強調表示する。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体を破壊する。ａ．組換えβ−カテニンに対するＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢとＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）の異なる結合親和性。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、ＧＳＴプルダウンアッセイによって実証されたように組換えβ−カテニン／ＢＣＬ９複合体を用量応答的に解離させた。Ｒ３５９Ｅ点突然変異誘発はＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ活性を６倍低下させた。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＷｎｔ転写を選択的にブロックする。ａ．ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｃｏｌｏ３２０細胞のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子の用量依存的抑制を明らかにした。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊ｐ＜０．０１。腺腫（ｂ）および癌腫（ｃ）シグネチャーにわたるＤＬＤ１細胞でのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによって下方調節された遺伝子およびドミナントネガティブＴＣＦ１／ＴＣＦ４発現の定量的比較。腺腫（ｄ）および癌腫（ｅ）シグネチャーに関する、リーディングエッジの５０の最も下方調節された遺伝子（ｐ＜０．００１）、すなわちＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢとドミナントネガティブＴＣＦ１／ＴＣＦ４発現との間の相関に最も寄与する遺伝子のヒートマップ表示。ｆ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処理したＤＬＤ１細胞での鍵となるＷｎｔ標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ検証。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢによるＷｎｔ標的遺伝子発現の抑制。ａ．ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、１０μΜのＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢでのＭＭ１Ｓ細胞の処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子の抑制を明らかにした。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊ｐ＜０．０１。ｂ．ＤＬＤ１細胞におけるＶＥＧＦ−ＡのＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現プロファイリング分析。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、病的Ｗｎｔシグナル伝達によって駆動され、ＢＣＬ９を発現する培養した結腸癌細胞の増殖を選択的に阻害する。ａ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＣＲＣ細胞株の増殖を有意に低減させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは有意に低減させなかった。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ感受性癌細胞はＢＣＬ９を発現するが、ＢＣＬ９を発現しないＬＳ１７４Ｔ細胞株は応答を示さず、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの阻害作用をＢＣＬ９発現と関連付けた。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの作用特異性についてのさらなる細胞対照として、増殖能力がＷｎｔ／β−カテニン活性に依存しない、ＨＣＴ１１６細胞ならびにその２つの派生細胞株、ＨＣＴ１１６ＤＯ２０およびＨＣＴ１１６ＫＯ５８（Ｔ．Ａ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，８２６５（２００２））は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂに対して感受性を示さなかった。ｂ．ウェスタンブロットによって評価した、ＣＲＣ細胞株におけるＢＣＬ９、Ｂ９Ｌおよびβ−カテニンの発現。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは従来の化学療法剤の細胞傷害作用を増強する。ａ．Ｃｏｌｏ３２０細胞をビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴおよび漸増濃度の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と共培養し、^３Ｈ−チミジン取込みを用いて細胞増殖に関して評価した。ｂ．ＭＭ１Ｓ細胞をビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴおよび漸増濃度のドキソルビシン（Ｄｏｘ）と共培養し、^３Ｈ−チミジン取込みを用いて細胞増殖に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは従来の薬剤の抗腫瘍活性を有意に増強したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴまたはビヒクルは増強しなかった。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの結腸腫瘍組織におけるアポトーシスの増大。腹腔内Ｃｏｌｏ３２０細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腫瘍組織を、ＴＵＮＥＬアッセイ（褐色）を用いてアポトーシス誘導に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＴＵＮＥＬ陽性率を著明に上昇させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは上昇させなかった。６つの高倍率視野におけるＴＵＮＥＬ陽性率の定量化を含む、３つの代表的な４０倍率視野を示す。^＊ｐ＜０．００１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの骨髄腫組織においてＩＮＡ−６細胞の増殖はＷｎｔ転写活性およびアポトーシスの増大に依存する。ａ．ＩＮＡ−６細胞に空ベクター（モック）またはドミナントネガティブ型のＴＣＦ４を発現するベクター（ＥｄＴＰ）をレンチウイルスで形質導入し、増殖を^３Ｈ−チミジン取込みによって測定した。ｂ．ＩＮＡ−６細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス骨片からの腫瘍組織切片を、ＴＵＮＥＬアッセイ（褐色）を用いてアポトーシス誘導に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＴＵＮＥＬ陽性率を著明に上昇させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは上昇させなかった。６つの高倍率視野におけるＴＵＮＥＬ陽性率の定量化を含む、３つの代表的な４０Ｘ倍率視野を示す。^＊ｐ＜０．００１。

最近の試験は、高いＷｎｔシグナル伝達活性が、従来の化学療法に抵抗性であり、腫瘍再発の原因であると考えられている、結腸癌幹細胞（ＣＲＣ）集団に機能的に帰せられることを明らかにした（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４６８，２０１０）。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達経路をブロックすることはこれらの細胞に対して最も効果的であり得る。さらに古典的Ｗｎｔ経路は生理的および病的血管新生に関与しており（Ｄｅｊａｎａ Ｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０７：９４３ ２０１０）、標的薬剤発見および治療開発のためのこの経路の重要性を強調する（Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．，＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ５：９９７，２００６）。

β−カテニン／ＢＣＬ９／ＴＣＦ−４複合体の結晶構造は、β−カテニン上のＢＣＬ９結合部位が、ＢＣＬ９のαへリックスＨＤ２ドメイン（残基３５２から３７４）がβ−カテニンのアルマジロリピート１のαへリックス２および３によって形成される表面溝に結合する（図１ａ）という点で他の結合パートナーとは異なることを明らかにした（Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３−３００（２００６））。重要な点として、Ｈ３５８ＡまたはＲ３５９ＡなどのＢＣＬ９結合界面における鍵となる残基のアラニン突然変異誘発は、β−カテニンに結合するＢＣＬ９の能力をブロックし、トランス活性化を排除した。β−カテニンを標的とするのにこの天然結合モチーフを利用するため、炭化水素ステープリングを適用して（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ，Ｐｏ，Ｊ．＆ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２２，５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））、ＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインに基づく構造的に強化されたαへリックスペプチドを作製した。オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸を（ｉ，ｉ＋４）位置で置換し、次いでルテニウム触媒オレフィンメタセシスに供して、ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドＡ〜Ｃを生成した（図１ｂ）。円二色性（ＣＤ）分析は、炭化水素ステープリングが、対応する非修飾ペプチド（ＢＣＬ９ ＨＤ２）と比較してペプチドのαへリックス性を一貫して増強することを確認した（図１ｃ）。ペプチドの蛍光誘導体で処理し、次いで洗浄して、トリプシン処理し、抽出した細胞は、溶解物中にＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９ Ａ〜Ｃを含んだが、対応する非修飾ＦＩＴＣ−ペプチドは含まず、ＳＡＨペプチドの細胞取込みを明らかにした（図１ｄ）。ＦＩＴＣおよびβ−カテニンの免疫沈降はいずれも、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂをインサイチュで最も有効なβ−カテニン相互作用物質と同定した（図１ｄ）。免疫蛍光共焦点顕微鏡検査は、β−カテニンの顕著な核局在および核内のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂを明らかにし（図１ｅ）、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの核内濃縮が細胞分画法によって確認された（図１ｆ）。生物学的試験用の陰性対照ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドを開発するため、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｈ３５８Ｄ）およびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）を作製し、これらは鍵となる結合界面残基の単一逆極性点突然変異体を含む（図１ａ）。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂと比較して、両変異体は類似のαへリックス増強（図１ｇ）および細胞取込み（図１ｈ）を示したが、共免疫沈降分析によりβ−カテニン相互作用の低下（図１ｈ）、およびＲ３５９Ｅ突然変異誘発が最も有害な作用を生じさせることを明らかにした。そこで、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびその対応するＲ３５９Ｅ突然変異体を、これら２つのペプチドの用量当量取込みを示す、β−カテニン／ＢＣＬ９依存性細胞株Ｃｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓにおける機能試験のために選択した（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９）；Ｉｌｙａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４，１０３３０−４（１９９７））（図１ｉ）。

ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン標的化が、β−カテニンと、ＢＣＬ９および同じＨＤ２ドメインを含む（Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３−３００（２００６））その近縁ホモログＢ９Ｌ（Ｂｒｅｍｂｅｃｋ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，２２２５−３０（２００４））との内因性相互作用を分断するかどうかを判定するために、一連の共免疫沈降分析を実施した。顕著に、抗ＢＣＬ９およびＢ９Ｌ共免疫沈降試験においてＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体の用量応答性破壊を生じさせたが、そのＲ３５９Ｅ誘導体は破壊を生じさせなかった（図２ａ）。それに対応して、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニンと用量応答的に共免疫沈降したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は共免疫沈降せず（図２ａ）、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン標的化をβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体の離脱と関連付けた。β−カテニンを標的とし、広くそのタンパク質相互作用を分断する薬剤に関連する実証された毒性を考慮して、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、ＢＣＬ９／β−カテニン結合部位の異なる、重複しない位置と一致して、β−カテニンのＥ−カドヘリンとの恒常的相互作用に影響を及ぼさないことが確認された。ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの標的ベースの選択性は、抗ＦＩＴＣプルダウンによってさらに実証され、抗ＦＩＴＣプルダウンはβ−カテニンを共沈させるが、ＩκＢαおよびアクチンなどの他の無関係な細胞タンパク質は共沈させない。

ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ媒介性複合体破壊の機能的影響を調べるため、Ｗｎｔ特異的ＴＣＦレポーター遺伝子転写アッセイにおけるＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）の作用を評価した（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９）；Ｓｕｓｔｍａｎｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２８，３５２６−３７（２００８））。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処理はレポーター活性を５０％近く低下させたが、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は影響を及ぼさなかった（図２ｂ）。重要な点として、ＳＡＨ−ＢＣＬ９の作用の特異性は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９の阻害作用が漸増量のｐｃＤＮＡ−ＢＣＬ９でのトランスフェクションによって選択的に排除されること、およびＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢがＮＦκＢレポーター遺伝子転写アッセイに影響を及ぼさないことを示すことにより実証された（図２ｂ）。ＴＣＦ調節配列の転写制御下にあるｄＧＦＰを観測する２番目のＷｎｔ特異的レポーターアッセイにおいて、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはｄＧＦＰ発現を用量応答的にブロックしたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）はブロックしなかった。ＶＥＧＦを含む、β−カテニン／ＢＣＬ９標的遺伝子の発現へのビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）の作用を測定するために定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を使用した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃおよびアキシン２のｍＲＮＡレベルを有意に低下させたが、非Ｗｎｔ経路標的遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは低下させず、一方ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）はＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃおよびアキシン２のｍＲＮＡレベルを有意に低下させなかった（図２ｃ）。

β−カテニン／ＢＣＬ９複合体の薬理学的破壊の表現型への影響を調べるため、細胞増殖、血管新生および移動アッセイを実施した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＣｏｌｏ３２０、ＭＭ１Ｓならびに一次ＣＲＣおよびＭＭ細胞の増殖を低下させるが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は低下させないという一貫したパターンが現れた（図３ａ〜ｄ）。言うまでもなく、生存能アッセイならびにカスパーゼ３およびＰＡＲＰ活性化についてのウェスタン分析によって評価したように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理は細胞死を誘導しなかった（図３ｅ〜ｆ）。腫瘍細胞誘導性血管新生へのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの作用を測定するため、Ｃｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞をビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドで処理し、その後ＶＥＧＦレベルを培地中で定量した。ｑＰＣＲ分析と一致して、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂだけが分泌ＶＥＧＦのレベルを低下させた（図３ｇ）。インビトロ血管新生アッセイにおいて、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、処理したＣｏｌｏ３２０またはＭＭ１Ｓ細胞からの上清で培養し、次に顕微鏡検査によって毛細管様形成物の形成に関して採点した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理細胞からの上清に曝露したＨＵＶＥＣ細胞は、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処理対照と比較して低い毛細管形成を示した（図３ｈ）。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはまた、マトリゲル被覆浸潤チャンバーを用いて評価した場合、細胞外マトリックスを通過するＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理細胞の能力の有意の低下に反映されたように、Ｃｏｌｏ３２０細胞の接着および浸潤能も低下させた（図３ｉ）。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢがＢＣＬ９／β−カテニン転写複合体によって調節される一連の生理的過程を特異的に分断することを明らかにする。

ＢＣＬ９／β−カテニン相互作用を標的化することの治療可能性を調べるため、腫瘍増殖を抑制するＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの能力をインビボで検討した。ＧＦＰを発現するＣｏｌｏ３２０細胞（１×１０^６）を、致死量以下で照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹腔内に注入した。細胞注入の２日後、マウスコホート（ｎ＝６）を、ビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）で、１日おきに腹腔内投与した合計６回にわたって処置した。実験の４０日目に、マウスを犠死させ、全身イメージングおよび採取したＧＦＰ陽性組織の組織学的検査によって腫瘍量および転移に関して評価した。全体的な組織蛍光は、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置動物と比較してＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処置したマウスでは著明に減少した（図４ａ）。これらのデータは、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの肝臓で認められた転移性腫瘍結節の全体的な減少と一致した（図４ｂ〜ｃ）。興味深いことに、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスからの腫瘍組織はまた、腫瘍細胞ＣＤ４４の免疫反応性の低下（図４ｂ）、腫瘍内血管数の減少（図４ｄ）、およびより低い強度の毛細管ＣＤ３４免疫反応性（図４ｅ）を示し、腫瘍増殖および転移のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ媒介性抑制が、少なくとも一部には細胞移動および血管新生の低減に由来し得ることを示唆した。重要な点として、剖検後の処置群全体にわたって正常マウス組織の組織学的変化は認められなかった。

２番目のインビボモデルでは、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスの側腹部に移植したヒト骨移植片内のＩＮＡ−６ ＭＭ細胞の増殖へのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置の影響を検討した（Ｔａｓｓｏｎｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０６，７１３−６（２００５））。ＢＣＬ９およびβ−カテニンの両方を発現し、インビトロでＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによって抑制される、ＧＦＰ標識ＩＮＡ−６細胞（５×１０^６）を、移植の４週間後に骨移植片に注入した。２日後、マウスのコホート（ｎ＝５）を、局所注射によりビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）で、１日おきに投与して合計１０回にわたって処置した。腫瘍量を観測するため、ＩＮＡ−６腫瘍移植の３〜４週間後に最初に検出可能となる、可溶性ヒトインターロイキン６受容体（ｓｈｕＩＬ−６Ｒ）の血清レベルを測定した。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）で処置したマウスは、腫瘍増殖を反映するｓｈｕＩＬ−６Ｒレベルの漸進的上昇を示したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスは評価期間全体を通じて低レベルから検出不能レベルを維持した（図４ｆ）。ＩＮＡ−６細胞注入の３３日後にマウスを犠死させ、蛍光イメージング、組織学的分析および抗ＣＤ３４染色によってＭＭ腫瘍量を評価した。測定されたｓｈｕＩＬ−６Ｒのレベルと一致して、骨片内の腫瘍量はＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスにおいて有意に低減した（図４ｇ〜ｈ）。興味深いことに、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウス中に存在する腫瘍細胞は骨片の境界内に位置したが、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置マウスは周囲の軟組織への浸潤を示した（図４ｈ、黒色の矢印）。ＣＲＣモデルと同様に、抗ＣＤ３４染色および血管定量によって観測されたように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処置したＳＣＩＤ−ｈｕマウスでは局所血管新生が抑制された（図４ｉ）。したがって、Ｗｎｔ駆動性癌の２つの異なるマウスモデルにおいて、ＳＡＨ−ＢＣＬ９は配列特異的に腫瘍の増殖、浸潤および血管新生を有効に抑制した。

β−カテニン転写複合体は、広範囲の癌におけるその病理学的役割のゆえに最優先の薬理学的標的である。β−カテニンは様々な恒常性機能に関与し、同じ結合表面を使用してその相互作用パートナーの大部分と係合するので（Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ５，９９７−１０１４（２００６））、抗癌活性および選択性を達成することは依然として緊急の課題である。例えば、β−カテニン／ＴＣＦ相互作用の阻害剤に関するハイスループットスクリーニングによって同定された低分子、ＰＫＦ１１５−５８４は、Ｗｎｔ特異的転写活性をブロックし、結腸癌細胞の増殖を低減したが（Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５，９１−１０２（２００４））、処置マウスの重篤な骨髄低形成、貧血および全身性消耗を誘導した（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））。ＢＣＬ９は、（１）病的β−カテニン転写活性を促進し、（２）独自の結合部位でβ−カテニンに係合し（Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３−３００（２００６））、および（３）起源細胞ではなく主として腫瘍組織において認められる（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））ので、選択的な方法としてβ−カテニン−ＢＣＬ９界面の標的化は魅力的である。重要な点として、マウスモデルにおけるＢｃｌ９の遺伝子欠失を介したＢＣＬ９／β−カテニン相互作用の排除は、明らかな表現型への影響を及ぼさなかった（Ｄｅｋａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０，６６１９−２８）。そこで、炭化水素ステープリングを適用して、β−カテニンと直接係合するＢＣＬ９のαへリックスＨＤ２ドメインを構造的に安定化した。これを行う際に、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂがインサイチュでβ−カテニンを標的とし、β−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体を選択的に破壊することが測定された。これらの相互作用の薬理学的遮断は、β−カテニン依存性転写活性および標的遺伝子発現の阻害、ならびに正常組織への明らかな損傷を伴わない、腫瘍細胞の増殖、血管新生および転移の抑制と一致した。したがって、これらの原理証明実験は、癌におけるβ−カテニン−ＢＣＬ９界面の選択的標的化が発癌性Ｗｎｔシグナル伝達を探索し、それに対抗するための有望な方策であることを明らかにする。

本発明は、少なくとも一部には、本明細書で提供する結果、ならびに安定化されたαへリックスペプチドが優れた構造安定性、タンパク質分解、酸および熱に対する安定性を有することを明らかにする国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００４３８号（国際公開第２００９／１０８２６１号；２００９年１月２３日出願）に基づく。安定化されたαへリックスペプチドはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を妨げるうえで極めて有効であることも解明され、このペプチドが癌の治療のために使用できることを指示した。さらに、安定化されたαへリックスペプチドは、その非修飾対応物と比較してインビボで卓越した薬理学的特性を有しており、天然ペプチド配列と比較して投与する必要がある安定化αへリックスペプチドの頻度および量を低減し、接触が維持されることを確実にする。

この点から、「安定化架橋」という用語またはその派生語は、ジスルフィド、アミド、エステル、１，２，３−トリアゾール、または他のバイオコンジュゲートもしくは生体適合性架橋などの、しかしこれらに限定されない、その同名の架橋または他の共有結合もしくはイオン性架橋を指す。この点から、「炭化水素ステープル」または「炭化水素架橋」という用語またはその派生語は、その同名の架橋または他の炭化水素共有結合もしくはイオン性、バイオコンジュゲートもしくは生体適合性架橋を指す。

本明細書で提供するペプチドにおいて、αへリックスＨＤ２ドメインは少なくとも１つの分子テザー、例えば炭化水素ステープルで安定化されるが、２、３またはそれ以上の炭化水素ステープルを含み得る。複数の炭化水素ステープルを含むことは、１６またはそれ以上のアミノ酸長であるαへリックスペプチドに特に適する。２以上（例えば、ペプチドの長さに依存して、２、３、４、５）の炭化水素ステープルを含むことは、修飾されたペプチドの非常に優れたタンパク質分解に対する安定性、構造安定性、酸および熱に対する安定性を提供し、インビボで著しく増強された薬理学的特性を有する生物活性ペプチドを生じる（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０参照）。

本明細書で提供する化合物において、ＨＤ２ドメインは天然配列の１またはそれ以上の修飾によって構造的に拘束される。ＨＤ２ドメインのαへリックスは、炭化水素ステープルなどの分子テザーを用いて安定化することができる。あるいはまたは加えて、ペプチドの所望構造を促進するため、２つのへリックス間の所望角度を促進するもしくは維持するためまたは相互に対してヘリックスを方向づけるため、または薬理学的特性を改善するための、天然または非天然アミノ酸を含むように、該領域内でまたは該領域に隣接してアミノ酸置換を行うことができる。１つの実施形態では、ＨＤ２ドメインのヘリックスの少なくとも一方は、ドメインのヘリックス性を促進するまたは維持するための炭化水素ステープルなどの分子テザーを含む。別の実施形態では、ＨＤ２ドメインのヘリックスの両方が、ドメインのヘリックス性を促進するまたは維持するための炭化水素ステープルなどの分子テザーを含む。

ポリペプチドの炭化水素ステープリング
好ましくは、αへリックスまたはＨＤ２ドメインは少なくとも１つの炭化水素ステープルで安定化される。修飾ペプチドのいずれかに関する使用に適する炭化水素ステープルは、本明細書で、ならびにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号、同第２０１０／０２３４５６３号、同第２００７／０１９７７７２号、同第２００６／０００８８４８号、同第２００６／００１４６７５号；米国特許第７，７２３，４６９号、同第７，１９２，７１３号および同第７，０８４，２４４号；国際公開第２００９／１０８２６１号および同第２０１０／１４８３３５号；ならびにＫａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５，１１３７−１１４６（２０１２）；Ｍａｈｏｎ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ Ａｒｏｒａ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８，１４１６−１４１８（２０１２）；およびＣｈａｐｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１２２５２−３（２００４）において記述されている。炭化水素ステープリングは、ヘリックス二次構造を有する傾向があるポリペプチドがその天然ヘリックス立体配座を維持し、安定性と効果を高めることを可能にする。１つの実施形態では、修飾ペプチドは、円二色性によって測定した場合、水溶液中で少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれ以上のヘリックス性を有する。円二色性を測定するためのアッセイは当分野で公知であり、本明細書で説明する。

炭化水素ステープルポリペプチドは、２個のアミノ酸の間にテザー（連結部）を含み、テザーはポリペプチドのヘリックス二次構造を有意に増強する。一般に、テザーは１または２個のヘリックスターンの長さ（すなわち３、４または７アミノ酸）にわたって伸びる。したがって、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；またはｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾および架橋のための理想的な候補である。したがって、本発明の修飾ポリペプチドのアミノ酸残基のいずれかを上記に従ってテザーし得る（例えば架橋し得る）。適切なテザーは、本明細書で、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号、同第２０１０／０２３４５６３号、同第２００７／０１９７７７２号、同第２００６／０００８８４８号、同第２００６／００１４６７５号；米国特許第７，７２３，４６９号、同第７，１９２，７１３号および同第７，０８４，２４４号；国際公開第２００９／１０８２６１号および同第２０１０／１４８３３５号；ならびにＫａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５，１１３７−１１４６（２０１２）；Ｍａｈｏｎ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ Ａｒｏｒａ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８，１４１６−１４１８（２０１２）；およびＣｈａｐｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１２２５２−３（２００４）において記述されている。炭化水素ステープルなどのテザーは、ヘリックス変異体（例えば異なるピッチ、角度または残基およびターン当たりのその割合を有する）またはヘリックス以外の構造を促進するために他の間隔で位置し得ることが理解される。

さらなる実施形態では、炭化水素ステープルは、１番目のアミノ酸（ｉ）と、１番目のアミノ酸の３アミノ酸下流にある２番目のアミノ酸（ｉ＋３）を連結するように位置する。別の実施形態では、炭化水素ステープルは、１番目のアミノ酸（ｉ）と、１番目のアミノ酸の４アミノ酸下流にある２番目のアミノ酸（ｉ＋４）を連結する。さらに別の実施形態では、炭化水素ステープルは、１番目のアミノ酸（ｉ）と、１番目のアミノ酸の７アミノ酸下流にある２番目のアミノ酸（ｉ＋７）を連結する。

本発明の修飾ポリペプチドは、一般に以下で提供する式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の構造を含む。

本明細書で述べる修飾ポリペプチドのいずれかは、組成物（例えば医薬組成物）またはキット中に存在し得る。本発明の一部の実施形態では、組成物またはキットは２またはそれ以上の修飾ポリペプチドを含む。

ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド
本発明の修飾ポリペプチドは以下のＨＤ２ペプチド（アミノ酸３５２から３７４）を含む：

上述した、完全長およびトランケートされたＨＤ２ドメインまたはＢＣＬ９ペプチドの類似体に対応するペプチドは、本発明によって企図され得る。本明細書で使用される、「ＨＤ２ドメイン類似体」という用語は、リピート類似体ドメインまたはＢＣＬ９ドメインを有すると認識されるまたは同定されるペプチドを指す。リピート類似体ポリペプチドについての方法は当分野で公知であり、例えばペアワイズ残基相関に基づくバイオインフォマティクスプログラム（例えばワールドワイドウェブ：ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＣＯＩＬＳ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ上の）は、タンパク質配列からコイルを認識し、それらの構造をモデリングする能力を有する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｕｐａｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１．２５２：１１６２−１１６４参照）。さらに、そのような修飾ペプチドは抗癌活性を示す。ＢＣＬ９ ＨＤ２および他のＢＣＬ９ホモログを同定するための方法は当分野で公知であり、本明細書で示す基準を用いて実施できる。

ＨＤ２ドメインおよびＢＣＬ９ペプチドの突然変異、トランケーションおよび伸長
アミノ酸置換は、保存的または非保存的であり得る。保存的アミノ酸置換は、ＨＤ２ペプチド配列の１またはそれ以上のアミノ酸を類似の電荷、大きさおよび／または疎水性特徴のアミノ酸で置換することからなる。非保存的置換は、ＨＤ２ドメイン配列の１またはそれ以上のアミノ酸を異なる電荷、大きさおよび／または疎水性特徴を有するアミノ酸で置換することからなる。置換は、保存的または非保存的非天然アミノ酸の使用を含み得る。

アミノ酸挿入は１個のアミノ酸残基または一続きの残基で構成され得る。挿入は、完全長もしくはトランケートされたＨＤ２ドメインまたはＢＣＬ９ペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端で、ならびにペプチドの内部の位置で行われ得る。そのような挿入は一般に２から１５アミノ酸の長さにわたる。対象とするペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかで行われる挿入はより広いサイズ範囲であってもよいことが企図され、約２から約５０アミノ酸が好ましい。１またはそれ以上のそのような挿入は、そのような挿入がまだ抗癌活性を示し得る修飾ペプチドを生じさせる限り、完全長もしくはトランケートされたＨＤ２ドメインまたはＢＣＬ９ペプチドに導入され得る。

完全長もしくはトランケートされたＨＤ２ドメインまたはＢＣＬ９ペプチドの欠失も本発明の範囲内である。そのような欠失は、ＨＤ２ドメインもしくはＢＣＬ９ペプチドからの、またはＨＤ２ドメインもしくはＢＣＬ９ペプチド様ペプチド配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去からなり、生じるペプチド配列の下限の長さは４、５または６アミノ酸である。そのような欠失は、ペプチド配列の１つの隣接する部分または２以上の別個の部分を含み得る。１またはそれ以上のそのような欠失は、そのような欠失がまだ抗癌活性を示し得る修飾ペプチドを生じさせる限り、完全長もしくはトランケートされたＨＤ２ドメインまたはＢＣＬ９ペプチドに導入され得る。

加えて、当業者は、炭化水素ステープルペプチドとその標的タンパク質との間の相互作用が、ペプチド上で相互作用面と非相互作用面が規定され得る複合体を形成することを認識する。非相互作用面に沿った突然変異は容易に作製できるが、相互作用面上の突然変異は、相互作用面上の残基は複合体の主成分であり、設計される炭化水素ステープルペプチド内でそれ自体が保存され、維持されるべきであるので、容認されない。そこで、β−カテニン／ＢＣＬ９複合体中のＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインの相互作用面上の残基の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、不変であるかまたは構造的もしくは化学的に類似のアミノ酸残基に変更されるべきである。

ＨＤ２ドメインおよびＢＣＬ９ペプチドの安定化
本発明の修飾ポリペプチドは、構造的に拘束（例えば安定化、ステープル）されたヘリックスであり、ならびに／または生理的環境から取り出された場合生物活性形状を失う天然配列に比べてペプチドの構造的柔軟性を制限する天然および／もしくは非天然アミノ酸を組み込むための、ネイティブ（すなわち野生型または天然に生じる）配列と比較して１もしくはそれ以上のアミノ酸配列修飾を含む。好ましくは、ポリペプチドは、炭化水素ステープルなどの少なくとも１つの分子テザーを含む。炭化水素ステープリングは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号、同第２０１０／０２３４５６３号、同第２００７／０１９７７７２号、同第２００６／０００８８４８号、同第２００６／００１４６７５号；米国特許第７，７２３，４６９号、同第７，１９２，７１３号および同第７，０８４，２４４号；国際公開第２００９／１０８２６１号および同第２０１０／１４８３３５号；ならびにＫａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５，１１３７−１１４６（２０１２）；Ｍａｈｏｎ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ Ａｒｏｒａ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８，１４１６−１４１８（２０１２）；およびＣｈａｐｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１２２５２−３（２００４）に記載されている。

ペプチドαへリックスは、比較的大きな接触表面積にわたって規則正しい正確な配置で特定のアミノ酸残基を提示することにより、決定的に重要なタンパク質相互作用に関与する（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９５．１４（２２）：ｐ．５５８９−５５９６；Ｋｕｓｓｉｅ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６．２７４（５２８９）：ｐ．９４８−９５３；Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９２．７１（７）：ｐ．１２２３−１２３７）。αへリックスドメインおよび他のタンパク質構造特徴は、タンパク質の残りの部分における足場配列によってしばしば安定化され、足場配列はヘリックス構造、例えばαへリックス構造の形成および／または維持を促進する。環境から取り出された場合、αへリックスペプチドモチーフはほどけて、生物学的活性の喪失をもたらし得る。αへリックスペプチドを開発するうえでの重要な課題には、それらの天然のαへリックス構造を促進および／または維持すること、ならびにタンパク質分解、酸および熱分解に耐えることができ、それによりインビボで無傷のままであり得るペプチドを作製することが含まれる。

炭化水素ステープリングは、少なくとも２個の置換アミノ酸（または２個の天然アミノ酸からの非天然結合、例えば炭素−炭素）によってポリペプチドを安定に架橋するための工程であって、そのポリペプチドの天然二次構造を立体配座的に与えるのを助ける工程を指す。炭化水素ステープリングは、αへリックス構造が熱力学的に好ましいペプチドにおいてαへリックス二次構造を促進し、維持する。この二次構造は、タンパク質分解切断および熱に対するポリペプチドの抵抗性を増大させ、疎水性も高め得る。したがって、本明細書で述べる炭化水素ステープル（構造的に拘束された、例えば架橋された）ポリペプチドは、対応する非炭化水素ステープル（構造的に拘束されていない）ポリペプチドと比較して改善された生物学的活性を有する。本明細書で述べる架橋ポリペプチドは治療的に、例えば癌を治療するために使用できる。

炭化水素ステープルペプチドは２個のアミノ酸の間にテザー（連結部）を含み、該テザーはポリペプチドのヘリックス二次構造を有意に増強する。一般に、テザーは１または２個のヘリックスターンの長さ（すなわち約３〜３．６または約７アミノ酸）にわたって伸びる。したがって、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；またはｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾および架橋のための理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが配列・・・Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９・・・を有する場合、Ｘ１とＸ４の間、またはＸ１とＸ５の間、またはＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘ２とＸ５の間、またはＸ２とＸ６の間、またはＸ２とＸ９の間等の架橋と同様に有用である。個々のステープル付加体の有用性を組み合わせる（例えば改善されたヘリックス性と活性；改善されたヘリックス性と熱安定性；改善されたヘリックス性と酸安定性；改善されたヘリックス性と薬理学的特性）、複数の架橋（例えば２、３、４またはそれ以上）の使用も達成されている。「ステッチ」架橋の使用も達成されており、それにより二重の結合が共通の起源（例えばＸ１、Ｘ５およびＸ９、ここでＸ５は２つのステープルのアンカーポイントである）から作製される。したがって、本発明は、配列をさらに安定化するためまたはより長い一続きのポリペプチドの構造安定化、タンパク質分解抵抗性、熱安定性、酸安定性、薬理学的特性および生物学的活性増強を促進するための、ポリペプチド配列内の１またはそれ以上の架橋の組込みを包含する。

本発明の一部の実施形態では、テザー、例えば炭化水素ステープルを、ヘリックス以外の構造を安定化するために使用する。そのような場合、テザーの末端はｉ、ｉ＋３、ｉ＋４およびｉ＋７以外の間隔で位置づけることができる。

１つの実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、式（Ｉ）：

［式中、
各々のＲ_１およびＲ_２は、独立してＨまたはＣ_１〜Ｃ_１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ_３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４］_ｎであり、その各々は０〜６個のＲ_５で置換されており；
Ｒ_４は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり；
Ｒ_５は、ハロ、アルキル、ＯＲ_６、Ｎ（Ｒ_６）_２、ＳＲ_６、ＳＯＲ_６、ＳＯ_２Ｒ_６、ＣＯ_２Ｒ_６、Ｒ_６、蛍光部分または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＣＯＮＲ_６または

であり、
Ｒ_６は、Ｈ、アルキルまたは治療薬であり；
ｎは１〜４の整数であり；
ｘは２〜１０の整数であり；
各々のｙは、独立して０〜１００の整数であり；
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；ならびに
各々のＸａａは、独立してアミノ酸である］
を有する。

修飾ポリペプチドは、αへリックスを形成し、および配列番号１から７のアミノ酸配列に３０％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含んでよく、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、炭化水素ステープルによって連結されたアミノ酸残基をさらに特定し、およびＢはノルロイシンである。

テザーは、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分（例えばＣ_５、Ｃ_８もしくはＣ_１１アルキル、またはＣ_５、Ｃ_８もしくはＣ_１１アルケニル、またはＣ_５、Ｃ_８もしくはＣ_１１アルキニル）を含み得る。テザーされたアミノ酸はα二置換され得る（例えばＣ_１〜Ｃ_３またはメチル）。

一部の場合には、ｘは２、３または６である。

一部の場合には、各々のｙは、独立して３から１５の間の整数である。

一部の場合には、各々のｙは、独立して１から１５の間の整数である。

一部の場合には、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである。

一部の場合には、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してＣ_１〜Ｃ_３アルキルである。

一部の場合には、Ｒ_１およびＲ_２の少なくとも一方はメチルである。例えばＲ_１およびＲ_２はどちらもメチルである。

一部の場合には、Ｒ_３はアルキル（例えばＣ_８アルキル）であり、およびｘは３である。

一部の場合には、Ｒ_３はＣ_１１アルキルであり、およびｘは６である。

一部の場合には、Ｒ_３はアルケニル（例えばＣ_８アルケニル）であり、およびｘは３である。

一部の場合には、ｘは６であり、およびＲ_３はＣ_１１アルケニルである。

一部の場合には、Ｒ_３は直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

一部の場合には、Ｒ_３は−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である。

ある実施形態では、２つのα，α二置換された立体中心は、どちらもＲ立体配置もしくはＳ立体配置であるか（例えばｉ、ｉ＋４架橋）、または一方の立体中心はＲであり、および他方はＳである（例えばｉ、ｉ＋７架橋）。したがって、式Ｉが、

と表される場合、例えばｘが３であるとき、Ｃ’およびＣ’’二置換された立体中心は、どちらもＲ立体配置であり得るかまたはこれらはどちらもＳ立体配置であり得る。ｘが６である場合、Ｃ’二置換された立体中心はＲ立体配置であり、およびＣ’’二置換された立体中心はＳ立体配置である。Ｒ_３二重結合は、ＥまたはＺ立体化学的立体配置であってもよい。

一部の場合には、Ｒ_３は［Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４］_ｎであり；およびＲ_４は直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

一部の実施形態では、修飾ポリペプチドは、リピートまたはリピート様ドメイン、例えばＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。各々の［Ｘａａ］_ｙは、リピートまたはリピート様ドメイン、例えばＨＤ２ドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれ以上のアミノ酸を独立して含み得るペプチドである。［Ｘａａ］_ｘは、リピートまたはリピート様ドメインの３または６個のアミノ酸を含み得るペプチドである。

修飾ポリペプチドは、リピートまたはリピート様ドメイン、例えばＨＤ２ドメイン、例えば配列番号１から７のアミノ酸配列を有するポリペプチドの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれ以上のアミノ酸を含むことができ、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって隔てられた２個のアミノ酸は、Ｒ_３を介して連結されたアミノ酸置換基によって置き換えられている。したがって、少なくとも２個のアミノ酸は、テザーアミノ酸またはテザーアミノ酸置換基によって置き換えることができる。したがって、式（Ｉ）が、

と表される場合、［Ｘａａ］_ｙ’および［Ｘａａ］_ｙ’’は、同じかまたは異なる７アミノ酸リピートまたは７アミノ酸リピート様ドメインからのポリペプチド配列を各々含み得る。

本発明は、リピートまたはリピート様ドメイン、例えばＨＤ２ドメイン、例えば配列番号１から７のアミノ酸配列を有するポリペプチドの１０個（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれ以上）のアミノ酸を含む架橋ポリペプチドに関し、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって隔てられた２個のアミノ酸のα炭素はＲ_３を介して連結されており、２個のα炭素の一方はＲ_１で置換され、他方はＲ_２で置換され、および各々はペプチド結合を介してさらなるアミノ酸に連結されている。

別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、式（ＩＩ）：

［式中、
各々のＲ_１およびＲ_２は、独立してＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロシクリルアルキルであり；
各々のｎは、独立して１〜１５の整数であり；
ｘは２、３または６であり；
各々のｙは、独立して０〜１００の整数であり；
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；
各々のＸａａは、独立してアミノ酸である］
を有する。

さらに別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、式（ＩＩＩ）：

［式中、
各々のＲ_１およびＲ_２は、独立してＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ_３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４］_ｎまたは天然のアミノ酸側鎖であり、その各々は０〜６個のＲ_５で置換されており；
Ｒ_４は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり；
Ｒ_５は、ハロ、アルキル、ＯＲ_６、Ｎ（Ｒ_６）_２、ＳＲ_６、ＳＯＲ_６、ＳＯ_２Ｒ_６、ＣＯ_２Ｒ_６、Ｒ_６、蛍光部分または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＣＯＮＲ_６または

であり、
Ｒ_６は、Ｈ、アルキルまたは治療薬であり；
Ｒ_７は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４］_ｎまたは天然のアミノ酸側鎖であり、その各々は０〜６個のＲ_５で置換されており；
ｎは１〜４の整数であり；
ｘは２〜１０の整数であり；
各々のｙは、独立して０〜１００の整数であり；
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；ならびに
各々のＸａａは、独立してアミノ酸である］
を有する。

その内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８５７５号（国際公開第２００８／１２１７６７号）に少なくとも開示されているステッチペプチドも本発明によって企図される。

修飾ポリペプチドは、αへリックスを形成し、および配列番号１から７の配列を有するペプチドに２０％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列からの少なくとも７個のアミノ酸、または配列番号１から７の配列を有するペプチドによって形成されるヘリックスの１つの面からの少なくとも２個のアミノ酸を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、炭化水素ステープルによって連結されたアミノ酸残基をさらに特定し、およびＢはノルロイシンである。ある実施形態では、修飾ポリペプチドは、αへリックスを形成し、および配列番号１から７の配列を有するペプチドに３０％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態では、αへリックス内のアミノ酸配列は、配列番号１から７の配列を有するペプチドに４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれ以上同一である。

炭化水素テザーが説明されてきたが、他のテザーも想定される。例えば、テザーは、エーテル、チオエーテル、エステル、アミンまたはアミド部分の１またはそれ以上を含み得る。一部の場合には、天然のアミノ酸側鎖をテザーに組み込むことができる。例えば、テザーを、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第一級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドなどの官能基とカップリングすることができる。したがって、２個の非天然アミノ酸をカップリングすることによって作製されたテザーを使用するのではなく、天然アミノ酸を用いてテザーを作製することが可能である。天然アミノ酸と共に１個の非天然アミノ酸を使用することも可能である。

テザーの長さを変化させ得ることがさらに想定される。例えば、二次構造に比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合は、より短い長さのテザーを使用することができ、一方、一部の場合には、二次構造により少ない拘束を与えることが望ましく、したがってより長いテザーが望ましいと考えられる。アミノ酸配列がヘリックスを形成する傾向を有さない場合、ある部位におけるまたはアミノ酸配列内のテザーの挿入はヘリックス形成をもたらさないことがさらに理解される。

加えて、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４；およびｉからｉ＋７にまたがるテザーの例は、主としてαヘリックスの単一面上にあるテザーを提供するために記述されているが、テザーは、多数のアミノ酸の任意の組合せにまたがるようにおよび／またはαへリックス以外の構造を維持するように合成することができる。

当業者に認識されるように、本明細書で述べる化合物を合成する方法は当業者に明らかである。加えて、所望化合物を与えるために様々な合成段階を選択的な順序または順番で実施し得る。本明細書で述べる化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は当分野で公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）ならびにこれらのその後の版に記載されているものを包含する。ペプチドの合成の特定の方法は本発明の限定ではない。

ペプチドの合成
本発明のペプチドは、当業者に周知であり、本明細書で述べる化学合成方法によって作製することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７；およびＢｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４４６，３６９−８６（２００８）参照。したがって、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａもしくは４３１またはＡＡＰＰＴＥＣマルチチャネル合成装置ＡＰＥＸ ３９６上で側鎖保護されたアミノ酸を使用する、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかによって保護されたα−ＮＨ_２による固相合成の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いて合成することができる。

本明細書で述べるペプチドを作製する１つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いることである。Ｃ末端アミノ酸を、リンカー分子との酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に付着させる。この樹脂は合成に使用される溶媒に不溶性であり、このことが、過剰な試薬および副産物を洗浄除去することを比較的簡単かつ迅速にしている。Ｎ末端は、酸に安定であるが、塩基によって除去し得るＦｍｏｃ基で保護する。任意の側鎖官能基を、塩基に安定で、酸に不安定な基で保護する。

より長いペプチドも、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて個々の合成ペプチドを結合させることによって作製できる。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコールと共に周知の標準的なマニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードするコード配列を構築するために、そのアミノ酸配列を逆翻訳し、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンと共に、アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的にはこのペプチドおよび必要に応じて任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより、コード配列を作製する。コード配列を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。さらに、炭化水素ステープルのための非天然アミノ酸を組み込むことができるように宿主細胞を遺伝子操作する。ペプチドを、次に、選択した発現系および宿主に適した適切な条件下で発現させる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ），９４：１００９２−１００９７（１９９７）参照。ペプチドを標準的な方法によって精製し、特性付ける。

ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ／ＡＰＰＴＴＥＣ、ＴｈｕｒａｍｅｄまたはＣＥＭから入手可能なもののようなハイスループットマルチチャネルコンビナトリアル合成装置を使用して、ハイスループット、コンビナトリアル方式で作製することができる。

定義
「作用物質」は、本明細書では治療活性化合物または潜在的に治療活性な化合物を包含すると理解される。作用物質は、これまでに既知または未知の化合物であり得る。本明細書で使用される場合、作用物質は、典型的には非細胞ベースの化合物であるが、生物学的治療薬、例えばペプチドまたは核酸治療薬、サイトカイン等を包含し得る。

本明細書で使用される場合、「改善」または「治療」は、特定の疾患または状態の少なくとも１つの徴候、症状、徴候または作用を軽減するまたは低下させるという意味と理解される。改善および治療は、単独でまたは他の治療薬および治療介入と組み合わせて、作用物質の２回分以上の用量の投与を必要とし得る。改善または治療は疾患または状態が治癒されることを必要としない。

「アミノ酸」という用語は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子を指す。適切なアミノ酸は、限定されることなく、適当なアミノ酸は、ペプチドにおいて認められる２０種類の一般的な天然に生じるアミノ酸（例えばＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（一文字略号として公知））のＤ異性体およびＬ異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路により調製され、化学的多様性、機能性、結合能力、構造模倣性および安定性の増大などの特定の用途のために適用できる、β−アミノ酸およびα，α二置換アミノ酸を含む天然および非天然のアミノ酸を包含する。

「アミノ酸側鎖」または「アミノ酸Ｒ基」という用語は、アミノ酸のα−炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンについてのアミノ酸側鎖またはＲ基はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルである、等である。他の非天然アミノ酸側鎖も、例えば天然に生じるもの（例えばアミノ酸代謝産物）または合成により生成されたもの（例えばα，α二置換アミノ酸、β−アミノ酸）も包含される。

本明細書で使用される場合、「対照と比較して変化した」試料または被験者は、正常、未処置または対照試料からの試料とは統計的に異なるレベルで検出される分析物または診断もしくは治療指標のレベルを有すると理解される。対照試料には、例えば、培養下の細胞、１もしくはそれ以上の実験室試験動物、または１もしくはそれ以上のヒト被験者が含まれる。対照試料を選択し、試験する方法は当業者の能力の範囲内である。分析物は、細胞もしくは生物によって特徴的に発現もしくは産生される天然の物質、またはレポーター構築物によって生成される物質（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ）であり得る。検出のために使用される方法に依存して、変化の量および測定は異なり得る。統計的有意性の決定は当業者の能力の範囲内である。

本明細書で使用される「共投与」は、１またはそれ以上の作用物質を、作用物質が被験者において同時に存在し、活性であるように被験者に投与することと理解される。共投与は、作用物質の混合剤の調製または作用物質の同時投与を必要としない。

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。例えばペプチドの電荷を改変するためにアスパラギン酸をアスパラギンに置換する場合のような、他の保存的アミノ酸置換も、アミノ酸側鎖ファミリーを越えて起こり得る。したがって、ＨＤ２ドメインペプチド内の予測されるアミノ酸残基を、例えば、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別アミノ酸残基またはファミリーを越える同族体（例えばアスパラギン酸の代わりにアスパラギン、グルタミン酸の代わりにグルタミン）で置換する。保存的変化は、化学的に同族の非天然アミノ酸の置換（すなわちロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）をさらに包含し得る。

「細胞に接触させること」は、本明細書では、作用物質または単離された細胞が、試験細胞または処理されるべき細胞と相互作用して、潜在的に試験細胞または処理されるべき細胞によって取り込まれ、試験細胞または処理されるべき細胞に作用を及ぼすように、作用物質を培養下または動物中の試験細胞、例えば処理されるべき細胞に提供することと理解される。作用物質または単離された細胞は、直接（例えば培地への作用物質の添加もしくは対象とする細胞もしくは組織への注入によって）、または循環、リンパ管もしくは他の手段による細胞への送達のための経腸的または非経口的投与経路による生物への送達によって、対象とする細胞に送達され得る。

本明細書で使用される場合、「検出すること」、「検出」等は、試料中の特定の分析物、試料中のレポーター構築物からの生成物または試料中の作用物質の活性の同定のためにアッセイを実施することと理解される。

本明細書で使用される「診断すること」とは、疾患、障害または状態の少なくとも１つの徴候または症状の存在に基づいて疾患、障害または状態を有する被験者を同定するための、観察、試験または状況に基づく被験者の状態の臨床的または他の評価を指す。典型的には、本発明の方法を使用した診断には、疾患、障害または状態の他の徴候または症状に関して被験者を観察することが含まれる。

「有効量」または「有効用量」という用語は、意図する薬理学的、治療的または予防的結果を生じさせる作用物質の量を指す。薬理学的有効量は、本明細書で提供する障害の１もしくはそれ以上の徴候もしくは症状の改善をもたらすか、または障害の拡大を予防する。例えば、治療有効量は、好ましくは癌拡大の速度を未処置の対照被験者と比較して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上低下させる治療薬の量を指す。有効用量を提供するには作用物質の２回以上の投与が必要であり得る。

本明細書で使用される場合、「有効」および「有効性」という用語は、薬理学的有効性と生理的安全性の両方を包含する。薬理学的有効性は、患者において所望の生物学的作用を生じさせる治療の能力を指す。生理的安全性は、治療の投与から生じる細胞、器官および／または生物レベルでの毒性または他の有害な生理的作用（しばしば副作用と称される）のレベルを指す。他方で、「無効」という用語は、治療が、有害作用が存在しない場合でも、少なくとも非層別集団において治療的に有用である十分な薬理学的作用を提供しないことを指示する。（そのような治療は、発現プロフィールによって同定され得るサブグループにおいて無効であり得る。）「より有効でない」は、治療が、治療的に有意により低いレベルの薬理学的有効性および／または治療的により高いレベルの有害な生理的作用を生じさせることを意味する。

したがって、薬剤の投与に関連して、疾患または状態「に対して有効」な薬剤は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計的に有意の割合の患者に対して有益な作用、例えば症状の改善、治癒、疾患徴候または症状の軽減、寿命の延長、生活の質の改善、または特定の種類の疾患または状態を治療することに精通した医師によって一般的に有益と認識される他の作用を生じさせることを指示する。

本明細書で使用される場合、ヘリックス、例えばαへリックスまたは３_１０ヘリックスの「面」は、ヘリックスが垂直に位置する場合、１つの面のアミノ酸が他方の面の上にあるものとして表されるように、タンパク質のヘリックス内に「積層」されているアミノ酸と理解される。例えば、αへリックスは１回転当たり約３．６個のアミノ酸を有する。それゆえ、配列ａｂｃｄｅｆｇａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’ｆ’ｇ’を有するペプチドがαへリックスを形成する場合、４番目と５番目のアミノ酸（ｉ＋３とｉ＋４）、すなわちアミノ酸ｄとｅは最初のアミノ酸（位置１＋〜３．６アミノ酸）上に「積層」し、８番目のアミノ酸であるアミノ酸ａ’（ｉ＋７）はアミノ酸ａ上に積層してヘリックスの面を形成し、アミノ酸ａ’から新しい回転が始まる。αへリックスにおいて、２番目のアミノ酸であるアミノ酸ｂは、＋３および＋４位置で５番目と６番目のアミノ酸、すなわちアミノ酸ｅおよびｆと積層し、＋７位置のアミノ酸ｂ’と共にヘリックスの面を形成する。アミノ酸ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇから始まるヘリックス上の面は、上記開示に基づいて容易に決定することができる。さらに、ヘリックスの面は、「積層」残基の２つの隣接する柱、３つの隣接する柱または４つの隣接する柱を含み得る。

ヘリックスの「面」の一例には、ヘリックスの「相互作用面」が含まれる。「相互作用面」のアミノ酸残基は、ヘリックスバンドル中の１またはそれ以上のヘリックスと接触して、ポリペプチドの機能活性を無効化または実質的な無効化を生じさせる残基である。実質的な無効化とは、適切なアッセイにおいてＢＣＬ９ペプチドの機能活性を野生型ペプチドの約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満に低下させることと理解される。ＢＣＬ９ペプチドの相互作用面アミノ酸残基は当分野で周知の方法によって容易に決定することができ、本明細書で説明する。１つの実施形態では、必須アミノ酸残基はＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインの「ａ」または「ｄ」位置にあるが、可欠アミノ酸は「ｂ」、「ｃ」、「ｅ」、「ｆ」または「ｇ」位置に生じ得る。本明細書で使用される「相互作用面」アミノ酸残基という用語は、配列の機能を妨げない相互作用面アミノ酸の保存的置換を包含する。一般に、「相互作用面」アミノ酸残基はαへリックスの相互作用面において認められる。

ＢＣＬ９、ＢＣＬ９様およびＨＤ２ドメインならびにＨＤ２ドメイン類似体は、配列に基づく相同性、構造的相同性および／または機能的相同性により、当業者によって容易に同定可能である。そのような方法は当分野で周知であり、ペアワイズ残基相関に基づくバイオインフォマティクスプログラム（例えばｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＣＯＩＬＳ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を含み、このプログラムは、タンパク質配列からコイルを認識し、それらの構造をモデリングする能力を有する（Ｌｕｐａｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１．２５２：１１６２−１１６４参照）。

１つの実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と２０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と３０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と４０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と５０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と６０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と７０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と８０％またはそれ以上類似する。別の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、相互作用面において配列番号１から７のアミノ酸配列と９０％またはそれ以上類似する。ＢＣＬ９ペプチドの相互作用面はβ−カテニン相互作用面であり得る。αへリックスの「相互作用面」は、他のタンパク質上および／または他のヘリックス内の他のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基を含む。リピートおよび相互作用面残基を同定する方法は当分野で周知であり、本明細書で説明する。

本明細書で使用される場合、「炭化水素ステープリング」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋するための工程であって、そのポリペプチドの天然二次構造を立体配座的に与えるのを助ける工程を指す。炭化水素ステープリングは、ヘリックス二次構造、例えばαへリックス二次構造を有する傾向があるペプチドにおいて、その天然αへリックス立体配座を達成するまたは維持するために、ヘリックス二次構造を促進するまたは維持する。この二次構造は、タンパク質分解切断および熱に対するポリペプチドの抵抗性を増大させ、疎水性も高め得る。

炭化水素ステープルペプチドは２個の非天然アミノ酸（または２個の天然アミノ酸からの非天然結合、例えば炭素−炭素）の間に１またはそれ以上のテザー（連結部）を含み、該テザーはポリペプチドのヘリックス二次構造を有意に増強する。一般に、ヘリックス構造を促進するために、テザーは１または２個のヘリックスターンの長さ（すなわち約３、４または約７アミノ酸）にわたって伸びる。したがって、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；またはｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾および架橋のための理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが配列・・・Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９・・・を有し、およびアミノ酸Ｘが各々の位置について独立して選択される場合、Ｘ１とＸ４の間、またはＸ１とＸ５の間、またはＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘ２とＸ５の間、またはＸ２とＸ６の間、またはＸ２とＸ９の間等の架橋と同様に有用である。複数の架橋（例えば２、３、４またはそれ以上）の使用も企図される。複数の架橋の使用は、特にペプチドの長さが増大すると共に、ペプチドを安定化し、最適化するのに有効である。「ステッチ」架橋の使用も達成されており、それにより二重の結合が共通の起源（例えばＸ１、Ｘ５およびＸ９、ここでＸ５は２つのステープルのアンカーポイントである）から作製される。したがって、本発明は、ポリペプチド配列内の１またはそれ以上の架橋の組込みを包含する。複数の架橋の使用は、特にペプチドの長さが増大すると共に、ペプチドを安定化し、最適化するのに有効である。したがって、本発明は、２つのステープルが共通の起源から生じるステッチ架橋を含む、ポリペプチド配列内の１またはそれ以上の架橋の組込みを包含する。

本明細書で使用される場合、「ステープルスキャン」は、ステープルペプチドのライブラリの合成を指し、それによりｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；およびｉとｉ＋７の単一および複数のステープルまたはステッチの場所がペプチド配列の長さに沿って下流へと連続的に位置づけ、すべての可能な場所をサンプリングして、ステープルまたはステッチ構築物についての所望のまたは最適の特性および活性を同定する。

本明細書で使用される場合、「同一性」または「パーセント同一性」という用語は、２つのポリマー分子、例えば２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば２つのペプチドの各々におけるある位置がセリンで占められている場合、それらはその位置において同一である。２つの配列間の同一性は、マッチするまたは同一の位置の数の直接の関数であり、例えば２つのペプチドまたは化合物配列における位置の半数（例えばポリマーの１０サブユニット長における５つの位置）が同一である場合、これら２つの配列は５０％同一である；位置の９０％、例えば１０のうち９がマッチする場合、２つの配列は９０％の配列同一性を共有する。２つの配列間の同一性は、マッチするまたは同一の位置の数の直接の関数である。したがって、参照配列の一部分が特定のペプチドにおいて欠失している場合、その欠失区域は、配列同一性を計算する目的に関しては計数しない。同一性はしばしば配列解析ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおいて入手可能）を用いて測定される。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）により２つの配列を比較する（例えば２つの配列を互いに対して「Ｂｌａｓｔ」する）ためのデフォルトパラメータは、マッチリワード＝１、ミスマッチペナルティ＝０、オープンギャップ＝５、エクステンションギャップ＝２である。タンパク質配列用のＢＬＡＳＴＰを使用する場合は、デフォルトパラメータは、マッチリワード＝０、ミスマッチペナルティ＝０、オープンギャップ＝１１およびエクステンションギャップ＝１である。同一性を決定するためのさらなるコンピュータプログラムは当分野で公知である。

本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関して使用される場合の「単離された」または「精製された」とは、天然ポリペプチドまたはタンパク質がその通常の生理的環境から取り出されていること（例えば血漿もしくは組織から単離されたタンパク質）、または非天然環境で合成されること（例えばインビトロ翻訳系においてもしくは化学合成を用いて人工的に合成される）を意味する。したがって、「単離された」または「精製された」ポリペプチドは、無細胞溶液中に存在し得るかまたは異なる細胞環境に位置し得る（例えば異種細胞型において発現される）。「精製された」という用語は、そのポリペプチドが、存在する唯一のポリペプチドであることを意味するのではなく、該ポリペプチドが天然に結合している細胞または生物物質を基本的に含まず（約９０〜９５％、９９〜１００％まで純粋）、したがって天然のポリペプチドとは区別されることを意味する。同様に、単離された核酸は、その通常の生理的環境から取り出されている。細胞に関して使用される場合の「単離された」は、細胞が、初代細胞または細胞株の、細胞培養または器官培養のいずれかの、培養下にある（すなわち動物中ではない）ことを意味する。細胞は、正常な動物、トランスジェニック動物、自然に生じる遺伝子変化を有する動物、ならびに／または遺伝的および／もしくは誘発された疾患もしくは状態を有する動物から単離することができる。

本明細書で使用される場合、「キット」は、本発明の方法における使用のための少なくとも１つの非標準的な実験用試薬を含むと理解される。例えば、キットは、すべて適切な包装中の、少なくとも１つのペプチドおよび使用のための指示書の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つを含み得る。キットは、乾燥粉末、濃縮溶液または即時使用溶液として、本発明の方法を実施するために必要な任意の他の成分をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、本発明の方法における使用のための試薬が入った１またはそれ以上の容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または試薬を保持するのに適した他の材料で作製され得る。

「可欠」アミノ酸残基は、ポリペプチドの活性／二次構造（αへリックス構造）を無効にせずまたは実質的に無効にせずに、ポリペプチドの野生型配列から変化させ得る残基である。

「得ること」は、本明細書では製造する、購入するまたは入手することと理解される。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、作動可能に連結された２またはそれ以上の成分がそれらのもとの活性を保持するか、または作動可能に連結された部分の活性が実施例で提供する方法の少なくとも１つを用いて検定することができ、検出可能な活性を有するように、連結されたとき活性を獲得する方法で、好ましくは共有結合によって連結されていること、例えば１つのペプチドのアミノ末端が別のペプチドのカルボキシ末端に連結されていることと理解される。

「医薬的に許容される担体」という語句は、当分野で承認されており、本発明の化合物を哺乳動物に投与するのに適した、医薬的に許容される材料、組成物またはビヒクルを包含する。担体には、対象作用物質を１つの器官または身体の一部分から別の器官または身体の別の部分に運ぶまたは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料が含まれる。各々の担体は、製剤のその他の成分と適合性であり、患者に有害でないという意味で「許容され」ねばならない。例えば、細胞の投与のための医薬的に許容される担体は、典型的な注射による送達用に許容される担体であり、界面活性剤または送達すべき細胞を損傷し得る他の化合物などの作用物質を含まない。医薬的に許容される担体としての機能を果たし得る材料の一部の例には、糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤ワックス；油脂類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール類、例えばプロピレングリコール；ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質不含水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤において使用される他の非毒性適合性物質が含まれる。

湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、着香剤および香料、防腐剤および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。

医薬的に許容される抗酸化剤の例には、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；ならびに金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。

本発明の製剤は、経口、鼻、局所、経皮、口腔、舌下、筋肉内、腹腔内、直腸、膣および／または非経口投与に適するものを包含する。製剤は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる化合物の量である。

本明細書で使用される場合、「複数」は２以上を意味すると理解される。例えば、複数は、少なくとも２、３、４、５またはそれ以上を指す。

本明細書で使用される「ポリペプチド」または「ペプチド」は、共有結合（例えばペプチド結合）によって連結された２またはそれ以上の、独立して選択される天然または非天然アミノ酸と理解される。ペプチドは、ペプチド結合によって連結された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の天然または非天然アミノ酸を含み得る。本明細書で述べるポリペプチドは、完全長タンパク質（例えば完全にプロセシングされたタンパク質）ならびにより短いアミノ酸配列（例えば天然タンパク質のフラグメントまたは合成ポリペプチドフラグメント）を包含する。

本明細書で使用される「試料」は、その環境（例えば動物由来の血液もしくは組織、細胞、または組織培養由来の順化培地）から単離されており、ウイルス、抗体またはレポーター構築物からの生成物などの分析物を含むことが疑われるまたは含むことが既知である生物学的物質を指す。試料はまた、組織または体液の部分精製された画分であり得る。参照試料は、疾患もしくは状態の液体を有さないドナーから、または疾患もしくは状態を有する被験者における正常組織（例えば非感染組織対感染組織）からの、「正常」試料であり得る。参照試料はまた、活性物質で処置されていない（例えば治療なしまたはビヒクルだけの投与）未処置ドナーまたは細胞培養物に由来し得る。参照試料はまた、細胞または被験者を試験する作用物質と接触させる前の「ゼロ時点」で採取することもできる。

２またはそれ以上のポリペプチド配列に関連して「類似性」または「パーセント類似性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてもしくは目視検査によって測定した場合、同じであるか、または対応を最大にするように比較して整列したとき同じである特定の割合のアミノ酸残基もしくはその保存的置換物を有する、２またはそれ以上の配列を指す。

ポリペプチドに関して本明細書で使用される、「安定な」または「安定化された」という用語は、ヘリックス構造を促進および／もしくは維持するため、ならびに／またはプロテアーゼ抵抗性を改善するため、ならびに／または酸安定性を改善するため、ならびに／または熱安定性を改善するため、ならびに／または薬理学的特性を改善するために炭化水素ステープルされたポリペプチドを指す。安定化されたポリペプチドは、一種の構造的に拘束されたポリペプチドである。

本明細書で使用される場合、「構造的に拘束されたペプチド」等は、構造的に拘束されたペプチドが非修飾ペプチドよりも限られた数の構造をとるように、何らかの（すなわち少なくとも１つの）化学修飾、例えば天然または非天然アミノ酸による、もとのまたは天然の配列の突然変異、分子テザーを組み込むための化学修飾、ジスルフィド架橋の形成を促進するための化学修飾等を有する修飾ペプチドを包含すると理解される。構造的に拘束されたペプチドは、天然の野生型配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の突然変異を含み得る。例えば、分子テザーは、安定なヘリックス構造、特にαへリックスおよび３_１０構造の形成を促進する炭化水素ステープル、またはテザーの末端の位置およびテザーの長さに依存するねじれを包含し得る。ねじれ（例えば２つの隣接する構造体間の可変角度によって規定される構造体中の屈曲）または他の好ましい立体配座を促進するために天然または非天然アミノ酸が使用できる。例えば、天然アミノ酸プロリンは、アミノ酸Ｒ基の構造および水素結合供与体の欠如によりペプチド内にねじれを誘導することができる。非天然アミノ酸、特に大型および／もしくは荷電Ｒ基を有するもの、またはＮメチル化アミド、Ｎ置換グリシン、環状α，α二置換、環状Ｎ，Ｎ二置換ならびにβ−アミノ酸は、特定の所望立体配座を促進することができる。溶液中の「構造的に拘束された」ペプチドの集団は、必ずしも常にすべてが所望立体配座を有するとは限らないことが理解される。その代わりに、溶液中の構造的に拘束されたペプチドの集団において、所望立体配座は、化学修飾前の溶液中の天然またはもとのペプチド配列よりも少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上の確率で存在する。溶液中のペプチドの集団の構造は、円二色性およびＮＭＲ分光法を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々な方法によって決定され得る。結晶の形態でパックされている場合の拘束されたペプチドの構造を決定するにはＸ線結晶学が適用できる。

本明細書で使用される「低分子」は、約１５００Ｄａ、１０００Ｄａ、７５０Ｄａまたは５００Ｄａ以下の分子量を有する化合物、典型的には有機化合物と理解される。１つの実施形態では、低分子は、天然アミノ酸および／またはヌクレオチドだけを含むポリペプチドまたは核酸を包含しない。

作用物質、ポリペプチド、核酸または他の化合物は、非特異的化合物または非特異的化合物のプールと比較して、標的分子が少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも５００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、好ましくは少なくとも５０００倍、好ましくは少なくとも１０，０００倍の選択性で結合される場合、標的分子、例えば抗原、ポリペプチド、核酸または他の化合物に「特異的に結合する」。特異的結合は、物理的に関連する構造を有する２またはそれ以上の関連化合物の１つに結合することに関して使用できる。絶対的または相対的な、結合選択性および親和性は、例えば各々の対に関して別々に親和性を測定することによってまたは競合アッセイもしくは当業者に周知の他の方法の使用によって決定することができる。

本明細書で使用される「被験者」は生存生物を指す。ある実施形態では、生存生物は動物である。ある好ましい実施形態では、被験者は哺乳動物である。ある実施形態では、被験者は家畜哺乳動物である。被験者の例には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが含まれる。ヒト被験者は患者とも称され得る。

特定の疾患、状態または症候群に「罹患しているかまたは罹患している疑いがある」被験者は、適格な個人が、被験者が疾患、状態または症候群に罹患していると診断するかまたはその疑いを抱くのに十分な数の危険因子を有するかまたは十分な数もしくは組合せの疾患、状態もしくは症候群の徴候もしくは症状を呈する。

本明細書で使用される「治療有効量」は、細胞または被験者への単回用量または反復用量の投与後に、そのような治療を行わない場合に予想される以上に、そのような障害を有する患者の生存能を延長させる、障害の１またはそれ以上の徴候または症状を軽減する、感染を予防するまたは遅延させる、疾患または障害の進行を予防するかまたは遅延させるうえで有効な作用物質の量を指す。

作用物質は、単独でまたは１もしくはそれ以上の治療薬と組み合わせて、従来の賦形剤、例えば医薬的に許容される担体との混合物中の医薬組成物としてまたは治療処置として、被験者に投与することができる。

薬剤は、単位剤形で好都合に投与することができ、および、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５）に記載されているように、製薬分野において周知の方法のいずれかによって調製し得る。非経口投与用の製剤は、無菌水または食塩水のような一般的な賦形剤として、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含み得る。特に、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、ある種の作用物質の放出を制御するために有用な賦形剤であり得る。

所与の療法において使用される活性化合物の実際の好ましい量は、例えば使用される特定の化合物、製剤化される特定の組成物、投与の方法ならびに被験者の特徴、例えば被験者の動物種、性別、体重、一般的な健康状態および年齢に応じて異なる。所与の投与プロトコールについての最適の投与率は、前記指針に関して実施される従来の用量決定試験を用いて当業者によって容易に確認され得る。

本明細書で使用される場合、特定の疾患または状態等に「感受性がある」、「罹患しやすい」または「素因がある」は、遺伝、環境、健康および／または他の危険因子に基づき、一般的な集団よりも疾患または状態を発症する可能性が高い個体を指す。疾患を発症する可能性の上昇は、約１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上の上昇であり得る。

「アルキル」という用語は、指示数の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖であってよい炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ_１〜Ｃ_１０は、基がその中に１から１０個（両端を含む）の炭素原子を有してよいことを示す。数の指定がない場合、「アルキル」は、その中に１から２０個（両端を含む、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち−Ｒ−）を指す。

「アルケニル」という用語は、１またはそれ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖であってよい炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は指示数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ_２〜Ｃ_１０は、基がその中に２から１０個（両端を含む）の炭素原子を有してよいことを示す。「低級アルケニル」という用語は、Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル鎖を指す。数の指定がない場合、「アルケニル」は、その中に２から２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

「アルキニル」という用語は、１またはそれ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖であってよい炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は指示数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ_２〜Ｃ_１０は、基がその中に２から１０個（両端を含む）の炭素原子を有してよいことを示す。「低級アルキニル」という用語は、Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル鎖を指す。数の指定がない場合、「アルキニル」は、その中に２から２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

「アリール」という用語は、各々の環の０、１、２、３または４個の原子が置換基によって置換されていてもよい、６個の炭素の単環式または１０個の炭素の二環式芳香族環系を指す。アリール基の例には、フェニル、ナフチル等が含まれる。「アリールアルキル」という用語または「アラルキル」という用語は、アリールで置換されたアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されたアルコキシを指す。

本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、３から１２個の炭素、好ましくは３から８個の炭素、より好ましくは３から６個の炭素を有する飽和および部分不飽和の環式炭化水素基を包含し、ここで、シクロアルキル基は場合によりさらに置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基には、限定されることなく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。

「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のいずれかの基を指す。

「ヘテロアリール」という用語は、単環式である場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式である場合は１〜６個のヘテロ原子または三環式である場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族の５〜８員単環式、８〜１２員二環式または１１〜１４員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子はＯ、ＮまたはＳから選択され（例えば、炭素原子および、単環式、二環式または三環式である場合、それぞれ１〜３、１〜６または１〜９個のＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子）、ここで、各々の環の０、１、２、３または４個の原子は置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等が含まれる。「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。

「ヘテロシクリル」という用語は、単環式である場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式である場合は１〜６個のヘテロ原子または三環式である場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族の５〜８員単環式、８〜１２員二環式または１１〜１４員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および、単環式、二環式または三環式である場合、それぞれ１〜３、１〜６または１〜９個のＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子）、ここで、各々の環の０、１、２または３個の原子は置換基によって置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例には、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等が含まれる。

「置換基」という用語は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール基上のその基の任意の原子において「置換された」基を指す。適切な置換基には、限定されることなく、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニルおよびシアノ基が含まれる。

本明細書で提供する範囲は、範囲内のすべての値の簡潔表記であると理解される。これは、配列番号の範囲が与えられる場合、すべての個別配列を包含する。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群の任意の数、数の組合せまたは部分的範囲を包含すると理解される。

特に記述されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または」は包括的であると理解される。

特に記述されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「１つの」および「その」という用語は単数または複数であると理解される。

特に記述されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当分野における一般な許容値の範囲内、例えば平均の２標準偏差の範囲内と理解される。約は、記述される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供するすべての数値は約の語で修飾され得る。

本明細書での変数の何らかの定義における化学基の列挙の記述は、単一の基としてまたは列挙される基の組合せとしてのその変数の定義を包含する。本明細書での変数または態様についての実施形態の記述は、単一の実施形態としてまたは任意の他の実施形態もしくはその部分との組合せとしてのその実施形態を包含する。

記号

は、分子構造の一部として用いられる場合、単結合またはトランスもしくはシス二重結合を指す。

本明細書で提供する任意の組成物または方法は、本明細書で提供するその他の組成物および方法のいずれかの１またはそれ以上と組み合わせることができる。

医薬組成物および投与経路
本発明の１またはそれ以上の構造的に拘束されたペプチドは、本明細書で提供する障害の治療のための医薬組成物において使用することができる。本明細書で提供する治療方法は、被験者において障害を治療するために選択し、組み合わせることができる、構造的に拘束されたペプチドの組合せを用いて実施できる。例えば、本発明の医薬組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の構造的に拘束されたペプチドを含み得る。構造的に拘束されたペプチドはまた、他の作用物質、例えば抗癌剤または血管新生阻害剤と組み合わせることもできる。

本明細書で使用される場合、本発明の化合物は、医薬的に許容されるその誘導体を包含すると定義される。「医薬的に許容される誘導体」は、受容者に投与したとき、本発明の化合物を提供することができる（直接または間接的に）、本発明の化合物の任意の医薬的に許容される塩、エステル、エステルの塩または他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体は、そのような化合物を哺乳動物に投与した場合、本発明の化合物のバイオアベイラビリティを高める（例えば経口的に投与された化合物が、血液中により容易に吸収される、血清安定性を高めるもしくは化合物のクリアランス率を低下させることを可能にすることによって）、または親種に比べて親化合物の生物学的区画（例えば脳またはリンパ系）への送達を増強するものである。誘導体は、水溶解度または消化管膜を介した能動輸送を高める基が本明細書に記載する式の構造に付加されている誘導体を包含する。

本発明の化合物は、選択的な生物学的特性を高める適切な官能基を付加することによって修飾し得る。そのような修飾は当分野で公知であり、所与の生物学的区画（例えば血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を高める、経口バイオアベイラビリティを高める、注射による投与を可能にするために溶解度を高める、代謝を変化させるおよび排泄の速度を変化させるものを包含する。本発明の化合物の医薬的に許容される塩には、医薬的に許容される無機および有機酸および塩基から誘導されるものが含まれる。適切な酸性塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、本発明の化合物の医薬的に許容される塩は、医薬的に許容される無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。適当な酸塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が含まれる。適切な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびＮ−（アルキル）_４＋塩が含まれる。本発明はまた、本明細書で開示する化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定する。水溶性もしくは油溶性または分散性生成物は、そのような四級化によって得ることができる。

本発明の化合物は、例えば、注射によって、静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内もしくは皮下的に；または経口的、口腔内、鼻内、経粘膜、膣内、頸部、局所的に、眼用調製物中でもしくは吸入によって、約０．００１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、または特定の薬剤の必要条件に従って、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。本明細書における方法は、所望のまたは記述される作用を達成するための有効量の化合物または化合物組成物の投与を企図する。

単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ得る有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定の方法に応じて異なる。典型的な製剤は、約１％から約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有する。あるいは、そのような製剤は約２０％から約８０％の活性化合物を含有する。

上記で言及したものより低いまたは高い用量が必要なこともある。任意の特定の患者についての具体的な用量および治療レジメンは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、併用薬、疾患、状態または症状の重症度および経過、患者の疾患、状態または症状に対する素因、ならびに治療する医師の判断を含む、様々な因子に依存する。

患者の状態が改善したときは、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組合せの維持用量を投与し得る。その後、用量または投与の頻度またはその両方を、症状に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低減し得る。患者は、しかし、疾患症状が再発したときには長期的なベースでの間欠的治療を必要とし得る。

本発明の医薬組成物は、本発明の化合物または医薬的に許容されるその塩、例えば本明細書で提供する障害の予防および／または治療のため、特に癌の予防および／または治療のための１またはそれ以上の治療薬を含む付加的な作用物質、ならびに任意の医薬的に許容される担体、補助剤またはビヒクルを含有する。本発明の選択的な組成物は、本発明の化合物または医薬的に許容されるその塩、および医薬的に許容される担体、補助剤またはビヒクルを含有する。本明細書で説明する組成物は、本明細書で説明する本発明の化合物ならびに、存在する場合は、付加的な治療薬を、癌またはその症状を含む疾患または疾患症状の調節を達成するために有効な量で含有する。

「医薬的に許容される担体または補助剤」という用語は、本発明の化合物と共に患者に投与することができ、ならびに治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与した場合、その薬理学的活性を破壊せずかつ非毒性である担体または補助剤を指す。

本発明の医薬組成物中で使用し得る医薬的に許容される担体、補助剤およびビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型ドラッグデリバリーシステム（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬剤形中で使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）または他の同様の高分子送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン類も、本明細書に記載する式の化合物の送達を増強するために好都合に使用し得る。

本発明の医薬組成物は、例えば経口投与によって経腸的に、吸入スプレーによって、局所的、直腸、鼻内、口腔内、膣または埋め込み式リザーバーによって非経口的に、好ましくは経口もしくは膣投与または注射による投与によって、投与し得る。本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の医薬的に許容される担体、補助剤またはビヒクルを含有し得る。一部の場合、製剤のｐＨは、医薬的に許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を高めるように調整し得る。本明細書で使用される非経口的という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を包含する。

剤形の例には、錠剤、カプレット、軟弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル、カシェ剤、トローチ、ロゼンジ、分散液、坐剤、軟膏、パップ剤（湿布）、ペースト、散剤、包帯、クリーム、硬膏剤、溶液、パッチ、エアロゾル（例えば鼻スプレーまたは吸入器）、ゲル、懸濁液（例えば水性もしくは非水性懸濁液、水中油型乳剤または油中水型乳濁液）、溶液およびエリキシルを含む、患者に経口または粘膜投与するのに適した液体剤形、患者に非経口投与するのに適した液体剤形、ならびに患者に非経口投与するのに適した液体剤形を提供するように再構成できる滅菌固体（例えば結晶性または非晶質固体）が含まれるが、これらに限定されない。

医薬組成物は、滅菌の注射可能な製剤の形態、例えば滅菌の注射可能な水性または油性懸濁液であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０など）および懸濁化剤を使用して、当分野で公知の技術に従って製剤化し得る。滅菌注射可能製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用し得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、マンニトール、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌の不揮発性油が溶媒または懸濁媒として慣例的に使用される。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の不揮発性油を使用し得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型などの天然の医薬的に許容される油と同様に、注射可能製剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは乳剤および／もしくは懸濁液などの医薬的に許容される剤形の製剤化において一般的に使用される同様の分散剤も含有し得る。ＴｗｅｅｎまたはＳｐａｎなどの他の一般的に使用される界面活性剤および／または医薬的に許容される固体、液体もしくは他の剤形の製造において一般的に使用される他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増強剤も製剤化のために使用し得る。

本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、乳剤および水性懸濁液、分散液および溶液を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与し得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体にはラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も、典型的には添加される。カプセル形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤にはラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁液および／または乳剤を経口的に投与する場合は、有効成分を油相に懸濁または溶解することができ、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わせる。所望する場合は、特定の甘味料および／または着香剤および／または着色剤を添加し得る。

本発明の医薬組成物はまた、直腸投与のための坐剤の形態でも投与し得る。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、そのため直腸内で溶けて活性成分を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製できる。そのような物質には、ココアバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は局所的または膣内に投与し得る。医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含む適切な軟膏で製剤化される。本発明の化合物の局所投与のための担体には、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含む適切なローションまたはクリームで製剤化することができる。さらに別の実施形態では、医薬組成物は膣リングとして製剤化される。適切な担体には、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、肛門坐剤製剤によってまたは適切な浣腸製剤中で下部腸管に局所的に適用し得る。局所経皮的なパッチおよびイオン泳動投与も本発明に包含される。

本発明の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与し得る。そのような組成物は、医薬製剤化の分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または当分野で公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。

本発明の組成物が、本明細書に記載する式の化合物と１またはそれ以上の付加的な治療薬または予防薬との組合せを含有する場合、化合物および付加的な作用物質の両方が、単剤療法レジメンで通常投与される用量の約１から１００％、より好ましくは約５から９５％の用量レベルで存在すべきである。付加的な作用物質は、反復投与レジメンの一部として、本発明の化合物とは別途に投与され得る。あるいは、これらの作用物質は、単一組成物中で本発明の化合物と共に混合された、単一剤形の一部であり得る。

投与すべき本発明のペプチドの有効用量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性などのパラメータに対処する当業者に周知の手順を通して決定され得る。

治療有効用量は、患者において症状の改善または生存の延長をもたらすのに十分な化合物の量を指す。そのような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な製薬手順によって判定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を策定する際に使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わない、ＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および用いられる投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用されるいずれの化合物についても、最初は細胞培養アッセイから治療有効用量を推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されたＩＣ_５０（例えば、試験化合物が存在しない場合の量と比較してアッセイによって測定されたＢＣＬ９／β−カテニンタンパク質相互作用の最大半量阻害またはその機能的代替値を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて策定し得る。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または質量分析法（ＭＳ）によって測定し得る。

キット
本発明はまた、最終包装され、ラベル貼付された医薬品または実験用試薬を包含する。この製品は、ガラスバイアルまたは密閉される他の容器などの適切な入れ物または容器中に、使用のための適切な指示書を含む。医薬品は、例えば、１番目の容器に単位剤形中の本発明の化合物、および２番目の容器には注射用の滅菌水または補助剤を含み得る。あるいは、単位剤形は、経口、経皮、鼻内、膣内、子宮頸リングまたは局所送達に適した固体であり得る。

特定の実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、経口、膣内、頸部、局所または皮下送達に適する。したがって、本発明は、各々の送達経路に適した、好ましくは滅菌の、溶液、固体、泡、ゲルを包含する。

任意の医薬品に関して、包装材料および容器は、貯蔵および発送の間、製品の安定性を保護するように設計される。さらに、本発明の製品は、使用のための指示書または問題の疾患もしくは障害をいかにして適切に予防または治療するかに関して医師、技術者もしくは患者にアドバイスする他の情報資料を含む。言い換えると、製品は、実際の用量、観測手順（例えば感染の検出および定量化）および他の観測情報を含むがこれらに限定されない投与レジメンを指示するまたは示唆する指示書を含む。

具体的には、本発明は、箱、ビン、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、薬袋等のような包装材料および前記包装材料内に含まれる少なくとも１つの単位剤形の薬剤を含む製品を提供し、ここで、前記薬剤は本発明の化合物を含有し、および前記包装材料は、前記化合物が、特定の用量を投与し、本明細書で述べる特定の投与レジメンを使用することにより、本明細書で提供する疾患に関連する１またはそれ以上の症状を管理する、治療するおよび／または改善するために使用できることを示す指示手段を含む。

以下の実施例は、単に本発明の様々な態様の説明として提供するものであり、いかなる意味においても本発明を限定すると解釈されるべきではない。

本発明によって治療される障害
ある実施形態では、本発明の安定化されたペプチドによって治療される疾患または障害は、血管新生に関連する。ある実施形態では、疾患は、腫瘍または癌増殖（新生物）、皮膚障害、新生血管形成、炎症性疾患および関節炎疾患、網膜芽細胞腫、類嚢胞黄斑水腫 （ＣＭＥ）、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または眼炎症性疾患から選択される。

様々な実施形態において、本発明の構造的に拘束されたペプチドは、癌幹細胞の化学療法抵抗性および放射線抵抗性（治療抵抗性）を克服するために使用できる。

ある実施形態では、疾患または障害は、腫瘍または癌増殖（新生物）である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、眼の癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、口腔癌、良性および悪性腫瘍、胃癌、肝癌、膵癌、肺癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、脳／ＣＮＳ癌、咽喉癌、多発性骨髄腫、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口腔／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、結節硬化症、血管腫およびリンパ管新生である。

他の実施形態では、疾患または障害は皮膚障害である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、乾癬、ざ瘡、酒さ、いぼ、湿疹、血管腫、リンパ管新生、スタージ・ウェーバー症候群、皮膚の静脈性潰瘍、神経線維腫症および結節硬化症である。

ある実施形態では、疾患または障害は新生血管形成である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過剰装用、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、乾性翼状片角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、フリクテン症、梅毒、ミコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原生動物感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁性角膜溶解、外傷、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン病、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植片拒絶反応、黄斑水腫、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、ミコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、眼陥凹、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー治療後合併症、ルベオーシス（隅角の新生血管形成）に関連する疾患である。

ある実施形態では、疾患または障害は、炎症性疾患および関節炎疾患である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、関節リウマチ、変形性関節症、狼瘡、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、サルコイドーシス、皮膚病変、血管腫、オスラー・ウェーバー・ランデュ病、遺伝性出血性末梢血管拡張症および変形性関節症である。

他の実施形態では、疾患または障害は、真皮、表皮、子宮内膜、網膜、外科創傷、胃腸管、臍帯、肝臓、腎臓、生殖系、リンパ系、中枢神経系、乳房組織、尿路、循環系、骨、筋肉または気道を侵す。

実施例１．ペプチド合成および円二色性
β−カテニンと直接相互作用する、ＢＣＬ９ ＨＤ２ドメインの安定化されたαへリックス（図１６）を作製するため、炭化水素ステープルペプチド（図１４、１５）の合成を以前に記述されているように実施した（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４）；Ｂｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４４６，３６９−８６（２００８）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７，１４０９３−８（２０１０））。ペプチドを、５０ｍｍｏｌ規模で、ＲｉｎｋアミドＡＭ ＬＬ樹脂（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．２ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）を使用してＡｐｅｘ ３９６（Ａａｐｐｔｅｃ）自動ペプチド合成装置で生成した。標準的なＦｍｏｃプロトコールを用いて２０％ピペリジン／ＮＭＰ中で１０分間ずつ２回脱保護し、次にメタノールとジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の対で連続的に洗浄した。組み込まれた非天然アミノ酸を２０％ピペリジン／ＮＭＰ中で１０分間ずつ４回インキュベートして処理し、完全な脱保護を達成した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の０．４Ｍ保存溶液、０．６７Ｍ ２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）および２Ｍ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用してアミノ酸カップリングを実施し、０．２Ｍ活性エステル１ｍＬ（４当量）を生成した。カップリングの頻度およびインキュベーション時間は、標準的な残基については３０分間ずつ２回、オレフィン非天然アミノ酸については４５分間ずつ２回、および非天然アミノ酸に続く残基については４５分間ずつ３回であった。自動合成の完了後、アミノ末端をアセチル化するかまたはＦＩＴＣ誘導体化のためにＦｍｏｃ−β−Ａｌａでキャップした。オレフィンメタセシスによって炭化水素ステープルを作製するため、樹脂に１，２−ジクロロエタン中のビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ベンジリデンルテニウム（ＩＶ）ジクロリド（グラブス第一世代触媒）の１０ｍＭ溶液を充填し、２時間ずつ２回撹拌した。ＦＩＴＣ誘導体化のために、Ｆｍｏｃ−β−ＡｌａをＮＭＰ中のピペリジンで脱保護し、次にジメチルホルムアミド中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびトリエチルアミンと一晩反応させた。ペプチドを樹脂から切断し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９５％、２．５％、２．５％）中で脱保護して、ジエチルエーテル／ヘキサンで沈殿させた。ステープルペプチドを、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって精製し、ＬＣ／ＭＳ（エレクトロスプレーを正イオンモードで使用して得られた質量スペクトル）によって特徴づけて、Ｂｅｃｋｍａｎ ６３００高速アミノ酸分析装置でのアミノ酸分析（ＡＡＡ）によって定量化した。凍結乾燥粉末を１から１０ｍＭで１００％ＤＭＳＯに溶解することによって作業用保存溶液を作製した。ＳＡＨ−ｇｐ４１粉末とＤＭＳＯ溶液を−２０℃で保存した。αへリックス性の測定を以前に記述されているように実施した（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４）；Ｂｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４４６，３６９−８６（２００８））。図１ａ〜１ｃ、１ｇの実験結果参照。

実施例２．タンパク質の生成および精製
組換えヒトＢＣＬ９（２１４〜４９３）を、カルボキシ末端にヘキサヒスチジンタグを含むｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、Ａ６００＝０．６に達するまで３７℃でインキュベートして、その後１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導した。細胞を遠心分離によって採取し、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液中で超音波処理によって溶解させた。次に溶解物を遠心分離し、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）に負荷して、洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾール中で溶出させ、滅菌１×ＰＢＳ中で一晩透析した。ヒトβ−カテニン構築物（例えば残基１〜７８１、１３８〜６８３、２７３〜６８４）をｐＧＥＸ４Ｔ１／ｐＧＥＸ４Ｔ２、ｐＥＴ−２８ａおよびｐＥＴ−２３ａにそれぞれクローニングした。Ｈｉｓタグ融合タンパク質をＢＣＬ９について上述したように生成した。ＧＳＴタグ構築物については、形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃でＡ６００＝０．６まで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧで４時間誘導した。細胞をペレット化し、再懸濁して、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ＭＭ ＮａＣｌ、２０％スクロース、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌアプロチニンおよび０．７ｍｇ／ｍｌペプスタチン）中で超音波処理した。可溶化したタンパク質をグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ＧＥ）に吸着させ、次にこれを２０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ａ中で溶出させて、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＰＢＳ緩衝液に対して透析した。

実施例３．ＧＳＴプルダウンアッセイ
グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ＧＥ）に結合した等量（０．５μＭ）のＨｉｓタグＢＣＬ９およびＧＳＴタグβ−カテニンを、漸増量のＨＤ２またはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドと共にまたはペプチドなしで、最終容量１０００μｌのＰＢＳ中、４℃で１時間インキュベートした。タンパク質複合体を２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してペレット化し、ビーズをＰＢＳ緩衝液で４回洗浄した。次にビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液中に取り、煮沸して、クマシー染色によって結合タンパク質を視覚化するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。

実施例４．患者試料および細胞株
Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ治験審査委員会の承認に基づきＭＭを有する患者から骨髄標本を入手し、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得た。初代ＣＤ１３８＋形質細胞を、記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））磁気ビーズを使用して精製した。ＣＲＣ原発腫瘍試料をＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、この施設の治験審査委員会の方針に従って得た。実験のために十分なＣＲＣ原発腫瘍細胞を生成するため、原発腫瘍を最初にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において皮下的に拡大させた。腫瘍が直径２ｃｍに達した後、マウスを施設のガイドラインに従って犠死させ、皮下腫瘍異種移植片を外科用メスで細分化して、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および０．０１％ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３７℃で３０分間インキュベートして消化し、次いでＳｔｏｍａｃｈｅｒ装置（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いてさらに機械的に解離させた。試料を７０μｍセルストレーナーでろ過し、ＰＢＳで洗浄した。ＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌｏｎｚａ）を用いて赤血球を溶解し、生腫瘍細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって濃縮した。生腫瘍細胞だけを精製するため、試料をＡＰＣ結合抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体（クローンＳＦ１−１．１．１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（クローンＢｅｒ−ＥＰ４，Ｄａｋｏ）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、次にＦＡＣＳＡｒｉａフローソーティング（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｐＣＡＭ陽性、Ｈ−２Ｋｄ陰性およびＨｏｅｃｈｓｔ陰性原発腫瘍細胞を単離した。培養した細胞株を以前に記述されているように（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））維持した。図３ｂ、３ｄの結果参照。

実施例５．免疫ブロット法および共免疫沈降法
記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））実施したウェスタンブロット法は、以下の一次抗体を使用した：ＢＣＬ９（６１０９）（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））、ＢＣＬ９（ａｂ３７３０５、Ａｂｃａｍ）、Ｂ９Ｌ（ＡＦ４９６７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、β−カテニン（ＣＡＴ５−Ｈ１０、Ｚｙｍｅｄ）、ＦＩＴＣ（ａｂ１９２２４、Ａｂｃａｍ）、アクチン−ＨＲＰ（Ｃ−１１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、カスパーゼ３（Ｎｏ．９６６２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ΙκΒα（Ｎｏ．９２４２、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＡＲＰ（Ｎｏ．９５４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｅ−カドヘリン（Ｎｏ．３１９５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびラミンＢ（ｓｃ−６２１７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体をＳａｎｔａ ＣｒｕｚおよびＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈより購入した。共免疫沈降法を記述されているように（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））実施した。簡単に述べると、細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ ＣＨＡＰＳ緩衝液中で溶解させた。溶解物をプロテインＡ／Ｇ ＰＬＵＳ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３時間前除去し、次いでそれぞれの抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次にアガロースＡ／Ｇビーズを４時間添加し、ペレット化して、記述されているように（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））洗浄した。図１ｄ、１ｈ、２ａ、８の結果参照。

実施例６．ＳＡＨ−ＢＣＬ９細胞取込みおよび局在化分析
蛍光顕微鏡検査による評価のために、集細胞遠心装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いて細胞を調製し、以前に記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７）；Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））固定した。抗β−カテニンおよびローダミン結合二次抗体（５μｇ／ｍｌ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。ＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて画像を得た。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）の細胞透過性を、上述したステープルペプチドの ＦＩＴＣ誘導体で処理した細胞の蛍光顕微鏡検査によって、およびまた以前に記述されているように（Ｐｉｔｔｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，４４６，（２００８），３８７−４０８；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））実施したブロット法／蛍光走査によって測定した。図１ｅ、７の結果参照。

実施例７．組織病理学的分析および免疫組織化学
組織切片を記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））処理した。切片を一次抗体（５μｇ／ｍｌ）または免疫前血清の対応するＩｇＧ画分と共にブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中４℃で一晩インキュベートした。ＢＣＬ９抗体（ａｂ３７３０５、Ａｂｃａｍ）、マウスＣＤ３４抗体（ＲＡＭ３４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトＣＤ３４抗体（Ｍ７１６５、Ｄａｋｏ）およびヒトＣＤ４４Ｈ抗体（２Ｃ５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＣＲＣおよびＭＭモデルにおける血管形成を、それぞれ抗マウスＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体ならびにストレプトアビジンペルオキシダーゼに結合した対応するビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して評価した。ＣＤ３４染色（褐色）によって強調した５０ｘ倍率での５つの無作為に選択した視野において独立した血管の平均数を数えることによって血管の数を決定した。図４ｂ、４ｅ、４ｉおよび６の結果参照。

実施例８．定量的逆転写ＰＣＲ
製造者のプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いてｑＰＣＲを実施した。標的遺伝子の分析を、ＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を先に述べたプライマーセットと共に使用して四重に実施した。転写産物レベルをβ−アクチン発現に規準化した。これらの実験を３回反復した。図２ｂ、２ｃの結果参照。

実施例９．遺伝子発現プロファイリング
ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）で処理した細胞からのＲＮＡを、記述されているように（Ｍｏｌｌｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６２，１８２−８（２００９））Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ ２．０アレイチップ上で移動させた。統計解析をＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）において実施した。アレイデータを、Ａｆｆｙパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．Ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／２．６／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ａｆｆｙ．ｈｔｍｌ）で実行されるようにｒｍａ法（Ｂｏｌｓｔａｄ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９，１８５−９３（２００３））で基準化し、ＬＩＭＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．Ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／２．６／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ｌｉｍｍａ．ｈｔｍｌ）により一般値へと向かう標準誤差の経験的ベイズ収縮を用いて区別的発現を算定した（ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｄ．Ｊ．＆Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，７６５−７１（２００９）；Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．Ｓｔａｔ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３，Ａｒｔｉｃｌｅ３（２００４））。遺伝子セットの濃縮分析を、ＧＳＥＡソフトウェア（バージョン２．０６）およびｍＳｉｇＤＢ（バージョン２．５）を用いて実施した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２，１５５４５−５０（２００５））。

実施例１０．細胞増殖、生存能アッセイおよびアポトーシスの検出
細胞増殖アッセイを記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って使用して細胞生存能を測定した。アポトーシスは、活性化カスパーゼ３およびＰＡＲＰウェスタンブロット法によって評価した。図３ａ〜ｆ、１３および２０の結果参照。

実施例１１．血管新生および浸潤アッセイ
血管新生を、インビトロ血管新生アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して以前に記述されているように（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））評価した。毛細管形成分析のために、ＨＵＶＥＣを重合マトリックスゲル上で培養し、ビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチド（５μΜ）で２４時間処理したＣｏｌｏ３２０またはＭＭ１Ｓ細胞から収集した上清培地に曝露した。３７℃で５時間の処理後に形成された毛細管の数を、製造者の指示に従って４０ｘ倍率で５つの無作為に選択した視野を数えることによって測定した。ＶＥＧＦ培地およびＶＥＧＦ不含培地で培養したＨＵＶＥＣをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。細胞浸潤アッセイは、記述されているように（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））Ｍａｔｒｉｇｅｌボイデンチャンバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。報告するデータは、三重に実施した３つの独立した実験の平均である。図３ｈ〜３ｉの結果参照。

実施例１２．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂのインビボ抗腫瘍作用（異種移植モデル）
ＧＦＰ陽性Ｃｏｌｏ３２０細胞を、以前に報告されているように（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））作製した。細胞をペレット化し、滅菌１×ＰＢＳに再懸濁して、５週齢の致死量以下に照射したＮＯＤ．ＣＢ１７−ＰｒｋｄｃＳＣＩＤ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（コホートにつきｎ＝６）に腹腔内注射した（１×１０^６細胞／マウス）。細胞接種の２日後、マウスを１日おきに合計６回投与にわたってビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により処置した。腫瘍細胞注射の４０日後、マウスを安楽死させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ−４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＧＦＰ陽性腫瘍を視覚化した。各々の実験動物について完全な剖検を実施し、腫瘍転移の定量化のために肝臓全体を５ｍｍ間隔で切片化した。組織をＨ＆Ｅ染色および抗ＣＤ３４および抗ＣＤ４４抗体を使用した免疫組織化学分析に供した。

ヒトＭＭのＳＣＩＤ−ｈｕマウスモデルのために、１．５×０．５ｃｍと測定されるヒト胎児骨移植片を、以前に記述されているように（Ｔａｓｓｏｎｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０６，７１３−６（２００５））８週齢の雄性ＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に皮下移植した。骨移植の４週間後、５×１０^６ＧＦＰ陽性ＩΝΑ−６ ＭＭ細胞を各骨移植片に直接注入した。２日後、マウスを１日おきに合計１０回投与にわたって、骨片に隣接して注入したビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）１０００μｌの注射により処置した。マウス血清をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）によってｓｈｕＩＬ−６Ｒレベルに関して連続的に観測した。腫瘍細胞注入の３３日後、マウスを犠死させ、骨移植片の蛍光イメージングおよび組織学的分析によって腫瘍量を分析した。図４ａ〜ｉの結果参照。加えて、マウスから得た試料に関してＴＵＮＥＬ染色を実施した。結果は、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴ処置マウスと比較してＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処置した動物ではアポトーシス腫瘍細胞の増加が存在することを明らかにした。図２２および２３の結果参照。すべての動物実験は、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物実験委員会の承認済みプロトコールに従って実施した。

実施例１３．Ｗｎｔレポーター活性へのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂのインビボ作用
ＨＣＴ１１６細胞にｐＯＴ−Ｌｕｃプラスミドまたは対照ＵｂＣ−Ｌｕｃプラスミドをトランスフェクトした。ＨＣＴ１１６−ｐＯＴ−Ｌｕｃ細胞をマウス（ｎ＝２）の左側腹部に移植し、および構成的ＵｂＣ−Ｌｕｃ対照細胞を右側腹部に移植した。動物に基線イメージングを行い、次いでＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）を注射して、指示されている時点で連続的に画像撮影した。ｐＯＴ−Ｌｕｃレポーター活性をＵｂＣ−Ｌｕｃ活性に基準化した。図９の結果参照。

実施例１４．ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
以前に記述されているように（Ｍａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７−８６（２００９））ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡを実施した。簡単に述べると、細胞（１×１０^６）をビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド（５μΜ）で２４時間処理した。次に上清中のＶＥＧＦレベルを製造者のＥＬＩＳＡプロトコール（ＤｕｏＳｅｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って測定した。

実施例１５．クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
抗体（３μｇ）をプロテインＡおよびプロテインＧ Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に８時間、前結合させ、５％ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳで５回洗浄して、次に以下の抗体を使用した一晩免疫沈降のために希釈したクロマチンに添加した：ＴＣＦ−４（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｎｏ．０５−５１１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５４０９）およびウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。磁気ビーズ−クロマチン複合体を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５Ｍ ＬｉＣｌ）中で６回洗浄した。ＤＮＡを以前に記述されているように（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｃｅｌｌ １２７，４６９−８０（２００６））ビーズから溶出させた。９４℃で５分の初期変性後、以下の温度および時間プロフィールを使用した３０サイクルのＰＣＲにより、ＰＴＣ−２００プログラマブルサーマルコントローラ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で増幅を実施した：９４℃、０．５分の変性、５９℃、０．５分のプライマーアニーリング、７２℃、０．５分のプライマー伸長および７２℃、１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物を２％ゲル電気泳動によって視覚化した。以下のプロモータープライマーセットを使用した：（１）ＶＥＧＦ：Ｆ（順方向）：５’−ｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇａｃａｇａｇｔｔｔ−３’およびＲ（逆方向）：５’−ａｇｃｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｃｃａｃａ−３’；（２）ＶＥＧＦ上流：Ｆ：５’−ｇａｇｇｃｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔａｇｇ−３’およびＲ：５’−ｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｃｃａａｃｔｃｔｃｃ−３’；（３）ｃ−Ｍｙｃ：Ｆ：５’−ａｃｔｃｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｇｔｃｃａｃａａｇｃ−３’およびＲ：５’−ｃｃｃａａｔｔｔｃｔｃａｇｃｃａｇｇｔｔｔｃａｇ−３’（Ｋｌａｕｓ，Ａ．＆ Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｗ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８，３８７−９８（２００８））。図１１ａの結果参照。

実施例１６．ＶＥＧＦプロモータールシフェラーゼアッセイ
ＶＥＧＦプロモーター駆動性ルシフェラーゼ構築物（２．６ｋｂ）は、Ｓｏｕｍｉｔｒｏ Ｐａｌ（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＢｏｓｔｏｎおよびＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の好意により提供された（Ｂａｓｕ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８，５６８９−９８（２００８））。ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞にＶＥＧＦルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトし、以前に記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。図１１ｂの結果参照。

実施例１７．レンチウイルスベクター
７つのＴＣＦ／ＬＥＦ−１結合モチーフおよび脱安定化されたＧＦＰ発現を駆動する最小プロモーターを含むレンチウイルスレポーターベクター（７ｘＴｄＧ）を、３つのＴＣＦ／ＬＥＦ−１結合モチーフを含むレンチウイルスベクターＴＯＰ−ｄＧＦＰから誘導した（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））。Ｘｂａ１制限部位にアニーリングするための適合性突出末端を作製するために、４つのＴＣＦ／ＬＥＦ−１結合モチーフ（ＧＡＴＣＡＡＡＧＧ）を含む２つの合成相補的オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ−ＤＮＡ）を設計した。オリゴヌクレオチドを９５℃に加熱し、室温まで緩やかに冷却することによってアニーリングして、次にＸｂａ１で直線化したＴＯＰ−ｄＧＦＰベクターに連結し、７ｘＴｄＧを生成した。７つのＦＯＰ部位を担持する対照ベクター（７ｘＦｄＧ）を構築するため、Ｘｍａ１およびＡｇｅ１で制限消化することによって７ｘＴＯＰカセットを７ｘＴｄＧベクターから除去した。７つのＦＯＰ部位を担持するが、さもなければ除去された７ｘＴＯＰカセットと同一である合成カセット（ＧＧＣＣＡＡＡＧＧ）を挿入し、７ｘＦｄＧを生成した。ＢＣＬ９ ｓｈＲＮＡおよび対照ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターを、報告されているように（Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３−３００（２００６））作製した。図１０、１１ｂの結果参照。

実施例１８．レンチウイルスの生成および感染
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの組織培養皿に塗布し、製造者のプロトコールに従ってＬｉｐｏＤ２９３（Ｓｉｇｎａｇｅｎ）６０μＬを使用してレンチウイルスベクター１０μｇ（７ｘＴｄＧまたは７ｘＦｄＧのいずれか）、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１ １０μｇおよびｐＭＤ２．Ｇ ２μｇ（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１９９６）を同時トランスフェクトした。培地を１２時間後にＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含む３０％ＦＣＳと交換し、３６時間順化させた。次に順化培地を０．４５μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、新鮮ＤＭＥＭと１：１混合して、その後、培養したＣｏｌｏ３２０（ＡＴＣＣ）細胞の感染のために直接使用した。感染の効率を高めるためにポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を８μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ノックダウンＢＣＬ９発現物へのレンチウイルスｓｈＲＮＡ感染を以前に記述されているように（Ｌｏｇａｎ，Ｃ．Ｙ．＆ Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２０，７８１−８１０（２００４））実施した。簡単に述べると、組換えＢＣＬ９ ｓｈＲＮＡおよび対照レンチウイルスを２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。Ｃｏｌｏ３２０にポリブレンを含むウイルス上清で形質導入し、ＧＦＰ発現細胞をＦＡＣＳによって選別した。図１０、１１ｂの結果参照。

実施例１９．単細胞培養物の樹立
Ｃｏｌｏ３２０細胞を７ｘＴｄＧまたは７ｘＦｄＧレンチウイルスによる７２時間の感染に供し、形質導入した細胞と対照非形質導入細胞をトリプシン処理して、洗浄し、次にＦＡＣＳａｒｉａフローソーターで分析した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８染色を使用して死細胞を除外した。単一ＧＦＰ陽性Ｃｏｌｏ３２０−７ｘＴｄＧ細胞を、二重項を排除するために前方／側方散乱の高さおよび幅に関する厳密なゲーティングを使用して９６穴プレートに選別した。選別後、ウェル当たりの単細胞の存在を顕微鏡で確認し、次に単細胞培養物をその後の使用のために増殖させた。図１１ｂの結果参照。

実施例２０．クロマチン免疫沈降
抗体（３μｇ）をプロテインＡおよびプロテインＧ Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に８時間、前結合させ、５％ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳで５回洗浄して、次に以下の抗体を使用した一晩免疫沈降のために希釈したクロマチンに添加した：ＴＣＦ−４（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｎｏ．０５−５１１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５４０９）およびウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。磁気ビーズ−クロマチン複合体を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５Ｍ ＬｉＣｌ）中で６回洗浄した。ＤＮＡを以前に記述されているように（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｃｅｌｌ １２７，４６９−８０（２００６））ビーズから溶出させた。９４℃で５分の初期変性後、以下の温度および時間プロフィールを使用した３０サイクルのＰＣＲにより、ＰＴＣ−２００プログラマブルサーマルコントローラ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で増幅を実施した：９４℃、０．５分の変性、５９℃、０．５分のプライマーアニーリング、７２℃、０．５分のプライマー伸長および７２℃、１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物を２％ゲル電気泳動によって視覚化した。以下のプロモータープライマーセットを使用した：（１）ＶＥＧＦ^Ｂ：Ｆ（順方向）：５’−ｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇａｃａｇａｇｔｔｔ−３’およびＲ（逆方向）：５’−ａｇｃｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｃｃａｃａ−３’；（２）ＶＥＧＦ上流：Ｆ：５’−ｇａｇｇｃｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔａｇｇ−３’およびＲ：５’−ｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｃｃａａｃｔｃｔｃｃ−３’；（３）ｃ−Ｍｙｃ：Ｆ：５’−ａｃｔｃｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｇｔｃｃａｃａａｇｃ−３’およびＲ：５’−ｃｃｃａａｔｔｔｃｔｃａｇｃｃａｇｇｔｔｔｃａｇ−３’。図１１ａの結果参照。

実施例２１．レポーターアッセイ
以前に記述されているように（Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，７５１６−２１（２００７））Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。ＷｎｔまたはＮＦκＢレポーター活性を測定するため、Ｃｏｌｏ３２０細胞にＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ、ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨプラスミド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＮＦκＢルシフェラーゼレポーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、内部ウミシイタケ対照プラスミド（ｈＲＬ−ｎｕｌｌ）と共にトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者のプロトコールに従って使用してトランスフェクションを実施した。結果を対照ウミシイタケ活性に規準化した。報告するデータは、三重に実施した３つの独立したトランスフェクション実験の平均である。図９、１０の結果参照。

実施例２２．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢによるＢＣＬ９／β−カテニン複合体の選択的解離
ＥＬＩＳＡによって結合を評価するため、グルタチオンマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ウェルにつきＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）１００μＬ中の組換えＧＳＴ−β−カテニン５０ｎｇと共に３７℃で１時間インキュベートして回転させ（２００ｒｐｍ）、次いでＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０による４サイクルの自動プレート洗浄に供した。ＥＬＩＳＡ緩衝液中のＦＩＴＣ結合ペプチドの２倍段階希釈物を別の９６穴プレートにおいて調製し、β−カテニン結合プレートに移した（１００μＬ）。実験プレートを３７℃で２時間インキュベートし（２００ｒｐｍ）、自動プレート洗浄に供して、次にＥＬＩＳＡ緩衝液中の抗ＦＩＴＣ結合ＨＲＰの１：７５００希釈物１００μＬを各ウェルに移して、３７℃でさらに１時間インキュベートし（２００ｒｐｍ）、次いで自動プレート洗浄を行った。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液５０μＬを添加することによってウェルを発色させ、室温で２０分間インキュベートして、その後２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ ５０μＬで反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍの吸光度を読み取り、結合等温線をプロットして、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた非線形回帰分析によってＥＣ_５０値を決定した。結合アッセイを三重に実施し、新鮮調製した組換えタンパク質を用いて少なくとも２回反復した。天然β−カテニンを免疫沈降させるＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴ（ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ））の能力低下と一致して（図１Ｈ参照）、Ｒ３５９Ｅ点突然変異誘発は組換えβ−カテニンタンパク質への直接結合活性の５倍低下を生じさせた。図１７Ａの結果参照。

Ｗｎｔシグナル伝達の遮断のために必要な生物学的活性である、あらかじめ形成したＢＣＬ９／β−カテニン複合体を破壊するＳＡＨ−ＢＣＬ９の能力を評価するため、カルボキシ末端にヘキサヒスチジンタグを含むｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクターにクローニングした組換えヒトＢＣＬ９（残基２４３〜４６９）（Ｈｉｓ−ＢＣＬ９）およびアミノ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターにクローニングした完全長ヒトβ−カテニン（組換えＧＳＴ−β−カテニン）を発現させ、以前に報告されているように（Ｊ．Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３（２００６））精製した。グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ＧＥ）に結合したＧＳＴタグβ−カテニン及び等量（１ｎＭ）のＨｉｓタグＢＣＬ９を、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４［ｐＨ７．４］、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および４％ＤＭＳＯ）中４℃で一晩インキュベートした。ビーズに固定化したＧＳＴタグβ−カテニンに結合したＨｉｓタグＢＣＬ９の複合体を遠心分離によって単離し、アッセイ緩衝液１ｍＬに再懸濁して、スラリー５０μＬをアッセイ緩衝液５００μｌ中のＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴ（ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ））の存在下または不在下に室温で２時間インキュベートした。グルタチオンビーズ結合タンパク質を遠心分離によって２回洗浄し、溶出させて、ゲル電気泳動によって分離した。ＧＳＴ−β−カテニンをクマシーブルー染色によって検出し、保持されるＨｉｓ−ＢＣＬ９の存在を免疫ブロット分析（抗Ｈｉｓ ２３６５５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって検出して、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｍｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いて定量化した。実験を３回反復し、同様の結果を得た。結果は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂが１３５ｎＭのＩＣ_５０で複合体を用量応答的に解離することができ、一方単一点突然変異誘発は活性を６倍低下させることを明らかにした。図１７Ｂの結果参照。

実施例２３．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＷｎｔの転写活性を阻害する
Ｃｏｌｏ３２０（図１８）およびＭＭ１Ｓ（図１９）細胞株において、ＶＥＧＦを含むＷｎｔ／β−カテニン標的遺伝子の発現へのビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴの作用を測定するため、定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を実施した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って使用してＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いてｑＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーを以下のように設計した：

標的遺伝子の分析を、以前に報告されているように（Ｍ．Ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，７５７７（２００９））ＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して四重に実施した。転写産物レベルをβ−アクチン発現に規準化した。これらの実験を３回反復した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂでの処理は、ＶＥＧＦ、ｃ−ＭＹＣ、ＬＧＲ５、ＬＥＦ１およびアキシン２のｍＲＮＡレベルを用量応答的に低下させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴによる処理はｍＲＮＡレベルを低下させなかった（図１８Ａおよび１９Ａ）。非Ｗｎｔ経路標的遺伝子であるアクチンをＣｏｌｏ３２０細胞における対照標準として使用し、アクチンはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理に応答した変化を示さなかった（図１８Ａ）。Ｗｎｔ標的遺伝子転写の細胞特異性と一致して、ＬＧＲ５はＣｏｌｏ３２０細胞において低下したが、ＭＭ１Ｓ細胞では低下しなかった。

Ｗｎｔ転写活性をブロックするうえでのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの特異性をさらに検討するため、Ｗｎｔ転写経路シグネチャーが記述されている（Ｌ．Ｇ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３２，６２８（２００７））、ＤＬＤ１結腸癌細胞株におけるＷｎｔ標的遺伝子の比較全ゲノム発現分析を実施した。３組のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理およびビヒクル処理したＤＬＤ１試料（各々１０μΜで１２時間）からのＲＮＡを遺伝子発現プロファイリング分析のために単離した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイを、ａｆｆｙ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）の機能を利用して処理した。遺伝子セットをＶａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．から収集し、遺伝子セットの濃縮および統計解析を、ＧＳＥＡソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＳＥＡ）および両側ｔ検定をそれぞれ使用して実施した。マイクロアレイデータをＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）に寄託し、ＭＩＡＭＥ注釈基準に従った。

Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して作製したＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理およびビヒクル処理ＤＬＤ１からの３組のデータセットを、誘導的ドミナントネガティブ形態のＴＣＦ１およびＴＣＦ４を担持するＤＬＤ１細胞からの公開されている遺伝子発現データ（Ｌ．Ｇ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３２，６２８（２００７））と比較した。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、腺腫（図１８Ｂ、ファミリーワイズエラー率（ＦＷＥＲ）ｐ値＜０．００１；偽発見率（ＦＤＲ）ｑ値＜０．００１）および癌腫（図１８Ｃ、ＦＷＥＲおよびＦＤＲ＜０．０１）の両方においてＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによって下方調節される遺伝子とドミナントネガティブ形態のＴＣＦ１およびＴＣＦ４との間で強い、統計的に有意の相関を明らかにし、Ｗｎｔ転写経路をブロックするうえでのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの特異性を強調した。堅固で特異的なＷｎｔ標的遺伝子（３）であるアキシン２は、細胞転移（ＣＤ４４、ＣＬＤＮ２）、細胞増殖（サイクリンＡ２、ＣＤＫ４）およびＥＭＴ（ＦＯＸＱ１）に関与する他のＷｎｔ標的に加えて、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理によって最も下方調節される遺伝子の１つであった（図１８Ｄおよび１８Ｅ）。次にこれらの所見をｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図１８Ｆ）。ＶＥＧＦ−Ａは、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処理した細胞において下方調節される遺伝子の１つであり（図１８Ｆおよび１９）、β−カテニン／ＢＣＬ９複合体を腫瘍誘導性血管新生に関連付けた。

実施例２４．併用療法
ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの抗増殖作用がＭＭまたはＣＲＣを治療するために一般的に使用される他の作用物質と相乗的に作用し得るかどうかを調べるため、併用治療試験を実施した。実際に、ＣＲＣ細胞への５−フルオロウラシルの細胞傷害作用およびＭＭ細胞へのドキソルビシンの細胞傷害作用がＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによって増強されたが、ビヒクルまたは突然変異体ペプチドによっては増強されなかった。図２１の結果参照。

参考文献の組込み
本出願全体にわたって引用されるすべての参考文献（文献、発行済み特許、公開特許出願、同時係属特許出願およびＧｅｎＢａｎｋ番号を含む）の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者に一般的に知られる意味を与えられる。

等価物
当業者は、本明細書で述べる本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、日常的な実験だ系を使用して認識するまたは確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの設計、合成および特性付け。ａ．β−カテニンの表面溝に直接係合する、ＢＣＬ９のαへリックスＨＤ２ドメインは、炭化水素ステープリングによって鋳型に構造的安定化をもたらした。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９ Ａ〜Ｃ（それぞれ、配列番号３〜５）を、ＨＤ２ドメインの非相互作用表面上の天然残基を、オレフィンメタセシス反応に供された場合対応するステープルペプチドを生じる、オレフィン非天然アミノ酸で置換することによって作製した。修飾されていない鋳型ペプチド（ＢＣＬ９ ＨＤ２（配列番号１））も作製した。ｃ．ＣＤ分析は、非修飾鋳型ペプチドと比較してＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの著明なαへリックス安定化を明らかにした。ｄ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびβ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）は、抗ＦＩＴＣおよび抗β−カテニンプルダウンアッセイの両方により、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９処理したＣｏｌｏ３２０細胞の溶解物から共沈した。ＴＣＬ、全細胞溶解物。ｅ〜ｆ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂおよびβ−カテニンのどちらも、共焦点顕微鏡検査および細胞分画分析によって観測されたようにＣｏｌｏ３２０細胞の核に選択的に局在する。ｇ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢのＨ３５８ＤおよびＲ３５９Ｅ逆極性突然変異体は、ＣＤ分析により、野生型ＳＡＨと比較して同様の高いパーセントのαへリックス性を示した。ｈ．点突然変異誘発はＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９／β−カテニンの共免疫沈降を低減させ、Ｒ３５９Ｅ誘導体は最も有効な陰性対照として働いた。ｉ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびそのＲ３５９Ｅ対照は、Ｃｏｌｏ３２０による用量当量の細胞取込みを示す。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは天然のβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体を破壊し、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写を抑制する。ａ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＢＣＬ９およびＢ９Ｌとβ−カテニンの結合を用量応答的に阻止したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）による細胞処理は影響を及ぼさなかった。ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌからのβ−カテニンの解離は、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂとβ−カテニンの共免疫沈降と相関した。ｂ．Ｃｏｌｏ３２０細胞にＴＯＰ−ＦＬＡＳＨをトランスフェクトし、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドと共にインキュベートして、ルシフェラーゼ活性に関して検定し、それをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照に基準化した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＷｎｔ依存性レポーター活性を阻害したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は阻害しなかった。誤差バーは、三重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。ｃ．ｑＰＣＲ分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃおよびアキシン２の抑制を明らかにしたが、ＧＡＰＤＨの抑制は示さなかった。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は影響を及ぼさなかった。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは細胞の増殖、血管新生および移動をブロックする。ａ〜ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理は、２４時間目に［^３Ｈ］チミジン取込みによって観測されたように、Ｃｏｌｏ３２０および結腸直腸原発腫瘍（ＣＣＰＴ）の増殖を低減した。^＊、Ｐ＜０．０１。ｃ〜ｄ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、Ｗｎｔ３Ａ順化培地（Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ）および多発性骨髄腫原発腫瘍（ＭＭＰＴ）の存在下または不在下でＭＭ１Ｓ細胞の増殖を同様に低下させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は低下させなかった。^＊、Ｐ＜０．０１。ｅ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、７２時間目にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって評価したときＣｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞の生存能に影響を及ぼさなかった。ｆ．それに対応して、ウェスタン分析によって観測されたように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはカスパーゼ３またはＰＡＲＰを活性化しなかった。ｇ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理は、ＥＬＩＳＡによって測定されたようにＣｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞によるＶＥＧＦ分泌を低下させた。^＊、Ｐ＜０．００１。ｈ．ＨＵＶＥＣを、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドと共にインキュベートしたＣｏｌｏ３２０またはＭＭ１Ｓ細胞から収集した上清で培養し、５時間目に高倍率視野当たりに形成された管（黒色の矢印）の数を顕微鏡検査によって分析した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはインビトロで毛細管様の管形成をブロックした。^＊、Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）。ｉ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、マトリゲルボイデンチャンバーを使用して観測されたようにＣｏｌｏ３２０細胞の移動をブロックした。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）は影響を及ぼさなかった。^＊、Ｐ＜０．０１。ビヒクル、０．５％ＤＭＳＯ；ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド、５μΜ。誤差バーは、三重に実施した実験についての平均±標準偏差である。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはインビボで腫瘍の増殖、血管新生および転移を阻害する。ａ．腹腔内ＧＦＰ陽性Ｃｏｌｏ３２０細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのコホート（ｎ＝６）を、ビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに合計６回にわたって腹腔内投与して処置した。全身イメージングおよび剖検は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処置したマウスにおける腫瘍量および肝転移の減少を明らかにしたが、ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置動物では減少を示さなかった。ｂ．肝臓の組織学的分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスにおける腫瘍浸潤およびＣＤ４４陽性率の低下を明らかにした。ｃ．各実験群（ｎ＝６）についての実質内結節の総数は、５ｍｍ間隔で肝切片を検査することによって定量化した場合、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスにおいて著明に減少した。誤差バーは平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０１。ｄ〜ｅ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置は、腫瘍血管定量および抗ＣＤ３４免疫染色によって評価した場合、同様に血管新生を阻害した。誤差バーは平均±標準偏差である。^＊、Ｐ＜０．０００１（ｎ＝６）。ｆ〜ｇ．ＧＦＰ陽性ＩＮＡ−６細胞が存在するヒト骨片を担持するＳＣＩＤ−ｈｕマウスのコホート（ｎ＝５）に、一日おきに合計１０分回用量にわたってビヒクル（Ｄ５Ｗ中２．５％ＤＭＳＯ）またはＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を局所的に注入した。腫瘍量を、腫瘍細胞の注入後の指示されている日にｓｈｕＩＬ−６Ｒ血清レベルによって（ｆ）、および３３日目に犠死させた後に蛍光全身イメージングによって（ｇ）評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置は、骨片蛍光の低下に反映されたように、ｓｈｕＩＬ−６Ｒ産生および腫瘍量を有意に抑制した。ｈ．組織学的分析は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの骨片中のＩＮＡ−６細胞の実質的な低減を明らかにし、腫瘍細胞は骨に限局された。ビヒクルおよびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処置マウスでは、腫瘍細胞は骨片の外側に移動し、隣接する軟組織（黒色の矢印）を浸潤した。ｉ．血管定量および抗ＣＤ３４免疫染色によって観測されたように、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスでは腫瘍内血管新生が抑制された。 ＢＣＬ９の安定化されたαへリックスを使用した、癌におけるＷｎｔ転写活性の標的化。調節解除されたＷｎｔシグナル伝達は広範囲のヒト癌の病因の基礎となるが、経路を破壊する標的化療法の開発はいまだ課題のままである。β−カテニンは古典的Ｗｎｔ経路の中心的エフェクターであり、細胞の増殖、移動および血管新生に関与するｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＶＥＧＦおよびＣＤ４４などの遺伝子の発現を活性化する。ＢＣＬ９はβ−カテニン媒介性転写のための重要なコアクチベータであり、腫瘍において高発現されるが起源細胞では高発現されず、病的β−カテニン活性を選択的に阻害する可能性を提示する。ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の構造を手引きとして、ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の標的化破壊を通して癌におけるＷｎｔシグナル伝達をブロックするためにＢＣＬ９の安定化されたαへリックス（ＳＡＨ−ＢＣＬ９）を作製した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９はＷｎｔ転写活性およびＷｎｔ／β−カテニン転写標的の発現を低下させ、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞の増殖、移動、浸潤および血管新生を妨げた。 ＢＣＬ９は広範囲の腫瘍において過剰発現される。ａ．結腸癌（ｎ＝２３）、乳癌（ｎ＝２２）、肺癌（ｎ＝３２）、肝癌（ｎ＝２９）および卵巣癌（ｎ＝３２）からの組織マイクロアレイに関して実施した免疫組織化学試験は、多種多様な腫瘍における高レベルのＢＣＬ９発現を明らかにした。高レベルまたは低レベルのＢＣＬ９免疫染色を有する腫瘍の代表的な例を示す。ｂ．免疫化ＢＣＬ９ペプチド（Ａｂｃａｍ）を使用したブロッキング実験を製造者のプロトコールに従ってヒト結腸直腸癌標本に関して実施し、ＢＣＬ９抗体の特異性を明らかにした。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドの同等の細胞取込み。ａ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチドは、ステープルペプチドに関して以前に実証されたエネルギー依存性エンドサイトーシス取込み機構と一致して（Ｂｅｒｎａｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２９，２４５６−７（２００７）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４６６−７０（２００４））、Ｃｏｌｏ３２０細胞において同等の温度依存性取込みを示す。ｂ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢおよびＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）ペプチドは、Ｃｏｌｏ３２０およびＭＭ１Ｓ細胞による同等の細胞取込みを示す。 ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニンに選択的に係合し、非ＢＣＬ９結合パートナーとのその相互作用を妨げない。ａ．重要な点として、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン標的化はＢＣＬ９／β−カテニン複合体の破壊に選択的であり、ＭＣＦ７細胞溶解物からのＥ−カドヘリンの抗β−カテニン共免疫沈降には影響を及ぼさない。ｂ．ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢでのＭＣＦ７細胞の処理、次いで細胞溶解物に関して実施した抗ＦＩＴＣプルダウンは、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂとβ−カテニンとの間の選択的相互作用を明らかし、ＩκＢαおよびアクチンなどの無関係なタンパク質の共免疫沈降を示さなかった。ＳＡＨ−ＢＣＬ９結合界面の単一Ｒ３５９Ｅ点突然変異誘発はβ−カテニンの共免疫沈降を排除し、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂペプチドの特異性をさらに確認した。ＭＣＦ７細胞は容易に検出可能なレベルのＥ−カドヘリンタンパク質を含むので、β−カテニン／Ｅ−カドヘリン相互作用を観測するためにＭＣＦ７細胞をこのアッセイで使用した。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるβ−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写の抑制はＢＣＬ９の発現上昇によって用量応答的に逆転される。ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨおよびｐｃＤＮＡ−ＢＣＬ９をトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞をビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチド（５μΜ）で処理し、２４時間目にデュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによるレポーター活性の抑制は、ＢＣＬ９タンパク質発現を上昇させることにより用量応答的に逆転され、β−カテニン／ＢＣＬ９駆動性転写のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂに基づく阻害の的確な特異性を強調した。^＊Ｐ＜０．０１。ＨＣＴ１１６細胞を、その比較的低いレベルの内因性ＢＣＬ９発現のゆえにこのアッセイで使用した。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢによるＷｎｔ特異的転写レポーター活性の阻害。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、Ｃｏｌｏ３２０細胞においてＴＣＦ調節配列（７ｘＴｄＧ）の転写制御下でｄＧＦＰ発現を用量応答的にブロックした。これに対し、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）での処理は皆無かそれに近い影響しか及ぼさなかった。 ＶＥＧＦはＢＣＬ９の直接の転写標的である。ａ．抗ＴＣＦ−４、β−カテニンおよびＢＣＬ９抗体を使用したＣｏｌｏ３２０細胞のクロマチン免疫沈降分析（ＣｈＩＰ）は、ｃ−Ｍｙｃと同様に、ＶＥＧＦプロモーターがＷｎｔ／β−カテニン／ＢＣＬ９転写複合体の標的であることを明らかにした。陰性対照には、ＩｇＧを用いたＣｈＩＰおよびＶＥＧＦプロモーターの非特異的な上流領域に対するプライマーの使用が含まれた。ｂ．対照ｓｈＲＮＡまたはＢＣＬ９ ｓｈＲＮＡベクターをレンチウイルスで形質導入したＣｏｌｏ３２０細胞に、ＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトした。デュアルルシフェラーゼアッセイ系を用いてレポーター活性を検定し、結果を各々の試料についてウミシイタケの値に基準化した。ＢＣＬ９ノックダウンはＶＥＧＦプロモーターにおける転写活性を有効に低下させた。^＊、Ｐ＜０．００１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９処置マウスにおける結腸粘膜および骨髄の正常な外観。ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９ペプチドで処置した実験マウスから単離した結腸粘膜および骨髄組織のＨ＆Ｅ染色は、すべての組織標本にわたって毒性の証拠を示さなかった。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＩＮＡ−６多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する。ａ．ウェスタン分析によって検出した、ＭＭ１ＳおよびＩＮＡ−６細胞におけるＢＣＬ９およびβ−カテニンタンパク質の発現。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（５μＭ）に２４時間曝露したＩＮＡ−６細胞は、チミジン取込みによって測定した場合、ビヒクル処理細胞およびＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）処理細胞と比較して有意に低い増殖を示した。^＊、Ｐ＜０．００１。誤差バーは、三重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。 オレフィンメタセシスによって炭化水素ステープルペプチドを作製するためにペプチド鋳型に挿入された非天然オレフィンアミノ酸の例。 １箇所で、２箇所で、および連続的にステープルされたＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチドの例。Ｘ、ステープリングアミノ酸；Ｂ、ノルロイシン。ステープルスキャンは、ＢＣＬ９ ＨＤ２構築物の最適に安定化されたαへリックスを同定するためのペプチド配列に沿った異なるステープル組成物およびそれらの異なる位置の反復生成および試験を容易に可能にする。図１５はそれぞれ出現順に、配列番号２、配列番号２の残基２〜６及び配列番号８〜１１５を開示している。 ＢＣＬ９（配列番号１４０）のαへリックスＨＤ２ドメインの残基３５１から３７４の三次元構造。β−カテニンと接触するＢＣＬ９ ＨＤ２相互作用面のこれらのアミノ酸残基を強調表示する。図１６は配列番号１４０の残基１〜４を開示している。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂはβ−カテニン−ＢＣＬ９／Ｂ９Ｌ複合体を破壊する。ａ．組換えβ−カテニンに対するＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢとＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ）の異なる結合親和性。ｂ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、ＧＳＴプルダウンアッセイによって実証されたように組換えβ−カテニン／ＢＣＬ９複合体を用量応答的に解離させた。Ｒ３５９Ｅ点突然変異誘発はＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ活性を６倍低下させた。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＷｎｔ転写を選択的にブロックする。ａ．ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｃｏｌｏ３２０細胞のＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子の用量依存的抑制を明らかにした。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊ｐ＜０．０１。腺腫（ｂ）および癌腫（ｃ）シグネチャーにわたるＤＬＤ１細胞でのＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂによって下方調節された遺伝子およびドミナントネガティブＴＣＦ１／ＴＣＦ４発現の定量的比較。腺腫（ｄ）および癌腫（ｅ）シグネチャーに関する、リーディングエッジの５０の最も下方調節された遺伝子（ｐ＜０．００１）、すなわちＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢとドミナントネガティブＴＣＦ１／ＴＣＦ４発現との間の相関に最も寄与する遺伝子のヒートマップ表示。ｆ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂで処理したＤＬＤ１細胞での鍵となるＷｎｔ標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ検証。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢによるＷｎｔ標的遺伝子発現の抑制。ａ．ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、１０μΜのＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢでのＭＭ１Ｓ細胞の処理に応答したＷｎｔ標的遺伝子の抑制を明らかにした。誤差バーは、四重に実施したアッセイについての平均±標準偏差である。^＊ｐ＜０．０１。ｂ．ＤＬＤ１細胞におけるＶＥＧＦ−ＡのＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現プロファイリング分析。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは、病的Ｗｎｔシグナル伝達によって駆動され、ＢＣＬ９を発現する培養した結腸癌細胞の増殖を選択的に阻害する。ａ．ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＣＲＣ細胞株の増殖を有意に低減させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは有意に低減させなかった。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ感受性癌細胞はＢＣＬ９を発現するが、ＢＣＬ９を発現しないＬＳ１７４Ｔ細胞株は応答を示さず、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの阻害作用をＢＣＬ９発現と関連付けた。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂの作用特異性についてのさらなる細胞対照として、増殖能力がＷｎｔ／β−カテニン活性に依存しない、ＨＣＴ１１６細胞ならびにその２つの派生細胞株、ＨＣＴ１１６ＤＯ２０およびＨＣＴ１１６ＫＯ５８（Ｔ．Ａ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，８２６５（２００２））は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂに対して感受性を示さなかった。ｂ．ウェスタンブロットによって評価した、ＣＲＣ細胞株におけるＢＣＬ９、Ｂ９Ｌおよびβ−カテニンの発現。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは従来の化学療法剤の細胞傷害作用を増強する。ａ．Ｃｏｌｏ３２０細胞をビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴおよび漸増濃度の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と共培養し、^３Ｈ−チミジン取込みを用いて細胞増殖に関して評価した。ｂ．ＭＭ１Ｓ細胞をビヒクル、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴおよび漸増濃度のドキソルビシン（Ｄｏｘ）と共培養し、^３Ｈ−チミジン取込みを用いて細胞増殖に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂは従来の薬剤の抗腫瘍活性を有意に増強したが、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴまたはビヒクルは増強しなかった。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの結腸腫瘍組織におけるアポトーシスの増大。腹腔内Ｃｏｌｏ３２０細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腫瘍組織を、ＴＵＮＥＬアッセイ（褐色）を用いてアポトーシス誘導に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＴＵＮＥＬ陽性率を著明に上昇させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは上昇させなかった。６つの高倍率視野におけるＴＵＮＥＬ陽性率の定量化を含む、３つの代表的な４０倍率視野を示す。^＊ｐ＜０．００１。 ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ処置マウスの骨髄腫組織においてＩＮＡ−６細胞の増殖はＷｎｔ転写活性およびアポトーシスの増大に依存する。ａ．ＩＮＡ−６細胞に空ベクター（モック）またはドミナントネガティブ型のＴＣＦ４を発現するベクター（ＥｄＴＰ）をレンチウイルスで形質導入し、増殖を^３Ｈ−チミジン取込みによって測定した。ｂ．ＩＮＡ−６細胞を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス骨片からの腫瘍組織切片を、ＴＵＮＥＬアッセイ（褐色）を用いてアポトーシス誘導に関して評価した。ＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢはＴＵＮＥＬ陽性率を著明に上昇させたが、ビヒクルまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴは上昇させなかった。６つの高倍率視野におけるＴＵＮＥＬ陽性率の定量化を含む、３つの代表的な４０Ｘ倍率視野を示す。^＊ｐ＜０．００１。

実施例２．タンパク質の生成および精製
組換えヒトＢＣＬ９（２１４〜４９３）を、カルボキシ末端にヘキサヒスチジンタグ（配列番号１４１）を含むｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、Ａ６００＝０．６に達するまで３７℃でインキュベートして、その後１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導した。細胞を遠心分離によって採取し、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液中で超音波処理によって溶解させた。次に溶解物を遠心分離し、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）に負荷して、洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾール中で溶出させ、滅菌１×ＰＢＳ中で一晩透析した。ヒトβ−カテニン構築物（例えば残基１〜７８１、１３８〜６８３、２７３〜６８４）をｐＧＥＸ４Ｔ１／ｐＧＥＸ４Ｔ２、ｐＥＴ−２８ａおよびｐＥＴ−２３ａにそれぞれクローニングした。Ｈｉｓタグ融合タンパク質をＢＣＬ９について上述したように生成した。ＧＳＴタグ構築物については、形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃でＡ６００＝０．６まで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧで４時間誘導した。細胞をペレット化し、再懸濁して、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ＭＭ ＮａＣｌ、２０％スクロース、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌアプロチニンおよび０．７ｍｇ／ｍｌペプスタチン）中で超音波処理した。可溶化したタンパク質をグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ＧＥ）に吸着させ、次にこれを２０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ａ中で溶出させて、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＰＢＳ緩衝液に対して透析した。

実施例１５．クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 抗体（３μｇ）をプロテインＡおよびプロテインＧ Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に８時間、前結合させ、５％ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳで５回洗浄して、次に以下の抗体を使用した一晩免疫沈降のために希釈したクロマチンに添加した：ＴＣＦ−４（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｎｏ．０５−５１１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５４０９）およびウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。磁気ビーズ−クロマチン複合体を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５Ｍ ＬｉＣｌ）中で６回洗浄した。ＤＮＡを以前に記述されているように（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｃｅｌｌ １２７，４６９−８０（２００６））ビーズから溶出させた。９４℃で５分の初期変性後、以下の温度および時間プロフィールを使用した３０サイクルのＰＣＲにより、ＰＴＣ−２００プログラマブルサーマルコントローラ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で増幅を実施した：９４℃、０．５分の変性、５９℃、０．５分のプライマーアニーリング、７２℃、０．５分のプライマー伸長および７２℃、１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物を２％ゲル電気泳動によって視覚化した。以下のプロモータープライマーセットを使用した：（１）ＶＥＧＦ：Ｆ（順方向）：５’−ｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇａｃａｇａｇｔｔｔ−３’（配列番号１１６）およびＲ（逆方向）：５’−ａｇｃｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｃｃａｃａ−３’（配列番号１１７）；（２）ＶＥＧＦ上流：Ｆ：５’−ｇａｇｇｃｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔａｇｇ−３’（配列番号１１８）およびＲ：５’−ｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｃｃａａｃｔｃｔｃｃ−３’（配列番号１１９）；（３）ｃ−Ｍｙｃ：Ｆ：５’−ａｃｔｃｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｇｔｃｃａｃａａｇｃ−３’（配列番号１２０）およびＲ：５’−ｃｃｃａａｔｔｔｃｔｃａｇｃｃａｇｇｔｔｔｃａｇ−３’（配列番号１２１）（Ｋｌａｕｓ，Ａ．＆ Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｗ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８，３８７−９８（２００８））。図１１ａの結果参照。

実施例２０．クロマチン免疫沈降
抗体（３μｇ）をプロテインＡおよびプロテインＧ Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に８時間、前結合させ、５％ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳで５回洗浄して、次に以下の抗体を使用した一晩免疫沈降のために希釈したクロマチンに添加した：ＴＣＦ−４（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｎｏ．０５−５１１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５４０９）およびウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。磁気ビーズ−クロマチン複合体を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５Ｍ ＬｉＣｌ）中で６回洗浄した。ＤＮＡを以前に記述されているように（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｃｅｌｌ １２７，４６９−８０（２００６））ビーズから溶出させた。９４℃で５分の初期変性後、以下の温度および時間プロフィールを使用した３０サイクルのＰＣＲにより、ＰＴＣ−２００プログラマブルサーマルコントローラ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で増幅を実施した：９４℃、０．５分の変性、５９℃、０．５分のプライマーアニーリング、７２℃、０．５分のプライマー伸長および７２℃、１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物を２％ゲル電気泳動によって視覚化した。以下のプロモータープライマーセットを使用した：（１）ＶＥＧＦ^Ｂ：Ｆ（順方向）：５’−ｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇａｃａｇａｇｔｔｔ−３’（配列番号１１６）およびＲ（逆方向）：５’−ａｇｃｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｃｃａｃａ−３’ （配列番号１１７）；（２）ＶＥＧＦ上流：Ｆ：５’−ｇａｇｇｃｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔａｇｇ−３’ （配列番号１１８）およびＲ：５’−ｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｃｃａａｃｔｃｔｃｃ−３’ （配列番号１１９）；（３）ｃ−Ｍｙｃ：Ｆ：５’−ａｃｔｃｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｇｔｃｃａｃａａｇｃ−３’（配列番号１２０）およびＲ：５’−ｃｃｃａａｔｔｔｃｔｃａｇｃｃａｇｇｔｔｔｃａｇ−３’（配列番号１２１）。図１１ａの結果参照。

Ｗｎｔシグナル伝達の遮断のために必要な生物学的活性である、あらかじめ形成したＢＣＬ９／β−カテニン複合体を破壊するＳＡＨ−ＢＣＬ９の能力を評価するため、カルボキシ末端にヘキサヒスチジンタグ（配列番号１４１）を含むｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクターにクローニングした組換えヒトＢＣＬ９（残基２４３〜４６９）（Ｈｉｓ−ＢＣＬ９）およびアミノ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターにクローニングした完全長ヒトβ−カテニン（組換えＧＳＴ−β−カテニン）を発現させ、以前に報告されているように（Ｊ．Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４，２９３（２００６））精製した。グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ＧＥ）に結合したＧＳＴタグβ−カテニン及び等量（１ｎＭ）のＨｉｓタグＢＣＬ９を、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４［ｐＨ７．４］、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および４％ＤＭＳＯ）中４℃で一晩インキュベートした。ビーズに固定化したＧＳＴタグβ−カテニンに結合したＨｉｓタグＢＣＬ９の複合体を遠心分離によって単離し、アッセイ緩衝液１ｍＬに再懸濁して、スラリー５０μＬをアッセイ緩衝液５００μｌ中のＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＢまたはＳＡＨ−ＢＣＬ９_ＭＵＴ（ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂ（Ｒ３５９Ｅ））の存在下または不在下に室温で２時間インキュベートした。グルタチオンビーズ結合タンパク質を遠心分離によって２回洗浄し、溶出させて、ゲル電気泳動によって分離した。ＧＳＴ−β−カテニンをクマシーブルー染色によって検出し、保持されるＨｉｓ−ＢＣＬ９の存在を免疫ブロット分析（抗Ｈｉｓ ２３６５５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって検出して、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｍｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いて定量化した。実験を３回反復し、同様の結果を得た。結果は、ＳＡＨ−ＢＣＬ９_Ｂが１３５ｎＭのＩＣ_５０で複合体を用量応答的に解離することができ、一方単一点突然変異誘発は活性を６倍低下させることを明らかにした。図１７Ｂの結果参照。

Claims (41)

1. 少なくとも１つの炭化水素ステープルまたはステッチを含む、ＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン（ＢＣＬ９−ＨＤ２）の構造的に拘束されたペプチド。
2. ペプチドが、β−カテニンと相互作用するアミノ酸からなる相互作用面を含む、請求項１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
3. 相互作用面が約３から約２０個のアミノ酸を含む、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
4. 相互作用面が４から１５個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の構造的に拘束されたペプチド。
5. 相互作用面が、β−カテニンに結合するＢＣＬ９−ＨＤ２のへリックス面に４０％またはそれ以上の同一性を含み、ここで相互作用面が、ＢＣＬ９残基Ｇｌｎ−３５５、Ｈｉｓ−３５８、Ａｒｇ−３５９、Ｓｅｒ−３６２、Ｌｅｕ−３６３、Ｌｅｕ−３６６、Ｉｌｅ−３６９、Ｇｌｎ−３７０、Ｌｅｕ−３７３およびＰｈｅ−３７４またはその保存的置換物を含む、請求項４に記載の構造的に拘束されたペプチド。
6. 相互作用面が、β−カテニンに結合するＢＣＬ９−ＨＤ２のへリックス面に５０％から９０％の同一性を含み、ここで相互作用面が、ＢＣＬ９残基Ｇｌｎ−３５５、Ｈｉｓ−３５８、Ａｒｇ−３５９、Ｓｅｒ−３６２、Ｌｅｕ−３６３、Ｌｅｕ−３６６、Ｉｌｅ−３６９、Ｇｌｎ−３７０、Ｌｅｕ−３７３およびＰｈｅ−３７４またはその保存的置換物を含む、請求項５に記載の構造的に拘束されたペプチド。
7. 相互作用面がαへリックスの１つの面である、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
8. へリックスの１つの面が、アミノ酸の１、２、３または４の隣接する積層柱を含み、ここでアミノ酸の積層柱は、１回転当たり３．６個のアミノ酸を有するαへリックスにおいて位置ａ、ｄおよびｇ；位置ｂおよびｅ；または位置ｃおよびｆによって規定され、ここでアミノ酸は、連続的および順次に位置ａ〜ｇが割り当てられ；並びに、１回転当たり３個のアミノ酸を有する３_１０へリックスにおいて位置ａおよびｄ；位置ｂおよびｅ；または位置ｃおよびｆによって規定され、ここでアミノ酸は、連続的および順次に位置ａ〜ｆが割り当てられ；またはそのホモログである、請求項７に記載の構造的に拘束されたペプチド。
9. ＢＣＬ９−ＨＤ２のアミノ酸３５１から３７４である配列番号１（ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＱＴＬＲＤＩＱＲＭＬＦ）に約２０％から１００％の配列相同性を有し、１から５個の炭化水素ステープルを含む、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
10. ＢＣＬ９−ＨＤ２のアミノ酸３５１から３７４である配列番号１（ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＱＴＬＲＤＩＱＲＭＬＦ）に約５０％から１００％の配列相同性を有し、１から５個の炭化水素ステープルを含む、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
11. 炭化水素ステープルまたはステッチが１またはそれ以上の天然アミノ酸または非天然アミノ酸の間に存在する、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
12. 炭化水素ステープルまたはステッチがオレフィンメタセシス反応によって形成される、請求項１１に記載のペプチド。
13. 非天然アミノ酸が以下：
    

    

    から選択される、請求項１１に記載のペプチド。
14. ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内に１から５個のステープルまたはステッチを含む、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
15. １つのステープルまたはステッチがＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する、請求項１４に記載の構造的に拘束されたペプチド。
16. 別のステープルまたはステッチがＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する、請求項１４に記載の構造的に拘束されたペプチド。
17. 任意の他のステープルまたはステッチがＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の位置：ａ）ｉ，ｉ＋４；ｂ）ｉ，ｉ＋７；およびｃ）ｉ，ｉ＋３に存在する、請求項１４に記載の構造的に拘束されたペプチド。
18. １つの炭化水素ステープルが、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の例示的な位置に存在し、ステープルスキャニングにより反復される：
    

    

    

    

    請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
19. ２つの炭化水素ステープルが、ＢＣＬ９ ＨＤ２ペプチド内の以下の例示的な位置に存在し、ステープルスキャニングにより反復される：
    

    

    

    

    請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
20. １またはそれ以上の炭化水素ステープルまたはステッチが、ＢＣＬ９ ＨＤ９ドメイン内の以下の例示的な位置のいずれかに存在し、ステープルスキャニングにより反復される：
    

    

    

    

    

    

    請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
21. １から４個の付加的な炭化水素ステープルをさらに含む、請求項１８に記載の構造的に拘束されたペプチド。
22. 付加的な炭化水素ステープルが、ＢＣＬ９ ＨＤ２ドメイン内の以下の例示的な位置のいずれかに存在し、ステープルスキャニングにより反復される：
    

    

    

    

    

    

    

    請求項２１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
23. 位置３５１から３７４のアミノ酸配列が、以下：
    

    

    から選択される、請求項２に記載の構造的に拘束されたペプチド。
24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチドおよび医薬的に許容される担体を含有する組成物。
25. 請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、被験者において古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法。
26. 請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、被験者においてＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合を阻害する方法。
27. ＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合の阻害が、請求項１から２３のいずれか一項に記載の構造的に拘束されたペプチドによって引き起こされる、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物を被験者に投与することを含む、被験者においてＢＣＬ９／β−カテニン結合によって媒介される疾患または障害を治療する方法。
29. 被験者が、ＢＣＬ９／β−カテニン相互作用またはＷｎｔシグナル伝達の阻害剤を必要とすると特定された、請求項２８に記載の方法。
30. 疾患が、癌、腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞の脱分化および転移、腫瘍の移動、腫瘍誘導性血管新生、癌幹細胞の化学療法抵抗性ならびに増殖性疾患であるか、または創傷治癒、血管新生もしくは糖尿病に関係する、請求項２８に記載の方法。
31. 疾患が、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、脳の癌、腎癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、骨の癌、胃癌、乳癌、膵癌、神経膠腫、膠芽腫、肝細胞癌、乳頭状腎癌、頭頸部扁平上皮癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫および固形腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
32. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物を被験者に投与することを含む、被験者において癌を治療する方法。
33. 被験者が、癌を治療するために古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害剤を必要とすると以前に特定されたことがある、請求項３２に記載の方法。
34. 疾患が創傷治癒、血管新生または糖尿病に関係する、請求項３０に記載の方法。
35. 被験者に付加的な治療薬、放射線または化学療法を投与する、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 付加的な治療化合物が抗癌化合物である、請求項３５に記載の方法。
37. 該化合物と付加的な治療薬を同時にまたは連続的に投与する、請求項３５に記載の方法。
38. 該化合物と付加的な治療薬を結合する（すなわち二官能性化合物である）、請求項３５に記載の方法。
39. 被験者がヒトである、請求項２５から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の構造的に拘束されたペプチドおよび癌を治療するのに使用するための指示書を含むキット。
41. ＢＣＬ９のβ−カテニンへの結合を阻害する化合物を同定する方法であって、請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチドをβ−カテニンと接触させる段階および次に請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチドとβ−カテニンとの間の相互作用を阻害する低分子または化合物をスクリーニングする工程を含む方法。

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