DE3854476T2

DE3854476T2 - Inhibierung von eukaryotischen pathogenen und neoplasmen mit lytischen peptiden.

Info

Publication number: DE3854476T2
Application number: DE3854476T
Authority: DE
Inventors: Frederick M Enright; Jesse Jaynes; Gale Jeffers; Kenneth White
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Helix Biomedix Inc
Priority date: 1987-07-06
Filing date: 1988-07-06
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2008-07-07
Also published as: AU2132088A; EP0383770A1; EP0383770A4; JP2962555B2; DE3854476D1; JPH03503522A; KR890701722A; ATE127838T1; EP0383770B1; KR970006154B1; US6440935B1; WO1989000194A1; US5962410A

Description

Rückverweisung auf verwandte Anmeldungen

Dies ist eine Teilfortführungsanmeldung von U.S.- Aktenzeichen Nr. 069,653, die am 7. Juli 1987 von Jesse M. Jaynes, Frederick M. Enright und Kenneth L. White eingereicht wurde, weiche hierdurch unter Bezugnahme hierin enthalten ist. Die U.S.-Patentanmeldung, die unter Aktenzeichen Nr. 889,225 am 25. Juli 1986, von Jaynes und Kenneth S. Derrick eingereicht wurde, welche sich auf die genetische Transformation von Pflanzen mit genexprimierenden lytischen Peptiden zur Bereitstellung genannter Pflanzen mit Resistenz gegen pathogene Mikroorganismen und Schädlinge bezieht, ist auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung und ist hierdurch unter Bezugnahme hierin enthalten.

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf lytische Peptide, ihre Verwendung in Verfahren zur Hemmung eukaryoter pathogener Mikroorganismen, Krebszelien und intrazellulär infizierter Zellen. Diese Erfindung bezieht sich besonders auf die Hemmung von genannten pathogenen Mikroorganismen, Krebs und infizierten Zellen in Säugetieren und anderen höheren Tieren.

Hintergrund der Erfindung

Es sind viele Erkrankungen prokaryoten Ursprungs bekannt, das heißt die durch pathogene Bakterien hervorgerufen werden. Diese Erkrankungen können aufgrund der deutlichen Unterschiede zwischen den eindringenden Prokaryoten und den eukaryoten Zellen des Wirtes im allgemeinen leichter behandelt werden als jene, die eukaryoten Ursprungs sind. Folglich sind aufgrund der Unterschiede zwischen Bakterienzellen und denen des Wirtes viele Antibiotika bekannt, welche die eindringenden Bakterien ohne signifikante unerwünschte Wirkungen auf den Wirt spezifisch hemmen. Im Gegensatz dazu ist es im allgemeinen viel schwieriger gewesen, Erkrankungen nichtbakteriellen Ursprungs, wie zum Beispiel Malaria, die Schlafkrankheit und die Chagas-Krankheit zu behandeln.
Die Eigenschaft bestimmter Peptide, eine Lyse von prokaryoten Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien zu induzieren, ist bekannt. Zum Beispiel beschreiben die an Hultmark et al. erteilten U.S.-Patente 4,355,104 und 4,520,016 die bakteriolytischen Eigenschaften einiger Cecropine gegenüber gramnegativen Bakterien. Ziemlich interessant ist dabei, daß die in den Patenten von Hultmark et al. beschriebenen Cecropine nicht universell gegen alle gramnegativen Bakterien wirksam waren. Die darin beschriebenen Cecropine lysierten zum Beispiel Serratia marcescens D 61108, aber nicht Serratia marcescens D611. Darüber hinaus wurde bislang berichtet, daß Cecropine keine lytische Aktivität gegenüber eukaryoten Zellen, wie zum Beispiel lnsektenzellen, Leberzellen und Schafserythrozyten aufweisen, wie in den Hultmark-Patenten; der Internationalen Patent-Veröffentlichung WO/8604356; Andreu et al., Biochemistry, Vol. 24, S. 1683-88 (1985); Boman et al., Developmental and Comparative Immunology, Vol. 9, S. 551-558 (1985) und Steiner et al., Nature, Vol. 292, S. 246-248 (1981) berichtet wurde.
Andere bislang bekannte lytische Peptide schließen zum Beispiel die Sarcotoxine und Lepidopterane ein. Diese Peptide kommen in allgemeinen im Immunsystem von Sarcophaga peregrina bzw. der Seidenraupe, Lepidopteran, natürlich
TEXT FEHLT
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TEXT FEHLT 1986 auch beschrieben.
Die oben erwähnten Patente von Hultmark et al. erwähnen auch, daß es keine bekannten Antikörper gegen Cecropin gibt, die aufgrund der hohen Aktivität gegen Pseudomonas auf eine breite Zulässigkeit für menschliche und veterinäre Applikationen, einschließlich einer scheinbar nützlichen Applikation bei Oberflächeninfektionen hindeuten. Auf ähnliche Weise erwähnt die EPA-Veröffentlichung 182,278 (1986), daß erwartet werden kann, daß Sarcotoxine in pharmazeutischen Präparaten und als Lebensmittelzusatzstoffe wirksam sein können und daß in Anwesenheit von Serum eine antibakterielle Aktivität von Sarcotoxin erkannt werden kann. Shiba, Chem. Abstr. 104: 230430K (1985) erwähnt auch ein Injektionspräparat, das 500 mg Lepidopteran, 250 mg Glucose und Wasser zu Injektionszwecken auf 5 ml enthält.
Es wurde über mehrere Analoga natürlich vorkommender Cecropine, Sarcotoxine und Lepidopterane berichtet. So wurde zum Beispiel in Andreu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 80, S. 6475-6479 (1983) berichtet, daß Änderungen an einem der beiden Enden der Aminosäurensequenz von Cecropin im allgemeinen zu Verlusten der bakteriziden Aktivität zu unterschiedlichen Graden gegen verschiedene Bakterien führt. In dem oben berichteten Patent von Andreu et al. (1985) wird berichtet, daß Trp² für die bakterizide Aktivität von Cecropin eindeutig wichtig ist und daß andere Veränderungen in der 4-, 6- oder 8-Stellung auf andere Bakterien andere Effekte ausüben. Anhand der in Tabelle II auf Seite 1687 von Andreu et al. (1985) ersichtlichen Daten hat es den Anschein, daß sich fast jede beliebige Änderung von natürlichem Cecropin im allgemeinen ungünstig auf seine bakerizide Aktivität auswirkt. Cecropin wird in der Internationalen Veröffentlichung W086/04356 hingegen
TEXT FEHLT
Biochemical und Biophysical Research Communications, Vol. 87, Nr. 1, 1971, Seiten 99 bis 105 lehrt, daß porenbildende Antibiotika weiße Blutkörperchen lysieren.
Es wurde nunmehr gefunden, daß lytische Peptide gegen bestimmte eukaryote Zellen wirksam sind, die bei höheren Tieren eine Krankheitsguelle darstellen. Lytische Peptide sind dazu in der Lage, Protozoa, Fungi, Krebszellen und mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus infizierte eukaryote Zellen aufzulösen und wird dennoch durch angemessene Selektion des lytischen Peptids im allgemeinen nicht die normalen Zellen des Wirtstieres auflösen. Folglich können lytische Peptide in vitro dazu verwendet werden, die Membranen bestimmter eukaryoter Zellen aufzulösen. Noch wichtiger, die lytischen Peptide können in vivo dazu verwendet werden, Krebs und pathogene Erkrankungen eukaryoten Ursprungs bei höheren Tieren zu behandeln oder zu verhüten. Diese Entdeckung ist hinsichtlich der scheinbar einmütigen Schlußfolgerungen von früheren Forschern, daß lytische Peptide eukaryote Zellen nicht lysieren, ziemlich überraschend und unerwartet.
Demgemäß liefert die Erfindung ein Verfahren für das Lysieren eukaryoter Zellen, welches den Kontakt der Zellen mit einem lytischen Peptid in einer Menge einschließt, die wirksam genug ist, um die Zellen zu lysieren. Die Zellen sind eukaryote Mikroorganismen, Lymphome, Leukämien oder Karzinome oder mit einen intrazellulären pathogenen Mikroorganismus infizierte eukaryote Zellen. Das lytische Peptid weist von circa bis circa 40 Aminosäuren auf, wobei mindestens ein Anteil davon in einer amphiphilen α-Helix-Konformation angeordnet ist. Das Peptid hat einen im wesentlichen hydrophilen Kopf mit einer positiven Ladungsdichte und einen im wesentlichen hydrophoben Schwanz. Die Konformation hat eine überwiegend hydrophobe Seite entlang der Länge der Konformation und eine überwiegend hydrophile Seite entgegengesetzt davon.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die selektive Lyse eukaryoter Zellen in Gegenwart von Zellen bereit, die nicht lysiert werden. Das Verfahren schließt den Kontakt mit eukaryoten Targetzellen in Gegenwart von Non- Targetzellen mit einen selektiv lytischen freien Peptid in einer Menge ein, die zum Lysieren der Targetzellen wirksam ist. Die Targetzellen sind eukaryote Mikroorganismen, Lymphome, Leukämien oder Karzinome oder mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus infizierte eukaryote Zellen. Das lytische Peptid enthält von circa 30 bis circa 40 Aminosäuren, von denen mindestens ein Anteil in einer amphiphilen α-Helix-Konformation angeordnet ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lysieren eukaryoter Mikroorganismen bereit, das den Kontakt der Eukaryoten mit einer Menge eines lytischen Peptids einschließt, das bei der Lyse der Mikroorganismen wirksam ist. Das Peptid schließt von circa bis circa 40 Aminosäuren ein, von denen mindestens ein Anteil in einer amphiphilen α-Helix-Konformation angeordnet ist.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lysieren von Krebszellen bereit. Das Verfahren schließt den Kontakt mit Lymphon-, Leukämie- oder Karzinonzellen mit einer wirksamen Menge eines lytischen Peptids zum Lysieren der Zellen ein. Das Peptid hat von circa bis circa 40 Aminosäuren, von denen mindestens ein Anteil in einer amphiphilen α-Helix-Konformation angeordnet ist.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur selektiven Lyse infizierter eukaryoter Zellen bereit. Die infizierten eukaryoten Zellen sind mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus infiziert, wie zum Beispiel Viren, Bakterien, Fungi und Protozoa. Das Verfahren schließt den Kontakt der infizierten und nicht infizierten Zellen mit einem selektiv lytischen, freien Peptid in einer Menge ein, die bei der selektiven Lyse der infizierten Zellen wirksam ist und die nicht infizierten Zellen weitgehend frei von Lyse zurückläßt.
Und noch darüber hinausgehend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen eukaryoter Zellen in einen höheren Tier bereit. Das Verfahren schließt das Einführen eines selektiv lytischen, freien Peptids in das höhere Tier in einer Menge ein, die bei der Hemmung von eukaryoten Zellen darinnen, wie zum Beispiel eukaryoten Mikroorganismen, Säugetierlymphomen, -leukämien oder -karzinomen oder mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus infizierte Zellen ein.
In anderen Aspekten stellt die Erfindung eine synergistische bakterizide Zusammensetzung bereit, die lytisches Peptid und Lysozym sowie neue lytische Peptide enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Eig. 1 ist ein helikales Radgebilde für Cecropin B nach Edmundson (Edmundson 'helical wheel').
Fig. 2 ist ein helikales Radgebilde für Cecropin SB-37 nach Edmundson.
Fig. 3 ist ein helikales Radgebilde für Cecropin A nach Edmundson.
Fig. 4 ist ein helikales Radgebilde für Cecropin D nach Edmundson.
Fig. 5 ist ein helikales Radgebilde für Shiva 1 nach Edmundson.
Fig. 6 ist ein helikales Radgebilde für Lepidopteran nach Edmundson.
Fig. 7 ist einhelikales Radgebilde für Sarcotoxin 1A nach Edmundson.
Fig. 8 ist ein helikales Radgebilde für Sarcotoxin 1B nach Edmundson.
Fig. 9 ist ein helikales Radgebilde für Sarcotoxin 1C nach Edmundson.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß lytische Peptide mit circa 30-40 Aminosäuren dazu in der Lage sind, eukaryote Zellen, die zur Produktion von biologischen Produkten verwendet werden und/oder bei der Erkrankung oder Krankheit höherer Tiere beteiligt sind, zu lysieren oder anderweitig zu hemmen. Genannte eukaryote Zellen schließen zum Beispiel Protozoa, Fungi, Algen, Krebszellen, wie zum Beispiel Lymphome, Leukämien und Karzinome und mit intrazellulären Fungi, Bakterien, Protozoa oder Viren infizierte Zellen ein.
Wie hierin verwendet, schließt die Bezeichnung "lytisches Peptid" jedes beliebige Polypeptid ein, welches die Membran einer Zelle in einem System in vivo oder in vitro lysiert, in welchem genannte Aktivität gemessen werden kann. Geeignete lytische Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weisen eine lytische Aktivität auf, die gegen eine oder mehrere eukaryote Zellen, wie zum Beispiel Protozoa, Fungi, Helminthen, Leukämien, Lymphome oder Karzinome oder mit intrazellulären pathogenen Mikroorganismen infizierte Zellen gerichtet ist. Bevorzugte lytische Peptide haben von circa bis circa 40 Aminosäuren, von denen mindestens ein Anteil in einer amphiphilen α-Helix-Konformation mit einem im wesentlichen hydrophilen Kopf mit einer positiven Ladungsdichte, einem im wesentlichen hydrophoben Schwanz und einem Paar entgegengesetzter Seiten entlang der Länge der Helix- Konformation angeordnet ist, wobei eine genannte Seite überwiegend hydrophil und die andere überwiegend hydrophob ist. Der Kopf dieser Konformation kann entweder als das Aminterminusende oder das Carboxylterminusende genommen werden, ist aber bevorzugt das Aminterminusende.
Ein "Selektiv lytisches Peptid" ist ein lytisches Peptid, welches bevorzugt Targetzellen in einem System auflöst, das sowohl Target- als auch Non-Targetzellen umfaßt, worin die Targetzellen unter Protozoa, Fungi, Säugetierleukämien, -lymphonen und -karzinonen und mit intrazelluären pathogenen Mikroorganismen infizierten Zellen ausgewählt werden. Die selektiv lytischen Peptide, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, sind bevorzugt "freie Peptide", das heißt ungerichtet in Aktion durch einen Antikörper und anderweitig ungebunden oder nicht an ein anderes Molekülfragment fusioniert, welches sich ungünstig auf seine lytische Aktivität auswirkt.
Geeignete lytische Peptide schließen im allgemeinen Cecropine ein, wie zum Beispiel Cecropin A, Cecropin B, Cecropin D und Lepidopteran; Sarcotoxine, wie zum Beispiel Sarcotoxin IA, Sarcotoxin IB und Sarcotoxin IC und andere Polypeptide, die aus der Hämolymphe jeder beliebigen Insektenspezies erhaltbar sind, die eine lytische Aktivität gegen Bakterien ähnlich der der Cecropine und Sarcotoxine aufweisen. Es wird auch daran gedacht, daß lytische Peptide als der lytisch aktive Anteil größerer Peptide, wie zum Beispiel von Attacinen, Lysozymen, bestimmten Phagenproteinen, wie zum Beispiel S-Protein von Phage λ, E- Protein von Phage PHIX 174 und P13-Protein von Phage P22 und C9-Protein von Humankomplement erhalten werden. Wie hierin verwendet, sind die Klassen lytisch aktiver Peptide, wie zum Beispiel "Cecropine", "Sarcotoxine" und "Phagenproteine" und spezifische Peptide in genannten Klassen dazu beabsichtigt, die lytisch aktiven Analoga, Homologa, Mutanten oder Isoneren davon einzuschließen, sofern anhand des Kontexts nicht anderweitig angezeigt wird. Von diesen beispielhaften lytischen Peptiden sind diejenigen mit weniger als circa 30 Aminosäuren, wie zum Beispiel Melittine aufgrund ihrer mangelnden Spezifität, wie durch ihr hämolytisches Potential angezeigt, im allgemeinen in der vorliegenden Erfindung ungeeignet, wohingegen die mit mehr als über 40 Aminosäuren, wie zum Beispiel Attacine und Lysozyme im allgemeinen nicht ausreichend lytisch sind, damit sie in der vorliegenden Erfindung von Nutzen wären. Andererseits sind die mit zwischen circa und über 40 Aminosäuren, wie zum Beispiel Cecropine und Sarcotoxine aufgrund ihrer Spezifität zum Lysieren von Targetzellen in Vergleich zu Non-Targetzellen im allgemeinen bevorzugter.
Hydrophile Aminosäuren enthalten und haben im allgemeinen den entsprechenden relativen Grad an Hydrophobie (bei pH 7,0; kcal/mol) wie folgt: Asparaginsäure (D), -7,4; Glutaminsäure (E), -9,9; Asparagin (N), -0,2; Glutamin (Q), -0,3; Lysin (K), -4,2; Arginin (R), -11,2; Serin (S), -0,3 und Cystein (C), -2,8. Hydrophobe Aminosäuren enthalten und haben in allgemeinen den entsprechenden relativen Grad an Hydrophobie wie folgt: Histidin (H), 0,5; Threonin (T), 0,4; Tyrosin (Y), 2,3; Tryptophan (W), 3,4; Phenylalanin (F), 2,5; Leucin (L), 1,8; Isoleucin (I), 2,5; Methionin (M), 1,3; Valin (V), 1,5 und Alanin (A), 0,5. Glycin hat einen relativen Hydrophobiegrad von 0 und kann als hydrophil oder hydrophob angesehen werden.
Die Aminosäurenhomologie von Peptiden kann ohne weiteres durch Kontrastieren der Aminosäurensequenzen davon bestimmt werden, wie dies im Fach bekannt ist. Auf ähnliche Weise kann die amphiphile Homologie von Peptiden durch Kontrastieren der Hydrophilie und Hydrophobie der Aminosäurensequenzen bestimmt werden. Die Aminosäurensequenzen von verschiedenen bevorzugten lytischen Peptiden werden in Tabelle 1 mit ihrem Homologiegrad mit Cecropin B verglichen, der durch Unterstreichen homologer Aminosäuren angezeigt wird. Die hydrophoben und hydrophilen Konformationsseiten von lytischen Peptiden werden ohne weiteres anhand der Konstruktion eines helikalen Rades nach Edmundson (Edmundson 'helical wheel') beobachtet, welches eine Art überlagerte Endansicht des Peptids ist, wobei die Seitenketten der Aminosäuren des Peptids in ihren relativen Axialstellungen angeordnet sind, die in einer α-Helix-Konformation vermutet würden. Helikale Räder, die für die in Tabelle I aufgelisteten Peptide konstruiert werden, sind in Figuren 1-9 zu sehen. Diese helikalen Radgebilde veranschaulichen die hydrophile Seite 'h' und die hydrophobe Seite 'H' des jeweiligen Peptids, wobei die Bezifferung jeder sequentiellen Aminosäure in einem schraffierten Kreis erscheint, um eine hydrophobe Aminosäure darzustellen oder in einem nicht schraffierten Kreis, um eine hydrophile Aminosäure darzustellen. TABELLE I - HOMOLOGIE DES LYTISCHEN PEPTIDS Peptid Amonosäurensequenz³ Amonosäurenhomologie mit Cecropin B Amphiphile Homologie mit Cecropin B Hydrophile Seite Hydrophobe Seite Grade (ca.) Aminosären (Hydrophil/Gesamt) Aminosären (Hydrophob/Gesamt) Cecropin Shiva Lepidoteran Sarcotoxin TABELLE I - HOMOLOGIE DES LYTISCHEN PEPTIDS Peptid Amonosäurensequenz Amonosäurenhomologie mit Cecropin B Amphiphile Homologie mit Cecropin B Hydrophile Seite Hydrophobe Seite Grade (ca.) Aminosären (Hydrophil/Gesamt) Aminosären (Hydrophob/Gesamt) Sarcotoxin cotoxin 1. O = Hydrophil 2. = Hydrophob 3. Stellung 1 ist der Aminterminus 4. Der Carboxylterminus aller Peptide hierin ist bei den Sarcotoxin amidiert.
Cecropin B ist ein potentes bakteriolytisches Peptid, welches natürlich vorkommt und wie in den oben erwähnten Patenten von Hultmark et al. beschrieben, von Insekten durch direkte Peptidsynthese oder von genetisch transformierten Wirtszellen, wie in der zuvor erwähnten Veröffentlichung WO/086/04356 beschrieben, erhalten werden kann. Die Aminosäurensequenz von Cecropin B wird in Tabelle 1 gegeben, und die Hydrophilie/Hydrophobie jeder Aminosäure in ihrer Sequenz ist unmittelbar darunter angegeben. Das in Fig. 1 zu sehende helikale Radgebilde von Cecropin B veranschaulicht, daß vierzehn der sechzehn Aminosäuren auf der hydrophoben Seite hydrophob sind, während elf der zwanzig Aminosäuren auf der hydrophilen Seite hydrophil sind, für insgesamt elf "Imperfektionen" Es wird daran gedacht, daß die Entfernung oder der Ersatz von Gly² ³ und Pro² &sup4; zu einem lytischeren Peptid mit nur sechs Imperfektionen in der amphiphilen Helix-Konformation führen würde. Außerdem ist von Prolin bekannt, daß es die Helix- Konformation stört, und seine Entfernung könnte eine mehr helikale Konformation und folglich eine lytischere Aktivität herbeiführen. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die helikalen Radgebilde für Cecropin SB-37, Cecropin D und Shiva 1 konstruiert wurden, wobei angenommen wurde, daß Proline in der Endregion dort störend in die α-Helix-Konformation eingreifen würden, und dies wird dadurch angezeigt, daß Prolin und die vorangehenden Aminosäuren auf die Außenseite des "Rades" gebracht werden.
Cecropin SB-37 ist ein Analogon, welches unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers zubereitet wurde und ist ungefähr genauso lytisch aktiv wie Cecropin B. Es verfügt in bezug auf seine Aminosäurensequenz und seine Amphiphilie über eine 94%ige Homologie damit. Wie in der helikalen Radkonstruktion von Fig. 2 zu sehen ist, sind zwei der sechzehn Aminosäuren auf der hydrophoben Seite hydrophil, während neun von zwanzig auf der hydrophilen Seite hydrophob sind. Es wird auf ähnliche Weise daran gedacht, daß wenn Gly² ³ und Pro² &sup4; entfernt oder ersetzt würden, es nur fünf Imperfektionen in der amphiphilen Konformation haben würde und folglich mehr lytisch aktiv wäre.
Auf ähnliche Weise passen die anderen natürlich vorkommenden lytischen Peptide Cecropin A, Cecropin D, Lepidopteran, Sarcotoxin 1A, Sarcotoxin 1B und Sarcotoxin 1C zu der amphiphilen Helix-Konformation von Cecropin B, wie in Tabelle 1 und Figuren 3, 4 und 6-9 zu sehen ist. Mit Ausnahme von Cecropin A, das in etwa genauso lytisch aktiv ist wie Cecropin B und SB-37, sind diese Peptide im allgemeinen weniger lytisch aktiv gegen Eukaryoten als Cecropin B. Es wird jedoch gleichermaßen daran gedacht, daß die lytische Aktivität durch Entfernen von Aminosäuren aus der Sequenz davon, wie zum Beispiel Val¹&sup9; und Ile²&sup0; aus Cecropin D oder Gly²³ und Pro²&sup4; aus Lepidopteran oder Cecropin A verbessert werden kann.
Ein anderes Peptid, das hierin als "Shiva 1" bezeichnet wird, wurde unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers zubereitet und weist die in Tabelle 1 angezeigte Aminosäurensequenz und die in Figur 5 gezeigte entsprechende helikale Radkonstruktion auf. Obwohl dieses Peptid nur eine 46%ige Aminosäurenhomologie mit Cecropin B aufweist, ist seine amphiphile Homologie damit 100%. Ziemlich überraschend ist Shiva 1 jedoch im allgemeinen lytisch sehr viel aktiver als Cecropin B, und es wird daran gedacht, daß seine lytische Aktivität durch Entfernung oder Ersatz von Gly²³ und Pro²&sup4; noch weiter verbessert werden kann.
Ein Homologon von Cecropin SB-37, das hierin als "*Cecropin SB-37" bezeichnet wird, ist identisch damit, außer der
Substitution von Glutaminsäure in der vierten Stellung (für Threonin, was der zweiten Stellung von Cecropin B entspricht) und Lysin in der achten Stellung (für Leucin, was der sechsten Stellung in Cecropin B entspricht) Substitutionen in diesen Stellungen können die lytische Aktivität des Cecropins SB-37 gegen Prokaryote um so viel wie 90% reduzieren, wie in Andreu et al. (1985) berichtet und oben erwähnt wurde. Es wurde jedoch ziemlich überraschend gefunden, daß die lytische Aktivität von *Cecropin SB-37 gegen Eukaryote, wie zum Beispiel eukaryote Mikroorganismen im allgemeinen mit Cecropin SB-37 vergleichbar ist.
Die lytischen Peptide können allein oder in Kombination mit anderen lytischen Peptiden verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die lytische Aktivität der in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Peptide zur synergistischen Verbesserung der lytischen Aktivität eines weniger lytischen Peptids verwendet werden kann, das andernfalls nicht ausreichend lytisch sein könnte, um in den vorliegenden Verfahren verwendet werden zu können. Die lytische Aktivität von Cecropin oder Sarcotoxin ist zum Beispiel syngergistisch verbessert, wenn es in Kombination mit Lysozym verwendet wird. Im allgemeinen ist die lytische Aktivität eines Gemisches aus Molen Lysozym und 0,1-100 Molen Cecropin, bevorzugt 1-10 Molen Cecropin lytisch aktiver als ein molares Aquivalent von entweder Cecropin oder Lysozym allein. Genannte synergistische Mischungen können nicht nur zum Lysieren oder Hemmen von Eukaryoten verwendet werden, sondern auch von Bakterien. Es wird daran gedacht, daß ein derartiges Gemisch vorteilhaft in pharmazeutischen Präparaten verwendet werden kann, die einen pharmazeutischen Träger zur Verabreichung an Menschen oder andere höhere Tiere in Lebensmitteln oder anderen Produkten als ein antibakterielles Konservierungsmittel sowie in landwirtschaftlichen Applikationen, wie zum Beispiel in einem Spray, der in einer wirksamen Menge auf Feldfrüchte zur Prävention von Infektionen durch oder zur Hemmung von Pflanzenpathogenen verwendet werden könnte.
Das vorliegende Verfahren ist bei der Lyse verschiedener eukaryoter Zelltypen, wie zum Beispiel eukaryoter Mikroorganismen, neoplastischen Säugetierzellen und mit intrazellulären pathogenen Mikroorganismen infizierten Zellen wirksam: Eukaryote Mikroorganismen schließen zum Beispiel Fungi wie Hefen und Protozoa wie Sarcodina, Mastigophora, Ciliata und Sporozoa ein. Die lytischen Peptide sind besonders wirksam gegen Trypanosona cruzi und Plasmodium falciparum, welche die Erreger der Chagas-Krankheit bzw. Malaria sind, und es wird auch daran gedacht, daß sie besonders wirksam gegen Trypanosoma gambiense sind, welche die Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist nützlich bei der Lyse oder Hemmung von Krebszellen, wie zum Beispiel Lymphomen, Leukämien und Karzinomen und besonders von Säugetierkrebszellen dieser Typen.
Geeignete infizierte Eukaryoten, die nach dem vorliegenden Verfahren der Lyse oder Hemmung unterworfen sind, schließen Zellen ein, die mit intrazellulären pathogenen Mikroorganismen, wie zum Beispiel Viren, Bakterien, Fungi oder Protozoa infiziert sind. Spezifische repräsentative Beispiele genannter Pathogene, deren Wirtszellen als zur Lyse oder Hemmung nach dem vorliegenden Verfahren geeignet gehalten werden, schließen Protozoa, wie zum Beispiel P. falciparum, T. cruzi, Bakterien, wie zum Beispiel Listeria monocytogenes, Brucella abortus und Viren, wie zum Beispiel Parainfluenza, Masern und Herpes simplex II ein. Das Verfahren ist besonders wirksam für die Behandlung von mit DNA-Virus infizierten Zellen, wie zum Beispiel Herpes simplex II. Genannte Pathogene wachsen oder replizieren sich in der infizierten Zelle und sind im allgemeinen durch die Membran der Wirtszelle vor Hemmung oder Lyse geschützt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt jedoch zur Lyse der Wirtszelle dergestalt, daß das intrazelluläre Pathogen im Anschluß daran mit den lytischen Peptiden der vorliegenden Erfindung oder von einem anderen Inhibitor zerstört oder einer Lyse oder Hemmung unterworfen wird, da es nicht mehr von der Membran der Wirtszelle geschützt ist.
Im Einklang mit dem vorliegenden Verfahren wird das lytische Peptid zur Lyse oder anderweitig zur Hemmung eukaryoter Zellen durch Kontaktieren der Zellen mit dem Peptid verwendet. Die Menge des zur Induktion der Zell-Lyse benötigten lytischen Peptids reicht gewöhnlich aus, um eine Peptidkonzentration in dem Medium bereitzustellen, das die Zellen von mindestens 1 uM enthält, es wird jedoch in Erwägung gezogen, daß unter Umständen weniger als diese Menge ausreichend sein könnte. Auf der anderen Seite werden Konzentrationen von lytischem Peptid über circa 200 um die Lyse der Zellen gewöhnlich nicht signifikant verbessern, obwohl Konzentrationen höher als 200 um verwendet werden können. Die lytische Peptidkonzentration liegt bevorzugt im Bereich von 20-200 uM und besonders 50-100 uM.
In einem System, in dem die mit dem lytischen Peptid kontaktierten Zellen kultiviert oder gezüchtet werden, um biologische oder biochemische Produkte davon zu erhalten, kann es wünschenswert sein, daß ein zytoplasmatisches Produkt aus den lysierten Zellen wiedergewonnen wird. Zum Beispiel kann die Wiedergewinnung eines Produktes, wie zum Beispiel Interferon durch Behandlung der das Produkt produzierenden Zellen mit einem lytischen Peptid In Kombination mit einem Inhibitor der zytoskeletalen Bildung, wie zum Beispiel Cytochalasin B erleichtert werden, wobei die Verwendung von Detergentien, die die Reinigung des gewünschten Produktes komplizieren, vermieden wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die zu lysierenden Targetzellen lysiert oder anderweitig in Gegenwart von Non-Targetzellen gehemmt. Die Targetzellen können zum Beispiel eine Kultur, ein Gemisch oder eine Suspension in vitro sein oder können Targetzellen in einem Wirt sein, bei dem es sich um ein höheres Tier handelt, besonders um Wirbeltiere oder aquakulturelle Wirbeltiere oder wirbellose Tiere und besonders um Säugetiere, wie zum Beispiel Menschen. In einer derartigen Situation muß bei der Auswahl des lytischen Peptids und seiner Konzentration ein gewisser Grad an Sorgfalt ausgeübt werden, um eine weitgehende Lyse oder Hemmung der Non-Targetzellen zu vermeiden. Zur Verwendung in vivo ist eine Menge des lytischen Peptids in Bereich von circa 1 mg/kg bis circa 100 mg/kg gewöhnlich ausreichend, um die gewünschte Hemmung zu bewirken und eine weitgehende Hemmung der Non-Target- oder Wirtszellen zu vermeiden, obwohl diese Dosierung in einer Reihe von Applikationen erhöht oder erniedrigt oder wiederholt werden kann. Das Peptid kann direkt in das höhere Tier auf irgendeine beliebige herkömmliche Weise, wie zum Beispiel durch Injektion des Peptids in einem pharmazeutisch zulässigen Träger intramuskulär, subkutan, intravenös oder intraperitoneal und bevorzugt an oder nahe des Infektionsortes oder des Krebses eingeführt werden. Wo eine relativ hohe Inzidenz an Targetzellen in dem Wirt vorliegen kann, besonders in fortgeschrittenen Stadien der Infektion oder Krebses, sollte zusätzliche Vorsicht ausgeübt werden, da schnelle Lyse einer derartig großen Zahl von Targetzellen eine Wirtsreaktion auf die Produkte der lytischen oder hemmenden Aktivität ausgelöst werden kann.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht durch Theorie gebunden oder beschränkt ist, wird angenommen, daß die Membranen der unteren Eukaryoten aufgrund der Unterschiede in ihren Membranen und zytoskeletalen Komponenten im allgemeinen der Lyse durch lytische Peptide unterliegen. Die Membranen normaler Zellen der höheren Eukaryoten verhüten jedoch irgendwie die Lyse, möglicherweise zum Beispiel durch die Fähigkeit ihrer gut entwickelten Zytoskelette, jegliche durch das lytische Peptid herbeigeführten Meirtbranschäden schnell zu reparieren. Andererseits sind höhere eukaryote Zellen mit einem aberranten Zytoskelett, wie zum Beispiel neoplastische oder infizierte Zellen, im allgemeinen nicht fähig, eine Lyse durch das lytische Peptid mit dem vorliegenden Verfahren zu verhüten.

Beispiel 1

In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 auf Trypomastigote von T. cruzi

Trypomastigote Formen von Trypanosoma cruzi wurden in Höhe von 10&sup5; Zellen/ml in Minimal-Essential-Medium ("MEM"; Mininalmedium) und 10% hitzeinaktiviertem fetalen Rinderserum ("MEM-FBS") mit 100 um Cecropin SB-37 suspendiert. Kontrolltrypomastigote wurden in den gleichen Medium ohne das Cecropin SB-37 suspendiert. Nach einer Stunde in Suspension wiesen die behandelten trypomastigoten Formen eine 90%ige Reduktion ihrer Lebensfähigkeit auf, wie mikroskopisch durch Zählen der Lebendzellen im Vergleich zu unbehandelten trypomastigoten Formen unter anderweitig identischen Bedingungen beurteilt wurde. Die Reduktion der Lebensfähigkeit wurde durch Zugabe der behandelten und unbehandelten Trypomastigoten-Suspensionen zu Vero-Zellen in MEM-FBS in Höhe von 10&sup5; Zellen/ml in einem Verhältnis von 1:1 Trypomastigoten (wie vor der Cecropin-Behandlung gezählt) zu Vero-Zellen zugefügt und 24 Stunden in Objektträgerkammern bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre kultiviert. Auf Grundlage der Zählungen infizierter Vero- Zellen zeigten die behandelten trypomastigoten Formen einen signifikant verminderten Grad der Parasitämie im Vergleich zu den Vero-Zellen mit den unbehandelten trypomastigoten Formen.

Beispiel 2

In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 auf intrazelluläre Amastigote von T. cruzi in Vero-Zellen

Vero-Zellen in Höhe von 10&sup5; Zellen/ml in MEM-FBS wurden mit Trypanosoma cruzi im trypomastigoten Stadium in Höhe von 10 Zellen/ml im gleichen Medium in einem Verhältnis von 1:1 Vero-Zellen zu Trypomastigoten gemischt. Das Gemisch aus Vero-Zellen und Trypomastigoten wurde bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre in Objektträgerkammern kultiviert. Nach 24 Stunden wurde den Kammern, mit Ausnahme einer Kontrollreihe, Cecropin SB-37 in einer Endkonzentration von 100 um zugefügt. Die Zahl intrazellulärer amastigoter Formen pro 100 Vero-Zellen wurde alle 24 Stunden durch Fixation mit Formalin, Färben nach Giemsa und Auszählen mehrerer hundert Vero-Zellen entlang einer Linie den Objektträger hinunter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 auf intrazelluläre Amastigote von T. cruzi in Vero-zellen Stunden nach Zugabe von T. cruzi Amastigote/100 vero-Zellen Infizierte Zellen % Kontrollen Behandelt
Die vorstehende Technik wurde zur Bestimmung der LD&sub5;&sub0; von Shiva 1 und Cecropin SB-37 (der Konzentration von jedem Peptid, das zur Erhaltung einer 50%igen Reduktion der Zahl von Vero-Zellen benötigt wurde, die mit trypomastigoten Formen über eine einstündige Periode infiziert wurden, im Vergleich zu der Zahl infizierter Vero-Zellen, die in Abwesenheit des Peptids über die gleiche Zeitdauer inkubiert wurde). Der LD&sub5;&sub0; für Cecropin SB-37 lag bei circa 90 uM, während der für Shiva 1 bei circa 9 uM lag, was darauf hinwies, daß Shiva 1 gegen Infektionen mit T. cruzi um etwa das 10fache wirksamer ist als Cecroprin SB-37.

Beispiel 3

In-vitro-Effekt von Cecropin B und Cecropin SB-37 auf P. falciparum in humanen Erythrozyten

Plasmodium falciparum wurde in Höhe von 0,0625, 0,1,25, 0,25 und 0,5% parasitierter Erythrozyten (PPRC) in Flaschen gegeben, die 50 ml humane Erythrozyten in RPMI und 10 uM Hypoxanthin mit 50 uCi ³H-Hypoxanthin bei einem Endvolumen von 150 ml enthalten. Das Gemisch wurde eine Woche lang bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Cecropin B und Cecropin SB-37 wurden dann den verschiedenen Flaschen in Konzentrationen von 0 (Kontrolle), 1, 20 und 200 uM zugesetzt. Nach 24 stündiger zusätzlicher Inkubation wurden die Erythrozyten durch Filtration geerntet und die Hypoxanthin-Aufnahme im Flüssigkeitsszintillationszähler als eine Anzeige der Lebensfähigkeit von P. falciparum gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zu sehen. Tabelle 3 In-vitro-Effekt von Cecropin B und Cecropin 53-37 auf P. falciparum in humanen Erythrozyten ³Hypoxanthin-Aufnahme (Imp/min) Cecropin Konzentration (um) P. falciparum (PPC)
Das vorstehende Verfahren wurde mit P. falciparum in Höhe von 0,5 PPRC mit der Zugabe von Cecropin SB-37 mit 0,25, 50,75 und 100 uM wiederholt. Die Zahl der infizierten Erythrozyten wurde anhand mikroskopischer Zählung nach 24stündiger Inkubation durch Fixation, Färben und Zählung wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 4 hervor. Tabelle 4 In-vitro-Effekt von Cecropin 53-37 auf P. falciparum in humanen Erythrozyten Konzentration (um) Infizierte Erythrozyten (%)
Das vorstehende Verfahren und die Techniken wurden zur Bestimmung der LD&sub5;&sub0; von Shiva 1 und Cecropin SB-37 (die Konzentration des Peptids, die zur Erhaltung einer 50%igen Reduktion der ³H-Hypoxanthinaufnahme über eine 24-Stunden- Periode im Vergleich zu unbehandelten infizierten Erythrozyten erforderlich ist) verwendet. Die LD&sub5;&sub0; für Cecropin SB-37 lag bei circa 22,5 uM, während die für Shiva 1 bei circa uM lag, was darauf hinweist, daß Shiva 1 gegen Infektionen mit P. falciparum um circa das 2fache wirksamer ist als Cecropin SB-37.

Beispiel 4

In-vitro-Effekt von Cecropin B, Cecropin SB-37 und Melittin auf S. cerevisiae

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde bis zur späten Log- Phase gezüchtet, wobei ein kleines Inoculum in 100 ml Nährlösung gebracht wurde, die 10 g Tryptose, 5 g Hefeextrakt und 2 g Glucose pro 1 enthielt. Die Hefe wurde dann durch Zentrifugation pelletiert und in Höhe von 10&sup5; Zellen/ml in 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung (PBS) bei pH 6,8 resuspendiert. Cecropin B, Cecropin SB-37, Melittin und ein nicht verwandtes Kontrollpeptid mit 15 Aminosäuren wurden zu verschiedenen Konzentrationen in verschiedenen Vertiefungen zugefügt, die 10&sup5; Zellen/Vertiefung enthielten und die Vertiefungen 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Jede Vertiefung wurde um das 1000fache mit PBS verdünnt und auf Glucose-Agar-Platten ausgestrichen. Am nächsten Tag wurde die Zahl der überlebenden Zellen durch Plattenzählungen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Effrekt lytischer Peptide auf S. cerevisiae Plattenzählung (Tausende) Peptid Konzentration (um) Kontrolle Melittin Cecropin B Cecropin SB-37

Beispiel 5

In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 und Shiva 1 auf Tumorzellen

EL-4-Lymphomzellen wurden in RPMI 1640 in Höhe von 5.000.000/ml mit 500.000 Zellen pro Vertiefung suspendiert. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Cecropin SB-37 und Shiva 1 zugefügt und die Vertiefungen 1 Stunde lang bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde durch mikroskopische Untersuchung auf Trypanblau-Ausschluß bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 und Shiva 1 auf EL-4-Zellen Peptid Konzentration (um) Lebensfähigkeit (%) Cecropin SB-37 Shiva 1
Die vorstehenden Ergebnisse veranschaulichen, daß beide Peptide gegen EL-4-Zellen lytisch aktiv sind und daß Shiva 1 um circa das 2fache wirksamer ist als Cecropin SB- 37. Diese Ergebnisse wurden anhand von Chromfreisetzungsdaten, die durch Inkubation von 10&sup6; EL-4- Zellen in 0,5 ml MEM-FBS mit 10% FCS (fetalem Kälberserum) und 1 uCi &sup5;¹Cr für die Dauer von 60 Minuten bei 37ºC, Zentrifugieren und Waschen der inkubierten EL-4-Zellen mit PBS und Resuspendieren der EL-4-Zellen in MEM-FBS erhalten wurden. Die EL-4-Zellen wurden dann Minuten lang in Gegenwart verschiedener Peptide bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Die Zytotoxizität wurde als ein Prozentsatz des freigesetzten Chroms (gemessen in dem Kulturüberstand) im Vergleich zu dem von EL-4-Zellen freigesetzten Chrom ermittelt, die durch Detergens lysiert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Effekt von Peptiden auf EL-4-Zellen gemessen anhand der Chromfreisetzung % Zytotoxizität¹ Peptidkonzentration (um) Cecroprin SB-37 *Cecropin SB-37 Shiva 1 Melittin
Hinweis für Tabelle 7:
1. Berechnet als ein Prozentsatz der Imp/min des Kulturüberstandes dividiert durch die Imp/min des Überstandes aus mit Detergens lysierten Zellen:
% Zytotoxizität = Imp/min (behandelter Zellüberstand) - Imp/min (spontane Freisetzung) Imp/min (Detergens-Lyse) - Imp/min (spontane Freisetzung)
Ähnliche Chromfreisetzungsdaten wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens mit einer 100 uM
Peptidkonzentration, aber mit EL-4-Zellkonzentrationen von 2 x 10&sup6;, 10&sup6; und 5 x 10&sup5; Zellen in 0,5 ml Medium erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 Effekt der EL-4-Zellkonzentration auf die Zytotoxizität von Peptiden % Zytotoxizität¹ Zellen pro 0,5 ml Cecropin SB-37 Shiva 1 *Cecropin SB-37 Melittin Hinweis für Tabelle 8: 1. Siehe Tabelle 7, Hinweis 1.
Die Chromfreisetzungsdaten wurden auch unter Verwendung des Überstandes von nichtmarkierten EL-4-Zellen erhalten, die Minuten lang in Gegenwart von 100 uM Peptid als Medium für, wie oben beschrieben, kultivierte, mit &sup5;¹Cr-markierte EL-4 gezüchtet wurden. Die wie oben beschrieben in % errechnete Zytotoxizität lag für Cecropin SB-37 bei 20,16, für *Cecropin SB-37 bei 19,73, für Shiva 1 bei 41,96 und für Melittin bei 106,67.

Beispiel 6

In-vitro-Effekt von Cecropin SB-37 auf normale und neoplastische Säugetierzellen

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde mit 50 und 200 uM Cecropin SB-37 unter Verwendung von SP2-Mäuselymphomzellen, humanen KG-1-Leukämiezellen, humanen Burkitt-Lymphomzellen nach Daudi, nicht adhärenten normalen humanen Lymphozyten und adhärenten humanen 3T3-Fibroblasten durchgeführt. Die Lebensfähigkeit wurde anhand mikroskopischer Beobachtung auf Trypanblau-Ausschluß bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9 Effekt von Cecropin SB-37 auf normale und neoplastische Säugetierzellen Zell-Linie Überleben (%) 50 uM SB-37 100 uM 35-37 SP2 KG-1 Daudi Nicht adhärente normale humane Lymphozyten 3T3
Dieses Verfahren wurde mit 100 uM Cecropin SB-37 unter Verwendung nicht adhärenter normaler humaner Lymphozyten, humaner Burkitt-Lymphomzellen nach Daudi, humaner KG-1- Leukämiezellen, humaner U937-Monozytenleukämiezellen und muriner SP2-Myelomzellen wiederholt und die Lebensfähigkeit durch das Trypanblau-Ausschlußverfahren bei 15, 30 und 60 Minuten nach Zugabe des Peptids bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle dargestellt. Tabelle 10 Effekt von 100 uM Cecropin 55-37 auf normale und neoplastische Säugetierzellen Zell-Linie Lebensfähigkeit (%) 15min 30min 60 min Nicht adhärente normale humane Lymphozyten Daudi KG1

Beispiel 7

In-vitro-Effekt von lytischen Peptiden auf Virus-infizierte Zellen

Simian-Nierenzellen, die mit dem Masernvirus, Parainfluenza-Virus und Herpes-simplex-II-Virus infiziert wurden, wurden in Höhe von 10&sup5; Zellen/ml in 1,0 ml Gesamtvolumen DMEM und 10% FCS (fetales Kälberserum) in Gegenwart von 100 uM Cecropin SB-37, *Cecropin SB-37 und Shiva 1 für 1-4 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Zugabe von gleichem Volumen sterilen Wassers lysiert, und 0,1 ml Überstand wurde zu 10&sup5; Simian- Nierenzellen in 1,0 ml Gesamtvolumen DMEM/10% FCS gegeben und das Gemisch 24 Stunden lang inkubiert. Die Zahl der Virus-infizierten Zellen in der frischen Kultur wurde durch Zählung auf Objektträgern unter dem Mikroskop bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11 Titration von Viren in Gegenwart von lytischen Peptiden Zahl der infizierten Zellen Inkubations periode (Tage) Peptid Masern Parainfluenza Herpes simplex II Cecropin SB-37 *Cecropin SB-37 Shiva 1 Kontrolle Shiva 1 Kontrolle Cecropin SB-37 *Cecropin SB-37 Shiva 1 Kontrolle
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß lytische Peptide bei der Hemmung Virus-infizierter eukaryoter Zellen wirksam und besonders wirksam gegen DNA-Viren, wie zum Beispiel Herpes simplex II sind. Cecropin SB-37 scheint eine größere Hemmwirkung zu haben als *Cecropin SB-37 und Shiva 1.

Beispiel 8

In-vivo-Screening von Cecropin SB-37 an Mäusen

Neun 4 bis 5 Wochen alte BALB/C-Mäuse, die auf einer gewerblich erhältlichen Futterration für Nagetiere ad libitum gehalten wurden und im allgemeinen bei guter Gesundheit waren, wurden jeweils mit 1,76 mg/Tag Cecropin SB-37 in PBS für 4 konsekutive Tage intramuskulär inokuliert. An der Diät oder den Bedingungen wurden keine weiteren Änderungen vorgenommen. Die Mäuse wurden zweimal täglich beobachtet, und es wurden keine unerwünschten Reaktionen bemerkt. Am Ende des vierten Tages wurden drei Mäuse getötet und untersucht. Nach Tagen wurde drei Mäusen zusätzlich jeweils 1,76 mg Cecropin SB-37 gegeben. Es wurden keine unerwünschten Reaktionen bemerkt.
Die übrigen Mäuse wurden alle 7 Tage nach der letzten Inokulation getötet. Die Untersuchung von Organen und Geweben wies darauf hin, daß keine makroskopischen pathologischen Veränderungen in den Organen oder an den Injektionsorten vorlagen. Keine dieser Mäuse produzierten nachweisbare Antikörperspiegel gegen das Cecropin SB-37.
Nach dem obigen Verfahren wurde drei BALB/C-Mäusen 100 mg/kg Körpergewicht (KG) pro Tag Cecropin SB-37 gegeben, das intramuskulär in einer ausgeglichenen Salzlösung für 6 Tage injiziert wurde. Die Leukozytenzahlen wurden periodisch bestimmt und werden in Tabelle 12 berichtet. Zehn Tage nach der letzten Inokulation wurden die Mäuse wieder intramuskulär mit 110 mg/kg Körpergewicht Cecropin SB-37 injiziert. Beobachtungen brachten keine unerwünschten Effekte während des Verfahrens zutage. Alle drei Mäuse wurden 7 Tage nach der letzten Inokulation getötet. Die Gewebe wurden untersucht. Alle Mäuse wiesen eine vergrößerte Milz auf, waren aber anderweitig unauffällig. Es wurden keine Antikörper gegen Cecropin SB- 37 nachgewiesen. Tabelle 12 Effekt von Cecropin SB-37 auf die Leukozytenzahl Leukozytenzahl (10³/ml) Tag Maus 1

Beispiel 9

In-vivo-Effekt von Shiva 1 auf ein murines

Mammakarzinom

Einer BALB/C-Maus wurden für die Dauer von drei konsekutiven Tagen täglich Injektionen von 1,76 mg (88 mg/kg) Shiva 1 in PBS wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben gegeben. Die Maus hatte ein großes Mammakarzinom, in welches Shiva 1 direkt injiziert wurde. Nach der dritten Injektion starb diese Maus fast sofort. Die Obduktion ergab als unmittelbare Todesursache Schock und weitgehenden Zelltod in dem Karzinom. Es wird angenommen, daß mit niedrigeren Dosierungen der Schock vermieden, aber das Karzinom noch signifikant gehemmt worden wäre.

Beispiel 10

In-vivo-Effekt von Cecropin SB-37 auf B. abortus bei Mäusen

Es wurden insgesamt 18 4 bis 5 Wochen alte BALB/C-Mäuse, die auf einer in Handel erhältlichen, ad libitum verfütterten Ration für Nagetiere gehalten wurden und bei guter Gesundheit waren, intraperitoneal mit 3 bis 5 x 10&sup8; Brucella abortus (einem intrazellulären, pathogenen Mikroorganismus) in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Am zwölften Tag nach der Infektion wurden sechs der Mäuse mit je 0,176 mg/Tag Cecropin SB-37 in PBS intramuskulär inokuliert, sechs wurden mit 0,176 mg/Tag Tetracyclin behandelt und sechs erhielten sterile PBS, alle für eine Dauer von 4 Tagen. Die Hälfte der Mäuse in jeder Gruppe wurde am sechzehnten Tag nach der Infektion getötet und das Milzgewebe morphologisch, histologisch und durch Kultivieren nach den Standardverfahren für Brucella abortus untersucht. Die gefundenen Konzentrationen sind in der folgenden Tabelle 13 zu finden. Tabelle 13 Konzentration von Brucella abortus in Milzgewebe von BALB/C-Mäusen nach 4tägiger Behandlung (Zahl pro g Milz) Kontrolle Tetracyclin Cecropin SB-37
Die übrigen Mäuse wurden am 23. Tag nach der Infektion getötet und auf die gleiche Weise untersucht. Es wurde kein Unterschied im Ergebnis beobachtet. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß das lytische Peptid Cecropin SB-37 dazu in der Lage ist, den Infektionsgrad und das Wachstum von Brucella abortus in Mäusen signifikant zu vermindern.

Beispiel 11

In-vivo-Effekt von Cecropin SB-37 auf L. monocytogenes in Mäusen

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt, außer daß anstelle von B. abortus ein anderer intrazellulärer pathogener Mikroorganismus, Listeria monocytogenes, verwendet und die Kontroll-Gruppe nicht behandelt wurde (erhielt nur sterile Kochsalzinjektionen). Die unbehandelten Mäuse, die fünf Tage nach der Infektion getötet wurden, wiesen durchschnittlich 46 Millionen L. monocytogenes-Bakterien in ihrer Milz auf, im Gegensatz zu weniger als fünf Millionen bei den Mäusen, denen täglich eine Injektion mit Cecropin SB-37 gegeben wurde.

Beispiel 12

Synergismus von Lysozym/Cecropin gegen E. coli

In einen geeigneten Behälter wurden 50 ul der zu untersuchenden Bakterien gegeben, in diesem Fall E. coli E/2/64, die von der Cornell University erhalten wurden, und 50 ul mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die aus 80,0 g NaCl, 3 g KCl, 0,73 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4; mit Verdünnung von ml Gemisch mit 90 ml Wasser und Sterilisation durch Autoklavieren zubereitet wurde. Die E. coli wurden in der späten Log-Wachstumsphase entnommen, wenn sich die Mehrzahl der Zellen nach 18-24 Stunden in der Wachstumsphase-befanden. Außerdem wurde das gleiche Gemisch mit 5 uM Cecropin B oder Cecropin SB-37 zubereitet. Die Gemische wurden 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gemische wurden in Reihenverdünnungen zu 7 Tropfen pro Verdünnung (10 ul pro Tropfen) auf 10&supmin;¹ oder 10&supmin;³ verdünnt und auf Tryptose-Agar-Wachstumsmedium ausplattiert. Die Platten wurden 3 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Die Plattenzählungen wiesen darauf hin, daß kein Wachstum von E. coli vorlag.
Kombinationen von Cecropin B wie auch Cecropin SB-37 mit Lysozym (25:25 ul Gemisch) verhinderten bei Konzentrationen von 0,1 uM auch das Wachstum, aber Lysozym selbst zeigte bei Konzentrationen von ug, 1 mg und 10 mg pro ml positives Wachstum von E. coli, sowohl bei Verdünnungen von 10&supmin;¹ als auch 10&supmin;³. Darüber hinaus zeigten niedrigere Konzentrationen von einem Nanomolar und einem Mikromolar von beiden Cecropin-Spezies positives Wachstum von E. coli.

Beispiel 13

Synergismus von Lysozym/Cecropin gegen B. abortus

Es wurde das Verfahren von Beispiel 12 befolgt, außer daß es sich bei dem Mikroorganismus um Brucella abortus handelte, der mittels herkömmlicher Verfahren isoliert wurde, das Cecropin/Bakterien-Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann Minuten bei 37ºC inkubiert, und die Platten wurden bei 37ºC inkubiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 unten gezeigt. Tabelle 14 Effekt von Cecropinen auf Brucella abortus Cecropin Konzentration (um) Ergebnisse Kein Wachstum
Kombinationen von Cecropin SB-37 und Cecropin B mit Lysozym bei 1, und 100 ug/ml waren bei der Verhinderung von Wachstum nur bei der höchsten Lysozymkonzentration mit Cecropin SB-37 wirksam; ansonsten wurde etwas Wachstum von Brucella abortus bemerkt.

Beispiel 14

Synergismus von Lysozym/lytischem Peptid gegen P. aeruginosa

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde mit Cecropin SB-37 und Shiva 1, allein und in Kombination mit Lysozym bei der gleichen molaren Konzentration des lytischen Peptids gegen Pseudomonas aeruginosa befolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 dargestellt. Tabelle 15 Lebensfähigkeit von P. aeruginosa in lytischem Peptid/Lysozym Lebensfähigkeit (%) Peptid konzentration (um) Cecropin SB-37 Shiva 1 Lysozym (1x) Shiva 1 und Lysozym (1x)

Beispiel 15

Synergismus von Lysozym/lytischem Peptid gegen Staphylococci

Das Verfahren von Beispiel 14 wurde unter Verwendung von S. intermedius 19930, S. internedius 20034 und S. aureus mit Lysozym bei 10x der molaren Konzentration des lytischen Peptids wiederholt. Die Ergebnisse werden in Tabellen 16, 17 bzw. 18 dargestellt. Tabelle 16 Lebensfähigkeit von S. Intermedius 199 in lytischem Peptid/Lysozym Lebensfähigkeit (%) Peptid konzentration (um) Cecropin SB-37 Shiva 1 Lysozym (10x) Shiva 1 und Lysozym (10x) Tabelle 17 Lebensfähigkeit von S. intermedius in lytischem Peptid/Lysozym Lebensfähigkeit (%) Peptid konzentration (um) Cecropin SB-37 Shiva 1 Lysozym (1x) Shiva 1 und Lysozym (1x) Tabelle 18 Lebensfähigkeit von S. aureus in lytischem Peptid/Lysozym Lebensfähigkeit (%) Peptidkonzentration (um) Cecropin SB-37 Shiva 1 Lysozym (1x) Shiva 1 und Lysozym (10x)

Beispiel 16

Synergismus von Lysozym/lytischem Peptid gegen Pflanzenpathogene

Die Verfahren der vorstehenden Beispiele mit der Ausnahme einer Inkubationstemperatur von 30ºC anstelle von 37ºC wurden zum Nachweis der synergistischen bakteriziden Eigenschaften eines lytischen Peptids in Kombination mit Lysozynt gegen häufige Pflanzenpathogene verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 dargestellt. Tabelle 19 LD&sub5;&sub0; von Pflanzenpathogen in Cecropin SB-37/Lysozym Bakterien LD&sub5;&sub0; (uM) Cecropin SB-37 Lysozym Cecropin SB-37 (+Lysozym (10x)) Pseudomonas syringae früher: tabaci Pseudomonas solanacearum Erwinia caratovara Subsp. carotova Xanthomonas campestris früher: campestris
Nachdem die Erfindung oben beschrieben wurde, werden den Fachleuten verschiedene Modifikationen der Techniken, Verfahren, des Materials und der Einrichtungen offensichtlich werden. Es wird beabsichtigt, daß alle derartigen Variationen im Rahmen und Grundgedanken der anhängenden Ansprüche damit einbegriffen sind.

Claims

1. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments für die Lyse von eukaryoten Mikroorganismen, Lymphomen, Leukämien, Karzinomen, Sarkomen und eukaryoten Zellen, die mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus in Gegenwart von eukaryoten Non- Targetzellen infiziert sind.

2. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1, worin das selektiv lytische Peptid ein freies Peptid ist.

3. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1 oder 2, worin das selektiv lytische Peptid ein Cecropin, Lepidopteran oder Sarcotoxin ist.

4. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das selektiv, lytische Peptid inklusive zwischen 30 und 40 Aminosäuren umfaßt.

5. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 4, worin genanntes selektiv lytische Peptid einen Anteil hat, welcher in einer amphiphilen α-Helix-Konformation angeordnet ist.

6. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 5, worin genanntes selektiv lytische Peptid einen im wesentlich hydrophilen Kopf mit einer positiven Ladungsdichte, einen im wesentlichen hydrophoben Schwanz, eine überwiegend hydrophile Seite entlang der Länge von genannter α-Helix- Konformation und eine überwiegend hydrophobe Seite entgegengesetzt davon besitzt.

7. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach keinem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte intrazelluläre pathogene Mikroorganismen ein Virus, Bakterien, Fungi oder Protozoa sind.

8. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 7, worin das Virus ein DNA-, Parainfluenza-, Masern- oder Herpes- simplex-II-Virus ist.

9. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 7, worin genanntes Bakterium eine Spezies von Listeria oder Brucella ist.

10. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 7, worin genanntes intrazelluläres Pathogen eine Spezies von Trypanosoma oder Plasmodium ist.

11. Lytisches Peptid mit der Aminosäuresequenz von Shiva 1 wie in Tabelle 1 definiert.

12. Lytisches Peptid mit einer Aminosäuresequenz von Cecropin SB-37 wie in Tabelle 1 definiert.

13. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin sich das selektiv lytische Peptid in einer Beimischung mit Lysozym in einem synergistischen Verhältnis befindet.

14. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 13, worin sich das selektiv lytische Peptid einer Beimischung mit Lysozym in einem synergistischen Verhältnis von Molen Lysozym zu 0,1 - 100 Molen selektiv lytischem Peptid befindet.

15. Verwendung eines selektiv lytischen Peptids für die Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 14, worin sich das selektiv lytische Peptid in einer Beimischung mit Lysozym in einem synergistischen Verhältnis von Molen Lysozym zu 1 - 10 Molen selektiv lytischem Peptid befindet.

16. Verfahren zum Lysieren eukaryoter Targetzellen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die in wesentlichen aus eukaryoten Mikroorganismen, Lymphonen, Leukämien, Karzinonen, Sarkomen und eukaryoten Zellen besteht, die mit einem intrazellulären pathogenen Mikroorganismus in Gegenwart von eukaryoten Non-Targetzellen infiziert sind, dadurch gekennzeichnet, daß genannte eukaryote Targetzellen mit einem selektiv lytischen Peptid in vitro in Kontakt gebracht werden.